TY  - THES
A1  - Förster, Sabrina
T1  - Regulation des Kaliumausstroms im  ABA- und Jasmonatvermittelten Stomaschluss
T1  - Regulation of Potassium Efflux in the ABA- and Jasmonate-controlled Stomatal Closure
N2  - Stomata sind mikroskopisch kleine Poren in der Blattoberfläche der Landpflanzen, über die das Blattgewebe mit CO2 versorgt wird. Als Schutz vor Austrocknung oder einer Infektion durch Pathogene entwickelte sich ein Mechanismus, um die Porenweite durch Bewegung der sie umgebenden Schließzellen an die Bedürfnisse der Pflanze anzupassen. Ein eng geknüpftes Signalnetzwerk kontrolliert diese Bewegungen und ist in der Lage, externe wie interne Stimuli zu verarbeiten. Der Schließvorgang wird osmotisch durch den Turgorverlust in den Schließzellen angetrieben, der durch den Efflux von Ionen wie K+ ausgelöst wird. In dieser Arbeit wurde die Regulation durch Phosphorylierung des wichtigsten K+-Effluxkanals für den Stomaschluss, GORK, untersucht. Folgende Erkenntnisse wurden durch elektrophysiologische Untersuchungen mit der DEVC-Methode gewonnen: GORK wird durch OST1 auf Ca2+- unabhängige und durch CBL1/9-CIPK5 und CBL1-CIPK23 auf Ca2+-abhängige Weise phosphoryliert und damit aktiviert. CBL1 muss CIPK5 an der Plasmamembran verankern und Ca2+ binden. CIPK5 benötigt ATP und eine Konformationsänderung, um GORK zu phosphorylieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch zum ersten Mal gezeigt, dass die PP2CPhosphatase ABI2 direkt mit einem Kanal interagiert und dessen Aktivität hemmt. ABI2 interagiert auch mit den Kinasen OST1, CIPK5 und CIPK23, sodass die Kontrolle der Kanalaktivität auf multiple Weise stattfinden kann. OST1 und ABI2 verbinden die GORKRegulation mit dem ABA-Signalweg. Schließzellen von gork1-2, cbl1/cbl9 und cipk5-2 sind insensitiv auf MeJA, nicht aber auf ABA. Dies stellt eine direkte Verbindung zwischen dem Jasmonatsignalweg und der Ca2+-Signalgebung dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere Hinweise für das komplexe Zusammenspiel der Phytohormone ABA, JA und des Pseudomonas- Effektors Coronatin gefunden werden. Hier konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Schließzellen je nach Inkubationszeit unterschiedlich auf MeJA und das Phytotoxin Coronatin reagieren. ABA und Coronatin verhalten sich dabei antagonistisch zueinander, wobei der Effekt der Stimuli auf die Stomaweite von der zeitlichen Abfolge der Perzeption abhängt. Der Jasmonat-Signalweg in Schließzellen löst eine geringe ABA-Synthese sowie den Proteinabbau durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System aus und benötigt ABA-Rezeptoren (PYR/PYLs), um einen Stomaschluss einzuleiten. Durch diese Arbeit konnte somit die JA-gesteuerte Regulation des Kaliumefflux-Kanals GORK entschlüsselt sowie einige Unterschiede zwischen den ABA, JA und Coronatin-vermittelten Schließzellbewegungen aufgedeckt werden.
N2  - Stomata are microscopically small pores in the leaf surface of land plants, through which the leaf tissue is supplied with CO2. To protect the plant from both desiccation and infection by pathogens, a mechanism evolved to adjust the pore width to the plant’s needs by movement of the surrounding guard cells. A dense signaling network controls these movements and is able to integrate external as well as internal stimuli. Stomatal closure is osmotically driven by the loss of turgor in guard cells caused by efflux of ions such as K+. In this work, we investigated the regulation by phosphorylation of the main K+ efflux channel for stomatal closure, GORK. The following results were obtained with electrophysiological measurements via the DEVC- technique: GORK is phosphorylated by OST1 in a Ca2+- independent and by CBL1/9-CIPK5 as well as CBL1-CIPK23 in a Ca2+-dependent manner. CBL1 anchors CIPK5 at the plasma membrane and must bind Ca2+ for activation of CIPK5. CIPK5 requires both ATP binding and a conformational change for phosphorylation of GORK. For the first time it was shown that the PP2C phosphatase ABI2 interacts directly with an ion channel and inhibits its activity. ABI2 also interacts with the kinases OST1, CIPK5 and CIPK23, implying a control by ABI2 over channel activity in multiple ways. OST1 and ABI2 link GORK regulation with the ABA signaling pathway. Guard cells of gork1-2, cbl1/cbl9 and cipk5-2 are insensitive to MeJA, but not to ABA. This represents a direct connection between JA signal transduction and Ca2+ signaling. In this work, further hints could be found for the complex interplay of the phytohormones ABA, JA and the effector Coronatine of Pseudomonas. Here it was shown for the first time that guard cells respond differently to MeJA and the phytotoxin Coronatine, based on incubation time. Depending on the temporal sequence of perception, ABA and Coronatine act antagonistically on the pore width. Jasmonate signal transduction in guard cells leads to a minor synthesis of ABA as well as protein degradation via the ubiquitin/ 26S proteasome system and initiates stomatal closure requiring ABA receptors (PYR/PYLs). This work describes the JA-controlled regulation of the potassium efflux channel GORK as well as some differential aspects of ABA, JA and Coronatine triggered stomatal movements.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Stomata
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Phophorylierung
KW  - Phytohormon
KW  - Spaltöffnung
KW  - Kaliumkanal
KW  - Abscisinsäure
KW  - Jasmonsäure
KW  - Pflanzenhormon
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115455
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lange, Manuel
T1  - Mutanten im RES-Oxylipin Signalweg von \(Arabidopsis\)  \(thaliana\)
T1  - Mutants in RES-Oxylipin Signaling in \(Arabidopsis\)  \(thaliana\)
N2  - Reaktive elektrophile Spezies-Oxylipine (RES-Oxylipine) finden sich in Pflanzen- und Tierzellen und zeichnen sich durch eine für sie typische Anordnung von Atomen aus: einer α,β ungesättigten Carbonyl Gruppe. In Pflanzenzellen gehören unter anderem 2-(E)-Hexenal und die Vorstufe der Jasmonsäure 12-Oxophytodiensäure (OPDA) zu den RES-Oxylipinen, in Tierzellen z.B. Prostaglandin A1 (PGA). RES-Oxylipine üben Signalfunktionen aus, wie dies in Pflanzenzellen funktioniert ist jedoch noch nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit ist dabei einen möglichen RES-Oxylipin Signalweg aufzuklären und die beteiligten Gene zu identifizieren. Es konnte aber gezeigt werden, dass die Expressionsrate von bestimmten Genen wie z.B. GST6 durch RES-Oxylipine spezifisch induziert wird. Zur Untersuchung des RES-Oxylipin Signalweges wurde der GST6 Promotor vor das Luciferase-Gen fusioniert, um so ein RES-Oxylipin spezifisches Reportersystem zu erhalten. Die Ethylmethansulfonat mutagenisierten Linien wurden auf geänderte Luciferase-Aktivität hin untersucht. Dabei wurden drei Mutanten isoliert, die in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Eine zeigte basal erhöhte Luciferase-Aktivität (constitutive overexpresser 3 = coe3) und die anderen beiden erniedrigte Luciferase-Aktivität nach PGA Gabe (non responsive 1 und 2 = nr1 und nr2). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phänotypen in allen 3 Mutanten rezessiv vererbt werden und die Mutanten nicht zueinander allel sind. Zudem war die veränderte Luciferase-Aktivität nicht durch geänderte Phytohormonspiegel oder durch Mutationen im GST6 Promotor erklärbar. Auf die Gabe von RES, wie Benzylisothiocyanat oder Sulforaphan, sowie auf endogene RES-Oxylipine, wie OPDA und Hexenal, reagierten die Mutanten auf ähnliche Weise, wie nach PGA Gabe. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass sich die drei Mutanten stark voneinander unterschieden. Das Transkriptom kontrollbehandelter coe3 Pflanzen unterschied sich stark von dem der GST6::LUC Pflanzen. Die Mutante war trockenstressresistenter zudem war sie sensibler gegenüber NaCl, was jedoch nicht von einer veränderten Reaktion auf Abscisinsäure herrührte. Des Weiteren war der Chlorophyllabbau bei dunkel inkubierten Blättern geringer. Bei der Lokalisierung der Mutation, die noch nicht abgeschlossen ist, konnten Chromosom 2 und 5 als die wahrscheinlichsten Kandidaten ermittelt werden. Weitere Analysen sind nötig um den Bereich weiter eingrenzen zu können. Die Mutante nr1, die sich durch verminderte Reaktion auf RES-Oxylipine auszeichnete, zeigte einen kleineren Wuchs und ein deutlich verzögertes Blühen. Außerdem wies die Mutante erhöhte Argininspiegel in ihren Blättern auf. Das Transkriptom unterschied sich sowohl bei kontrollbehandelten, als auch bei PGA behandelten nr1 Pflanzen massiv von denen der gleichbehandelten Kontrollen. Auch die nr1 schien trockenstressresistenter zu sein, sie war im Gegensatz zur coe3 aber robuster gegenüber höheren Konzentrationen an NaCl. Mit Hilfe eines „Next Generation Genome-Mappings“ war es möglich die Mutation am Ende von Chromosom 3 zu lokalisieren und auf fünf mögliche Gene einzugrenzen. Weitere Untersuchungen müssen nun klären, welches dieser Gene ursächlich für den Phänotyp der geänderten Luciferase-Aktivität ist. Die zweite Mutante mit einer reduzierten Reaktion auf RES-Oxylipine war die nr2. Überraschender Weise unterschied sich das Transkriptom kontrollbehandelter nr2 Pflanzen deutlich stärker von dem der gleichbehandelten GST6::LUC Pflanzen, als das nach PGA Gabe der Fall war. Sie reagierte nur mit sehr schwacher Luciferase-Aktivität auf Verwundung und war zudem deutlich sensibler gegenüber Trockenheit. Für eine zukünftige Lokalisation der ursächlichen Mutation wurden entsprechende Kreuzungen durchgeführt aus deren Samen jederzeit mit einer Selektionierung begonnen werden kann. Mit dieser Arbeit konnte ein erster großer Schritt in Richtung Identifikation der, für die geänderte Luciferase-Aktivität, verantwortlichen Mutation gemacht werden, sowie erste Reaktionen der Mutanten auf abiotische Stressfaktoren untersucht werden. Somit ist man der Entdeckung von Signaltransduktionsfaktoren, die RES-Oxylipinabhängig reguliert werden, einen wichtigen Schritt näher gekommen.
N2  - Reactive electrophilic species oxylipins (RES-oxylipins) can be found in plant and animal cells and contain an α,β unsaturated carbonyl group. In plant cells 2-(E)-hexenal and 12-oxo-phytodienoic acid (OPDA), the precursor of jasmonic acid, belong to the RES-oxylipins, in animal cells prostaglandin A1 (PGA). RES-oxylipins play an important role in signal transduction but it is still unknown how this functions in plant cells. In previous publications, it could be shown, that RES-oxylipins induce the expression of certain genes like GST6 specifically. To further investigate the possibility of a RES-oxylipin pathway the GST6 promotor was fused to the luciferase gene to get a RES-oxylipin sensitive reporter system. The ethyl methanesulfonate (EMS) mutagenized lines were screened for altered luciferase activity under basal conditions and after treatment with PGA. Three lines were selected for further investigation: one with a constitutive higher luciferase activity (constitutive overexpresser 3 = coe3) and two with a reduced luciferase activity after PGA treatment (non responsive 1 and 2 = nr1 and nr2). In this thesis, it could be shown, that the mutation, which is responsible for the altered luciferase activity, is recessive and not allelic to each other. Furthermore, neither altered phytohormone levels nor mutations in the GST6 promotor are responsible for the changes in the luciferase activity. The response of these mutants to RES, like benzyl isothiocyanate (BITC) or sulforaphane, or endogenous RES-oxylipins, like OPDA or hexenal, is comparable to the response to PGA treatment. Further investigations show huge differences between the mutants. Control treated coe3 plants had very different transcriptomes compared to the control line. The coe3 mutant was more resistant to drought stress but more susceptible to salt compared to the control. This was not due to a changed response to abscisic acid (ABA). Another observed phenotype was the reduced chlorophyll depletion in dark incubated leaves. The localization of the mutation could not be completed within this thesis but chromosome 2 and 5 could be identified as most likely positions. Further investigations on this topic are needed to complete the localization. The nr1 mutant showed a reduced growth and delayed flowering phenotype and higher arginine levels could be detected in the leaves. The transcriptome exhibited huge differences after both control treatment and PGA treatment compared to the GST6::LUC. In drought experiments, the nr1 was also more resistant but, compared to the coe3, also more robust against higher salt concentrations. By next generation genome mapping it was possible to locate the mutation, which was responsible for the changes in luciferase activity after PGA treatment, at the end of chromosome 3. So there are five genes left who might be responsible for the observed phenotypes. Further investigations have to show which one is the one causing the phenotype. The nr2, as the third mutant investigated in this thesis showed highest differences to the GST6::LUC line after control treatment. It only had weak luciferase activity after wounding and was more susceptible to drought then the control. For further mapping experiments of the mutation in the nr2 mutant, F2 lines were generated. These are now ready to use to set up a mapping population. With this thesis it was possible to provide a milestone in identification of the mutations responsible for the changes in luciferase activity and in investigation of different abiotic stress responses. Now we are one step closer to discover signal transduction factors which are regulated by RES-oxylipins.
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - RES-Oxylipine
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166085
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TY  - THES
A1  - Pahlavan, Pirasteh
T1  - Integrated Systems Biology Analysis; Exemplified on Potyvirus and Geminivirus interaction with \(Nicotiana\) \(benthamiana\)
T1  - Integrierte Systeme Biologie Analyse, Beispiel für Potyvirus und Geminivirus Interaktion mit \(Nicotiana\) \(benthamiana\)
N2  - Viral infections induce a significant impact on various functional categories of biological processes in the host. The understanding of this complex modification of the infected host immune system requires a global and detailed overview on the infection process. Therefore it is essential to apply a powerful approach which identifies the involved components conferring the capacity to recognize and respond to specific pathogens, which in general are defeated in so-called compatible virus-plant infections. Comparative and integrated systems biology of plant-virus interaction progression may open a novel framework for a systemic picture on the modulation of plant immunity during different infections and understanding pathogenesis mechanisms. In this thesis these approaches were applied to study plant-virus infections during two main viral pathogens of cassava: Cassava brown streak virus and African cassava mosaic virus. 
Here, the infection process was reconstructed by a combination of omics data-based analyses and metabolic network modelling, to understand the major metabolic pathways and elements underlying viral infection responses in different time series, as well as the flux activity distribution to gain more insights into the metabolic flow and mechanism of regulation; this resulted in simultaneous investigations on a broad spectrum of changes in several levels including the gene expression, primary metabolites, and enzymatic flux associated with the characteristic disease development process induced in Nicotiana benthamiana plants due to infection with CBSV or ACMV. 
Firstly, the transcriptome dynamics of the infected plant was analysed by using mRNA-sequencing, in order to investigate the differential expression profile according the symptom developmental stage. The spreading pattern and different levels of biological functions of these genes were analysed associated with the infection stage and virus entity. A next step was the Real-Time expression modification of selected key pathway genes followed by their linear regression model. Subsequently, the functional loss of regulatory genes which trigger R-mediated resistance was observed. Substantial differences were observed between infected mutants/transgenic lines and wild-types and characterized in detail. In addition, we detected a massive localized accumulation of ROS and quantified the scavenging genes expression in the infected wild-type plants relative to mock infected controls. 
Moreover, we found coordinated regulated metabolites in response to viral infection measured by using LC-MS/MS and HPLC-UV-MS. This includes the profile of the phytohormones, carbohydrates, amino acids, and phenolics at different time points of infection with the RNA and DNA viruses. This was influenced by differentially regulated enzymatic activities along the salicylate, jasmonate, and chorismate biosynthesis, glycolysis, tricarboxylic acid cycle, and pentose phosphate pathways, as well as photosynthesis, photorespiration, transporting, amino acid and fatty acid biosynthesis. We calculated the flux redistribution considering a gradient of modulation for enzymes along different infection stages, ranging from pre-symptoms towards infection stability. 
Collectively, our reverse-engineering study consisting of the generation of experimental data and modelling supports the general insight with comparative and integrated systems biology into a model plant-virus interaction system. We refine the cross talk between transcriptome modification, metabolites modulation and enzymatic flux redistribution during compatible infection progression. The results highlight the global alteration in a susceptible host, correlation between symptoms severity and the alteration level. In addition we identify the detailed corresponding general and specific responses to RNA and DNA viruses at different stages of infection. To sum up, all the findings in this study strengthen the necessity of considering the timing of treatment, which greatly affects plant defence against viral infection, and might result in more efficient or combined targeting of a wider range of plant pathogens.
N2  - Virale Infektionen haben einen signifikanten Einfluss auf verschiedene funktionelle Eigenschaften und biologische Prozesse im Wirt. Das Verständnis dieser komplexen Modifikation des infizierten Wirtsimmunsystems benötigt eine globale und detaillierte Einsicht in den Infektionsprozess. Diese erfordert einen leistungsfähigen Ansatz zur Identifizierung der beteiligten Komponenten, welche eine Pathogen-Erkennung und Antwort vermitteln bzw. eine kompatible Virus-Pflanze-Infektion voraussetzen. Die Anwendung der vergleichenden und integrierten Systembiologie zur Untersuchung dieser Pflanzen-Virus-Interaktionen im Infektionsverlauf kann eine neue Grundlage zum systematischen Verständnis der Modulation des Immunsystems der Pflanze und der Pathogen-Mechanismen während verschiedener Infektionen eröffnen. In dieser Arbeit wenden wir diese Ansätze an, um Pflanzen-Virus-Infektionen der zwei häufigsten viralen Pathogenen von Maniok zu untersuchen, den Cassava brown streak virus (CBSV) und den African cassava mosaic virus (ACMV).
Dazu rekonstruieren wir den Infektionsprozess durch die Kombination von „omics“ basierten Datenanalysen und metabolischen Netzwerkmodellen um die wichtigen Elemente des viralen Infektionsprozesses zu verschieden Zeitpunkten aufzuklären. Metabolische Flussanalysen geben Einblick in metabolische Umsätze und deren Regulierung. Diese simultanen Untersuchungen erfassen ein breites Spektrum der Virus-vermittelten Veränderungen im Wirt über mehrere „omics“ Ebenen, einschließlich Geneexpression, Primärmetabolite und enzymatischer Aktivitäten, die mit dem charakteristischen Krankheitsentwicklungsprozess assoziiert sind, der in Nicotiana benthamiana Pflanzen aufgrund einer Infektion mit CBSV oder ACMV induziert wurde.
Zuerst wurde die Dynamik des Transkriptoms infizierter Pflanzen mittels mRNA-Sequenzierung analysiert um das differentielle Expressionsprofil nach dem Symptomentwicklungsstadium zu untersuchen. Die Expressionsmuster und die biologischen Funktionen dieser Gene wurden im Hinblick auf die Infektionsstufe und den Virus Einheiten aufgelöst. Ein nächster Schritt war die Echtzeit-Expressionsmodifikation ausgewählter Schlüsselprozess-Gene, gefolgt von der Umsetzung im linearen Regressionsmodell. Anschließend wurde der funktionelle Verlust von regulatorischen Genen ermittelt, welche eine R-vermittelte Resistenz auslösen können. Es wurden erhebliche Unterschiede zwischen infizierten Mutanten / transgenen Linien und Wild-typen beobachtet und im Detail charakterisiert. Darüber hinaus entdeckten wir eine massive lokalisierte Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies und quantifizierten die Expression von Abbauproteinen in den infizierten Wildtyp-Pflanzen relativ zu Mock-infizierten Kontrollen.
Darüber hinaus fanden wir koordinierte regulierte Metaboliten als Reaktion auf eine virale Infektion, gemessen unter Verwendung von LC-MS / MS und HPLC-UV-MS Techniken. Dazu gehören die Analyse der Profile von Phytohormonen, Kohlenhydraten, Aminosäuren, und Phenolika zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion mit den RNA und DNA-Viren. Diese wurden beeinflusst durch die differentielle regulierten enzymatischen Aktivitäten entlang der Salicylat-, Jasmonat- und Chorismat-Biosynthese, der Glykolyse, Tricarbonsäure und Pentose-Phosphat-Umsetzung, der Photosynthese und Photorespiration, des Transportes und der Aminosäure sowie Fettsäure-Biosynthese. Wir berechneten die Umverteilung des metabolischen Flusses unter Berücksichtigung einer ansteigenden Beeinflussung von Enzymen in den verschiedeneren Infektionsstadien, die von Prä-Symptomen zur Infektionsstabilität reichen.
Zusammengefasst beinhaltet unsere Reverse-Engineering-Studie die Generierung von experimentellen Daten und deren Modellierung mittels vergleichender und integrierter Systembiologie zum Einblick in das Modell-Pflanzen-Virus-Interaktionssystem. Wir lösten die Interaktion zwischen Transkriptom-Modifikation, Metabolitenmodulation und die Umverteilung des metabolischen Flusses während des kompatiblen Infektionsprozesses auf. Das Ergebnis zeigt die globalen Veränderungen in einem anfälligen Wirt auf, sowie die Korrelation zwischen Symptomschwere und der Stärke dieser Veränderungen. Darüber hinaus identifizieren wir im Detail die entsprechenden allgemeinen und spezifischen Reaktionen auf RNA und DNA-Viren in den verschiedenen Stadien der Infektion. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Erkenntnisse aus dieser Studie die Notwendigkeit aufzeigen, den zeitlichen Ablauf bei einer Pflanzenschutzbehandlung zu berücksichtigen, welche die pflanzliche Abwehr gegen eine Virusinfektion stark beeinflusst; und insgesamt zu einer effizienteren oder kombinierten Anwendung gegen ein breiteres Spektrum von Pflanzenpathogenen führen könnte.
KW  - RNA-seq
KW  - virus
KW  - next generation sequencing
KW  - transcriptome
KW  - fluxosome
KW  - metabolite profiling
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153412
N1  - I also provided some supplementary data in digital version, which are available on-request from the dean's office.
ER  - 
TY  - THES
A1  - Reyer, Antonella
T1  - Charakterisierung des Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii als nicht-invasives, optogenetisches Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen
T1  - Characterisation of Channelrhodopsin-2 from Chlamydomonas reinhardtii as a non-invasiv, optogenetic tool for the functional analysis of electical signals in plants
N2  - Ebenso wie Tiere verfügen Pflanzen über die Fähigkeit elektrische Signale zu generieren. Dabei repräsentieren elektrische Signale – Membranpotentialänderungen an der Plasmamembran – die frühesten Antworten, welche an Pflanzenzellen im Zuge veränderter externer und intrinsischer Bedingungen beobachtet werden können. Stimuli wie Kälte, Hitze, Verwundung, Herbivorie und Pathogene, aber auch physiologische Prozesse, wie Wachstum und Bestäubung führen zur Änderung des Potentials der Plasmamembran pflanzlicher Zellen. Die meisten dieser Membranpotentialänderungen bestehen aus einer schnellen Depolarisation, gefolgt von einer Repolarisation des Membranpotentials, deren Kinetik, in Abhängigkeit des Stimulus hoch variabel sein kann. Das Wissen über die molekularen Grundlagen der Generierung und Weiterleitung elektrischer Signale in Pflanzen ist im Gegensatz zu Tieren nur wenig verstanden. Eine Ausnahme stellen ‚klassisch-erregbare‘ Pflanzen wie die Venusfliegenfalle oder die Mimose dar. In diesen Pflanzen führt ein Berührungsreiz zur Auslösung eines charakteristischen Aktionspotentials, welches in der Folge zu einer, auf differentiellen Turgoränderungen basierenden, nastischen Bewegung führt. In allen anderen Pflanzen ist die Kinetik der Membranpotentialänderungen sehr variabel, abhängig vom Stimulus und dem physiologischen Zustand der Zellen und – mit Ausnahme der Reaktion auf einen Kältestimulus – lediglich nach langen Latenzzeiten wiederholbar. Dieser Umstand verhindert eine systematische Analyse der molekularen Basis elektrischer Signale in den meisten Pflanzen. Ziel dieser Arbeit war es daher, auf der Basis des Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, welches bereits seit 2005 in der Neurobiologie genutzt wird, ein nicht-invasives Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen zu etablieren. ChR2 ist ein Blaulicht-aktivierter Kationenkanal, der für seine Funktion all trans-Retinal als Cofaktor benötigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Varianten des ChR2, mit einem Schwerpunkt auf ChR2-C128T und vor allem ChR2-D156C, auch bekannt als ChR2-XXL eingesetzt. ChR2 konnte bereits durch M. Baumann im Rahmen ihrer Dissertation funktionell im transienten Expressionssystem Nicotiana benthamiana dargestellt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das System weiter ausgebaut und die besonders aussichtsreichen ChR2-Varianten nicht nur in N. benthamiana, sondern auch in stabilen Arabidopsis thaliana Linien funktionell charakterisiert. Dabei konnte mit dem ChR2-XXL ein geeignetes optogenetisches Werkzeug zur Untersuchung elektrischer Signale in Pflanzen identifiziert werden. ChR2-XXL bietet die Möglichkeit das Membranpotential durch kurze, 5 s Blaulichtpulse im Mittel um 95 mV zu depolarisieren und im Anschluss die Repolarisationsphase zu untersuchen. Blaulicht-induzierbare, ChR2-XXL-vermittelte Depolarisationen konnten, reproduzierbar und beliebig oft an den gleichen Zellen wiederholt ausgelöst werden. Dadurch ermöglicht ChR2-XXL die bisher nur unzureichend bekannten molekularen Komponenten der Repolarisation des Membranpotentials in Pflanzen zu erforschen. In tierischen Zellen generieren spannungsabhängige Natriumkanäle die Depolarisation, während spannungsabhängige Kaliumkanäle die Depolarisationskinetik bestimmen. Die im Vergleich zu tierischen Zellen veränderten Ionengradienten lassen vermuten, dass die pflanzliche Depolarisation im Wesentlichen durch Ca2+-abhängige Anionenkanäle vermittelt wird, die durch den Efflux von Cl- das Membranpotential depolarisieren. Für die Repolarisation wird zum einen die Beteiligung von auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen postuliert. Zum anderen wird auch eine Beteiligung der Plasmamembran (PM) H+-ATPasen vermutet, welche gleichzeitig einen essentiellen Beitrag zur Generierung des Ruhepotentials leisten. In der vorliegenden Arbeit wurde es durch den Einsatz von ChR2-XXL möglich, beide potentiellen Komponenten der Repolarisationsphase, Kaliumkanäle und PM H+-ATPasen, erstmals durch eine nicht-invasive, Anionen-unabhängige Methode der Depolarisation zu untersuchen. Durch den Einsatz von Mutanten und Kaliumkanalinhibitoren konnte ein möglicher Beitrag des auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanals Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (AtGORK) an der Repolarisationsphase in Arabidopsis Mesophyllzellen nahezu ausgeschlossen werden. Der auswärtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK öffnet erst bei Membranpotentialen positiv vom Gleichgewichtspotential für Kaliumionen (EK (-118 mV)). Da die ChR2-induzierbaren Depolarisationen ebenso wie viele natürliche Stimuli, diesen Wert kaum erreichen oder nur geringfügig überschreiten, leistet der GORK einen geringfügigen Beitrag bei der Repolarisation. Dies ließ vermuten, dass die Repolarisation von EK bis zum Ruhepotential bei ca. -180 mV dagegen möglicherweise durch die PM H+-ATPasen bewerkstelligt wird. Die Wirkung des PM H+-ATPase Inhibitors Natriumorthovanadat, sowie des PM H+-ATPase Aktivators Fusicoccin auf die Repolarisationsphase konnten diese Hypothese unterstützen. Die Hemmung der PM H+-ATPasen verlangsamte die Repolarisationskinetik während eine Aktivierung der PM H+-ATPasen diese beschleunigte. So wurde es erstmals möglich den genauen Einfluss der PM H+-ATPasen auf Wiederherstellung des Membranpotentials während der Repolarisation in Mesophyllzellen zu studieren. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass in Gegenwart des Kaliumkanalblockers Ba2+ die Repolarisation ebenfalls beschleunigt werden konnte. In Übereinstimmung mit dem ‚Pump-and-Leak‘-Modell (Alberts et al. 2002) deutet dies darauf hin, dass schwach einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle, wie der ARABIDOPSIS K+ TRANSPORTER 2 (AKT2) dem PM H+-ATPasen Protonengradienten entgegenwirken und somit das Ruhepotential aus der Summe der bewegten Ladungen von Pumpen und Kaliumkanälen bestimmt wird. Das mögliche Potenzial optogenetischer, Rhodopsin-basierter Werkzeuge für die molekulare Analyse elektrischer Signale, insbesondere unter Einsatz der breiten Palette lichtgesteuerter Pumpen und Kanäle, ihrer spektralen Diversität und ihrer Einkreuzung in ausgewählte Arabidopsis Mutanten wird diskutiert.
N2  - Like animals, plants have the ability to generate electrical signals – membrane potential changes on the plasma membrane. Electrical signals represent the earliest answers that can be observed in plant cells in the course of changing external and internal conditions. Stimuli such as cold, heat, wounding, herbivory and pathogens, as well as physiological processes such as growth and pollination, lead to changes in the potential of the plasma membrane of plant cells. Most of these membrane potential changes consist of rapid depolarization, followed by repolarization of the membrane potential, the kinetics of which can be highly variable depending on the stimulus. In contrast to animals, knowledge about the molecular basis of the generation and transmission of electrical signals in plants is poorly understood. Exceptions include "classically excitable plants" such as the Venus fly trap or mimosa, in which a touch stimulus leads to the triggering of a characteristic action potential, which subsequently leads to an elastic movement based on differential turgor changes. In all other plants, the kinetics of membrane potential changes are highly variable, depending on the stimulus and the physiological state of the cells and – with the exception of the reaction to a cold stimulus – can only be repeated after long latency periods. This prevents a systematic analysis of the molecular basis of electrical signals in most plants. The aim of this work was therefore to establish a non-invasive tool for the functional analysis of electrical signals in plants based on the channelrhodopsin-2 ChR2 from the green alga Chlamydomonas reinhardtii, which has been used in neurobiology since 2005. ChR2 is a blue light-activated cation channel that needed all-trans retinal as a cofactor in order to function. In this work, different variants of the ChR2, with a focus on C128T and especially D156C, also known as ChR2-XXL, were used. ChR2 could already be functionally represented by M. Baumann in the context of her dissertation in the transient expression system Nicotiana benthamiana. In the present work, the system was expanded and particularly promising ChR2 variants were characterized not only in N. benthamiana, but also in stable Arabidopsis thaliana lines. The ChR2-XXL identified a suitable optogenetic tool for examining electrical signals in plants. ChR2-XXL offers the possibility to depolarize the membrane potential by short, 5 s blue light pulses on average by 95 mV and then to investigate the repolarization phase. Blue light-inducible, ChR2-XXL-mediated depolarizations could be triggered reproducibly and repeatedly on the same cells as often as desired. ChR2-XXL enables research into the previously inadequate molecular components of the repolarization of the membrane potential in plants. In animal cells, voltage-dependent sodium channels generate depolarization, while voltage-dependent potassium channels determine the depolarization kinetics. The ion gradients changed compared to animal cells suggest that plant depolarization is essentially due to Ca2+-dependent anion channels, which depolarize the membrane potential through the efflux of Cl-. For repolarization, the involvement of outward rectifying potassium channels is postulated. On the other hand, participation of PM H+-ATPases is also suspected, which at the same time make an essential contribution to the generation of the resting potential. In the present work, the use of ChR2-XXL made it possible for the first time to investigate both potential components of the repolarization phase, potassium channels and PM H+-ATPases, using a non-invasive, anion-independent method of depolarization. Through the use of mutants and potassium channel inhibitors, a possible contribution of the outward rectifying potassium channel Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (GORK) to the repolarization phase in Arabidopsis mesophyll cells could almost be excluded. The outward-rectifying potassium channel GORK only opens at membrane potentials more positive than the equilibrium potential for potassium ions (EK (-118 mV)). Since the ChR2-inducible depolarizations, like many natural stimuli, hardly reach this value or only exceed it slightly, GORK makes a minor contribution to repolarization. This suggested that the repolarization from EK to the resting potential at approximately -180 mV, on the other hand, may be accomplished by PM H+-ATPases. The effects of the PM H+-ATPase inhibitor sodium orthovanadate and the PM H+-ATPase activator fusicoccin on the repolarization phase supported this hypothesis. The repolarization kinetics were slowed by inhibition of the PM H+-ATPases and accelerated by their activation. This made it possible for the first time to study the exact influence of the PM H+-ATPases on restoring the membrane potential during repolarization in mesophyll cells. It was also observed that repolarization could be accelerated in the presence of the potassium channel blocker Ba2+. In accordance with the 'pump-and-leak' model, this indicates that weakly inwardly-rectifying potassium channels, such as the Arabidopsis K+ Transporter 2 (AKT2) counteract the PM H+-ATPase-generated proton gradient and thus the resting potential from the sum of the moving charges of pumps and potassium channels is determined. The potential of optogenetic, rhodopsin-based tools for the molecular analysis of electrical signals, in particular using the wide range of light-controlled pumps and channels, their spectral diversity and their intersection with selected Arabidopsis mutants is discussed.
KW  - pflanzliche Elektrophysiologie
KW  - Channelrhodopsin-2
KW  - elektrische Signale
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Optogenetik
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218671
ER  - 
TY  - THES
A1  - Önel, Ayla
T1  - Synthese und Relevanz von Oxylipinen in Blättern, Wurzeln und Samen von \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
T1  - Synthesis and relevance of oxylipins in leaves, roots and seeds of \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
N2  - Die Lipidoxidation kann sowohl enzymatisch als auch nicht enzymatisch erfolgen. Der erste Schritt der enzymatischen Oxidation wird durch Lipoxygenasen katalysiert, von welchen es in Arabidopsis thaliana sechs verschiedene Isoformen gibt. Dabei werden die Lipoxygenasen nach dem Kohlenstoffatom klassifiziert, welches sie oxidieren. Somit gehören die LOX1 und LOX5 zu den 9-Lipoxygenasen, während LOX2, LOX3, LOX4 und LOX6 zu den 13 Lipoxygenasen zählen. Während der Samenalterung findet vermehrt eine Lipidperoxidation statt, welche mit einem Verfall des Samens sowie einer verringerten Keimrate korreliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst erfolgreich ein System zur künstlichen Samenalterung von Arabidopsis thaliana etabliert. Bei der künstlichen Alterung stiegen ähnlich wie bei der natürlichen Samenalterung oxidierte Lipide an und die Keimrate fiel ab. Nach Alterung konnte ein Anstieg von sechs verschiedenen oxidierten Triacylglycerolen detektiert werden. Es konnte in dieser Arbeit mit Hilfe von Mutanten mit Defekten in mehreren der Lipoxygenase Gene gezeigt werden, dass die Oxidation dieser veresterten Fettsäuren zum größten Teil nicht enzymatisch erfolgt. Bei der Alterung stiegen zudem enzymatisch gebildete 9 Lipoxygenase Produkte wie freie Hydroxy- und Ketofettsäuren an. Bei einer Analyse der freien oxidierten Fettsäuren konnte ebenfalls mit Lipoxygenase Mutanten ermittelt werden, dass diese hauptsächlich via LOX1 oxidiert werden. Die Untersuchung der Keimraten der Lipoxygenase Mutanten nach Alterung zeigte in mehreren Versuchen eine leicht erhöhte Keimrate der lox1 im Vergleich zum Wildtyp. Eine exogene Behandlung von Wildtyp Samen mit verschiedenen 9-Lipoxygenase Produkten, welche bei der Alterung ansteigen, führte allerdings nicht zu einer Keimungshemmung. Somit scheinen Produkte wie Hydroxy- und Ketofettsäuren der 9-Lipoxygenase LOX1 nicht die Hauptursache für die Keimungshemmung nach Alterung zu sein.
Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Behandlung der Blüten des Wildtyps mit Methyljasmonat zu einer signifikant höheren Keimrate der Samen im Vergleich zu Samen von unbehandelten Pflanzen nach Alterung führt. Ein „Lipidprofiling“ der Samen von mit Methyljasmonat behandelten Pflanzen wies signifikant geringere Gehalte sowohl an freien als auch veresterten oxidierten Fettsäuren auf, was mit einer erhöhten Lebensfähigkeit korrelierte. Diese Erkenntnisse könnten von großer Relevanz für die Landwirtschaft sein, falls eine Übertragung auf Nutzpflanzen möglich ist.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war eine eingehende Untersuchung der Rolle und Funktion der LOX6. Mit Hilfe von GUS Färbungen konnte eine Lokalisation der LOX6 in Blättern und Wurzeln nachgewiesen werden. 
Zudem wurde ein 35SLOX6GFP Konstrukt erstellt und in Arabidopsis thaliana Pflanzen stabil transformiert. Mit den selektionierten Linien könnte in Zukunft auch die intrazelluläre Lokalisation der LOX6 untersucht werden. Außerdem wurden Konstrukte mit dem Reportergen GFP und AOS sowie LOX2 hinter dem 35S Promotor kloniert, welche ebenfalls für weitere Lokalisations- und Kolokalisationsstudien genutzt werden können. Zudem wurde mit der Klonierung eines Konstruktes begonnen, um in Zukunft einen spezifischen LOX6 Antikörper herstellen und auch die endogene LOX6 Lokalisation in dem Wildtyp analysieren zu können. Um die Produkte der LOX6 zu untersuchen, wurden 35SLOX6 Linien sowie die lox6 Mutante verwendet. Obwohl Hydroxyfettsäuren und Jasmonate Folgeprodukte der LOX6 sind, wiesen die 35SLOX6 Linien weder basal, noch nach Stress erhöhte Gehalte dieser im Vergleich zum Wildtyp auf. Somit geben die 35SLOX6 Linien einen Hinweis darauf, dass LOX6 im Wildtyp nicht limitierend für die Produktion von Hydroxyfettsäuren und Jasmonaten sein könnte. Um zu untersuchen, ob das Substrat der LOX6 der limitierende Faktor sein könnte, wurde eine Behandlung mit α Linolensäure durchgeführt. Dabei entstanden allerdings nicht mehr Folgeprodukte der LOX6, sondern es fand sowohl in den 35SLOX6 Linien als auch in dem Wildtyp eine massive nicht enzymatische radikalische Oxidation der Fettsäuren statt. Um festzustellen, ob sich durch eine LOX6 Überexpression das Metabolom ändert, wurde eine „untargeted Analyse“ mit 35SLOX6 Linien durchgeführt. Diese zeigte vier Metabolite, welche in den 35SLOX6 Linien im Vergleich zum Wildtyp unterschiedlich stark vorhanden waren. Zudem sollte untersucht werden, ob sich die Physiologie und Stressresistenz in den Überexpressionslinien im Vergleich zum Wildtyp unterscheiden. Dabei zeichneten sich die 35SLOX6 Linien durch kleinere, hellere und rundere Blätter aus. Zudem wurden die Wurzeln der 35SLOX6 Linien bei Fraßversuchen mit Pocellio scaber im Vergleich zum Wildtyp weniger bevorzugt gefressen. Diese Erkenntnisse sowie die generierten Konstrukte und Pflanzenlinien können in der Zukunft einen weiteren Einblick in die vielfältigen Funktionen und Produkte der LOX6 gewähren.
N2  - Lipidoxidation can take place enzymatically and non-enzymatically. The first step of the enzymatic oxidation is catalysed via lipoxygenases. In Arabidopsis thaliana there are six lipoxygenase isoforms. The lipoxygenases are characterized by the carbon atom they oxidise. LOX1 and LOX5 are 9-lipoxygenases, while LOX2, LOX3, LOX4 and LOX6 are 13 lipoxygenases. During seed ageing lipid peroxidation takes place, which correlates with a deterioration of the seed and a lower germination rate. First, a method for artificial ageing of Arabidopsis thaliana seeds was successfully established as a part of this work. During artificial seed ageing, oxidised lipids increased and the germination rate decreased similar to natural ageing. During artificial ageing an accumulation of six oxidised triacylglycerols could be detected. In this work, it could be shown with the help of mutants with defects in the lipoxygenase genes, that the oxidation of esterified fatty acids mainly takes place non-enzymatically. Moreover, enzymatically formed free 9-lipoxygenase products such as hydroxy and keto fatty acids increase during the process of ageing. An analysis of the free fatty acids in lipoxygenase mutants lead to the conclusion that they are formed primarily by LOX1. The lox1 mutant showed a slightly higher germination rate than the wild type after seed ageing in the majority of the experiments. However, an exogenous treatment of wild type seeds with free 9-lipoxygenase products, which increase during ageing, did not inhibit the germination rate. Therefore, LOX1 (9-lipoxygenase) products like hydroxy and keto fatty acids do not seem to be the main cause for the inhibition of germination after ageing. 
In addition, this work shows that a methyl jasmonate treatment of wild type flowers leads to a significant higher germination rate of their seeds after ageing in comparison to the seeds of untreated wild type plants. A lipid profiling revealed significantly lower levels of oxidised esterified as well as free fatty acids after ageing in seeds of treated wild type plants compared to untreated ones, which correlates with a higher germination rate. These findings could be of great value for the agriculture if they are transferable to crop plants.
Another focus of this work was set on investigating the function and relevance of LOX6. The localization of LOX6 in leaves and roots could be confirmed with the help of GUS stainings. Furthermore, a 35SLOX6GFP construct was generated and stably transformed in Arabidopsis thaliana plants. With the selected lines it will be possible to investigate the intracellular localization of LOX6 in the future. Moreover, constructs with the reporter gene GFP and AOS or LOX2 were cloned behind the 35S promoter which can also be used for additional localization and co-localization experiments. To analyse the endogenous localization of LOX6 in the wild type, the cloning of a construct was started to generate a specific antibody in the future. To investigate the different products of LOX6, 35SLOX6 lines and the lox6 mutant were used. Although hydroxy fatty acids and jasmonates are secondary products of LOX6, neither basal nor after different stress treatments elevated levels could be detected in the overexpression lines compared to the wild type. This finding indicates that LOX6 may not be limiting for the production of jasmonates and hydroxy fatty acids in the wild type. Moreover, to investigate if the substrate of LOX6 could be a limiting factor, a treatment with α linolenic acid was performed. However, this did not lead to more LOX6 secondary products but rather to a massive increase of non-enzymatic radical triggered oxidation of fatty acids in the 35SLOX6 lines as well as in the wild type. To examine whether an overexpression of LOX6 leads to changes in the metabolom, an untargeted analysis with 35SLOX6 lines was performed. This analysis revealed four metabolites, which were present in different amounts in 35SLOX6 lines and the wild type. Apart from that, the physiology and stress resistance of the 35SLOX6 lines should be investigated for differences compared to the wild type. The overexpression lines exhibited smaller, rounder and paler leaves. In feeding experiments, the roots of 35SLOX6 plants were less attractive to the rough woodlouse Porcellio scaber than the wild type. The insights of this work, together with the generated constructs and plant lines could help to gain a better understanding of the versatile functions and products of LOX6 in the future.
KW  - Jasmonate
KW  - Lipoxygenase
KW  - Oxylipine
KW  - Samen
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Jasmonate
KW  - Künstliche Samenalterung
KW  - Lipoxygenase 6
KW  - Oxylipine
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141647
ER  -