TY - THES A1 - Lux, Thomas Joachim T1 - Characterization of Junctional Proteins in the Dorsal Root Ganglion of Rats with Traumatic Nerve Injury T1 - Charakterisierung von Junktionsproteinen im Spinalganglion von Ratten mit traumatischer Nervenverletzung N2 - In my thesis, I characterized aGPCRs Adgrl1 and Adgrl3, tight junction proteins and the blood-DRG-barrier in rats’ lumbar dorsal root ganglions after traumatic neuropathy. In contrast to the otherwise tightly sealed barriers shielding neural tissues, the dorsal root ganglion’s neuron rich region is highly permeable in its healthy state. Furthermore, the DRG is a source of ectopic signal generation during neuropathy; the exact origin of which is still unclear. I documented expression of Adgrl1 and Adgrl3 in NF200 + , CGRP + and IB4 + neurons. One week after CCI, I observed transient downregulation of Adgrl1 in non-peptidergic nociceptors (IB4+). In the context of previous data, dCirl deletion causing an allodynia-like state in Drosophila, our research hints to a possible role of Adgrl1 nociceptive signal processing and pain resolution in neuropathy. Furthermore, I demonstrated similar claudin-1, claudin-12, claudin-19, and ZO-1 expression of the dorsal root ganglion’s neuron rich and fibre rich region. Claudin-5 expression in vessels of the neuron rich region was lower compared to the fibre rich region. Claudin-5 expression was decreased one week after nerve injury in vessels of the neuron rich region while permeability for small and large injected molecules remained unchanged. Nevertheless, we detected more CD68+ cells in the neuron rich region one week after CCI. As clinically relevant conclusion, we verified the high permeability of the neuron rich regions barrier as well as a vessel specific claudin-5 downregulation after CCI. We observed increased macrophage invasion into the neuron rich region after CCI. Furthermore, we identified aGPCR as potential target for further research and possible treatments for neuropathy, which should be easily accessible due to the blood-DRG-barriers leaky nature. Its precise function in peripheral tissues, its mechanisms of activation, and its role in pain resolution should be evaluated further. N2 - Die vorliegende Arbeit charakterisiert die aGPCR Adgrl1 und Adgrl3, repräsentative Tight Junction Proteine, sowie die Blut-Spinalganglion-Schranke in lumbalen Spinalganglien von Ratten mit und ohne traumatische Neuropathie. Die hohe Permeabilität der zellulären, neuronenreichen Region von Spinalganglien in naiven Tieren ist eine der wenigen Ausnahmen der sonst sehr dichten Barrieren des Nervensystems. Ich konnte die Expression von Adgrl1 und Adgrl3 in NF200+ , CGRP+ und IB4+ Neuronen nachweisen. Eine Woche nach CCI war die Adgrl1 Expression in nicht-peptidergen Nozizeptoren (IB4+ ) vorübergehend herabreguliert. Zusätzlich konnten wir eine ähnliche Expression von Claudin-1, Claudin-12, Claudin-19 und ZO-1 in der neuronenreichen sowie der faserreichen Region zeigen. Claudin-5 ist in Gefäßen der neuronenreichen Region niedriger exprimiert als in Gefäßen der faserreichen Region. Nach Nervenläsion war die Claudin-5 Immunoreaktivität in Gefäßen der neuronenreichen Region reduziert, die Permeabilität für große und kleine Moleküle jedoch unverändert. Allerdings konnten wir nach traumatischer Nervenverletzung vermehrt Makrophagen in der neuronenreichen Region nachweisen. Weiterhin haben wir einen neuen endogenen antinozizeptiven Rezeptor, Adrlg1, ähnlich den Opioidrezeptoren, als potenzielles, und aufgrund der permeablen Blut-Spinalganglion-Schranke therapeutisch gut erreichbares, Target für die antineuropathische Therapie identifiziert. KW - Neuropathy KW - Neuropathic Pain KW - Claudin KW - Latrophilin KW - Tight Junction Proteins KW - Dorsal Root Ganglion Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251926 ER - TY - THES A1 - Klein, Thomas T1 - Establishing an in vitro disease model for Fabry Disease using patient specific induced pluripotent stem cell-derived sensory neurons T1 - Etablierung eines in vitro Krankheitsmodells für M. Fabry mittels patienteneigener sensibler Neurone, generiert über induzierte pluripotente Stammzellen N2 - Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by deficiency of the α-galactosidase A (GLA), leading to intracellular accumulations of globotriaosylceramide (Gb3). Acral burning pain, which can be triggered by heat, fever or physical activity is an early hallmark of FD and greatly reduces patients’ quality of life. The pathophysiology of FD pain is unknown and research is hindered by the limited in vivo availability of suitable human biomaterial. To overcome this obstacle, we generated induced pluripotent stem cells (iPSC) from one female and two male patients with a differing pain phenotype, and developed a refined differentiation protocol for sensory neurons to increase reliability and survival of these neurons, serving as an in vitro disease model. Neurons were characterized for the correct neuronal subtype using immunocytochemistry, gene expression analysis, and for their functionality using electrophysiological measurements. iPSC and sensory neurons from the male patients showed Gb3 accumulations mimicking the disease phenotype, whereas no Gb3 depositions were detected in sensory neurons derived from the female cell line, likely caused by a skewed X-chromosomal inactivation in favor of healthy GLA. Using super-resolution imaging techniques we showed that Gb3 is localized in neuronal lysosomes of male patients and in a first experiment using dSTORM microscopy we were able to visualize the neuronal membrane in great detail. To test our disease model, we treated the neurons with enzyme replacement therapy (ERT) and analyzed its effect on the cellular Gb3 load, which was reduced in the male FD-lines, compared to non-treated cells. We also identified time-dependent differences of Gb3 accumulations, of which some seemed to be resistant to ERT. We also used confocal Ca2+ imaging to investigate spontaneous neuronal network activity, but analysis of the dataset proofed to be difficult, nonetheless showing a high potential for further investigations. We revealed that neurons from a patient with pain pain are more easily excitable, compared to cells from a patient without pain and a healthy control. We provide evidence for the potential of patient-specific iPSC to generate a neuronal in vitro disease model, showing the typical molecular FD phenotype, responding to treatment, and pointing towards underlying electrophysiological mechanisms causing different pain phenotypes. Our sensory neurons are suitable for state-of-the-art microscopy techniques, opening new possibilities for an in-depth analysis of cellular changes, caused by pathological Gb3 accumulations. Taken together, our system can easily be used to investigate the effect of the different mutations of GLA on a functional and a molecular level in affected neurons. N2 - Morbus Fabry (M. Fabry) ist eine X-chromosomal vererbte lysosomale Speichererkrankung, die durch die Defizienz von α-Galaktosidase A (GLA) verursacht wird. Diese führt zu pathologischen Ablagerungen von Globotriaosylceramid (Gb3) in Zellen. Akraler, brennender Schmerz, der durch Hitze, Fieber oder Sport ausgelöst werden kann, ist ein frühes Krankheitsmerkmal und reduziert die Lebensqualität der Patienten deutlich. Die Pathophysiologie von M. Fabry ist unklar und die Forschung ist durch die limitierte Verfügbarkeit von humanem Biomaterial nur eingeschränkt möglich. Um dieses Problem zu bewältigen haben wir induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) von einer weiblichen Patientin und zwei männlichen Patienten mit unterschiedlichen Schmerzphänotypen generiert. Mit diesen Zellen konnten wir ein verbessertes Protokoll zur Herstellung sensibler Neurone etablieren um diese als in vitro Krankheitsmodell zu nutzen. Die Neurone wurden mittels Immunozytochemie, Genexpressionsanalyse und elektrophysiologischer Messungen auf die korrekte Zellidentität und deren Funktionalität getestet. Gb3 Ablagerungen konnten als Krankheitsmerkmal in iPSC und sensiblen Neuronen der männlichen Patienten, nicht aber in Zellen der weiblichen Patientin und der Kontrollperson nachgewiesen werden. Das Fehlen von pathologischen Ablagerungen in Zellen der weiblichen Betroffenen ist vermutlich auf eine verschobene X-Inaktivierung zu Gunsten des gesunden GLA zurückzuführen. Nichtsdestotrotz ist es uns durch die Nutzung hochauflösender Mikroskopietechniken gelungen, bei männlichen Patienten Gb3 in neuronalen Lysosomen nachzuweisen und die Membran in großem Detail abzubilden. Die Behandlung der Neurone mit der Enzymersatztherapie (ERT) als Nachweis für die Funktionalität des Krankheitsmodells führte zu einer Reduktion der Gb3 Ablagerungen bei männlichen Zellen, im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Zudem konnten wir unterschiedliche Arten von Gb3 Akkumulationen identifizieren, von denen einige scheinbar behandlungsresistent sind. Erste Versuche mit Ca2+ Imaging zeigten spontane, neuronale Netzwerkaktivität, die noch weitergehend analysiert werden müssen. Mittels Patch-Clamp Analysen konnten wir zeigen, dass Neurone des Patienten mit Schmerzen leichter erregbar sind als Zellen des Patienten ohne Schmerzen, was einen Hinweis auf die mögliche Beteiligung gestörter Ionenkanäle gibt. Wir konnten zeigen, dass patientenspezifische iPSC geeignet sind um ein neuronales in vitro Krankheitsmodell zu erstellen. Dieses Modell zeigt den typischen molekularen Phänotypen des M. Fabry, spricht auf ERT an und liefert erste Hinweise auf pathologische elektrophysiologische Krankheitsursachen, die zu unterschiedlichen Schmerzphänotypen führen können. Zelluläre Veränderungen durch Gb3 Ablagerungen können nun mittels neuester Mikroskopietechniken anhand der von uns generierten Neurone untersucht werden um ein besseres Verständnis der zugrundeliegenden Pathophysiologie zu bekommen. Zusammenfassend bietet unser System eine neue Möglichkeit den neuronalen Einfluss verschiedener GLA Mutationen auf einer funktionellen und molekularen Ebene zu untersuchen und die Diversität von M. Fabry aufzuschlüsseln. KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - iPSC KW - disease model KW - fabry disease KW - pain Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199705 ER - TY - THES A1 - Sasi, Manju T1 - A mouse model for genetic deletion of presynaptic BDNF from adult hippocampal mossy fiber terminals T1 - Mausmodell für genetische Deletion von präsynaptischem BDNF aus adulten hippokampalen Moosfaserterminalen N2 - Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is a modulator and mediator of structural and functional plasticity at synapses in the central nervous system. Despite our profound knowledge about the synaptic function of BDNF at synapses, it is still controversially discussed whether synaptic BDNF acts primarily from pre- or postsynaptic sites. In the central nervous system, several studies show that mossy fiber (MF) projections formed by hippocampal granule neurons store the highest amount of BDNF. However, immunofluorescence and RNA labelling studies suggest that MF BDNF is primarily produced by granule neurons. Multiple other studies prefer the view that BDNF is primarily produced by postsynaptic neurons such as CA3 pyramidal neurons. Here, we question whether the BDNF, which is stored in the mossy fiber synapse, is primarily produced by granule neurons or whether by other cells in the MF-CA3 microcircuit. After standardization of immunolabelling of BDNF, confocal imaging confirmed the localization of BDNF in presynaptic MF terminals. This anterograde location of synaptic BDNF was also found in distinct regions of the fear and anxiety circuit, namely in the oval nucleus of the bed nucleus stria terminals (ovBNST) and in the central amygdala. To find out whether the presynaptic BDNF location is due to protein translation in the corresponding presynaptic dentate gyrus (DG) granule neuron, we developed and characterized a mouse model that exhibits BDNF deletion specifically from adult DG granule neurons. In this mouse model, loss of presynaptic BDNF immunoreactivity correlated with the specific Creactivity in granule neurons, thus confirming that MF BDNF is principally released by granule neurons. After BDNF deletion from granule neurons, we observed more immature neurons with widely arborized dendritic trees. This indicated that local BDNF deletion also affects the local adult neurogenesis, albeit Cre-mediated BDNF deletion only occur in adult granule neurons. Since BDNF is a master regulator of structural synaptic plasticity, it was questioned whether it is possible to visualize presynaptic, synapse-specific, structural plasticity in mossy fiber synapses. It was established that a combination of Cre-techniques together with targeting of GFP to membranes with the help of palmitoylation / myristoylation anchors was able to distinctly outline the synaptic structure of the BDNF-containing MF synapse. In summary, the mouse model characterized in here is suited to investigate the synaptic signalling function of presynaptic BDNF at the mossy fiber terminal, a model synapse to investigate microcircuit information processing from molecule to behaviour. N2 - Der neurotrophe Wachstumsfaktor BDNF (brain-derived neurotrophic factor) ist ein Regulator und Vermittler von struktureller und funktionaler Plastizität in Synapsen des zentralen Nervensystems. Trotz des umfassenden Wissens über die synaptische Funktion von BDNF an Synapsen wird immer noch kontrovers diskutiert, ob synaptisches BDNF vorrangig von der prä- oder von der postsynaptischen Seite her agiert. Zahlreiche Studien zeigen, dass die größten BDNF Mengen des Zentralnervensystems in den Projektionen der hippocampalen Körnerzellen, den sogenannten Moosfasern (MF), enthalten sind. Während manche Studien basierend auf der Markierung von RNA und Immunofloureszenz nahelegen, dass MF BDNF in erster Linie von Körnerzellen produziert wird, bevorzugen zahlreiche andere Studien wiederum die Sicht, dass BDNF primär von postsynaptischen Neuronen wie beispielsweise den CA3 Pyramidenneuronen gebildet wird. In dieser Arbeit wurde die Fragestellung untersucht, ob das BDNF, welches in den Moosfasersynapsen enthalten ist, in erster Linie von Körnerzellen hergestellt wird, oder ob es hauptsächlich von anderen Zellen aus dem MF-CA3 Mikronetzwerk gebildet wird. Nachdem eine Standardisierung der Immunfluoreszenzmarkierung von BDNF etabliert wurde, konnte anhand von konfokaler Bildgebung die Lokalisierung von BDNF in den präsynaptischen MF Terminalen bestätiget werden. Diese anterograde Lokalisierung synaptischen BDNFs konnte außerdem in zwei weiteren Regionen des Furcht- und Angstnetzwerkes, genauer gesagt im ovalen Kern des bed nucleus stria terminalis (ovBNST) und in der zentralen Amygdala, nachgewiesen werden. Um Herauszufinden, ob die präsynaptische Lokalisation von BDNF von der Proteintranslation in den zugehörigen präsynaptischen Körnerzellen des Gyrus Dentatus abhängig ist, entwickelten und charakterisierten wir ein Mausmodel , welches die spezifische Deletion von BDNF aus den ausgereiften Körnerzellen des Gyrus Dentatus ermöglicht. In diesem Mausmodell korrelierte der Verlust präsynaptischer BDNF Immunreaktivität mit der spezifischen Cre-Aktivität in Körnerzellen, was bestätigt, dass MF BDNF hauptsächlich von den Körnerzellen ausgeschüttet wird. Nach BDNF Deletion aus den Körnerzellen konnten mehr unreife Neurone mit sich weit verzweigenden, dendritischen Strukturen beobachtet werden. Dies weist darauf hin, dass die lokale Deletion von BDNF auch die lokale adulte Neurogenese beeinflusst, obwohl die Crevermittelte BDNF Deletion nur in adulten Körnerzellen stattfindet. Da BDNF ein Hauptregulator von struktureller synaptischer Plastizität ist, kam die Frage auf, ob es möglich ist, diese präsynaptische, synapsenspezifische strukturelle Plastizität in Moosfasersynapsen zu visualisieren. Es wurde festgestellt, dass eine Kombination aus der Cre- Technik zusammen mit der gezielten Verankerung von GFP in der Zellmembran durch Palmitoylierungs-/Myristoylierungsmotive in der Lage ist, die synaptische Struktur von BDNF enthaltenden MF Synapsen darzustellen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass das hier entwickelte und charakterisierte Mausmodell dafür geeignet ist, die synaptische Signalfunktion präsynaptischen BDNFs in der Moosfaserterminale, einer Modellsynapse für die Erforschung der Informationsverarbeitung in Mikronetzwerken vom Molekül bis hin zum Verhalten, zu untersuchen. KW - Wachstumsfaktor KW - Brain derived neurotorphic factor KW - Hippokampus KW - Moosfaserterminalen KW - hippocampus KW - mossy fiber terminal Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186250 ER - TY - THES A1 - Martin, Corinna T1 - Oxidized phospholipids and their role in neuronal excitation of primary sensory neurons T1 - Oxidierte Phospholipide und ihre Funktion in neuronaler Erregbarkeit in primären sensorischen Neuronen N2 - Recently, our research group identified in a study novel proalgesic targets in acute and chronic inflammatory pain: oxidized phospholipids (OxPL). OxPL, endogenous chemical irritants, are generated in inflamed tissue and mediate their pain-inducing function by activating the transient receptor potential channels TRPA1 and TRPV1. Both channels are sensors for chemical stimuli on primary afferent nociceptors and are involved in nociception. Here, with the help of calcium imaging and whole cell patch clamp recording techniques, it was found that OxPL metabolites acutely activate TRPA1 and TRPV1 ion channels to excite DRG neurons. OxPL species act predominantly via TRPA1 ion channels and mediate long- lasting non-selective inward currents. Notably, one pure OxPL compound, PGPC, activated a TRPA1 mutant lacking the binding site for electrophilic agonists, suggesting that OxPL activate TRP ion channels by an indirect mechanical mechanism. Next, it was investigated how OxPL influence the excitability of primary sensory neurons. Acute stimulation and fast calcium imaging revealed that OxPL elicit repetitive, spike-like calcium transients in small- diameter DRG neurons, which were fully blocked by antagonists against TRPA1/V1 and N- type voltage-gated calcium channels. In search of a mechanism that drives repetitive spiking of DRG neurons, it was asked whether NaV1.9, a voltage-gated sodium channel involved in subthreshold excitability and nociception, is needed to trigger OxPL-induced calcium spikes and action potential firing. In electrophysiological recordings, both the combination of local application of OxPL and current injection were required to efficiently increase the action potential (AP) frequency of small-diameter sensory neurons. However, no difference was monitored in the resting membrane potential or OxPL-induced AP firing rate between wt and NaV1.9-deficient small diameter DRG neurons. To see whether NaV1.9 needs inflammatory conditions to be integrated in the OxPL-induced excitation cascade, sensory neurons were pretreated with a mixture of inflammatory mediators before OxPL application. Under inflammatory conditions both the AP and the calcium-spike frequency were drastically enhanced in response to an acute OxPL stimulus. Notably, this potentiation of OxPL stimuli was entirely lost in NaV1.9 deficient sensory neurons. Under inflammatory conditions, the resting membrane potential of NaV1.9-deficient neurons was more negative compared to wt neurons, suggesting that NaV1.9 shows resting activity only under inflammatory conditions. In conclusion, OxPL are endogenous irritants that induce excitability in small-diameter DRG neurons, a cellular model of nociceptors, via TRP activation. This effect is potentiated under inflammatory conditions. Under these conditions, NaV1.9 functions as essential mediator as it eases the initiation of excitability after OxPL stimulation. As mutants in the human NaV1.9 mediate an enhanced or painless perception, this study provides new insight into the mechanism on how NaV1.9 amplifies stimuli of endogenous irritants under inflammatory conditions. N2 - Im Zuge einer Studie über Entzündungsschmerz hat unsere Arbeitsgruppe oxidierte Phospholipide (OxPL) als neue endogene Entzündungsmediatoren entdeckt. Diese werden im entzündeten Gewebe produziert und vermitteln ihre schmerzinduzierende Funktion durch Aktivierung von sogenannten transienten Rezeptorpotentialkanälen TRPA1 und TRPV1. Beide Ionenkanäle werden von afferenten Nozizeptoren exprimiert und sind Sensoren für chemische Reize. In dieser Arbeit wurde mithilfe von Calcium Imaging und elektrophysiologischen Messungen gezeigt, dass oxidierte Phospholipide TRPA1 und TRPV1 aktivieren und eine erhöhte Erregbarkeit in sensorischen Neuronen der Hinterwurzelganglien (DRG Neuronen) auslösen. Hierbei aktivieren oxidierte Phospholipide TRPA1 stärker als TRPV1 und induzieren langanhaltende, nicht-selektive Einwärtsströme. Ein Bestandteil von OxPL, das Oxidationsprodukt PGPC, aktiviert zudem eine Mutante von TRPA1, die nicht die Bindungsstelle für elektrophile Agonisten trägt. Dies lässt vermuten, dass OxPL die TRP Kanäle über einen indirekten, mechanischen Mechanismus aktivieren. Als nächstes wurde der Einfluss von OxPL auf die Erregbarkeit von sensorischen Neuronen untersucht. Schnelles Calcium Imaging zeigte, dass eine akute Stimulation mit OxPL zu wiederholten spike-ähnlichen Signalen in DRG Neuronen führt. Diese waren nur in Neuronen mit kleinem Durchmessern zu finden und deren Aktivierung konnte sowohl durch Antagonisten gegen TRPA1/V1 als auch mit Inhibitoren spannungsgesteuerter N-Typ Kalziumkänale blockiert werden. Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten, dass eine Strominjektion mit gleichzeitiger lokaler Applikation von OxPL zur Erhöhung der Aktionspotentialsrate in kleinen DRG Neuronen führt. Deshalb wurde untersucht, ob der spannungsgesteuerte Natriumkanal NaV1.9 für die durch OxPL induzierten Kalziumspikes und Aktionspotentiale verantwortlich ist, da er an der unterschwelligen Erregbarkeit von Neuronen beteiligt ist. Es konnte jedoch kein Unterschied beim Ruhemembranpotential oder der OxPL induzierten Aktionspotentialsrate zwischen den wt und NaV1.9-defizienten (NaV1.9 KO) Neuronen festgestellt werden. Um zu verstehen, ob NaV1.9 unter inflammatorischen Bedingungen in die OxPL induzierte Erregungskaskade integriert wird, wurden die sensorischen Neurone mit inflammatorischen Mediatoren vorbehandelt und anschließend mit OxPL stimuliert. Dies führte sowohl zu einer stark erhöhten Kalziumspike- als auch Aktionspotentialfrequenz im wt, während die NaV1.9 KO Neurone sich wie unter nicht inflammatorischen Bedingungen verhielten. Unter inflammatorischen Bedingungen konnte zudem eine Erniedrigung des Ruhemembranpotentials im Vergleich zwischen NaV1.9 KO und wt Neuronen beobachtet werden. Das lässt vermuten, dass NaV1.9 seine Ruheaktivität nur unter Entzündungsbedingungen zeigt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass OxPL endogene Agonisten sind, die kleine DRG Neurone, ein zelluläres Model für Nozizeptoren, über TRPA1 und TRPV1 aktivieren. Dieser Effekt wird unter Entzündungsbedingungen verstärkt. Hierbei spielt der unterschwellig aktive Kanal NaV1.9 eine essentielle Vermittlerrolle, indem er die Auslösung von Aktionspotentialen nach einem OxPL Stimulus erleichtert. Da Mutationen im menschlichen Na1.9 Kanal zu einem erhöhten oder sogar fehlendem Schmerzempfinden führen können, gibt diese Studie einen neuen Einblick in den Mechanismus mit dem NaV1.9 Stimuli endogener, reizauslösender Substanzen unter Entzündungsbedingungen amplifiziert. KW - inflammatory pain KW - Entzündungsschmerz KW - NaV1.9. oxidized phospholipids KW - TRPA1 KW - TRPV1 KW - DRG KW - oxidierte Phospholipide KW - Entzündung KW - Schmerz KW - Phospholipide Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160665 ER - TY - THES A1 - Langlhofer, Georg T1 - Über die Bedeutung intrazellulärer Subdomänen des Glycinrezeptors für die Kanalfunktion T1 - Investigations into the relevance of glycine receptor intracellular subdomains to receptor channel function N2 - Der zur Familie der pentameren ligandengesteuerten Ionenkanäle zugehörige Glycinrezeptor (GlyR) ist ein wichtiger Vermittler synaptischer Inhibition im Zentralnervensystem von Säugetieren. GlyR-Mutationen führen zur neurologischen Bewegungsstörung Hyperekplexie. Aufgrund fehlender struktureller Daten ist die intrazelluläre Loop-Struktur zwischen den Transmembransegmenten 3 und 4 (TM3-4 Loop) eine weitgehend unerforschte Domäne des GlyR. Innerhalb dieser Domäne wurden Rezeptortrunkierungen sowie Punktmutationen identifiziert. Rezeptortrunkierung geht mit Funktionslosigkeit einher, welche jedoch durch Koexpression des fehlenden Sequenzabschnitts zum Teil wiederhergestellt werden kann. Innerhalb dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen trunkierten, funktionslosen GlyR und sukzessiv verkürzten Komplementationskonstrukten untersucht. Dabei wurden als Minimaldomänen für die Interaktion das C-terminalen basische Motive des TM3-4 Loops, die TM4 sowie der extrazelluläre C-Terminus identifiziert. Die Rückkreuzung transgener Mäuse, die das Komplementationskonstrukt iD-TM4 unter Kontrolle des GlyR-Promotors exprimierten, mit der oscillator-Maus spdot, die einen trunkierten GlyR exprimiert und 3 Wochen nach der Geburt verstirbt, hatte aufgrund fehlender Proteinexpression keinen Effekt auf die Letalität der Mutation. Des Weiteren wurde die Bedeutsamkeit der Integrität beider basischer Motive 316RFRRKRR322 und 385KKIDKISR392 im TM3-4 Loop in Kombination mit der Loop-Länge für die Funktionalität und das Desensitisierungsverhalten des humanen GlyRα1 anhand von chimären Rezeptoren identifiziert. Eine bisher unbekannte Patientenmutation P366L innerhalb des TM3-4 Loops wurde mit molekularbiologischen, biochemischen und elektrophysiologischen Methoden charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die mutierten Rezeptorkomplexe in vitro deutlich reduzierte Glycin-induzierte Maximalströme sowie eine beschleunigte Schließkinetik aufweisen. P366L hat im Gegensatz zu bereits charakterisierten Hyperekplexiemutationen innerhalb des TM3-4 Loops keinen Einfluss auf die Biogenese des Rezeptors. P366 ist Teil einer möglichen Poly-Prolin-Helix, die eine Erkennungssequenz für SH3-Domänen darstellt. Ein potenzieller Interaktionspartner des TM3-4 Loops des GlyRα1 ist Collybistin, welches eine wichtige Rolle bei der synaptischen Rezeptorintegration spielt und die Verbindung zum Zytoskelett vermittelt. An der inhibitorischen Synapse verursacht P366L durch die Reduzierung postsynaptischer Chloridströme, das beschleunigte Desensitisierungsverhalten des GlyRα1 sowie ein verändertes Interaktionsmotiv Störungen der glycinergen Transmission, die zur Ausprägung phänotypischer Symptome der Hyperekplexie führen. N2 - The glycine receptor (GlyR) belongs to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels and mediates synaptic inhibition in the central nervous system of mammals. GlyR mutations lead to the neuromotor disorder hyperekplexia. Due to the lack of structural data, the intracellular loop between transmembrane segments 3 and 4 (TM3-4 Loop) is considered as the most unexplored domain of the GlyR. Within this domain receptor truncations as well as point mutations have been identified. Receptor truncation correlates with non-functionality that can be partially restored by coexpression of the missing sequence. In this work, the interaction between a truncated non-functional GlyR and successively truncated complementation constructs was investigated. The C-terminal basic motif of the TM3-4 loop, the TM4 and the C-Terminus were identified as the minimal domain required for interaction. Backcrossing of a transgenic mouse line expressing the complementation construct iD-TM4 under the control of the GlyR promotor, with the oscillator mouse spdot expressing a truncated GlyR leading to death 3 weeks after birth, was unsuccessful and did not influence the lethality of the mutation, most probably due to the lack of transgene protein expression. In addition the importance of the integrity of both basic motifs 316RFRRKRR322 and 385KKIDKISR392 within the TM3-4 loop in combination with loop length were shown to be essential for functionality and desensitization behavior of the human GlyRα1 using chimeric receptors. An unknown TM3-4 loop mutation P366L was characterized using biomolecular, biochemical and electrophysiological approaches. It was demonstrated that mutated receptor complexes display remarkably reduced glycine-induced maximal currents in addition to accelerated channel closing kinetics in vitro. In contrast to previously analyzed hyperekplexia mutations within the TM3-4 loop, P366L exhibits no influence on receptor biogenesis. P366 is located in a sequence probably forming a poly-proline helix, which serves as a recognition sequence for SH3 domains. One prospective interaction partner is collybistin, which plays a major role in the process of synaptic receptor integration and connects the receptor complex to the cytoskeleton. At the site of the inhibitory synapse, P366L causes reduced chloride currents, accelerated desensitization behavior of the GlyRα1 and an altered interaction motif leading to disturbed glycinergic neurotransmission that result in formation of phenotypic symptoms of hyperekplexia. KW - Glycinrezeptor KW - intrazelluläre Domäne KW - Hyperekplexie KW - intracellular domain KW - hyperekplexia KW - Bewegungsstörung KW - Synapse KW - Ionenkanal Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140249 ER - TY - THES A1 - Rüdt von Collenberg, Cora Freifrau T1 - The role of Ciliary Neurotrophic Factor in hippocampal synaptic plasticity and learning T1 - Die Rolle von Ciliary Neurotrophic Factor bei hippocampaler synaptischer Plastizität und Lernen N2 - Ciliary neurotrophic factor (Cntf) acts as a differentiation and survival factor for different types of neurons and glial cells. It is expressed by peripheral Schwann cells and astrocytes in the central nervous system and mediates its effects via a receptor complex involving CntfRα, LifRß and gp130, leading to downstream activation of Stat3. Recent studies by our group have shown that Cntf modulates neuronal microtubule dynamics via Stat3/stathmin interaction. In a mouse model for motor neuron disease, i.e. pmn, Cntf is able to rescue axonal degeneration through Stat3/stathmin signaling. While these findings suggest a role of Cntf in controlling axonal functions in the neuromuscular system, additional data indicate that Cntf might also play a role in synaptic plasticity in the hippocampus. Electrophysiological recordings in hippocampal organotypic cultures and acute slices revealed a deficit in long-term potentiation (LTP) in Cntf -/- mice. This deficit was rescued by 24 h stimulation with Cntf, combined with an acute application of Cntf during LTP-measurements indicating that Cntf is both necessary and sufficient for hippocampal LTP, and possibly synaptic plasticity. Therefore, Cntf knockout mice were investigated to elucidate this possible role of Cntf in hippocampal LTP and synaptic plasticity. First, we validated the presence of Cntf in the target tissue: in the hippocampus, Cntf was localized in Gfap-positive astrocytes surrounding small blood vessels in the fissure and in meningeal areas close to the dentate gyrus. Laser micro-dissection and qPCR analysis showed a similar distribution of Cntf-coding mRNA validating the obtained immunofluorescent results. Despite the strong LTP deficit in organotypic cultures, in vivo behavior of Cntf -/- mice regarding hippocampus-dependent learning and anxiety-related paradigms was largely inconspicuous. However, western blot analysis of hippocampal organotypic cultures revealed a significant reduction of pStat3 levels in Cntf -/- cultures under baseline conditions, which in turn were elevated upon Cntf stimulation. In order to resolve and examine synaptic structures we turned to in vitro analysis of cultured hippocampal neurons which indicated that pStat3 is predominantly located in the presynapse. In line with these findings, presynapses of Cntf -/- cultures were reduced in size and when in contact to astrocytes, contained less pStat3 immunoreactivity compared to presynapses in wildtype cultures. In conclusion, our findings hypothesize that despite of a largely inconspicuous behavioral phenotype of Cntf -/- mice, Cntf appears to have an influence on pStat3 levels at hippocampal synapses. In a next step these two key questions need to be addressed experimentally: 1) is there a compensatory mechanism by members of the Cntf family, possibly downstream of pStat3, which explains the in vivo behavioral results of Cntf -/- mice and can likewise account for the largely inconspicuous phenotype in CNTF-deficient humans? 2) How exactly does Cntf influence LTP through Stat3 signaling? To unravel the underlying mechanism further experiments should therefore investigate whether microtubule dynamics downstream of Stat3 and stathmin signaling are involved in the Cntf-induced modulation of hippocampal synaptic plasticity, similar to as it was shown in motoneurons. N2 - Ciliary neurotrophic factor (Cntf) wirkt als Differenzierungs- und Überlebensfaktor für verschiedene Arten von Neuronen und Gliazellen. Es wird von peripheren Schwann´schen Zellen und Astrozyten des zentralen Nervensystems exprimiert und vermittelt seine Effekte über einen Rezeptorenkomplex, der aus CntfRα, LifRß und gp130 besteht, und zu einer nachfolgenden Aktivierung von Stat3 führt. Jüngste Studien unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass Cntf neuronale Mikrotubulidynamik über Stat3/stathmin Interaktion modulieren kann. In pmn Mäusen, einem Mausmodell für Motoneuronenerkrankungen, ist Cntf in der Lage, durch Stat3/Stathmin Signaltransduktion die zugrundeliegende axonale Degeneration wieder aufzuheben. Während diese Ergebnisse eine Rolle von Cntf bei der Kontrolle axonaler Funktionen im neuromuskulären System postulieren, deuten zusätzliche Daten darauf hin, dass Cntf ebenfalls eine Funktion bei synaptischer Plastizität im Hippocampus ausübt. Elektrophysiologische Messungen in hippocampalen organotypischen Kulturen und akuten Schnitten zeigen ein Defizit in der Langzeitpotenzierung (LTP) bei Cntf -/- Mäusen. Dieses Defizit konnte durch eine 24 stündige Stimulation mit Cntf, in Kombination mit akuter Zugabe von Cntf während der LTP Messungen, kompensiert werden. Dies weist darauf hin, dass Cntf sowohl notwendig als auch ausreichend für hippocampale LTP und möglicherweise synaptische Plasizität ist. Deshalb wurden Cntf knockout Mäuse untersucht, um diese putative Rolle von Cntf bei hippocampaler LTP und synaptischer Plastizität zu untersuchen. Zunächst haben wir die Lokalisation von Cntf in unserem Zielgewebe bestätigt: im Hippocampus war Cntf sowohl in Gfap-positiven Astrocyten lokalisiert, die kleine Blutgefäße in der Fissur umschließen, als auch in Gfap-positiven Astrocyten nahe des Gyrus dentatus. Lasermikrodissektion und qPCR-Analysen zeigten eine ähnliche Verteilung von Cntf kodierender mRNA, und bestätigten somit die durch Immunoflureszenz-Färbung erworbenen Ergebnisse. Trotz des starken LTP Defizits in organotypischen Kulturen zeigten jedoch Cntf -/- Mäuse in Hippocampus-abhängigen lern- und angstbedingten Verhaltensparadigmen keinen offensichtlichen Phänotyp. Allerdings zeigten Western Blot Analysen hippocampaler Kulturen eine signifikante Reduktion der pStat3 Level in Cntf -/- Kulturen unter Kontrollbedingungen, die nach Cntf Zugabe wieder erhöht werden konnten. Um synaptische Strukturen besser darstellen und evaluieren zu können, wurden hippocampale Neurone in vitro kultiviert, in denen Stat3 überwiegend in Präsynapsen lokalisiert war. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen zeigten Cntf -/- Präsynapsen eine geringere Größe und enthielten, verglichen zu Präsynapsen in Wildtypkulturen, weniger pStat3 Immunreaktivität, gerade dann, wenn sie sich in Kontakt mit Astrozyten befanden. Zusammenfassend weisen unsere Befunde darauf hin, dass Cntf – trotz eines weitgehend unaufälligen Verhaltensphänotyps bei Cntf -/- Mäusen – einen Einfluss auf den Level von pStat3 an hippokampalen Synapsen zu haben scheint. In einem nächsten Schritt sollten die folgenden zwei Schlüsselfragen experimentell geklärt werden: 1) gibt es einen kompensierenden Mechanismus, über welchen Mitglieder der Cntf Familie wirken könnten – möglicherweise nachfolgend von pStat3 – und welcher das Verhalten der Cntf -/- Mäuse, sowie den größtenteils unauffälligen Phänotyp bei CNTF defizienten Menschen erklären könnte? 2) Wie genau wirkt sich Cntf induziertes pStat3 auf LTP aus? Um diesen zugrundeliegenden Mechanismus aufzuklären, sollten weitere Experimente untersuchen, ob pStat3 und Stathmin abhängige Mikrotubulidynamik in der durch Cntf induzierten Modulation hippocampaler Plastizität eine Rolle spielt – ähnlich, wie es in Motoneuronen bereits gezeigt wurde. KW - Hippocampus KW - Ciliary neurotrophic factor KW - hippocampus KW - synaptic plasticity KW - learning KW - Hippocampus KW - synaptische Plastizität KW - Lernen Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206646 ER - TY - THES A1 - Forero Echeverry, Andrea Marcela T1 - Impact of Cadherin-13 deficiency on the brain serotonin system using mouse models and human iPSC-derived neurons T1 - Einfluss einer Cadherin-13 Defizienz auf das Serotonin-System des Gehirns unter Verwendung von Mausmodellen und humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen N2 - Serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) is a neurotransmitter involved in early developmental processes such as cell proliferation, migration, and differentiation. Recent research in humans showed that the brain 5-HT system and CDH13 are interlinked in the genetics of neurodevelopmental disorders including attention- deficit/hyperactivity disorder and autism spectrum disorder (Lesch et al., 2008; Neale et al., 2008; Neale, Medland, Ripke, Anney, et al., 2010; Neale, Medland, Ripke, Asherson, et al., 2010; Sanders et al., 2011; Sanders et al., 2015; Zhou et al., 2008). This study introduces Cadherin-13 (CDH13), a cell adhesion protein, as a contributor to the development and function of the 5-HT system. Our experiments show that the absence of CDH13 increases the density of 5-HT neurons in the developing dorsal raphe (DR) and increases the 5-HT innervation of the prefrontal cortex in mouse embryonic stages. CDH13 is also observed in radial glial cells, an important progenitor cell type linked to neuronal migration. A three-dimensional reconstruction carried out with super-resolution microscopy, identifies 5-HT neurons intertwined with radial glial cells, and CDH13 clusters at contact points between these cells. This indicates a potential contribution of CDH13 to the migration of DR 5-HT neurons. As CDH13 is strongly expressed in 5-HT neurons, we asked whether the selective deletion of CDH13 from these cells is sufficient to generate the alterations observed in the Cdh13 constitutive knockout mouse line. In 5-HT conditional Cdh13 knockout mice (Cdh13 cKO) an increase in DR 5-HT neurons in the embryonic and adult brains is observed, as well as 5-HT hyperinnervation of cortical regions. Therefore, illustrating that the lack of CDH13 from 5-HT neurons alone impacts DR formation and serotonergic innervation. Behavioral testing conducted on Cdh13 cKO mice showed delayed learning in visuospatial learning and memory processing, as well as, changes in sociability parameters. To find out how CDH13 localizes in human 5-HT neurons, CDH13 was visualized in neurons that derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). Super-resolution microscopy confirmed CDH13 expression in a subgroup of induced human neurons positive for typical hallmarks of 5-HT neurons, such as expression of Tph2, the neuron-specific tryptophan hydroxylase, and synaptic structures. In summary, the work included in this thesis presents a detailed analysis of CDH13 expression and localization in the 5-HT system and shows that deletion of CDH13 from 5-HT neurons affects specific higher-order functions of the brain. N2 - Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) ist ein Neurotransmitter, der in frühe Entwicklungsprozesse involviert ist, wie beispielsweise Zellproliferation, Migration und Differenzierung. Aktuelle Forschungsergebnisse im Menschen zeigten eine Verbindung zwischen dem 5-HT System des Gehirns und CDH13 in der Genetik neurologischer Entwicklungsstörungen, wie die Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung und die Autismus-Spektrum-Störung (Lesch et al., 2008; Neale, Medland, Ripke, Anney, et al., 2010; Neale, Medland, Ripke, Asherson, et al., 2010; Sanders et al., 2011; Sanders et al., 2015; Zhou et al., 2008). Diese Studie präsentiert Cadherin-13 (CDH13), ein Zelladhäsionsprotein, als einen Gegenspieler in der Entwicklung und Funktion des 5-HT Systems. Unsere Experimente zeigen, dass die Abwesenheit von CDH13 die Dichte der 5-HT Neuronen in dem sich entwickelnden dorsalen Raphe (DR) sowie die 5-HT Innervation des Präfrontalen Kortex in den embryonalen Stadien der Maus steigert. CDH13 wird auch in Radialen Gliazellen beobachtet, ein wichtiger Vorläuferzelltyp, der mit neuronaler Migration in Verbindung gebracht wurde. Eine 3-dimensionale Rekonstruktion, durchgeführt mit Superresolutions-Mikroskopie, identifiziert 5-HT Neuronen verflochten mit Radialen Gliazellen und CDH13 in den Kontaktpunkten zwischen diesen Zellen. Dies verdeutlicht eine potenzielle Rolle von CDH13 bei der Migration der DR 5-HT Neuronen. Da CDH13 eine starke Expression in den 5-HT Neuronen aufweist, fragten wir uns, ob die selektive Deletion von CDH13 in den Zellen ausreichend sei, um die in der konstitutiven Cdh13 Knockout-Mauslinie beobachteten Veränderung zu erzeugen. In 5-HT konditionalen Cdh13 Knockout-Mäusen (Cdh13 cKO) wurde eine Erhöhung der Anzahl der DR 5-HT Neuronen im embryonalen und adulten Gehirn sowie eine 5-HT Überinnervation der kortikalen Regionen beobachtet. Dies veranschaulicht, dass bereits ein Mangel an CDH13 in 5-HT Neuronen die DR-Ausbildung und serotonerge Innervation beeinflusst. Verhaltensversuche, die an Cdh13 cKO-Mäusen durchgeführt wurden, zeigten verspätetes Lernen im visuell-räumlichen Spektrum und der Gedächtnisverarbeitung sowie Veränderungen der Soziabilitätsparameter. Um herauszufinden, wie CDH13 in humanen 5-HT Neuronen lokalisiert ist, wurde CDH13 in aus humanen pluripotenten Stammzellen (iPSC) erzeugten Neuronen visualisiert. Superresolutions-Mikroskopie bestätigte eine CDH13 Expression in einer Untergruppe induzierter humaner Neuronen, die typische Merkmale von 5-HT Neuronen, wie etwa die Expression der Neuronen-spezifischen Tryptophan-Hydroxylase Tph2 und synaptische Strukturen, aufweisen. Zusammengefasst präsentiert diese Doktorarbeit eine detaillierte Analyse der CDH13 Expression und Lokalisation im 5-HT System und zeigt, dass eine Deletion von CDH13 in 5-HT Neuronen spezifische höhergradige Funktionen des Gehirns beeinflusst. KW - neurodevelopment KW - cadherin-13 KW - serotonin Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216592 ER - TY - THES A1 - Samtleben, Samira T1 - Investigation of homeostatic calcium fluxes in hippocampal neurons by means of targeted-esterase induced dye loading (TED) T1 - Untersuchung von homöostatischen Kalziumströmen in hippokampalen Neuronen mittels “targeted-esterase induced dye loading (TED)” N2 - Calcium ions can activate intracellular signalling cascades that control key functions in all types of neurons. These functions include neuronal excitability and excitation, synaptic plasticity, cell migration, transmitter release, gene transcription, and apoptosis. The major intracellular neuronal store for calcium is the endoplasmic reticulum (ER), a continuous and dynamic, membranous organelle that extends through all parts of neurons, from axons to dendrites. The calcium concentration in the ER is appr. one thousand fold higher than in the cytosol and this calcium gradient is built up by the sarco-/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump that pumps calcium from the cytosol into the ER. Despite detailed knowledge about various induced calcium signals within neurons, it was still elusive, how resting neurons maintain their ER calcium content at rest. In order to shed light on the calcium homeostasis at rest, the targeted-esterase induced dye loading (TED) technique was improved. TED allows the direct and non-disruptive visualization of ER calcium in presence of extracellular calcium, thus enabling to visualize the dynamic flow of ER calcium. TED is based on the overexpression of an ER-targeted mouse carboxylesterase. Inside the ER the carboxylesterase cleaves the acetoxymethyl ester calcium dye Fluo5N, AM, thereby converting this dye into a calcium sensitive, low-affinity, cell membrane impermeable calcium indicator that is trapped in the ER. When bound to calcium ions and excited by fluorescent light, its fluorescence intensity increases one hundredfold compared to the calcium-free state. It was observed that calcium withdrawal from resting neurons led to a rapid loss of calcium from both the ER and the cytosol, which recovered upon calcium re-addition. It was concluded that a strong calcium influx and efflux must exist under resting conditions that maintain a constant calcium concentration in neurons at rest. TED calcium imaging could visualize this resting calcium influx event. When the inhibitor of store-operated calcium entry (SOCE), SKF-96365, was acutely added to neurons an immediate decline in ER calcium levels was observed, whereas cytosolic calcium levels remained constant. Based on these findings, a novel calcium homeostasis model is proposed in which a strong SOCE-like calcium influx and a corresponding calcium efflux maintain the ER calcium levels at rest. These fluxes are adapted to disturbances in order to maintain a constant calcium level in resting neurons. This study visualizes for the first time the resting calcium flow into the ER. The calcium enters the neurons via a store-operated calcium entry-like mechanism, a form of calcium influx that was thought to be induced by signalling events. N2 - Kalzium kann intrazelluläre Signalkaskaden aktivieren und somit Schlüsselfunktionen in allen Typen von Neuronen kontrollieren. Diese Schlüsselfunktionen umfassen Zellmigration, Freisetzung von Neurotransmittern, synaptische Plastizität, Transkription von Genen und Apoptose. Der wichtigste Speicher für Kalzium in Neuronen ist das endoplasmatische Retikulum (ER); ein kontinuierliches, membranumschlossenes Zellorganell, das sich in alle Teile von Neuronen erstreckt, von Axonen bis zu Dendriten. Im ER ist die Kalziumkonzentration ca. eintausendmal höher als im Zytosol. Dieser Kalziumgradient wird von der sogenannten SERCA, der sarco-/endoplasmic reticulum calcium ATPase, Kalziumpumpe aufrechterhalten, die Kalziumionen aktiv vom Zytosol in das Innere des ER pumpt. Obwohl die einzelnen induzierten Kalziumsignalwege in Neuronen gut untersucht sind, war es lange nicht bekannt wie es Neuronen gelingt die hohe Kalziumkonzentration des ERs in Ruhe aufrechtzuerhalten. Um diese Frage zu klären wurde die sogenannte targeted-esterase induced dye loading (TED) Technik verbessert. TED ermöglicht es ER Kalzium direkt, in intakten Neuronen und in Gegenwart von extrazellulärem Kalzium sichtbar zu machen. Dadurch wird es möglich den Kalziumstrom des ERs direkt zu beobachten. TED beruht darauf, dass eine für das ER bestimmte Carboxylesterase der Maus überexprimiert wird, die sich im ER ansammelt. Im Inneren des ERs wandelt dieses Enzym den synthetischen Kalziumfarbstoff Fluo5N, AM um, der zur Gruppe der Acetoxymethyl-ester gehört. Dadurch wird aus diesem Farbstoff ein kalzium-sensitiver, niedrig-affiner Kalziumindikator, der nicht mehr permeabel für biologische Membranen ist und daher im ER verbleibt. In seiner Kalzium-gebunden Form erhöht sich die Fluoreszenz dieses Indikators einhundertfach im Vergleich zur Kalzium-ungebunden Form, wenn er durch Fluoreszenzlicht angeregt wird. Es wurde beobachtet, dass der Entzug von extrazellulärem Kalzium zu Verlust von Kalzium im ER und Zytosol von Neuronen führt. Bei Rückgabe des Kalziums erholt sich die Kalziumkonzentration wieder. Daraus wurde gefolgert, dass es bei Neuronen in Ruhe einen starken Einstrom und Ausstrom von Kalzium geben muss. Diese Ströme halten den Kalziumgehalt der Neurone konstant. Wenn SKF-96365, ein Inhibitor des sogenannten store-operated calcium entry (SOCE), akut auf die Neurone appliziert wurde, wurde sofort ein Abfall der ER Kalziumkonzentration beobachtet, wohingegen die Kalziumkonzentration des Zytosols gleich blieb. Aufgrund dieser Ergebnisse kann ein neues Kalziumhomöostase-Modell für Neurone vorgeschlagen werden: In ruhenden Neuronen halten ein starker SOCE-ähnlicher Kalziumeinstrom und ein entsprechender Kalziumausstrom den Kalziumgehalt des ERs aufrecht. Diese Ströme werden an Störungen angepasst um eine konstante Kalziumkonzentration zu erreichen. In dieser Studie wird zum ersten Mal der Ruhestrom von Kalzium in das ER sichtbar gemacht. Kalzium gelangt über einen store-operated calcium entry -ähnlichen Mechanismus in die Neurone. Bisher dachte man, dass diese Art von Kalziumeinstrom nur nach Aktivierung von Signalen stattfindet. KW - Calciumhomöostase KW - Nervenzelle KW - neuron KW - calcium homeostasis KW - calcium imaging KW - Calcium Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110332 ER - TY - THES A1 - Yuan, Xidi T1 - Aging and inflammation in the peripheral nervous system T1 - Altern und Entzündung im peripheren Nervensystem N2 - Aging is known to be a risk factor for structural abnormalities and functional decline in the nervous system. Characterizing age-related changes is important to identify putative pathways to overcome deleterious effects and improve life quality for the elderly. In this study, the peripheral nervous system of 24-month-old aged C57BL/6 mice has been investigated and compared to 12-month-old adult mice. Aged mice showed pathological alterations in their peripheral nerves similar to nerve biopsies from elderly human individuals, with nerve fibers showing demyelination and axonal damage. Such changes were lacking in nerves of adult 12-month-old mice and adult, non-aged humans. Moreover, neuromuscular junctions of 24-month-old mice showed increased denervation compared to adult mice. These alterations were accompanied by elevated numbers of macrophages in the peripheral nerves of aged mice. The neuroinflammatory conditions were associated with impaired myelin integrity and with a decline of nerve conduction properties and muscle strength in aged mice. To determine the pathological impact of macrophages in the aging mice, macrophage depletion was performed in mice by oral administration of CSF-1R specific kinase (c-FMS) inhibitor PLX5622 (300 mg/kg body weight), which reduced the number of macrophages in the peripheral nerves by 70%. The treated mice showed attenuated demyelination, less muscle denervation and preserved muscle strength. This indicates that macrophage-driven inflammation in the peripheral nerves is partially responsible for the age-related neuropathy in mice. Based on previous observations that systemic inflammation can accelerate disease progression in mouse models of neurodegenerative diseases, it was hypothesized that systemic inflammation can exacerbate the peripheral neuropathy found in aged mice. To investigate this hypothesis, aged C57BL/6 mice were intraperitoneally injected with a single dose of lipopolysaccharide (LPS; 500 μg/kg body weight) to induce systemic inflammation by mimicking bacterial infection, mostly via activation of Toll-like receptors (TLRs). Altered endoneurial macrophage activation, highlighted by Trem2 downregulation, was found in LPS injected aged mice one month after injection. This was accompanied by a so far rarely observed form of axonal perturbation, i.e., the occurrence of “dark axons” characterized by a damaged cytoskeleton and an increased overall electron density of the axoplasm. At the same time, however, LPS injection reduced demyelination and muscle denervation in aged mice. Interestingly, TREM2 deficiency in aged mice led to similar changes to LPS injection. This suggests that LPS injection likely mitigates aging-related demyelination and muscle denervation via Trem2 downregulation. Taken together, this study reveals the role of macrophage-driven inflammation as a pathogenic mediator in age-related peripheral neuropathy, and that targeting macrophages might be an option to mitigate peripheral neuropathies in aging individuals. Furthermore, this study shows that systemic inflammation may be an ambivalent modifier of age-related nerve damage, leading to a distinct type of axonal perturbation, but in addition to functionally counteracting, dampened demyelination and muscle denervation. Translationally, it is plausible to assume that tipping the balance of macrophage polarization to one direction or the other may determine the functional outcome in the aging peripheral nervous system of the elderly. N2 - Es ist bekannt, dass das Altern ein Risikofaktor für strukturelle Veränderungen und Funktionsstörungen des Nervensystems ist. Die Charakterisierung altersbedingter Veränderungen ist wichtig, um mögliche Wege zu identifizieren, um schädliche Auswirkungen zu überwinden und die Lebensqualität älterer Menschen zu verbessern. In dieser Studie wurde das periphere Nervensystem von 24 Monate alten gealterten C57BL/6-Mäusen untersucht und mit 12 Monate alten adulten Mäusen verglichen. Gealterte Mäuse zeigten ähnliche pathologische Veränderungen in ihren peripheren Nerven wie Nervenbiopsien älterer Menschen, wobei die Nervenfasern eine Demyelinisierung und axonale Schädigung zeigten. Bei den Nerven von adulten 12 Monate alten Mäusen und nicht gealterten Menschen fehlten solche Veränderungen. Darüber hinaus wiesen die neuromuskulären Endplatten von 24 Monate alten Mäusen im Vergleich zu adulten Mäusen eine erhöhte Denervation auf. Diese Veränderungen wurden von einer erhöhten Anzahl von Makrophagen in den peripheren Nerven gealterter Mäuse begleitet. Die neuroinflammatorischen Bedingungen waren mit einer Beeinträchtigung der Myelinintegrität, einer Abnahme der Nervenleitungseigenschaften und der Muskelkraft bei gealterten Mäusen verbunden. Um den pathologischen Einfluss von Makrophagen bei alternden Mäusen zu bestimmen, wurde die Makrophagen-Depletion bei Mäusen durch orale Verabreichung des CSF-1R-spezifischen Kinase-Inhibitors (c-FMS) PLX5622 (300 mg/kg Körpergewicht) durchgeführt, welche die Anzahl der Makrophagen in den peripheren Nerven um 70% reduzierte. Die behandelten Mäuse zeigten eine verminderte Demyelinisierung, eine reduzierte Muskeldenervation und einen Erhalt der Muskelkraft. Dies deutet darauf hin, dass die durch Makrophagen verursachte Entzündung in den peripheren Nerven teilweise für die altersbedingte Neuropathie bei Mäusen verantwortlich ist. Auf der Grundlage früherer Beobachtungen, dass systemische Entzündungen das Fortschreiten der Krankheit in Mausmodellen neurodegenerativer Erkrankungen beschleunigen können, wurde die Hypothese aufgestellt, dass systemische Entzündungen die periphere Neuropathie in gealterten Mäusen verschlimmern können. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde gealterten C57BL/6-Mäusen eine Einzeldosis Lipopolysaccharid (LPS; 500 μg/kg Körpergewicht) intraperitonal injiziert, um eine systemische Entzündung durch Nachahmung einer bakteriellen Infektion, meist über die Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren (TLRs), zu induzieren. Eine veränderte endoneuriale Makrophagenaktivierung, die durch eine reduzierte Trem2-Expression hervorgehoben wird, konnte bei LPS-injizierten gealterten Mäusen einen Monat nach der Injektion gefunden werden. Dies ging einher mit einer bisher selten beobachteten Form der axonalen Perturbation, d.h. dem Auftreten von "dunklen Axonen", die sich durch ein geschädigtes Zytoskelett und eine erhöhte Gesamtelektronendichte des Axoplasmas auszeichnen. Gleichzeitig verringerte die LPS-Injektion jedoch die Demyelinisierung und Muskeldenervation bei gealterten Mäusen. Interessanterweise führte die TREM2 Defizienz bei gealterten Mäusen zu vergleichbaren Veränderungen wie die LPS-Injektion. Dies deutet darauf hin, dass die LPS-Injektion die alterungsbedingte Demyelinisierung und Muskeldenervierung über die Trem2 Herunterregulation abschwächt. Zusammenfassend zeigt diese Studie die Rolle der Makrophagen-getriebenen Entzündung als pathogener Mediator bei der altersbedingten peripheren Neuropathie. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die gezielte Behandlung von Makrophagen eine Option zur Linderung peripherer Neuropathien bei alternden Menschen sein könnte. Darüber hinaus zeigt diese Studie, dass die systemische Entzündung ein ambivalenter Modifikator der altersbedingten Nervenschädigung sein kann, der zu einer bestimmten Art von axonaler Perturbation führt, aber zusätzlich zu einer funktionell entgegenwirkenden, weniger schweren Demyelinisierung und Muskeldenervation. Translatorisch ist es plausibel anzunehmen, dass eine Veränderung des Gleichgewichts der Makrophagenpolarisation in die eine oder andere Richtung das funktionelle Ergebnis im alternden peripheren Nervensystem der älteren Menschen bestimmen kann. KW - Maus KW - Peripheres Nervensystem KW - Altern KW - Immunsystem KW - macrophages KW - peripheral nervous system KW - aging KW - neuroinflammation KW - Trem2 KW - systemic inflammation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237378 ER - TY - THES A1 - Ku, Hsing-Ping T1 - Cadherin-13 Deficiency Impacts Murine Serotonergic Circuitries and Cognitive Functions T1 - Cadherin-13 Defizienz beeinflusst serotonerge Netzwerke und kognitive Funktionen der Maus N2 - Cadherin-13 (CDH13) is a member of the cadherin superfamily that lacks the typical transmembrane domain for classical cadherins and is instead attached to the cell membrane with a GPI-anchor. Over the years, numerous genome-wide association (GWA) studies have identified CDH13 as a risk factor for neurodevelopmental disorders, including attention- deficit/hyperactivity disorder (ADHD) and autism spectrum disorder. Further evidence using cultured cells and animal models has shown that CDH13 plays important roles in cell migration, neurite outgrowth and synaptic function of the central nervous system. Research in our laboratory demonstrated that the CDH13 deficiency resulted in increased cell density of serotonergic neurons of the dorsal raphe (DR) in developing and mature mouse brains as well as serotonergic hyperinnervation in the developing prefrontal cortex, one of the target areas of DR serotonergic neurons. In this study, the role of CDH13 was further explored using constitutive and serotonergic system-specific CDH13-deficient mouse models. Within the adult DR structure, the increased density of DR serotonergic neurons was found to be topographically restricted to the ventral and lateral-wing, but not dorsal, clusters of DR. Furthermore, serotonergic hyperinnervation was observed in the target region of DR serotonergic projection neurons in the lateral wings. Unexpectedly, these alterations were not observed in postnatal day 14 brains of CDH13-deficient mice. Additionally, behavioral assessments revealed cognitive deficits in terms of compromised learning and memory ability as well as impulsive-like behaviors in CDH13-deficient mice, indicating that the absence of CDH13 in the serotonergic system alone was sufficient to impact cognitive functions and behavioral competency. Lastly, in order to examine the organization of serotonergic circuitries systematically and to tackle limitations of conventional immunofluorescence, a pipeline of the whole-mount immunostaining in combination with the iDISCO+ based rapid tissue clearing techniques was established. This will facilitate future research of brain neurotransmitter systems at circuitry and/or whole-brain levels and provide an excellent alternative for visualizing detailed and comprehensive information about a biological system in its original space. In summary, this study provided new evidence of CDH13’s contribution to proper brain development and cognitive function in mice, thereby offering insights into further advancement of therapeutic approaches for neurodevelopmental disorders. N2 - Cadherin-13 (CDH13) ist ein Mitglied der Cadherin-Superfamilie, dem die für klassische Cadherine typische Transmembran-Domäne fehlt und das stattdessen mit einem GPI-Anker an der Zellmembran befestigt ist. Im Laufe der Jahre wurde CDH13 in mehreren genom-weiten Assoziationsstudien (GWAS) als Risikofaktor für neurologische Entwicklungsstörungen, einschließlich Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) und Autismus- Spektrum-Störung, identifiziert. Weitere Nachweise in Zellkulturen und Tiermodellen zeigten, dass CDH13 eine wichtige Rolle bei der Zellmigration, dem Wachstum von Neuriten und der synaptischen Funktion des zentralen Nervensystems spielt. Untersuchungen in unserem Labor haben gezeigt, dass CDH13-Defizienz zu einer erhöhten Zelldichte serotonerger Neuronen der dorsalen Raphe (DR) in sich entwickelnden und reifen Mäusegehirnen sowie zu einer serotonergen Hyperinnervation im sich entwickelnden präfrontalen Kortex, einem der Zielgebiete der serotonergen Neuronen der DR, führt. In dieser Studie wurde die Rolle von CDH13 weiter untersucht, indem konstitutive und für das serotonerge System spezifische CDH13-defiziente Mausmodelle verwendet wurden. Innerhalb der adulten DR-Struktur zeigte sich, dass die erhöhte Dichte serotonerger DR-Neurone topographisch auf die ventralen und lateralen, nicht aber dorsalen Cluster der DR beschränkt ist. Außerdem wurde eine serotonerge Hyperinnervation in der Zielregion der serotonergen Projektionsneuronen der DR in den Seitenflügeln beobachtet. Unerwarteterweise wurden diese Veränderungen nicht in den Gehirnen von CDH13-defizienten Mäusen nach dem 14. postnatalem Tag. Darüber hinaus zeigten Verhaltensuntersuchungen bei CDH13-defizienten Mäusen kognitive Defizite in Form von beeinträchtigter Lern- und Gedächtnisfähigkeit sowie impulsivem Verhalten, was darauf hindeutet, dass das Fehlen von CDH13 im serotonergen System allein ausreicht, um kognitive Funktionen und V erhaltenskompetenz zu beeinträchtigen. Um die Organisation der serotonergen Netzwerke systematisch zu untersuchen und die Grenzen der konventionellen Immunfluoreszenz zu überwinden, wurde eine Pipeline für die Ganzkörper-Immunfärbung in Kombination mit der auf iDISCO+ basierenden raschen und effizienten Gewebereinigungstechnik eingerichtet. Dies wird die künftige Erforschung der Neurotransmitter-Systeme des Gehirns auf Netzwerk- und/oder Ganzhirnebene erleichtern und eine hervorragende Alternative für die Visualisierung detaillierter und umfassender Informationen über ein biologisches System in seinem ursprünglichen Raum bieten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie neue Hinweise für den Beitrag von CDH13 zur korrekten Entwicklung des Gehirns und der kognitiven Funktionen bei Mäusen lieferte und damit Einblicke in die weitere Entwicklung von therapeutischen Ansätzen für Entwicklungsstörungen des Nervensystems bietet. KW - CDH13 KW - neurodevelopmental disorders KW - serotonergic system Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251446 ER - TY - THES A1 - Pfeiffer, Marion Verena T1 - Die Rolle von CRAF bei der adulten hippocampalen Neurogenese T1 - The role of CRAF in adult hippocampal neurogenesis N2 - Der gyrus dentatus im Hippocampus ist die primäre Zielregion kortikaler Afferenzen des Enthorinalen Cortex. Im Laufe seiner Entwicklung erlangt der gyrus dentatus durch die Etablierung einer neurogenen Nische (tertiäre Matrix) die Fähigkeit fortwährender postnataler Neurogenese. Diese wird durch eine Vielzahl von Mediatoren wie Transkriptionsfaktoren gesteuert, die die Proliferation und Zelldifferenzierung, aber auch das Überleben der hippocampalen neuralen Vorläuferzellen (NPCs, neural progenitor cells) kontrollieren. In Säugetieren steuern die homologen RAF Kinasen ARAF, BRAF und CRAF die mitogene Kaskade, die bei der adulten Neurogenese von elementarer Bedeutung ist. In dieser Studie wurde untersucht ob die Nullmutation von CRAF eine Auswirkung auf die postnatale und adulte hippocampale Neurogenese hat. Unsere Analysen von BRAF- und CRAF-defizienten Mäusen zeigen in der frühen Embryonalentwicklung gemeinsame Funktionen beider Kinasen, weshalb das Fehlen einer Kinase bis zu bestimmten embryonalen Entwicklungszeitpunkten durch die jeweils andere Kinase kompensiert werden kann. Letalitätsstudien zeigen jedoch, dass BRAF und CRAF bei späteren Entwicklungsstadien jeweils unabhängig für das Überleben von Tieren relevant sind. CRAF Nullmutanten werden nicht nach der erwarteten Mendelschen Frequenz geboren und nahezu 70% der Tiere sterben bereits kurz nach der Geburt. Die maximale beobachtete Lebenserwartung adulter CRAFko Tiere lag bei postnatal Tag 55. CRAFko Mäuse haben eine reduzierte Körpergröße, veränderte Hautfarbe und einen eye-open-at-birth-Phänotyp. Verhaltensexperimente in unserer Arbeitsgruppe zeigten an heterozygoten CRAF Mäusen einen Einfluss von CRAF auf das Angst - und Lernverhalten, was einen Einfluss von CRAF auf die Neurogenese-vermittelte hippocampale Funktion andeutete. Tatsächlich konnte hier die Expression von CRAF im postnatalen Gehirn von Mäusen immunhistologisch wie auch proteinbiochemisch nachgewiesen werden. Im Hippocampus zeigte sich, dass ein Funktionsverlust von CRAF zu einer erhöhten Anzahl mitotisch aktiver NPCs führt, die massive Zellzyklusveränderungen aufweisen. Zudem wurde eine fehlerhafte Reorganisation der tertiären Matrix beobachtet. NPCs CRAF-defizienter Tiere befinden sich vermehrt im Hilus und bleiben in der Entwicklung zu reifen Körnerzellen im D Zell-Vorläuferstadium stecken. Weitere Analysen zeigen, dass diese fehlplatzierten NPCs teilweise über apoptotische Signalwege eliminiert werden. Als Resultat dieser Entwicklungsstörung ist der gyrus dentatus CRAF-defizienter Tiere verkleinert und es kann eine verlangsamte neuronale Differenzierung NPC-abgeleiteter Neurone beobachtet werden. Diese Befunde zeigen erstmals einen CRAF-spezifischen Einfluss auf die Regulation elementarer, zellulärer Eigenschaften neuronaler Vorläuferzellen des Hippocampus. N2 - The hippocampal dentate gyrus is the primary target region of cortical afferents originating in the entorhinal cortex. During its evolutionary development, the dentate gyrus has achieved the ability of continuous postnatal neurogenesis by establishing a neurogenic niche (tertiary matrix). This process is regulated by multiple mediators such as transcription factors that control proliferation, cell differentiation and survival of hippocampal neural precursor cells (NPCs). Mammals express three homologous RAF kinases ARAF, BRAF and CRAF which regulate the mitogenic cascade, an essential element of adult neurogenesis. In this study we analysed if the nullmutation of CRAF interferes with postnatal and adult hippocampal neurogenesis. Our analysis of BRAF and CRAF-deficient mice reveals common functions of both kinases during early embryogenesis. In this developmental phase, lack of one kinase may be compensated by the other kinase. This phenomenon ends at later embryonic developmental stages. Lethality studies show independent roles of BRAF and CRAF in survival during later developmental stages. CRAF null-mutants are not born in mendelian frequency and almost 70% of all CRAF mutants die within a short time window after birth. The oldest analysed CRAFko mice survived until postnatal day P55. CRAFko mice show a decreased body size, altered skin colour and possess an eye-open-at-birth-phenotype. Previous behavioural experiments by our group revealed the influence of CRAF in anxiety-like behaviour and specific learning paradigms, indicating an effect of CRAF on neurogenesis-dependent hippocampal functions. Indeed, this study confirmed the expression of CRAF with immunohistological and biochemical methods in postnatal mouse brain tissue. In the hippocampus, the loss-of-function mutation of CRAF leads to increased numbers of mitotically activated NPCs which exhibit drastic cell-cycle abnormalities. In addition, CRAF-deficient mice carry malformations in the organisation of their tertiary matrix. NPCs of CRAF-deficient mice are mainly located in the hilus where their maturation towards the neuronal lineage persists in the D-cell stage. A detailed analysis shows that these misplaced NPCs are - at least partially - eliminated by apoptosis. Due to this developmental defect the dentate gyrus of CRAF-deficient mice is smaller and the neuronal differentiation of NPC-derived neurons is delayed. These results show for the first time a CRAF-specific effect on the regulation of basic cellular functions of neuronal precursors in the hippocampus. KW - Hippocampus KW - Neurogenese KW - adulte Neurogenese KW - RAF Kinasen Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98220 ER - TY - THES A1 - Wetzel, Andrea T1 - The role of TrkB and NaV1.9 in activity-dependent axon growth in motoneurons T1 - Die Rolle von TrkB und NaV1.9 in aktivitätsabhängigem Axonwachstum von Motoneuronen N2 - Während der Entwicklung des Nervensystems lassen sich bei Motoneuronen aktivitätsabhängige Kalziumströme eobachten, die das Axonwachstum regulieren. Diese Form der neuronalen Spontanaktivität sowie das Auswachsen von Axonen sind bei Motoneuronen, die aus Tiermodellen der Spinalen Muskelatrophie isoliert werden, gestört. Experimente aus unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass spontane Erregbarkeit und aktivitätsabhängiges Axonwachstum von kultivierten Motoneuronen auch unter Verwendung von Toxinen beeinträchtigt sind, welche die Aktivität von spannungsabhängigen Natriumkanälen blockieren. In diesen Versuchen war die Wirkung von Saxitoxin effizienter als die Wirkung von Tetrodotoxin. Wir identifizierten den Saxitoxin-sensitiven/Tetrodotoxin-insensitiven spannungsabhängigen Natriumkanal NaV1.9 als Trigger für das Öffnen spannungsabhängiger Kalziumkanäle. Die Expression von NaV1.9 in Motoneuronen konnte über quantitative RT-PCR nachgewiesen werden und antikörperfärbungen offenbarten eine Anreicherung des Kanals im axonalen Wachstumskegel sowie an Ranvier'schen Schnürringen von isolierten Nervenfasern wildtypischer Mäuse. Motoneurone von NaV1.9 knock-out Mäusen zeigen reduzierte Spontanaktivität und eine Reduktion des Axonwachstums, welche durch NaV1.9 Überexpression normalisiert werden kann. In Motoneuronen von Smn-defizienten Mäusen konnte keine Abweichung der NaV1.9 Proteinverteilung nachgewiesen werden. Kürzlich wurden Patienten identifiziert, die eine missense-Mutation im NaV1.9 kodierenden SCN11A Gen tragen. Diese Patienten können keinerlei Schmerz empfinden und leiden zudem an Muskelschwäche in Kombination mit einer verzögerten motorischen Entwicklung. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnten molekularbiologische Untersuchungen an Mäusen, welche die Mutation im orthologen Scn11a Gen tragen, zur Aufklärung des Krankheitsmechanismus beitragen. Die Kooperationsstudie zeigte, dass eine gesteigerte Funktion von NaV1.9 diese spezifische Kanalerkrankung auslöst, was die Wichtigkeit von NaV1.9 in menschlichen Motoneuronen unterstreicht. Eine frühere Studie beschrieb an hippocampalen Neuronen, dass die Rezeptortyrosinkinase tropomyosin receptor kinase B (TrkB) den NaV1.9 Kanal öffnen kann. Im Wachstumskegel von Motoneuronen ist TrkB nachweisbar und folglich in räumlicher Nähe zu NaV1.9 zu finden. Um zu prüfen, ob TrkB in die spontane Erregbarkeit von Motoneuronen involviert ist, wurden TrkB knock-out Mäuse untersucht. Isolierte Motoneurone von TrkB knock-out Mäusen weisen eine Reduktion der Spontanaktivität und eine Verringerung des Axonwachstums auf. Ob TrkB und NaV1.9 hierbei funktionell gekoppelt sind, ist Gegenstand künftiger Forschung. N2 - During development of the nervous system, spontaneous Ca2+ transients are observed that regulate the axon growth of motoneurons. This form of spontaneous neuronal activity is reduced in motoneurons from a mouse model of spinal muscular atrophy and this defect correlates with reduced axon elongation. Experiments from our group demonstrated that voltage-gated sodium channel pore blockers decrease spontaneous neuronal activity and axon growth in cultured motoneurons, too. In these experiments, saxitoxin was more potent than tetrodotoxin. We identified the saxitoxin-sensitive/tetrodotoxin-insensitive voltage-gated sodium channel NaV1.9 as trigger for the opening of voltage-gated calcium channels. In motoneurons, expression of NaV1.9 was verified via quantitative RT-PCR. Immuno labelling experiments revealed enrichment of the channel in axonal growth cones and at the nodes of Ranvier of isolated nerve fibres from wild type mice. Motoneurons from NaV1.9 knock-out mice show decreased spontaneous activity and reduced axonal elongation. This growth defect can be rescued by NaV1.9 overexpression. In motoneurons from Smn-deficient mice, NaV1.9 distribution appeared to be normal. Recently, patients carrying a missense mutation in the NaV1.9-encoding gene SCN11A were identified. These patients are not able to feel pain and suffer from muscular weakness and a delayed motor development. Molecular biological work during this dissertation supported the analysis of this mutation in a mouse model carrying the orthologous alteration in the Scn11a locus. The cooperation study confirmed that a gain-of-function mechanism underlies the NaV1.9-mediated channelopathy, thus suggesting a functional role of NaV1.9 in human motoneurons. An earlier study showed in hippocampal neurons that the receptor tyrosine kinase tropomyosin receptor kinase B (TrkB) can open the NaV1.9 channel. TrkB is localized in growth cones of motoneurons and subsequently found in close proximity to NaV1.9. In order to proof whether TrkB is involved in spontaneous excitability in motoneurons, TrkB knock-out mice were analysed. Isolated motoneurons from TrkB knock-out mice show a reduced spontaneous activity and axon elongation. It remains to be studied whether TrkB and NaV1.9 are functionally connected. KW - Motoneuron KW - Neurotrophic factors KW - NaV1.9 KW - motoneuron KW - spontaneous neuronal activity KW - Axon KW - Wachstum KW - Natriumkanal KW - TrkB Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-92877 ER - TY - THES A1 - Popp, Maria Corinna T1 - Einfluss von neuropathischem Schmerz und dessen Behandlung mit D-4F auf die Expression von Abca1 in Ratten T1 - Influence of neuropathic pain and its treatment with D-4F on the expression of Abca1 in rats N2 - D-4F, an ApoA-I mimetic peptide, alleviates mechanical hyperalgesia after administration to rodents suffering from inflammatory and neuropathic pain. D-4F scavenges proalgesic oxidized lipids – as such an anti-inflammatory drug – but also activates ATP-binding cassette transporters (Abca1 and Abcg1) – as such an anti-atherosclerotic drug. Aim of the project was to investigate the impact of neuropathy and its treatment with D-4F on the expression of Abca1/Abcg1 as well as cytokines. N2 - D-4F, ein ApoA-I-mimetisches Peptid, lindert mechanische Hyperalgesie nach Verabreichung an Nagetiere, die an entzündlichen und neuropathischen Schmerzen leiden. D-4F fängt proalgetische oxidierte Lipide ab – als ein solches entzündungshemmendes Medikament – ​​aktiviert aber auch ATP-bindende Kassettentransporter (Abca1 und Abcg1) – als ein solches anti-atherosklerotisches Medikament. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Neuropathie und deren Behandlung mit D-4F auf die Expression von Abca1/Abcg1 sowie Zytokinen zu untersuchen. KW - ABC-Transporter KW - Neuralgie KW - D-4F KW - Neuropathischer Schmerz KW - Cholesterintransporter Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281502 ER - TY - THES A1 - Spitzel, Marlene T1 - The impact of inflammation, hypoxia, and vasculopathy on pain development in the α-galactosidase A mouse model of Morbus Fabry T1 - Der Einfluss von Inflammation, Hypoxie und Vaskulopathie auf die Schmerzentwicklung des Morbus Fabry-spezifischen α-Galaktosidase A Mausmodells N2 - Fabry disease (FD), an X-linked lysosomal storage disorder, is caused by variants in the gene α-galactosidase A (GLA). As a consequence, the encoded homonymous enzyme GLA is not produced in sufficient amount or does not function properly. Subsequently, globotriaosylceradmide (Gb3), the target substrate of GLA, starts accumulating in several cell types, especially neurons and endothelial cells. FD patients suffer from multiorgan symptoms including cardiomyopathy, nephropathy, stroke, and acral burning pain. It is suggested that the impact of pathological Gb3 accumulation, inflammatory and hypoxic processes, and vasculopathy are contributing to the specific FD pain phenotype. Thus, we investigated the role of inflammation, hypoxia, and vasculopathy on molecular level in dorsal root ganglia (DRG) of the GLA knockout (KO) mouse model. Further, we investigated pain-like characteristics of GLA KO mice at baseline (BS), after capsaicin administration, and after repeated enzyme replacement therapy (ERT) administration for a period of 1.5 years. Acquired data showed disturbances in immune response markers represented by downregulated inflammation-associated genes and lower numbers of CD206+ macrophages in DRG of GLA KO mice. Hypoxic mechanisms were active in DRG of GLA KO mice reflected by increased gene expression of hypoxia- and DNA damage-associated targets, higher numbers of hypoxia-inducible factor 1α-positive (HIF1α+) and carbonic anhydrase 9-positive (CA9+) neurons in DRG of GLA KO mice, and DRG neuronal HIF1α cytosolic-nuclear translocation in GLA KO mice. Vascularization in DRG of GLA KO mice was reduced including lower numbers of blood vessel branches and reduced total blood vessel length. Pain-like behavior of the GLA KO mouse model revealed no mechanical hypersensitivity at BS but age-dependent heat hyposensitivity, which developed also age-matched wild type (WT) mice. Capsaicin administration under isoflurane anesthesia did not elicit the development of nocifensive behavior in GLA KO mice after mechanical or heat stimulation. Repeated ERT administration did not show a clear effect in GLA KO mice in terms of restored heat hyposensitivity to BS paw withdrawal latencies. In summary, we demonstrated the impact of disturbed immune response markers, active hypoxic mechanisms, and reduced vascularization on molecular FD pathophysiology. N2 - Morbus Fabry (M. Fabry oder Fabry disease, FD) ist eine X-chromosomal vererbte, lysosomale Speichererkrankung, die durch Varianten im Gen α-Galaktosidase A (GLA) verursacht wird. Das durch GLA kodierte gleichnamige Enzym GLA kann somit nicht in ausreichender Menge produziert werden oder erhält nicht die volle Funktionalität. Als Folge akkumuliert das Glykosphingolipid Globotriaosylceramid (Gb3), welches das Zielsubstrat von GLA ist und durch dieses Enzym normalerweise abgebaut wird. Gb3 Akkumulationen sind in verschiedenen Zelltypen zu finden, jedoch bevorzugt in Neurone und Endothelzellen. FD-Patienten leiden unter Symptome, die verschiedene Organe betreffen, insbesondere Kardiomyopathien, Nephropathien, Schlaganfälle, und brennende Schmerzen in den Extremitäten. Es wird vermutet, dass neben dem pathologischen Einfluss der Gb3 Ablagerungen auch inflammatorische und hypoxische Prozesse und Vaskulopathien zum spezifischen FD-Schmerzphänotyps beitragen. Daher wurde die Rolle der Inflammation, Hypoxie und Vaskulopathie auf molekularer Ebene in Spinalganglien (dorsal root ganglion, DRG) eines FD-spezifischen GLA knockout (KO) Mausmodells untersucht. Des Weiteren wurde der Schmerz-ähnliche Phänotyp in GLA KO Mäusen unter nativen Bedingungen, nach Capsaicingabe und unter Enzymersatztherapie (enzyme replacement therapy, ERT) während einer Dauer von 1,5 Jahren untersucht. Unsere erhobenen Daten zeigten eine Beeinträchtigung von Faktoren der Immunantwort, die sich durch herunterregulierter Genexpression Inflammations-assoziierter Gene und einer geringeren Anzahl an CD206+ Makrophagen in DRG von GLA KO Mäusen nachweisen ließ. Zu aktiven Hypoxiemechanismen trugen eine hochregulierte Genexpression Hypoxie- und DNA-Schäden-assoziierter Gene, eine höhere Anzahl an hypoxia-inducible factor 1α-positiver (HIF1α+) und carbonic anhydrase 9-positiver (CA9+) Neurone in DRG von GLA KO Mäusen, und die DRG neuronale HIF1α Translokation zwischen Zytosol und Nukleus bei. Die Vaskularisierung der DRG in GLA KO Mäusen war reduziert zusätzlich zu der geringeren Anzahl an Blutgefäßverzweigungen und einer Reduzierung der gesamten Blutgefäßlänge. Die Untersuchungen des nativen Schmerz-ähnlichen Verhaltens der GLA KO Mäuse zeigte keine Entwicklung mechanischer Hypersensitivität, während sich eine Hitzehyposensitivität mit steigendem Alter der Tiere entwickelte, die sich auch in altersangepassten Wildtyp (WT) Mäusen zeigte. Eine Capsaicingabe unter Isoflurannarkose zeigte keine erhöhte Sensitivität der GLA KO Mäuse nach mechanischer oder Hitzestimulation. Wiederholte ERT-Gaben zeigten keine Verbesserung der Hitzehyposensitivität auf ein natives Niveau der Pfotenrückzuglatenz. Wir konnten den Einfluss beeinträchtigter Faktoren der Immunantwort, aktiver Hypoxieprozesse und reduzierter Vaskularisierung in DRG von GLA KO Mäusen auf die molekulare FD-Pathophysiologie zeigen. KW - Fabry disease KW - GLA KO mouse model KW - molecular mechanism KW - Fabry-Krankheit KW - Morbus Fabry Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345794 ER - TY - THES A1 - Bieniussa, Linda Ilse T1 - Different effects of conditional Knock-Out of Stat3 on the sensory epithelium of the Organ of Corti T1 - Unterschiedliche Auswirkungen des konditionellen Knock-Outs von Stat3 im sensorischen Epithel des Cortischen Organs N2 - Die Cochlea von Säugetieren nimmt Schall als Reaktion auf Vibrationen an frequenzabhängigen Positionen entlang des Cochlea-Kanals wahr. Die sensorischen äußeren Haarzellen, die von Stützzellen umgeben sind, wirken als Signalverstärker, indem sie ihre Zelllänge verändern können. Dies wird als Elektromotilität bezeichnet. Um eine korrekte elektrische Übertragung bei mechanischen Kräften zu gewährleisten, ist ein gewisser Widerstand des sensorischen Epithels eine Voraussetzung für die fehlerfreie Weiterleitung von Hörinformationen. Dieser Widerstand wird durch Mikrotubuli und deren posttranslationalen Modifikationen in den Stützzellen des sensorischen Epithels der Cochlea gewährleistet. Stat3 ist ein Transkriptionsfaktor, der an verschiedenen Phosphorylierungsstellen, sowie je nach Zelltyp und aktiviertem Signalweg an vielen zellulären Prozessen wie Differenzierung, Entzündung, Zellüberleben und Mikrotubuli-Dynamik beteiligt ist. Während Stat3 ein breites Spektrum an intrazellulären Funktionen hat, stellte sich die Frage, wie und ob Stat3 in den Zellen des Cortischen Organ einen Einfluss auf den Hörprozess hat. Um dies zu testen, wurde das Cre/loxp-System verwendet, um Stat3 in den äußeren Haarzellen oder den Stützzellen entweder vor oder nach Hörbeginn von Mäusen konditional auszuschalten. Um das Hörvermögen zu erfassen, wurden DPOAE- und ABR-Messungen durchgeführt, während molekulare und morphologische Untersuchungen mittels Sequenzierung und Immunhistochemie durchgeführt wurden. Eine konditioneller Knock-Out von Stat3 vor und nach dem Beginn des Hörens in äußeren Haarzellen führt zu leichten Hörschäden, während Synapsen, Nervenfasern und Mitochondrien nicht betroffen waren. Die Analyse der Sequenzierung von äußeren Haarzellen aus Mäusen mit konditionellem Knock-Out vor dem Beginn des Hörens ergab eine Störung der zellulären Homöostase und der extrazellulären Signale. Ein konditioneller Knock-Out von Stat3 in den äußeren Haarzellen nach Beginn des Hörens führte zu einem früh-entzündlichen Signalweg mit erhöhter Zytokinproduktion und der Hochregulierung des NF-κB-Wegs. In den Stützzellen führte ein kondioneller Knock-Out von Stat3 nur nach dem Beginn des Hörens zu einer Hörbeeinträchtigung. Synapsen, Nervensoma und -fasern waren jedoch von einem konditionellen Knock-Out von Stat3 in Stützzellen nicht betroffen. Dennoch war die detyronisierte Modifikation der Mikrotubuli verändert, was zu einer Instabilität der Stützzellen, insbesondere der Phalangealfortsätze, führte, was wiederum zu einer Instabilität des Epithels während des Hörvorgangs führte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein konditioneller Knock-Out von Stat3 in Zellen des Cortischen Organs zu einer Hörstörung führte. Während ein konditioneller Knock-Out in äußeren Haarzellen eine erhöhte Zytokinproduktion zur Folge hatte, verloren die Stützzellen ihre Zellstabilität aufgrund einer verminderten detyronisierten Modifikation der Mikrotubuli. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Stat3 ein wichtiges Protein für die Hörleistung ist. Es sind jedoch weitere Untersuchungen des molekularen Mechanismus erforderlich, um die Rolle von Stat3 in den Zellen des Corti-Organs zu verstehen. N2 - The mammalian cochlea detects sound in response to vibration at frequency-dependent positions along the cochlea duct. The sensory outer hair cells, which are surrounded by supporting cells, act as a signal amplifier by changing their cell length. This is called electromotility. To ensure correct electrical transmission during mechanical forces, a certain resistance of the sensory epithelium is a prerequisite for correct transduction of auditory information. This resistance is managed by microtubules and its posttranslational modification in the supporting cells of the sensory epithelium of the cochlea. Stat3 is a transcription factor, with its different phosphorylation sites, is involved in many cellular processes like differentiation, inflammation, cell survival and microtubule dynamics, depending on cell type and activated pathway. While Stat3 has a wide range of intracellular roles, the question arose, how and if Stat3 is involved in cells of the organ of Corti to ensure a correct hearing. To test this, Cre/loxp system were used to perform conditional Knock-Out (cKO) of Stat3 in outer hair cells or supporting cells either before hearing onset or after hearing onset. Hearing performances included DPOAE and ABR measurements, while molecular were performed by sequencing. Additionally, morphological examination was used by immunohistochemistry and electron microscopy. A cKO of Stat3 before and after hearing onset in outer hair cells leads to hearing impairments, whereas synapses, nerve fibers and mitochondria were not affected. Bulk sequencing analyzation of outer hair cells out of cKO mice before hearing onset resulted in a disturbance of cellular homeostasis and extracellular signals. A cKO of Stat3 in the outer hair cells after hearing onset resulted in inflammatory signaling pathway with increased cytokine production and upregulation of NF-kb pathway. In supporting cells, cKO of Stat3 only after hearing onset resulted in a hearing impairment. However, synapses, nerve soma and fibers were not affected of a cKO of Stat3 in supporting cells. Nevertheless, detyronisated modification of microtubules were altered, which can lead to an instability of supporting cells during hearing. In conclusion, Stat3 likely interact in a cell-specific and function-specific manner in cells of the organ of Corti. While a cKO in outer hair cells resulted in increased cytokine production, supporting cells altered its stability due to decreased detyronisated modification of microtubules. Together the results indicated that Stat3 is an important protein for hearing performances. However, additional investigations of the molecular mechanism are needed to understand the role of Stat3 in the cells of the organ of Corti. KW - Audiologie KW - Corti-Organ KW - Transgener Organismus KW - Sinneszelle KW - Elektrophysiologie KW - Stat3 KW - Mikrotubuli KW - conditional Knockout KW - hearing KW - Organ of Corti KW - Mikrotubulus Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-351434 ER - TY - THES A1 - Hugo, Julian T1 - ‘Signal-close-to-noise’ calcium activity reflects neuronal excitability T1 - ‘Signal-close-to-noise’ Kalziumaktivität als Ausdruck neuronaler Erregbarkeit N2 - Chronic pain conditions are a major reason for the utilization of the health care system. Inflammatory pain states can persist facilitated by peripheral sensitization of nociceptors. The voltage-gated sodium channel 1.9 (NaV1.9) is an important regulator of neuronal excitability and is involved in inflammation-induced pain hypersensitivity. Recently, oxidized 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylcholine (OxPAPC) was identified as a mediator of acute inflammatory pain and persistent hyperalgesia, suggesting an involvement in proalgesic cascades and peripheral sensitization. Peripheral sensitization implies an increase in neuronal excitability. This thesis aims to characterize spontaneous calcium activity in neuronal compartments as a proxy to investigate neuronal excitability, making use of the computational tool Neural Activity Cubic (NA3). NA3 allows automated calcium activity event detection of signal-close-to-noise calcium activity and evaluation of neuronal activity states. Additionally, the influence of OxPAPC and NaV1.9 on the excitability of murine dorsal root ganglion (DRG) neurons and the effect of OxPAPC on the response of DRG neurons towards other inflammatory mediators (prostaglandin E2, histamine, and bradykinin) is investigated. Using calcium imaging, the presence of spontaneous calcium activity in murine DRG neurons was established. NA3 was used to quantify this spontaneous calcium activity, which revealed decreased activity counts in axons and somata of NaV1.9 knockout (KO) neurons compared to wildtype (WT). Incubation of WT DRG neurons with OxPAPC before calcium imaging did not show altered activity counts compared to controls. OxPAPC incubation also did not modify the response of DRG neurons treated with inflammatory mediators. However, the variance ratio computed by NA3 conclusively allowed to determine neuronal activity states. In conclusion, my findings indicate an important function of NaV1.9 in determining the neuronal excitability of DRG neurons in resting states. OxPAPC exposition does not influence neuronal excitability nor sensitizes neurons for other inflammatory mediators. This evidence reduces the primary mechanism of OxPAPC-induced hyperalgesia to acute effects. Importantly, it was possible to establish an approach for unbiased excitability quantification of DRG neurons by calcium activity event detection and calcium trace variance analysis by NA3. It was possible to show that signal-close-to-noise calcium activity reflects neuronal excitability states. N2 - Entzündliche Schmerzzustände können lange fortbestehen, was durch eine periphere Sensibilisierung von Nozizeptoren begünstigt wird. Der spannungsgesteuerte Natriumkanal 1.9 (NaV1.9) ist ein wichtiger Regulator neuronaler Erregbarkeit und ist nachweislich an entzündungsbedingter Schmerzüberempfindlichkeit beteiligt. Kürzlich wurde oxidiertes 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylcholin (OxPAPC) als Mediator akuter Entzündungsschmerzen und anhaltender Hyperalgesie identifiziert, was auf eine Beteiligung an Mechanismen der peripheren Sensibilisierung hindeutet. Periphere Sensibilisierung setzt eine Erhöhung der neuronalen Erregbarkeit voraus. In dieser Arbeit soll neuronale spontane Kalziumaktivität charakterisiert werden, um Rückschlüsse auf die neuronale Erregbarkeit zu ziehen. Dazu wurde das Tool Neural Activity Cubic (NA3) eingesetzt, welches die automatisierte Detektion von „signal-close-to-noise“ Kalziumaktivitätsereignissen und die Bewertung neuronaler Aktivitätszustände erlaubt. Mittels NA3 wurde der Einfluss von OxPAPC und NaV1.9 auf die Erregbarkeit von murinen Spinalganglion (DRG)-Neuronen untersucht. Zusätzlich wurde die Reaktion von DRG-Neuronen auf weitere Entzündungsmediatoren (Prostaglandin E2, Histamin und Bradykinin) nach Inkubation mit OxPAPC beurteilt. Mittels Calcium-Imaging konnte spontane Kalziumaktivität in murinen DRG-Neuronen identifiziert werden. NA3 wurde verwendet, um diese spontane Kalziumaktivität zu quantifizieren. NaV1.9 Knockout-Neuronen (KO) zeigten signifikant Verringerte Kalziumaktivität im Vergleich Wildtyp (WT)-Neuronen. Die Inkubation von WT-Neuronen mit OxPAPC vor Calcium-Imaging resultierte in unveränderter Kalziumaktivität. Eine OxPAPC-Inkubation hatte ebenso keinen Einfluss auf die Reaktion von DRG-Neuronen, die mit einem Gemisch aus Entzündungsmediatoren stimuliert wurden. Die von NA3 berechnete „variance ratio“ ermöglichte jedoch eine eindeutige Bestimmung der neuronalen Aktivitätszustände. Zusammenfassend weisen meine Ergebnisse auf eine wichtige Funktion von NaV1.9 bei der Bestimmung der neuronalen Erregbarkeit von DRG-Neuronen im Ruhezustand hin. Eine Exposition mit OxPAPC beeinflusst allerdings weder die neuronale Erregbarkeit noch werden Neuronen für andere Entzündungsmediatoren sensibilisiert. Dies legt akute Effekte als primären Mechanismus der OxPAPC-induzierten Hyperalgesie nahe. Es war möglich, eine Methode für die unverzerrte Quantifizierung neuronaler Erregbarkeit von durch die Erkennung von Kalziumaktivitätsereignissen und die Varianzanalyse von Kalziumsignalen mit NA3 zu etablieren. Es konnte gezeigt werden, dass die „signal-close-to-noise“ Kalziumaktivität den Zustand der neuronalen Erregbarkeit widerspiegelt. KW - Entzündung KW - Schmerz KW - Natriumkanal KW - Erregbarkeit KW - Phospholipide KW - neuronal excitability KW - NaV1.9 KW - inflammatory pain KW - calcium activity Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-292605 ER - TY - THES A1 - Fuhl, Isabell T1 - Untersuchung der synaptischen Lokalisation des heteromeren Glycin-Rezeptors in einem neuen Mausmodell der \(Startle\) Erkrankung - mit Fokus auf die GlyR-β-Untereinheit - T1 - Investigation of the synaptic localisation of the heteromeric glycine receptor in a new mouse model of startle disease - with a focus on the GlyR-β subunit N2 - Der Glycin-Rezeptor ist Teil der inhibitorischen liganden-gesteuerten Ionenkanäle im ZNS und wird am stärksten im adulten Rückenmark sowie im Hirnstamm exprimiert. In der Nerv-Muskel-Synapse sind GlyR für die rekurrente Hemmung der Motoneuronen wichtig und steuern das Gleichgewicht zwischen Erregung und Hemmung der Muskelzellen. Für die glycinerge Neurotransmission sind neben den präsynaptischen GlyR 𝛼1 insbesondere postsynaptische GlyR 𝛼1/𝛽 verantwortlich. Durch Mutationen des GlyR entsteht das Erkrankungsbild der Hyperekplexie mit übersteigerter Schreckhaftigkeit, Muskelsteifheit und Apnoe. Hauptursächlich dafür sind Mutationen im GLRA1-Gen. Die shaky Maus stellt ein gutes Modell zur Erforschung dieser seltenen Erkrankung dar. Die shaky Missense-Mutation Q177K in der extrazellulären 𝛽8-𝛽9 Schleife der Glycin- Rezeptor-𝛼1-Untereinheit zeigte strukturell ein gestörtes Wasserstoffbrückennetzwerk. Funktionell konnten eingeschränkt leitfähige Ionenkanäle identifiziert werden. Der letale Phänotyp äußert sich beim homozygoten shaky Tier durch Schrecksymptome mit einem einhergehenden zunehmenden Gewichtsverlust. Die Quantifizierung der Oberflächenexpression deutete auf einen Verlust synaptischer GlyR 𝛼1/𝛽 hin. Aussagen bezüglich der GlyR-𝛽-Untereinheit, die Teil des synaptischen GlyR Komplexes ist, waren aufgrund fehlender stabiler Antikörper bisher nicht möglich. Das neuartige KI- Mausmodell Glrb eos exprimiert endogen fluoreszierende 𝛽 -Untereinheiten und ermöglicht damit erstmalig eine Betrachtung der GlyR- 𝛽-Expression in Tiermodellen der Startle Erkrankung. Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen der shaky Mutation auf die Interaktion mit der 𝛽 -Untereinheit und Gephyrin zu erforschen. Dafür wurden Markerproteine der glycinergen Synapse in Rückenmarksneuronen der Kreuzung Glrb eos x Glra1 sh gefärbt und quantifiziert. Die durchgeführte Gewichtsbestimmung der Nachkommen im zeitlichen Verlauf zeigte keinen Einfluss der eingefügten mEos4b-Sequenz auf das Körpergewicht der Tiere und schließt damit funktionelle Einschränkungen bedingt durch die mEos4b-Sequenz aus. Zur Verstärkung des 𝛽 eos-Signals wurde ein Antikörper verwendet. Die Quantifizierung der GlyR- 𝛽- Untereinheit an Rückenmarksneuronen zeigte für homozygote shaky Tiere im Vergleich zum Wildtyp signifikant reduzierte 𝛽eos Oberflächenexpressionen in Gephyrin Clustern sowie signifikant erniedrigte Kolokalisationen von Gephyrin/𝛼1, 𝛽eos/𝛼1 und 𝛽eos/Gephyrin. Die mutierte GlyR-𝛼1- Untereinheit wurde hingegen vermehrt an der Oberfläche in shaky Tieren exprimiert. Die Ergebnisse der Rückenmarksschnitte unterstützen diese Befunde aus den Primärneuronen. Die Untersuchung der Präsynapse erbrachte für Glrb eos/eos x Glra1 sh/sh eine signifikant verminderte Synapsin und Synapsin/𝛼1 Expression. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern die Daten früherer Arbeiten zur shaky Maus und zeigen einen starken Verlust synaptischer GlyR 𝛼 1/ 𝛽 an der Oberfläche von Motoneuronen. Ein möglicher kompensatorischer Versuch durch erhöhte 𝛼1 Expression bleibt infolge der Funktionsbeeinträchtigung dieser mutierten GlyR- 𝛼 1 Rezeptoren erfolglos mit letalem Ausgang. In vorherigen Arbeiten wurde vermutet, dass die Mutation in der extrazellulären Bindungsstelle in der Lage ist, Konformationsänderungen in die TM3-TM4-Schleifenstruktur zu übertragen und dadurch die Gephyrin Bindung und synaptische Verankerung zu stören. Die Daten dieser Arbeit stützen diese Annahme und weisen darüber hinaus auf eine gestörte Rezeptorkomplexbindung hin. Die vorliegende Arbeit trägt somit zum besseren Verständnis der Startle Erkrankung auf synaptischer Ebene bei. N2 - The glycine receptor belongs to the inhibitory ligand-gated ion channels in the CNS and is most strongly expressed in the adult spinal cord and brainstem. In the nerve-muscle synapse, GlyR are important for recurrent inhibition of motor neurons and control the balance between excitation and inhibition of muscle cells. In addition to the presynaptic GlyR 𝛼1, postsynaptic GlyR 𝛼1/ 𝛽 in particular are responsible for glycinergic neurotransmission. Mutations of the GlyR lead to the clinical symptoms of hyperekplexia with excessive startle responses, muscle stiffness and apnea. The main causes are mutations in the GLRA1 gene. The shaky mouse is a good model for studying this rare disease. The shaky missense mutation Q177K, located in the extracellular 𝛽8-𝛽9 loop of the glycine receptor 𝛼1 subunit, showed a disrupted hydrogen bond network at the structural level. Functionally restricted conductive ion channels could be identified. The lethal phenotype in the homozygous shaky mouse is manifested by startle symptoms with accompanied increasing weight loss. Quantification of surface expression indicated a loss of synaptic GlyR 𝛼1/𝛽. So far, statements regarding the GlyR-𝛽-subunit which is part of the synaptic receptor complex had not been possible due to the lack of stable antibodies. The novel KI mouse model Glrb eos endogenously expresses fluorescent β-subunits and thus allows an observation of GlyR 𝛽-expression in animal models of startle disease for the first time. The aim of this study was to explore the effects of the shaky mutation on the interaction with the 𝛽-subunit and gephyrin. To this aim, marker proteins of the glycinergic synapse were stained and quantified in spinal cord neurons of Glrb eos x Glra1 sh. The performed weight determination of the littermates over time showed no influence of the inserted mEos4b-sequence on the bodyweight of the animals, thus ruling out functional limitations caused by the mEos4b-sequence. An antibody was used to amplify the 𝛽eos signal. Quantification of the GlyR-𝛽- subunit at spinal cord neurons demonstrated significantly reduced 𝛽eos surface expressions in gephyrin clusters as well as significantly decreased colocalisations of gephyrin/α1, 𝛽eos/𝛼1 and 𝛽eos/gephyrin for homozygous shaky animals compared to wild type. The mutant GlyR- 𝛼1 subunit exhibited enhanced expression at the surface in isolated spinal cord neurons from shaky animals. Results from spinal cord tissues supported these findings from primary neurons. Examination of presynapses revealed significantly decreased synapsin and synapsin/ 𝛼1 expression for Glrb eos/eos x Glra1 sh/sh. The results of this study extend the data of previous studies on the shaky mouse, showing a severe loss of synaptic GlyR 𝛼1/𝛽 at the surface of motor neurons. A potential compensatory attempt through increased α1 expression remains unsuccessful with a lethal outcome due to the functional impairment of these mutated GlyR 𝛼1 receptors. Previous studies have suggested that the mutation in the extracellular binding site is able to transduce conformational changes in the TM3-TM4 loop structure, thereby disrupting gephyrin binding and synaptic integration. The data in this study support this hypothesis and furthermore indicate a disrupted receptor complex binding. The present study thus contributes to a better understanding of Startle disease at the synaptic level. KW - Glycinrezeptor KW - glycine receptor KW - shaky mouse KW - startle disease KW - Hyperekplexie KW - Mausmodell KW - inhibitory snapse Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348328 ER - TY - THES A1 - Prada Salcedo, Juan Pablo T1 - Image Processing and other bioinformatic tools for Neurobiology T1 - Bildbearbeitung und andere bioinformatische Werkzeuge für die Neurobiologie N2 - Neurobiology is widely supported by bioinformatics. Due to the big amount of data generated from the biological side a computational approach is required. This thesis presents four different cases of bioinformatic tools applied to the service of Neurobiology. The first two tools presented belong to the field of image processing. In the first case, we make use of an algorithm based on the wavelet transformation to assess calcium activity events in cultured neurons. We designed an open source tool to assist neurobiology researchers in the analysis of calcium imaging videos. Such analysis is usually done manually which is time consuming and highly subjective. Our tool speeds up the work and offers the possibility of an unbiased detection of the calcium events. Even more important is that our algorithm not only detects the neuron spiking activity but also local spontaneous activity which is normally discarded because it is considered irrelevant. We showed that this activity is determinant in the calcium dynamics in neurons and it is involved in important functions like signal modulation and memory and learning. The second project is a segmentation task. In our case we are interested in segmenting the neuron nuclei in electron microscopy images of c.elegans. Marking these structures is necessary in order to reconstruct the connectome of the organism. C.elegans is a great study case due to the simplicity of its nervous system (only 502 neurons). This worm, despite its simplicity has taught us a lot about neuronal mechanisms. There is still a lot of information we can extract from the c.elegans, therein lies the importance of reconstructing its connectome. There is a current version of the c.elegans connectome but it was done by hand and on a single subject which leaves a big room for errors. By automatizing the segmentation of the electron microscopy images we guarantee an unbiased approach and we will be able to verify the connectome on several subjects. For the third project we moved from image processing applications to biological modeling. Because of the high complexity of even small biological systems it is necessary to analyze them with the help of computational tools. The term in silico was coined to refer to such computational models of biological systems. We designed an in silico model of the TNF (Tumor necrosis factor) ligand and its two principal receptors. This biological system is of high relevance because it is involved in the inflammation process. Inflammation is of most importance as protection mechanism but it can also lead to complicated diseases (e.g. cancer). Chronic inflammation processes can be particularly dangerous in the brain. In order to better understand the dynamics that govern the TNF system we created a model using the BioNetGen language. This is a rule based language that allows one to simulate systems where multiple agents are governed by a single rule. Using our model we characterized the TNF system and hypothesized about the relation of the ligand with each of the two receptors. Our hypotheses can be later used to define drug targets in the system or possible treatments for chronic inflammation or lack of the inflammatory response. The final project deals with the protein folding problem. In our organism proteins are folded all the time, because only in their folded conformation are proteins capable of doing their job (with some very few exceptions). This folding process presents a great challenge for science because it has been shown to be an NP problem. NP means non deterministic Polynomial time problem. This basically means that this kind of problems cannot be efficiently solved. Nevertheless, somehow the body is capable of folding a protein in just milliseconds. This phenomenon puzzles not only biologists but also mathematicians. In mathematics NP problems have been studied for a long time and it is known that given the solution to one NP problem we could solve many of them (i.e. NP-complete problems). If we manage to understand how nature solves the protein folding problem then we might be able to apply this solution to many other problems. Our research intends to contribute to this discussion. Unfortunately, not to explain how nature solves the protein folding problem, but to explain that it does not solve the problem at all. This seems contradictory since I just mentioned that the body folds proteins all the time, but our hypothesis is that the organisms have learned to solve a simplified version of the NP problem. Nature does not solve the protein folding problem in its full complexity. It simply solves a small instance of the problem. An instance which is as simple as a convex optimization problem. We formulate the protein folding problem as an optimization problem to illustrate our claim and present some toy examples to illustrate the formulation. If our hypothesis is true, it means that protein folding is a simple problem. So we just need to understand and model the conditions of the vicinity inside the cell at the moment the folding process occurs. Once we understand this starting conformation and its influence in the folding process we will be able to design treatments for amyloid diseases such as Alzheimer's and Parkinson's. In summary this thesis project contributes to the neurobiology research field from four different fronts. Two are practical contributions with immediate benefits, such as the calcium imaging video analysis tool and the TNF in silico model. The neuron nuclei segmentation is a contribution for the near future. A step towards the full annotation of the c.elegans connectome and later for the reconstruction of the connectome of other species. And finally, the protein folding project is a first impulse to change the way we conceive the protein folding process in nature. We try to point future research in a novel direction, where the amino code is not the most relevant characteristic of the process but the conditions within the cell. N2 - Neurobiologie wird durch Bioinformatik unterstützt, aufgrund der großen Datenmengen, die von biologischer Seite her anfallen, bedarf es eines rechnerischen Ansatzes, um diese Daten sinnvoll zu interpretieren. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation werden vier Werkzeuge aus dem Bereich der Bioinformatik für die Anwendung in der Neurobiologie vorgestellt. Die ersten beiden Werkzeuge gehören zum Bereich der digitalen Bildverarbeitung. Das erste Werkzeug nutzt einen Algorithmus basierend auf der Wavelet-Transformation, um Calciumaktivität in Neuronenkulturen zu bewerten. Hierzu wurde Open-Source-Software entwickelt, die Neurobiologen bei der Analyse von Videoaufnahmen unterstützt. Diese Analyse wird herkömmlicherweise manuell vorgenommen, sodass der Prozess zeitintensiv und sehr subjektiv ist. Die entwickelte Software beschleunigt den Arbeitsprozess und ermöglicht eine unverzerrte Detektion der Ereignisse in Bezug auf Calcium. Von noch größerer Bedeutsamkeit ist die Tatsache, dass der entwickelte Algorithmus nicht nur neuronale Spiking-Aktivität detektiert, sondern auch lokale Spontanaktivität, die herkömmlicherweise als irrelevant betrachtet und daher verworfen wird. Wir konnten zeigen, dass diese Spontanaktivität hohe Relevanz für die Dynamik von Calcium in den Neuronen besitzt und wahrscheinlich an wichtigen Funktionen beteiligt ist, wie der Signalmodulation, Lernen und Gedächtnis. Beim zweiten Projekt handelt es sich um eine Segmentierungsaufgabe. Wir sind daran interessiert, die neuronalen Zellkerne in elektromikroskopischen Aufnahmen des C.elegans zu segmentieren. Die Kennzeichnung dieser Struktur ist notwendig, um das Konnektom dieses Organismus zu rekonstruieren. Als Studienobjekt eignet sich C.elegans aufgrund der Simplizität seines Nervensystems (er besteht lediglich aus 502 Neuronen). Trotz der Simplizität des Nervensystems dieses Wurms konnten wichtige Erkenntnisse im Hinblick auf neuronale Mechanismen durch die Untersuchung dieses Modellorganismus gewonnen werden. Daher ist die Bestimmung des Konnektoms bedeutsam. Es existiert bereits eine Version des Konnektoms, doch diese wurde händig für lediglich ein Subjekt rekonstruiert und ist daher möglicherweise fehlerbehaftet. Die automatisierte Segmentierung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen ermöglicht einen weniger verzerrten Ansatz, der zudem die Verifizierung an mehreren Subjekten gestattet. Das dritte Projekt dieser Dissertation ist ein Projekt zur Modellierung und Simulation eines biologischen Systems. Aufgrund der hohen Komplexität selbst kleinster biologischer Systeme ist die computergestützte Analyse notwendig. Der Begriff in silico wurde für die computergestützte Simulation biologischer Systeme geprägt. Wir haben ein in silico Modell des TNF (Tumornekrosefaktor) Ligand und seiner zwei Hauptrezeptoren entwickelt. Dieses biologische System ist von hoher Bedeutsamkeit, da es am Entzündungsprozess beteiligt ist, der höchste Wichtigkeit als Schutzmechanismus hat, aber es kann auch komplizierte Erkrankungen auslösen (beispielsweise Krebs), falls es zu einer chronischen Entzündungsreaktion kommt. Derartige Entzündungsprozesse können besonders gefährlich im Gehirn sein. Das System muss eine schwierige Balance zwischen protektiver Funktion und möglicher Krankheitsursache behalten. Um die Dynamiken besser zu verstehen, die das TNF System leiten, haben wir ein Modell mittels der BioNetGen Sprache erstellt. Diese regelbasierte Sprache ermöglicht es ein System zu simulieren, in dem multiple Agenten geleitet werden von einer Regel. Mithilfe unseres Modells charakterisieren wir das TNF System und stellen Hypothesen über die Beziehung des Liganden mit den beiden Rezeptoren auf. Diese Hypothesen können später genutzt werden, um mögliche Ziele im System für Arzneimittel, mögliche Behandlungen für chronische Entzündungen oder das Fehlen einer Entzündungsreaktion zu bestimmen. Im abschießenden Projekt wird das Proteinfaltungsproblem behandelt. In unserem Organismus werden ständig Proteine gefaltet, denn nur im gefalteten Zustand können sie ihrer Aufgabe nachkommen (mit sehr wenigen Ausnahmen). Dieser Faltungsprozess stellt eine große Herausforderung für die Wissenschaft dar, weil gezeigt wurde, dass der Faltungsprozess ein NP Problem ist. NP steht dabei für nichtdeterministisch polynomielles Zeitproblem. Dies bedeutet im Grunde, dass es nicht effizient gelöst werden kann. Nichtsdestotrotz ist der Körper in der Lage, ein Protein in Millisekunden zu falten. Dieses Phänomen stellt nicht nur Biologen sondern auch Mathematiker vor Rätsel. In der Mathematik wurde diese Probleme schon lange studiert und es ist bekannt, dass die Kenntnis der Lösung eines NP Problems die Lösung vieler bedeuten würde (insbesondere NP-kompletter Probleme). Daher ist die Idee, dass viele Probleme gelöst werden könnten, durch das Verständnis davon, wie die Natur das Problem löst. Unsere Forschung zielt darauf ab, zu dieser Diskussion beizutragen, allerdings nicht durch die Erklärung davon, wie die Natur das Problem löst, sondern durch die Erklärung, dass die Natur das Problem nicht löst. Dies scheint zunächst widersprüchlich, da der Körper ständig Proteine faltet. Unsere Hypothese besagt jedoch, dass der Organismus gelernt hat, eine vereinfachte Version des NP Problems zu lösen. Die Natur löst das Problem nicht in seiner vollen Komplexität, sondern nur eine kleine Instanz davon. Eine Instanz, die ein konvexes Optimierungsproblem darstellt. Wir formulieren das Proteinfaltungsproblem als konvexes Optimierungsproblem und zur Illustrierung unserer Behauptung nutzen wir theoretische Beispiele. Wenn die Hypothese zutrifft, bedeutet dies, dass das Proteinfaltungsproblem ein einfaches ist und wir müssen lediglich die Ausgangskonstellation der Umgebung in der Zelle verstehen und modellieren, in dem Moment in dem die Faltung passiert. Sobald wir die Ausgangskonstellation und den Einfluss auf den Faltungsprozess verstehen, können wir Behandlungen für Amyloid-Krankheiten, wie Alzheimer-Demenz und Morbus Parkinson entwickeln. Zusammenfassend trägt die vorliegende Dissertation zu neurobiologischer Forschung durch vier Ansätze bei. Zwei sind praktische Beiträge mit sofortigem Nutzen für die Forschung, dazu zählen das Videoanalyse Tool für Calcium Aufnahmen und das TNF in silico Modell. Die neuronale Zellkernsegmentierung ist ein Beitrag für die nahe Zukunft – ein Schritt zur Vervollständigung des Konnektoms des C.elegans und langfristig zur Rekonstruktion der Konnektome anderer Spezies. Und schließlich ist das Proteinfaltungsprojekt ein erster Impuls den Proteinfaltungsprozess anders zu denken. Wir versuchen zukünftige Forschung in eine andere Richtung zu lenken, wobei nicht der Aminosäurecode das relevanteste Charakteristikum des Prozesses ist, sondern vielmehr die Bedingungen innerhalb der Zelle. KW - Bildverarbeitung KW - Neurobiologie KW - Model simulation KW - Protein folding KW - Bioinformatik KW - Image Processing KW - Simulation Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157721 ER - TY - THES A1 - Braun, Alexandra T1 - Psychosocial and somatic resilience factors of patients with fibromyalgia syndrome (FMS) T1 - Psychosoziale und somatische Resilienzfaktoren bei Patienten mit dem Fibromyalgie Syndrom (FMS) N2 - Background: In recent years, health care has increasingly become the focus of public interest, politics, health insurance companies, and research. This includes the development of therapeutic concepts that can respond individually to patients' resources in order to improve coping with chronic diseases. Research into psychosocial and biological resilience factors is very important and the basic objective of the present work. I studied patients with fibromyalgia syndrome (FMS), who suffer among others from chronic pain, fatigue, sleep and gastrointestinal problems. This patient cohort is characterized by a pronounced heterogeneity in terms of clinical outcome, degree in disability and coping. FMS has a prevalence of 3 – 8 % in the Western population and has a significant socio-economic impact. Validated psychosocial resilience factors include optimism, humor, coherence, self-efficacy, awareness with one's own resources and the ability to apply them profitably (coping), and a healthy social environment with positive relationships. Studies in patients with cancer revealed religiosity as positive and negative factor on the health outcome, but there is little data on religious aspects of pain resilience. Various genetic polymorphisms and anti-inflammatory cytokines are known as biological resilience factors. Various microRNA (miRNA) were detected to contribute to resilience in the context of stress and psychiatric disorders. Objective: The underlying research question of this work is to understand the factors that make some FMS patients resilient and others not, even though they suffer from the same disease. The long-term aim was to understand mechanisms and influencing factors of resilience to design preventive and resource-oriented therapies for FMS patients. Material and Methods: Three studies examined religious, physiological, biological, and psychosocial factors which may contribute to resilience in FMS patients. Study one combined data of questionnaires, a psychosocial interview, and regression analyses to investigate the relevance of religiosity for coping and resilience. Study two examined variance explaining factors and defined clusters among FMS patients by their differences in coping, pain phenotype and disability. The factor analysis used variables derived from questionnaires and qPCR of cytokines in white blood samples (WBC) of patients and healthy controls. Study three assessed cluster-wise miRNA signatures which may underly differences in behaviour, emotional and physiological disability, and resilience among patient clusters. A cluster-specific speculative model of a miRNA-mediated regulatory cycle was proposed and its potential targets verified by an online tool. Results: The data from the first study revealed a not very religious patient cohort, which was rather ambivalent towards the institution church, but described itself as a believer. The degree of religiosity played a role in the choice of coping strategy but had no effect on psychological parameters or health outcomes. The coping strategy "reinterpretation", which is closely related iv to the religious coping "reappraisal", had the highest influence on FMS related disability. Cognitive active coping strategies such as reappraisal which belongs to religious coping had the highest effect on FMS related disability (resilience) and could be trained by a therapist. Results from the second study showed high variances of all measured cytokines within the patient group and no difference between patient and control group. The high dispersion indicated cluster among patients. Factor analysis extracted four variance-explaining factors named as affective load, coping, pain, and pro-inflammatory cytokines. Psychological factors such as depression were the most decisive factors of everyday stress in life and represented the greatest influence on the variance of the data. Study two identified four clusters with respective differences in the factors and characterized them as poorly adapted (maladaptive), well adapted (adaptive), vulnerable and resilient. Their naming was based on characteristics of both resilience concepts, indicated by patients who were less stress-sensitive and impaired as a personal characteristic and by patients who emerged as more resilient from a learning and adaptive process. The data from the variance analysis suggests that problem- and emotion-focused coping strategies and a more anti-inflammatory cytokine pattern are associated with low impairment and contribute to resilience. Additional favorable factors include low anxiety, acceptance, and persistence. Some cluster-specific intervention proposals were created that combine existing concepts of behavioral and mindfulness therapies with alternative therapies such as vitamin D supplementation and a healthy intestinal flora. The results of the third study revealed lower relative gene expression of miR103a-3p, miR107, and miR130a-3p in the FMS cohort compared to the healthy controls with a large effect size. The adaptive cluster had the highest gene expression of miR103a-3p and tendentially of miR107, which was correlated with the subscale score "physical abuse" of the trauma questionnaire. Further correlations were found in particular with pain catastrophizing and FMS-related disability. MiR103a-3p and miR107 form a miRNA-family. Based on this, we proposed a miR103a/107 regulated model of an adaptive process to stress, inflammation and pain by targeting genetic factors which are included in different anti-inflammatory and stress-regulating pathways. Conclusion: All three studies provide new insights into resilience in FMS patients. Cognitive coping (reappraisal/reinterpretation) plays a central role and thus offers therapeutic targets (reframing in the context of behavioral therapy). Religosity as a resilience factor was only partially valid for our patient cohort. Basically, the use of resource-oriented therapy in large institutions still requires research and interdisciplinary cooperation to create a consensus between the humanities, natural sciences and humanism. N2 - Hintergrund: Die Gesunderhaltung ist in den letzten Jahren mehr und mehr in den Fokus des Interesses der Öffentlichkeit, Politik, Krankenkassen und Forschung gerückt. Dazu zählt auch die Entwicklung von Therapiekonzepten, die individuell auf die Bedürfnisse und Ressourcen der Patienten zugeschnitten sind, um den Umgang mit insbesondere chronischen Erkrankungen zu verbessern. Die Erforschung von psychosozialen und biologischen Resilienzfaktoren ist hierfür sehr wichtig, und das grundlegende Ziel der vorliegenden Arbeit. Zielgruppe sind Patienten mit Fibromyalgiesyndrom (FMS). Symptome des FMS sind u.a. chronischer Schmerz, Erschöpfung, Schlaf und Magen-, Darmprobleme. Die Patientengruppe erscheint in der Klinik als sehr heterogene mit unterschiedlichen Beeinträchtigungsgraden und verschiedenen Strategien, mit den Auswirkungen der Erkrankung umzugehen. Die Prävalenz des FMS liegt bei 3 – 8% in der westlichen Bevölkerung und ist somit von erheblicher gesellschaftlicher und sozioökonomischer Bedeutung. Validierte psychosoziale Resilienzfaktoren sind u.a. Optimismus, Humor, Kohärenzgefühl, Selbstwirksamkeit, Bewusstsein der eigenen Ressourcen und die Fähigkeit diese gewinnbringend anzuwenden (Coping) und ein gesundes soziales Umfeld mit positiven Beziehungen. Studien an Krebspatienten ergaben unterschiedliche Effekte von Religiosität als Copingstrategie und Resilienzfaktor. Im Allgemeinen liegen wenige Daten vor zum Thema Religiosität / als Schutzfaktor bei Schmerzpatienten. Als biologische Resilienzfaktoren sind verschiedene genetische Polymophismen, anti-inflammatorische Zytokine und microRNA (miRNA) bekannt, die zur Resilienz bei chronischem Stress und psychiatrischen Krankheitsbildern beitragen. Ziel: Die zugrundeliegende Forschungsfrage dieser vorliegenden Arbeit ist, welche Faktoren dazu beitragen, dass manche Patienten resilienter sind als andere, obwohl sie unter derselben Erkrankung leiden. Das langfristige Ziel dieser Forschung ist es, Mechanismen und Einflussfaktoren der Resilienz zu verstehen, um präventive und gezielte Ressourcen-orientierte Therapien für FMS Patienten zu entwickeln. Material und Methoden: Insgesamt drei Studien untersuchten explorativ eine Reihe von religiösen, physiologischen, biologischen und psychosozialen Faktoren und ihre Rolle als Schutzfaktor bei Patienten mit FMS. Studie 1 kombinierte Daten von Fragebögen, einem psychologischen Interview und Regressionsanalysen, um die Relevanz von Religiosität für das Coping und Resilienz zu untersuchen. Studie 2 versuchte mit einer explorativen Faktorenanalyse Einflussfaktoren zu ermitteln, die für die heterogene Datenlage der Patienten verantwortlich sind. Mithilfe einer Clusteranalyse wurden Subgruppen anhand ihrer Unterschiede in mentaler Gesundheit, Coping, Schmerzphänotyp und Beeinträchtigung definiert. Die Faktorenanalyse verwendete Daten der Fragebögen und Genexpressionsanalysen ausgewählter Zytokine aus Blutproben der Patienten und einer gesunden Kontrollgruppe. Zuletzt wurden Cluster-spezifische Therapievorschläge auf der Basis bereits bekannter Therapien zusammengestellt. Studie 3 bestimmte Cluster-charakteristische miRNA Signaturen, die verantwortlich für die Cluster-spezifischen Unterschiede in Verhalten (coping), emotionaler und körperlicher Beeinträchtigung, und Resilienz sein können. Die Ergebnisse wurden in einem Regulationsschema zusammengefasst und schlagen einen möglichen miRNA-regulierten Mechanismus von adaptivem Verhalten vor. Die potentiellen genetischen Targets wurden mittels eines online Tools „Target Scan Human“ verifiziert. Ergebnisse: Die Daten der ersten Studie zeigten eine wenig religiöse Patientenkohorte, die der Institution Kirche eher ambivalent gegenüberstand, sich jedoch dennoch als gläubig beschrieb. Der Grad der Religiosität spielte eine Rolle bei der Wahl der Copingstrategie, hatte jedoch keinen Einfluss auf psychologische Parameter oder die Gesundheit. Die Copingstrategie „Reinterpretation“, welche auch nah verwandt mit dem religiösen Coping „reappraisal“ ist, hatte einen signifikanten Einfluss auf die Beeinträchtigung, und könnte innerhalb einer Verhaltenstherapie erlernt werden. Ergebnisse der zweiten Studie zeigen hohe Varianzen aller gemessenen Zytokine innerhalb der Patientengruppe und keinen signifikanten Unterschied zwischen Patienten- und Kontrollgruppe. Die hohe Streuung deutete auf Subgruppen innerhalb der FMS Kohorte hin. Mittels einer Faktorenanalyse wurden vier Faktoren ermittelt, die dieser Varianz zugrunde liegen, welche absteigend als affektive Belastung, Coping, Schmerz und pro-inflammatorische Zytokine benannt wurden. Interessant ist, dass psychische Faktoren wie Depression den höchsten Einfluss auf die Belastung im Alltag darstellten und auch den größten Einfluss auf die Varianz der Daten abbildete. Studie 2 konnte vier Subgruppen mit jeweiligen Unterschieden in den charakterisierten Faktoren ermitteln und diese als schlecht angepasst (maladaptive), gut angepasst (adaptive), vulnerabel und resilient charakterisieren. Ihre Benennung basierte auf Charakteristika beider Resilienzkonzepte. Es gab Anzeichen für Patienten, die weniger stresssensibel und beeinträchtigt waren aufgrund von Persönlichkeitsstrukturen sowie Patienten, die aus einem Lern- und Anpassungsprozess nun resilienter hervorgingen. Die Daten der Varianzanalyse legten nahe, dass problem- und emotionsfokussierte Copingstrategien und ein eher antiinflammatorisches Zytokinmuster mit einer niedrigen Beeinträchtigung assoziiert sind und eher zur Resilienz beitragen. Zusätzliche begünstigende Faktoren sind niedrige Angstwerte, Akzeptanz und Durchhaltevermögen. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden einige Subgruppen-spezifische Interventionsvorschläge vorgestellt, welche bereits existierende Konzepte der Verhaltens- und Achtsamkeitstherapien mit alternativen Therapien wie Supplementierung von Vitamin D und eine gesunde Darmflora miteinander kombinieren. Die Ergebnisse der dritten Studie zeigten eine niedrigere relative Genexpression von miR103a-3p, miR107 und miR130a-3p in der FMS Kohorte verglichen mit der gesunden Kontrollkohorte mit einer großen Effektstärke. Die höchste relative Genexpression zeigte miR103a im adaptiven Cluster, das Cluster mit der niedrigsten Beeinträchtigung. MiR107 tendierte zu einer leicht erhöhten relativen Expression im adaptiven Cluster und war mit dem Subskalenscore „körperlicher Missbrauch“ des Traumafragebogens korreliert. Weitere Korrelationen fanden sich insbesondere mit den Variablen psychologischer Fragebögen zu Schmerz Katastrophisieren und FMS-bezogene Beeinträchtigung. MiR103a-3p und miR107 bilden zuammen eine miRNA Familie mit gleichen physiologischen Funktionen. Basierend auf diesen Erkenntnissen, schlugen wir ein Model der miR103a/107 regulierten Anpassung an Stress, Entzündung und Schmerz unter Einbezug verifizierter Gene, vor. Schlussfolgerung: Zusammenfassend geben alle drei Studien neue Einblicke in die Resilienzfaktoren von FMS Patienten. Dabei kommt dem kognitiven Coping (reappraisal / reinterpretation) eine zentrale Rolle zu, was therapeutische Ansatzpunkte (reframing innerhalb einer Verhaltenstherapie) bietet. Religiosität konnte sich in der hier untersuchten Kohorte als Schutzfaktor nur bedingt validieren. Grundsätzlich benötigt der Einsatz von ressourcenorientierter Therapie innerhalb großer Kliniken noch einiges an Forschung und interdisziplinärer Zusammenarbeit, die einen Konsens zwischen Geisteswissenschaften, Naturwissenschaften und Humanismus schafft. KW - Resilienz KW - resilience KW - Fibromyalgia KW - somatic resilience KW - psychosocial resilience Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242809 ER - TY - THES A1 - Gupta, Rohini T1 - Intracellular self-activation of the TrkB kinase domain causes FAK phosphorylation and disrupts actin filopodia dynamics T1 - Intrazelluläre Selbst-aktivierung der TrkB Kinase induziert FAK Phosphorylierung und verändert die Dynamik von Aktinfilopodien N2 - The tropomysin receptor kinase B (TrkB), the receptor for the neurotrophin brain-derived neurotrophic factor (BDNF), plays an important role in neuronal survival, neuronal differentiation, and cellular plasticity. Conventionally, TrkB activation is induced by binding of BDNF at extracellular sites and subsequent dimerization of receptor monomers. Classical Trk signaling concepts have failed to explain ligand-independent signaling of intracellular TrkB or oncogenic NTRK-fusion proteins. The intracellular activation domain of TrkB consists of a tyrosine kinase core, with three tyrosine (Y) residues at positions 701, 705 and 706, that catalyzes the phosphorylation reaction between ATPγ and tyrosine. The release of cisautoinhibition of the kinase domain activates the kinase domain and tyrosine residues outside of the catalytic domain become phosphorylated. The aim of this study was to find out how ligand-independent activation of TrkB is brought about. With the help of phosphorylation mutants of TrkB, it has been found that a high, local abundance of the receptor is sufficient to activate TrkB in a ligand-independent manner. This self-activation of TrkB was blocked when either the ATP-binding site or Y705 in the core domain was mutated. The vast majority of this self-active TrkB was found at intracellular locations and was preferentially seen in roundish cells, lacking filopodia. Live cell imaging of actin dynamics showed that self-active TrkB changed the cellular morphology by reducing actin filopodia formation. Signaling cascade analysis confirmed that self-active TrkB is a powerful activator of focal adhesion kinase (FAK). This might be the reason why self-active TrkB is able to disrupt actin filopodia formation. The signaling axis from Y705 to FAK could be mimicked by expression of the soluble, cytosolic TrkB kinase domain. However, the signaling pathway was inactive, when the TrkB kinase domain was targeted to the plasmamembrane with the help of artificial myristoylation membrane anchors. A cancer-related intracellular NTRK2-fusion protein (SQSTM1-NTRK2) also underwent constitutive kinase activation. In glioblastoma-like U87MG cells, self-active TrkB kinase reduced cell migration. These constitutive signaling pathways could be fully blocked within minutes by clinically approved, anti-tumorigenic Trk inhibitors. Moreover, this study found evidences for constitutively active, intracellular TrkB in tissue of human grade IV glioblastoma. In conclusion, the data provide an explanation and biological function for selfactive, constitutive TrkB kinase domain signaling, in the absence of a ligand. N2 - Die Rezeptortyrosinkinase TrkB, der Rezeptor für das Neurotrophin brain-derived neurotrophic factor (BDNF), spielt eine wichtige Rolle für das neuronale Überleben, die neuronale Differenzierung und die zelluläre Plastizität. Üblicherweise wird TrkB bei der Bindung von BDNF an extrazellulären Domänen durch Dimerisierung von Rezeptormonomeren aktiviert. Klassische Konzepte der Trk Signalübertragung können jedoch die Liganden-unabhängige Signalübertragung von intrazellulären TrkB- oder Onkogen-aktiven NTRK-Fusionsproteinen nicht erklären. Die intrazelluläre Aktivierungsdomäne von TrkB besitzt eine Tyrosinkinasedomäne mit drei Tyrosin (Y)-Resten an den Positionen 701, 705 und 706. Diese katalysieren die Phosphorylierungsreaktion zwischen ATPγ und Tyrosin. Durch die Enthemmung der cis-Autoinhibition wird die Kinase-Domäne aktiv und Tyrosinreste außerhalb der katalytischen Domäne werden phosphoryliert. Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, wie es zur Liganden-unabhängigen Aktivierung von TrkB kommen kann. Mit Hilfe von TrkB-Phosphorylierungsmutanten wurde gefunden, dass eine hohe, lokale Abundanz des Rezeptors ausreicht, um TrkB Liganden-unabhängig zu aktivieren. Diese Selbstaktivierung von TrkB konnte blockiert werden, wenn entweder die ATP-bindende Domäne oder Y705 in der Kinasedomäne mutiert wurden. Die überwiegende Mehrheit dieses selbstaktivierenden TrkB wurde intrazellulär, in rundlichen Zellen ohne Filopodien, gefunden. Live-Zellbildgebung der Aktindynamik zeigte zudem, dass selbstaktives TrkB die Zellmorphologie veränderte, indem es die Bildung von Aktin-Filopodien reduzierte. Die Analyse von Signalkaskaden bestätigte, dass selbstaktives TrkB ein starker Aktivator der Focal Adhesion Kinase (FAK) ist. Dies kann der Grund sein, warum selbstaktives TrkB die Bildung von Aktin-Filopodien zerstört. Die Signalkaskade von Y705 bis FAK konnte durch Expression der löslichen, zytosolischen TrkB-Kinase-Domäne imitiert werden. Der Signalweg war jedoch inaktiv, wenn die TrkB-Kinase-Domäne durch künstliche Myristoylierung an die Plasmamembran gebunden wurde. Ein intrazelluläres NTRK2-Fusionsprotein (SQSTM1-NTRK) zeigte ebenfalls konstitutive Kinaseaktivierung. In Glioblastom-ähnlichen U87MG-Zellen reduzierte die selbstaktive TrkB-Kinase sogar die Zellwanderung. Die konstitutiven Signalwege konnten durch klinisch zugelassene, anti-tumorale Trk-Inhibitoren innerhalb von Minuten vollständig blockiert werden. Darüber hinaus zeigt diese Studie Beweise für konstitutiv-aktives, intrazelluläres TrkB im Gewebe von humanem Glioblastom Grad IV. Die Daten dieser Arbeit geben somit eine Erklärung und eine biologische Funktion für die selbst-aktive, konstitutive Signalübertragung der TrkB-Kinase-Domäne, in Abwesenheit eines Liganden. KW - TrkB KW - self-activation KW - NTRK fusions KW - tyrosine kinase KW - BDNF KW - phosphorylation KW - cancer Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233829 ER -