TY - THES A1 - Bargul, Joel Ltilitan T1 - Characterization of motility and erythrocyte adherence as virulence factors in African trypanosomes T1 - Charakterisierung der Motiliät und Erythrozytenadhärenz als Virulenzfaktoren bei Afrikanischen Trypanosomen N2 - Pathogens causing African animal trypanosomiasis (AAT), the major livestock disease in sub-Saharan Africa, belong to the salivarian group of the African trypanosomes, which are transmitted by the bite of the tsetse fly (Glossina spec.). T. vivax, T. congolense and T. brucei brucei are major pathogens of cattle in particular, causing nagana, with dramatic socio-economic consequences for the affected regions. The parasites additionally have a huge reservoir of other livestock and wild animal hosts. T. brucei, the species which also includes the subspecies pathogenic to humans causing sleeping sickness, has been extensively studied as the cultivatable model trypanosome. But less is known about the other salivarian species, which are not routinely held in culture, if at all possible. A hallmark of trypanosomal lifestyle is the protozoan flagellates incessant motility, which enables them to populate an enormous range of habitats in very diverse hosts. We were now able to characterize, for the first time with high spatiotemporal resolution microscopy, the swimming behaviour and mechanism of the most relevant salivarian species isolated directly from blood. We show the influence of viscosity on the motility of bloodstream form (BSF) cells and simulate their movement between erythrocytes, giving a clear picture of how all analyzed species move under varying environmental conditions. We show that although the basic mechanism of flagellar motility applies to all analyzed species, there are clear morphological differences that produce different reactions to the physical environment. We could define specific conditions for highly increased swimming persistence and speed for compared to the behaviour in standard culture. These results have important implications for the parasites survival strategies in the host, e.g. regarding the capacity for antibody clearance. Although we show all species to effectively remove antibodies from the cell surface, T. congolense differed markedly in its motility behaviour, which gives rise to interesting questions about this species behaviour in the bloodstream. Most of the T. congolense parasites (and to a lesser extent T. vivax) adhere to sheep erythrocytes. Further in vitro studies showed that T. congolense and T. vivax adhered to rabbit, goat, pig and cattle erythrocytes- but binding behaviour was absent in murine blood. Notably, both T. brucei and T. evansi lacked adherence to all studied host erythrocytes. Generally, attachment to blood cells caused reduction of swimming velocities. Judging from its cell architecture, as well as the motility studies in higher media viscosity and in micropillar arrays, T. congolense is not adapted to swim at high speeds in the mammalian bloodstream. Low swimming speeds could allow these purely intravascular parasites to remain bound to the host erythrocytes. N2 - Die wichtigste Viehseuche des subsaharischen Afrika, die afrikanische Trypanosomiasis (AAT), wird durch Pathogene ausgelöst, die zu einer Gruppe der afrikanischen Trypanosomen gehört, die durch den Stich der Tsetsefliege übertragen werden (Salivaria). T. vivax, T. congolense und T. brucei brucei sind die Haupt-Erreger in Rindern, wo sie Nagana verursachen, mit dramatischen sozio-ökonomischen Folgen für die betroffenen Regionen. Die Parasiten haben zusätzlich ein riesiges Reservoir an Zucht- und Wildtieren als Wirte zur Verfügung. T. brucei, die Spezies die auch die humanpathogenen Subspezies umfasst, die Erreger der Schlafkrankheit, ist eingehend als das kultivierbare Trypanosomenmodell untersucht worden, aber es ist weniger über die anderen Salivaria Spezies bekannt, die nicht routinemäßig in Kultur gehalten werden, wenn überhaupt die Möglichkeit besteht. Ein Kennzeichen des trypanosomalen Lebensstils ist die unablässige Motilität der protozooischen Flagellaten, die es ihnen ermöglicht eine riesige Bandbreite an Habitaten in sehr diversen Wirten zu besiedeln. Wir waren in der Lage, zum ersten Mal mit räumlich und zeitlich hochauflösender Mikroskopie, das Schwimmverhalten und den Schwimmmechanismus der wichtigsten Salivaria Spezies zu charakterisieren, die direkt aus dem Blut isoliert wurden. Wir zeigen wie Viskosität die Motilität der Blutstromform (BSF)-Zellen beeinflußt und simulieren deren Bewegung zwischen Erythrozyten. Durch diese Ergebnisse erhalten wir ein klares Bild davon, wie die analysierten Spezies sich unter variierenden experimentellen Bedingungen bewegen. Wir zeigen, dass obwohl der grundlegende Mechanismus der flagellaren Motilität bei allen Spezies gleich ist, es klare morphologische Unterschiede gibt, die verschiedene Reaktionen auf die physikalische Umgebung zur Folge haben. Wir konnten spezifische Konditionen für stark erhöhte Persistenz und Schwimmgeschwindigkeit, im Vergleich zum Verhalten in der Standardkultur, bei T. vivax, T. evansi and T. brucei definieren. Diese Ergebnisse haben wichtige Implikationen für die Überlebensstrategien im Wirt, z.B. bezüglich der Kapazität für die Antikörperentfernung. Obwohl wir zeigen konnten, dass alle Spezies effektiv gebundene Antikörper von ihrer Oberfläche entfernen können, unterscheidet sich T. congolense stark in seinem motilen Verhalten, was interessante Fragen über das Verhalten dieser Spezies im Blutstrom aufwirft. Die meisten T. congolense Parasiten (und in geringerem Ausmaß T. vivax) adhärieren an Erythrozyten des Schafs. Weitere in vitro Versuche zeigten, dass T. congolense und T. vivax auch an Erythrozyten von Kaninchen, Ziege, Schwein und Rind binden, aber nicht im Blut von Mäusen. Interessanterweise adhärierten weder T. brucei noch T. evansi an Erythrozyten irgendeiner Wirts-Spezies. Im Allgemeinen hat die Bindung an Erythrozyten eine Reduktion der Schwimmgeschwindigkeit zur Folge. Nach der Zellarchitektur und dem Verhalten in Medien höherer Viskosität und zwischen Micropillar-Strukturen zu urteilen, ist T. congolense nicht adaptiert, um mit hohen Geschwindigkeiten im Blutstrom von Säugern zu schwimmen. Niedrige Schwimmgeschwindigkeiten könnten diesem rein intravaskulären Parasiten erlauben an den Erythrozyten des Wirts haften zu bleiben. KW - Motiliät KW - African trypanosomes KW - Trypanosomen KW - Erythrozyt KW - motility KW - Antibody clearance KW - erythrocyte adherence KW - Adhäsion KW - Virulenzfaktor KW - Erythrozytenadhärenz Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115053 ER - TY - THES A1 - Jung, Jamin T1 - Precise timing of the trypanosome cell division cycle T1 - Präzises Timing des trypanosomalen Zellzyklus N2 - African trypanosomes are the causative agents of fatal diseases in humans and livestock. Trypanosomes show a complex lifecycle and shuttle between the transmitting vector, the tsetse (Glossina spec.), and the mammalian host. As a result of this the parasite undergoes tremendous changes in morphology and metabolism to adapt to the different living environments. The two best-studied lifecycle stages are the procyclic forms (PCF) that live in the tsetse fly and the proliferative bloodstream form (BSF) that resides in the mammalian blood. The most conspicuous weapon that trypanosomes use to evade the host immune attack is a dense layer of a single protein type, the variant surface glycoprotein (VSG), which shields the entire cell surface. Immune evasion required high rates of surface membrane turnover and surface coat recycling. Trypanosomes show highly polarised cell architecture with all major eukaryotic organelles (endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, endosomal apparatus, lysosome, mitochondrion and peroxisome-like glycosomes) generally present in single copy. Furthermore, trypanosomes possess a single flagellum, which is important not only for cellular motility but also for cell division. How the duplication of all these cellular components is coordinated in order to progresss through the cell division cycle is poorly understood. We used trypanosomes as a model organism due to the relative simplicity and the polarised nature of their cell architecture and determined the duplication of all their compartments. This was only possible due to a new synchronisation approach developed during this project. In the first part of the thesis a precise temporal map of the cell division cycle of the BSF T. brucei cell division cycle was generated. By the use of well-described morphological markers (K/N status, new flagellum outgrowth and DNA synthesis) the position of individual cells was determined with high temporal resolution; this allowed us for the first time to synchronise a cell population in silico without affecting the naturally asynchronous growth. In the second part of the thesis we used this tool to follow duplication events of the Major organelles during progression through the cell division cycle. We precisely determined the time points of organelle duplication and found that it is ordered in trypanosomes. Furthermore we found that BSF T. brucei cells do not grow continuously, cell size start to increase rapidly, during a short period of time, late in the cell division cycle. We speculate that the initiation of cell volume increase is temporally separated from the formation of all secretory organelles in order to ensure maintenance of the protective coat, which must remain intact at all times in order for BSF trypanosomes to be able to evade the host immune response. N2 - Afrikanische Trypanosomen sind Erreger fataler Krankheiten sowohl bei Menschen also auch bei Nutztieren. Trypanosomen weisen einen komplexen Lebenszyklus auf und wechseln hierbei zwischen ihrem Überträger, der Tsetse Fliege (Glossina spec.) und ihrem Säugerwirt. Hieraus resultierend, erlebt der Parasit dramatische Veränderungen der Zellmorphologie und des Zell- metabolismus um sich an die jeweiligen Lebensräume anzupassen. Die zwei am besten unter- suchten Lebensstadien sind die Prozyklische Form (PCF), welche in der Tsetse Fliege vor- kommt und die Blutstrom Form, welche im Säugerwirt zirkuliert. BSF Trypanosomen leben extrazellulär im Säugerblut und sind hier kontinuierlich der Immunabwehr des Wirtes ausge- setzt. Durch einen dichten Proteinmantel eines einzigen Proteintyps, dem variablen Oberflä- chenglykoproteins (VSG) ummantelt der Parasit seine Zelloberfläche und schützt so invariable Proteine vor der Erkennung durch das Immunsystem. Um diesen VSG Mantel aufrecht zu er- halten werden enorm hohe Raten an Oberflächen-membran- und VSG- Recycling benötigt. Trypanosomen weisen eine hoch polarisierte Zellarchitektur auf und die wichtigen Organellen (Endoplasmatisches Retikulum, Golgi Apparat, Endosomaler Apparat, Lysosome, Mitochondri- um und Glykosomen) sind generell in einfacher Kopie vorhanden. Weiterhin besitzen Trypano- somen ein einzenes Flagellum welches sowohl für die Bewegung als auch die Zellteilung des Parasiten von großer Bedeutung ist. All diese Bestandteile müssen während des Zellzyklus verdoppelt werden um zwei lebensfähige Tochterzellen zu generieren. Über die Koordinierung und die Mechanismen der Organellenteilung ist kaum etwas bekannt. Wir nutzen den einfachen Zellaufbau und die polarisierte Zellarchitektur von Trypanosomen um die Verdopplung der zel- lulären Bestandteile zu untersuchen. Dies war jedoch nur durch einen neuen Synchronisie- rungsansatz möglich der im Rahmen dieser Arbeit entwickelt und etabliert wurde. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine zeitlich hoch aufgelöste Kartierung des Zellzyklus vorge- nommen. Wir nutzen morphologisch gut beschriebene Marker um die Position einzelner Zellen im Zellzyklus zeitlich sehr genau zu bestimmen, somit kann eine in silico Synchronisierung durchgeführt werde ohne das natürliche Verhalten der Zellpopulation zu beeinflussen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde mittels dieser zeitlichen Zellzykluskarte der Teilungszeitpunkt aller wichtigen Organellen bestimmt. Hierbei fanden wir heraus, dass die Teilung der Zellorga- nellen in einer definierten Reihenfolge stattfindet. Weiterhin konnten wir zeigen, dass Trypano- somen nicht kontinuierlich wachsen, die Zelle wächst in einer relativ kurzen Phase, spät im Zellzyklus. Wir vermuten, dass die Teilung der sekretorischen Organellen und das Zellwachs- tums zeitlich voneinander getrennt sind um so den schützenden Proteinmantel, der für das überleben im Blut unabdingbar ist, aufrecht zu erhalten. KW - Zellteilung KW - Trypanosomes KW - Trypanosomen KW - Zellbiologie Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114932 ER - TY - THES A1 - Bartossek, Thomas T1 - Structural and functional analysis of the trypanosomal variant surface glycoprotein using x-ray scattering techniques and fluorescence microscopy T1 - Strukturelle und funktionale Analyse des variablen Oberflächenproteins von Trypanosoma brucei mithilfe vön Röntgenstreutechniken und Fluoreszenzmikroskopie N2 - Trypanosoma brucei is an obligate parasite and causative agent of severe diseases affecting humans and livestock. The protist lives extracellularly in the bloodstream of the mammalian host, where it is prone to attacks by the host immune system. As a sophisticated means of defence against the immune response, the parasite’s surface is coated in a dense layer of the variant surface glycoprotein (VSG), that reduces identification of invariant epitopes on the cell surface by the immune system to levels that prevent host immunity. The VSG has to form a coat that is both dense and mobile, to shield invariant surface proteins from detection and to allow quick recycling of the protective coat during immune evasion. This coat effectively protects the parasite from the harsh environment that is the mammalian bloodstream and leads to a persistent parasitemia if the infection remains untreated. The available treatment against African Trypanosomiasis involves the use of drugs that are themselves severely toxic and that can lead to the death of the patient. Most of the drugs used as treatment were developed in the early-to-mid 20th century, and while developments continue, they still represent the best medical means to fight the parasite. The discovery of a fluorescent VSG gave rise to speculations about a potential interaction between the VSG coat and components of the surrounding medium, that could also lead to a new approach in the treatment of African Trypanosomiasis that involves the VSG coat. The initially observed fluorescence signal was specific for a combination of a VSG called VSG’Y’ and the triphenylmethane (TPM) dye phenol red. Exchanging this TPM to a bromo-derivative led to the observation of another fluorescence effect termed trypanicidal effect which killed the parasite independent of the expressed VSG and suggests a structurally conserved feature between VSGs that could function as a specific drug target against T. b. brucei. The work of this thesis aims to identify the mechanisms that govern the unique VSG’Y’ fluorescence and the trypanocidal effect. Fluorescence experiments and protein mutagenesis of VSG’Y’ as well as crystallographic trials with a range of different VSGs were utilized in the endeavour to identify the binding mechanisms between TPM compounds and VSGs, to find potentially conserved structural features between VSGs and to identify the working mechanisms of VSG fluorescence and the trypanocidal effect. These trials have the potential to lead to the formulation of highly specific drugs that target the parasites VSG coat. During the crystallographic trials of this thesis, the complete structure of a VSG was solved experimentally for the first time. This complete structure is a key component in furthering the understanding of the mechanisms governing VSG coat formation. X-ray scattering techniques, involving x-ray crystallography and small angle x-ray scattering were applied to elucidate the first complete VSG structures, which reveal high flexibility of the protein and supplies insight into the importance of this flexibility in the formation of a densely packed but highly mobile surface coat. N2 - Trypanosoma brucei ist ein eukaryotischer Parasit welcher bei Menschen und Nutztieren schwere Krankheiten auslöst. Der Protist lebt extrazellulär im Blutstrom seines Säugetier-Wirtes, in welchem er unter konstantem Angriff durch das Wirts-Immunsystem steht. Als ausgeklügelte Methode zur Umgehung der Immunantwort besitzt der Parasit einen dichten Oberflächenmantel des variablen Oberflächen-Glycoproteins (VSG), welcher die Identifikation invariabler Oberflächenproteine durch das Immunsystem erschwert und Wirts-Immunität gegen den Parasiten verhindert. Der gebildete VSG-Mantel muss gleichzeitig eine hohe Dichte besitzt, um invariable Oberflächenproteine vor Immundetektion zu beschützen, und eine hohe Mobilität aufweisen, um ein schnelles Recycling des Schutzmantels während Immunantworten zu gewährleisten. Dieser Mantel schützt den Parasiten effektiv vor dem Wirts-Immunsystem und führt bei fehlender Behandlung des Patienten zur persistenten Parasitemie durch Trypanosoma brucei. Die verfügbaren Behandlung gegen die Afrikanische Trypanosomiasis beinhaltet die Benutzung von Medikamenten welche ihrerseits z.T. stark toxisch sind und den Tod des Patienten verursachen können. Ein Großteil der verfügbaren Medikamente wurden zu Beginn des letzten Jahrhunderts entwickelt und stellen trotz anhaltenden Entwicklungen noch immer die beste Lösung im Kampf gegen den Parasiten dar. Die Entdeckung eines fluoreszierenden VSGs deutete auf eine Interaktionen zwischen dem VSG Mantel und Bestandteilen des umgebenden Medium hin, welche die Entwicklung von Medikamenten mit dem VSG Mantel als Drug Target ermöglichen könnte. Das ursprünglich beobachtete Fluoreszenz-Signal war spezifisch für eine Kombination eines VSG namens VSG’Y’ und dem Triphenylmethan (TPM) Phenolrot. Der Austausch von Phenolrot gegen ein Brom-Derivat führte zur Beobachtung eines weiteren Fluoreszenz-Effekts, welcher unabhängig vom exprimierten VSG auftritt und letal für den Parasiten ist. Dieser so genannten Trypanozide Effekt lässt auf konservierte Strukturen schließen, welche von allen VSGs geteilt werden und als hochspezifisches Drug Target gegen T. b. brucei fungieren könnten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen zu identifizieren, welche die einzigartige VSG’Y’-Fluoreszenz und den Trypanoziden Effekt auslösen. Fluoreszenz-Experimente und Protein-Mutagenese von VSG’Y’, sowie röntgenkristallographische Analysen mit mehreren unterschiedlichen VSGs wurden in dem Bestreben durchgeführt, die Bindung zwischen VSGs und TPMs zu charakterisieren, potentiell konservierte Strukturen von VSGs zu finden und die Mechanismen der einzigartigen VSG’Y’-Fluoreszenz und des Trypanoziden Effekts zu identifizieren. Diese Arbeiten haben das Potenzial die Formulierung hochspezifischer Medikamente mit VSGs als Drug Target anzutreiben. Im Rahmen der kristallographischen Analysen wurden die ersten vollständigen VSG Strukturen ermittelt, welche eine hohe Bedeutung für das Verständnis über die Bildung des VSG-Mantels haben. Die VSG Strukturen wurden u.a. per Röntgenkristallographie und Kleinwinkel-Röntgenstreuung aufgeschlüsselt und zeigten dass VSGs ein hohes Maß an Flexibilität besitzen. Diese Flexibilität ist wichtig für die Bildung eines dichten und hochmobilen VSG-Mantels. KW - Trypanosoma brucei brucei KW - Röntgenstrukturanalyse KW - Röntgen-Kleinwinkelstreuung KW - Mutagenese KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Variables Oberflächen Glycoprotein KW - VSG Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144775 ER -