TY - THES A1 - Hermann, Stephanie T1 - Adenosindiphosphat-vermittelte Funktion und Expression von purinergen Rezeptoren in gewaschenen humanen Thrombozyten T1 - Adenosindiphosphate-mediated function and expression of purinergic receptors in washed platelets N2 - Nach der Präparation von gewaschenen Thrombozyten, einem wichtigen Ausgangsmaterial für die experimentelle Forschung oder für die Transfusionsmedizin, tritt bekannterweise ein zunehmender Verlust der ADP-vermittelten Aggregationsfähigkeit ein. Die verminderte Funktionsfähigkeit von Thromboyzten nach dem Waschvorgang kann somit auch experimentelle Ergebnisse beeinflussten. Allerdings sind die dafür verantwortlichen molekularen Mechanismen bisher nicht aufgeklärt, sodass in dieser Dissertationsarbeit molekulare sowie auch funktionelle Vorgänge untersucht wurden, die zum bekannten Phänomen des raschen Verlustes der ADP-vermittelten Aggregationsfähigkeit gewaschener Thrombozyten führen. Die Wirkung von ADP wird über die drei purinergen Rezeptoren P2Y1, P2X1 und P2Y12 vermittelt wird. Daher wurde zunächst die ADP-induzierte Aggregationsfähigkeit alleine bzw. unter Kostimulation mit Epinephrin oder Serotonin - zwei Induktoren, deren Rezeptoren mit analogen Signalwegen wie die ADP-Rezeptoren P2Y1 bzw. P2Y12 gekoppelt sind - bestimmt. Um Hinweise zu erhalten, wie die Abnahme der ADP-vermittelten Reaktivität von gewaschenen Thrombozyten mit der purinergen Rezeptorexpression und -distribution sowie mit der nachgeschalteten Signalweiterleitung im Zusammenhang steht, wurde zudem die Expression purinerger Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche bzw. die Konzentration von purinergen Rezeptoren im Zytosol gewaschener Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie bzw. ELISA gemessen. Es zeigte sich, dass die Funktion der den purinergen Rezeptoren nachgeschalteten Signalwege während der Lagerungszeit zunehmend beeinträchtigt wird, aber zumindest teilweise erhalten bleibt, wie anhand von Effekten durch Kostimulation mit den Induktoren Epinephrin und Serotonin gezeigt werden konnte. Die Distribution der Rezeptoren zwischen der Thrombozytenoberfläche und den intrazellulären Kompartimenten unterliegt komplexen Prozessen, die induktorabhängig reguliert sind. Eine initiale Zunahme der Expression von ADP-Rezeptoren während der Lagerung von gewaschenen Thrombozyten geht dabei nicht einher mit der Aufrechterhaltung der ADP-induzierten Aggregation. In der Schlussfolgerung ist die fortschreitende Degeneration der ADP-vermittelten Aggregation - neben einem Rückgang der Rezeptorexpression nach mehr als einer Stunde Lagerungszeit - vor allem auf einen funktionellen Verlust der purinergen Rezeptoren zurückzuführen. N2 - Washing of platelets is an important procedure commonly used for experimental studies, e.g. in cardiovascular research, or transfusion medicine. As a well-known phenomenon, responsiveness to adenosine diphosphate (ADP) is reduced in washed platelets. Therefore, washing of platelets may affect experimental results. The underlying molecular mechanisms of the rapid loss of ADP-mediated aggregation of washed platelets have not been thoroughly studied. Aim of this dissertation was to elucidate the molecular and functional processes of this phenomenon. ADP mediates its action via three purinergic receptors P2Y1, P2X1 and P2Y12. At first the ADP-induced aggregation of washed platelets was determined by using ADP alone or ADP combined with the stimulators epinephrine or serotonin. Both mediate their effects via the same signaling pathways as ADP but use different receptors. To get information if the reduced responsiveness to ADP in washed platelets is linked with the receptor expression and distribution, the expression and concentration of purinergic receptors on the platelet surface and in the cytosol of washed platelets was measured by using flow cytometry and ELISA. It was shown that the function of the signaling pathways downstream of the purinergic receptors was increasingly impaired during storage of washed platelets. However, it could be at least partially retained by co-stimulation with epinephrine or serotonin. The distribution of receptors between the platelet surface and the intracellular compartments is based on complex processes which are regulated depending on the different stimulators. An initial increase in the expression of ADP receptors during storage of washed platelets was not associated with the maintenance of ADP-induced aggregation. In conclusion, the progressive decrease of ADP-mediated aggregation is - next to a decrease of expression - mainly caused by functional loss of the purinergic receptors. KW - ADP KW - Aggregation KW - G-Protein gekoppelte Rezeptor KW - Purinozeptor KW - Thrombozyt KW - adenosine diphosphate KW - aggregation KW - purinergic receptors KW - g-protein-coupled receptor KW - washed platelets KW - P2Y1 KW - P2Y12 KW - P2X1 KW - ELISA KW - flow cytometry Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185201 ER - TY - THES A1 - Schüpferling, Anne Marie Heidi T1 - Der Einfluss der Proteasomhemmung durch Bortezomib auf die Aktivierbarkeit humaner Thrombozyten T1 - The role of proteasom activity for activating signaling in human platelets N2 - Bortezomib, ein selektiver und potenter Proteasominhibitor, wird experimentell in der Tumorzellforschung sowie therapeutisch in der Therapie des Multiplen Myeloms eingesetzt. Die Wirkung auf die Thrombozytenfunktion war bislang unzureichend untersucht. Daher evaluiert diese Studie die dosisabhängige Wirkung von Bortezomib auf die Viabilität, die Aggregation von gewaschenen Thrombozyten und auf aktivierende Signalwege in gewaschenen Thrombozyten. Die Thrombozytenviabilität war bei hohen Bortezomibkonzentrationen von 100 - 200 µM vermindert. Passend dazu verminderten 100 - 200 µM Bortezomib die Phosphorylierung der ERK1/2 und der Akt/PKB in humanen Thrombozyten. Im Gegensatz dazu hatten diese hohen Bortezomibkonzentrationen keinen Einfluss auf das Niveau der p38 MAP Kinase-Phosphorylierung in aktivierten Thrombozyten. Die Thrombozytenaggregation, induziert durch hohe Konzentrationen von Kollagen oder TRAP-6, blieb unter 0,1 nM - 200 µM Bortezomib unverändert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Bortezomib weder die essenziellen, aktivierenden Signalwege noch die Initialisierung der Aggregation relevant beeinflusst. Das zeigt, dass diese Prozesse in Thrombozyten nicht abhängig von der Proteasomaktivität sind. Supramaximale Inhibierung des Proteasomsystems mit Bortezomibkonzentrationen von 100 µM oder mehr führen möglicherweise zu veränderter Thrombozytenreaktionsfähigkeit, welche unter Umständen durch unspezifische und potenziell toxische Effekte mit erniedrigter Zellviabilität verursacht werden. N2 - Bortezomib, a selective and potent proteasome inhibitor, is used experimentally in tumor cell research and therapeutically in the treatment of multiple myeloma. Its effect on platelet function has been insufficiently studied. Therefore, this study evaluates the dose-dependent effects of bortezomib on viability, aggregation of washed platelets and activating signaling pathways in washed platelets. Platelet viability was tampered after incubation with high bortezomib concentrations of 100 - 200 µM. Fittingly, 100 - 200 µM bortezomib decreased phosphorylation of ERK1/2 and Akt/PKB in human platelets. In contrast, these high concentrations of bortezomib had no effect on the level of p38 MAP kinase phosphorylation in activated platelets. Furthermore platelet aggregation induced by high concentrations of collagen or TRAP-6 remained unchanged under the influence 0.1 nM - 200 µM bortezomib. In conclusion, bortezomib does not relevantly affect essential activating signaling pathways or the initialization of aggregation. This indicates that these processes in platelets are not dependent on proteasome activity. Supramaximal inhibition of the proteasome system with bortezomib concentrations of 100 µM or above may lead to altered platelet responsiveness, which may be accompanied by nonspecific and potentially toxic effects associated with decreasing cell viability. KW - Thrombozyt KW - Proteasom KW - Bortezomib KW - Thrombozytenaggregation KW - Thrombozyten KW - Proteasomsystem KW - Thrombozytenaktivierung KW - Viabilität KW - Proteasomhemmung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-327551 ER -