TY - THES A1 - Hanselmann, Steffen T1 - PRC1 serves as a microtubule-bundling protein and is a potential therapeutic target for lung cancer T1 - PRC1 dient als ein Mikrotubuli-bündelndes Protein und ist ein potenzielles therapeutisches Target für Lungenkrebs N2 - Protein regulator of cytokinesis 1 (PRC1) is a microtubule-associated protein with essential roles in mitosis and cytokinesis. Furthermore, the protein is highly expressed in several cancer types which is correlated with aneuploidy and worse patient outcome. In this study it was investigated, whether PRC1 is a potential target for lung cancer as well as its possible nuclear role. Elevated PRC1 expression was cell cycle-dependent with increasing levels from S-phase to G2/M-phase of the cell cycle. Thereby, PRC1 localized at the nucleus during interphase and at the central spindle and midbody during mitosis and cytokinesis. Genome-wide expression profiling by RNA sequencing of ectopically expressed PRC1 resulted in activation of the p53 pathway. A mutant version of PRC1, that is unable to enter the nucleus, induced the same gene sets as wildtype PRC1, suggesting that PRC1 has no nuclear-specific functions in lung cancer cells. Finally, PRC1 overexpression leads to proliferation defects, multi-nucleation, and enlargement of cells which was directly linked to microtubule-bundling within the cytoplasm. For analysis of the requirement of PRC1 in lung cancer, different inducible cell lines were generated to deplete the protein by RNA interference (RNAi) in vitro. PRC1 depletion caused proliferation defects and cytokinesis failures with increased numbers of bi- and multi-nucleated cells compared to non-induced lung cancer cells. Importantly, effects in control cells were less severe as in lung cancer cells. Finally, p53 wildtype lung cancer cells became senescent, whereas p53 mutant cells became apoptotic upon PRC1 depletion. PRC1 is also required for tumorigenesis in vivo, which was shown by using a mouse model for non-small cell lung cancer driven by oncogenic K-RAS and loss of p53. Here, lung tumor area, tumor number, and high-grade tumors were significantly reduced in PRC1 depleted conditions by RNAi. In this study, it is shown that PRC1 serves as a microtubule-bundling protein with essential roles in mitosis and cytokinesis. Expression of the protein needs to be tightly regulated to allow unperturbed proliferation of lung cancer cells. It is suggested that besides phosphorylation of PRC1, the nuclear localization might be a protective mechanism for the cells to prevent perinuclear microtubule-bundling. In conclusion, PRC1 could be a potential target of lung cancer as mono therapy or in combination with a chemotherapeutic agent, like cisplatin, which enhanced the negative effects on proliferation of lung cancer cells in vitro. N2 - Protein-Regulator der Zytokinese 1 (PRC1) ist ein Mikrotubuli-assoziierendes Protein mit wesentlicher Funktion bei der Mitose und Zytokinese. Die Expression des Proteins ist in verschiedenen Krebsarten stark erhöht, was mit Aneuploidie und schlechterer Lebenserwartung der Patienten korreliert. In dieser Untersuchung wurde erforscht, ob PRC1 ein potenzielles therapeutisches Target für die Behandlung von Lungenkrebs darstellt, sowie seine mögliche Zellkern-Funktion untersucht. Die gesteigerte PRC1-Expression war Zellzyklus-abhängig, mit ansteigendem Expressionslevel von der S-Phase bis zur G2/M-Phase des Zellzyklus. Hierbei ist PRC1 während der Interphase im Zellkern lokalisiert und während der Mitose und Zytokinese an der zentralen Spindel und dem Mittelkörper lokalisiert. Genomweite Expressionsanalysen durch RNA-Sequenzierung nach ektopischer PRC1-Expression resultierte in einer Aktivierung des p53-Signalweges. Eine mutierte Version von PRC1, die nicht imstande ist in den Zellkern zu gelangen, hat dieselbe Gen-Zusammenstellung wie das Wildtyp-PRC1 induziert. Dies deutet auf keine Kern-spezifische Funktion von PRC1 im Lungenkrebs hin. Schlussendlich führt die Überexpression von PRC1 zu Proliferationsdefekten, mehreren Zellkernen und Vergrößerung der Zellen, was im direkten Zusammenhang mit der Mikrotubuli-Bündelung im Zytoplasma steht. Zur Analyse des Bedarfs von PRC1 im Lungenkrebs wurden verschiedene induzierbare Zelllinien hergestellt, um die Expression des Proteins durch RNA-Interferenz (RNAi) im Zellkultursystem vermindern zu können. Die PRC1-Depletion durch RNAi führte bei Lungenkrebszellen zu Proliferationsdefekten und Zytokinese-Fehlern. Im Vergleich zu nicht-induzierten Lungenkrebszellen zeigte sich ein Anstieg von multinuklearen Zellen. Wichtig war hier, dass Effekte in Kontrollzellen weniger stark waren als in Lungenkrebszellen. Außerdem hat sich gezeigt, dass nach PRC1-Depletion, p53-Wildtyp Lungenkrebszellen seneszent und p53-mutierte Zellen apoptotisch wurden. PRC1 wird auch für die Tumorentstehung in vivo bei einem Mausmodell von nichtkleinzelligem Lungenkrebs, das durch Onkogenes K-RAS und Verlust von p53 getrieben ist, benötigt. Hierbei zeigte sich eine signifikante Reduzierung der Lungentumorfläche, Anzahl der Tumore und hochgradige Tumore durch Depletion von PRC1 durch RNAi. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PRC1 eine wichtige Funktion als Mikrotubuli-bündelndes Protein in der Mitose und Zytokinese hat. Die Expression des Proteins muss genau kontrolliert werden, um eine ungestörte Proliferation von Lungekrebszellen aufrecht zu erhalten. Es wird vorgeschlagen, dass neben der Phosphorylierung von PRC1, die Kern-Lokalisation ein Schutzmechanismus der Zellen vor perinukleärer Mikrotubuli-Bündelung darstellt. Schlussendlich könnte PRC1 ein potentielles therapeutisches Target für Lungenkrebs sein, sowohl als Monotherapie oder auch in Kombination mit chemotherapeutischen Wirkstoffen, wie beispielsweise Cisplatin, was einen zusätzlichen negativen Effekt auf das Zellwachstum im Zellkultur System zeigte. KW - Mikrotubuli-assoziiertes Protein (MAP) KW - Zellteilung (Zytokinese) KW - Mitose KW - Zellzyklus KW - Mikrotubuli KW - Zellkern KW - Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom (NSCLC) KW - Lungenkrebs KW - potenzielles therapeutisches Target KW - K-Ras KW - p53 KW - zentrale Spindel und Mittelkörper KW - MMB Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266314 ER - TY - THES A1 - Fetiva Mora, Maria Camila T1 - Changes in chromatin accessibility by oncogenic YAP and its relevance for regulation of cell cycle gene expression and cell migration T1 - Änderungen der Chromatinzugänglichkeit durch onkogene YAP und seine Relevanz für die Genexpression während des Zellzyklus und für die Zellmigration N2 - Various types of cancer involve aberrant cell cycle regulation. Among the pathways responsible for tumor growth, the YAP oncogene, a key downstream effector of the Hippo pathway, is responsible for oncogenic processes including cell proliferation, and metastasis by controlling the expression of cell cycle genes. In turn, the MMB multiprotein complex (which is formed when B-MYB binds to the MuvB core) is a master regulator of mitotic gene expression, which has also been associated with cancer. Previously, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP. By binding to enhancers of MMB target genes and promoting B-MYB binding to promoters, YAP and MMB co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes which promote cell proliferation. This doctoral thesis addresses the mechanisms of YAP and MMB mediated transcription, and it characterizes the role of YAP regulated enhancers in transcription of cell cycle genes. The results reported in this thesis indicate that expression of constitutively active, oncogenic YAP5SA leads to widespread changes in chromatin accessibility in untransformed human MCF10A cells. ATAC-seq identified that newly accessible and active regions include YAP-bound enhancers, while the MMB-bound promoters were found to be already accessible and remain open during YAP induction. By means of CRISPR-interference (CRISPRi) and chromatin immuniprecipitation (ChIP), we identified a role of YAP-bound enhancers in recruitment of CDK7 to MMB-regulated promoters and in RNA Pol II driven transcriptional initiation and elongation of G2/M genes. Moreover, by interfering with the YAP-B-MYB protein interaction, we can show that binding of YAP to B-MYB is also critical for the initiation of transcription at MMB-regulated genes. Unexpectedly, overexpression of YAP5SA also leads to less accessible chromatin regions or chromatin closing. Motif analysis revealed that the newly closed regions contain binding motifs for the p53 family of transcription factors. Interestingly, chromatin closing by YAP is linked to the reduced expression and loss of chromatin-binding of the p53 family member Np63. Furthermore, I demonstrate that downregulation of Np63 following expression of YAP is a key step in driving cellular migration. Together, the findings of this thesis provide insights into the role of YAP in the chromatin changes that contribute to the oncogenic activities of YAP. The overexpression of YAP5SA not only leads to the opening of chromatin at YAP-bound enhancers which together with the MMB complex stimulate the expression of G2/M genes, but also promotes the closing of chromatin at ∆Np63 -bound regions in order to lead to cell migration. N2 - Ein Kennzeichen vieler Tumoren ist die fehlerhafte Aktivierung von zellzyklusregulierenden Signalwegen. Ein für das Tumorwachstum wichtiger Signalwege ist der Hippo-Signalweg und das durch ihn regulierte Onkogen YAP, ein transkriptioneller Koaktivator. Durch die Regulierung von Zellzyklusgenen ist YAP verantwortlich für onkogene Prozesse wie Zellproliferation und Metastasierung. Der MMB-Multiproteinkomplex wiederum – er entsteht, wenn B-MYB an das MuvB-Kernmodul bindet – ist ein wichtiger Regulator der mitotischen Genexpression, welche ebenso mit der Tumorentstehung in Verbindung gebracht wurde. Unser Labor hat zuvor einen neuen Mechanismus der Regulation mitotischer Gene durch den MMB-Komplex und YAP identifiziert: Durch die Bindung an Enhancer der MMB-Zielgene und die Förderung der B-MYB-Bindung an Promotoren reguliert YAP eine Reihe von mitotischen und zytokinetischen Zielgenen, welche die Zellproliferation fördern. Diese Doktorarbeit befasst sich mit den Mechanismen der YAP- und MMB-vermittelten Transkription und charakterisiert die Rolle der YAP regulierten Enhancer während der Transkription von Zellzyklusgenen. Die in dieser Dissertation dargelegten Ergebnisse zeigen, dass die Expression von konstitutiv aktivem, onkogenem YAP5SA zu weitreichenden Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit nicht-transformierter humaner MCF10A Zellen führt. ATAC-seq zeigte, dass ein grosse Anzahl YAP-gebundene Enhancer zugänglich und aktiviert werden. Gleichzeitig konnte festgestellt werden, dass die MMB-gebundenen Promotoren bereits vor der Expression von YAP zugänglich sind und während der YAP-Induktion offen bleiben. Mittels CRISP-Interferenz (CRISPRi) und Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) konnten wir zeigen, dass YAP-gebundene Enhancer die Rekrutierung von CDK7 an MMB-regulierten Promotoren sowie die Initiation und Elongation der Transkription von G2/M Genen fördert. Durch die experimentelle Blockade der YAP-B-MYB Proteininteraktion konnten wir darüber hinaus belegen, dass auch die Bindung von YAP an B-MYB für die Initiation der Transkription an MMB-regulierten Genen entscheidend ist. Unerwarteterweise führte die Überexpression von YAP5SA auch dazu, dass bestimmte Regionen im Genom weniger zugänglich werden. Motivanalysen ergaben, dass diese neu geschlossenen Regionen Bindungsmotive für die p53-Familie von Transkriptionsfaktoren enthalten. Die Chromatinschließung durch YAP ist an eine reduzierte Expression und an den Verlust der Chromatinbindung des p53-Familienmitglieds Np63 gekoppelt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass die Inhibition von Np63 durch YAP ein wichtiger Schritt in der YAP-abhängigen Förderung der Zellmigration ist. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse dieser Dissertation Einblicke in die Rolle von YAP bei Chromatinveränderungen welche zu den onkogenen Aktivitäten von YAP beitragen. Die Überexpression von YAP führt dabei einerseits zur Öffnung des Chromatins an YAP-gebundenen Enhancern, die zusammen mit dem MMB-Komplex die Expression von G2/M Genen stimulieren. Andererseits fördert YAP auch das Schließen von Chromatin an Np63-gebundenen Regionen, was wiederum Zellmigration nach sich zieht. KW - YAP KW - B-MYB KW - MMB KW - enhancers KW - transcription KW - chromatin accessibility KW - opening of chromatin KW - closing of chromatin KW - cell migration KW - G2/M genes KW - Chromatin KW - Genexpression KW - Zellzyklus KW - Zellmigration Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302910 ER -