TY  - THES
A1  - Prieto García, Cristian
T1  - USP28 regulates Squamous cell oncogenesis and DNA repair via ΔNp63 deubiquitination
T1  - USP28 reguliert Plattenepithelzell-Onkogenese und DNA-Reparatur über ΔNp63-Deubiquitinierung
N2  - ∆Np63 is a master regulator of squamous cell identity and regulates several signaling pathways that crucially
contribute to the development of squamous cell carcinoma (SCC) tumors. Its contribution to coordinating the
expression of genes involved in oncogenesis, epithelial identity, DNA repair, and genome stability has been
extensively studied and characterized. For SCC, the expression of ∆Np63 is an essential requirement to
maintain the malignant phenotype. Additionally, ∆Np63 functionally contributes to the development of cancer
resistance toward therapies inducing DNA damage.
SCC patients are currently treated with the same conventional Cisplatin therapy as they would have been
treated 30 years ago. In contrast to patients with other tumor entities, the survival of SCC patients is limited,
and the efficacy of the current therapies is rather low. Considering the rising incidences of these tumor entities,
the development of novel SCC therapies is urgently required. Targeting ∆Np63, the transcription factor, is a
potential alternative to improve the therapeutic response and clinical outcomes of SCC patients.
However, ∆Np63 is considered “undruggable.” As is commonly observed in transcription factors, ∆Np63 does
not provide any suitable domains for the binding of small molecule inhibitors. ∆Np63 regulates a plethora of
different pathways and cellular processes, making it difficult to counteract its function by targeting
downstream effectors. As ∆Np63 is strongly regulated by the ubiquitin–proteasome system (UPS), the
development of deubiquitinating enzyme inhibitors has emerged as a promising therapeutic strategy to target
∆Np63 in SCC treatment.
This work involved identifying the first deubiquitinating enzyme that regulates ∆Np63 protein stability. Stateof-the-art SCC models were used to prove that USP28 deubiquitinates ∆Np63, regulates its protein stability,
and affects squamous transcriptional profiles in vivo and ex vivo. Accordingly, SCC depends on USP28 to
maintain essential levels of ∆Np63 protein abundance in tumor formation and maintenance. For the first time,
∆Np63, the transcription factor, was targeted in vivo using a small molecule inhibitor targeting the activity of
USP28. The pharmacological inhibition of USP28 was sufficient to hinder the growth of SCC tumors in
preclinical mouse models.
Finally, this work demonstrated that the combination of Cisplatin with USP28 inhibitors as a novel therapeutic
alternative could expand the limited available portfolio of SCC therapeutics. Collectively, the data presented
within this dissertation demonstrates that the inhibition of USP28 in SCC decreases ∆Np63 protein abundance,
thus downregulating the Fanconi anemia (FA) pathway and recombinational DNA repair. Accordingly, USP28
inhibition reduces the DNA damage response, thereby sensitizing SCC tumors to DNA damage therapies, such
as Cisplatin.
N2  - ∆Np63 ist ein Hauptregulator der Plattenepithelzellidentität und reguliert mehrere Signalwege, die entscheidend zur Entstehung von Plattenepithelkarzinomen (SCC) beitragen. Sein Beitrag zur Koordination der Expression von Genen, die an der Onkogenese, der epithelialen Identität, der DNA-Reparatur und der Genomstabilität beteiligt sind, wurde umfassend untersucht und charakterisiert. Für SCC ist die Expression von ∆Np63 eine wesentliche Voraussetzung, um den malignen Phänotyp zu erhalten. Darüber hinaus trägt ∆Np63 funktionell zur Entwicklung einer Krebsresistenz gegenüber Therapien bei, die DNA-Schäden induzieren.
SCC-Patienten werden derzeit mit der gleichen konventionellen Cisplatin-Therapie behandelt, wie sie vor 30 Jahren behandelt worden wären. Im Gegensatz zu Patienten mit anderen Tumorentitäten ist das Überleben von SCC-Patienten begrenzt und die Wirksamkeit der aktuellen Therapien eher gering. Angesichts der steigenden Inzidenz dieser Tumorentitäten ist die Entwicklung neuer Therapien für das Plattenepithelkarzinom dringend erforderlich. Das Targeting von ∆Np63, dem Transkriptionsfaktor, ist eine potenzielle Alternative zur Verbesserung des therapeutischen Ansprechens und der klinischen Ergebnisse von SCC-Patienten.
∆Np63 gilt jedoch als „nicht medikamentös“. Wie bei Transkriptionsfaktoren häufig beobachtet, bietet ∆Np63 keine geeigneten Domänen für die Bindung von niedermolekularen Inhibitoren. ∆Np63 reguliert eine Vielzahl von verschiedenen Signalwegen und zellulären Prozessen, was es schwierig macht, seiner Funktion entgegenzuwirken, indem es nachgeschaltete Effektoren angreift. Da ∆Np63 stark durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) reguliert wird, hat sich die Entwicklung von deubiquitinierenden Enzyminhibitoren als vielversprechende therapeutische Strategie erwiesen, um ∆Np63 bei der Behandlung von Plattenepithelkarzinomen zu bekämpfen.
Diese Arbeit beinhaltete die Identifizierung des ersten deubiquitinierenden Enzyms, das die Stabilität des ∆Np63-Proteins reguliert. Hochmoderne SCC-Modelle wurden verwendet, um zu beweisen, dass USP28 ∆Np63 deubiquitiniert, seine Proteinstabilität reguliert und Plattenepithel-Transkriptionsprofile in vivo und ex vivo beeinflusst. Dementsprechend hängt SCC von USP28 ab, um wesentliche Mengen des Np63-Proteinüberflusses bei der Tumorbildung und -erhaltung aufrechtzuerhalten. Zum ersten Mal wurde ∆Np63, der Transkriptionsfaktor, in vivo mit einem niedermolekularen Inhibitor gezielt, der auf die Aktivität von USP28 abzielt. Die pharmakologische Hemmung von USP28 war ausreichend, um das Wachstum von SCC-Tumoren in präklinischen Mausmodellen zu verhindern.
Schließlich zeigte diese Arbeit, dass die Kombination von Cisplatin mit USP28-Inhibitoren als neuartige therapeutische Alternative das begrenzt verfügbare Portfolio an SCC-Therapeutika erweitern könnte. Zusammengefasst zeigen die in dieser Dissertation präsentierten Daten, dass die Hemmung von USP28 in SCC die Np63-Proteinhäufigkeit verringert, wodurch der Fanconi-Anämie (FA)-Signalweg und die rekombinatorische DNA-Reparatur herunterreguliert werden. Dementsprechend reduziert die Hemmung von USP28 die Reaktion auf DNA-Schäden und sensibilisiert dadurch SCC- Tumoren für DNA-Schädigungstherapien wie Cisplatin.
KW  - USP28
KW  - Squamous cell carcinoma
KW  - ΔNp63
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-270332
ER  - 
TY  - THES
A1  - Reissland, Michaela
T1  - USP10 is a \(de\) \(novo\) tumour-specific regulator of β-Catenin and contributes to cancer stem cell maintenance and tumour progression
T1  - USP10 ist ein \(de\) \(novo\) tumorspezifischer Regulator von ß-Catenin und trägt zur Erhaltung von Krebsstammzellen und zur Tumorprogression bei
N2  - Colorectal Cancer (CRC) is the third most common cancer in the US. The majority of CRC cases are due to deregulated WNT-signalling pathway. These alterations are mainly caused by mutations in the tumour suppressor gene APC or in CTNNB1, encoding the key effector protein of this pathway, β-Catenin. In canonical WNT-signalling, β-Catenin activates the transcription of several target genes, encoding for proteins involved in proliferation, such as MYC, JUN and NOTCH. Being such a critical regulator of these proto-oncogenes, the stability of β-Catenin is tightly regulated by the Ubiquitin-Proteasome System. Several E3 ligases that ubiquitylate and degrade β-Catenin have been described in the past, but the antagonists, the deubiquitylases, are still unknown. By performing an unbiased siRNA screen, the deubiquitylase USP10 was identified as a de novo positive regulator of β-Catenin stability in CRC derived cells. USP10 has previously been shown in the literature to regulate both mutant and wild type TP53 stability, to deubiquitylate NOTCH1 in endothelial cells and to be involved in the regulation of AMPKα signalling. Overall, however, its role in colorectal tumorigenesis remains controversial. By analysing publicly available protein and gene expression data from colorectal cancer patients, we have shown that USP10 is strongly upregulated or amplified upon transformation and that its expression correlates positively with CTNNB1 expression. In contrast, basal USP10 levels were found in non-transformed tissues, but surprisingly USP10 is upregulated in intestinal stem cells. Endogenous interaction studies in CRC-derived cell lines, with different extend of APCtruncation, revealed an APC-dependent mode of action for both proteins. Furthermore, by utilising CRISPR/Cas9, shRNA-mediated knock-down and overexpression of USP10, we could demonstrate a regulation of β-Catenin stability by USP10 in CRC cell lines. It is widely excepted that 2D cell culture systems do not reflect complexity, architecture and heterogeneity and are therefore not suitable to answer complex biological questions. To overcome this, we established the isolation, cultivation and genetically modification of murine intestinal organoids and utilised this system to study Usp10s role ex vivo. By performing RNA sequencing, dependent on different Usp10 levels, we were able to recapitulate the previous findings and demonstrated Usp10 as important regulator of β-dependent regulation of stem cell homeostasis. Since genetic depletion of USP10 resulted in down-regulation of β-Catenin-dependent transcription, therapeutic intervention of USP10 in colorectal cancer was also investigated. Commercial and newly developed inhibitors were tested for their efficacy against USP10, but failed to significantly inhibit USP10 activity in colorectal cancer cells. To validate the findings from this work also in vivo, development of a novel mouse model for colorectal cancer has begun. By combining CRISPR/Cas9 and classical genetic engineering with viral injection strategies, WT and genetically modified mice could be transformed and, at least in some animals, intestinal lesions were detectable at the microscopic level. The inhibition of USP10, which we could describe as a de novo tumour-specific regulator of β-Catenin, could become a new therapeutic strategy for colorectal cancer patients.
N2  - Darmkrebs ist die dritthäufigste Krebsart in den USA. Die Mehrheit der Darmkrebsfälle
sind auf einen deregulierten WNT-Signalweg zurückzuführen. Diese Veränderungen wer-
den hauptsächlich durch Mutationen im Tumorsuppressor-Gen APC oder in CTNNB1
verursacht, welches für das zentrale Protein dieses Signalwegs, β-Catenin, kodiert.
Beim kanonischen WNT-Signalweg aktiviert β-Catenin die Transkription mehrerer Gene,
die für, an der Proliferation beteiligte Proteine wie MYC, JUN und NOTCH, kodieren.
Da β-Catenin ein kritischer Regulator dieser proto-Onkogene ist, wird die Stabilität von
β-Catenin durch das Ubiquitin-Proteasom-System streng reguliert. In der Vergangen-
heit wurden mehrere E3-Ligasen beschrieben, die β-Catenin ubiquitylieren und abbauen,
aber die Deubiquitylasen, sind grö𐀀tenteils noch unbekannt.
Mit Hilfe eines unvoreingenommenen siRNA-Screens wurde die Deubiquitylase USP10
als de novo Regulator der β-Catenin-Stabilität in Darmkrebs-Zellen identifiziert. In der
Literatur wurde bereits gezeigt, dass USP10 sowohl die Stabilität von mutiertem als
auch von wild typ TP53 reguliert, NOTCH1 in Endothelzellen deubiquityliert und an
der Regulation des AMPKα Signalwegs beteiligt ist. Insgesamt bleibt seine Rolle in der
kolorektalen Tumorgenese aber bisher umstritten.
Anhand der Analyse öffentlich zugänglicher Protein- und Genexpressionsdaten haben
wir gezeigt, dass USP10 bei der Transformation stark hochreguliert oder amplifiziert
wird und dass seine Expression positiv mit der von CTNNB1 korreliert. Im Gegensatz
dazu wurden in nicht transformiertem Gewebe basale USP10-Spiegel gefunden, aber
überraschenderweise ist USP10 in intestinalen Stammzellen hochreguliert.
Endogene Interaktionsstudien in Darmkrebs-Zelllinien mit unterschiedlichem Ausma𐀀
an APC-Trunkierung zeigten eine APC-abhängige Interaktion für beide Proteine. Darüber
hinaus konnten wir mit Hilfe von CRISPR/Cas9, shRNA-vermitteltem Knock-down und
Überexpression von USP10 eine Regulation der β-Catenin-Stabilität durch USP10 in
Darmkrebs-Zelllinien nachweisen. Es ist allgemein bekannt, dass 2D-Zellkultursysteme
die Komplexität, Architektur und Heterogenität nicht widerspiegeln und daher nicht
geeignet sind, um komplexe biologische Fragen zu beantworten. Um dies zu überwinden,
haben wir die Isolierung, Kultivierung und genetische Veränderung von murinen Dar-
morganoiden etabliert und dieses System genutzt, um die Rolle von Usp10 ex vivo zu
untersuchen. Durch die Durchführung von RNA-Sequenzierungen in Abhängigkeit von
unterschiedlichen Usp10-Spiegeln konnten wir die bisherigen Ergebnisse rekapitulieren
und Usp10 als wichtigen Regulator der β-Catenin-abhängigen Regulation der Stammzell-
homöostase nachweisen.
Da die genetische Depletion von USP10 zu einer Herunterregulierung der β-Catenin-
abhängigen Transkription führte, wurde auch die therapeutische Intervention von USP10
in Darmkrebs untersucht. Kommerzielle und neu entwickelte Inhibitoren wurden auf
ihre Wirksamkeit gegen USP10 getestet, konnten jedoch die Aktivität von USP10 in
Darmkrebs- Zellen nicht hemmen. Um die Erkenntnisse aus dieser Arbeit auch in vivo
zu validieren, wurde mit der Entwicklung eines neuartigen Mausmodells für Darmkrebs
begonnen. Durch die Kombination von CRISPR/Cas9 und klassischer Gentechnik mit
viralen Injektionsstrategien konnten WT- und gentechnisch veränderte Mäuse trans-
formiert werden und zumindest bei einigen Tieren waren Darmläsionen auf mikroskopis-
cher Ebene nachweisbar.
Die Inhibtierung von USP10, als de novo tumorspezifischer Regulator von β-Catenin,
könnte eine neue therapeutische Strategie für Darmkrebs-Patienten werden.
KW  - Biomedizin
KW  - Biomedicine
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-319579
ER  -