TY - THES A1 - Roth, Markus T1 - Etablierung eines isogenen Zelllinienmodells zur Untersuchung der Bedeutung mono- und biallelischer TP53-Inaktivierungen beim Multiplen Myelom T1 - Establishment of an isogenic cell line model for the investigation of the impact of mono- and biallelic TP53-inactivation on multiple myeloma N2 - Trotz der Fortschritte in der Therapie des Multiplen Myeloms und des stetig wachsenden Arsenals effektiver anti-MM-Medikamente muss ein Teil der Patienten mit bestimmten zytogenetischen Veränderungen der Tumorzellen nach wie vor der Hochrisiko-Gruppe zugeordnet werden und hat eine Lebens-erwartung von nur wenigen Jahren. Einer der ungünstigsten prognostischen Marker ist die Inaktivierung des Tumorsuppressorgens TP53 durch Mutationen des Gens oder Deletionen des kurzen Arms von Chromosom 17, del(17p). Diese wird häufig mit einer Chemoresistenz der entarteten Plasmazellen in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit gelang es mittels des CRISPR/Cas9-Systems TP53-Läsionen zu erzeugen und isogene Klone der TP53wt/wt Zelllinie AMO-1 zu generieren. Diese wurden anhand der Sequenzanalysen von beiden TP53-Allelen den Gruppen der biallelisch TP53-inaktivierten, der monoallelisch TP53-inaktivierten und der TP53wt/wt Klone zugeordnet. Das gruppenspezifische Verhalten der Klone aller drei Gruppen hinsichtlich deren Expression von p53, p21 und Mdm2 unterstrich die Validität des etablierten Zelllinienmodells zur Untersuchung der Bedeutung von TP53-Läsionen beim Multiplen Myelom. Neben einer kompletten Ausschaltung durch biallelische TP53-Inaktivierung zeigten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auch eine Haploinsuffizienz des p53-Systems. Diese äußerte sich in einer Abschwächung der Nutlin-3A-abhängigen p53-, p21- und Mdm2-Induktion bereits nach Inaktivierung eines TP53-Allels durch Frameshift-Mutation. Korrelierend zu dem Proteinexpressions¬muster konnte eine zunehmende Resistenzentwicklung der Klone je nach Grad der TP53-Inaktivierung (mono- bzw. biallelisch) gegen Nutlin 3A sowie genotoxische Substanzen nachgewiesen werden, während die Sensibilität der MM-Zellen gegen Proteasominhibitoren unbeeinträchtigt blieb. Einschränkungen hinsichtlich der Übertragbarkeit der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf das Multiple Myelom im Allgemeinen bestehen in dem Umstand, dass die beschriebenen Beobachtungen lediglich an einer einzigen MM-Zelllinie gemacht werden konnten. Dies ist durch die geringe Auswahl an TP53wt/wt MM-Zelllinien, die zudem noch oft eine schlechte Transfektabilität und niedrige Zellteilungsrate nach Einzelzellselektion aufweisen, bedingt. Die an der Zelllinie AMO-1 gemachten Beobachtungen stehen in Einklang mit der in klinischen Studien festgestellten Verkürzung des progressionsfreien- (PFS) und Gesamt-Überlebens (OS) bei MM-Patienten mit TP53-Alterationen. Die zunehmende Chemoresistenz der malignen Plasmazellen nach mono- bzw. biallelischer TP53-Inaktivierung kann als Grund für die Akkumulation entsprechender Klone im Rezidiv und in fortgeschrittenen Krankheitsstadien des MM angesehen werden. Mittels möglichst umfassender Erfassung des genauen TP53-Läsions-Status in zukünftigen klinischen Studien zu multiplen Zeitpunkten des Krankheitsverlaufs könnte der Einfluss verschiedener, in der Therapie des MM zum Einsatz kommender Substanzen auf die Selektion bzw. die Unterdrückung besonders virulenter Subklone mit TP53-Läsionen untersucht werden. N2 - Despite the current huge improvements in the therapy of multiple myeloma, patients with TP53-inactivation have a poor PFS and OS. In the present work, it succeeded to establish isogenic clones of the TP53wt/wt-cell-line AMO-1 via CRISPR-Cas9-engineering. These clones could successfully be grouped in TP53wt/wt, TP53wt/- and TP53-/- clones by detection of p53 expression after overnight treatment with the mdm2-inhibitor nutlin-3a and by TP53-sequencing. All clones showed a group-specific induction of p53, p21 and mdm2, being less for the wt/- in comparison to the wt/wt-clones and not detectable for the -/- clones. Subsequently these clones showed a resistance for the treatment with the genotoxic drugs melphalan and etoposide, in contrast to their response on the proteasome inhibitors bortezomib and carfilzomib where no differences could be observed. These observations agree well with the clinically observed dramatic impact of TP53-inactivation on PFS and OS. The development of chemoresistance by TP53-inactivation could be the reason for the accumulation of such clones during relapse after therapy and in advanced stages of the disease. To explore the impact of different therapy-modalities on the development of TP53-inactivated clones might be the aim of future clinical studies. KW - Plasmozytom KW - Muliples Myelom KW - multiple myeloma KW - TP53 KW - p53 KW - CRISPR/Cas9 Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208939 ER - TY - THES A1 - Rossow, Leonie T1 - Einfluss der Lysyloxidase-katalysierten Matrix-Quervernetzung auf Tumorwachstum, -metabolismus und -malignität T1 - Effects of LOX(L)-catalyzed extracellular matrix crosslinking on tumor growth, metabolism and malignity N2 - Die EZM bildet ein Netzwerk quervernetzter Proteine, welches alle Zellen im Tumor umgibt. Sie übt direkte Effekte auf die Medikamenteneinbringung und -verteilung aus und somit auch auf die therapeutische Effizienz von Chemotherapeutika. Die LOX(L)-Proteinfamilie katalysiert die oxidative Desaminierung von Lysinresten in Elastin und Kollagenfasern und ermöglicht dadurch eine intra- und intermolekulare Quervernetzung. Diese wird für die Reifung und Stabilisierung der Kollagene in der EZM benötigt. Eine erhöhte LOX(L)-Expression steigert durch eine verstärkte EZM-Quervernetzung die Gewebesteifheit im Tumor und bildet so eine physikalische Diffusionsbarriere. Durch diese Barriere wird die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen reduziert. Die resultierende Hypoxie im Tumor kann eine fehlgeleitete Angiogenese triggern und zu einer Aktivierung maligner Signalkaskaden führen. In dieser Arbeit wurden durch eine LOX(L)-Inhibierung mittels βAPN einerseits und eine ektopische LOX-/LOXL2-Überexpression andererseits Auswirkungen solcher Eingriffe auf verschiedene Indikatoren wie Zellproliferation und apoptose, Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen, Angiogenese, Hypoxie, Makrophageninfiltration und die Expression verschiedener Wachstumsfaktoren analysiert. Die Versuche wurden an fünf verschiedenen Tumoren (4T1-, E0771- und EMT6-Brustkarzinome, LLC-Lungenkarzinome und MT6-Fibrosarkome) durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren eine direkte Verbindung zwischen der EZM und einer Therapieresistenz. Nach βAPN-Behandlung konnte eine verbesserte Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen beobachtet werden, welches in einer Verringerung maligner Signalkaskaden und folglich auch in einer verbesserten Vaskularisierung resultierte. Als Konsequenz wurde die therapeutische Effizienz von Chemotherapeutika verbessert. Im Gegensatz dazu führte eine LOX-/LOXL2-Überexpression zu einer erhöhten Therapieresistenz. Die vorliegende Studie zeigt, dass die Modifizierung der EZM durch eine Hemmung von LOX(L) das Potenzial birgt, das Ansprechen von Chemotherapeutika in der Behandlung von Krebserkrankungen zu verbessern. N2 - The extracellular matrix (ECM) forms a network of cross-linked proteins, which surrounds all cells in the tumor. The ECM has direct effects on the accumulation and distribution of drugs and therefore also on the therapeutic efficacy of chemotherapeutics. The LOX protein family catalyzes the oxidative deamination of lysin-residues in elastins and collagen fibers and as a consequence allows an intra- and intermolecular crosslinking. This is necessary for the maturation and stabilization of the collagens in the ECM. An elevated LOX(L)-expression increases the stiffness through a higher cross-linked ECM and thus builds a physical diffusion barrier. Because of this barrier the oxygen and nutritional supply is limited. The resulting hypoxia in the tumor could promote errant angiogenesis and lead to an activation of malign signal cascades. In this dissertation, effects on different influences were examined on the one hand through a LOX(L)-inhibition with βAPN and on the other hand through an ectopic LOX /LOXL2-overexpression. These influences were cell proliferation and -apoptosis, supply with oxygen and nutrients, angiogenesis, hypoxia, infiltration of macrophages and the expression of various growth factors. The experiments were performed on five different tumor models (4T1, E0771, EMT6 breast carcinomas, LLC lung carcinomas and MT6 fibrosarcomas). The results of this work demonstrate a direct link between the ECM and a therapeutic resistance of tumors. After βAPN-treatment a better supply with oxygen and nutrients could be determined, which ended up in a reduction of malign signal cascades and thus in a better vascularization. As a consequence the therapeutic efficacy of chemotherapeutics was improved. In contrast, LOX /LOXL2-overexpression lead to a higher therapeutic resistance. This dissertation shows that modification of the ECM through LOX(L)-inhibition has the potential to improve response of chemotherapeutics in the treatment of cancer. KW - Lysyl-Oxidase KW - Tumor KW - β-Aminopropionitril Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-180346 ER - TY - THES A1 - Müller, Sophie T1 - Retrospektive Datenauswertung des Tumorregisters Würzburg im Zeitraum 2005 – 2013 bei Patienten mit Nicht-Kleinzelligem-Bronchialkarzinom (NSCLC) mit besonderer Betrachtung der Tyrosinkinaseinhibitor-Therapie bei EGFR-Mutation T1 - Retrospektive data evaluation of the tumor registry Würzburg from 2005-2013 analysing patients with non-small-cell lung cancer (NSCLC) with special regard to tyrosine kinase inhibitor (TKI) therapy in case of EGFR-mutation N2 - Das Bronchialkarzinom ist die häufigste Krebstodesursache unter Männern in Deutschland. Bei Frauen liegt es auf dem zweiten Platz, allerdings besteht aktuell eine Tendenz das Mammakarzinom zu überholen. 2014 erkrankten in Deutschland 53.840 Menschen an Lungenkrebs. Auf Grund der demographischen Entwicklung und der zunehmenden Inzidenz wird mit einem weiteren Anstieg der Neuerkrankungsraten in den nächsten Jahren gerechnet. Da es aktuell keine wirksamen Screening Programme gibt und der Großteil der Erkrankungen erst in einem fortgeschrittenen Stadium entdeckt wird, nimmt auch die Bedeutung an individualisierten palliativen Therapien weiter zu. In der vorliegenden Auswertung wurde untersucht, ob sich bei Patienten mit einem fortgeschrittenen Bronchialkarzinom und einer aktivierenden EGFR-Mutation unter einer TKI-Therapie ein Überlebensvorteil gegenüber einer konventionellen platinbasierten Chemotherapie zeigt. Die Daten hierfür wurden retrospektiv aus dem Tumorregister des CCC-MF gewonnen, um eine Untersuchung unter „real life“ Bedingungen zu ermöglichen. Grundlage der Auswertung bildeten Patienten, die von 2005 bis 2013 an einem Bronchialkarzinom erkrankten und am UKW behandelt wurden. Das Follow-up wurde am 31.05.2016 beendet. Insgesamt wurden 1154 Fälle gefunden, von denen 898 an einem NSCLC litten. Die weiteren Auswertungen haben sich auf das NSCLC-Kollektiv beschränkt. Aus der Datenbank des Tumorregisters, der Datenbank der Pathologie des UKW sowie mit Hilfe des Patientendokumentationsprogrammes SAP wurden folgenden Parameter erhoben: Geschlecht, Alter bei Diagnose, Diagnosejahr, Tumorstadium, Histologie, EGFR-Mutationsstatus, ECOG, Art der Therapien, TKI-Therapie Zweitmalignome, Metastasenlokalisationen sowie das Gesamtüberleben und ggf. der Todeszeitpunkt. Nach ausführlichen Recherchen konnten die meisten Parameter vollständig ermittelt werden. Lediglich beim EGFR-Mutationsstatus bestand die Limitation, dass nicht alle Patienten eine Mutationsanalyse erhalten hatten. Aus diesem Grund gibt es für einige Patienten eine unbekannte EGFR-Situation. 50 Vergleicht man die deskriptiven Ergebnisse mit Angaben aus der Literatur, konnte eine repräsentative Verteilung der Patientenmerkmale ermittelt werden, sodass eine Relevanz der Ergebnisse angenommen werden kann. Die Geschlechterverteilung im NSCLC-Kollektiv war 65,8 % Männer und 34,2 % Frauen. Das durchschnittliche Erkrankungsalter lag für Männer bei 66,2 Jahren und für Frauen bei 64,1 Jahren. Mit über 50 % fand sich bei den histologischen Typen vor allem das Adenokarzinom vor. Plattenepithelkarzinome hatten einen Anteil von 24,4 %. Wie aus der Literatur bekannt, befand sich ein Großteil der Patienten bei Diagnosestellung bereits in einem fortgeschrittenen Stadium. Das UICC-Stadium IV machte dabei 48,8 % und das UICC-Stadium IIIB 11,0 % des Gesamtkollektivs aus. 178 Patienten erhielten im Laufe des Beobachtungszeitraumes eine Therapie mit einem TKI. Darunter befanden sich, über alle Stadien hinweg, 26 Patienten mit einer positiven EGFR-Mutation. Insgesamt trat die EGFR-Mutation zum Großteil unter Adenokarzinom-Histologie auf. Frauen hatten signifikant häufiger einen positiven EGFR-Mutationsnachweis als Männer. Das mediane Überleben betrug für alle 898 Patienten 16,9 Monate. Getrennt nach Geschlechtern hatten Frauen mit 22,6 Monaten medianem Überleben einen signifikanten Vorteil gegenüber Männern mit nur 15,6 Monaten. Ebenso fand sich bei Patienten mit einer bronchioloalveolären Histologie ein signifikanter Überlebensvorteil gegenüber allen anderen histologischen Typen. Im Gegensatz dazu hatten großzellige Karzinome ein signifikant schlechteres Überleben als die anderen Histologien. Ein weiterer wichtiger Einflussfaktor auf die Prognose stellt das UICC-Stadium dar. So nehmen mit steigendem UICC-Stadium das mediane Überleben sowie das 5-JÜL ab. Die Auswertung der TKI-Therapie gestaltete sich schwieriger als primär angenommen. Vor allem der sogenannte „immortal time bias“, welcher bereits aus anderen Studien bekannt war, sollte einen möglichst geringen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Aus diesem Grund wurde ein adaptiertes Matched-Pairs-Verfahren für die Analysen verwendet. Dabei wurde zur besseren Vergleichbarkeit eine homogene Gruppe für die TKI-Auswertung ermittelt. Kriterien hierfür waren: Adenokarzinom-Histologie, UICC-Stadium IV, Alter bei 51 Diagnose 40 – 80 Jahre, ECOG 0 – 2, und eine mindestens 3-monatige Follow-up Zeit. Matches wurden anhand des Propensity Scores gefunden und mittels Kaplan-Meier-Kurven ausgewertet. Beim Vergleich der Gruppe von Patienten mit negativem EGFR-Mutationsstatus fand sich kein Überlebensvorteil für eine TKI-Therapie im Gegensatz zu einer konventionellen platinbasierten Chemotherapie. Bei Patienten mit einer aktivierenden Mutation im EGFR-Gen fand sich unter einer TKI-Therapie ein signifikant längeres Gesamtüberleben als in der Vergleichsgruppe unter konventioneller Chemotherapie. Die Daten sprechen dafür, dass die Ergebnisse aus klinischen Studien mit den Daten des Tumorregisters Würzburg reproduzierbar sind. Bei nachgewiesener EGFR-Mutation die TKI-Therapie ein deutlich längeres Überleben für den Patienten bietet. Trotz der signifikant längeren Überlebenszeit von median 22,5 Monaten zu 15,0 Monaten, zeigte sich ein prognostischer Vorteil hauptsächlich in den ersten beiden Therapiejahren. Dieses Phänomen kann wahrscheinlich auf eine Resistenzentwicklung der Tumorzellen zurückgeführt werden. Insgesamt kann man sich für eine flächendeckende Testung auf EGFR-Mutationen bei fortgeschrittenen Bronchialkarzinomen aussprechen. Patienten sollte bei einer positiven Mutationsanalyse ein TKI als Erstlinientherapie angeboten werden. In anderen Studien wurde bereits gezeigt, dass diese Therapieform auch mit weniger Nebenwirkungen einhergeht. Eine TKI-Therapie kann für Patienten mit positiver EGFR-Mutation eine längere Überlebenszeit in Kombination mit einer besseren Lebensqualität ermöglichen. Wie in einigen Studien bereits untersucht, sollten nicht nur Adenokarzinom Patienten eine Testung erhalten, sondern auch eine Erweiterung auf andere histologische Gruppen stattfinden. Insgesamt ist es wichtig, dass individualisierte Therapien weiter vorangebracht werden. Dabei darf aber nicht vergessen werden, dass diese neuen Therapien sehr kostspielig sind. Daher sollte immer untersucht werden, ob die in klinisch kontrollierten Studien gefundenen Ergebnisse auch unter „real life“ Bedingungen reproduzierbar sind. N2 - This work analysed patients with NSCLC based on the data collected in the tumor registry Würzburg with special focus on patients with palliative stages of disease. At the time of diagnosis more than 50% of the patients suffer from advanced tutor stages representing a not curative situation. EGFR mutation and tyrosine kinase inhibitor therapy were evaluated. In cases of activating EGFR Mutation, a benefit of survival for patients treated with TKI therapy compared with conventional chemotherapy has been observed. In patients without EGFR mutation, no benefit for TKI therapy on survival has been identified. However, TKI therapy showed no inferiority to conventional chemotherapy in these patients. KW - NSCLC KW - TKI KW - Bronchialkarzinom KW - Retrosepektiv Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202776 N1 - aus dem Comprehensive Cancer Center Mainfranken ER - TY - THES A1 - Dufner, Vera Christine T1 - Effektivität und Sicherheit von Blinatumomab im Long-term Follow-up bei Non-Hodgkin-Lymphom-Patienten T1 - Long-term Follow-up of safety and efficacy of Blinatumomab in Non-Hodgkin-Lymphoma patients N2 - Das Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) steht an siebter Stelle der Inzidenzen aller Krebserkrankungen, mit jährlich steigender Tendenz. Wie kann einer so gefährlichen und heterogenen Krankheitsentität in der heutigen Medizin angemessen begegnet werden? Neben etablierten Therapien, die geraden bei rezidivierten oder refraktären NHL an ihre Grenzen stoßen, bieten experimentelle Therapieansätze neue Hoffnung: Blinatumomab ist ein bispezifischer Antikörper, der durch seine beiden Domänen als Adapter für die T-Zelle und die Tumor-Zelle fungiert und eine Zytolyse der malignen B-Zelle induziert. Bei der ALL fand Blinatumomab schon Anwendung in mehreren klinischen Studien und wurde im Dezember 2014 von der FDA in den USA zur Behandlung von Philadelphia-Chromosom-negativer rezidivierten/ refraktären B-Zell Vorläufer-ALL zugelassen. Als erste klinische Studie an NHL-Patienten wurde von 2004-2011 die MT103/104-Studie veranlasst. Im Zuge dieser unverblindeten, multizentrischen Phase I/II Studie wurden 76 Patienten mit refraktärem und rezidiviertem NHL vier bis acht Wochen mit Blinatumomab als Dauerinfusion behandelt und hierbei Informationen zu Toxizität und Tolerabilität gesammelt. Mit der Langzeitbeobachtung der Würzburger Kohorte aus dieser Studie befasst sich die vorliegende Arbeit. Ziel ist es zunächst, festzustellen, wie lange die Patienten nach Blinatumomab-Therapie im Zuge der MT103/104 Studie gesamt, rezidiv- oder therapiefrei überlebten und ob bei einem bestimmten Patientensubkollektiv ein besonders vorteilhaftes Langzeitüberleben gezeigt werden kann. Die Frage nach der Sicherheit von Blinatumomab beantwortet die Erfassung des Langzeitnebenwirkungsspektrums: Somit werden als zweiter Endpunkt die häufigsten Gründe für Krankenhausaufenthalte nach Blinatumomabtherapie, eventuelle Häufungen einer spezifischen Nebenwirkungsentität und die Reversibilität der unter der Therapie aufgetretenen Nebenwirkungen mit einem selbst entwickelten Fragebogen erfasst. Der MoCA-Test soll neurokognitive Langzeittoxizitäten ausschließen. Die Arbeit konnte nicht nur zeigen, dass Patienten, die auf Blinatumomab ansprachen gegenüber den Patienten ohne Ansprechen ein deutlich längeres Überleben zeigten, sie bestätigte die Wichtigkeit des Erhalts der effektiven Dosis von 60 µg/m²/24h für das Erreichen und den Erhalt der Progressionsfreiheit. Sechs Patienten waren bei Beobachtungsende noch in Remission. Die unterschiedlichen Eindosierungsmodi hatten keinen Effekt auf das Langzeitüberleben, können aber nebenwirkungsbedingte Therapieabbrüche während der Therapie minimieren. Alle während der Therapie aufgetretenen Nebenwirkungen waren in der Langzeitnachbeobachtung vollständig reversibel. Am häufigsten mussten Patienten auf Grund von Infektionen im Verlauf hospitalisiert werden, bei zwei Patienten traten zusätzliche Tumorerkrankungen auf, die allerdings nicht mit der Blinatumomab-Therapie assoziiert waren. Die Rate der Transformationen von indolenten in aggressive NHL war nicht erhöht. Im MoCA-Test lassen sich keine Häufungen von neurokognitiven Defiziten finden. Blinatumomab zeigt sich auch in der Langzeitbeobachtung als ein für die Behandlung von rezidivierten und refraktären NHLs effektives und sicheres Medikament. N2 - The incidence of NHL ranks on seventh position of all cancer types with a tendency to increase year by year. How can we face such a dangerous and heterogenous entity in today’s medicine? Besides established therapy options, which find their boundaries in relapsed or refractory NHL, new, experimental approaches raise new hope: Blinatumomab is a bispecific antibody, which is able to link T-cells to tumor cells, and thus induces cytolysis of the malign B-cell. Blinatumomab was applied in ALL patients in multiple clinical trials and was admitted by the FDA for treatment of Philadelphia-chromosome negative, relapsed or refractory B-cell precursor ALL in December 2014 in the U.S.. The first clinical trial in NHL patients (MT103/104) was initiated 2004-2011. During this open-labeled, multicenter, phase I/II study, 76 patients with relapsed or refractory NHL received Blinatumomab for four to eight weeks as a continous intravenous infusion, whilst data about tolerability and toxicity were collected. The aim of this work is the long-term follow-up of the patients, who were treated in Wuerzburg. First and foremost, the goal is to determine overall, progression-free and therapy-free survival of the patients, who received Blinatumomab during the MT103/104 trial, and if a certain subgroup shows an outstanding long-term survival. The second goal is to acquire long-term safety data and collect the possible spectrum of side-effects after Blinatumomab treatment. Therefore, the most frequent reasons for hospitalization after Blinatumomab administration, potential accumulation of certain side-effects and the reversibility of the witnessed adverse events were recorded by a self-generated questionnaire. The MoCA-test is to exclude long-term neurotoxicity. This work shows, that patients who responded to blinatumomab had a significantly longer OS, PFS and TFS in comparison to patients who did not respond to blinatumomab. The work also confirmed the importance of treatment on a target dose (60 µg/m²/d) in order to achieve and preserve PFS. Six patients were still in remission at the end of observation. The different steps of dosing (single, double, flat) couldn’t show any effect on the long-term survival, but where able to minimize side-effect-related treatment dropouts. Every single witnessed adverse-event during therapy is fully reversible. The most common reason for hospitalization after treatment cessation were infections, two patients experienced other malignancies, however not associated with Blinatumomab treatment. The number of transformations from indolent to aggressive lymphomas was not elevated. The MoCA-test doesn’t show any accumulation of neurocognitive impairment. Thus, Blinatumomab is safe and effective in the treatment of relapsed and refractory NHL. KW - Non-Hodgkin-Lymphom KW - Blinatumomab Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184762 ER - TY - THES A1 - Riekert, Maximilian T1 - Wertigkeit klinischer, instrumenteller und bildgebender Untersuchungsverfahren der Kiefergelenksdiagnostik bei Patienten mit juveniler idiopathischer Arthritis T1 - Validity of clinical, instrumental and imaging examination methods of temporomandibular joint diagnosis in patients with juvenile idiopathic arthritis N2 - Zusammenfassung Ziel: Pathomorphologische Veränderungen der Kiefergelenke treten im Rahmen einer JIA häufig auf. In dieser Arbeit sollten anhand von einer kieferorthopädischen zweidimensionalen Röntgenbildgebung (Orthopantomographie - OPG) pathologische Veränderungen der Kiefergelenke bei JIA-Patienten differenziert und Asymmetrien des Unterkiefers in Abhängigkeit vom Grad der Kondylendestruktion bestimmt werden. Darüber hinaus sollte geprüft werden, wie sich die Krankheitsdauer auf den Befall der Kiefergelenke auswirkt. Zusätzlich wurden zur differenziellen Analyse der Pathomorphologie die klinische Funktionsanalyse (FAL), die Joint Vibration Analysis (JVA) sowie die 3D-Stereophotogrammetrie (3d-Scan) eingesetzt. Ziel war mittels non-invasiver, kostengünstiger und schnell verfügbarer Untersuchungsmethoden eindeutige Parameter zum Befall der Kiefergelenke zu detektieren. Patienten und Methodik: In dieser Arbeit wurden 46 Patientin (28 weiblich; 18 männlich) kaukasischer Herkunft mit diagnostizierter JIA eingeschlossen. Die Kiefergelenke (n = 92) wurden einzeln nach dem Grad ihrer Kondylendestruktion (Grad 0 - 4 nach Billiau et. al. [78]) befundet und in eine leicht betroffene Gruppe 1 (Grad 0, 1 und 2 nach Billiau: röntgenologisch unauffällig, Kondylenerosionen, Kondylenabflachungen) und in eine schwer betroffene Gruppe 2 (Grad 3 und 4 nach Billiau: Kondylusabflachungen mit Erosionen, Komplettverlust des Kondylus) eingeteilt. Zur Quantifizierung von Unterkieferasymmetrien wurde das Seitenverhältnis aus Kondylus-, Ramus- und Mandibulahöhe bestimmt. Der Vergleich der einzelnen klinischen, instrumentellen und bildgebenden Untersuchungsverfahren (OPG, FAL, JVA, 3d-Scan) erfolgte jeweils durch die Gegenüberstellung der schwer betroffenen und der leicht betroffenen Patientengruppe. � Ergebnisse: Erkrankungsdauer: Anhand des Grades der Kondylendestruktion wurden 36 Patienten in die leicht betroffene Gruppe 1 und 10 Patienten in die schwer betroffenen Gruppe 2 eingeteilt. Dabei war die Erkrankungsdauer in der schwer betroffenen Patientengruppe (8,9 ± 5,2 Jahre) signifikant länger, als in der leicht betroffenen Patientengruppe (4,6 ± 4,7; Jahre) (p = 0,031). FAL: Die Ergebnisse der FAL zeigten ausgeprägtere funktionelle Abweichungen in der schwer betroffenen Patientengruppe (Gruppe 2). Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied zur Gruppe 1 ermittelt. Die schwer betroffene Patientengruppe zeigten einen höheren Prozentsatz an von Schmerzen bei Palpation der Kiefergelenke (Gruppe 2: 70,0 % vs. Gruppe 1: 61,1 %) oder Schmerzen bei Mundöffnung (Gruppe 2: 10,0% vs. Gruppe 1: 8,3 %), Deflexionen des Unterkiefers (Gruppe 2: 50,0% vs. Gruppe 1: 33,3 %), Gelenkgeräuschen (Gruppe 2: 80,0 % vs. Gruppe 1: 63,9 %) und Mundöffnungseinschränkungen (Gruppe 2: 60,0 % vs. Gruppe 1: 25,0 %). Die durchschnittliche Mundöffnung betrug in Gruppe 2 40,6 mm, während sie in Gruppe 1 43,5 mm betrug. Bei Patienten mit einer Mundöffnung < 40 mm wurde in Gruppe 2 eine durchschnittliche Mundöffnung von 35,3 mm und in Gruppe 1 von 34,1 mm gemessen. JVA: Sowohl in der gelenkbezogenen, als auch in der patientengruppenbezogenen Analyse der JVA deuteten die Messparameter in der schwer betroffenen Patientengruppe vermehrt auf chronisch-degenerative oder bestehende Ergüsse im Kiefergelenk hin. In der gelenkbezogenen Auswertung zeigte sich dies insbesondere durch eine reduzierte Signalstärke in der schwer betroffenen Patientengruppe (Total power: p = 0,005; Power < 300 Hz: p = 0,006; Power > 300 Hz: 0,003;) sowie in einer signifikant erhöhten Peak Frequenz (p = 0,036). OPG: In der Auswertung der OPGs war die Ratio von Kondylus-, Ramus- und Mandibulahöhe in der schwer Patientengruppe (Ratio 79,6 %, 85,9 %, 86,5 %) signifikant kleiner (Kondylushöhe: p = 0,0005; Ramushöhe: p = 0,0030; Mandibulahöhe: p = 0,0002), als in der leicht betroffenen Patientengruppe (Ratio 93,8 %, Ratio 96,0 %, 95,6 %). Somit ergaben sich in der schwer betroffenen Patientengruppe signifikant stärker ausgeprägte Unterkieferasymmetrien, als in der leicht betroffenen Patientengruppe. 3d-Scan: Im 3d-Scan kam es bei Patienten mit schwer betroffenen Kiefergelenken signifikant häufiger zu Abweichungen des Weichteilkinns von der Medianebene (Gruppe 2: 3,0 mm vs. Gruppe 1: 1,2 mm; p = 0,041) und zu Asymmetrien des Unterkiefers (Gruppe 2: 62,5 % vs. Gruppe 1: 14,8 %; p = 0,015) als bei Patienten mit leicht betroffenem Kiefergelenk. Schlussfolgerung: Es zeigte sich, dass mittels einfacher und schnell verfügbarer Untersuchungsmethoden wie der klinischen Funktionsanalyse, der Joint Vibration Analysis und der OPG-Aufnahme eine Pathologie im Kiefergelenk dargestellt werden kann. Die Methoden können als wichtige Referenz zur Kontrolle der Krankheitsprogression bei Patienten mit JIA dienen. Darüber hinaus ist eine Klassifikation der Kondylen in schwer und leicht betroffene Kiefergelenke mittels pathomorphologischer Analyse möglich. Dabei ist von einem direkten Zusammenhang zwischen Grad der Destruktion, Ausmaß der Unterkieferasymmetrie und Dauer der Erkrankung bei Patienten mit JIA auszugehen. Insgesamt konnte die Wertigkeit klinischer, instrumenteller und bildgebender Untersuchungsverfahren der Kiefergelenksdiagnostik bei Patienten mit juveniler idiopathischer Arthritis dargestellt werden. N2 - Summary Aim: Pathomorphological changes of the temporomandibular joints occur frequently in patients with JIA. In this study, orthodontic two-dimensional X-ray imaging (orthopantomography - OPG) was used to differentiate pathological changes of the temporomandibular joints in JIA patients and to determine asymmetries of the mandible in accordance to the degree of condyle destruction. In addition, it should be examined how the disease duration affects the involvement of the temporomandibular joints. In addition, clinical analysis (FAL), joint vibration analysis (JVA) and 3D stereophotogrammetry (3d-scan) were used for the specific analysis of pathomorphology. The aim was to detect unambiguous parameters for affected temporomandibular joints by means of non-invasive, cost-effective and rapidly available examination methods. Patients and methods: In this study, 46 patients (28 female, 18 male) of Caucasian origin were diagnosed with JIA. The temporomandibular joints (n = 92) were individually evaluated based on the degree of their condylar destruction (Grades 0 - 4 according to Billiau et al. [78]) and divided into a slightly affected group 1 (Grades 0, 1 and 2 according to Billiau: radiologically unremarkable, Condylar erosions, condyle flattening) and into a severely affected group 2 (grade 3 and 4 according to Billiau: condyle flattening with erosions, complete loss of the condyle). To quantify mandibular asymmetries, the ratio of condyle, ramus and mandibular height was determined. The comparison of the individual clinical, instrumental and imaging examination procedures (OPG, FAL, JVA, 3d-Scan) was performed by comparing the severely affected and the slightly affected patient group. Results: Disease duration: Based on the degree of condylar destruction, 36 patients were divided into the slightly affected group 1 and 10 patients to the severely affected group 2. The disease duration was significantly longer in the severely affected patient group (8.9 ± 5.2 years) than in the slightly affected patient group (4.6 ± 4.7 years) (p = 0.031). FAL: The results of the FAL showed more functional deviations in the severely affected patient group (group 2). However, no significant difference to Group 1 was found. The severely affected patients showed a higher percentage of pain in palpation of the temporomandibular joints (group 2: 70.0% vs. group 1: 61.1%) or mouth opening pain (group 2: 10.0% vs. group 1: 8.3%), mandibular deflections (group 2: 50.0% vs. group 1: 33.3%), joint noises (group 2: 80.0% vs. group 1: 63.9%) and mouth opening restrictions (Group 2: 60.0% vs. Group 1: 25.0%). The average mouth opening in group 2 was 40.6 mm, while in group 1 it was 43.5 mm. In patients with a mouth opening <40 mm, an average mouth opening of 35.3 mm was measured in group 2 and 34.1 mm in group 1. JVA: In the joint-related as well as in the patient-group-related analysis of the JVA, the measurement parameters in the severely affected patient group increasingly pointed to chronic degenerative or existing effusions in the temporomandibular joint. In the joint-related evaluation, this was demonstrated in particular by a reduced signal strength in the severely affected patient group (total power: p = 0.005, power <300 Hz: p = 0.006, power> 300 Hz: 0.003;) and in a significantly increased peak frequency (p = 0.036). OPG: In the evaluation of the OPGs, the ratio of condyle, ramus and mandibular height was significantly lower in the severe patient group (ratio 79.6%, 85.9%, 86.5%) (condyle height: p = 0.0005; p = 0.0030, mandibular height: p = 0.0002), than in the slightly affected Patient group (ratio 93.8%, ratio 96.0%, 95.6%). Thus, significantly more pronounced mandibular asymmetries were found in the severely affected patient group than in the slightly affected patient group. 3d scan: In the 3d scan, deviations of the soft tissue chin from the median plane (group 2: 3.0 mm vs. group 1: 1.2 mm, p = 0.041) and mandibular asymmetry were significantly more frequent in patients with severely affected temporomandibular joints (group 2: 62.5% vs. Group 1: 14.8%, p = 0.015) than in patients with slightly affected temporomandibular joints. Conclusion: It has been shown that it is possible to visualize pathology in the temporomandibular joint by means of simple and easily available examination methods such as clinical functional analysis, joint vibration analysis and OPG imaging. The methods can serve as an important reference for controlling disease progression in patients with JIA. In addition, a classification of the condyles in severe and slightly affected temporomandibular joints by means of pathomorphological analysis is possible. There is a direct correlation between the degree of destruction, the extent of mandibular asymmetry and the duration of the disease in patients with JIA. Overall, the value of clinical, instrumental and imaging examination methods of temporomandibular joint diagnosis in patients with juvenile idiopathic arthritis was demonstrated. KW - Kiefergelenkkrankheit KW - Juvenile idiopathische Arthritis KW - Kiefergelenk KW - Orthopantomogramm KW - Kernspintomografie KW - Kiefergelenksarthritis KW - Imaging KW - TMJ KW - Klinische Funktionsanalyse KW - Joint Vibration Analysis KW - Stereophotogrammetrie Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163762 ER - TY - THES A1 - Zhi, Yingjun T1 - Immunhistochemische Analyse der Antikörper PAT-SM6 und PAT-LM1 auf Kolonkarzinomen und deren Metastasen T1 - Immunohistochemical analysis of the antibodies PAT-SM6 and PAT-LM1 of colon cancer and the metastases N2 - Das kolorektale Karzinom stellt die dritthäufigste Tumorerkrankung weltweit dar. Die Risikofaktoren sind vielseitig und werden in exogene und endogene Faktoren eingeteilt. Eine wichtige Präventionsmaßnahme von Kolonkarzinom ist die komplette endoskopische Koloskopie, die ab dem 55. Lebensjahr empfohlen wird. Der Goldstandard zur Behandlung von Kolonkarzinom ist nach wie vor die chirurgische Tumorresektion mit mikroskopisch nachgewiesener Tumorfreiheit. Eine chirurgische Sanierung der Fernmetastasen, welche am häufigsten in der Leber vorkommen, ist bei betroffenen Patienten anzustreben. Eine adjuvante Chemotherapie wird je nach UICC-Stadium des Tumors durchgeführt. Im Gegensatz zur Behandlung einiger maligner Tumorerkrankungen ist der Einsatz von Antikörpern noch kein fester Bestandteil der Therapie von Kolonkarzinomen. In dieser Arbeit wurde Untersuchungsmaterial von 41 Patienten mit Kolonkarzinom, die am Universitätsklinikum Würzburg in den Jahren 1997 bis 2012 behandelt wurden, analysiert. Dabei wurden Paraffinschnitte vom Primärtumor, regionalen Lymphknotenmetastasen und Lebermetastasen der einzelnen Patienten mit 2 verschiedenen monoklonalen IgM-Antikörpern, PAT-SM6 und PAT-LM1, gefärbt und mikroskopisch untersucht. Der Antikörper PAT-SM6 wurde aus einem an einem Magenkarzinom erkrankten Patienten isoliert und bindet an eine Isotyp-Form des 'Glucose-Regulated' Protein (GRP)-78PAT-SM6. Als Zielstruktur des PAT-LM1 Antikörpers wurde eine tumorspezifische Form von NONO (Non-POU domain-containing octamer-binding protein) identifiziert (NONOPAT-LM1). Für beide Rezeptor-Isoformen wurde nachgewiesen, dass sie nur auf malignen epithelialen Zellen, nicht aber auf gesunden Zellen exprimiert werden. Anhand dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PAT-SM6 die Tumorzellen der Lebermetastasen stärker anfärbte als Zellen des Primärtumors. Für die PAT-LM1 Antikörperfärbung wurde ein ähnliches Resultat erzielt. In Bezug auf das Lebensalter der Patienten wiesen die Tumorzellen von älteren Patienten (ab dem 65. Lebensjahr) eine stärkere Antikörperbindung durch PAT-SM6 und PAT-LM1 auf. Interessant war auch die Feststellung, dass die Tumorzellen der Lebermetastasen von verstorbenen Patienten durch PAT-LM1 stärker gefärbt waren als die von zum Untersuchungszeitpunkt noch lebenden Patienten. Die Bindungsunterschiede zwischen PAT-SM6 und PAT-LM1 könnten neue diagnostische und therapeutische Möglichkeiten bei Kolonkarzinomen bieten und somit zukünftig eine individuelle Tumortherapie ermöglichen. N2 - Colorectal carcinoma is one of the most frequently malignant tumor disease worldwide. Two antibodies, PAT-SM6 and PAT-LM1 were used on primary tumor of colon cancer and metastases for the immunohistochemical analyses. It could been shown that both antibodies had a strong affinity to metastases and the tumorcells of older patients. KW - PAT-SM6 KW - PAT-LM1 KW - Kolonkarzinom Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150456 ER - TY - THES A1 - Geiger, Katharina T1 - Etablierung eines Vektorsystems zum shRNA-vermittelten Knockdown von Y-box binding protein 1 T1 - Generating a vector system for the shRNA-mediated knockdown of Y-box binding protein 1 N2 - Die Funktion eines Genes zu erforschen, indem man es ausschaltet, und damit seiner Rolle im komplexen Zusammenspiel der einzelnen Prozesse des menschlichen Körpers nachzugehen, stellt heutzutage eines der vielversprechendsten Felder der Gentechnologie dar. Der als RNA-Interferenz bekannte Mechanismus wurde in dieser Arbeit durch den Einsatz von sogenannten short hairpin RNAs (shRNAs), dauerhaft in das Wirtsgenom integrierter Knockdown-Träger, für das Gen bzw. Protein Y box binding Protein (YBX1) angewendet. YBX1, ein Vertreter der Cold-Shock-Proteine, stellt einen zentralen Interakteur lebensnotwendiger Prozesse wie Proliferation, Apoptose und Embryogenese im menschlichen Körper dar. Seine Dysregulation wird jedoch auch in einen Zusammenhang mit Entzündung, Tumorformation und –aufrechterhaltung gebracht, unter anderem auch für das Multiple Myelom. Das Multiple Myelom ist für 1% aller Krebserkrankungen weltweit verantwortlich mit noch immer ungelösten Problemen unzulänglicher Therapie und deletärer Prognose. In der vorliegenden Arbeit wurde die Möglichkeit geschaffen, die Rolle von YBX1 für das Multiple Myelom mit Hilfe einer Maus-Plasmazelllinie in vivo zu untersuchen. Dies geschah durch die Suppression der Genexpression von YBX1 mittels verschiedener gegen YBX1 gerichteter Polymerase II-getriebener short hairpin RNAs (shRNAs). Diese wurden in ein lentivirales Plasmid kloniert. Durch das Vorhandensein von Tetrazyklin induzierbaren Promotoren (Tet-On bzw. Tet-Off) wurde die Möglichkeit geschaffen, einen konditionellen Knockdown von YBX1 zu induzieren. Dies war notwendig, da initiale Arbeiten mit humanen Myelomzelllinien zeigten, dass der Knockdown von YBX1 Apoptose induzieren kann. Mit diesem Konstrukt wurden in HEK293 Zellen lentivirale Partikel hergestellt und damit die murine Plasmozytomzelle MOPC315.BM stabil transduziert. Nach Selektion, Klonierung und Testung (Puromycin-Selektion, RFP-Expression und Western-Blot Analyse) stand ein Zellklon zur Verfügung, der einen induzierbaren YBX1 Knockdown zeigt. Damit gelang die Etablierung eines gegen YBX1 gerichteten Vektorsystems in einer murinen Plasmazellinie in vitro. Mit Hilfe dieser Zelllinien kann nun in weiteren Arbeiten untersucht werden, wie ein YBX1 Knockdown das Tumorwachstum in vivo beinflusst. N2 - One of the most dynamic areas in gene technology today is to get an understanding of a gene and its role in the human body via knockout. By using so called short hairpin RNA (shRNA), stably in the host genome integrated knockdown instruments, the mechanism of RNA interference was adopted for the gene and protein YB-1. On the one hand YB-1, a cold-shock-protein, is an important protagonist in life for vital processes such as proliferation, apoptosis and embryogenesis in the human body. On the other hand its dysregulation is associated with inflammation, tumor formation and maintenance, for example in the multiple myeloma. The multiple myeloma is responsible for 1% of all cancer entitities word wide. The therapeutic options are deficient and the prognosis is often unfavourable. In this thesis we had the possibility to analyze the importance of YB-1 for the multiple myeloma by using a multiple myeloma mouse model in vivo. Using different against YB-1 targeted polymerase II driven short hairpin shRNA (shRNA) we suppressed the expression of the gene YB-1. The shRNAs were cloned in a lentiviral plasmid. By using a tetracyclin inducible promotor (tet-on and tet-off) we got the possibility to induce a conditional knockdown of YB-1. This was necessary because the irreversible knockdown of YB-1 can be able to induce apoptosis. Lentiviral particles in HEK293 cells were produced via this construct and MOPC315.BM, a murine plasmocytoma cell, was stably transduced. After selection, cloning and verification (puromycin-selection, RFP-expression and western blot analysis) a cell clon was selected which showed an inducible YB1 knockdown. So we established a vector system targeted against YB-1 in a murine plasmocytoma cell line in vitro. Based on this findings the influence of a YB-1 knockdown on tumor growth in vivo can be investigated in future. KW - Plasmozytom KW - Gentechnologie KW - RNS-Interferenz KW - YB-1 KW - Knockdown KW - shRNA KW - Multiples Myelom KW - Plasmazellinie Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149809 ER - TY - THES A1 - Maier, Eduard T1 - Molekulare Analyse des IKK-Komplexes als Zielstruktur für potentielle Therapieoptionen im Multiplen Myelom T1 - Molecular analysis of the IKK-complex as a target for potential therapies in multiple myeloma N2 - ZUSAMMENFASSUNG Obwohl diverse Mutationen des NF-κB Systems in Myelomzelllinien und primären Myelomzellen eine pathogenetische Beteiligung andeuten, ist die Relevanz des IKK Komplexes als molekularer Angriffspunkt für die Entwicklung medikamentöser Therapieoptionen noch nicht ausreichend geklärt. Zwar führte die Applikation des IKK-β Inhibitors MLN120b dosisabhängig und längerfristig zu einer Reduktion der Zellviabilität in einer Vielzahl von Myelomzelllinien, doch kann nicht ausgeschlossen werden, dass bei höheren Konzentrationen unspezifische Wirkungen für die beobachteten Effekte (mit-) verantwortlich sind. Aus diesem Grund erfolgte in der vorliegenden Arbeit eine spezifische Suppression von IKK-α, IKK-β oder IKK-γ mittels transienter Transfektion von shRNA Expressionsvektoren oder Stealth-siRNA. Es folgte die Charakterisierung der verminderten Zielproteinspiegel mittels Western-Blot und die Messung der Viabilität der Zellen mittels FACS Analysen. Darüber hinaus wurde in TNF-α Stimulationsexperimenten der Effekt der Suppression von IKK-β mittels Stealth-siRNA auf (Phospho-)IκB-α analysiert. Schließlich erfolgte die Applikation des IKK-β Inhibitors TPCA, dessen Wirkung auf die Zellviabilität und auf die TNF-α-vermittelte Phosphorylierung und Degradation von IκB-α in MM.1S Zellen untersucht wurde. Die Experimente mit Stealth-siRNA zeigten, dass weder die Suppression von IKK-β, noch die Suppression von IKK-α oder IKK-γ in AMO-1, L363 oder MM.1S eine Verminderung der Zellviabilität bewirken konnte. Auch eine kombinierte Suppression von IKK-α zusammen mit IKK-β in L363 und MM.1S Zellen bewirkte keinen vermehrten Zelltod. Dagegen zeigte die Behandlung von MM.1S Zellen mit hohen Konzentrationen von TPCA einen geringen Effekt auf das Überleben dieser Zellen. Die Suppression von IKK-β mittels Stealth-siRNA in MM.1S konnte nicht die TNF-α vermittelte IκB-α Phosphorylierung und Degradation verhindern. Sowohl die hohe TNF-α Konzentration von 100ng/ml, als auch eine unvollständige Suppression von IKK-β könnte dazu beigetragen haben. In analogen Experimenten mit TPCA konnte die TNF-α vermittelte IκB-α Phosphorylierung und Degradation dagegen effektiv unterdrückt werden. In der Zusammenschau der Ergebnisse konnte somit eine potenzielle therapeutische Relevanz des IKK-Komplexes als molekularer Angriffspunkt für eine Myelomtherapie nicht gefunden werden. Eine noch detailliertere Analyse der Funktionalität des Signalwegs (insbesondere eine Messung der Aktivität der NF-κB Transkriptionsfaktoren im Zellkern) und die Etablierung stabiler und induzierbarer Expressionssysteme für längerfristige Untersuchungen der RNAi Wirkungen in Myelomzellen, stellen weiterführende Wege zu einer umfangreicheren Beurteilung der pathobiologischen und therapeutischen Bedeutung des NF-κB Systems dar. Darüber hinaus sind die das NF-κB System betreffenden Mutationen genauer hinsichtlich ihrer potenziellen Wirkung auf NF-κB unabhängige Signalwege zu untersuchen. N2 - ABSTRACT Although the known mutations in NF-kB in imply to view the IKK complex to be involved in promoting survival of Multiple Myeloma cells, and IKK-beta inhibitors have been reported to show anti-Myeloma activity, the actual significance of IKK as a molecular target for treatment of the desease remains unclear. This is due to the fact that the influence on survival by pharmacological inhibitors on many Multiple Myeloma cells has been shown to be dependend on high concentration applications and on long-term incubation times, both inheriting the possibility of unspecific drug effects. Therefor we chose an alternative approach and performed a RNAi mediated knockdown of each of the three components of the IKK Complex (IKK-alpha, IKK-beta and IKK-gamma) and measured the survival rate of the Multiple Myeloma celllines AMO-1, L363 and MM.1s. None of the knockdowns led to a decrease of Multiple Myeloma survival rate, and even a combined knockdown of IKK-alpha and IKK-beta in L363 and MM.1S showed significant effects on the survival. Summarized, IKK is not crucially involved in promoting survival of the mentioned Multiple Myeloma celllines and thus the relevance of the complex as a therapeutic target for the treatment of Multiple Myeloma is not thoroughly clarified yet. Further investiations in different celllines and RNAi mediated knockdowns in longer time intervalls might resolve the true significance of IKK for Myeloma survival. KW - Multiples Myelom KW - NF-Kappa B KW - RNAi KW - Multiples Myelom KW - NF-Kappa B KW - IKK KW - RNAi KW - Therapie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127198 ER - TY - THES A1 - Müller, Elisabeth T1 - Pan-Raf-Inhibition als neue therapeutische Strategie im Multiplen Myelom T1 - Pan-Raf-Inhibition as a new therapeutical strategy in Multiple Myeloma N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist eine durch monoklonale Vermehrung terminal differenzierter Antikörper-produzierender B-Lymphozyten (Plasmazellen) im Knochenmark charakterisierte maligne Krankheit, die sich v.a. in osteolytischen Knochendestruktionen, hämatopoetischer und Niereninsuffizienz äußert. Verbesserte Therapieansätze wie die Hochdosis-Chemotherapie mit Melphalan und anschließender autologer Stammzelltransplantation sowie die Einführung neuer pharmakologischer Substanzklassen (Proteasom-Inhibitoren, Cereblon-bindende Thalidomidderivate) führten zu einer Verlängerung der durchschnittlichen Überlebenszeit, für die meisten der Patienten ist die Erkrankung jedoch derzeit unheilbar. Die Erforschung neuer potenzieller therapeutischer Angriffspunkte auf Grund pathobiologischer Erkenntnisse bleibt daher unabdingbar. Ein Ansatz zur Verbesserung des Verständnisses der Pathogenese ist die funktionelle, molekulare und genetische Analyse des Signalnetzwerkes im MM. Im Zusammenhang mit diesem Konzept wurde entdeckt, dass wachstums-regulierende Signalwege in MM Zellen aktiviert oder dereguliert sind und zum Überleben und der Proliferation des Tumors beitragen. So konnte beispielsweise von unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden, dass onkogenes Ras essentiell zum Überleben der MM Zellen beiträgt. Da Ras derzeit mangels spezifischer Inhibitoren pharmakologisch nicht angreifbar ist, stellen weitere funktionelle Bestandteile des Signalweges eine potenzielle therapeutische Zielstruktur dar. Während die Blockade von MEK1/2 in MM Zellen keinen Einfluss auf das Überleben hatte, konnte durch die Blockade von Raf in ersten Tests unserer Arbeitsgruppe Apoptose hervorgerufen werden. Aus diesem Grund habe ich in der vorliegenden Arbeit zur Evaluation eines neuen Therapieansatzes die Rolle der Raf-abhängigen Signaltransduktion eingehend untersucht. Als Grundlage diente dabei die Hypothese, dass die Raf-Kinasen entscheidende Effektoren der durch onkogenes Ras vermittelten apoptotischen Effekte darstellen. In einem ersten Schritt konnte ich nachweisen, dass alle drei Raf-Isoformen (A-, B- und C-Raf) in humanen MM Zelllinien und in primären MM Zellen aktiviert sind. Mittels shRNA-vermittelter, Isoform-spezifischer Raf-Knockdown-Experimente konnte ich zeigen, dass nur ein simultaner Knockdown aller Isoformen, d.h. ein Pan-Raf-Knockdown, zu einer De-Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 führte. Dieser Versuch ließ sich mittels pharmakologischer Raf-Inhibition, bei der ebenfalls nur eine Pan-Raf-Blockade zu einer Herunterregulation von MEK1/2 und ERK1/2 in MM Zellen führte, bestätigen. Das MEK/ERK-Modul stellte somit einen hervorragenden Surrogat- und Biomarker für die Pan-Raf-Aktivität dar. Im Gegensatz zur Blockade des MEK/ERK-Moduls führte eine Hemmung der Pan-Raf-Aktivität mittels shRNA oder pharmakologischer Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien und in der Mehrheit der primären MM Zellen zu einer starken Induktion von Apoptose. Da das Ansprechen auf eine Pan-Raf-Blockade nicht mit dem Ras-Mutationsstatus korrelierte, könnten die Raf-Kinasen eine von onkogenem Ras unabhängie Qualität als therapeutische Zielstruktur aufweisen. Zur Untersuchung möglicher MEK/ERK-unabhängiger Effektormechanismen der Pan-Raf-Inhibition habe ich die mRNA-basierten Genexpressionsprofile von INA-6 Zellen nach pharmakologischer Pan-Raf- oder MEK-Inhibition verglichen. Dabei führte die Pan-Raf-Inhibition zu einer Regulation von wesentlich mehr Genen, wobei sich auch die Art der regulierten Gene unterschied, darunter Gene mit tumorrelevanten Funktionen wie Regulation von Proliferation, Zellzyklus und Apoptose. Für eine dieser Gengruppen, die Gruppe der PI3K-abhängigen, mTOR-assoziierten Gene, konnte ich eine Regulation auch auf der Proteinebene nachweisen: die Phosphorylierungen von mTOR, p70S6K, Rb und AKT und die Expression von CyclinD1 und PDK1 waren nach Pan-Raf-Inhibition, nicht jedoch nach MEK-Blockade herunterreguliert. Dieses Ergebnis deutet auf eine Ko-Regulation der PI3K-abhängigen Signaltransduktion durch die Raf-kinasen hin. Mittels spezifischer PI3K-Inhibitoren ließ sich sowohl bei der Regulation der untersuchten Proteine als auch bei der Induktion von Apoptose eine deutliche Verstärkung der Pan-Raf-Inhibition in HMZL und in primären Zellen erzielen. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass die Pan-Raf-Blockade eine neue Therapiemöglichkeit darstellt, die durch Kombination mit einer PI3K/AKT-Inhibition noch verstärkt werden kann. N2 - Multiple Myeloma (MM) is a malignant disease which is characterized by monoclonal expansion of terminally differentiated, antibody-producing B-lymphocytes (plasma cells) and results mostly in bone lesions, haematopoietic and renal insufficiency. Improved therapeutic approaches like high-dose melphalan chemotherapy followed by autologous stem-cell transplantation and the introduction of new pharmacological compounds (proteasome inhibitors, cereblon-binding Thalidomide derivates) increased the mean survival time. Nevertheless, the disease remains incurable for most of the patients. Therefore, the exploration of new potential therapeutical targets based on pathobiologic insights becomes vital. One approach to improve the understanding of the pathogenesis is to analyze functionally, molecularly and genetically the signaling network in MM. In the context of this concept, it was discovered, that growth-regulating pathways are activated or deregulated in MM cells and contribute to tumor survival and proliferation. Our working group could already proof that oncogenic Ras is crucial for cell survival. Since Ras itself does not yet represent a druggable target, therapeutical approaches should aim at other functional parts of the pathway. While blocking of MEK1/2 has no influence on MM cell survival, early reports of our working group showed that inhibiting Raf induced apoptosis. For this reason I investigated the role of Raf-dependent signaling in order to evaluate a new therapeutic approach. This was based on the hypothesis that Raf kinases act as important effectors for the apoptotic effects of oncogenic Ras. As a first step, I could prove, that all three Raf isoforms (A-, B- and C-Raf) are activated in human MM cell lines and in primary MM cells. By using of shRNA-mediated, isoform-specific Raf knockdown experiments I could reveal that only the simultaneous knockdown of all three isoforms, i.e. a Pan-Raf knockdown, led to de-phosphorylation of MEK1/2 and ERK1/2. Also pharmacological Raf inhibition showed that only Pan-Raf blockage decreases the phosphorylation of MEK1/2 and ERK1/2 and thereby confirmed the knockdown experiment. These experiments also proved that the MEK/ERK module is a strong surrogate and biomarker for Pan-Raf activity. Contrary to inhibiting the MEK/ERK module the inhibition of Pan-Raf activity by shRNAs or pharmacological inhibitors led on to a strong induction of apoptosis in the tested cell lines and in the majority of primary cells. Since the response to Pan-Raf inhibition did not correlate with Ras mutational status, the Raf kinases could probably represent a Ras-independent therapeutical target of high quality. In order to decode possible MEK/ERK-independent effector mechanisms I compared the mRNA-based gene expression profiles of INA-6 cells after pharmacological inhibition of Pan-Raf or MEK. Pan-Raf inhibition led to the regulation of a greater number of genes, taking into account that the character of the regulated genes also varied. This included genes with functions relevant for tumors like regulation of proliferation, cell cycle and apoptosis. For one of these groups, the PI3K-dependent, mTOR-associated genes, I could show the regulation on the level of the proteins: phosporylation of mTOR, p70S6K, Rb and AKT as well es the expression of cyclinD1 and PDK1 decreased after Pan-Raf inhibition, but not after MEK inhibition. This result suggests a co regulation of the PI3K-dependent signal transduction by Raf kinases. In summary, this thesis presents a rationale for Pan-Raf inhibition as a new therapeutical option, which can be enhanced by combination with PI3K/AKT-inhibition. KW - Plasmozytom KW - Raf-Kinasen KW - Inhibition KW - Multiples Myelom KW - Pan-Raf-Inhibition KW - Behandlungsoption Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124666 ER - TY - THES A1 - Glutsch, Valerie T1 - Implementierung eines kardialen Begleitmonitorings im Kontext experimenteller Tumortherapie (insbesondere Phase I/II Studien) zur frühen Detektion potenzieller Kardiotoxizität T1 - Implementation of a prospective cardiac monitoring program for the early detection of cardiac dysfunction in oncological phase I/II trials N2 - CARMO – kurz für „kardiologisches Monitoring“ – stellt eine Erweiterung des im Rahmen onkologischer Phase I/II Studien bereits implementierten kardiologischen Begleitmonitorings dar. Insgesamt 90 Studienpatienten der Early Clinical Trial Unit des Comprehensive Cancer Centers Mainfranken wurden möglichst über einen Zeitraum von sechs Monaten experimenteller Therapie mittels serieller Elektrokardiogramme (EKG), Echokardiographie inklusive Deformationsbildgebung und Bestimmung der kardialen Biomarker systematisch kardiologisch überwacht. Veränderungen der kardialen Funktion wurden anhand der Common Terminology Criteria of Adverse Events (CTCAE Version 4.03) graduiert. Auf Grundlage unserer klinischen Ergebnisse konnten schließlich das 12-Kanal-EKG, die Echokardiographie inklusive der Deformationsbildgebung, der kardiale Biomarker High-sensitive Troponin und zusätzlich erstmalig auch das LZ-EKG als wichtige Untersuchungsmodalitäten eines möglichst vollständigen kardialen Assessments identifiziert werden. Hypothetisch können die CARMO-Ergebnisse somit als Basis für verbesserte datenbasierte Empfehlungen zukünftiger kardiologischer Monitoringprogramme dienen. N2 - CARMO – short for cardiologic monitoring - established an expanded cardio-oncological monitoring for early detection of cardiovascular complications during oncologic phase I/II trials. Ninety patients referred to the Early clinical Trial Unit of the Comprehensive Cancer Center Mainfranken underwent prospective cardiac monitoring including repeat-electrocardiogram (ECG), echocardiography with speckle tracking imaging (STI), and determination of cardiac biomarkers for ideally six months of experimental treatment. Changes in cardiac function were evaluated according to the Common Terminology Criteria of Adverse Events (CTCAE Version 4.03). Conventional ECG, echocardiography including STI-analysis, high-sensitive troponin T, and for the first time 24-hour Holter ECG were identified as relevant diagnostic tools. The results of our prospective cardiac monitoring hypothetically allow data-based recommendations for the early detection of cardiac dysfunction during experimental anti-tumour therapy. KW - CARMO KW - Katdiotoxizität KW - Experimentelle Tumortherapie KW - cardiotoxicity KW - clinical trials Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216909 ER - TY - THES A1 - Roth, Bernhard T1 - Entwicklung von Plasmiden mit multiplen short hairpin RNA-Expressionskassetten für den simultanen Knockdown onkogener Zielstrukturen im Multiplen Myelom T1 - Development of plasmids with multiple shRNA-expressioncassettes for simultaneous knockdown of oncogene targets in multiple myeloma N2 - Zielvorgabe dieser Dissertation stellte die Konstruktion eines Plasmides mit mehreren shRNA-Expressionskassetten für den simultanen Knockdown onkogener Zielstrukturen im Multiplen Myelom dar. Es sollte sich zudem um ein Konstrukt handeln, bei dem ein beliebig häufiges Einfügen oder Ersetzen von Expressionskassetten durch einfache Klonierungsschritte möglich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Plasmide mit bis zu vier unterschiedlichen shRNA-Expressionskassetten konstruiert und getestet. Mittels Elektroporation und anschließender Analyse der Knock-down-Effizienz im Western Blot konnte beispielhaft an Proteinen des MEK-ERK-Signalweges gezeigt werden, dass mithilfe der klonierten Plasmide die Spiegel von mindestens vier Zielproteinen gleichzeitig herunterreguliert werden können, ohne dass es dabei zu Einschränkungen im Vergleich zur Verwendung von Einzel-shRNA-Expressionsvektoren kommt. Es konnte gezeigt werden, dass weder die zunehmende Menge an hintereinander klonierten Kassetten noch die Reihenfolge der einzelnen Expressionskassetten im Plasmid einen negativen Einfluss auf das Knock-down-Ergebnis haben. Dieses Ergebnis konnte in verschiedenen Zelllinien des Multiplen Myeloms bestätigt werden. Die Vorteile des Verfahrens liegen vor allem in der Kosteneffizienz, der einfachen Herstellung und Modifikation, sowie der niedrigen biologischen Sicherheitsstufe der Versuchsschritte. Bedeutend ist zudem die Vermeidung von toxischen Effekten, welche das Einbringen von Fremd-DNA in Zellen ab gewissen Mengen mit sich bringt, durch Klonierung aller shRNA-Expressionskassetten zu lediglich einem Plasmidkonstrukt. Einschränkungen erfährt die etablierte Methodik dadurch, dass die zu untersuchenden Zellen sich für die Transfizierung mit Plasmiden eigenen müssen und ein Verfahren der Selektion transfizierter von nativen Zellen verfügbar sein muss. Durch genannte Vorteile stellt das Konstrukt jedoch ein hervorragendes Mittel zur Erforschung zellulärer Signalwege und ihrer Interaktionen weit über die Erkrankung des Multiplen Myeloms hinaus dar. Es kann zudem als kostengünstige molekulare Methode zur Identifizierung neuer pharmakologischer Angriffspunkte bei Tumorerkrankungen dienen. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden in Folgeversuchen genutzt um eine stabile Integration der shRNA-Expressionskassetten in die zelluläre DNA sowie eine pharmakologische Induzierbarkeit zu erreichen. Es konnte somit der Sprung von den transienten Knock-down-Versuchen dieser Arbeit hin zur langfristig verminderten Proteintranslation geschafft werden. Am Ende dieser Arbeit verblieb zu eruieren, inwieweit die Anzahl der shRNA-Expressionskassetten über die getestete Anzahl von vier erweiterbar wäre und ob die guten Erfahrungen mit dieser Methodik auch bei anderen Arten von Tumorzellen replizierbar sind. Das etablierte Vektorsystem könnte in künftigen Versuchen zur schnellen Erforschung bisher wenig untersuchter oder unbekannter Signalwege dienen. N2 - Goal setting of this dissertation was the construction of a plasmid with multiple shRNA-expressioncassettes for a simultaneous knockdown of oncogene targets in multiple myeloma. It was furthermore supposed to be a construct which allowed adding or replacing of cassettes by simple cloning mechanisms. In this work plasmids have been constructed and established with up to four shRNA-expressioncassettes. By electroporation and westernblot-analysis it could be shown on the MEK-ERK-pathway that it is possible to downregulate four proteins at once with one plasmid and that this is as efficient as the use of single plasmids. It could be shown that neither the number of expressioncassettes nor the order had a negative impact on the knockdown results. This result could be proved in different myeloma cell lines. The advantages of this construct are based on the cost efficiency, the simple construction and modification and the low biosafety level. The most significant advantage lies within the reduction of toxic effects for the cells that come within growing amounts of foreign DNA. These are reduced by fusion of multiple shRNA-expressioncassettes in one plasmid. The construct also underlies restrictions because in order to work with it there has to be a method to transfect the cells with the plasmid and a method to sort transfected cells afterwards. Nevertheless, the construct represents an excellent mean to investigate cellular signalling and interactions in multiple myeloma and beyond. Moreover, it can be used as a cost-efficient method to identify new pharmacological targets in malignancies. The results of this work have been used to establish stable transfection and inducible knockdowns. In the end it stayed yet to be investigated if the construct could be expanded over the here tested number of four shRNA-expressioncassettes and if it could be used in other malignancies than multiple myeloma. The established vector-system could be used in future to quickly investigate unknown signalling pathways. KW - RNS-Interferenz KW - Plasmide KW - Multiples Myelom Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219464 ER - TY - THES A1 - Tränka, Christopher T1 - Untersuchungen zur Expression und Funktion des „LIM and SH3 Domain Proteins“ (LASP-1) in Medulloblastomen T1 - Investigation of the expression and function of the "LIM and SH3 Domain Protein" LASP-1 in Medulloblastoma N2 - Medulloblastome (MB) gehören zu den häufigsten Tumorerkrankungen des Kindes- und Jugendalters, in der Gruppe der intrakraniell und intraspinal gelegenen Tumoren stellen sie gar die häufigste Entität in dieser Altersgruppe dar. Die Einteilung der nach WHO Grad IV klassifizierten Medulloblastome erfolgt derzeit hauptsächlich in vier Subgruppen entsprechend der jeweils vorherrschenden molekulargenetischen Veränderungen. Aberrationen der Chromosomen 7 und 17 sind dabei die häufigsten molekulargenetischen Veränderungen der als Hochrisiko-MB eingestuften Tumoren der Gruppe 3 und 4. Das LIM- und SH3-Domänen-Protein „LASP-1“ ist auf Chromosom 17 in der Region q11 – q21.3 codiert und wird im humanen Organismus ubiquitär exprimiert. LASP-1 wurde in vergleichenden mRNA-Analysen als eines der am stärksten hochregulierten Transkripte in MB mit Chromosom 17q – Zugewinn identifiziert. Als ein Aktin – bindendes Gerüstprotein spielt LASP-1 eine wichtige Rolle in der Zytoskelettorganisation humaner Zellen. Die pathophysiologische Bedeutung einer LASP-1-Überexpression wurde bereits unter anderem in Brustkrebs- und Ovarialkrebszellen demonstriert, in denen ein LASP-1-silencing die Migration und Proliferation der Zellen hemmte. Die Ergebnisse dieser Dissertation unterstreichen bisherige Annahmen, dass eine LASP-1-Überexpression eine wichtige Rolle in der Tumorigenese und Metastasenbildung humaner Tumoren spielt. Mittels Immunfluoreszenz konnte die Ko-Lokalisation von LASP-1 und F-Aktin in MB bestätigt werden. Aufgefallen ist dabei eine besonders starke Akkumulation der phosphorylierten Variante von LASP-1 in MB-Zellkernen. Funktionelle Untersuchungen zu LASP-1 in MB erbrachten zudem folgende Ergebnisse: ein LASP-1 silencing mittels small-interfering-RNA (siRNA) führte zu einer signifikant verringerten Proliferations- und Migrationsfähigkeit der untersuchten Tumorzellen. Die Adhäsionsfähigkeit der MB-Zellen konnte durch ein LASP-1-silencing hingegen signifikant gesteigert werden – ein erstmaliger direkter Nachweis des möglichen Einflusses von LASP-1 auf die Adhäsionsfähigkeit humaner Tumorzellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen bisherige Erkenntnisse zur Funktion von LASP-1 in humanen Tumorzellen und übertragen diese auf das humane Medulloblastom. Parallel zu dieser Dissertation durchgeführte immunhistochemische Untersuchungen (DKFZ, Heidelberg) stellten eine signifikante Korrelation einer hohen LASP-1-Expression in humanen MB und einem Zugewinn auf Chromosom 17q, einer fortgeschrittenen Metastasierung sowie schlechterem progressfreien und schlechterem Gesamtüberleben her. Nicht zuletzt im Kontext individualisierter Therapieansätze, basierend auf jeweiligen molekulargenetischen Veränderungen der Tumoren, könnte LASP-1 somit als ein prognostischer Marker in humanen Medulloblastomen dienen und zum Beispiel eine Therapie-(De)Eskalation stützen. N2 - Medulloblastoma is the most common malignant pediatric brain tumor. This WHO grade IV tumor is currently classified into four subgroups, based on the predominant molecular and cytogenetic changes in each tumor. Aberrations of the chromosomes 7 and 17 are most common in high-risk Medulloblastoma (group 3 and group 4 Medulloblastoma). The LIM- and SH3-domain protein "LASP-1" is ubiquitiously expressed in human tissue, but has been shown to be upregulated in several human cancers. Further, it has been identified as one of the most upregulated transcripts in Medulloblastoma harboring a 17q gain. This analysis identifies LASP-1 as an important regulator of cell migration, proliferation and cell adhesion in Medulloblastoma. Upon siRNA LASP-1-silencing in Medulloblastoma celllines, cell migration and proliferation were significantly inhibited, whereas cell adhesion was significantly increased. KW - Medulloblastom KW - LASP-1 KW - Medulloblastoma Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133207 N1 - Aus datenschutzrechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. Eine inhaltlich identische neue Version ist erhältlich unter: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-139539 ER - TY - THES A1 - Tränka, Christopher T1 - Untersuchungen zur Expression und Funktion des „LIM and SH3 Domain Proteins“ (LASP-1) in Medulloblastomen T1 - Investigation of the expression and function of the "LIM and SH3 Domain Protein" LASP-1 in Medulloblastoma N2 - Medulloblastome (MB) gehören zu den häufigsten Tumorerkrankungen des Kindes- und Jugendalters, in der Gruppe der intrakraniell und intraspinal gelegenen Tumoren stellen sie gar die häufigste Entität in dieser Altersgruppe dar. Die Einteilung der nach WHO Grad IV klassifizierten Medulloblastome erfolgt derzeit hauptsächlich in vier Subgruppen entsprechend der jeweils vorherrschenden molekulargenetischen Veränderungen. Aberrationen der Chromosomen 7 und 17 sind dabei die häufigsten molekulargenetischen Veränderungen der als Hochrisiko-MB eingestuften Tumoren der Gruppe 3 und 4. Das LIM- und SH3-Domänen-Protein „LASP-1“ ist auf Chromosom 17 in der Region q11 – q21.3 codiert und wird im humanen Organismus ubiquitär exprimiert. LASP-1 wurde in vergleichenden mRNA-Analysen als eines der am stärksten hochregulierten Transkripte in MB mit Chromosom 17q – Zugewinn identifiziert. Als ein Aktin – bindendes Gerüstprotein spielt LASP-1 eine wichtige Rolle in der Zytoskelettorganisation humaner Zellen. Die pathophysiologische Bedeutung einer LASP-1-Überexpression wurde bereits unter anderem in Brustkrebs- und Ovarialkrebszellen demonstriert, in denen ein LASP-1-silencing die Migration und Proliferation der Zellen hemmte. Die Ergebnisse dieser Dissertation unterstreichen bisherige Annahmen, dass eine LASP-1-Überexpression eine wichtige Rolle in der Tumorigenese und Metastasenbildung humaner Tumoren spielt. Mittels Immunfluoreszenz konnte die Ko-Lokalisation von LASP-1 und F-Aktin in MB bestätigt werden. Aufgefallen ist dabei eine besonders starke Akkumulation der phosphorylierten Variante von LASP-1 in MB-Zellkernen. Funktionelle Untersuchungen zu LASP-1 in MB erbrachten zudem folgende Ergebnisse: ein LASP-1 silencing mittels small-interfering-RNA (siRNA) führte zu einer signifikant verringerten Proliferations- und Migrationsfähigkeit der untersuchten Tumorzellen. Die Adhäsionsfähigkeit der MB-Zellen konnte durch ein LASP-1-silencing hingegen signifikant gesteigert werden – ein erstmaliger direkter Nachweis des möglichen Einflusses von LASP-1 auf die Adhäsionsfähigkeit humaner Tumorzellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen bisherige Erkenntnisse zur Funktion von LASP-1 in humanen Tumorzellen und übertragen diese auf das humane Medulloblastom. Parallel zu dieser Dissertation durchgeführte immunhistochemische Untersuchungen (DKFZ, Heidelberg) stellten eine signifikante Korrelation einer hohen LASP-1-Expression in humanen MB und einem Zugewinn auf Chromosom 17q, einer fortgeschrittenen Metastasierung sowie schlechterem progressfreien und schlechterem Gesamtüberleben her. Nicht zuletzt im Kontext individualisierter Therapieansätze, basierend auf jeweiligen molekulargenetischen Veränderungen der Tumoren, könnte LASP-1 somit als ein prognostischer Marker in humanen Medulloblastomen dienen und zum Beispiel eine Therapie-(De)Eskalation stützen. N2 - Medulloblastoma is the most common malignant pediatric brain tumor. This WHO grade IV tumor is currently classified into four subgroups, based on the predominant molecular and cytogenetic changes in each tumor. Aberrations of the chromosomes 7 and 17 are most common in high-risk Medulloblastoma (group 3 and group 4 Medulloblastoma). The LIM- and SH3-domain protein "LASP-1" is ubiquitiously expressed in human tissue, but has been shown to be upregulated in several human cancers. Further, it has been identified as one of the most upregulated transcripts in Medulloblastoma harboring a 17q gain. This analysis identifies LASP-1 as an important regulator of cell migration, proliferation and cell adhesion in Medulloblastoma. Upon siRNA LASP-1-silencing in Medulloblastoma celllines, cell migration and proliferation were significantly inhibited, whereas cell adhesion was significantly increased. KW - Medulloblastom KW - Medulloblastoma KW - LASP-1 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139539 N1 - Dieses Dokument wurde aus Datenschutzgründen - ohne inhaltliche Änderungen - erneut veröffentlicht. Die ursprüngliche Veröffentlichung war am 13.05.2016 ER - TY - THES A1 - Oehler, Steffen Claus T1 - Deeskalation der Immuntherapie bei Patienten mit Multipler Sklerose T1 - Deescalation of Immuntherapy in patients with Multiple Sclerosis N2 - Die vorliegende Arbeit ist die erste, die sich mit der Frage beschäftigt, mit welcher zur Deeskalation eingesetzten Therapie nach Beendigung einer Eskalationstherapie mit Mitoxantron am besten Krankheitsstabilität erreicht werden kann bzw. ob Patienten-/Krankheitscharakteristika existieren, die eine bestimmte Nachfolge-Therapie favorisieren. Trotz neuer Behandlungsmöglichkeiten der hochaktiven MS mit Fingolimod, Natalizumab und Alemtuzumab hat Mitoxantron im klinischen Alltag nach wie vor einen hohen Stellenwert, so dass die Fragestellung dieser Studie weiter relevant ist. Es zeigten sich keine Patientencharakteristika, die auf eine erfolgsversprechende Therapie in der Deeskalationsphase nach Mitoxantron schließen ließen. Bei Patienten, bei denen während der Eskalation mit Mitoxantron die Dosis reduziert werden konnte, wurden während der Deeskalationstherapie ein stabilerer Verlauf und weniger Therapiewechsel beobachtet. Bei Patienten, die wegen einer rein chronischen Krankheitsprogredienz eskaliert wurden, trat eine Verschlechterung nach Deeskalation häufiger auf als bei denjenigen, welche wegen Schubaktivität eskaliert wurden. Die Aussagekraft der Daten wird durch die nur niedrige Anzahl der in diese Studie eingeschlossenen Patienten limitiert. Rekrutierungsprobleme stellten die Hauptursache für die geringe Anzahl der Studienteilnehmer dar. N2 - Deescalation of Immuntherapy in patients with Multiple Sclerosis KW - Multiple Sklerose KW - Mitoxantron KW - Deeskalation KW - MS KW - Deeskalationstherapie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133666 ER - TY - THES A1 - Reuter, Miriam T1 - Der Einfluss des Multityrosinkinaseinhibitors Sunitinib auf die Proliferation und Steroidbiosynthese von Nebennierenkarzinomzellen in vitro T1 - Influence of Multi-Tyrosine Kinase Inhibitor Sunitinib on Proliferation and Steroidogenesis of Adrenocortical Cancer Cells in vitro N2 - Tyrosinkinaseinhibitoren nehmen in der modernen Onkologie einen wachsenden Stellenwert ein. Sunitinib wirkt als Multityrosinkinaseinhibitor einerseits antiangiogenetisch, andererseits auch direkt antiproliferativ auf Tumorzellen. Im Tierversuch sind unter Sunitinib adrenotoxische Wirkungen beschrieben. Für das Nebennierenkarzinom, eine sehr seltene Tumorerkrankung mit schlechter Prognose, werden dringend neue Therapieoptionen benötigt. In dieser Arbeit wurde der Effekt von Sunitinib auf die Proliferation von Nebennierenkarzinomzellen in vitro und auf deren Steroidbiosynthese untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Sunitinib dosisabhängig auf die beiden Nebennierenkarzinomzelllinien NCI-h295(R) und SW-13 antiproliferativ wirkt (SW-13: unter 0,1 µM Sunitinib 96 ± 7 %; 1 µM 90 ± 9 %*; 5 µM 62 ± 6 %*, Kontrollen 100 ± 9 %, ab 1 µM p<0,05). Steroidanalysen in den Zellkulturüberständen von NCI-h295-Zellen mittels Isotopenverdünnungs-/Gaschromatographie-Massenspektrometrie belegen eine Abnahme der Cortisolsekretion (1 μM 90,1 ± 1,5 %*, 5 μM 57,2 ± 0,3 %*, Kontrollen 100 ± 2,4 %), während bestimmte Vorläuferhormone akkumulieren. Der beobachtete Anstieg der Quotienten von 17-OH-Pregnenolon zu 17-OH-Progesteron und DHEA zu Androstendion belegt eine partielle Hemmung der Steroidsynthese auf Ebene der 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (HSD3B2). Nachdem eine direkte Hemmung des Enzyms HSD3B2 mittels Hefe-Mikrosomen-Assay ausgeschlossen werden konnte, bestätigte sich auf RNA- mittels Real-Time-PCR und Proteinebene mittels Western Blot eine dosisabhängige Hemmung der Transkription und Translation des Enzyms (mRNA: 1 μM 47 ± 7 %*; 5 μM 33 ± 7 %*; 10 μM 27 ± 6 %*; Protein: 1 μM 82 ± 8 %; 5 μM 63 ± 8 %*; 10 μM 55 ± 9 %*). Auch für CYP11B1 zeigte sich eine dosisabhängige Transkriptionshemmung durch Sunitinib, andere Enzyme wie CYP11A1 dagegen werden nicht beeinflusst. Wenn sich diese in vitro Effekte bei Patienten unter Sunitinib-Therapie bestätigen sollten, könnte es bei einzelnen Patienten zu einer klinisch relevanten Nebenniereninsuffizienz kommen. Eine eindeutige Wirksamkeit von Sunitinib als Therapieoption beim Nebennierenkarzinom konnte im Rahmen der SIRAC-Studie nicht bestätigt werden. Hier ist jedoch anzumerken, dass wahrscheinlich eine gravierende Medikamenteninteraktion mit Mitotane zu einer Reduktion des Effekts von Sunitinib beigetragen hat. N2 - Tyrosine kinase inhibitors are commonly used in modern oncology. Sunitinib as a multi tyrosine kinase inhibitor has antiangiogenetic but also direct anti-tumor activity. Animal experiments pointed to an adrenotoxic effect of sunitinib. New therapies are urgently needed in treatment of advanced adrenocortical cancer. Therefore the effect of sunitinib on proliferation and steroidogenesis was examined in this work. Sunitinib reduced dose-dependently cell viability of both NCI-H295 and SW13 cells (SW13: 0.1 μM 96 ± 7%, 1 μM 90 ± 9%*, 5 μM 62 ± 6%*, controls 100 ± 9%; *p < 0.05). To determine sunitinib effects on steroidogenesis, we measured steroid hormones in cell culture supernatant by gas chromatography-mass spectrometry. We observed a pronounced decrease of cortisol secretion (1 μM 90.1 ± 1.5%*, 5 μM 57.2 ± 0.3%*, controls 100 ± 2.4%) and a concomitant increase in the 17-hydroxypregnenolone/17-hydroxyprogesterone and DHEA/4-androstenedione ratios, indicating specific inhibition of 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (HSD3B2). In yeast microsome assay, no direct inhibition of HSD3B2 by sunitinib was detected. Sunitinib induced down-regulation of HSD3B2 mRNA and protein in NCI-H295 cells (mRNA: 1 μM 47 ± 7%*; 5 μM 33 ± 7%*; 10 μM 27 ± 6%*; protein: 1 μM 82 ± 8%; 5 μM 63 ± 8%*; 10 μM 55 ± 9%*). CYP11B1 was down-regulated at mRNA but not at protein level while CYP11A1 remained unchanged. If these in vitro effects prove true in vivo, it seems possible that several patients with sunitinib therapy may suffer from clinical relevant adrenal insufficiency as adverse effect. The SIRAC study could not confirm a definitely efficacy of sunitinib in adrenocortical cancer, probably due to a relevant drug interaction between mitotane and sunitinib. KW - Nebennierenrindenkarzinom KW - Sunitinib KW - Zellkultur KW - Steroidogenese KW - Tyrosinkinaseinhibitor KW - HSD3B2 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-129537 ER - TY - THES A1 - Koljaja-Batzner, Angelika T1 - Der Zusammenhang zwischen endogenen Erythropoietin-Spiegeln und Mortalität bei niereninsuffizienten Patienten mit Typ 2-Diabetes T1 - Endogenous erythropoietin and the association with inflammation and mortality in diabetic chronic kidney disease N2 - Wir haben 215 Typ 2-Diabetiker mit begleitender chronischer Nierenerkrankung, die noch keine Dialysebehandlung erhalten hatten, über maximal 7 Jahre nachverfolgt. Dabei konnten von allen Studienteilnehmern Follow-up-Daten erhoben werden. Ziel dieser Untersuchung war es, einen Zusammenhang zwischen erhöhten endogenen EPO-Spiegeln im Blut und einer erhöhten Mortalität zu eruieren. Diesen Zusammenhang konnten wir sowohl in der univariaten Analyse als auch nach Korrektur für etablierte Risikofaktoren wie Alter, vorangegangene kardiovaskuläre Ereignisse, erhöhte CRP-Spiegel und niedrige Albumin-Blutwerte zeigen. Somit ist ein erhöhter endogener EPO-Spiegel ein unabhängiger Risikofaktor für die Mortalität. Unsere Untersuchungen zeigen sogar, dass eine einzelne Messung des EPO-Spiegels einen höheren prädiktiven Wert bezüglich des Risikos zu versterben besitzt als eine einzelne CRP-Messung. N2 - In this cohort study, we aimed to identify factors associated with endogenous EPO levels and investigate their relation to all-cause mortality. Between 2004 and 2005, 215 patients with type 2 diabetes were enrolled. Exclusion criteria included end stage renal disease (ESRD) and any form of anemia therapy. Patents were followed for up to 7,0 years. Forty-one patients died. Elevated EPO levels were independently associated with elevated C-reactive protein, low ferritin, and hypertension, in a multivariate model that also included age, cardiovascular disease, kidney function, albumin, cholesterol, and hemoglobin. Higher EPO levels were independently predictive for mortality, as were age, low levels of albumin, and cardiovascular disease. In diabetic patients with CKD, elevated endogenous EPO levels were predictive for mortality and were related mainly to markers of inflammation, independent of kidney function, and despite low hemoglobin levels. KW - Erythropoietin KW - Sterblichkeit KW - Diabetes melltius KW - Endogenes Erythropoietin und Mortalität KW - Endogenous erythropoietin and all-cause mortality Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115535 SN - 1555-905X ER - TY - THES A1 - Overbeck, Lea T1 - Patientenberichtete Symptome und Belastungen sowie Einschätzung des Therapieziels bei Erstvorstellung in der Radioonkologie T1 - Patient-reported symptoms and distress as well as assessment of the therapeutic goal at first presentation to the radiation oncology department N2 - Uns interessierten die Symptome und Belastungen der radioonkologischen Patienten bei Erstvorstellung in der Strahlenklinik sowie die Übereinstimmung des Therapieziels des Patienten mit dem ärztlich dokumentierten Therapieziel. Insbesondere die Unterschiede zwischen palliativen und kurativen Patienten sollten eruiert werden. Auch ein möglicher Zusammenhang zwischen dem Bestrahlungsverlauf und der Symptomintensität der Patienten wurde thematisiert. Des Weiteren sollte untersucht werden, welche Faktoren mit Symptomen und Belastungen assoziiert sind. Dazu wurde in der Klinik und Poliklinik der Strahlentherapie ein routinemäßig verteilter Selbsteinschätzungsbogen retrospektiv ausgewertet. Dieser enthielt neben einer an die Bedürfnisse der Strahlenmedizin adaptierten Version der Integrated Palliative care Outcome Scale (aIPOS) und dem Distress-Thermometer (DT) auch die Frage nach dem Therapieziel aus Patientensicht. N2 - We were interested in the symptoms and distress of the radio-oncological patients when they first appeared at the radiation clinic, as well as the agreement between the patient's therapy goal and the medically documented therapy goal. In particular, the differences between palliative and curative patients were investigated. A possible connection between the course of the radiation and the patient's symptom intensity was also discussed. Furthermore, it should be investigated which factors are associated with symptoms and distress. For this purpose, a routinely distributed self-assessment sheet was retrospectively evaluated in the radiation therapy clinic and polyclinic. In addition to a version of the Integrated Palliative care Outcome Scale (aIPOS) adapted to the needs of radiation medicine and the distress thermometer (DT), the question of the therapy goal from the patient's perspective was also included. KW - PROM KW - Palliativmedizin KW - Therapieziel KW - Symptome KW - Radioonkologie KW - IPOS Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-223475 ER - TY - THES A1 - Ok [geb. Hofmann], Claudia Barbara T1 - Isoform-spezifische Analyse der PI3-Kinase (Klasse I) im Multiplen Myelom T1 - Isoform-specific analysis of the PI3-kinase (class I) in multiple myeloma N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist eine unheilbare Erkrankung, die aus einer klonalen Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark hervorgeht. Dabei liegt ein komplexes Signalnetzwerk vor, das zum Überleben und Wachstum der MM-Zellen führt. Das MM ist durch eine enorme genetische und phänotypische Heterogenität gekennzeichnet. Die konstitutive Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs spielt bei ungefähr der Hälfte der Patienten mit MM eine wichtige Rolle für das Überleben der MM-Zellen und ist daher ein potentieller therapeutischer Ansatzpunkt. Isoform-spezifische Untersuchungen der katalytischen Untereinheiten der Klasse I-PI3K (p110α, p110β, p110γ, p110δ) sollten zur Erkenntnis führen, welche dieser Isoformen für das MM Zellüberleben wichtig sind, um spezifischere Behandlungen mit möglichst geringen Nebenwirkungen zu erlauben. Dafür wurden zunächst Isoform-spezifische Knockdown-Experimente mit MM Zelllinien durchgeführt und sowohl deren Überleben als auch die Aktivierung der nachgeschalteten Komponenten im PI3K Signalweg untersucht. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden sowohl MM Zelllinien als auch Primärzellen mit Isoform-spezifischen PI3K-Inhibitoren behandelt (BYL 719 für p110α, TGX 221 für p110β, CAY10505 für p110γ und CAL 101 für p110δ) und in gleicher Weise untersucht. In beiden Versuchsansätzen stellte sich die katalytische Untereinheit p110α als wichtigste Isoform für das Überleben von MM Zellen mit konstitutiv phosphoryliertem Akt Signal heraus. Weder der Knockdown noch die pharmakologische Inhibition der anderen drei Isoformen (p110β, p110γ, p110δ) führten in MM-Zelllinien zur Beeinträchtigung des Zellüberlebens. Auch reagierten die Primärzellen von MM Patienten größtenteils nicht mit Apoptose auf eine Behandlung mit TGX 221, CAY10505 oder CAL 101. Aufbauend auf der postulierten Bedeutung von p110α, wurde der dafür spezifische Inhibitor BYL 719 mit bereits klinisch etablierten Therapeutika in Kombination verwendet, woraus eine im Vergleich zur Einzelbehandlung verstärkte Apoptose resultierte. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass PI3K/p110α eine therapeutisch nutzbare Zielstruktur zur Behandlung des Multiplen Myeloms darstellt. Daher scheinen weitergehende prä-klinische Studien mit p110α Inhibitoren erfolgversprechend. N2 - Multiple myeloma (MM) is an incurable disease, which results from clonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow. Thereby, a complex signaling network regulates the survival and growth of MM cells. This malignant hematological disease is characterized by profound genetic and phenotypical heterogeneity. The PI3K/Akt signaling pathway is constitutively activated in about 50% of patients with MM and therefore plays an important role for the survival of MM cells. Accordingly, treatment of MM patients with the most isoform-specific drugs may be a desirable goal to achieve therapeutic utility with a minimum of undesired side effects. Therefore, an isoform-specific analysis of the catalytic subunits of the PI3K class I (p110α, p110β, p110γ, p110δ) was undertaken to reveal their individual role(s) for MM cell survival. Initially, isoform-specific knockdown experiments in MM cell lines were performed to assess their survival and the activation states of down-stream components of the PI3K pathway. These experiments were then complemented using isoform-specific pharmacological inhibitors (BYL 719 for p110α, TGX 221 for p110β, CAY10505 for p110γ and CAL 101 for p110δ) in MM cells and primary MM cells. Cell lines with constitutively phosphorylated Akt reduced this signal after p110α knockdown or pharmacologic inhibition and these treatments also affected their survival. Conversely, neither knockdown nor drug-mediated inhibition of any of the other three p110 isoforms influenced MM cell survival. In addition, whereas most primary MM samples were sensitive against BYL-719 only a few samples displayed apoptotic effects when treated with TGX 221, CAY10505 or CAL-101. These results showed that p110α is the major contributor of PI3K-mediated cell survival, and therefore the inhibitor BYL 719 was tested in combination with clinically relevant therapeutics for MM. Such treatment led to increased rates of apoptosis in MM cell lines in comparison to the respective single drug treatments. Taken together, we assume that PI3K/p110α is a therapeutically valuable target structure for the treatment of MM that would warrant more extensive pre-clinical studies. KW - Phosphatidylinositolkinase KW - Isomer KW - Signaltransduktion KW - Plasmozytom KW - p110alpha KW - BYL-719 KW - Carfilzomib KW - Melphalan KW - Lenalidomid KW - Pomalidomid KW - Bortezomib KW - synergistische Effekte KW - Phospho-Akt KW - Zellüberleben KW - pi3kinase KW - Multiples Myelom KW - Knochenmark KW - Isoform Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108466 ER - TY - THES A1 - Hartung, Andreas Walter T1 - Entwicklung neuartiger pharmakologischer Wirkstoffe als Inhibitoren des HSF-1/HSP70-Systems zur Behandlung des Multiplen Myeloms T1 - Development of novel pharmacological drugs as inhibitores of HSF-1/HSP70-System for the treatment of multiple myeloma N2 - Das Multiple Myelom (MM) zeichnet sich durch eine krankhafte Entartung der Plasmazellen im Knochenmark aus und gilt heute trotz zahlreicher Behandlungsfortschritte immer noch als unheilbar. Als attraktive Zielstrukturen für neue Therapiemöglichkeiten haben sich in den vergangenen Jahren „Heat-Shock“-Proteine etabliert. Diese liegen häufig überexprimiert vor und sind bei der Stabilisierung mehrerer onkogener Signalwege des MM von zentraler Bedeutung. Zunächst wurden von Pharmaunternehmen verschiedene Inhibitoren von HSP90 entwickelt, die sich in präklinischen MM-Studien als erfolgreich herausstellten, in klinischen Studien jedoch nur eine begrenzte Wirksamkeit zeigten, da eine Inhibition von HSP90 zu einer schnellen HSF-1-vermittelten Hochregulation der HSP70- Expression führt. Dies kompensiert die Inhibition von HSP90 und führt damit zu einer Abschwächung der Anti-Tumoraktivität. Eine duale Hemmung von HSP90 und des HSF-1/HSP70-Systems wird daher als vielversprechende Strategie für eine wirksame Behandlung des MM betrachtet. Die vorliegende Arbeit, die im Rahmen der klinischen Forschergruppe 216 erstellt wurde, befasst sich daher mit der Entwicklung von Inhibitoren des HSF-1/HSP70-Systems. Hierzu wurden zwei unabhängige Strategien verfolgt. Neben einem indirekten Ansatz, der auf einer blockierten HSP70-Expression via Inhibition des HSF-1-Signalwegs beruht, stand die direkte Inhibition von HSP70 im Fokus. Die erzielten Ergebnisse im Einzelnen: 1) In Anlehnung an den HSF-1-Inhibitor NZ28 (12) sollte untersucht werden, ob das dort enthaltene Tetrahydroisochinolin-Gerüst eine Leitstruktur für die Entwicklung von Hemmstoffen des HSF-1-Signalwegs darstellt. Hierzu wurde eine Reihe unterschiedlich substituierter Tetrahydroisochinolinon-Derivate hergestellt. Die Synthese erfolgte über eine sequenzielle Ugi-Heck-Reaktion, da hierbei drei Substituenten des Tetrahydro- isochinolin-Gerüsts hochflexibel und unabhängig voneinander variiert werden können und sich so leicht ein breites Spektrum verschiedener Tetrahydroisochinolinon-Derivate aufbauen lässt. Eine Bioaktivitätsanalyse zeigte jedoch, dass keine der so erhaltenen Verbindungen (26) die HSF-1-vermittelte HSP70-Expression zu inhibieren vermochte. Um den Einfluss des spezifischen Substitutionsmusters der via Ugi-Heck-Reaktion erhaltenen Produkte zu untersuchen, wurde außerdem eine Auswahl der als HSP70- Inhibitoren synthetisierten Tetrahydroisochinolinone (24 und 36) im HSF-1-Assay getestet. Da auch für diese Verbindungen keine Inhibition des Signalwegs beobachtet werden konnte, besteht Grund zur Annahme, dass substituierte Tetrahydroisochinolin-Derivate nicht als Leitstruktur für die Entwicklung von HSF-1-Inhibitoren geeignet sind. 2) Im Gegensatz zu den synthetisierten Tetrahydroisochinolinonen zeigten einige der als Zwischenprodukte der Ugi-Heck-Reaktion isolierten α-Acylaminocarboxamide, die durch ein Michael-System charakterisiert sind, eine Inhibition der HSF-1-vermittelten HSP70- Expression. Zwar konnten keine eindeutigen Struktur-Wirkungsbeziehungen bezüglich einzelner Substituenten abgeleitet werden, aber es zeigte sich, dass die beobachtete Bioaktivität nicht vom enthaltenen Michael-System abhängig ist. Dem Wirkprinzip der α-Acylaminocarboxamide scheint somit keine kovalente Bindung mit nukleophilen Seitenketten von Proteinen zugrunde zu liegen, was das Potenzial unspezifischer Interaktionen reduziert. 3) Bei der Ugi-Multikomponentenreaktion wurden als Carbonsäurederivate auch β-Acyl-substituierte Acrylsäuren eingesetzt. Dabei wurde beobachtet, dass dieser Austausch zur Bildung von pharmakologisch interessanten 2,5-Diketopiperazinderivaten (35) führt. Die in nur einem Reaktionsschritt erhaltenen 2,5-DKPs zeigten eine spezifische und dosisabhängige antiproliferative Wirkung auf aktivierte T-Zellen, was sie als potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Behandlung von unbeabsichtigten T-Zell-vermittelten Autoimmunantworten interessant macht (AG Topp). Eine Analyse der Struktur-Wirkungsbeziehungen zeigte unter anderem eine Präferenz für trans-konfigurierte 2,5-DKPs. Die Aktivität der potentesten Verbindungen der syntheti- sierten Serie lag in derselben Größenordnung wie die der Positiv-Kontrolle 17-Dimethoxyaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG, 4b). 4) Ausgangspunkt für die Entwicklung neuartiger HSP70-Inhibitoren war das Ergebnis eines virtuellen Screenings (AG Sotriffer), das darauf abzielte die Proteinfunktion durch eine Interaktion mit dem Interdomänen-Interface von HSP70 zu blockieren. Im ersten Schritt wurde eine diastereoselektive und hochflexible Reaktionssequenz zum virtuelle Screening-Hits (trans-24a) etabliert, mit der im zweiten Schritt eine Bibliothek verwandter Substanzen aufgebaut wurde. Gezielte strukturelle Modifikationen erlaubten dabei wesentliche Strukturelemente zu identifizieren sowie Informationen für die Generierung von Derivaten mit höherer Aktivität zu gewinnen. Die wichtigsten Erkenntnisse dabei waren: - Ausschließlich trans-konfigurierte Tetrahydroisochinolinon-Derivate sind wirksam. - Carboxamide (Pos. 4) sind aktiver als analoge Carbonsäuren. - Die Methoxyfunktion am Phenylsubstituenten in Pos.3 ist für die Aktivität wichtig, dagegen führt das Entfernen der OCH3- Gruppe am Phenylring in Pos. 2 zu einer Aktivitätssteigerung. - Eine aliphatische MeNH-Einheit am exozyklischen Amid reduziert die Aktivität gegenüber Arylamidsubstituenten um eine Zehnerpotenz. Darüber hinaus führt ein tertiärer Dimethylcarboxamid-Rest zum vollständigen Aktivitätsverlust. Zur Falsifizierung der postulierten Bindetasche wurden zusätzlich gezielt Derivate mit sterisch anspruchsvollen Substituenten (Tetrahydronaphthyl, Phenoxyphenyl) hergestellt, die nicht in der Lage sein sollten im berechneten Bindemodus am Interdomänen-Interface zu binden. Dabei stand das so ermittelte verfügbare Platzangebot in Einklang mit den aufgrund der Docking-Analysen getroffenen Annahmen. Um die Enantioselektivität der Aktivität der trans-Verbindungen zu prüfen, wurde für zwei repräsentative Carboxamide (24a und 24i) eine Enantiomerentrennung mittels chiraler HPLC durchgeführt und die Enantiomere einzeln getestet. Dabei erwiesen sich die R,R-Derivate als Träger der Anti-MM-Wirksamkeit. Zur Abschätzung der Permeabilität wurden die PSA-Werte der Carboxamide (24) berechnet. Mit Ausnahme der hydroxylsubstituierten Verbindung 24r lagen die Werte aller Derivate (24a-q) in einem Bereich von 65–88Å2, was einen akzeptablen Resorptionsanteil von 55–90% erwarten lässt. Die Bestimmung der Lipophilie der hergestellten Carboxamide mittels HPLC ergab einen logD-Bereich von 1–3, in dem Wirkstoffe einen ausgewogenen lipophilen Charakter besitzen. Die Effizienz der hergestellten Inhibitoren wurde darüber hinaus anhand der ermittelten LE- (engl. ligand efficiency) und LLE-Werte (engl. ligand lipophilic efficiency) beurteilt. Die günstigste Kombination aus LE und LLE wurde für Verbindung 24j (EC50 = 0.20 μM) ermittelt. Dieses Derivat zeichnet sich durch einen Phenylsubstituenten in Position2 des Tetrahydroisochinolin-Gerüsts, einen Methoxyphenylrest in Position3 und einen Pyrimidinsubstituenten am exozyklischen Amid aus. Zur Beurteilung unspezifisch toxischer Effekte wurde neben der Wirksamkeit an MM-Zellen auch der Einfluss der Tetrahydroisochinolin-Derivate auf die Viabilität von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) untersucht (AG Chatterjee). Während die aktivsten Carboxamide an MM-Zellen im submikromolaren Bereich wirksam waren, zeigte mit Ausnahme des phenolsubstituierten Derivats trans-24r keine der getesteten Verbindungen toxische Effekte an PBMCs (EC50 > 100 μM). Darüber hinaus legen detaillierte Westernblot-Analysen einen HSP70-spezifischen Wirkmechanismus nahe. Außerdem führte eine duale Hemmung von HSP70 und HSP90 durch gleichzeitige Inkubation mit trans-24i und NVP-AUY922 (5) zu einem additiven pro-apoptotischen Effekt bei MM-Zellen. Aufgrund der vielversprechenden In-vitro-Ergebnisse und seiner guten Löslichkeit wurde trans-39c in vivo untersucht. Zu diesem Zweck wurden zunächst die physikochemischen Parameter pKa, logP und Löslichkeit sowie die Plasma-Proteinbindung ermittelt (in Kooperation mit AG Meinel). Auf Basis einer im Anschluss durchgeführten Pharmakokinetik-Simulation wurden zwei unterschiedliche Dosierungen gewählt. Toxizitätsuntersuchungen von trans-39c zeigten keine Hämolyseaktivität und keinen Effekt auf die Viabilität von Leber- und Nierenzellen (H. Bruhn). Für die In-vivo-Studie wurde ein murines MM-Modell verwendet, das auf MOPC-315.BM-Luciferase+-Zellen basiert und eine nicht-invasive In-vivo-Bestimmung der Tumorentwicklung via Biolumineszenz ermöglicht (AG Beilhack). Über einen Zeitraum von zehn Tagen wurde zwei Gruppen mit jeweils fünf Tieren behandelt. Dazu wurde trans-39c (4 bzw. 40 μg) im Abstand von 12 h intraperitoneal appliziert. Alle Versuchstiere tolerierten die Behandlung und die mit einer Dosis von 40 μg therapierte Gruppe zeigte eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums gegenüber einer unbehandelten Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis konnte zusätzlich durch eine im Anschluss durchgeführte Ex-vivo-Untersuchung bestätigt werden, bei der die Tumorlast in verschiedenen Knochen und Geweben ermittelt wurde. Die Tetrahydroisochinolinon-Derivate haben sich damit als ausgezeichnete Leitstruktur für die Weiterentwicklung als HSP70-Inhibitoren erwiesen und könnten in Zukunft zu einem deutlichen Fortschritt bei der Behandlung des Multiplen Myeloms beitragen. N2 - Multiple Myeloma (MM) is generally characterized by a malignant disorder of the plasma cells within the bone marrow. Despite some progress made in treatment, it still remains incurable. Since the past years heat shock proteins (HSPs) have been established as attractive targets for new therapies. HSPs are frequently overexpressed in MM and play an important role in stabilizing multiple oncogene signaling pathways. Initially pharmaceutical companies had developed various inhibitors of HSP90, which proved to be successful in preclinical MM studies. However, in clinical therapies they just showed limited potency since the inhibition of HSP90 leads to a strong and fast HSF-1-mediated upregulation of the HSP70 expression. This response is compensating the inhibition of HSP90 and leads to an attenuation of the antitumor activity. Therefore a dual depletion of HSP90 and the HSF- 1/HSP70 system is regarded as a promising strategy for an efficient treatment of MM. The present work, established within the Clinical Research Unit 216, deals with the development of inhibitors of the HSF-1/HSP70 system. Therefore two independent strategies were implemented, i.e. an inhibition of the HSF-1 signaling pathway and the direct inhibition of HSP70. The obtained results in detail: 1) According to the HSF-1 inhibitor NZ28 (12) it was tested whether its tetrahydro- isoquinoline-scaffold can serve as a lead structure for the development of HSF-1 pathway inhibitors. Hence a series of variously substituted tetrahydroisoquinolinone derivatives was prepared. The synthesis followed a sequential Ugi-Heck reaction, as this procedure offers the opportunity to vary three substituents of the tetrahydroisoquinoline-scaffold independently and highly flexible and therefore gives access to a library of different tetrahydroisoquinolinones. However, bioactivity analysis revealed that none of the obtained compounds (26) was able to inhibit the HSF-1-mediated HSP70 expression. In order to analyze the influence of the specific substitution pattern of the products from the Ugi-Heck reaction, a variety of the tetrahydroisoquinolinones (24 and 36) synthesized as inhibitors of HSP70 were additionally tested with the HSF-1 assay. As these compounds also showed no inhibition of the signaling pathway, it is supposed that substituted tetrahydroisoquinolines are no suitable lead structures for the development of HSF-1 inhibitors. 2) In contrast to the synthesized tetrahydroisoquinolinones, several α-acylaminocarbox- amides showed an inhibition of the HSF-1-mediated HSP70 expression. These compounds were obtained as intermediates of the Ugi-Heck reaction and are characterized through a Michael system. Although no distinct structure-activity relationship could be derived with regard to individual substituents, it could be shown that the observed bioactivity is independent from the Michael system included. Thus, the activity of the α-acylamino-carboxamides is apparently not restricted to a covalent bond formed along with nucleophilic protein side chains. This reduces the potential of unspecific interactions. 3) The Ugi reaction was also performed with β-acyl-substituted acrylic acids. Making use of such carbonic acids, access to pharmacological interesting 2,5-diketopiperazines (35) was gained in just one reaction step. The products obtained showed specific anti-proliferative properties towards activated T-cells in a dose-dependent manner. Therefore they represent potential candidates for treating unwanted T cell-mediated immune responses (explored in the group of Prof. Topp). Analyzing the structure-activity relationship revealed an explicit preference for trans-configured 2,5-DKPs. Moreover, the activity of the most potent compound was of the same magnitude as the positive control 17-dimethoxyaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG, 4b) 4) For the development of novel HSP70 inhibitors it was aimed to prevent the protein function by an interaction with the interdomain interface of HSP70. A corresponding Virtual Screening (performed in the group of Prof. Sotriffer) yielded the tetrahydro- isoquinolinone trans-24a as most potent compound. Initially a diastereoselective and highly flexible reaction sequence to the virtual screening hit (trans-24a) was established which was then utilized to create a library of modified compounds. By means of systemic structural modifications significant moieties were identified and furthermore detailed information for creating derivatives with higher potency important results were: - Exclusively trans-configured tetrahydroisoquinolinones are highly active against MM cells. - Carboxamides (Pos. 4) are more potent than the corresponding carbonic acid and carboxylate analogues. - The methoxy function at the phenyl substituent in pos. 3 is important for the activity, whereas its absence at the phenyl ring in pos. 2 increases the potency. - An aliphatic MeNH-group at the exocyclic amide is reducing the activity against arylamide substituents by an order of magnitude. Moreover, a tertiary dimethylcarboxamide moiety causes the complete loss of activity. To falsify the postulated binding pocket, specific derivatives bearing structural challenging substituents (tetrahydronaphthyl, phenoxyphenyl) were synthetized additionally. They should not be able to bind to the interdomain interface in the calculated binding mode. As a result the available space was in good agreement with the assumptions made upon the docking analyses. In order to prove whether the activity of the trans-compounds is induced by only one enantiomer, two representative carboxamides (24a und 24i) were subjected to an enantioseparation by means of chiral HPLC. Exclusively the R,R-compounds were active. To estimate the compounds’ permeability, the PSA values of the carboxamides (24) were calculated. With exception of the hydroxyl substituted compound 24r, the values of all other derivatives (24a-q) ranged between 65–88 Å2. Thus, the fraction of absorption is expected to be 55–90%. The lipophilicity determined by means of HPLC yielded logD- values of 1–3, complying to a well-balanced lipophilic character. The efficiency of the synthesized inhibitors was evaluated by means of the calculated ligand efficiency (LE) and lipophilic ligand efficiency (LLE). The most favorable combination of LE and LLE was found for compound 24j (EC50 = 0.20 μM). It is characterized by a phenyl substituent in position 2 of the tetrahydroisoquinoline-scaffold, a methoxyphenyl group in position 3 and a pyrimidine substituent at the exocyclic amide. In addition to the analyzed potency against MM cells, the influence of the tetrahydroisoquinolines on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was determined in order to appraise unspecific toxic effects (performed in the group of Dr. Chatterjee). While the most potent carboxamides showed activity against MM cells in a submicromolar concentration range, none of the tested compounds showed toxic effects against PBMCs (EC50 > 100 μM) with exception of the phenol substituted derivative trans-24r. Furthermore, detailed Westernblot analyses suggest a HSP70 specific mode of action. As expected the dual inhibition of HSP70 and HSP90 by means of concomitant incubation with trans-24i and NVP-AUY922 (5) yielded an additive pro-apoptotic effect against MM cells. Based on these promising in vitro results compound trans-39c was subjected to an in vivo study. For this purpose the physicochemical parameters pKa, logP and solubility were determined initially (in collaboration with the group of Prof. Meinel) as well as the degree of plasma protein binding. Pharmacokinetic simulations were the fundamental for the two different dosages selected afterwards. In order to evaluate the potential of toxicity in more detail, the compounds’ hemolysis activity and its impact on the viability of liver and kidney cells were determined by H. Bruhn. These analyses did not reveal any cytotoxic effect. The in vivo study was performed with a novel murine MM model that based on MOPC-315.BM luciferase+ cells and therefore allows the none-invasive determination of tumor growth by means of bioluminescence imaging (developed and performed in the group of Prof. Beilhack). Two groups of five animals each were treated over a period of ten days. Therefore trans-39c (4 and 40μg, respectively) was injected intraperitoneal every 12 h. The therapy was well tolerated by all animals and the group treated with the higher dose of 40μg showed a significant reduction of tumor growth compared to the untreated control group. This result could be supplemented by ex vivo analyses performed subsequently where the tumor burden in different bones and tissues was determined. Ultimately the tetrahydroisoquinolinones have been established as excellent lead structures for an advanced development as HSP70 inhibitors and may contribute to a considerable progress in treatment of Multiple Myeloma in the future. KW - Plasmozytom KW - Hitzeschock Proteine KW - Hitzeschock-Proteine KW - Hitzeschocktranskriptionsfaktor KW - Multiples Myelom KW - HSF-1 KW - HSP70 KW - therapeutisches Target KW - Heatshock Proteins KW - Multiple Myeloma KW - therapeutic strategy Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91390 ER - TY - THES A1 - Eich, Kilian Philipp Johannes T1 - Untersuchungen in vitro zur therapeutischen Wertigkeit von 2,6-Dimethoxy-1,4-benzochinonen im Supportivprodukt Avemar T1 - In vitro investigations into the therapeutic role of 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinones in Avemar, a medical nutriment with supportiv value N2 - Avemar ist ein fermentierter Weizenkeimextrakt mit einem hohen Gehalt an 2,6-Dimethoxy-1,4-benzochinonen. Der ungarische Nobelpreisträger Albert Szent-Györgyi zeigte in den 1980er Jahren für diese Benzochinone, dass sie langlebige Semichinonradikale mit starker zytotoxischer Wirkung in Gegenwart geeigneter Elektronendonoren wie Ascorbinsäure bilden. Weizenkeime stellen eine natürliche Quelle für Benzochinone dar, zudem ist eine zytotoxische Wirkung von Avemar auf Tumorzellen belegt. Ebenso wurde die supportive Wirkung von Avemar für onkologische Patienten gezeigt. In der Literatur wird die zelltoxische Wirkung von Avemar als Ergebnis des hohen Anteils an Benzochinonen diskutiert, wobei dies bislang experimentell nicht eindeutig bestätigt ist. Die Wirkung von Avemar wurde an 12 malignen und 3 benignen Zelllinien in vitro untersucht. Dazu wurden Konzentrationen von 0,1; 1; 10 und 50 mg/mL Avemar nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden untersucht. Der Anteil vitaler Zellen wurde mit dem Kristallviolett-Assay bestimmt. Um Aussagen zur Dauer der Avemarwirkung machen zu können, wurde ebenfalls die Vitalität der Zellen in Avemar-freiem Medium nach einer weiteren Kultivierung für 24 bzw. 48 Stunden bestimmt. Die zytotoxische Wirkung von Benzochinonen als Rein- bzw. Referenzsubstanz und als Bestandteil von Avemar wurde miteinander verglichen. Während die Referenzsubstanz für sämtliche getesteten Zelllinien stark zytotoxisch war, wies Avemar unterschiedliche Effekte auf. Der Einfluss von Avemar auf die unter-schiedlichen Zelllinien wurde mit Hilfe der effektiven Konzentration quantifiziert. Dieser EC50-Wert ist die Konzentrationan Avemar, die nach einer Inkubation von 24 Stunden zu einem Effekt bei 50 % der Zellen führt. Eine Konzentration von 50 mg/mL Avemar war für nahezu sämtliche getesteten Zelllinien zytotoxisch, während eine Konzentration von 10 mg/mL Avemar bei 6 von 15 Zelllinien zytotoxisch, bei 8 von 15 Zelllinien zytostatisch und bei 1 von 15 Zelllinienwachstumsverzögernd wirkte. Zu den Zelllinien mit den niedrigsten EC50-Werten von unter 10 mg/mL Avemar gehören die beiden Pankreaskarzinomzelllinien ASPC-1 und BxPC-3 sowie die beiden Mammakarzinomzelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-468. Der zytostatische Effekt von Avemar wurde bei EC50-Werten zwischen 6 und 32 mg/mL Avemar beobachtet. Bei diesen Zellen stagnierte der Anteil vitaler Zellen in der Nachbeobachtung oder nahm kontinuierlich weiter ab. Der wachstumsverzögernde Effekt von Avemar wurde bei der Zelllinie HRT-18 mit einem EC50-Wert von 10,23 mg/mL Avemar beobachtet. Zusätzlich zu den zwölf malignen Zelllinien wurden auch die drei benignen Zelllinien HUVEC, NHDF-p und J 774.3 untersucht. Während HUVEC und NHDF-p einen EC50-Wert von weit über 10 mg/mL aufweisen, reagieren die Zellen der murinen Makrophagenzelllinie J 774.3 mit einem EC50-Wert von 4,9 mg/mL Avemar weitaus empfindlicher auf die Inkubation mit Avemar. Die Wirkung von Avemar auf benignen Zelllinien ist somit nicht eindeutig abzuschätzen. Umso bemerkenswerter sind Daten verschiedener klinischer Studien, die bisher über keine toxischen Nebenwirkungen berichten. Das Wirkmolekül von Benzochinonen sind Semichinonradikale bzw. reaktive Sauerstoffspezies. Um die Bildung von Semichinonradikalen auszulösen, sind Elektronendonoren wie Ascorbinsäure notwendig. Dies gilt für Benzochinone als Referenzsubstanz, nicht aber für Benzochinone in Avemar. Die zytotoxische Wirkung der Benzochinone als Referenzsubstanz wurde durch Zugabe von Katalase bzw. N-Acetylcystein nahezu vollständig aufgehoben. Katalase und N-Acetylcystein zerstören Wasserstoffperoxid, was bestätigt, dass an der zytotoxischen Wirkung von Benzochinonen Wasserstoffperoxid beteiligt ist. Für Benzochinone in Avemar wurde dies nicht beobachtet. Somit wurde erstmals gezeigt, dass Benzochinone mit großer Wahrscheinlichkeit nicht für die zytotoxische Wirkung von Avemar verantwortlich sind. Die Suche nach dem Hauptwirkmechanismus von Avemar darf deshalb als noch nicht abgeschlossen gelten. N2 - Avemar is a fermented wheat germ extract containing 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinones. The Hungarian Nobel laureate Albert Szent-Györgyi showed in the 1980s for these benzoquinones to form long-lived semiquinone radicals with strong cytotoxic effect in the presence of suitable electron donors such as ascorbic acid. Wheat germs are a natural source of benzoquinones and a cytotoxic effect of Avemar on tumor cells has been already shown. Similarly, the supportive effect of Avemar for cancer patients has been demonstrated. In the literature, the cytotoxic effect of Avemar is discussed as a result of the high proportion of benzoquinones, although this is not yet experimentally confirmed inconclusive. The effect of Avemar was investigated in 12 malignant and 3 benign cell lines in vitro. Cells were incubated with different concentrations of Avemar (0,1; 1; 10 and 50 mg/ml) for 24 hours and cell viability was determined with crystal violet assay. In order to make statements about the duration of the effect of Avemar, also the viability of the cells was determined after a further period of 24 or 48 hours in Avemar-free medium. The cytotoxic effect of benzoquinones as pure substance and as part of Avemar was compared. While the pure substance was strongly cytotoxic to all cell lines tested, Avemar had different effects. The effect of Avemar on the different cell lines was quantified using EC50 values. This EC50 value is the concentration of Avemar that results in an effect in 50% of cells after 24 hours incubation. A concentration of 50 mg/ml Avemar was cytotoxic for nearly all cell lines tested, whereas a concentration of 10 mg/ml resulted in a cytotoxic effect for 6 of 15 cell lines, in a cytostatic effect for 8 of 15 cell lines and in a growth retarding effect for 1 of 15 cell lines. Cell lines with the lowest EC50 values of less than 10 mg/ml Avemar were the two pancreatic cancer cell lines ASPC-1 and BxPC-3 and the two breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-468. The cytostatic effect of Avemar was observed at EC50 values between 6 and 32 mg/ml Avemar. In these cells, the proportion of viable cells in the follow-up stagnated or decreased continuously on. The growth retarding effect of Avemar was observed in the cell line HRT-18 with an EC50 value of 10,23 mg/ml Avemar. In addition to the twelve malignant cell lines the three benign cell lines HUVEC, NHDF-p, and J 774.3 were examined. While HUVEC and NHDF-p exhibit an EC50 value of more than 10 mg/ml, the cells of the murine macrophage cell line J 774.3 are more sensitive with an EC50 value of 4,9 mg/ml Avemar. At this time the effect of Avemar on benign cell lines is not clear. All the more remarkable is data of various clinical studies that report so far no toxic side effects. The active molecules of benzoquinones are semiquinone radicals or reactive oxygen species. To trigger the formation of semiquinone radicals, electron donors such as ascorbic acid are necessary. This applies to benzoquinones as pure substance, but not for benzoquinones in Avemar. The cytotoxic effect of benzoquinones as pure substance was almost completely abolished by the addition of catalase or N-acetyl cysteine. Catalase and N-acetyl cysteine are able to destroy hydrogen peroxide, which confirms, that the cytotoxic effect of benzoquinones as pure substance involves hydrogen peroxide. For benzoquinones in Avemar this was not observed. Thus, it is highly probably that benzoquinones are not responsible for the cytotoxic effect of Avemar. This was shown for the first time. The active molecules in Avemar are still unknown. Therefore further investigations are necessary. KW - Benzochinone KW - Oxidativer Stress KW - Weizenkeim KW - Nahrungsergänzungsmittel KW - Onkologie KW - Avemar KW - Supportivprodukt KW - Benzochinone KW - Weizenkeimextrakt KW - supportive agent KW - benzoquinones KW - wheat germ extract KW - oxidative stress Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101640 ER - TY - THES A1 - Großhans, Lukas Friedrich T1 - Funktionelle Validierung von seltenen KRas-Mutationen in Zelllinien des Multiplen Myeloms T1 - Functional Validation of rare KRas-mutations in myeloma cell lines N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist eine seltene, maligne Störung der Plasmazellen, welche trotz gehöriger Therapiefortschritte in den letzten Jahrzehnten nach wie vor als unheilbare Erkrankung betrachtet werden muss. Obwohl eine sehr große intra- und interindividuelle Heterogenität beim Multiplen Myelom beobachtet werden kann, gibt es verschiedene Mutationen, die mit höherer Frequenz in Myelompatientinnen und -patienten gefunden werden. Eines dieser häufiger betroffenen Proteine ist KRas mit Mutationen in etwa 20% der Fälle. Da die Ras-Proteine und somit auch ihre Isoform KRas zu Beginn der Ras/Raf/Mek/Erk-Signalkaskade stehen und dementsprechend einen großen Einfluss auf die Übermittlung von Wachstums- und Überlebenssignalen in Zellen besitzen, ist eine nähere funktionelle Analyse verschiedener KRas-Mutationen von großer Relevanz. Während für einige Mutationen von KRas bereits funktionelle Analysen existieren, wurden die häufig auftretende Exon 2-Mutation KRasp.G12A, sowie die beiden seltenen Exon 4-Mutationen KRasp.A146T und KRasp.A146V bisher in ihrer funktionellen Rolle im MM noch nicht näher charakterisiert. Um die funktionellen Aspekte dieser genannten Mutationen von KRas näher zu untersuchen, kamen im Rahmen meiner Versuchsreihe Sleeping Beauty Transposon System basierte Expressionsvektoren zur transienten und dauerhaften Proteinexpression in verschiedenen Myelomzelllinien zum Einsatz. Durch Transfektion dieser Plasmide in die KRas-Wildtyp tragenden Zellen mit nachfolgender Transposition in die genomische DNA konnte gezielt die Überexpression der verschiedenen Mutationen realisiert werden. So konnte durch die funktionelle Proteinauslese mittels der Anfertigung von Western Blots gezeigt werden, dass jede der drei getesteten Mutationen zu einer verstärkten Phosphorylierung und damit Aktivierung von KRas-nachgeschalteten Proteinen wie z.B. Erk führt. Zusätzlich wurde für die KRas-Mutationen auch ein aktivierender Effekt auf den PI3K/Akt-Signalweg anhand einer erhöhten Phosphorylierung des Proteins Akt nachgewiesen. Ebenso wie andere bereits besser charakterisierte KRas-Mutationen haben demnach auch die getesteten KRas-Mutationen KRasp.G12A, KRasp.A146T und KRasp.A146V einen positiven Einfluss auf die intrazellulären Überlebenssignale und könnten daher eine elementare Rolle in der Entwicklung des Multiplen Myeloms bei Patientinnen und Patienten spielen. Es gilt daher, die drei in dieser Arbeit untersuchten KRas-Mutationen, zukünftig in die Wirkstoffsuche KRas-spezifischer Therapeutika miteinzubeziehen. N2 - Multiple Myeloma (MM) is a rare, malignant disorder of plasma cells, which despite the progress in therapy over the last decades, must still be considered an incurable disease. Although a very large intra- and interindividual heterogeneity can be observed in multiple myeloma, there are various mutations that are found at higher frequencies in myeloma patients. One of these more common proteins affected by mutations in myeloma patients is KRas, with mutations in about 20% of cases. Since the Ras proteins and thus also their KRas isoform are at the beginning of the Ras/Raf/Mek/Erk signaling cascade and therefore have a major influence on the transmission of survival signals in cells, a closer functional analysis of various KRas mutations is of great relevance. While functional analyses already exist for some KRas mutations, the frequently occurring exon 2 mutation KRasp.G12A and the two rare exon 4 mutations KRasp.A146T and KRasp.A146V have not yet been characterized in their functional role in MM. To further investigate the functional aspects of these KRas mutations, I used protein expression vectors based on the Sleeping Beauty Transposon System for transient and sustained protein expression in different myeloma cell lines. By transfection of these plasmids into KRas wild-type cells the overexpression of the different mutations could be realized. By functional protein readout using Western blots it could be shown that each of the three tested mutations leads to increased phosphorylation and thus activation of KRas downstream proteins such as Erk. In addition, an activating effect on the PI3K/Akt signaling pathway could be demonstrated for the KRas mutations by showing an increased phosphorylation of the Akt protein. As with other KRas mutations that have already been better characterized, the KRas mutations KRasp.G12A, KRasp.A146T and KRasp.A146V have a positive influence on intracellular survival signals and could therefore play a fundamental role in the development of multiple myeloma in patients. It is therefore important to include the three KRas mutations investigated in this work in the drug discovery process for KRas-specific therapeutics in the future. KW - Plasmozytom KW - K-ras KW - KRas KW - Multiples Myelom KW - Funktionelle Validierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-292974 ER - TY - THES A1 - Schneider, Carina T1 - Der Einfluss des JNK-Signaltransduktionsweges auf Carfilzomib-induzierten fatalen ER-Stress beim Multiplen Myelom T1 - The influence of the JNK signal transduction pathway on Carfilzomib-induced fatal ER-stress in Multiple Myeloma N2 - Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich Carfilzomib, einem Proteasominhibitor der zweiten Generation. Carfilzomib bindet irreversibel an das Proteasom, hemmt dadurch seine Funktion des Proteinabbaus und löst dadurch eine Reihe von bisher noch nicht vollständig verstandenen zellulären Reaktionen aus, die zu einer Induktion von Apoptose in MM-Zellen führen. Einer der Signaltransduktionswege, die durch Carfilzomib induziert werden, ist der JNK-Signaltransduktionsweg, der unter anderem bei zellulärem Stress in die Entscheidung zwischen Zellprotektion und Apoptose eingebunden ist. Welche Umstände welche Wege triggern, und wie genau dieser Prozess reguliert wird, ist bisher noch weitgehend unklar. Da Carfilzomib zu einer Aktivierung des JNK-Signaltransduktionsweg führt und Apoptose induziert, lag die Frage nach einem möglichen Zusammenhang zwischen beiden Mechanismen nahe. Die vorliegende Arbeit überprüft die Hypothese, dass der JNK-Signaltransduktionsweg entscheidend zur Vermittlung der apoptotischen Effekte von Carfilzomib beiträgt. Die Ergebnisse einer ersten Versuchsreihe schienen die Hypothese zu bestätigen, da wir bei einer artifiziellen, sehr starken Aktivierung des JNK-Signaltransduktionsweges durch Anisomycin eine Verstärkung des durch Carfilzomib-induzierten apoptotischen Effektes beobachten konnten. Weitere Versuche, die sich auf die durch Carfilzomib induzierte Aktivierung des JNK-Signaltransduktionsweges fokussierten, konnten die Annahme in unserer Hypothese klar widerlegen, indem sie zeigten, dass die JNK-vermittelte Phosphorylierung von c-jun an Serin 63 und Serin 73 für die Carfilzomib-induzierte Apoptose nicht notwendig ist. Im Gegenteil, bei Inhibition des JNK-Signaltransduktionsweges waren die apoptotischen Effekte durch Carfilzomib sogar stärker ausgeprägt als durch Carfilzomib-Behandlung allein. Die diesem Effekt zugrundeliegenden molekularen Mechanismen ließen sich im Rahmen der Arbeit nicht aufklären. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die reaktive Aktivierung des JNK-Signaltransduktionsweges unter dem zellulären Stresszustand, den die Proteasominhibition auslöst, eher eine zellprotektive Wirkung zeigt. Der Wegfall dieser protektiven Wirkung vermag die erhöhte Apoptoserate bei JNK-Inhibition zu erklären. Meine Arbeit unterstreicht dabei den weiterzuverfolgenden Ansatz, die zellprotektiven Mechanismen unter Carfilzomib-Behandlung besser zu verstehen. N2 - The present work analyzes the second generation proteasome inhibitor Carfilzomib, a substance that irreversibly binds to the proteasome, inhibiting its protein degradation function and thereby triggering a series of, as yet not fully understood, cellular responses leading to induction of apoptosis in MM cells. One of the signal transduction pathways induced by Carfilzomib is the JNK signal transduction pathway, which has been implicated in the decision pathway between cell protection and apoptosis during cellular stress. The specific circumstances that trigger these pathways and the exact processes for regulation remain largely unclear. As Carfilzomib leads to activation of the JNK signal transduction pathway and induces apoptosis, a correlation between these mechanisms has been postulated. Therefore, the present work tests the hypothesis of whether the JNK signal transduction pathway is crucial in mediating the apoptotic effects of carfilzomib. The results of an initial series of experiments confirmed the hypothesis, as the apoptotic effect induced by carfilzomib was enhanced when the JNK signal transduction pathway was artificially activated to a very high degree by Anisomycin. However, further experiments that focused on Carfilzomib-induced activation of the JNK signal transduction pathway did not support the hypothesis and showed that JNK-mediated phosphorylation of c-jun at serine 63 and serine 73 was not required for carfilzomib-induced apoptosis. In contrast, when the JNK signal transduction pathway was inhibited, the apoptotic effects were even more pronounced by Carfilzomib than by Carfilzomib treatment alone. The molecular mechanisms underlying this effect could not be elucidated within the scope of this work. However, one possible explanation for these results could be that reactive activation of the JNK signal transduction pathway tends to exhibit a cell-protective effect under the cellular stress state induced by proteasome inhibition. The removal of this protective effect may explain the increased rate of apoptosis on JNK inhibition. In this regard, this work underscores the ongoing efforts to understand the cell-protective mechanisms that are impacted by Carfilzomib treatment. KW - Myelom KW - Proteasominhibitor KW - Plasmozytom KW - Carfilzomib Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-290069 ER - TY - THES A1 - Jendretzki, Julia Bianca T1 - Ernährungsberatung in der Onkologie – Eine Fragebogen-basierte Analyse zur Erfassung des subjektiven und medizinischen Beratungsbedarfs von krebskranken Patienten am Comprehensive Cancer Center der Uniklinik Würzburg T1 - Nutritional counseling in oncology - A questionnaire-based analysis to assess the subjective and medical counseling needs of patients with cancer at the Comprehensive Cancer Center of Würzburg University Hospital N2 - Hintergrund Mangelernährung bleibt im klinischen Alltag noch oft unerkannt und wird häufig unterschätzt. Die durchgeführte Studie hatte das Ziel, die Häufigkeit eines Ernährungsrisikos sowie die Patientengruppen, welche am meisten von einer Ernährungsberatung profitieren würden, zu ermitteln. Methode Ambulant versorgte Patienten mit Tumorerkrankungen des Universitätsklinikums Würzburgs wurden mittels eines vom Ernährungsteam des Comprehensive Cancer Centers erstellten Fragebogens zwischen Mai 2017 und Januar 2018 befragt. Es wurden insbesondere Fragen zum Ernährungszustand und Ernährungsproblemen gestellt. Zudem wurde das Risiko für das Entstehen einer Mangelernährung mittels des validierten Screening-Fragebogens Malnutrition Universal Screening Tool (MUST) erfasst. Ergebnisse In der vorliegenden Studie wurden 311 Patienten befragt. Im MUST-Screening zeigte sich bei 16,4 % ein mittleres und bei 20,3 % ein hohes Risiko für eine Mangelernährung, wobei die Punktevergabe in 94,8 % der Fälle durch einen ungewollten Gewichtsverlust erfolgte. Insbesondere Patienten der Gastroenterologie sowie Patienten > 65 Jahre wiesen ein hohes Risiko auf. Es zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen stattgehabter Chemotherapie und einem MUST-Score ≥ 2 (OR = 3,6). Als besondere Risikofaktoren ließen sich zudem Geschmackveränderungen, Schluckbeschwerden, Ekelempfinden und Appetitlosigkeit feststellen (OR = 2,3 – 3,2). Interesse am Thema „Ernährung bei Krebs“ zeigten vor allem junge, weibliche und normalgewichtige Patienten. Ein Gespräch mit dem behandelten Arzt hierzu fand nur bei 38 % aller Patienten statt. Schlussfolgerungen Jeder fünfte Patient unterlag einem hohen Ernährungsrisiko, nur ein Bruchteil wäre durch Erhebung des Body Mass Index aufgefallen. Ein valides Screeningverfahren mit aussagekräftigen Parametern sollte Einzug in den klinischen Alltag ambulant versorgter Krebspatienten finden und gemeinsam mit einer Ernährungsberatung standardisiert bei Diagnosestellung sowie in regelmäßigen Abständen im Verlauf stattfinden. N2 - Background Malnutrition still often remains unrecognized in clinical practice and is frequently underestimated. The aim of this study was to determine the frequency of nutritional risk and the patient groups that would benefit most from nutritional counseling. Methods Outpatients with tumor diseases at the University Hospital of Würzburg were surveyed using a questionnaire prepared by the Comprehensive Cancer Center's nutrition team between May 2017 and January 2018. In particular, questions were asked about nutritional status and nutritional problems. In addition, the risk of developing malnutrition was assessed using the validated screening questionnaire Malnutrition Universal Screening Tool (MUST). Results In the present study, 311 patients were interviewed. MUST screening showed 16.4% to be at moderate risk of malnutrition and 20.3% to be at high risk of malnutrition, with scoring by unintentional weight loss in 94.8% of cases. Gastroenterology patients and patients > 65 years of age were at particularly high risk. There was a significant association between chemotherapy given and a MUST score ≥ 2 (OR = 3.6). In addition, changes in taste, difficulty swallowing, disgust, and loss of appetite could be identified as particular risk factors (OR = 2.3 - 3.2). Interest in the topic of "nutrition in cancer" was mainly shown by young, female and normal-weight patients. A discussion with the treating physician on this topic took place in only 38% of all patients. Conclusions One in five patients was at high nutritional risk, only a fraction would have been detected by body mass index. A valid screening procedure with meaningful parameters should be introduced into the clinical routine of outpatient cancer patients and, together with nutritional counseling, should take place in a standardized manner at the time of diagnosis and at regular intervals during the course of treatment. Translated with www.DeepL.com/Translator (free version) KW - Ernährungsberatung KW - Mangelernährung KW - Onkologie KW - Ambulante Patienten KW - MUST-Score KW - Nutritional Counseling KW - Oncology KW - Outpatients KW - MUST-Score KW - Malnutrition Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-283495 ER - TY - THES A1 - Demler, Theresa T1 - Funktionelle Analyse von patientenspezifischen Mutationen in IKZF1/3 als mögliche Resistenzmechanismen in der Therapie des refraktären und rezidivierten multiplen Myeloms T1 - Functional analysis of patient-specific mutations in IKZF1/3 as possible resistance mechanisms in the therapy of refractory and relapsed multiple myeloma N2 - Trotz einer Vielzahl neuer Therapieansätze in den letzten Jahren, die ein längeres Überleben der Patienten ermöglichen, stellt das multiple Myelom weiterhin eine unheilbare Krankheit dar. Der Großteil der Patienten entwickelt letztlich ein rezidiviertes oder refraktäres multiples Myelom (RRMM). Bei Erstdiagnose und bei RRMM sind immunmodulierende Medikamente (IMiDs), wie Lenalidomid, eine bedeutende Therapieoption. Durch die Bindung von Lenalidomid an den CRL4CRBN Ligase Komplex entwickelt dieser eine modifizierte Substratspezifität: die Transkriptionsfaktoren IKZF1 (Ikaros) und IKZF3 (Aiolos) werden ubiquitinyliert und proteasomal abgebaut. Von Krönke et al. (2014) wurde eine 30 Aminosäuren lange Sequenz (Degron) am N-Terminus von IKZF1/3 definiert, die essenziell für die Lenalidomid-Sensitivität ist. Durch Next Generation Sequencing (NGS)-Technologien wurde ein signifikanter Anstieg der Mutationsfrequenz unter Therapie verzeichnet und vier Missense-Mutationen in IKZF1 und eine in IKZF3 bei Patienten mit RRMM identifiziert. Die Mutationen IKZF1-A152T und IKZF3-G159R sind innerhalb der Degron-Sequenz lokalisiert, IKZF1-E170D liegt unmittelbar daneben und IKZF1-Y413C bzw. IKZF1-R439H befinden sich am C-Terminus des Proteins. Für diese mutierten IKZF-Proteine wurden im Rahmen dieser Arbeit Expressionsvektoren kloniert und stabil in humane Myelomzelllinien transfiziert. Durch Western Analysen und funktionelle Assays der Zellviabilität (alamarBlue) bzw. des Zelltods (Annexin V-PI) wurden diese polyklonalen Sublinien bezüglich ihrer Implikationen für die Lenalidomid-Sensibilität untersucht. Nur die IKZF1-Mutationen A152T und E170D führten zu einer verminderten, bei A152T geradezu aufgehobenen, Degradierung von Ikaros nach Lenalidomid-Behandlung. In den funktionellen Analysen führte A152T ebenfalls zu stark verminderter Lenalidomid-Aktivität und zu deutlich höherem Überleben. Obwohl Sleeping Beauty Vektoren mit unterschiedlichen Expressionskassetten für Aiolos eingesetzt wurden, war keine eindeutige Überexpression von IKZF3 feststellbar, daher sind diese Ergebnisse nur eingeschränkt zu verwerten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in vivo bei Patienten aufgetretene und in vitro analysierte Mutationen, gezeigt an der in der Degron-Sequenz lokalisierten Mutation IKZF1-A152T, im Zellmodell eine Resistenz vermitteln und damit Einfluss auf mögliche Therapieresistenzen haben können. N2 - Numerous therapeutic approaches were developed in recent years and have made a longer survival of patients possible. Nevertheless, multiple myeloma still is an incurable disease, and most patients progress to relapsed and refractory multiple myeloma (RRMM). Immunomodulatory drugs (IMiDs) such as lenalidomide are an important therapeutic option in the treatment of RRMM and newly diagnosed multiple myeloma. Lenalidomide binds to the CRL4CRBN ubiquitin ligase complex and modifies its substrate specificity. As a result, ubiquitination and degradation of the neo-substrates IKZF1 (Ikaros) and IKZF3 (Aiolos), both transcription factors, is induced. Krönke et al. (2014) defined a 30 amino acid sequence (termed degron) at the N-terminal end of IKZF1/3 that is essential for lenalidomide sensitivity. A significant increase in the mutation frequency during therapy was shown through next-generation sequencing (NGS) diagnostics and four missense mutations in IKZF1 and one in IKZF3 in patients with RRMM were identified. The mutations IKZF1-A152T and IKZF3-G159R are located within the degron sequence described by Krönke, IKZF1-E170D lies close to the border of this region and the position of IKZF1-Y413C and IKZF1-R439H is C-terminal. In this thesis, expression vectors were cloned for these mutated IKZF proteins and then stably transfected in human myeloma cell lines. The implications of these identified mutations for their sensitivity to lenalidomide were examined using Western blotting and functional assays: alamarBlue (cell viability assay) and Annexin V-PI (cell death assay). Only the IKZF1 mutations A152T and E170D led to a reduced, for A152T even abrogated, degradation of Ikaros following lenalidomide-incubation. In the functional analyses A152T also strongly diminished lenalidomide activity and caused a considerably higher survival in this subline. Although Sleeping Beauty vectors with different expression cassettes for IKZF3 were used, no distinct overexpression of Aiolos was achieved, and the results obtained for IKZF3 are therefore of limited interpretability. In summary, it was shown that mutations that occurred in patients, namely IKZF1-A152T located within the degron sequence, can confer resistance to lenalidomide-treatment in cell models and implications for therapy resistances are possible. KW - Plasmozytom KW - Punktmutation KW - Resistenz KW - Lenalidomid KW - Multiples Myelom KW - IKZF1 KW - Ikaros KW - IKZF3 KW - Aiolos Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248730 ER - TY - THES A1 - Fink, Severin Lion Julian T1 - Entwicklung eines Sleeping Beauty Transposon Systems zum simultanen und induzierbaren shRNA-Knock-down verschiedener Zielstrukturen in Zelllinien des Multiplen Myeloms T1 - Development of a system for multi-targeted inducible shRNA-knock-downs with the Sleeping Beauty transposon system and establishment in Multiple Myeloma cell lines N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist ungeachtet neuer medikamentöser Therapien weiterhin eine für die allermeisten Patienten unheilbare Erkrankung. Aktuelle Whole-Genome-Sequenzierungen konnten die Annahme, dass hierfür die genetische Heterogenität des MM verantwortlich ist, bestätigen. Um dieses onkogene Signalnetzwerk auf effiziente Weise zu untersuchen, wurde ein induzierbares Knock-down-System basierend auf der weitverbreiteten RNA-Interferenz und dem neuen, innovativen Sleeping Beauty Transposon System (SBTS) entwickelt. Die Etablierung des SBTS im MM zeigte, dass die CMV-Promotor-vermittelte EGFP-Expression über 231 Tage stabil ist. Die Verwendung des SBTS ermöglicht es, Zellen bei niedrigster biologischer Schutzstufe (S1) stabil zu transfizieren. Am Beispiel des MAPK-Signalweges konnten stabile shRNA-vermittelte Knock-downs in verschiedenen MM-Zelllinien erfolgreich durchgeführt werden. Um ein induzierbares Tet-On-System zur shRNA-Expression zu erstellen, wurden zum einen dem verwendeten H1-Promotor zwei TetO-Sequenzen hinzugefügt. Zum anderen wurde durch die Verwendung eines zweiten, neu konstruierten SBTS Vektors mit anderer Selektionsresistenz in den verwendeten Zellen das Tet-Repressor-Protein (TetR) stabil exprimiert. Die notwendige Expression von TetR konnte nur mittels CAG-Promotors erreicht werden. Am Beispiel von ERK2 konnte gezeigt werden, dass es durch die stabile Transfektion und die Induktion des Knock-downs mit Doxycyclin möglich ist, den Knock-down Effekt zu erzielen. Das etablierte Plasmid-basierte System stellt somit ein versatiles, einfach anwendbares, kostengünstiges und zeitsparendes Werkzeug dar, induzierbare Knock-downs durch RNA-Interferenz für einzelne oder mehrere Proteine gleichzeitig zu erzielen. Es ist davon auszugehen, dass die Anwendung aufgrund der Verwendung etablierter Techniken und der leichten Modifizierbarkeit nicht nur auf das MM begrenzt sein wird. N2 - Multiple Myeloma (MM) is regardless of new drug therapies still an incurable disease for the majority of patients. Large-scale whole-genome-sequencing studies strongly support the assumption that the reason for this is the large genetic heterogeneity of MM. To gain knowledge about the complex oncogenetic signalling efficiently, in this work, a system for inducible knock-downs based on the wide-spread RNA-interference and the new innovative Sleeping Beauty Transposon System (SBTS) was developed. The successful establishment of the SBTS in MM revealed that EGFP-expression by a CMV-promotor is stable for at least 231 days without any further selection by antibiotics. The use of SBTS makes it possible to transfect cells stably at the lowest biological safety level (S1). Utilizing the MAPK-signal path as an example it was possible to successfully demonstrate shRNA-provided knock-downs for up to four targets at once in several different MM-cell lines. To create an inducible Tet-on-system for shRNA-Expression, two TetO-sequences were added to the used H1-Promotor. Furthermore, the required Tet-repressor-protein (TetR) was expressed by another newly constructed SBTS vector, which contains another selection resistance. After trying different approaches, it was possible to express the necessary amount of TetR by using the CAG-Promotor, which was verified by Western Blot. Using ERK2 as a sample target, it was possible to show that with stable transfection and induction of the knock-down with doxycycline it is possible to measure knock-down results without the toxic side effects of the electroporation necessary for transfection. The established plasmid-based system serves as an easily applicable, cost-efficient and time-saving tool for inducible knock-downs by RNAi for single or multiple proteins. Due to the fact that yet established techniques were used and thanks to the simplicity of the customization it is assumed that the application is not only limited to MM. KW - RNS-Interferenz KW - Plasmozytom KW - Transposon KW - Multiples Myelom KW - shRNA KW - Sleeping Beauty Transposon System Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249796 ER - TY - THES A1 - Zugelder, Laurens T1 - Etablierung eines stabilen induzierbaren Multikassetten-Systems für shRNA-Knockdown-Konstrukte in Myelom Zelllinien und Anwendung zur Analyse des NFκB-Signalwegs T1 - Establishment of a stable and inducible Multicassette-shRNA-Knockdown System in Myeloma Cell Lines and Adaption to the Evaluation of the NFκB-Pathway in Multiple Myeloms N2 - Das Multiple Myelom muss trotz stetiger Fortschritte im Hinblick auf die verfügbaren Therapieoptionen und die Krankheitsprognose weiterhin im Wesentlichen als eine unheilbare Erkrankung angesehen werden. Dies kann vor allem auf die große inter- und intraindividuelle Heterogenität des MM zurückgeführt werden, welche die Entwicklung gezielter molekularer Therapiestrategien erheblich erschwert. Hierbei stellen loss-of-function- Experimente, welche die Identifikation einzelner oder mehrerer potenziell therapeutisch relevanter Zielstrukturen durch die (kombinierte) Depletion von Proteinen ermöglichen, eine wichtige Säule dar, für deren Durchführung verschiedene Systeme mit jeweils eigenen Vor- und Nachteilen zur Verfügung stehen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Etablierung eines auf RNA-Interferenz basierenden stabilen und induzierbaren Knockdownsystems durch Elektroporation von MM Zelllinien mit Einzel- und Mehrfach-shRNA-Vektoren abgeschlossen werden. Die Transfektion von tet-Repressor-exprimierenden Zellinien mit einer oder mehreren shRNAExpressionskassetten innerhalb eines Plasmidvektors ermöglicht durch die vollständige Repression der shRNA-Transkription im nicht-induzierten Zustand die Selektion erfolgreich transponierter Zellen ohne Effekt-vermittelte Bias und die Generierung großer Zellmengen für Versuchsreihen in vergleichsweise kurzer Zeit. Die Induktion der verschiedenen in dieser Arbeit evaluierten Einzel- und Mehrfach-shRNA-Konstrukte gegen (Kombinationen von) Zielstrukturen im Ras/MAPK- sowie im NFκB-Signalsystem mittels Doxyzyklin als Induktionsagens zeigte durchweg deutliche und den Erwartungen aus transienten Experimenten entsprechende Knockdownergebnisse. Auch die Resultate hinsichtlich funktioneller Readouts und zellphysiologischer Effekte der induzierten Knockouts stehen im Einklang mit vorangegangenen Experimenten und bestätigen somit die Äquivalenz des stabilen induzierbaren Systems zu transienten Ansätzen auf RNAi-Basis oder zu pharmakologischen Inhibitoren. Der hierbei erzielte hypomorphe Phänotyp innerhalb einer polyklonalen Zellpopulation bildet die Realität einer medikamentösen Blockade einer oder weniger Zielstrukturen einer heterogenen MM Tumorpopulation näherungsweise ab, weshalb das vorgestellte System ein hilfreiches, kosteneffizientes und leicht zu handhabendes Werkzeug für die Identifikation potenziell relevanter Zielstrukturen für molekulare Therapieansätze im Multiplen Myelom darstellt N2 - Despite steady progress concerning the therapeutic arsenal available to and the improved prognosis for newly diagnosed patients, multiple myeloma still has to be regarded as an incurable malignancy in the overwhelming majority of cases. This is mainly due to the disease’s high grade of inter- and intraindividual heterogeneity, which greatly complicates the development of molecular therapies. Loss-of-function studies, which enable researchers to identify individual or combinations of drug targets with a potential for clinical relevance by correlating the (combined) depletion of proteins with the resulting phenotype, represent an important cornerstone in the process of developing new molecular therapies, for the execution of which a broad variety of systems with their individual advantages and disadvantages is available. During this thesis project, the establishment of a stable and inducible knockdown system by way of electroporation of myeloma cell lines with single- and multiple-shRNA- expression vectors was successfully completed. Transfecting cell lines which constitutively express the tet-repressor protein with a single plasmid vector carrying one or multiple shRNA expression cassettes allows for the selection of successfully transposed cells without any effect mediated bias and the creation of large amounts of cells for experiments in a comparatively short time, thanks to the full repression of the transcription of the transfected shRNA genes in an un-induced state. Inducing their transcription by adding doxycycline to the cell suspension resulted in strong and specific knockdowns for all single and multiple constructs against different (combinations of) targets in the Ras/MAPK- and the NFκB-pathway which were tested in the experiments shown in this thesis. Results regarding knockdowns, functional readouts and alterations in cellular metabolism mirrored with experiments conducted previously with both transiently expressed shRNAs and pharmacological inhibitors and therefore attest to the universal applicability of the system. The resulting polyclonal cell population with a hypomorphic phenotype depicts the reality conveyed by a pharmacological inhibition of one or more targets within a heterogenic myeloma tumour rather well and therefore this stable and inducible system represents a useful, economical and easily applicable tool for the identification of potentially relevant targets for the development of new molecular therapies in multiple myeloma. KW - Plasmozytom KW - Multiples Myelom KW - shRNA KW - reverse genetics Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188377 ER - TY - THES A1 - Seibold, Marcel T1 - Funktionelle Charakterisierung des Ras family small GTP binding protein RAL im Multiplen Myelom T1 - Functional characterization of the Ras family small GTP binding protein RAL in multiple myeloma N2 - Die monoklonale Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark ist charakteristisch für das multiple Myelom (MM) und kann bei Erkrankten zu Störungen in der Hämatopoese sowie zu Knochenläsionen und Niereninsuffizienz führen. Die Weiterentwicklung und der Einsatz neuer Therapieoptionen konnten das Überleben von MM-Patienten zwar erheblich verbessern, jedoch gilt diese Krankheit weiterhin als unheilbar. Onkogene Mutationen und das Knochenmarkmikromilieu führen in MM-Zellen zur Entstehung eines onkogenen Signalnetzwerks, das das Wachstum und Überleben der Zellen aufrechterhält. Mutationen der GTPase RAS treten bei bis zu 50 % der MM-Patienten auf und tragen zum Überleben von MM-Zellen bei. Trotz der Häufigkeit und Bedeutsamkeit von onkogenem RAS, auch in anderen Tumorentitäten, ist die GTPase nach wie vor therapeutisch nicht angreifbar. Die GTPase RAL aus der Familie der RAS-GTPasen wird als Downstream-Effektor von RAS angesehen, der damit ebenfalls zur Aufrechterhaltung des Tumorzellüberlebens beitragen könnte. In einigen Tumorentitäten konnte bisher gezeigt werden, dass eine Überexpression von RAL in den Tumorzellen vorliegt und die Proliferation und Apoptose von Tumorzellen durch RAL beeinflusst wird. Daher stellte sich die Frage, ob RAL im MM ebenfalls das Überleben von Tumorzellen beeinflusst und ob eine direkte Verbindung zwischen onkogenem RAS und RAL besteht. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle von RAL sowie dessen Zusammenhang mit onkogenem RAS im MM untersucht. Hierbei konnte eine Überexpression von RAL in MM-Zellen im Vergleich zu MGUS oder normalen Plasmazellen beobachtet werden. In Knockdown-Analysen wurde gezeigt, dass RAL überlebensnotwendig für MM-Zellen ist. Dabei wurde in Western Blot-Analysen festgestellt, dass diese Überlebenseffekte unabhängig von MAPK/ERK-Signaling vermittelt werden. Es konnte teilweise jedoch eine Abhängigkeit von der AKT-Aktivität beobachtet werden. Da RAL-Knockdown Einfluss auf das Überleben von MM-Zellen hat, wurde eine pharmakologische Inhibition von RAL durch den Inhibitor RBC8 untersucht. RBC8 zeigte in höheren Dosen nur bei einem Teil der MM-Zelllinien eine Wirkung auf das Zellüberleben sowie auf die RAL-Aktivierung. Die Weiterentwicklung potenter RAL-Inhibitoren ist daher für eine klinische Translation einer RAL-Inhibition von großer Bedeutung. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen onkogenem RAS und der RAL-Aktivierung wurden RAL-Pulldown-Analysen nach Knockdown von onkogenem RAS durchgeführt. In diesen Experimenten wurde keine Abhängigkeit der RAL-Aktivierung von onkogenem RAS festgestellt. Darüber hinaus zeigten Genexpressionsanalysen nach RAS- bzw. RAL-Knockdown unterschiedliche Genexpressionsprofile. In Massenspektrometrie-Analysen wurden mögliche Effektoren, die mit RAL an der Beeinflussung des Zellüberlebens beteiligt sein könnten, untersucht. Hierbei wurden die Komponenten des Exozyst-Komplexes EXO84 und SEC5 als Interaktionspartner von RAL identifiziert. Nachdem gezeigt wurde, dass RAL ausschlaggebend für das Überleben von MM-Zellen ist, wurde eine Kombination von RAL-Knockdown mit klinisch relevanten Wirkstoffen analysiert. Diese zeigte bei der Kombination mit PI3K oder AKT-Inhibitoren verstärkte Effekte auf das Zellüberleben der MM-Zellen. Zusammenfassend wurde die Bedeutung von RAL für das Überleben von Tumorzellen im MM gezeigt und RAL als potentielles therapeutisches Target im MM beschrieben, welches unabhängig von onkogenem RAS reguliert wird. N2 - Multiple myeloma (MM) is a hematologic neoplasia which is characterized by monoclonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow leading to hematopoetic failure, bone lesions and renal failure. Although continuous development of existing therapeutics and new therapeutic options vastly improved MM patient survival, MM still remains an incurable disease. Oncogenic mutations and the bone marrow microenvironment contribute to a signaling network which sustains MM cell proliferation and survival. Within this network mutations of the RAS oncogene account for up to 50 % of MM patients. Despite its prevalence and importance not only in MM, RAS still remains undruggable. The GTPase-family Member RAL is considered as a RAS effector which might also influence maintainance of tumor cell survival. In several tumor entities RAL is overexpressed in tumor cells and influences proliferation and apoptosis. Therefore, in MM RAL might also be controlled by oncogenic RAS and mediate cell survival of tumor cells. In this work, RAL’s functional role as well as the potential interconnection with oncogenic RAS was investigated. In MM cells RAL is ovexpressed compared to non-malignant MGUS or plasma cells. Knockdown analyses showed that RAL is essential for MM cell survival. These survival effects are transferred independently of MAPK/ERK signaling as shown by Western Blot analysis. However, to some extent RAL influenced MM cell survival dependently of AKT activity. Because RAL knockdown had a significant effect on MM cell survival a pharmacological inhibition was tested using the inhibitor RBC8. In a portion of MM cell lines RBC8 exerts effects on cell survival. But the effects of RBC8 on RAL activation were only visible at higher concentrations as shown by pulldown assays. Thus, subsequent development of potent RAL inhibitors is of major importance for clinical translation. To investigate whether RAL is directly activated by oncogenic RAS, RAL pulldown assays were performed after knockdown of oncogenic RAS. Strikingly, there was no direct connection between the presence of oncogenic RAS and RAL activation. Furthermore, gene expression profiles after RAS or RAL knockdown showed differing expression signatures. Potential effectors of RAL which might also influence MM cell survival were investigated in mass spectrometric analyses where the exocyst complex components EXO84 and SEC5 were identified as RAL interaction partners. Since RAL is of importance for MM cell survival, RAL knockdown was combined with clinically relevant agents. There was an enhanced induction of apoptosis upon combination of PI3K or AKT inhibitors with RAL knockdown. Taken together, the influence of RAL as a crucial mediator of MM cell survival was shown in this work. Therefore, RAL represents a potential therapeutic target which is regulated independently of oncogenic RAS. KW - Kleine GTP-bindende Proteine KW - Signaltransduktion KW - Plasmozytom KW - RAL KW - Multiples Myelom KW - Zellüberleben KW - Knochenmark Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208003 ER - TY - THES A1 - Behrmann, Christoph T1 - MicroRNA-221 sensitiviert Prostatakarzinomzellen gegenüber TRAIL durch Inhibition von SOCS-3 und PIK3R1 T1 - MicroRNA-221 sensitizes prostate cancer cells to TRAIL via inhibition of SOCS-3 and PIK3R1 N2 - MicroRNA-221 (miR-221) führt in Prostatakarzinomzellen zu einer Induktion einer TRAIL-supprotiven Signatur als Folge einer Interferonaktivierung mit Heraufregulation von STAT-1 und den TRAIL-relevanten, interferonsensitiven Genen TNFSF-10 und XAF-1. Ferner führt die Inhibierung des bekannten Zielgenes SOCS-3 sowie die Inhibierung des neu beschriebenen Zielgenens PIK3R1 zu einer TRAIL-Sensitivierung in den untersuchten Prostatakarzinomzellen. N2 - MicroRNA-221 (miR-221) mediates TRAIL-sensitivation of prostate cancer cells via inducing an TRAIL-supportive signature. This was shown by upregulation of STAT-1 and the TRAIL inducing the interferone sensitive genes XAF-1 and TNFSF-10. Furthermore the inhibition of two miR-221 targets mediates TRAIL sensitivation. The inhibition of the known target SOCS-3 and the new target PIK3R1 both led to TRAIL sensitivation of prostate cancer cells. KW - microrna KW - Prostatakarzinom KW - tumor necrosis factor KW - microRNA-221 KW - TRAIL KW - PIK3R1 KW - SOCS-3 Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199205 ER - TY - THES A1 - Kögl, Katharina Anna Edith T1 - Analyse des Qualitätsindikators Reduktion Schmerz und des Qualitätsindikators Opioide und Laxantien der S3-Leitlinie Palliativmedizin für Patienten mit einer nicht heilbaren Krebserkrankung T1 - Quality Indicator Reduction of Pain and Quality Indicator Opioids and Laxatives proposed in the german S3 Guideline Palliative care for patients with incurable cancer N2 - Hintergrund: Die Qualitätsindikatoren „QI2: Reduktion Schmerz“ und „QI 3: Opiate und Laxantien“ der S3-Leitlinie „Palliativmedizin für Patienten mit einer nicht heilbaren Krebserkrankung“ von 2015 wurden pilotiert und hinsichtlich ihrer Erhebbarkeit, Eindeutigkeit und Vergleichbarkeit evaluiert. Damit sollte die Routinetauglichkeit der Qualitätsindikatoren überprüft und ein Beitrag zu deren Weiterentwicklung geleistet werden. Methodik: Die Qualitätsindikatoren wurden retrospektiv für die Patientinnen und Patienten der Palliativstation des Universitätsklinikums Würzburg der Jahre 2015 und 2018 mit der Hauptdiagnose einer nicht heilbaren Krebserkrankung ausgewertet. Aufbauend auf den Vorgaben der S3-LL Palliativ Langversion 1.0 2015 wurde der Qualitätsindikator Reduktion Schmerz (QI RS) für den gesamten Zeitraum des stationären Aufenthalts erhoben. Der Qualitätsindikator Opioide und Laxantien wurde am 3. Tag des stationären Aufenthalts (QI OL T1) und am 3. Tag vor stationärer Entlassung (QI OL T2) erhoben. Ergebnisse: Bei 78,5% der Grundgesamtheit wurden moderate bis starke Schmerzen dokumentiert und für den QI RS eingeschlossen (419/534). Die Datengrundlage des QI RS war für die eingeschlossenen Fälle vollständig, da Schmerzanamnesen im Schmerzassessment der pflegerischen Dokumentation integriert sind: Unter den eingeschlossenen Fällen lag nach den Kriterien des QI RS bei insgesamt 73,5% (308/419) eine dokumentierte Schmerzreduktion vor. Bei 26,5% aller eingeschlossenen Fälle (111/419) lag nach den Kriterien des QI RS keine dokumentierte Schmerzreduktion vor. Unter jenen Fällen lag der Anteil der stationär Verstorbenen bei 64,0% (71/111). Es lag ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Fehlen einer dokumentierten Schmerzreduktion und dem Versterben vor (p<0,05). 73,4% (392/534) der Grundgesamtheit wurden für den QI OL T1 eingeschlossen, da eine Therapie mit Opioiden an T1 dokumentiert war. 75,8% (405/534) der Grundgesamtheit wurde für den QI OL T2 eingeschlossen, da eine Therapie mit Opioiden an T2 dokumentiert war. Aufgrund der Vollständigkeit der Routinedokumentation konnte die Auswertung des QI OL T1 bzw. des QI OL T2 bei allen eingeschlossenen Fällen vorgenommen werden: Am 3. Tag des stationären Aufenthalts lag der Anteil dokumentierter Laxantien bei Opioidtherapie mit 57,9% (227/392) etwas höher als am 3. Tag vor stationärer Entlassung mit 53,8% dokumentierter Laxantien bei Opioidtherapie (218/405). Unter den Fällen ohne Laxantien bei Opioidtherapie an T1 verstarben mit 58,8% (97/165) weniger als unter den Fällen ohne Laxantien bei Opioidtherapie an T2 mit 67,4% (126/187). Es zeigt sich sowohl für den QI OL T1 als auch für den QI OL T2 ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Fehlen dokumentierter Laxantien bei Opioidtherapie und dem Versterben (p<0,001). Schlussfolgerung: Die vorliegende Studie belegt die Sinnhaftigkeit der Evaluation von Qualitätsindikatoren für die Palliativversorgung. Exemplarisch zeigt die Erhebung des Qualitätsindikators Opioide und Laxantien in der Sterbephase, dass regelmäßig von der Leitlinienempfehlung abgewichen wird. In der Erweiterten S3-LL Palliativ Langversion 2.0 von 2019 wurde der genaue Erhebungszeitpunkt des „QI2: Reduktion Schmerz“ präzisiert: Eingeschlossen für die Erhebung sind nun alle Patienten mit starkem bzw. mittleren Schmerz „bei stationärer Aufnahme“. N2 - Background: The German S3 Guideline Palliative Care for patients with incurable cancer proposes the Quality Indicator (QI) „Reduction of Pain“ and the QI „Opioids and Laxatives“ to evaluate the quality of palliative care. Aim: To analyze these QI in cancer patients during their stay in a specialized palliative care unit. Methods: Data were collected retrospectively from patients‘ files of Interdisciplinary Center Palliative Care of Wuerzburg from the year 2015 and 2018. The QI „Reduction of Pain“ was analyzed continously from patients' first day to their last day on palliative care unit. The QI „Opioids and Laxatives“ was analyzed regarding the third day on the palliative care unit (T1) and the day 3 before dismissal (T2). Results: 534 files from cancer patients were analyzed in total. 419 of all patients were included in the QI „Reduction of Pain“ as well as 392 of them in the QI „Opioids and Laxatives“ T1 and 405 in the QI „Opioids and Laxatives“ T2. For 308 of 419 patients reduction of pain was documented (308/419, 73.5%). 227 of 392 patients were treated with opioids and laxatives at T1 and 218 of 405 patients were treated with opioids and laxatives at T2 (T1: 227/392, 57.9%, T2: 218/405, 53.8%). Regarding the QI „Reduction of Pain“ significant more deceased patients had no reduction of pain (71/111, 64.0%, p<0.05). Regarding the QI „Opioids and Laxatives“ T1 as well as the QI „Opioids and Laxatives“ T2 significant more deceased patients received opioids without laxatives (T1: 97/165, 58.8%, T2: 126/187, 67.4%, p<0,01). Conclusion: The QI were easy to assess using patients‘ files. Evaluation of QI isn’t reasonable during the whole stay, e.g. because of cancelling prescreption of laxatives in dying phase. Therefore the wording of the QI „Reduction of Pain“ was specified 2019 in the Extended S3 Guideline Palliative care for patients with incurable cancer. Since then the QI „Reduction of Pain“ refers to all “patients with the diagnosis “incurable cancer” (receiving generalist or specialist palliative care) and with moderate/severe pain at inpatient admission“. KW - Tumor KW - Palliativmedizin KW - Qualitätsindikatoren KW - S3-Leitlinie Palliativmedizin Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-254919 ER - TY - THES A1 - Munawar, Umair T1 - Functional analysis of oncogenic lesions in multiple myeloma with potential significance for refractory disease T1 - Funktionelle Analyse onkogener Läsionen beim Multiplen Myelom mit potenzieller Bedeutung für einen refraktären Krankheitsverlauf N2 - Despite the advancement in the treatment from genotoxic drugs to more targeted therapies, multiple myeloma (MM) remains incurable. MM is known for its complex genetic heterogeneity as different genetic lesion accrue over the course of the disease. The current work focuses on the functional analysis of genetic lesions found at the time of diagnosis and relapse and their potential role regarding therapy response and refractory disease. Genetic lesions involving tumor suppressor gene TP53, are found at diagnosis and tend to accrue during disease progression. Different types of mono- and biallelic TP53 alterations were emulated in the AMO1 cell line model, were functionally characterized and tested for their potential role in therapy response. Both types of single hit TP53 alteration (deletion 17p and TP53 point mutations) were found to have similar adverse effects on the functionality of the p53 system and response to genotoxic drugs which were completely abolished in the case of double hit TP53 alterations (no p53 expression, or mutant overexpression in wild type TP53 deletion background). Whereas, sensitivity to proteasome inhibitors remained unaltered. Using the clonal competition assay (CCA), single TP53 hit clones were found to have a fitness advantage over wildtype cells. Proliferative cell fitness was further enhanced in double hit TP53 clones, as they dominated wildtype and single hit TP53 clones in the CCA. Presence of external selection pressure in the form of low dose melphalan expedited the intrinsic fitness advantage. Alterations found in CUL4B, a component of CRL4-CRBN protein complex, a target of immunomodulatory drugs (IMiDs), were also functionally analyzed in the current study. Hotspot mutations and mutations found in IMiDs refractory patients were modelized in L363 cells and their role in IMiDs sensitivity was studied. CUL4B mutations were found not to be involved in providing lenalidomide resistance to the cell, whereas knocking CUL4B out was observed to provide negative fitness to the cells in CCA. In the presence of external selection pressure, these clones showed fitness, which was lost in the case of lenalidomide withdrawal. This shows that some alterations may play a role in refractory patients only in the presence of therapy, and as soon as therapy is discontinued, these altered clones may disappear such as clones with alterations in CUL4B. On the other hand, some alterations provide drug-independent intrinsic positive fitness, however, be further enhanced by drug exposure, such as seen in case of TP53 altered clones. Therefore, close monitoring and functional analysis of evolving clones is desired during disease progression, as it can be helpful in therapeutic guidance to achieve a better outcome for patients. N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist im Normalfall eine unheilbare Erkrankung, trotz etlicher Fortschritte hinsichtlich der Behandlung, angefangen von genotoxischen Medikamenten bis hin zu zielgerichteten Therapien. Eine komplexe genetische Heterogenität, bei der sich Läsionen im Verlauf der Krankheit ansammeln, ist typisch für das MM. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen Analyse von genetischen Läsionen zum Erstdiagnose-Zeitpunkt bzw. Rezidiv und ihrer potenziellen Bedeutung bezüglich des Ansprechens auf die Therapie und einer refraktären Verlaufsform. Genetische Veränderungen des Tumorsuppressorgens TP53 sind mitunter schon bei der Erst-Diagnose nachweisbar und nehmen im Krankheitsverlauf weiter zu. Deshalb wurden verschiedene mono- und biallelische TP53 Mutationen in AMO1 Zelllinien-Modellen nachgebildet, funktionell charakterisiert und auf ihre potenzielle Rolle im Therapie-Ansprechen getestet. Dabei wurden für beide Formen von single hit TP53 Alterationen (17p Deletionen und TP53 Punktmutationen) ähnlich nachteilige Effekte auf die Funktionalität des p53 Systems und das Ansprechen auf genotoxische Medikation gefunden. Im Falle von double hit TP53 Alterationen (keinerlei p53 Expression oder aber hohe Spiegel von mutiertem p53 bei TP53 wildtype deletierem Hintergrund) wurden diese Effekte noch weiter verstärkt. Die Sensitivität gegenüber Proteasom-Inhibitoren blieb indessen unbeeinträchtigt. Mithilfe des Clonal Competition Assays (CCA), wurde festgestellt, dass single hit TP53 Klone gegenüber wildtypischen Zellen einen Fitnessvorteil haben. In double hit TP53 Klonen war die proliferative Zell-Fitness zu dem gesteigert, sodass diese über wildtypische und single hit TP53 Klone im CCA dominierten. Die Anwesenheit eines externen Selektionsdrucks in Form von Niedrigdosis-Melphalan verstärkte zusätzlich den intrinsischen Fitnessvorteil. Aberrationen in CUL4B, einer Untereinheit des CRL4-CRBN Protein Komplexes, dem Angriffspunkt der Immunmodulatoren (IMiDs), wurden in dieser Studie ebenfalls funktionell analysiert. Hotspot Mutationen und solche Mutationen, die gehäuft in IMiD refraktären Patienten auftreten, wurden in L363 Zellen modelliert und hinsichtlich ihres Einflusses auf die IMiD Sensitivität untersucht. CUL4B Mutationen waren nicht in Lenalidomid-Resistenz involviert, ein Knockout von CUL4B äußerte sich aber in einer negativen Allgemeinzustand der Zellen im CCA. In Anwesenheit eines externen Selektionsdrucks, zeigten diese Klone einen Fitnessvorteil, der wieder verloren ging, wenn kein Lenalidomid mehr zugegeben wurde. Dies zeigt, dass manche Alterationen nur dann eine Rolle in refraktären Patienten zu spielen scheinen, wenn diese therapiert werden. Sobald die Therapie eingestellt oder unterbrochen wird, könnten solche Klone verschwinden wie z.B. CUL4B-Alterationen. Auf der anderen Seite bedingen manche Veränderungen wiederum einen Medikamenten-unabhängigen, intrinsisch Fitnessvorteil, der jedoch durch Medikamenten-Exposition noch zusätzlich verstärkt werden kann, wie beispielweise bei TP53 mutierten Klonen. Daher ist eine engmaschige Überwachung während der Krankheits-Progression sowie eine funktionelle Analyse der sich entwickelnden Klone wünschenswert. Dies könnte für die therapeutische Beratung hilfreich sein um somit ein besseres Behandlungsergebnis für die Patienten zu erzielen. KW - TP53 KW - Myeloma KW - Cul4b KW - MM KW - TP53 lesions KW - Clonal competition assay Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216446 ER - TY - THES A1 - Koch, Hanna Ulrike T1 - Funktionelle Untersuchung von IGF1R Mutationen im Multiplen Myelom T1 - Functional Investigation of IGF1R Mutations in Multiple Myeloma N2 - Das Mutationsspektrum einzelner Gene beziehungsweise zusammengefasster Gengruppen innerhalb von Signalwegen bei Patienten mit Multiplem Myelom wurde in den letzten Jahren eingehend untersucht und charakterisiert. Die Herausforderung besteht nun in der Interpretation der erhobenen Daten, insbesondere der Bewertung einzelner durch Sequenzierung identifizierter Biomarker bezüglich deren prognostischer Aussagekraft und konkreter therapeutischer Relevanz. Als übergeordnetes Ziel gilt die Ableitung von klinischen (Therapie-) Ansätzen. Auf dem Weg zu einem individualisierten Therapieansatz ist entscheidend, dass wir unser Wissen über die funktionelle Relevanz einzelner Mutationen wie hier im IGF1R im Hinblick auf deren Einbettung in Signalnetzwerke und auf das Proliferationsverhalten der MM Zellen erweitern. Konkret wurde im Rahmen der vorliegende Doktorarbeit der Einfluss von zwei IGF1R Punktmutationen, nämlich D1146N (Punktmutation des IGF1R der HMCL L-363) und N1129S (Punktmutation des IGF1R eines Patienten der DSMM XI Kohorte) auf die Proliferation und das nachgeschaltete Signalling in IGF1R-Überexpressionsmodellen der MM Zelllinien AMO-1 und U-266 untersucht. Zur stabilen Transfektion der HMCLs mit IGF1RWT und den zwei IGF1R Mutanten wurde ein Protokoll auf Grundlage des Sleeping Beauty (SB) Transposase Systems genutzt. In dieser und anderen assoziierten Arbeit konnte unter zu Hilfenahme von insgesamt vier verschiedenen gentechnisch veränderter HMCLs gezeigt werden, dass funktionelle Mutationen im IGF1R Effekte auf das Downstream Signalling zum Beispiel die Aktivierung von AKT und ERK, jedoch nicht auf die Zellproliferation haben. Im Vergleich der untersuchten HMCLs konnten jedoch keine verallgemeinerbaren Schlüsse gezogen werden, was die Heterogenität der Erkrankung und die Wichtigkeit der Einzelfallbetrachtung unterstreicht. N2 - Multiple myeloma (MM) is a malignant disease of the plasma cell and represents around 15% of all hematological neoplasms. There is a marked heterogeneity in terms of the severity of the disease, the progression and prognosis of the patients. This is also reflected in the underlying genetic heterogeneity. Genetic screenings at diagnosis and during the course of the disease are therefore essential. However, a better understanding of the pathogenesis of MM and the influence of individual genetic aberrations is essential to achieve improvements in personalized, targeted and, above all, risk-adapted therapy. The dysregulation of Receptor Tyrosine Kinases (RTKs), which significantly influences growth and progression, plays a decisive role in many types of cancer. Hence, RTKs also represent interesting target structures for cancer therapy. Specific RTK inhibitors have been a fixed element of oncological therapy in guidelines for many years with good therapeutic results, e. g. for breast, colon, or lung cancer. RTK signal transduction also plays an important role in MM. In a next generation sequencing study on a MM cohort, tumor-associated mutations were detected in RTK genes, which were associated with a significantly poorer prognosis. IGF1R was among the most frequently mutated RTKs in this. It has a decisive influence on e. g. cell proliferation of MM cells and therefore plays an important role in the pathogenesis of MM. Studies also suggest a connection between IGF1R overexpression and disease progression. IGF1R inhibitors were tested in clinical phase 1 studies as a monotherapy without significantly improved clinical response. However, in combination schemes with dexamethasone and bortezomib in patients with relapsed or refractory disease better results have been achieved. They cause manageable side effects and are promising concerning the length and depth of remission, especially in proteasome inhibitor refractory patients. Based on this information a project of the AG Leich aimed to study the influence of IGF1R and specifically IGF1R mutations in different HMCLs by means of functional analysis to identify patient cohorts, who might benefit from a therapy with IGF1R inhibitors. More specifically, the influence of two IGF1R mutations, namely D1146N (point mutation of IGF1R in the HMCL L-363) and N1129S (point mutation of IGF1R in a patient of the DSMM XI cohort), on proliferation and downstream signaling was to be investigated in IGF1R-overexpression models of the HMCLs AMO-1 and U-266 in this doctoral thesis. A protocol based on the Sleeping Beauty (SB) Transposase System was used for stable transfection of the HCMLs with IGF1RWT and the two IGF1R mutants. An increased expression or activation of downstream effectors could be detected in AMO-1. For example, the degree of phosphorylation of MEK and ERK in all three AMO-1 IGF1R overexpression cell lines (WT and two IGF1R mutant cell lines) under normal cell culture conditions seemed to be elevated in comparison to the empty vector control. However, no mutant specific differences could be detected even after stimulation with IGF1. Regarding IGF1R overexpression cell lines that were derived from U-266, expression and activation of IGF1R was especially pronounced for the IGF1R mutant IGF1RN1129S. In contrast, expression and activation of AKT, MEK and ERK in this IGF1R mutant overexpression cell line compared to the WT overexpression cell line, were not distinctively higher. Thus, it seems as if the role of IGF1R in different HMCLs varies, which could be also shown in other MM in vitro studies. The proliferation rate of the individual cell lines was not measured higher due to the overexpression of IGF1R, although important kinases such as AKT, MEK and ERK with their great importance concerning survival, growth and proliferation had been induced. Examinations with the IGF1R inhibitor Linsitinib on different HMCLs in subsequent studies of the AG Leich showed a reduction in metabolism in six out of seven cell lines, whereby the response was highly variable across cell lines and was independent of the IGF1R expression level or the IGF1R mutational status. Clear signs of apoptosis could be only detected in the HMCL MM1.S. An additive effect when combining Linsitinib with the proteasome inhibitor Carfilzomib, mostly used for therapy of refractory MM, was only detected in the IGF1R mutated HMCL L-363. Therefore, this combination might be a promising approach for patients with refractory MM, especially for patients with a IGF1R mutation. However, those compiled preliminary findings should be examined more closely in further in vitro and in vivo studies to determine the therapeutic potential of IGF1R inhibitors applied solely or in combination schemes with other specific inhibitors (e. g. iAKT or iMEK) or licensed standard drugs for patients with IGF1R mutations. KW - Plasmozytom KW - IGF1R Mutationen KW - Multiples Myelom KW - Funktionelle Untersuchung KW - Insulin-like Growth Factor I KW - IGF1 Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-370406 ER - TY - THES A1 - Pickert, Julia Felicia T1 - Untersuchungen zum Einfluss des Insulin-like growth factor Rezeptors auf Signalnetzwerke im Multiplen Myelom T1 - Investigating the influence of the insulin-like growth factor receptor on signalling networks in multiple myeloma N2 - Das MM ist eine maligne Erkrankung, die von biologischer und klinischer Heterogenität geprägt ist. Sie ist durch die monoklonale Vermehrung von Plasmazellen charakterisiert. In vorangegangenen Studien wurde eine Häufung von Mutationen in RTK nachgewiesen. Diese gingen mit einem negativen Einfluss auf das Überleben von MM Patientinnen und Patienten einher. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss des IGF1R an HMZL mittels siRNA-vermitteltem IGF1R-Knockdown untersucht und dessen Effekt auf das Signalnetzwerk mittels Western Blot Analysen ermittelt. Um die Heterogenität des MM besser abzubilden, wurden sechs verschiedenen HMZL ausgewählt. Der IGF1R-Knockdown war in allen HMZL sowohl anhand der Reduktion der IGF1R-Expression als auch der IGF1R-Aktivierung deutlich nachweisbar. Stellvertretend für den PI3K/AKT Signalweg wurde die AKT-Aktivierung untersucht, welche nach IGF1R-Knockdown in allen Linien abnahm. Im Ras/Raf/MEK/ERK Signalweg fiel eine deutliche Reduktion der ERK1/2- und MEK-Aktivierung in den von PCL stammenden HMZL L-363 und MM.1S, sowie in JJN-3 mit der Hochrisikotranslokation t(14;16) auf. Entsprechend der Beobachtungen für die AKT-Aktivierung, nahm die PYK2-Aktivierung in allen HMZL nach IGF1R-Knockdown ab, was auf ein Zusammenspiel von IGF1R, PYK2 und AKT in allen HMZL hindeutet. Zukünftige Untersuchungen werden zeigen, ob IGF1R Inhibitoren alleine oder in Kombination mit z.B. AKT, PYK2 oder Proteasomen-Inhibitoren in bestimmten molekularen MM Subgruppen ein effektives therapeutisches Ziel sind. N2 - MM is a haematological malignancy of great biological and clinical heterogeneity. It is characterised by monoclonal proliferation of plasma cells. The accumulation of mutations in RTK has previously been reported and was associated with a negative impact on MM patient survival. The IGF1R influence on its downstream signaling in HMCL was investigated using a siRNA mediated IGF1R-knockdown and Western Blot analysis. Six different HMCL were chosen to reflect this heterogenous disease. The IGF1R-knockdown successfully reduced both expression and activation level of IGF1R in all HMCL. Furthermore, phosphorylation level of AKT, representing the PI3K/AKT pathway, decreased in all six HMCL following the IGF1R-knockdown. For the analysis of the Ras/Raf/MEK/ERK pathway both ERK1/2 and MEK were selected. Following the IGF1R-knockdown phosphorylation level of ERK1/2 and MEK were reduced in HMCL L-363 and MM.1S, both derived from patients with plasma call leukaemia and in JJN-3 which harbours t(14;16), a high risk translocation. In accordance with decreased activation level in AKT the IGF1R-knockdown resulted in reduced phosphorylation level of PYK2 in all six HMCL suggesting an interaction of IGF1R, PYK2 and AKT. Future research will reveal whether IGF1R inhibition by itself or in combination with e.g. AKT, PYK2 or proteasome inhibitors will be an effective therapeutic target in selected molecular MM subgroups. KW - Plasmozytom KW - Rezeptor KW - Insulin-like Growth Factor KW - Multiples Myelom KW - Insulin like-growth factor Rezeptor KW - Multiple Myeloma Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369815 ER - TY - THES A1 - Bönninger, Solveig Eva T1 - Förderliche und hinderliche Faktoren im Trauerprozess von Nahestehenden eines*r Verstorbenen T1 - Supporting and Hindering Factors in the Grieving Process of Close Relatives of a Deceased Person N2 - Laut Statistischem Bundesamt (Destatis) starben allein im Jahr 2020 zirka 985.500 Menschen. Die häufigsten Todesursachen waren Herz-Kreislauf- und Krebs-Erkrankungen (vgl. Destatis 2020). Die meisten Menschen haben den Wunsch zuhause zu sterben, doch die Mehrheit stirbt in Krankenhäusern, Alten- und Pflegeheimen (vgl. DHPV 2017; Dasch et al. 2015). Der Tod eines nahestehenden Menschen kann bei Hinterbliebenen zu großen Belastungen, gesundheitlichen Problemen sowie einer gesteigerten Mortalität führen (vgl. Stroebe et al. 2007). Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von halbstandardisierten Interviews mit 30 Trauernden Faktoren herauszuarbeiten, die sich förderlich oder hinderlich auf den Trauerprozess auswirken können. Die Interviews wurden mit der Transkriptionssoftware f4transkript verschriftlicht und mittels qualitativer Inhaltsanalyse nach Mayring ausgewertet. Es entstand ein Kategoriensystem mit je vier Oberkategorien innerhalb der zwei Hauptkategorien, Förderliche und Hinderliche Faktoren. Folgende Faktoren konnten identifiziert werden: Förderliche Faktoren in der Oberkategorie Betreuung der erkrankten und trauernden Person sind eine gute Symptomkontrolle sowie der verständnisvolle Umgang mit den Nahestehenden, während mangelhafte Kommunikation wiederum hinderlich für eine positive Trauerbewältigung ist. In der Oberkategorie Intrapersonale Faktoren sind die Antizipation des Todes sowie die Auseinandersetzung mit der Trauer förderlich, während negative Gefühle (z.B. Schuldgefühle, Hilfslosigkeit) sich in besagter Hinsicht hinderlich auswirken. In der Oberkategorie Beziehung zur verstorbenen Person können die optimale Nutzung der verbliebenen Zeit sowie der offene Umgang mit der Erkrankung förderliche Faktoren darstellen, während ein “schwieriger“ Abschied sowie ungeklärte Konflikte oder offene Fragen Hindernisse für den Trauerprozess sein können. In der Oberkategorie Soziales Umfeld sind die unaufgeforderte Unterstützung, die emotionale Begleitung sowie ein flexibler Arbeitgeber förderlich. Streitigkeiten innerhalb der Familie und Unverständnis der Mitmenschen dagegen sind hinderlich. Eine gute und würdevolle Sterbebegleitung, wie sie in der Palliativmedizin in der Regel gewährleistet ist, ist von großer Bedeutung für einen gelingenden Trauerprozess. Daher sollte eine palliative Haltung disziplinübergreifend vorangebracht und ausgebaut werden. In der Gesellschaft sollte Trauernden mehr Toleranz und Verständnis entgegengebracht und offen mit dem Thema Tod und Sterben umgegangen werden. N2 - According to the German Federal Statistical Office (Destatis), approximately 985,500 people died in the year 2020 in Germany. The most common causes of death were cardiovascular diseases and cancer (cf. Destatis 2020). Most people wish to die at home, but the majority die in hospitals and care facilities (cf. DHPV 2017; Dasch et al. 2015). The death of a close person can lead to significant difficulties, health problems, and increased mortality among the bereaved (cf. Stroebe et al. 2007). The aim of this study was to identify factors that can have a supporting or hindering effect on the grieving process by conducting semi-structured interviews with 30 mourners. The interviews were transcribed using the f4transkript transcription software and evaluated using qualitative content analysis according to Mayring. A category system was developed with four subcategories within the two main categories, Supporting and Hindering Factors. The following factors were identified: Supporting factors in the subcategory "Care of the sick and grieving person" include good symptom control and understanding treatment of the relatives, while poor communication, in turn, is a hindrance to positive grief coping. In the subcategory "Intrapersonal factors", the anticipation of death and dealing with grief are supportive, while negative emotions (e.g., feelings of guilt, helplessness) have a hindering effect in this regard. In the subcategory "Relationship with the deceased person", optimal use of the remaining time and open handling of the illness can be supporting factors, while a "difficult" farewell and unresolved conflicts or open questions can be obstacles to the grieving process. In the subcategory "Social environment", unsolicited support, emotional companionship, and a flexible employer are supporting. Family disputes and a lack of understanding from others, on the other hand, are hindering. Good and dignified end-of-life care, as is generally ensured in palliative medicine, is of great importance for a successful grieving process. Therefore, a palliative attitude should be promoted and expanded across disciplines. In society, more tolerance and understanding should be shown to mourners, and the topic of death and dying should be dealt with openly. KW - Trauer KW - Trauerarbeit KW - Prolonged grief disorder KW - Trauerprozess KW - Soziales Umfeld KW - Beziehung zur verstorbenen Person KW - Medizinisch-psychologische Betreuung KW - Intrapersonale Faktoren KW - Milieu Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-364319 ER -