TY  - THES
A1  - Lodes, Nina Theresa
T1  - Tissue Engineering für seltene Erkrankungen mit Störungen des mukoziliären Transports
T1  - Tissue engineering for rare diseases with impaired mucociliary transport
N2  - Bei der zystischen Fibrose (CF) sowie der primären Ziliendyskinesie (PCD) handelt es sich um zwei seltene Erkrankungen, die unter anderem den mukoziliären Transport beeinträchtigen. CF gehört hierbei zu den am häufigsten vorkommenden angeborenen Stoffwechselerkrankungen, wobei Betroffene unter einem Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductor Regulator (CFTR)-Gens leiden, der durch die Produktion von hochviskosem Sekret in muzinproduzierenden Organen, wie dem gastrointestinalen Trakt und der Lunge, gekennzeichnet ist. Patienten, die an PCD leiden, weisen Defekte in, zum jetzigen Zeitpunkt, ca. 38 bekannten und PCD-assoziierten Genen auf, die in strukturellen Defekten des ziliären Apparats und somit in dysfunktionalen Kinozilien resultieren. Da aktuell weder für die CF noch für die PCD eine Heilung möglich ist, steht bei der Therapie vor allem die Linderung der Symptome im Fokus. Grundlegendes Ziel ist der langfristige Erhalt der Lungenfunktion sowie die Prävention bakterieller Infekte. Als bisherige Modellsysteme zur Erforschung möglicher Therapeutika gelten Tiermodelle, die den humanen Phänotyp aufgrund von Speziesdiversität nicht vollständig abbilden können. Als vielversprechende Testsysteme für die zystische Fibrose gelten humane intestinale Organoidkulturen. Nachdem allerdings vorwiegend respiratorische Symptome für die Mortalität der Patienten verantwortlich sind, stellen CF-Atemwegsmodelle bessere Testsysteme für zukünftige Therapeutika dar. Atmungsorganoidkulturen wurden verwendet, um die CFTR-Funktionalität zu untersuchen, repräsentieren aber nicht vollständig die in vivo Situation. Deshalb werden zur Entwicklung neuer Therapiestrategien patientenspezifische 3D in vitro Testsysteme der humanen Atemwege benötigt, die insbesondere im Hinblick auf personalisierte Medizin ihren Einsatz finden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine für den Lehrstuhl neue Methode zur Zellgewinnung aus nasalen Schleimhautabstrichen etabliert, die eine standardisierte Versorgung mit humanem Primärmaterial garantiert. Zur Generierung einer krankheitsspezifischen Zelllinie, wie beispielsweise einer PCD-Zelllinie mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems, ist eine Atemwegszelllinie erforderlich, die die in vivo Situation vollständig repräsentiert. So wurden vier verschiedene respiratorische Epithelzelllinien (HBEC3-KT, Calu-3, VA10 und Cl-huAEC) auf ihren mukoziliären Phänotyp hin untersucht, wobei lediglich die Zelllinie HBEC3-KT in zilientragende Zellen differenzierte. Diese zeigten jedoch nur auf ca. 5 % der Modelloberfläche Kinozilien, wodurch die humane respiratorische Mukosa nicht komplett abgebildet werden konnte und die HBEC3-KT-Zelllinie keine geeignete Zelllinie zur Generierung einer PCD-Zelllinie darstellte. Mit Hilfe des Tissue Engineering war es möglich, 3D in vitro Testsysteme basierend auf zwei unterschiedlichen Matrices, der biologischen SIS (small intestinal submucosa) und der synthetischen Polyethylenterephthalat (PET)-Membran, aufzubauen. Es wurden 3D Atemwegstestsysteme mit humanen primären nasalen und tracheobronchialen Epithelzellen generiert. Ergänzend zu histologischen Untersuchungen und zur Charakterisierung spezifischer Marker des respiratorischen Systems mittels Immunfluoreszenz, wurde die Ultrastruktur der Modelle, mit speziellem Fokus auf ziliäre Strukturen, analysiert. Um Rückschlüsse auf die ziliäre Funktionalität ziehen zu können und somit eine hohe in vivo Korrelation zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit am Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin die Methode der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie etabliert, welche die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Ebenfalls wurde der Einfluss von isotoner Kochsalzlösung und des � 2-adrenergen Agonisten Salbutamol, das vor allem als Bronchodilatator bei Asthmapatienten eingesetzt wird, auf die Zilienschlagfrequenz analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen den Zilienschlag im Atemwegsmodell erhöhen. Zur Generierung der Testsysteme der beiden seltenen Erkrankungen CF und PCD wurden Epithelzellen der betroffenen Patienten zunächst mittels nicht-invasiver Raman-Spektroskopie auf einen potentiellen Biomarker untersucht, welcher Einsatz in der Diagnostik der beiden Krankheiten finden könnte. Es konnte jedoch weder für die CF noch für die PCD ein Biomarker aufgedeckt werden. Jedoch zeigten PCD-Zellen eine geringe Auftrennung gegenüber nicht-PCD Zellen. Anschließend wurden 3D-Atemwegstestsysteme basierend auf Patientenzellen aufgebaut. Der Phänotyp der CF-Modelle wurde mittels immunhistologischer Färbung und der Analyse des gestörten mukoziliären Transports verifiziert. Strukturelle ziliäre Defekte konnten durch die ultrastrukturelle Analyse von Zilienquerschnitten in drei donorspezifischen PCD-Modellen identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die ziliäre Funktionalität mit Hilfe der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, eine neue Methode zur vollständigen Charakterisierung von 3D-Atemwegstestsystemen zu etablieren, die die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass mit Hilfe des Tissue Engineering ein personalisiertes Krankheitsmodell für die PCD auf Segmenten eines dezellularisierten porzinen Jejunums generiert werden kann, das zukünftig ein Testsystem für potentielle Therapeutika darstellen kann.
N2  - Cystic fibrosis (CF) and primary ciliary dyskinesia (PCD) are two rare diseases which,among others, impair the mucociliary transport. CF is one of the most common in-herited metabolic diseases with patients suffering from a defect in theCystic FibrosisTransmembrane Conductor Regulator(CFTR) gene, which is characterized by the pro-duction of highly viscous secretions in mucin-producing organs such as the gastrointestinaltract and lungs. Patients suffering from PCD have defects in currently approximately 38known and PCD-associated genes resulting in structural defects of the ciliary appara-tus and thus in dysfunctional cilia. Since neither CF nor PCD have any chance of beingcured so far, the main focus is on alleviating the symptoms. The basic goal is the long-term preservation of lung function and the prevention of microbial infections. Previousmodel systems for exploring possible therapeutic options have been animal models thatcan never completely represent the human phenotype due to species diversity. Humanintestinal organoid cultures are considered as a promising test system for cystic fibro-sis. However, since respiratory symptoms are mainly responsible for patient mortality,CF respiratory models provide better test systems for future therapeutics. Respiratoryorganoid cultures have been used to study CFTR functionality, but do not completelyrepresent thein vivosituation. In order to develop new therapeutic strategies, patient-specific 3Din vitrotest systems for the human respiratory tract expressing functionalkinocilia are required, which can be used in particular with regard to personalized medi-cine.In the present thesis, a new method for obtaining cells from nasal mucosal brush biop-sies was established, that guarantees a standardised supply of human primary materi-al. In order to generate a disease-specific cell line, such as a PCD cell line, using theCRISPR/Cas9 system, a respiratory cell line that fully represents thein vivosituation isrequired. Hence, four different respiratory epithelial cell lines (HBEC3-KT, Calu-3, VA10and Cl-huAEC) were investigated with regard to their mucociliary phenotype, wherebyonly the cell line HBEC3-KT differentiated into ciliated cells. However, these showed ki-nocilia only on approx. 5 % of the model’s surface, thus the human respiratory mucosacould not be completely modelled and HBEC3-KT cell line is no suitable cell line for geneediting experiments.Tissue engineering made it possible to build 3Din vitrotest systems based on two differentmatrices, the biological SIS (small intestine submucosa) and synthetic PET (polyethyleneterephthalate) membranes. 3D airway test systems were generated using human primarynasal and tracheobronchial epithelial cells. In addition to histological investigations and the characterization of specific markers of the respiratory system by immunofluorescence,the ultrastructure of the models was analyzed with a special focus on ciliary structures.In order to gain insight into the ciliary functionality and thus to achieve a highin vivocorrelation, the method of high-speed video microscopy was established within the scopeof this work at the Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, which allowsthe analysis of ciliary beat frequency as well as mucociliary transport. The influence ofisotonic saline solution and salbutamol, aβ2-adrenergic agonist mainly used as broncho-dilator in asthma patients, on ciliary beat frequency was also analyzed. It could be shownthat both substances increased the ciliary beat of the primary respiratory mucosa models.In order to generate test systems for the two rare diseases CF and PCD, epithelial cellsof the affected patients were first examined by non-invasive Raman spectroscopy for apotential biomarker that could be used in diagnostic approaches. However, no biomarkerfor CF or PCD could be detected, with PCD cells showing a low separation to non-PCDcells. Subsequently, 3D test systems based on patient cells were developed. The phenotypeof the CF models was verified by immunohistological staining and analysis of impairedmucociliary transport. Ultrastructural ciliary defects could be identified by ultrastructuralanalysis of cilia cross sections in three donor-specific PCD models. Additionally, ciliaryfunctionality could not be detected using high speed video microscopy analysis.In summary, this work succeeded in establishing a new method for the complete characte-rization of 3D airway test systems, which allows the analysis of ciliary beating frequencyand mucociliary transport. It has been shown for the first time that tissue engineering canbe used to generate a personalized disease model for PCD using a decellularized poricinejejunum as a scaffold. Both, PCD and CF disease models could in future be regarded astest systems for potential therapeutics.
KW  - In-vitro-Kultur
KW  - Tissue Engineering
KW  - Gewebekultur
KW  - Individualisierte Medizin
KW  - Respiratorisches System
KW  - Primäre Ziliendyskinesie
KW  - airways
KW  - primary ciliary dyskinesia
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200178
ER  - 
TY  - THES
A1  - Aydinli, Muharrem
T1  - Software unterstützte Analyse von regulatorischen Elementen in Promotoren mittels AIModules
T1  - Software backed Analysis of regulatory Elements of Promoters with AIModules
N2  - Die Regulation der Genexpression steht am Anfang vieler zellbiologischer Prozesse wie beispielsweise dem Zellwachstum oder der Differenzierung. Gene werden an Promotoren transkribiert, wobei ein Promotor selbst aus vielen logischen Einheiten aufgebaut ist, den Transkriptionsfaktorbindestellen (TFBSs). Diese können sehr nah beieinander liegen, aber auch weit entfernt voneinander sein. Sie werden spezifisch von Transkriptionsfaktoren (TFs) gebunden, die die Transkritptionsrate z.B. verstärken (Enhancer) oder schwächen (Silencer) können. Zwei oder mehr dieser TFBSs mit bestimmtem Abstand werden als "Module" zusammengefasst, die über Spezies hinweg konserviert sein können. Typischerweise findet man Module in Zellen mit einem Zellkern. Spezies mit gemeinsamen Modulen können ein Hinweis auf die gemeinsame phylogenetische Abstammung darstellen, aber auch gemeinsame Funktionsmechanismen von TFs über Gene hinweg aufdecken. Heutzutage sind verschiedene Anwendungen verfügbar, mit denen nach TFBSs in DNA gesucht werden kann. Zum Zeitpunkt des Verfassens dieser Arbeit sind aber nur zwei kommerzielle Produkte bekannt, die nicht nur TFBSs, sondern auch Module erkennen. Deshalb stellen wir hier die freie und quelloffene Lösung "AIModules" vor, die diese Lücke füllt und einen Webservice zur Verfügung stellt, der es erlaubt nach TFBSs sowie nach Modulen auf DNA- und auf RNA-Abschnitten zu suchen. Für die Motivesuche werden entweder Matrizen aus der Jaspar Datenbank oder Matrizen vom Anwender verwendet. Darüberhinaus zeigen wir, dass unser Tool für die TF Suche nur Sekunden benötigt, wohingegen conTraV3 mindestens eine Stunde für dieselbe Analyse braucht. Zusätzlich kann der Anwender bei unserem Tool den Grad der Konserviertheit für TFs mit angeben und wir zeigen, dass wir mit unserer Lösung, die die Jaspar Datenbank heranzieht, mehr Module finden, als ein kommerziell verfügbares Produkt. Weiterhin kann mit unserer Lösung auch auf RNA-Sequenzen nach regulatorischen Motiven gesucht werden, wenn der Anwender die dafür nötigen Matrizen liefert. Wir zeigen dies am Beispiel von Polyadenylierungsstellen. Zusammenfassend stellen wir ein Werkzeug vor, das erstens frei und quelloffen ist und zweitens entweder auf Servern veröffentlicht werden kann oder On-Site auf einem Notebook läuft. Unser Tool erlaubt es Promotoren zu analysieren und nach konservierten Modulen sowie TFBSs in Genfamilien sowie nach regulatorischen Elementen in mRNA wie z.B. Polyadenylierungsstellen oder andere regulatorische Elemente wie beispielsweise Enhancern oder Silencern in genomischer DNA zu suchen.
N2  - Regulation of gene expression is at the root of many processes in cellular biology such as cell growth and differentiation. Promotors are the starting points for the transcription of a gene.
	The promotor itself consists of transcription factor binding sites (TFBSs) which can be closely located or vastly apart. They are recognized and bound by transcription factors (TFs) which themselves can e.g. enhance or silence the transcribing process by the RNA polymerases. Two or more of those transcription factor binding sites within a certain range are called a "module". Typically, those are found in cells with a nucleus and they may be conserved throughout species. The knowledge of modules may indicate a phylogenetic relationship among species but may also provide insight into the concerted actions of TFs on different genes. Currently there are a number of tools available that can enable a user to find TFBSs on DNA. But at the time of assembling this thesis, there are only two commercial software products available, that can not only detect TFs but also modules. Therefore, we present a free and open source solution that fills this gap by providing a web service that searches for TFBSs and modules on DNA as well as RNA stretches, called "AIModules". For that, matrices from the Jaspar database or user input matrices are used for motif discovery. Additionally, we show that our tool does TF analysis in seconds, whereas tools like conTraV3 took at least an hour. Furthermore, for the module search the user can specify  the degree of conservation of the TFs. We show that with our solution using the JASPAR database we find more modules than a commercially available tool. Moreover, with our application RNA stretches can also be searched for regulatory motifs if suitable matrices are provided. We illustrate this for polyadenylation sites. Thus, our solution is free and open source, and can be deployed on servers as well as provided on-site on a notebook. We provide a tool to analyze promotors and search for conserved modules as well as common TFBSs in gene families, search for regulatory elements in mRNA such as polyadenylation sites or other regulatory elements such as enhancers or silencers in genomic DNA.
KW  - Genregulation
KW  - Promotor <Genetik>
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - Modulsuche
KW  - RNA Motivsuche
KW  - Modul
KW  - Module search
KW  - RNA motiv serach
KW  - module search
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248025
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kessie, David Komla
T1  - Characterisation of Bordetella pertussis virulence mechanisms using engineered human airway tissue models
T1  - Charakterisierung der Virulenzmechanismen von Bordetella pertussis mit humanen Gewebemodellen der Atemwege
N2  - Pertussis is a highly contagious acute respiratory disease of humans which is mainly caused by the gram-negative obligate human pathogen Bordetella pertussis. Despite the availability and extensive use of vaccines, the disease persists and has shown periodic re-emergence resulting in an estimated 640,000 deaths worldwide in 2014. The pathogen expresses various virulence factors that enable it to modulate the host immune response, allowing it to colonise the ciliated airway mucosa. Many of these factors also directly interfere with host signal transduction systems, causing damage to the ciliated airway mucosa and increase mucous production. Of the many virulence factors of B. pertussis, only the tracheal cytotoxin (TCT) is able to recapitulate the pathophysiology of ciliated cell extrusion and blebbing in animal models and in human nasal biopsies. Furthermore, due to the lack of appropriate human models and donor materials, the role of bacterial virulence factors has been extrapolated from studies using animal models infected with either B. pertussis or with the closely related species B. bronchiseptica which naturally causes respiratory infections in these animals and produces many similar virulence factors. Thus, in the present work, in vitro airway mucosa models developed by co-culturing human airway epithelia cells and fibroblasts from the conduction zone of the respiratory tract on a decellularized porcine small intestine submucosa scaffold (SISser®) were used, since these models have a high correlation to native human conducting zone respiratory epithelia. The major aim was to use the engineered airway mucosa models to elucidate the contribution of B. pertussis TCT in the pathophysiology of the disease as well as the virulence mechanism of B. pertussis in general. TCT and lipopolysaccharide (LPS) either alone or in combination were observed to induce epithelial cell blebbing and necrosis in the in vitro airway mucosa model. Additionally, the toxins induced viscous hyper-mucous secretion and significantly disrupted barrier properties of the in vitro airway mucosa models. This work also sought to assess the invasion and intracellular survival of B. pertussis in the polarised epithelia, which has been critically discussed for many years in the literature. Infection of the models with B. pertussis showed that the bacteria can adhere to the models and invade the epithelial cells as early as 6 hours post inoculation. Invasion and intracellular survival assays indicated the bacteria could invade and persist intracellularly in the epithelial cells for up to 3 days. Due to the novelty of the in vitro airway mucosa models, this work also intended to establish a method for isolating individual cells for scRNA-seq after infection with B. pertussis. Cold dissociation with Bacillus licheniformis subtilisin A was found to be capable of dissociating the cells without inducing a strong fragmentation, a problem which occurs when collagenase and trypsin/EDTA are used. In summary, the present work showed that TCT acts possibly in conjunction with LPS to disrupt the human airway mucosa much like previously shown in the hamster tracheal ring models and thus appears to play an important role during the natural B. pertussis infection. Furthermore, we established a method for infecting and isolating infected cells from the airway mucosa models in order to further investigate the effect of B. pertussis infection on the different cell populations in the airway by single cell analytics in the future.
N2  - Pertussis ist eine hoch ansteckende akute Atemwegserkrankung des Menschen, die durch das gramnegative obligat humanpathogene Bakterium Bordetella pertussis verursacht wird. Obwohl seit langer Zeit effektive Impfstoffe verfügbar sind und weltweit eingesetzt werden, stellt die Krankheit nach wie vor ein großes Problem dar und tritt seit einiger Zeit auch in Ländern mit guten Impfraten wieder vermehrt auf. Allein in den letzten 10 Jahren wurden weltweit etwa 24 Millionen Neuinfektionen mit 640,000 Todesfällen pro Jahr gezählt. Die Bakterien exprimieren verschiedene Virulenzfaktoren, die es ihnen ermöglichen, die Immunantwort des Wirts zu modulieren, wodurch sie die Schleimhaut der oberen Atemwege besiedeln können. Viele dieser Faktoren stören auch direkt die Signaltransduktionssysteme des Zellen der oberen Atemwege, was zu einer Schädigung des Flimmerepithels der Atemwege und zu einer starken Erhöhung der Schleimproduktion führt. Von den vielen bekannten Virulenzfaktoren von B. pertussis kann soweit bekannt nur das Tracheale Cytotoxin (TCT) die typische Pathophysiologie des Flimmerepithels verursachen, die durch massive Gewebszerstörung gekennzeichnet ist und z.B. das Herauslösen von Epithelzellen aus der Epithelschicht oder die Ausbildung von bläschenförmigen Epithelzellen beinhaltet. Aufgrund des Mangels an geeigneten menschlichen Modellsystemen bzw. an Spendermaterialien wurden die Virulenzeigenschaften des Erregers entweder mit Hilfe von einfachen Zellkultursystemen oder in Tiermodellen untersucht, die keine natürlichen Wirte für B. pertussis darstellen. Alternativ hierzu wurden auch Daten, die mit dem eng verwandten tierpathogenen Bakterium B. bronchiseptica, das viele aus B. pertussis bekannte Virulenzfaktoren produziert, in entsprechenden Tiermodellen erhoben wurden, genutzt, um auf die Virulenzeigenschaften von B. pertussis zu schließen. Die vorliegende Arbeit verwendet In-vitro-Atemwegsschleimhautmodelle, die durch Co-Kultivierung von menschlichen Atemwegsepithelzellen und Fibroblasten auf einem dezellularisierten Schweine-Dünndarm-Submukosa-Gerüst (SISser®) entwickelt wurden. Die in-vitro-Atemwegsschleimhautmodelle weisen eine hohe Korrelation mit nativen menschlichen Epithelien der oberen Atemwege auf. Mithilfe dieser neuartigen Atemwegsschleimhautmodelle sollte der Beitrag von B. pertussis TCT zur Pathophysiologie der Krankheit und die Bedeutung von TCT als relevanter Virulenzfaktor aufgeklärt werden. Es wurde beobachtet, dass TCT und das bakterielle Lipopolysaccharid (LPS) entweder alleine oder in Kombination die Bildung von Epithelzellbläschen und Nekrose in diesen in-vitro-Atemwegsschleimhautmodellen induzieren. Zusätzlich induzierten diese Toxine eine viskose Hyperschleimsekretion und störten die Barriereeigenschaften der in-vitro-Atemwegsschleimhautmodelle signifikant. Zudem wurde in dieser Arbeit versucht, die Invasion und das intrazelluläre Überleben von B. pertussis in den polarisierten Epithelien zu bewerten, das in der einschlägigen Fachliteratur kritisch diskutiert wird. Die Infektion der Modelle mit B. pertussis zeigte, dass die Bakterien bereits 6 Stunden nach der Inokulation an den Modellen adhärieren und in diese eindringen können. Invasions- und intrazelluläre Überlebenstests zeigten, dass die Bakterien bis zu 3 Tage intrazellulär in die Epithelzellen überleben können. Aufgrund der Neuheit der in dieser Arbeit entwickelten in-vitro-Atemwegsschleimhautmodelle sollte auch eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen für scRNA-seq Analysen nach Infektion mit B. pertussis etabliert werden. Dabei wurde festgestellt, dass die Inkubation der Modelle mit Subtilisin A von Bacillus licheniformis in der Kälte eine sehr gute Methode darstellt, um die Zellen zu dissoziieren, ohne eine starke Fragmentierung zu induzieren, wie sie unter Verwendung von Kollagenase und Trypsin / EDTA auftritt. Zusammenfassend wird in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass TCT gemeinsam mit LPS eine extrem destruktive Wirkung auf die menschliche Atemwegsschleimhaut besitzt, die der früher gezeigten Wirkung in Tiermodellen stark ähnelt. TCT sollte deshalb tatsächlich als ein wichtiger Virulenzfaktor von B. pertussis eingeschätzt werden. Darüber hinaus wurden Methoden zur Infektion und Isolierung von infizierten Zellen aus den Atemwegsschleimhautmodellen entwickelt, um künftig die Auswirkung einer B. pertussis Infektion auf die verschiedenen Zellpopulationen in den Atemwegen durch Einzelzellanalytik noch besser erforschen zu können.
KW  - Tissue engineering
KW  - Pertussis
KW  - Airway epithelia
KW  - Bordetella
KW  - tracheal cytotoxin
KW  - 3D models
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235717
ER  -