TY - THES A1 - Kristen, Alexander Kurt T1 - Effekt von β-Hydroxybutyrat und Acetoacetat auf die Proliferationsaktivität und die Strahlensensibilität von Kolonkarzinomzellen mit unterschiedlichem p53-Status T1 - Effect of β-hydroxybutyrate and acetoacetate on proliferation activity and radio sensitivity on colon carcinoma cell lines with different p53-status N2 - Die ketogene Diät besitzt ein breites mögliches therapeutisches Spektrum und aufgrund der induzierten Ketonkörper in der Theorie auch antiproliferative sowie antiinflammatorische Wirkmechanismen. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung der Ketonkörper β-Hydroxybutyrat und Acetoacetat auf Kolonkarzinomzellen in vitro zu untersuchen. Hierfür wurden Proliferation, Koloniebildung, Gen- und Proteinexpression von drei verschiedenen Zelllinien analysiert. Um einen möglichen Zusammenhang der Ketonkörperwirkung und dem p53-Status zu prüfen, wurden Zelllinien mit unterschiedlichem p53-Status eingesetzt. Etwaige Effekte der Ketonkörper auf die Strahlensensibilität der Zellen wurden ebenfalls untersucht. Um möglichst tumorphysiologische Bedingungen herzustellen, wurden die Versuche nicht nur unter normoxischen Bedingungen (21 % Sauerstoff), sondern parallel unter 1,5 % Sauerstoffkonzentration durchgeführt. In den Tests zur Proteinexpression konnte festgestellt werden, dass die Expression von p53 nicht durch die Zugabe von Ketonkörpern beeinflusst wird. Die Proteinexpression von p21 und p27 war unabhängig von der Expression von p53. Die Analyse der Genexpression beweist, dass die untersuchten Zelllinien sowohl die Monocarboxylattransporter (MCTs) exprimieren, über welche die Ketonkörper aufgenommen werden können, als auch die G-Protein- gekoppelten Rezeptoren, über welche die Ketonkörper auf die Signalketten wirken können. Ein hemmender Einfluss der Ketonkörper auf die Zellproliferation ließ sich im WST-8-Test für die Zelllinie HT-29 unter Zugabe von 3-OHB in Kombination mit LiAcAc nachweisen. Nach Strahlenbehandlung stellten sich die Zelllinien CaCo-2 und HT-29 bei Betrachtung der Kurzzeitproliferation weitgehend strahlenresistent dar. Bei Untersuchung der Langzeitproliferation mittels Koloniebildungstest zeigte sich jedoch auch hier eine zytotoxische Wirkung der ionisierenden Strahlung. Für die Zelllinie CaCo2 konnte zudem durch Zugabe von LiAcAc allein und in Kombination mit 3-OHB eine signifikante Reduktion der Koloniebildung nach Bestrahlung mit 2 Gy festgestellt werden. Zusammenfassend weisen die durchgeführten Versuche darauf hin, dass die Ketonkörper unabhängig vom p53-Status in alle untersuchten Kolonkarzinomzellen aufgenommen und verwertet werden können. Ein allgemein synergistischer Effekt zwischen ionisierender Strahlung und den Ketonkörpern konnte nicht eindeutig nachgewiesen werden. Die Zugabe der Ketonkörper führte weder zu einer Proliferationsanregung noch zur Reduktion der Strahlensensitivität, so dass hier von einer klinischen Unbedenklichkeit ausgegangen werden kann. Fortführende klinische Studien sind notwendig, um die in vivo Effekte zu untersuchen. N2 - The ketogenic diet has a wide possible therapeutic spectrum and due to the ketone bodies, it also has possible antiproliferative and anti-inflammatory effects. The aim of this work was to investigate the effect of the ketone bodies β-hydroxybutyrate and acetoacetate on colon carcinoma cells in vitro. For this purpose, proliferation, colony formation, gene expression and protein expression of three different cell lines were analyzed. In order to investigate a possible correlation between the ketone body effect and p53 status, cell lines with different p53 status were used. Effects of the ketone bodies on radio sensitivity were also investigated. In order to create tumor-physiological conditions, the experiments were not only performed at normoxic (21% oxygen), but also at hypoxic conditions (1.5 % oxygen). In the protein expression assays, it was found that the expression of p53 was not affected by the addition of ketone bodies. The protein expression of p21 and p27 was independent of the expression of p53. The analysis of gene expression proves that the cell lines express both the monocarboxylate transporters (MCTs) through which ketone bodies can be taken up into the cells, as well as the G protein-coupled receptors through which the ketone bodies can act on the signaling chains. An inhibitory effect of the ketone bodies on cell proliferation could be detected in the WST-8 assay for the HT-29 cell line with the addition of 3-OHB in combination with LiAcAc. The cell lines CaCo-2 and HT-29 were largely resistant to radiation in terms of short-time proliferation. In the Colony-Forming-Assay, however, we also observed a cytotoxic effect of ionizing radiation on those cell lines. For the cell line CaCo2 the addition of LiAcAc alone and in combination with 3-OHB resulted in a significant reduction of colonies after irradiation with 2 Gy. In summary, the experiments performed indicate that the ketone bodies can be taken up and utilized in all colon carcinoma cells examined, irrespective of the p53 status. A general synergistic effect between irradiation and ketone bodies could not be clearly demonstrated. The addition of the ketone bodies did not lead to either a stimulation of proliferation or reduction of radio sensitivity, so that clinical safety can be assumed. Further clinical studies are necessary to investigate the in vivo effects. KW - Ketonkörper KW - Acetessigester KW - Hydroxybutyrat <3-> KW - Colonkrebs KW - Protein p53 KW - Ketonkörper KW - Beta-Hydroxybutyrat KW - Acetoacetat KW - Kolonkarzinom KW - HCT-116 KW - HT-29 KW - CaCo-2 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-327068 ER - TY - THES A1 - Löffler, Miriam T1 - Bestimmung der optimalen Positionierung eines Kirschner-Drahtes zur temporären Transfixation des AC-Gelenks bei der operativen Behandlung der AC-Sprengung T1 - Determination of the optimal positioning of a Kirschner wire for temporary transfixation of the AC joint in the surgical treatment of AC joint dislocation N2 - Die AC-Sprengung ist eine weit verbreitete Verletzung des Schultergürtels und am häufigsten auf einen Sportunfall vorwiegend junger Männer zurückzuführen. Die optimale Therapie wird kontrovers diskutiert, keine der rund 150 OP-Methoden hat sich bisher als den anderen überlegen erwiesen. Allerdings gelten Operationen, bei denen das AC-Gelenk temporär durch eine intramedulläre Schienung per Kirschner-Draht ruhiggestellt wird, als sehr zuverlässig. Sie sind aufgrund einer sehr variablen Anatomie jedoch auch für erfahrene Operateure technisch anspruchsvoll. Ziel dieser Arbeit ist es daher, mithilfe der gewonnenen Kenntnisse zur idealen Lage eines K-Drahtes das operative Vorgehen zur temporären Transfixation des ACGs künftig durch eine gezieltere Platzierung zu erleichtern, somit die Operationsmethode zu optimieren und folglich das Outcome zu verbessern. Für diese Arbeit wurden bereits vorliegende anonymisierte computertomographische Daten gesunder AC-Gelenke nach ihrer physiologischen Anatomie sowie der Lage eines virtuell ideal platzierten transartikulären K-Drahtes ausgewertet. Hierfür wurden CT-Daten von insgesamt 66 Schultern herangezogen, der Epidemiologie der AC-Sprengung entsprechend waren hiervon 59 Patienten und 7 Patientinnen zuzuordnen. Die erhobenen Daten zeigen, dass die Lage des Eintrittspunktes idealerweise durch den orthogonalen Abstand des Drahtes zur Acromionspitze definiert wird und durchschnittlich 12,89 mm beträgt. Er ist primär abhängig von der Körpergröße und kann daher präoperativ anhand einer Regressionsgeraden individuell für jeden Patienten bestimmt werden. Der Drahtverlauf sollte primär durch Zielen auf den markierten Austrittspunkt definiert werden. Das Abschätzen der Bohrrichtung anhand von Winkeln erscheint nahezu unmöglich. Die Drahtlänge beläuft sich im Mittel auf 58,06 mm. Je kleiner der AC-Winkel ist, desto steiler und auch kürzer zeigt sich der Drahtverlauf. Die Lage des Austrittspunktes korreliert ebenfalls signifikant mit dem AC-Winkel und kann daher nach erfolgter Winkelmessung im Röntgenbild anhand einer Regressionsgeraden abgelesen werden. Der mithilfe der Daten ermittelte Austrittspunkt eines ideal platzierten K-Drahtes befindet sich durchschnittlich auf Höhe des lateralen Claviculawinkels und somit auf Höhe der CC-Bänder. Bei der nur geringen Fallzahl weiblicher Patienten besteht eine noch eingeschränkte Aussagekraft bezüglich geschlechtsabhängiger Lageunterschiede. Nach bisher vorliegenden Daten kann eine geschlechtsunabhängige OP-Planung erfolgen. Relevante ACG-Typ abhängige Lageunterschiede konnten ebenfalls nicht festgestellt werden, eine präoperative Bestimmung des anatomischen ACG-Typs ist daher nicht erforderlich. Die erhobenen Daten deuten darauf hin, dass die ideale Drahtplatzierung unter Einhaltung aller Drahtlagekriterien nicht immer möglich ist. Betroffen sind kleine Patienten (Grenzwert: 158,6 cm Körpergröße), bei denen der Mindestabstand zur Acromionspitze nicht sichergestellt werden kann. Zudem besteht bei Patienten mit einem kleinen AC-Winkel (Grenzwert: 156,2°) das Risiko, die Mindestdrahtlänge innerhalb der Clavicula zu unterschreiten. In diesen Fällen muss entweder dezent von der idealen Drahtlage abgewichen oder auf ein alternatives OP-Verfahren ausgewichen werden. N2 - The dislocation of the acromioclavicular joint is a common shoulder injury which mainly affects young men due to sports injuries. The therapy is highly controversial since none of the 150 different surgery methods seems to achieve significantly better results than the others. Nevertheless, surgery aiming at stabilising the AC joint by using an intramedullary Kirschner wire has proved to be a reliable method. Due to the very variable anatomy of the AC joint, placing the wire is challenging even for very experienced surgeons. Therefore, the aim of this study is to optimise the placement of the wire by defining the ideal location. This approach optimises the outcome of the AC joint stabilisation using a K-wire. For this study we used available anonymised computer tomographic data of intact AC joints and examined them with regard to physiological anatomy and the location of a virtually ideally placed K-wire. In total 66 CTs were examined belonging to 59 male and 7 female patients, the proportion representing the epidemiology of the injury. The data collected show that the entry point of the average K-wire is ideally located 12,89 mm dorsal of the acromion apex. It was shown to depend on the patient’s height and therefore can be determined individually by using a regression line. The placement of the wire should be determined by aiming at the exit point instead of trying to orientate towards angles which seems to be nearly impossible. The average length of the wire was 58,06 mm. The smaller the AC angle the shorter was the resulting length of the wire. The position of the exit point also correlates significantly with the AC angle and can be read off from a regression line after the angle has been measured in the X-ray image. The average ideal K-wire left the clavicle at the hight of the lateral clavicle angle where the insertion of the CC ligaments is located. As only few data of female patients were included, the findings concerning differences between the location of the wire for male and female patients are of limited validity only. So far it seems to be reasonable to place the wire without paying particular respect to peculiarities of gender. In addition it is obsolete to determine the anatomical AC joint type preoperatively because of a lack of differing wire locations. Data show that there are two types of patients where placing a wire in the perfect location might not always be successful. These are patients smaller than 158,6 cm because in this case the minimum distance between the wire and the acromion apex will most likely not be met. Also, patients with an AC angle lower than 156,2° may suffer the risk of too short wire sections within the clavicle. In these two cases it is recommended to either slightly diverge from the ideal wire location or to fall back on a different type of surgery without a K-wire. KW - Akromioklavikulargelenk KW - Acromioclavicular Joint KW - Schultereckgelenk KW - Kirschner-Draht KW - Acromioclaviculargelenkssprengung KW - Acromioclavicular joint dislocation KW - Schultereckgelenkssprengung KW - AC-Stabilisierung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328742 ER - TY - THES A1 - Janz, Anna T1 - Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in inherited cardiomyopathies: Generation and characterization of an iPSC-derived cardiomyocyte model system of dilated cardiomyopathy with ataxia (DCMA) T1 - Humane induzierte pluripotente Stammzellen in vererbbaren Kardiomyopathien: Generierung und Charakterisierung eines auf Stammzellen basierenden Herzmuskelmodellsystems der Dilatativen Kardiomyopathie mit Ataxie (DCMA) N2 - The emergence of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) and the rise of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) gene editing technology innovated the research platform for scientists based on living human pluripotent cells. The revolutionary combination of both Nobel Prize-honored techniques enables direct disease modeling especially for research focused on genetic diseases. To allow the study on mutation-associated pathomechanisms, we established robust human in vitro systems of three inherited cardiomyopathies: arrhythmogenic cardiomyopathy (ACM), dilated cardiomyopathy with juvenile cataract (DCMJC) and dilated cardiomyopathy with ataxia (DCMA). Sendai virus vectors encoding OCT3/4, SOX2, KLF4, and c-MYC were used to reprogram human healthy control or mutation-bearing dermal fibroblasts from patients to an embryonic state thereby allowing the robust and efficient generation of in total five transgene-free iPSC lines. The nucleofection-mediated CRISPR/Cas9 plasmid delivery in healthy control iPSCs enabled precise and efficient genome editing by mutating the respective disease genes to create isogenic mutant control iPSCs. Here, a PKP2 knock-out and a DSG2 knock-out iPSC line were established to serve as a model of ACM. Moreover, a DNAJC19 C-terminal truncated variant (DNAJC19tv) was established to mimic a splice acceptor site mutation in DNAJC19 of two patients with the potential of recapitulating DCMA-associated phenotypes. In total eight self-generated iPSC lines were assessed matching internationally defined quality control criteria. The cells retained their ability to differentiate into cells of all three germ layers in vitro and maintained a stable karyotype. All iPSC lines exhibited a typical stem cell-like morphology as well as expression of characteristic pluripotency markers with high population purities, thus validating the further usage of all iPSC lines in in vitro systems of ACM, DCMA and DCMJC. Furthermore, cardiac-specific disease mechanisms underlying DCMA were investigated using in vitro generated iPSC-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs). DCMA is an autosomal recessive disorder characterized by life threatening early onset cardiomyopathy associated with a metabolic syndrome. Causal mutations were identified in the DNAJC19 gene encoding an inner mitochondrial membrane (IMM) protein with a presumed function in mitochondrial biogenesis and cardiolipin (CL) remodeling. In total, two DCMA patient-derived iPSC lines (DCMAP1, DCMAP2) of siblings with discordant cardiac phenotypes, a third isogenic mutant control iPSC line (DNAJC19tv) as well as two control lines (NC6M and NC47F) were directed towards the cardiovascular lineage upon response to extracellular specification cues. The monolayer cardiac differentiation approach was successfully adapted for all five iPSC lines and optimized towards ventricular subtype identity, higher population purities and enhanced maturity states to fulfill all DCMA-specific requirements prior to phenotypic investigations. To provide a solid basis for the study of DCMA, the combination of lactate-based metabolic enrichment, magnetic-activated cell sorting, mattress-based cultivation and prolonged cultivation time was performed in an approach-dependent manner. The application of the designated strategies was sufficient to ensure adult-like characteristics, which included at least 60-day-old iPSC-CMs. Therefore, the novel human DCMA platform was established to enable the study of the pathogenesis underlying DCMA with respect to structural, morphological and functional changes. The disease-associated protein, DNAJC19, is constituent of the TIM23 import machinery and can directly interact with PHB2, a component of the membrane bound hetero-oligomeric prohibitin ring complexes that are crucial for phospholipid and protein clustering in the IMM. DNAJC19 mutations were predicted to cause a loss of the DnaJ interaction domain, which was confirmed by loss of full-length DNAJC19 protein in all mutant cell lines. The subcellular investigation of DNAJC19 demonstrated a nuclear restriction in mutant iPSC-CMs. The loss of DNAJC19 co-localization with mitochondrial structures was accompanied by enhanced fragmentation, an overall reduction of mitochondrial mass and smaller cardiomyocytes. Ultrastructural analysis yielded decreased mitochondria sizes and abnormal cristae providing a link to defects in mitochondrial biogenesis and CL remodeling. Preliminary data on CL profiles revealed longer acyl chains and a more unsaturated acyl chain composition highlighting abnormities in the phospholipid maturation in DCMA. However, the assessment of mitochondrial function in iPSCs and dermal fibroblasts revealed an overall higher oxygen consumption that was even more enhanced in iPSC-CMs when comparing all three mutants to healthy controls. Excess oxygen consumption rates indicated a higher electron transport chain (ETC) activity to meet cellular ATP demands that probably result from proton leakage or the decoupling of the ETC complexes provoked by abnormal CL embedding in the IMM. Moreover, in particular iPSC-CMs presented increased extracellular acidification rates that indicated a shift towards the utilization of other substrates than fatty acids, such as glucose, pyruvate or glutamine. The examination of metabolic features via double radioactive tracer uptakes (18F-FDG, 125I-BMIPP) displayed significantly decreased fatty acid uptake in all mutants that was accompanied by increased glucose uptake in one patient cell line only, underlining a highly dynamic preference of substrates between mutant iPSC-CMs. To connect molecular changes directly to physiological processes, insights on calcium kinetics, contractility and arrhythmic potential were assessed and unraveled significantly increased beating frequencies, elevated diastolic calcium concentrations and a shared trend towards reduced cell shortenings in all mutant cell lines basally and upon isoproterenol stimulation. Extended speed of recovery was seen in all mutant iPSC-CMs but most striking in one patient-derived iPSC-CM model, that additionally showed significantly prolonged relaxation times. The investigations of calcium transient shapes pointed towards enhanced arrhythmic features in mutant cells comprised by both the occurrence of DADs/EADs and fibrillation-like events with discordant preferences. Taken together, new insights into a novel in vitro model system of DCMA were gained to study a genetically determined cardiomyopathy in a patient-specific manner upon incorporation of an isogenic mutant control. Based on our results, we suggest that loss of full-length DNAJC19 impedes PHB2-complex stabilization within the IMM, thus hindering PHB-rings from building IMM-specific phospholipid clusters. These clusters are essential to enable normal CL remodeling during cristae morphogenesis. Disturbed cristae and mitochondrial fragmentation were observed and refer to an essential role of DNAJC19 in mitochondrial morphogenesis and biogenesis. Alterations in mitochondrial morphology are generally linked to reduced ATP yields and aberrant reactive oxygen species production thereby having fundamental downstream effects on the cardiomyocytes` functionality. DCMA-associated cellular dysfunctions were in particular manifested in excess oxygen consumption, altered substrate utilization and abnormal calcium kinetics. The summarized data highlight the usage of human iPSC-derived CMs as a powerful tool to recapitulate DCMA-associated phenotypes that offers an unique potential to identify therapeutic strategies in order to reverse the pathological process and to pave the way towards clinical applications for a personalized therapy of DCMA in the future. N2 - Die Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) und die biotechnologische Anwendung des „clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9“ (CRISPR/Cas9) Gen-Editierungssystems bilden eine innovative Forschungsplattform für Wissenschaftler basierend auf lebenden menschlichen pluripotenten Stammzellen. Die bahnbrechende Kombination beider nobelpreisprämierter Techniken erlaubt eine direkte Krankheitsmodellierung insbesondere für die Erforschung von genetisch bedingten Erkrankungen. Um die Untersuchung von mutationsassoziierten Pathomechanismen zu ermöglichen, etablierten wir robuste humane in vitro Systeme von drei vererbbaren Kardiomyopathien: die arrhythmogene Kardiomyopathie (AKM), die dilatative Kardiomyopathie mit juveniler Katarakt (DKMJK) und die dilatative Kardiomyopathie mit Ataxie (DKMA). Zur Generierung von transgenfreien iPS-Zellen wurden für OCT3/4, SOX2, KLF4 und c-MYC kodierende Sendai-Virus-Vektoren verwendet um humane gesunde Kontroll- oder mutationstragende dermale Fibroblasten von Patienten in einen embryonalen Zustand zu reprogrammieren. Die Verwendung der SeV-vermittelten Reprogrammierung ermöglichte uns eine effiziente und robuste Herstellung von insgesamt fünf transgen-freien iPS-Zelllinien. Zudem befähigt die Nukleofektion der CRISPR/Cas9-Plasmide in gesunden Kontroll-iPS-Zellen eine präzise und effiziente Genom-Editierung krankheitsrelevanter Gene und damit die Generierung von isogenen mutierten iPS-Zelllinien. Mit diesem Verfahren wurden eine PKP2-Knock-out- und eine DSG2-Knock-out iPSZ-Linie hergestellt, die jeweils als Modell für AKM dienen. Darüber hinaus wurde eine mit DKMA-assoziierte Spleißakzeptormutation auf genetischer Basis imitiert, um die mit dem Phänotyp zweier Patienten in Verbindung gebrachte C-terminal verkürzte DNAJC19-Variante (DNAJC19tv) auf translationaler Ebene rekapitulieren zu können. Alle acht eigens generierten iPS-Zelllinien entsprachen international definierten Qualitätskontrollkriterien. Die hergestellten iPS-Zellen behielten die Fähigkeit in vitro in Zellen der drei Keimblätter zu differenzieren und zeigten darüber hinaus einen normalen Karyotyp. Alle iPS-Zelllinien wiesen eine typische stammzellähnliche Morphologie sowie die Expression charakteristischer Pluripotenzmarker bei gleichzeitig hoher Populationsreinheit auf. Die experimentelle Qualtitätskontrolle hat somit die weitere Verwendung aller iPS-Zelllinien in in vitro Systemen von AKM, DKMA und DKMJK validiert. Die der DKMA zugrundeliegenden herzspezifischen Krankheitsmechanismen wurden zudem mithilfe von in vitro produzierten iPSZ-abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSZ-KMs) untersucht. DKMA ist eine autosomal rezessiv vererbte Erkrankung, die durch Mutationen im DNAJC19 Gen hervorgerufen wird. Das wichtigste klinische Merkmal der Patienten ist eine früh einsetzende und lebensbedrohliche dilatative Kardiomyopathie, die oftmals mit einem metabolischen Syndrom einhergeht. DNAJC19 kodiert für ein Protein der inneren mitochondrialen Membran (IMM), dessen postulierte Funktion in der mitochondrialen Biogenese und der Remodellierung von Cardiolipin liegt. Zur Modellierung der DKMA wurden zwei von DKMA-Patienten abgeleitete iPS-Zelllinien (DCMAP1, DCMAP2) eines Geschwisterpaares mit unterschiedlich ausgeprägten kardialen Phänotypen, eine dritte isogene mutierte iPS-Zelllinie (DNAJC19tv) sowie zwei gesunden Kontroll-iPS-Zelllinien (NC6M und NC47F) mithilfe extrazellulärer Spezifikationsfaktoren zur kardiovaskulären Differenzierung angeregt. Das Monolayer-Protokoll zur kardialen Differenzierung wurde erfolgreich für alle fünf iPSZ-Linien adaptiert und in Bezug auf die Anreicherung des ventrikulären Herzmuskelzellsubtyps, höhere Zellpopulationsreinheiten und adulte Reifegrade optimiert. Die Kombination der Laktat-basierten metabolischen Aufreinigung, der magnetisch-aktivierten Zellsortierung, der Anwendung einer Mattress-basierten Kultivierungsstrategie und verlängerte Kultivierungszeiten ermöglichte die Erfüllung aller DKMA-spezifischen Anforderungen. Zusammengefasst konnten insbesondere adulte Charakteristika durch die Kombination der benannten experimentellen Strategien unter Verwendung von mindestens 60 Tage kultivierten iPSZ-KMs nachgewiesen werden, um eine zuverlässige phänotypische Untersuchung der DKMA gewährleisten zu können. Die innovative humane Untersuchungsplattform wurde etabliert, um die Pathogenese der DKMA im Hinblick auf strukturelle, morphologische und funktionelle Veränderungen entschlüsseln zu können. Das mit DKMA assoziierte Protein DNAJC19 ist Bestandteil der TIM23-Importmaschinerie und besitzt zudem die Fähigkeit einer direkten Interaktion mit PHB2. PHB2 trägt zur Bildung der membrangebundenen hetero-oligomeren Prohibitin-Ringkomplexe bei, deren Hauptfunktion in der Anreicherung von Phospholipiden und Proteinen innerhalb von Clustern in der IMM liegt. Der durch DNAJC19 Mutationen vermutete hervorgerufenen Verlust der DnaJ-Interaktionsdomäne wurde durch die fehlende Expression des DNAJC19 Proteins in voller Länge in allen mutationstragenden Zellen bestätigt. Die subzelluläre Untersuchung von DNAJC19 zeigte ein auf den Kern beschränktes Expressionsmuster in mutierten iPSZ-KMs. Der Verlust der DNAJC19 Ko-Lokalisation mit mitochondrialen Strukturen ging mit einer abnormen mitochondrialen Fragmentierung, einer signifikanten Abnahme der mitochondrialen Masse und einer signifikant reduzierten Kardiomyozytengröße einher. Ultrastrukturelle Analysen ergaben zudem kleinere Mitochondrien und abnorme Cristae, die eine krankheitsrelevante Verbindung zu Defekten in der mitochondrialen Biogenese und der CL-Reifung darlegen. Vorläufige Daten zu CL-Profilen zeigten längere Acylketten und eine ungesättigtere Acylkettenzusammensetzung, was auf Anomalien in der Phospholipidmaturierung bei DKMA hinweist. Der Vergleich aller Mutanten mit gesunden Kontrollen hinsichtlich der mitochondrialen Funktion in iPS-Zellen und Hautzellen (dermale Fibroblasten), zeigte eine insgesamt höhere Sauerstoffverbrauchsrate, die in iPSZ-KMs noch stärker ausgeprägt war. Der erhöhte Sauerstoffverbrauch deutet auf eine höhere Aktivität der Elektronentransportkette hin um den zellulären Energiebedarf decken zu können. Wir vermuten einen erhöhten Sauerstoffverbrauch als Konsequenz des Protonendurchsickerns oder der Entkopplung der ETC-Komplexe, das durch eine abnorme CL-Einbettung in der IMM bedingt sein könnte. Darüber hinaus wiesen insbesondere iPSZ-KMs erhöhte extrazelluläre Säuerungsraten auf, die auf eine Verstoffwechselung anderer Substrate wie Glukose, Pyruvat oder Glutamin hinweisen, im Gegensatz zu der ansonsten bevorzugten Verstoffwechslung von Fettsäuren. Die Untersuchung der metabolischen Eigenschaften mittels der radioaktiven Tracer 18F-FDG und 125I-BMIPP zeigte eine signifikant verringerte Fettsäureaufnahme in allen Mutanten, die nur in einer Patientenzelllinie von einer erhöhten Glukoseaufnahme begleitet wurde. Diese Ergebnisse weisen auf eine DKMA-spezifische hochdynamische Präferenz der Substrate zwischen den unterschiedlichen Mutanten hin. Um den Einfluss der molekularen Veränderungen direkt mit physiologischen Prozessen in Verbindung bringen zu können, wurden Untersuchungen der Kalziumkinetik, der Kontraktilität und des arrhythmischen Potentials durchgeführt. Einzelzellmessungen ergaben eine signifikant erhöhte Kontraktionsfrequenz, erhöhte diastolische Kalziumkonzentrationen und eine Tendenz zu reduzierten Zellverkürzungen in allen mutierten Zelllinien basal und verstärkt nach Isoproterenol-Stimulation. Zudem wurden verlangsamte Erholungsgeschwindigkeiten in allen mutierten iPSZ-KMs festgestellt, das in den iPSZ-KMs des einen Patienten besonders auffällig war und mit verlängerten Relaxationszeiten einherging. Die Evaluation der Kalziumtransientenformen deutet auf verstärkte arrhythmische Merkmale in den mutierten Zellen hin, die sowohl das Auftreten von DADs/EADs als auch Fibrillations-ähnlichen Ereignissen mit gegensätzlichen Präferenzen umfasste. Insgesamt wurden unter der Verwendung patientenspezifischer iPS-Zellen und einer isogenen Mutantenkontrolle neue Einblicke in ein innovatives in vitro Modellsystem der DKMA gewonnen. Basierend auf unseren Ergebnissen vermuten wir, dass der Verlust des DNAJC19 Proteins in voller Länge die Stabilisierung von PHB-Komplexen innerhalb der IMM beeinträchtigt und damit PHB-Ringe an der Bildung von IMM-spezifischen Phospholipid-Clustern hindert. Diese Cluster sind essentiell um eine normale Cardiolipin-Reifung und dessen Funktion in der Cristae-Morphogenese gewährleisten zu können. Abnorme Cristae und fragmentierte mitochondriale Strukturen wurden beobachtet und deuten so auf eine essentielle Rolle von DNAJC19 in der mitochondrialen Morphogenese und Biogenese hin. Abnorme Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie werden in der Regel mit einer verminderten ATP-Verfügbarkeit und einer erhöhten Produktion an freien Sauerstoffradikalen assoziiert, das nachfolgend die gesamte Funktionalität der Kardiomyozyten negativ beeinflussen kann. Diese Veränderungen konnten anhand einer erhöhten Sauerstoffverbrauchsrate, unterschiedliche metabolische Eigenschaften und einer abnormalen Kalziumkinetik gemessen werden. Die zusammengefassten Daten unterstreichen die Verwendbarkeit von humanen iPSZ-KMs als ein eindrucksvolles System zur Rekapitulation von herzspezifischen Phänotypen und haben damit neue Einblicke in die Pathogenese der DKMA ermöglicht. Das Modellsystem bietet ein einzigartiges Potenzial zur Identifizierung therapeutischer Strategien, um pathologische Prozesse umkehren zu können und so den Weg für zukünftige klinische Anwendungen im Rahmen der personalisierten Therapie zu ebnen. KW - in vitro model system of inherited cardiomyopathies KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - CRISPR/Cas-Methode KW - induced pluripotent stem cells (iPSCs) KW - iPSC-derived CMs (iPSC-CMs) KW - CRISPR/Cas9 KW - dilated cardiomyopathy with ataxia (DCMA) Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240966 ER - TY - THES A1 - Winkler, Jana T1 - Einfluss von D-β-Hydroxybutyrat auf Stoffwechsel und Interaktion mit Chemo-/Strahlentherapie bei triple negativen Mamma-Karzinom Zellen T1 - The effect of D-ß-Hydroxybutyrat on metabolism and proliferation in combination with Chemotherapy / Radiation on triple negativ breast cancer N2 - Das triple negative Mamma-Karzinom stellt eine Tumorart dar, welche besonders junge Frauen betrifft und eine schlechte Prognose aufweist. Unterstützende und pro- gnoseverbessernde Therapien sind deshalb Gegenstand aktueller Forschung. Eine mögliche unterstützende Therapie stellt hierbei die ketogene Diät dar. Diese Arbeit untersuchte die Fragestellung, ob β-Hydroxybutyrat (3OHB), welches als Hauptme- tabolit unter ketogener Diät oder beim Fasten erhöht ist, Einfluss auf das Zellwachs- tum triple-negativer Brustkrebszellen ausübt. Außerdem wurde eruiert, ob 3OHB die üblichen Behandlungsformen - Chemotherapie und Strahlentherapie - positiv oder negativ beeinflusst. In vitro wurden Versuche mit drei triple-negativen Brust- krebszellreihen unter möglichst physiologischen Bedingungen durchgeführt. Hierbei konnte durch 3OHB weder ein wachstumsfördernder noch ein wachstumshemmender Effekt beobachtet werden. Genauso zeigte sich bei den Chemo- oder Strahlenthera- pieversuchen keine durch 3OHB induzierte Wechselwirkung. In vivo durchgeführte Studien über den Einfluss einer ketogenen Diät finden sich nur vereinzelt. Um be- lastbare Daten zu erhalten werden deshalb weitere Studien in Zukunft vonnöten sein. Eine ketogene Diät könnte hierbei im Rahmen eines multimodalen Therapie- konzeptes eine unterstützende Rolle spielen, wofür erste Einzelfallstudien Hinweise geben N2 - Triple-negative breast cancer is an aggressive cancer subtype affecting predominantly younger women. Owing to the worse prognosis obtained with standard therapy, alternative supportive approaches like ketogenic diet gain popular interest. Beta-hydroxybutyrate (3-OHB) is the main physiologic substrate generated during ketogenic diet. In this paper the effect of 3-OHB on metabolism, proliferation, and viability of triple negative breast cancer cells in vitro with exposure to cytotoxic chemotherapy and radiation was investigated. Different concentrations for 3-OHB, oxygen, chemotherapeutic agents and radiation doses were applied, resembling physiologic conditions within the tumor. 3-OHB did not influence cell proliferation and metabolism. Neither an inhibitory nor a growth-promoting effect for 3-OHB could be detected. The cytotoxic effects of chemotherapeutic agents as well as radiation were similar with or without the addition of 3-OHB. Given the limitations of in-vitro studies and the promising results of individual case studies, clinical trials investigating the effects of a ketogenic diet are necessary to provide further insights. KW - Ketogene Kost KW - Brustkrebs KW - Betahydroxybutyrat KW - triple negatives Mamma Karzinom Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-347044 ER - TY - THES A1 - Rainer, Johannes T1 - Vaskulartoxische Wirkung von Taxanen bei fortgeschrittenen Tumorerkrankungen T1 - Vasculartoxic effect of taxanes in advanced tumour diseases N2 - Taxane (wie Paclitaxel oder Cabazitaxel) sind bewährte Arzneimittel in den systemischen Therapieschemata vieler bösartiger Erkrankungen, einschließlich Brust- und Eierstockkrebs. Sie fördern die Stabilisierung der Mikrotubuli, was zu einem Stillstand des Zellzyklus während der Mitose führt, auf den die Apoptose folgt. Neben dieser antimitotischen Wirkung von Taxanen ist seit einiger Zeit auch eine gefäßverändernde Wirkung von Taxanen bekannt. Kürzlich wurde gezeigt, dass Taxane tatsächlich Störungen in der Gefäßarchitektur verursachen, indem sie den Kalziumeinstrom über TRPC6, einen unselektiven Kationenkanal, auslösen. Der erhöhte intrazelluläre Ca2+-Spiegel bewirkt eine Rundung der Endothelzellen, was zu einer Störung des endothelialen Monolayers, Serumausfluss und Gefäßkollaps führt. In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die Gefäßbetten von peripheren Organen wie dem Herzen oder der Niere in Abhängigkeit vom Tumorstadium und der Taxol-Behandlung. Die Organe wurden mit immunhistochemischen Techniken angefärbt, um Veränderungen in der Architektur und Morphologie der Blutgefäße zu untersuchen. Wir fanden Veränderungen in der Morphologie der Kapillaren des Herzens und darüber hinaus Veränderungen in der Expression endothelialer Antigene in Abhängigkeit vom Tumorstadium, insbesondere eine zunehmende endotheliale Expression von TRPC6 in Abhängigkeit vom Tumorstadium. Diese Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse für das Verständnis der systemischen Auswirkungen maligner Erkrankungen und tragen dazu bei, Folgeerkrankungen bei Patienten mit fortgeschrittenem Krebs zu verhindern. N2 - Taxanes (like Paclitaxel or Cabazitaxel) are well-established drugs in the systemic therapy regimens of many malignancies, including breast and ovarian cancer. They promote the stabilization of microtubules leading to an arrest of the cell cycle during mitosis which is followed by apoptosis. Beside this anti-mitotic action of taxanes, a vascular-directed effect of taxanes has been known for some time. We recently showed that taxanes actually cause vascular disruption by triggering calcium influx via TRPC6. The increased intracellular Ca2+-level causes rounding of endothelial cells, leading to a disruption of the endothelial monolayer, serum efflux, and vascular collapse. In this study, we focused on the vascular beds of peripheral organs like the heart or the kidney in dependency on tumor stage and Taxol-therapy. The organs were stained via immunohistochemical techniques to examine changes in the architecture and morphology of the blood vessels. We found changes in the morphology of the cardiac capillaries and furthermore changes in the expression of endothelial antigens in dependence on the tumor stage, especially an increasing endothelial expression of TRPC6 dependent on the tumor stage. These findings provide new insights for the understanding of the systemic effects of malignant diseases and help to prevent secondary diseases in patients with advanced cancer. KW - Taxane KW - Taxanes KW - Kardioonkologie KW - Mamma-Karzinom KW - Kapillararchitektur KW - Immunhistochemie KW - Brustkrebs KW - Immuncytochemie Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350722 ER - TY - THES A1 - Nadernezhad, Ali T1 - Engineering approaches in biofabrication of vascularized structures T1 - Ingenieurtechnische Ansätze in der Biofabrikation vaskularisierter Strukturen N2 - Biofabrication technologies must address numerous parameters and conditions to reconstruct tissue complexity in vitro. A critical challenge is vascularization, especially for large constructs exceeding diffusion limits. This requires the creation of artificial vascular structures, a task demanding the convergence and integration of multiple engineering approaches. This doctoral dissertation aims to achieve two primary objectives: firstly, to implement and refine engineering methods for creating artificial microvascular structures using Melt Electrowriting (MEW)-assisted sacrificial templating, and secondly, to deepen the understanding of the critical factors influencing the printability of bioink formulations in 3D extrusion bioprinting. In the first part of this dissertation, two innovative sacrificial templating techniques using MEW are explored. Utilizing a carbohydrate glass as a fugitive material, a pioneering advancement in the processing of sugars with MEW with a resolution under 100 microns was made. Furthermore, by introducing the “print-and-fuse” strategy as a groundbreaking method, biomimetic branching microchannels embedded in hydrogel matrices were fabricated, which can then be endothelialized to mirror in vivo vascular conditions. The second part of the dissertation explores extrusion bioprinting. By introducing a simple binary bioink formulation, the correlation between physical properties and printability was showcased. In the next step, employing state-of-the-art machine-learning approaches revealed a deeper understanding of the correlations between bioink properties and printability in an extended library of hydrogel formulations. This dissertation offers in-depth insights into two key biofabrication technologies. Future work could merge these into hybrid methods for the fabrication of vascularized constructs, combining MEW's precision with fine-tuned bioink properties in automated extrusion bioprinting. N2 - Biofabrikationstechnologien müssen zahlreiche Parameter und Bedingungen berücksichtigen, um die Komplexität von Gewebe in vitro zu rekonstruieren. Eine entscheidende Herausforderung ist die Vaskularisierung, insbesondere bei großen Konstrukten, die die Diffusionsgrenzen überschreiten. Dies erfordert die Schaffung künstlicher Gefäßstrukturen, eine Aufgabe, die die Konvergenz und Integration verschiedener technischer Ansätze erfordert. Mit dieser Dissertation sollen zwei Hauptziele erreicht werden: erstens die Implementierung und Verfeinerung technischer Methoden zur Herstellung künstlicher mikrovaskulärer Strukturen mit Hilfe des "Melt Electrowriting" (MEW) und zweitens die Vertiefung des Verständnisses der kritischen Faktoren, die die Druckbarkeit von Biotintenformulierungen beim 3D-Extrusions-Bioprinting beeinflussen. Im ersten Teil dieser Dissertation werden zwei innovative Opferschablonentechniken unter Verwendung von MEW erforscht. Unter Verwendung eines Kohlenhydratglases als flüchtiges Material wurde ein bahnbrechender Fortschritt bei der Verarbeitung von Zuckern mit MEW mit einer Auflösung von unter 100 Mikrometern erzielt. Darüber hinaus wurden durch die Einführung der "Print-and-Fuse"-Strategie als bahnbrechende Methode biomimetische, verzweigte Mikrokanäle hergestellt, die in Hydrogelmatrizen eingebettet sind und anschließend endothelialisiert werden können, um die vaskulären Bedingungen in vivo wiederzugeben. Der zweite Teil der Dissertation befasst sich mit dem Extrusions-Bioprinting. Durch die Einführung einer einfachen binären Biotintenformulierung wurde die Korrelation zwischen physikalischen Eigenschaften und Druckbarkeit aufgezeigt. Im nächsten Schritt wurde durch den Einsatz modernster Methoden des maschinellen Lernens ein tieferes Verständnis für die Zusammenhänge zwischen den Eigenschaften der Biotinte und der Druckbarkeit in einer erweiterten Bibliothek von Hydrogelformulierungen gewonnen. Diese Dissertation bietet tiefe Einblicke in zwei Schlüsseltechnologien der Biofabrikation. Zukünftige Arbeiten könnten diese zu hybriden Methoden für die Herstellung vaskularisierter Konstrukte zusammenführen und dabei die Präzision von MEW mit fein abgestimmten Biotinteneigenschaften im automatisierten Extrusionsbioprinting kombinieren. KW - 3D-Druck KW - Rheologie KW - Maschinelles Lernen KW - Bioinks KW - Hyrogels KW - Valscularization KW - Melt Electrowriting Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345892 ER -