TY - THES A1 - Karl, Franziska T1 - The role of miR-21 in the pathophysiology of neuropathic pain using the model of B7-H1 knockout mice T1 - Die Rolle von miR-21 in der Pathophysiologie von neuropathischem Schmerz am Model der B7-H1 defizienten Maus N2 - The impact of microRNA (miRNA) as key players in the regulation of immune and neuronal gene expression and their role as master switches in the pathophysiology of neuropathic pain is increasingly recognized. miR-21 is a promising candidate that could be linked to the immune and the nociceptive system. To further investigate the pathophysiological role of miR-21 in neuropathic pain, we assesed mice deficient of B7 homolog 1 (B7-H1 ko), a protein with suppressive effect on inflammatory responses. B7-H1 ko mice and wildtype littermates (WT) of three different age-groups, young (8 weeks), middle-aged (6 months), and old (12 months) received a spared nerve injury (SNI). Thermal withdrawal latencies and mechanical withdrawal thresholds were determined. Further, we investigated anxiety-, depression-like and cognitive behavior. Quantitative real time PCR was used to determine miR-21 relative expression in peripheral nerves, dorsal root ganglia and white blood cells (WBC) at distinct time points after SNI. Naïve B7-H1 ko mice showed mechanical hyposensitivity with increasing age. Young and middle-aged B7-H1 ko mice displayed lower mechanical withdrawal thresholds compared to WT mice. From day three after SNI both genotypes developed mechanical and heat hypersensitivity, without intergroup differences. As supported by the results of three behavioral tests, no relevant differences were found for anxiety-like behavior after SNI in B7-H1 ko and WT mice. Also, there was no indication of depression-like behavior after SNI or any effect of SNI on cognition in both genotypes. The injured nerves of B7-H1 ko and WT mice showed higher miR-21 expression and invasion of macrophages and T cells 7 days after SNI without intergroup differences. Perineurial miR-21 inhibitor injection reversed SNI-induced mechanical and heat hypersensitivity in old B7-H1 ko and WT mice. This study reveals that reduced mechanical thresholds and heat withdrawal latencies are associated with miR-21 induction in the tibial and common peroneal nerve after SNI, which can be reversed by perineurial injection of a miR-21 inhibitor. Contrary to expectations, miR-21 expression levels were not higher in B7-H1 ko compared to WT mice. Thus, the B7-H1 ko mouse may be of minor importance for the study of miR-21 related pain. However, these results spot the contribution of miR-21 in the pathophysiology of neuropathic pain and emphasize the crucial role of miRNA in the regulation of neuronal and immune circuits that contribute to neuropathic pain. N2 - Die Beteiligung von microRNA (miRNA) an der Genregulation immunologischer und neuronaler Prozesse und deren Rolle als Schlüsselelement in der Pathophysiologie von neuropathischem Schmerz gewinnt zunehmend an Bedeutung. miR-21 ist ein vielversprechender Kandidat, der sowohl das Immunsystem, als auch das nozizeptive System beeinflusst. Um die pathophysiologische Rolle von miR-21 bei neuropathischem Schmerz besser zu verstehen wurden Mäuse mit B7 homolog 1 Defizienz (B7-H1 ko), einem immunsupprimierendem Protein, untersucht. Eine frühere Studie zeigte eine Hochregulierung von miR-21 in murinen Lymphozyten. Junge (8 Wochen), mittelalte (6 Monate) und alte (12 Monate) B7-H1 ko Mäuse und Wildtypwurfgeschwister (WT) erhielten eine spared nerve injury (SNI) als neuropathischem Schmerzmodell. Es wurden thermische Rückzugslatenzen und mechanische Rückzugsschwellen bestimmt. Des weiteren wurde sowohl das Angstverhalten, das depressive Verhalten, als auch das kognitive Verhalten untersucht. Um die relative Expression von miR-21 in den peripheren Nerven, den Spinalganglien und in den weißen Blutzellen zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen, wurde die quantitative real time PCR angewandt. Naive B7-H1 ko Mäuse zeigten mit zunehmendem Alter eine mechanische Hyposensitivität. Bereits 3 Tage nach SNI entwickelten beide Genotypen eine Überempfindlichkeit gegenüber Hitze und mechanischer Stimulation. In drei durchgeführten Verhaltenstests konnten keine relevanten Unterschiede im Angstverhalten nach SNI von B7-H1 ko und WT Mäusen festgestellt werden. Bei beiden Genotypen gab es weder Hinweise auf depressives Verhalten nach SNI, noch wurde das kognitive Verhalten durch SNI beeinträchtigt. Die verletzen Nerven der B7-H1 ko und WT Mäuse zeigten 7 Tage nach SNI eine höhere miR-21 Expression und eine Invasion durch Makrophagen und T-Zellen ohne Gruppenunterschiede. Die perineurale Injektion eines miR-21 Inhibitors konnte die durch SNI induzierte mechanische und thermische Hypersensitivität lindern. Diese Studie zeigt, dass der Anstieg von miR-21 im N. tibialis und N. peroneus communis mit reduzierten Rückzugsschwellen gegen mechanische Reize und verkürzten Wegzugslatenzen bei Hitzestimulation einhergeht, welche durch perineurale Injektion eines miR-21 Inhibitors verringert werden können. Entgegen der Erwartungen zeigten B7-H1 ko Mäuse im Vergleich zu WT Mäusen keine erhöhte miR-21 Expression und sind daher möglicherweise von geringer Bedeutung für die Untersuchung von miR-21 assoziiertem Schmerz. Jedoch bekräftigen diese Ergebnisse eine Beteiligung von miR-21 an der Pathophysiologie von neuropathischem Schmerz und bestätigen die wichtige Rolle von miRNA bei der Regulation von neuronalen und immunologischen Prozessen, die zu neuropathischem Schmerz beitragen. KW - neuropathic pain KW - inflammation KW - B7-H1 KW - immune system KW - neuropathic pain KW - miRNA KW - miR-21 Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156004 ER - TY - THES A1 - Menzer, Alexander T1 - Massenspektrometrische Differenzierung bakterieller Infektionserreger mit dem Vitek MS-Routinetest-System (IVD) T1 - Mass spectrimetric identification of bacteria by Vitek MS Routine lab System (IVD) N2 - Untersucht wurde die Performance des Vitek MS-Systems anhand eines Keimspektrums von 1357 Isolaten im Zeitraum von Oktober 2011 bis April 2014. Das untersuchte Kollektiv bestand aus Isolaten der mikrobiologischen Routinediagnostik (n=1173), aus Stammsammlungen des Nationalen Referenzzentrum für Meningokokken und Haemophilus influenzae (n=128), sowie offizieller Stammsammlungen wie ATCC, DSMZ, LSM und anderen (n=56). Die Ergebnisse wurden entweder mit einer bereits vorhandenen Stammbezeichnung oder durch eine bzw. Kombinationen mehrerer molekularbiologischer (PCR der Teilabschnitte von Haushaltsgenen: 16S-rRNA-Untereinheit, sodA, recA) oder biochemischen Differenzierungsmethoden (Vitek 2, API-Systeme) verglichen. Mangels Referenzergebnisses wurden 25 Isolate (etwa 1,8%) aus der weiteren Betrachtung ausgeschlossen. Die verbliebenen 1332 Isolate wurden in 28 Bakterienordnungen, 109 Genera und 269 Spezies unterteilt. Auf Speziesebene konnten 1180 (etwa 88,6%) zum Vergleich herangezogen werden, da durch die Referenzmethoden nicht immer eine zuverlässige Speziesdifferenzierung gelang. Diese Referenzergebnisse wurden mit den Ergebnissen des Vitek MS-Systems verglichen. Eine Übereinstimmung zeigte sich auf Genusebene bei 86% (1157 von 1332 Isolaten) und auf Speziesebene bei 80% (944 von 1180 speziesdifferenzierten Keimen) der ausgewählten Stämme. Im Vergleich der Korrelationen der Vitek MS-Identifikationen und den Referenzergebnissen zeigte sich eine durchgehend gute Korrelation innerhalb der unterteilten Bakterienordnungen. Davon abweichend war die Speziesdifferenzierung von Keimen der Ordnung Enterobacteriales. Die beste Korrelation erreichte die Ordnung Clostridiales. Stämme ohne entsprechendes, dokumentiertes Korrelat in der Vitek MS-Datenbank (n=62) wurden ebenfalls in die Betrachtung mit eingeschlossen. Bei 31 Isolaten konnte kein Ergebnis ermittelt werden, 21 wurden massenspektrometrisch dem gleichen Genus zugeordnet, 10 Genusdifferenzierungen wichen ab. 315 Stämme wurden sowohl im Standardverfahren durch Konjugation von 1µl Ready-to-use Matrix als auch mit einem zweistufigen Säureextraktions- und Matrixkonjugationsverfahren gemessen und mit der solitären Konjugation der doppelten Matrixmenge verglichen. Die Abweichungen auf Genus- wie Speziesebene zwischen dem angewandten Standardprotokoll und den beiden anderen Verfahren waren deutlich signifikant. Im Vergleich der zweifachen Matrixmenge und dem zweistufigen Verfahren zeigte sich kein signifikanter Unterschied. Aufgrund der Ergebnisse scheint jedoch die Säureextraktion Gram-positiver Kokken in der Genusdifferenzierung von Vorteil zu sein, sie erreichte jedoch kein ausreichendes Signifikanzniveau. Die Daten sprechen eher dafür, eine Optimierung des Probe-Matrix-Verhältnisses anzustreben, zum Beispiel im Rahmen eines ausgedehnten Anwendertrainings. N2 - Mass spectrimetric identification of bacteria by Vitek MS Routine lab System (IVD) KW - Bakterien / Taxonomie KW - MALDI-MS KW - Pathogener Mikroorganismus KW - Automatische Identifikation KW - Mikrobiologische Diagnostik KW - Vitek MS Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147355 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Stefan T1 - Hybridisierungsbasierte Multiplex-Detektion von microRNA mit CMOS-Technologie für die Anwendung in der Point-of-Care-Diagnostik T1 - Hybridization-based multiplex detection of microRNA using CMOS technology towards point-of-care diagnostics N2 - MicroRNAs sind kurze, nicht-kodierende Ribonukleinsäuren, die eine wichtige Rolle bei der Genregulation spielen. Sie sind an vielen physiologischen Prozessen beteiligt und werden als vielversprechende Kandidaten für eine neue Generation von Biomarkern gehandelt. Die Quantifizierung von miRNAs aus Blut oder anderen Körperflüssigkeiten verspricht eine frühe Diagnose verschiedener Krankheitsbilder. Dazu zählen neben zahlreichen Krebsformen unter anderem auch Autoimmun- oder Herz-Kreislauferkrankungen. Um diese Biomarker schnell, sensitiv und spezifisch detektieren zu können, werden geeignete Detektionssysteme benötigt. Dabei liegt ein besonderer Fokus auf der Entwicklung von Point-of-Care-Systemen, die eine automatisierte Durchführung mit einfacher Handhabung verlangen. Mikrochips können als leistungsfähige technische Hilfsmittel für eine robuste und miniaturisierte Signalerfassung an biochemischen Grenzflächen dienen. Auf der Grundlage eines CMOS-Chips mit einem Sensorarray aus interdigitalen Gold-Elektroden sollte in dieser Arbeit eine quantitative und multiplexfähige miRNA-Detektionsmethode mit elektrochemischer Signaltransduktion entworfen und untersucht werden. Weitere wichtige Zielfaktoren waren eine einfache und schnelle Durchführbarkeit, eine hohe Spezifität und eine gute Sensitivität bei gleichzeitigem Verzicht auf Amplifikation und Vormarkierung des Ausgangsmaterials. Es wurden verschiedene Methoden entworfen, überprüft, untersucht, optimiert und weiterentwickelt. Das beste Ergebnis wurde letztlich mit einem als Sandwich-Ligations-Methode bezeichneten Verfahren erzielt. Dabei wird zunächst ein aus zwei doppelsträngigen Assay-Komponenten und der Ziel-miRNA bestehender dreiteiliger Hybridisierungskomplex gebildet, der eine beidseitige spezifische Ligation der miRNA mit einem auf der Sensoroberfläche immobilisierten Fängerstrang und einem enzymmarkierten Reporterstrang vermittelt. Durch einen anschließenden Waschschritt werden alle überschüssigen Markierungen vom Detektionsbereich entfernt, so dass bei der Detektion nur Reporterenzyme ausgelesen werden, die über die Ziel-miRNA kovalent mit dem immobilisierten Strang verbunden sind. Dieses Signal ist daher proportional zur Ausgangskonzentration der gesuchten miRNA. Die Methode wurde mit Hilfe von synthetischen miRNAs etabliert und optimiert. Sie erreichte eine analytische Sensitivität von unter 1 pM Ziel-Nukleinsäure bei einer Gesamt-Versuchsdauer von nur 30 Minuten. Konzentrationsreihen demonstrierten einen linearen dynamischen Messbereich zwischen 1 pM und 1 nM, der eine verlässliche Quantifizierung der detektierten miRNAs in diesem Bereich ermöglicht. Die sehr gute Spezfifität des Assays zeigte sich bei der Untersuchung des Einflusses verschiedener IsomiRs auf das Messergebnis sowie im Rahmen von Experimenten mit miRNAs der let-7-Familie. Dabei konnten Ziel-Nukleinsäuren mit Einzelbasenunterschieden klar differenziert werden. Die Multiplexfähigkeit der vorgestellten Methode wurde durch die gleichzeitige Quantifizierung von bis zu acht miRNAs auf einem CMOS-Chip demonstriert, zuzüglich Kontrollen. Die Validierung der Detektionsmethode erfolgte mit Gesamt-RNA-Extrakten aus Vollblutproben. Dazu wurde ein kardiales Panel aus acht miRNAs, die auf Basis von Studien zu zirkulierenden miRNAs bei Herzerkrankungen ausgewählt wurden, festgelegt. Mit Hilfe der entsprechenden optimierten Detektionskomponenten wurden aus Spenderblut gewonnene endogene miRNAs analysiert. Dabei zeigte sich für fünf der acht Kandidaten sowohl eine solide Korrelation zwischen eingesetzter Gesamt-RNA-Menge und Messsignal, als auch eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Die Konzentrationen der übrigen drei miRNAs lagen nah am unteren Detektionslimit und lieferten daher keine verlässlichen Daten. Mit Hilfe sogenannter branched DNA zur Signalamplifikation könnte bei Bedarf die Sensitivität des Assays noch verbessert werden, was durch weitere Experimente dieser Arbeit demonstriert wurde. Ein Vergleichsexperiment zwischen der Sandwich-Ligations-Methode und qRT-PCR zeigte nur eine schwache Korrelation der Messergebnisse. Dies ist jedoch konsistent mit anderen Studien zur Vergleichbarkeit unterschiedlicher Detektionsmethoden. Abschließend wurden die miRNAs des kardialen Panels in Gesamt-RNA-Extrakten aus Vollblut von Herzinfarktpatienten und Kontrollen mit der entwickelten Detektionsmethode analysiert und die Ergebnisse verglichen. Dabei konnten Abweichungen in den Konzentrationen von miR-15a und miR-425 aufgedeckt werden. Eine entsprechende diagnostische Untersuchung mit der hier vorgelegten und validierten Detektionsmethode könnte eine Alternative oder Ergänzung zu aktuell eingesetzten proteinbasierten Tests bieten. N2 - MicroRNAs are short, non-coding ribonucleic acids that play an important role in gene regulation. They are involved in many physiological processes and therefore considered as auspicious candidates for a new generation of biomarkers. The quantification of miRNAs from blood or other body fluids promises early diagnosis of various diseases, including autoimmune disorders, cardiovascular disease as well as different types of cancer. For a fast, sensitive and specific detection of these biomarkers, suitable detection systems are needed. A particular focus is thereby on the development of point-of-care systems, which require an automatized work-flow with easy handling. Microchips are powerful technical tools for a robust and miniaturized signal acquisition at biochemical interfaces. Based on a CMOS chip providing an array of interdigitated gold electrode sensors, a quantitative multiplex miRNA detection method with electrochemical readout should be designed and investigated in this work. A fast and easy workflow, a high specificity and a good sensitivity without amplification or prelabeling of the target material were additional important goals. Several approaches were designed, tested, investigated, optimized and refined. In the end a method labeled as Sandwich Ligation Assay provided the best results. In this procedure, a tripartite hybridization complex is created by two double-stranded assay components and the target nucleic acid. This formation mediates a specific both-sided ligation of the miRNA to an immobilized capture strand on the sensor surface and to an enzyme-linked reporter strand. A subsequent washing step removes all excessive label conjugates from the sensor array. Thus only reporter enzymes that are covalently bound to the immobilized capture strand via the target miRNA are measured during detection. The acquired signal is therefore proportional to the initial concentration of the respective target. The Sandwich Ligation Assay was established and optimized using synthetic miRNAs. A sensitivity of less than 1 pM nucleic acid target could be achieved at a time to result of only 30 minutes. Generated concentration curves showed a linear dynamic range between 1 pM and 1 nM allowing a reliable quantification of detected miRNAs in this scope of measurement. Experiments with miRNAs of the let-7 family that exhibited only one or two nucleotide differences demonstrated a very good specificity of the presented method, as did the investigation of the influence of IsomiRs on the measurement signal. The ability of multiplex measurement was verified by the simultaneous quantification of up to eight miRNAs plus controls on one CMOS chip. The detection method was validated using total RNA extracts gained from whole blood samples. Therefore a cardiac panel composed of eight miRNA candidates was assorted by leveraging the results of studies about circulating miRNAs in heart disease. The optimized corresponding detection components were used to analyze endogenous miRNAs from donor blood. Five of the eight candidates showed a solid correlation between the applied amount of total RNA and the measurement signal as well as a good reproducibility of results with CV values ranging from 0.04 to 0.13. The concentrations of the three remaining miRNAs were too close to the lower detection limit and hence didn’t provide reliable data. A signal amplification using so-called branched DNA can be integrated into the measurement procedure to further enhance the sensitivity of the assay, if required. This was demonstrated by additional experiments of this thesis. A comparison between the Sandwich Ligation Assay and qRT-PCR showed only weak correlation of measurement results, which is in line with previous studies about interplatform comparability. Finally, the miRNAs of the cardiac panel were analyzed in total RNA samples extracted from whole blood of patients with myocardial infarction and controls using the established detection method. By comparison of the results dysregulations of the particular miRNAs miR-15a and miR-425 could successfully be identified. A respective diagnostic test using the proposed measurement procedure could provide an alternative or a complement to the currently applied immunoassays. KW - miRNS KW - Diagnostik KW - Molekulare Hybridisierung KW - Detektion KW - miRNA-Detektion KW - molecular diagnostics KW - point-of-care Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150949 ER - TY - THES A1 - Gschmack, Eva Maria T1 - Anti-Gehirn-Autoantikörper und deren Bedeutung bei Morbus Parkinson T1 - Anti-brain-Autoantibodies and their role in Parkinson's Disease N2 - Hintergrund: Die der Pathogenese von Morbus Parkinson (PD, Parkinson’s disease) zugrunde liegenden Mechanismen sind bis heute nur unvollständig verstanden. Insbesondere ist unklar, durch welche ursächlichen Faktoren Parkinson ausgelöst wird. Bei der HIV-Infektion treten bei vielen Patienten neurologische Störungen auf (HIV-Associated Neurological Disorders, HAND), die in der klinischen Symptomatik und der Lokalisation der betroffenen Gehirnareale dem Morbus Parkinson ähneln. Möglicherweise könnte eine Fehlregulation der Immunantwort eine Rolle als Auslöser beider Erkrankungen spielen. In dieser Arbeit wurde die Autoimmunantwort von PD- und HAND-Patienten und gesunden Kontrollen gegen verschiedene Gehirnhomogenate untersucht, die während der Parkinsonerkrankung in unterschiedlichem Ausmaß geschädigt werden. Das Autoimmun-Signal wurde quantifiziert und prominente Autoantigene wurden identifiziert. Methoden: In dieser Arbeit wurde ein Western-Blot-basiertes Verfahren zum Nachweis von Autoantikörpern gegen Gehirngewebe entwickelt. Dieses Verfahren wurde nach Optimierung mit Plasmaproben von gesunden Kontrollen, PD-Patienten und Patienten mit HIV-Infektion insbesondere an einer Gruppe von 40 Parkinson-Patienten (Durchschnittsalter 65 Jahre, 45 % weiblich) und 40 alters- und geschlechtsgemachten Kontrollen (Durchschnittsalter 62 Jahre, 50 % weiblich) angewendet und die humorale Autoimmunität gegen verschiedene Gehirnareale untersucht. Dazu wurden die verschiedenen Areale (dorsaler Motornucleus des Glossopharynx- und Vagusnervs (dm), Substantia nigra (SN), anteromedialer temporaler Mesocortex (MC), high order sensorische Assoziations- und präfrontale Felder (HC), first oder sensorische Assoziations- und prämotorische Felder, primäre sensorische und motorische Felder (FC)) von post-mortem Gehirnen homogenisiert, auf SDS-Gradienten-Gelen elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Die Membranen wurden mit den Plasmen inkubiert und gebundene Autoantikörper immunologisch detektiert. Die Signale wurden qualitativ und quantitativ ausgewertet. Mit Hilfe einer zweidimensionalen Elektrophorese und anschließender Immunfärbung wurden prominente Autoantigene durch Massenspektroskopie identifiziert. Ergebnisse: Mit dem in dieser Arbeit entwickelten Assay lässt sich die humorale Autoimmunantwort gegen Gehirngewebe semiquantitativ bestimmen. In allen untersuchten Proben konnten verschiedene Autoantikörper gegen unterschiedliche Antigene nachgewiesen werden. Der Gesamt-IgG-Gehalt der Plasmen unterscheidet sich weder zwischen PD-Patienten und gesunden Kontrollen, noch zwischen Männern und Frauen signifikant. Weibliche PD-Patienten zeigen signifikant stärkere Signale gegen dm als männliche (p = 0.02, Mann-Whitney-U-Test), der wiederum in jedem Patienten - unabhängig vom Geschlecht - von den untersuchten Hirnarealen signifikant stärker autoimmunologisch erkannt wird, als die übrigen Hirnareale (p < 0.0001, Friedman-ANOVA). In jedem Hirnareal wurden drei Banden besonders häufig erkannt (45, 40 und 37 kDa), jede davon am stärksten im dm (p < 0.0001, Friedman-ANOVA). Die Einzelanalysen der Signalintensitäten zeigt, dass PD-Patienten signifikant weniger Autoreaktivität gegen die 45 kDa-Bande in der SN (p = 0.056), im MC (p = 0.0277) und im FC (p = 0.0188) zeigen, als Kontrollen. Weitere Analysen zeigen, dass männliche PD-Patienten hochsignifikant weniger das 45 kDa-Protein im SN (p < 0.0001), MC (p = 0.0042) und FC (p = 0.0088) erkennen als Kontrollen, wohingegen bei den weiblichen Kontroll- und PD-Plasmen kein Unterschied festzustellen war. Ein weiteres Protein bei 160 kDa wird signifikant unterschiedlich stark in allen Gehirnarealen erkannt (p < 0.0001, Friedman-ANOVA), wobei die stärkste Immunreaktivität gegen FC besteht. Basierend auf dem Nachweis der 45 kDa-Bande aus der SN ergibt sich eine Odds Ratio für das Merkmal Parkinson von 3.38 (CI 1.11 – 10.30). Bei Männern ist diese Odds Ratio sogar 53.12 (CI 2.79 - 1012), bei Frauen 0.44 (CI 0.09 – 2.09). Die Sensitivität dieses Tests liegt bei Männern bei 1 (CI 0.84 – 1), die Spezifität bei 4.41 (0.31 – 0.78). Die negativ prädiktiven Werte liegen in allen Gruppen über 99.15 %. Die Identifizierung der Proteine mittels Massenspektroskopie ergab, dass es sich bei den 37 – 45 kDa Banden um Isoformen oder posttranslational modifizierte Formen des GFAP (glial fibrillary acidic protein), einem Bestandteil von Neurofilamenten v.a. in Astrozyten handelt. Außerdem wurde Fructose-Bisphosphate Aldolase A und Aspartat-Aminotransferase (mitochondriale Isoform 1 Vorläufer), beides Proteine des Kohlenhydrat-Stoffwechsels und der Glykolyse, als weitere Proteine mit ebenfalls 45 kDa identifiziert. Bei dem identifizierten Protein mit dem Molekulargewicht von 160 kDa handelt es sich wahrscheinlich um Dihydropyrimidinase-related protein 2, wie GFAP ebenfalls bei der Bildung des Zytoskeletts beteiligt. Diskussion: Autoantikörper gegen Gehirnantigene sind ein physiologisches Phänomen, das unabhängig von dem Vorliegen einer neurologischen Erkrankung besteht. Gehirnareale, die bei Parkinson besonders stark geschädigt werden, werden von dieser humoralen Autoimmunantwort besonders stark erkannt. Eine vorübergehende Permeabilisierung der Blut-Hirn-Schranke durch Infektion oder Trauma könnte den Zutritt der Autoantikörper zum Gehirn erlauben und so autoreaktive Prozesse in Gang setzen und zum Untergang dopaminerger Neuronen führen. Bei den identifizierten Proteinen handelt es sich um grundlegende Bestandteile eukaryotischer Zellen, was die Hypothese eines Art Beseitigungsmechanismus der Autoantikörper und damit die Aufgabe der Aufrechterhaltung der Homöostase darstellen könnte. Bei männlichen PD Patienten wird die 45 kDa Bande signifikant weniger stark von Auto-IgGs erkannt; dieser Mechanismus könnte somit in den männlichen PD-Patienten vermindert sein. Als Folge wäre die Ablagerung von Zelltrümmern im Gehirn vorstellbar, die dann auch langfristig eine Angriffsfläche für Autoimmunprozesse mit dem Verlust dopaminerger Neuronen bieten könnte. N2 - Background: The pathogenic mechanisms of Parkinson’s disease (PD) are not yet fully understood. Particularly the basic cause of the disease remains unclear. In HIV-Infection many patients show neurologic impairments (HIV-associated neurological disorders, HAND), which are similar in clinic symptoms and localization of the affected brain areas to these observed in Parkinson’s disease. Possibly a dysregulation of immunologic responses might play a role as a cause for PD. In this work autoimmune processes in PD- and HAND-patients as well as in healthy controls against different brain homogenates were measured, which are damaged in variable extent during pathogenesis of PD. The autoimmune-signal was quantified and prominent autoantigens were identified. Methods: In this work we established a Western-Blot-based method to detect autoantibodies against brain homogenates. After the optimization with plasma of healthy controls, PD-patients and HIV-infected patients, the technique was used to measure the humoral autoimmunity against different brain areas in a group of 40 PD-patients (mean age 65, 45 % females), and 40 age- and sex-matched controls (mean age 62 years, 50 % female). Different brain areas (of the dorsal motor nucleus of the glossopharyngeal and vagal nerves (dm), substantia nigra (SN), anteromedial temporal mesocortex (MC), high order sensory association areas and prefrontal fields (HC), first order sensory association areas, premotor areas, as well as primary sensory and motor fields (FC)) of post-mortem brains were homogenized, separated by gel electrophoresis and blotted on a nitrocellulose membrane. The membranes were incubated with plasma and bound antibodies were detected immunologically. The signals were analyzed by quality and quantity. With a two-dimensional electrophoresis and following immune staining prominent autoantigens were identified by mass spectroscopy. Results: With the established assay, the humoral autoimmunity against brain tissue can be analyzed semi-quantitatively. In all investigated samples several autoantibodies against different antigens could be proven. The overall IgG-content did not differ significantly between PD-patients and healthy controls, nor between men and women. Female PD-patients show significant stronger signals against dm than male (p = 0.02, Mann-Whitney-U-test), which was recognized significantly stronger than the other brain areas in each patient, independently from sex (p < 0.0001, Friedman-ANOVA). In each brain area 3 bands were recognized stronger than others (45, 40 and 37 kDa), each of them the strongest in dm (p < 0.0001, Friedman-ANOVA). The single analysis of the signal intensities show that PD-patients display significantly less autoreactivity against the 45 kDa-band in SN (p = 0.056), MC (p = 0.0277) and FC (p = 0.0188) than controls. Further analyses show that plasma of male PD-patients detect highly significantly less the 45 kDa-protein in SN (p < 0.0001), MC (p = 0.0042) and FC (p = 0.0088) than controls, whereas there was no difference measurable in female control- and PD-plasma. Another protein at 160 kDa is recognized at significantly different intensities in all brain areas (p < 0.0001, Friedman-ANOVA), whereas the strongest immunoreactivity is shown against FC. Based on the detection of the 45 kDa-band from the SN the odds ratio for the feature PD is 3.38 (CI 1.11 – 10.30). In men the odds ratio is even 53.12 (CI 2.79 - 1012), in female 0.44 (CI 0.09 – 2.09). The sensitivity for the test in the group of men displays 1 (CI 0.84 – 1), the specificity is 4.41 (0.31 – 0.78). The negative predictive values exceed 99.15 % in all investigated groups. The identification of the proteins by mass spectroscopy showed that the 37 – 45 kDa-bands might be isoforms of posttranslational modified forms of GFAP (glial fibrillary acidic protein), a part of neurofilaments in astrocytes. Furthermore, fructose-bisphosphate aldolase A and aspartate aminotransferase (mitochondrial isoform 1 precursor), both in the metabolism of carbon hydrates and glycolysis, have been identified for further 45 kDa-bands. The identified protein with a molecular weight of 160 kDa is probably dihydropyrimidinase-related protein 2, like GFAP involved in the formation of the cytoskeleton. Conclusion: The presence of anti-brain-autoantibodies are a physiological occurrence in human plasma, independent of the presence of neurological disease. Brain areas that are damaged prominently during the pathogenesis of PD are recognized stronger by humoral autoimmunity. A temporal permeabilization of the blood brain barrier through infection or trauma might allow autoantibodies access to the brain and initiate autoreactive processes that lead to the demise of dopaminergic neurons. The identified proteins are basic members of eukaryotic cells. This could suggest the hypothesis of sort of a cleaning mechanism of the antibodies, which might have the function of sustaining homeostasis. Male PD patients showed significantly decreased levels of autoreactive antibodies against the 45 kDa band in SN, MC and FC, which could enhance the accumulation of protein debris due to a missing removal mechanism and in long-distance might be responsible for neurodegenerative processes. KW - Parkinson-Krankheit KW - Autoantikörper KW - Parkinson Disease KW - anti-brain autoantibodies KW - GFAP KW - Gliafaserprotein KW - Anti-Gehirn Autoantikörper Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149348 ER - TY - THES A1 - Kunz, Meik T1 - Systembiologische Analysen von Interaktionen: Zytokinine (Pflanzenpathogene), 3D-Zellkulturen (Krebstherapie) und Drugtargets T1 - Systems biology analysis of interactions: Cytokinins (plant pathogens), 3D cell cultures (cancer therapy) and drug targets N2 - Der Einsatz von computergestützten Analysen hat sich zu einem festen Bestandteil der biowissenschaftlichen Forschung etabliert. Im Rahmen dieser vorliegenden Arbeit wurden systembiologische Untersuchungen auf verschiedene biologische Themengebiete und Organismen angewendet. In diesem Zusammenhang liefert die Arbeit einen innovativen und interdisziplinären methodischen Ansatz. Die grundlegende Frage lautet: Wie verstehe und beschreibe ich Signalwege und wie kann ich sie beeinflussen? Der Ansatz verknüpft verschiedene biologische Datensätze und Datenebenen miteinander, beginnend vom Genom und Interaktionskontext über semiquantitative Simulationen hin zu neuen Interventionen und Experimenten, welche therapeutisch und biotechnologisch genutzt werden können. Die Analysen können auf diese Weise - zu einem besseren Verständnis experimenteller Daten und biologischer Fragestellungen beitragen und ermöglichen ein systematisches Verständnis der zugrunde liegenden Signalwege und Netzwerkeffekte (z.B. in Pflanzen). - Darüber hinaus ermöglichen sie die Identifizierung wichtiger funktioneller Hubproteine und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für weitere experimentelle Testungen (z.B. Tumormodelle), - stellen zudem einen hilfreichen Schritt auf dem Weg zur personalisierten Medizin (z.B. lncRNAs und Tumormodelle) und Medikamentenentwicklung (z.B. Datenbank DrumPID) dar. (i) Als Grundlage wurde hierzu eine integrierte systembiologische Methode entwickelt, welche experimentelle Daten (z.B. Transkriptomdaten) hinsichtlich ihrer biologischen Funktionen untersucht und die Identifizierung relevanter funktioneller Cluster und Hubproteine ermöglicht. In einem ersten Teil wurden Analysen zum pflanzlichen Immunsystem durchgeführt. Mithilfe der entwickelten Methode wurden Genexpressionsdatensätze von A. thaliana, die mit dem Pathogen Pst DC3000 infiziert wurden, untersucht, um den Einfluss verschiedener Virulenzfaktoren auf das Interaktom der Wirtspflanze zu untersuchen und neue Modulatoren einer CK-vermittelten Immunabwehr zu finden. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass die von Pst DC3000 sekretierten Abwehrstoffe wichtige pflanzliche Hormonsignalwege für die Immunabwehr in A. thaliana beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen zudem, dass sich der Einfluss auf das Netzwerkverhalten der Effektorproteine und COR-Phytotoxine von dem der PAMPs unterscheidet, sich jedoch auch eine Regulierung gemeinsamer Signalwege und eine Überlappung der beiden Phasen der Immunantwort (PTI und ETI) in A. thaliana finden lassen. Die komplexe Immunantwort auf eine Infektion spiegelt sich zudem in einer höheren Anzahl an funktionellen Clustern und Hubproteinen in Pst DC3000 gegenüber den beiden untersuchten Mutanten wider, wobei sich für Pst DC3000 insbesondere ein stark vernetztes immunrelevantes Cluster um den JA-Signalweg zeigt. Weiterhin wurden anhand der entwickelten Methode wichtige Hubproteine für die Immunabwehr identifiziert. Als bedeutende Vertreter sind AHK2 und AAR14 zu nennen, welche Teil des Zweikomponentensystems der Signalübertragung von CK sind und hierbei wichtige Modulatoren für eine CK-vermittelte Immunabwehr darstellen. (ii) Im zweiten Teil der Arbeit schließen sich Untersuchungen an einem in vitro-Experiment einer 2D- und 3D-Zellkultur einer HSP90-Behandlung in einem Lungentumormodell an. In diesem Zusammenhang wurden mithilfe der entwickelten Methode Unterschiede zwischen den beiden Zellkultursystemen gefunden, die das unterschiedliche Behandlungsansprechen erklären, und für die beiden KRAS-mutierten Zelllinien A549 und H441 des 3D-Testsystems neue prognostische und therapeutische Kandidaten identifiziert. Hierbei haben die durchgeführten Analysen zwei funktionelle Cluster von Protein-Interaktionen um p53 und die STAT-Familie gefunden, welche eine Verbindung zu HSP90 haben und die entsprechenden Behandlungsunterschiede nach einer HSP90-Inhibierung zwischen den beiden Zellkultursystemen erklären können. Unter Berücksichtigung des zelllinien-spezifischen Mutationshintergrunds wurde eine prognostische Markersignatur und daraus abgeleitet HIF1A für die H441-Zelllinie und AMPK für die A549-Zelllinie als neue therapeutische Targets gefunden, wobei die anschließend durchgeführten in silico-Simulationen einen potentiellen therapeutischen Effekt aufzeigen konnten. Weiterhin wurden wichtige experimentelle Readout-Parameter in ein in silico-Lungentumormodell integriert, wobei unter Einbeziehung des Mutationshintergrunds für die verwendeten Zelllinien die HSP90-Behandlung des 3D-Testsystems computergestützt abgebildet werden konnte. Im weiteren Verlauf wurden im in silico-Lungentumormodell Resistenzmechanismen nach einer Gefitinib-Behandlung mit bekanntem Mutationsstatus für die Zelllinien HCC827 und A549 untersucht und daraus folgend neue Therapieansätze abgeleitet, die von potentieller klinischer Bedeutung sein können. Die durchgeführten in silico-Simulationen für HCC827 konnten hierbei zeigen, dass eine EGFR- und c-MET-Koaktivierung zu einer Gefitinib-Resistenz führen kann, wohingegen bei den A549 eine Komutation von KRAS und IGF-1R zu einem geringen Behandlungsansprechen beiträgt. Die Simulationen lassen zudem erkennen, dass eine direkte Inhibierung der an der Resistenzentwicklung beteiligten Rezeptoren c-MET und IGF-1R in beiden Fällen nicht die bestmögliche Therapiestrategie darstellt. In beiden Zelllinien konnte gezeigt werden, dass eine kombinierte Inhibierung von PI3K und MEK den bestmöglichen therapeutischen Effekt liefert, was demnach einen vielversprechenden Therapieansatz bei Gefitinib-resistenten Lungentumorpatienten darstellt. In einem weiteren Schritt wurde das therapeutische Potential der miRNA-21 im in silico-Modell für die HCC827-Zelllinie untersucht. Die durchgeführten Simulationen zeigen, dass eine miRNA-21-Überexpression zu einer Resistenzentwickung nach Gefitinib-Behandlung beitragen kann, wobei eine Inhibierung der miRNA-21 diesen Effekt umkehren kann. Die Ergebnisse lassen zudem erkennen, dass eine PTEN-Aktivierung als potentieller Marker einer erfolgreichen therapeutischen Inhibierung der miRNA-21 fungieren kann, wohingegen eine reduzierte miRNA-21-Expression als möglicher Marker für eine erfolgreiche Gefitinib-Behandlung dienen kann. (iii) Im dritten Teil der Arbeit wurden systematisch RNA- und Protein-Interaktionen untersucht. Hierzu wurden integrierte systembiologische Analysen an neu identifizierten und funktionell bislang unbekannten lncRNAs durchgeführt. Die Analysen für die infolge einer Herzhypertrophie hochregulierte lncRNA Chast haben umfassend gezeigt, dass diese Proteine und Transkriptionsfaktoren regulieren und binden kann, welche die Signalübertragung und Genexpression regulieren, aber auch eine Verbindung zum kardiovaskulären System und stressinduzierter Herzhypertrophie besitzt. Anhand der Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass Chast direkt und indirekt (a) Proteine binden und die Translation beeinflussen kann, zudem eine Chromatin-modifizierende Funktion besitzt und so die Transkription, z.B. für herz- und stress-assoziierte Gene, reguliert, und/oder (b) in einem negativen Feedbackloop seine eigene Transkription reguliert. Obwohl lncRNAs meist eine geringe Konservierung aufweisen, konnten die durchgeführten Analysen für Chast eine Sequenz-Struktur-Konservierung in Säugetieren aufzeigen. Weiterhin haben die Untersuchungen an zwei hypoxie-induzierten lncRNAs in Endothelzellen gezeigt, dass die lncRNA MIR503HG eine hohe Sequenz-Struktur-Konservierung in Säugetieren besitzt, wohingegen die LINC00323-003 eine geringe Konservierung aufzeigt. Dies untermauert die Tatsache, dass lncRNAs häufig eine geringe Konservierung aufweisen, was Untersuchungen in Modellorganismen hinsichtlich einer therapeutischen Nutzung schwierig machen. Da sich zahlreiche Untersuchungen auf Interaktionen und Signalwege konzentriert haben, wurde abschließend eine Datenbank entwickelt, welche Analysen von Protein-Interaktionen und Signalwegen nachhaltig voranbringt. Die entwickelte DrumPID-Datenbank stellt insbesondere die Interaktion zwischen einem Medikament und seinem Target in den Fokus und ermöglicht Analysen einzelner Interaktionen und beteiligter Signalwege, bietet zusätzlich aber auch verschiedene Links zu anderen Datenbanken für individuelle weiterführende Analysen. DrumPID ermöglicht ein geeignetes Medikament u. a. für ein vorgegebenes Zielprotein zu finden und dessen Wirkmechanismus und Interaktionskontext zu untersuchen, was zu einem besseren experimentellen Verständnis beitragen kann. Zudem erlaubt DrumPID eine potentielle chemische Leitstruktur für ein Zielprotein zu entwickeln, was z.B. spezifisch ein parasitisches Protein inhibiert, ohne dabei einen toxischen Effekt im Menschen zu haben. Zahlreiche weitere Pharmakabeispiele belegen, dass DrumPID für den täglichen wissenschaftlichen Gebrauch auf dem Gebiet der Analyse von Protein-Pharmaka-Interaktionen und der Medikamentenentwicklung geeignet ist. Die beschriebenen Ergebnisse der Promotionsarbeit wurden in fünf Originalarbeiten, zwei Übersichtsartikeln und einem Buchteil, u. a. in Science Translational Medicine, veröffentlicht, sechs dieser Publikationen erfolgten im Rahmen von Erstautorschaften. N2 - The use of computer-based analysis has become an integral part of life science research. Within this thesis, systems biology investigations have been applied to various biological topics and organisms which provides an innovative and interdisciplinary methodological approach. The basic question was: How do I understand and describe signaling pathways and how can I influence them? The approach combines various biological data sets and data levels starting from the genome and interaction context over semiquantitative simulations towards new interventions and experiments which can be used therapeutically and biotechnologically. The analysis can contribute to - a better understanding of experimental data and biological questions and enables a systematic understanding of the signaling pathways and network effects (e.g. in plants). - They enable the identification of important functional hub nodes as well as the development of new therapeutic strategies for further experimental testing (e.g. tumor models), - also representing a helpful step on the path to personalized medicine (e.g. lncRNAs and tumor models) and drug development (e.g. database DrumPID). (i) As a basis, an integrated systems biology methodology was developed which examines experimental data sets (e.g. transcriptome data) with respect to their biological functions and enables the identification of relevant functional clusters and hub nodes. In the first part of the thesis, analyzes regarding the plant immune system were accomplished. Using the developed methodology, gene expression datasets of A. thaliana infected with the pathogen Pst DC3000 were analyzed in order to investigate the influence of different virulence factors on the host interactome, and to find new modulators of CK-mediated immune defense. In this context, the analysis could show that the secreted defense compounds of Pst DC3000 influence important plant hormone signaling pathways for the immune defense in A. thaliana. Moreover, the results show that the impact on the network behavior of the effector proteins and COR phytotoxins differ from the PAMPs, but there also exists an overlap in common regulated signal pathways as well as an overlap between the two phases of immune response (PTI and ETI) in A. thaliana. In addition, the complex immune response to an infection is also reflected by a higher number of functional clusters and hub nodes in Pst DC3000 compared to the two studied mutants, whereby for Pst DC3000 a highly connected immune-relevant cluster around the JA pathway has been found. Furthermore, using the developed methodology several important hub nodes for the immune defense have been identified. As most important candidates, AHK2 and AAR14 have to be highlighted which are part of the two-component-system of signal transduction of CK and represent in this context important modulators for a CK mediated immune defense. (ii) In the second part of the thesis, analyzes of a HSP90 treatment in lung cancer in an in vitro experiment in 2D and 3D cell cultures were accomplished. In this context using the developed methodology, differences between the two cell cultures explaining the differences in treatment responses were found, and for the two KRAS mutated cell lines A549 and H441 of the 3D test system new prognostic marker and therapeutic drug candidates were identified. However, the analyzes found two functional clusters of protein interactions around p53 and the STAT family which have a connection to HSP90 and might explain the observed treatment differences for the HSP90 inhibition between the two cell culture systems. Considering the mutational background of the cell lines, a prognostic marker signature were found and derived from it HIF1A for the H441 cell line and AMPK for the A549 cell line as new therapeutic drug targets. Moreover, the subsequently performed in silico simulations could show a potential therapeutic effect of the identified drug targets. Furthermore, important experimental read-out parameters were integrated into the in silico lung tumor model, and by considering the mutation background of the used cell lines the HSP90 treatment of the 3D test system could be in silico simulated. In the further course of the thesis, resistance mechanisms after gefitinib treatment with known mutation status for the HCC827 and A549 cell lines were investigated in the in silico lung tumor model and consequently new therapeutic approaches were derived which may be of potential clinical relevance. Here, the in silico simulations for HCC827 cells show that a co-activation of EGFR and c-MET can lead to a gefitinib resistance, whereas in the A549 a co-mutation of KRAS and IGF-1R can contribute to the reduced treatment response. In addition, the simulations reveal that a direct inhibition of the resistance contributing receptors c-MET and IGF-1R reflect not the best treatment strategy in both cases. However, in both cell lines a combined inhibition of PI3K and MEK provides the best therapeutic effect, thus representing a promising new therapeutic approach in gefitinib resistant lung cancer patients. In a further step, the therapeutic potential of the miRNA-21 was examined in the in silico model for the HCC827 cells. The simulations show that an overexpression of the miRNA-21 can contribute to a resistance development after gefitinib treatment, in which an inhibition of the miRNA-21 reverses this effect. Moreover, the results show that a PTEN activation can function as a potential marker of therapeutic success of miRNA-21 inhibition whereas a reduced miRNA-21 expression may serve as a potential marker for a successful gefitinib treatment. (iii) In the third part of the thesis, systematic RNA and protein interactions were investigated. For this, integrated systems biology analyzes were carried out on new identified and previously functional unknown lncRNAs. The analyzes of the cardiac hypertrophy caused upregulated lncRNA Chast have extensive demonstrated that Chast can regulate and bind proteins and transcription factors which regulate signal transduction and gene expression, but it has also a connection to the cardiovascular system and stress-induced cardiac hypertrophy. Based on the results, it can be concluded that Chast can directly and indirectly (a) bind proteins and influence the translation but also possess a chromatin-modifying function and regulate transcription e.g. for cardiac and stress-associated genes, and/or (b) regulate its own transcription in a negative feedback loop. Although lncRNAs often have a low conservation the analysis could show a sequence-structure-conservation for Chast in mammalians. Furthermore, the investigations for two hypoxia induced endothelial lncRNAs have shown that the lncRNA MIR503HG represents a high sequence-structure-conservation in mammalians, whereas the LINC00323-003 shows a low conservation. This underscores the fact that lncRNAs often have a low conservation thereby making studies regarding the therapeutic potential in model organisms difficult. Finally, as numerous analyzes in this thesis have focused on interactions and signaling pathways, a database was developed which brings a sustainable progress in analysis of protein interactions and signaling pathways. The developed DrumPID database puts especially the interaction between a drug and its target into its focus and allows analysis of individual interactions and involved signaling pathways but, additionally, provides various crosslinks to other databases for individual further analysis. DrumPID enables to find a suitable drug, e.g. for a given target protein, and to analyze its mechanism of action as well as interaction context which can contribute to a better understanding of experimental data. Moreover, DrumPID allows to develop a potential chemical lead structure for a target protein which e.g. specifically inhibits a parasitic protein but has no toxic effect in humans. Numerous additional pharmaceutical examples verify that DrumPID is suitable for the daily scientific usage in the field of analysis of protein-drug-interactions and drug development. The described results of the doctoral thesis were published in five research papers, two review articles and a book chapter, e.g. in Science Translational Medicine, including six first authorships. KW - Systembiologie KW - Interaktionen KW - Zytokinine (Pflanzenpathogene) KW - 3D-Zellkulturen (Krebstherapie) KW - Drugtargets KW - Systembiologische Analysen Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134911 ER - TY - THES A1 - Wolf, Beat T1 - Reducing the complexity of OMICS data analysis T1 - Verringerung der Komplexität von OMICS Datenanalysen N2 - The field of genetics faces a lot of challenges and opportunities in both research and diagnostics due to the rise of next generation sequencing (NGS), a technology that allows to sequence DNA increasingly fast and cheap. NGS is not only used to analyze DNA, but also RNA, which is a very similar molecule also present in the cell, in both cases producing large amounts of data. The big amount of data raises both infrastructure and usability problems, as powerful computing infrastructures are required and there are many manual steps in the data analysis which are complicated to execute. Both of those problems limit the use of NGS in the clinic and research, by producing a bottleneck both computationally and in terms of manpower, as for many analyses geneticists lack the required computing skills. Over the course of this thesis we investigated how computer science can help to improve this situation to reduce the complexity of this type of analysis. We looked at how to make the analysis more accessible to increase the number of people that can perform OMICS data analysis (OMICS groups various genomics data-sources). To approach this problem, we developed a graphical NGS data analysis pipeline aimed at a diagnostics environment while still being useful in research in close collaboration with the Human Genetics Department at the University of Würzburg. The pipeline has been used in various research papers on covering subjects, including works with direct author participation in genomics, transcriptomics as well as epigenomics. To further validate the graphical pipeline, a user survey was carried out which confirmed that it lowers the complexity of OMICS data analysis. We also studied how the data analysis can be improved in terms of computing infrastructure by improving the performance of certain analysis steps. We did this both in terms of speed improvements on a single computer (with notably variant calling being faster by up to 18 times), as well as with distributed computing to better use an existing infrastructure. The improvements were integrated into the previously described graphical pipeline, which itself also was focused on low resource usage. As a major contribution and to help with future development of parallel and distributed applications, for the usage in genetics or otherwise, we also looked at how to make it easier to develop such applications. Based on the parallel object programming model (POP), we created a Java language extension called POP-Java, which allows for easy and transparent distribution of objects. Through this development, we brought the POP model to the cloud, Hadoop clusters and present a new collaborative distributed computing model called FriendComputing. The advances made in the different domains of this thesis have been published in various works specified in this document. N2 - Das Gebiet der Genetik steht vor vielen Herausforderungen, sowohl in der Forschung als auch Diagnostik, aufgrund des "next generation sequencing" (NGS), eine Technologie die DNA immer schneller und billiger sequenziert. NGS wird nicht nur verwendet um DNA zu analysieren sondern auch RNA, ein der DNA sehr ähnliches Molekül, wobei in beiden Fällen große Datenmengen zu erzeugt werden. Durch die große Menge an Daten entstehen Infrastruktur und Benutzbarkeitsprobleme, da leistungsstarke Computerinfrastrukturen erforderlich sind, und es viele manuelle Schritte in der Datenanalyse gibt die kompliziert auszuführen sind. Diese beiden Probleme begrenzen die Verwendung von NGS in der Klinik und Forschung, da es einen Engpass sowohl im Bereich der Rechnerleistung als auch beim Personal gibt, da für viele Analysen Genetikern die erforderlichen Computerkenntnisse fehlen. In dieser Arbeit haben wir untersucht wie die Informatik helfen kann diese Situation zu verbessern indem die Komplexität dieser Art von Analyse reduziert wird. Wir haben angeschaut, wie die Analyse zugänglicher gemacht werden kann um die Anzahl Personen zu erhöhen, die OMICS (OMICS gruppiert verschiedene Genetische Datenquellen) Datenanalysen durchführen können. In enger Zusammenarbeit mit dem Institut für Humangenetik der Universität Würzburg wurde eine graphische NGS Datenanalysen Pipeline erstellt um diese Frage zu erläutern. Die graphische Pipeline wurde für den Diagnostikbereich entwickelt ohne aber die Forschung aus dem Auge zu lassen. Darum warum die Pipeline in verschiedenen Forschungsgebieten verwendet, darunter mit direkter Autorenteilname Publikationen in der Genomik, Transkriptomik und Epigenomik, Die Pipeline wurde auch durch eine Benutzerumfrage validiert, welche bestätigt, dass unsere graphische Pipeline die Komplexität der OMICS Datenanalyse reduziert. Wir haben auch untersucht wie die Leistung der Datenanalyse verbessert werden kann, damit die nötige Infrastruktur zugänglicher wird. Das wurde sowohl durch das optimieren der verfügbaren Methoden (wo z.B. die Variantenanalyse bis zu 18 mal schneller wurde) als auch mit verteiltem Rechnen angegangen, um eine bestehende Infrastruktur besser zu verwenden. Die Verbesserungen wurden in der zuvor beschriebenen graphischen Pipeline integriert, wobei generell die geringe Ressourcenverbrauch ein Fokus war. Um die künftige Entwicklung von parallelen und verteilten Anwendung zu unterstützen, ob in der Genetik oder anderswo, haben wir geschaut, wie man es einfacher machen könnte solche Applikationen zu entwickeln. Dies führte zu einem wichtigen informatischen Result, in dem wir, basierend auf dem Model von „parallel object programming“ (POP), eine Erweiterung der Java-Sprache namens POP-Java entwickelt haben, die eine einfache und transparente Verteilung von Objekten ermöglicht. Durch diese Entwicklung brachten wir das POP-Modell in die Cloud, Hadoop-Cluster und präsentieren ein neues Model für ein verteiltes kollaboratives rechnen, FriendComputing genannt. Die verschiedenen veröffentlichten Teile dieser Dissertation werden speziel aufgelistet und diskutiert. KW - Bioinformatik KW - Humangenetik KW - OMICS KW - Distributed computing KW - User interfaces KW - Verteiltes Datenbanksystem Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153687 ER - TY - THES A1 - Slaby, Beate Magdalena T1 - Exploring the microbiome of the Mediterranean sponge \(Aplysina\) \(aerophoba\) by single-cell and metagenomics T1 - Untersuchungen am Mikrobiom des Mittelmeerschwamms \(Aplysina\) \(aerophoba\) mittels Einzelzell- und Metagenomik N2 - Sponges (phylum Porifera) are evolutionary ancient, sessile filter-feeders that harbor a largely diverse microbial community within their internal mesohyl matrix. Throughout this thesis project, I aimed at exploring the adaptations of these symbionts to life within their sponge host by sequencing and analyzing the genomes of a variety of bacteria from the microbiome of the Mediterranean sponge Aplysina aerophoba. Employed methods were fluorescence-activated cell sorting with subsequent multiple displacement amplification and single-cell / ‘mini-metagenome’ sequencing, and metagenomic sequencing followed by differential coverage binning. These two main approaches both aimed at obtaining genome sequences of bacterial symbionts of A. aerophoba, that were then compared to each other and to references from other environments, to gain information on adaptations to the host sponge environment and on possible interactions with the host and within the microbial community. Cyanobacteria are frequent members of the sponge microbial community. My ‘mini-metagenome’ sequencing project delivered three draft genomes of “Candidatus Synechococcus spongiarum,” the cyanobacterial symbiont of A. aerophoba and many more sponges inhabiting the photic zone. The most complete of these genomes was compared to other clades of this symbiont and to closely related free-living cyanobacterial references in a collaborative project published in Burgsdorf I*, Slaby BM* et al. (2015; *shared first authorship). Although the four clades of “Ca. Synechococcus spongiarum” from the four sponge species A. aerophoba, Ircinia variabilis, Theonella swinhoei, and Carteriospongia foliascens were approximately 99% identical on the level of 16S rRNA gene sequences, they greatly differed on the genomic level. Not only the genome sizes were different from clade to clade, but also the gene content and a number of features including proteins containing the eukaryotic-type domains leucine-rich repeats or tetratricopeptide repeats. On the other hand, the four clades shared a number of features such as ankyrin repeat domain-containing proteins that seemed to be conserved also among other microbial phyla in different sponge hosts and from different geographic locations. A possible novel mechanism for host phagocytosis evasion and phage resistance by means of an altered O antigen of the lipopolysaccharide was identified. To test previous hypotheses on adaptations of sponge-associated bacteria on a broader spectrum of the microbiome of A. aerophoba while also taking a step forward in methodology, I developed a bioinformatic pipeline to combine metagenomic Illumina short-read sequencing data with PacBio long-read data. At the beginning of this project, no pipelines to combine short-read and long-read data for metagenomics were published, and at time of writing, there are still no projects published with a comparable aim of un-targeted assembly, binning and analysis of a metagenome. I tried a variety of assembly programs and settings on a simulated test dataset reflecting the properties of the real metagenomic data. The developed assembly pipeline improved not only the overall assembly statistics, but also the quality of the binned genomes, which was evaluated by comparison to the originally published genome assemblies. The microbiome of A. aerophoba was studied from various angles in the recent years, but only genomes of the candidate phylum Poribacteria and the cyanobacterial sequences from my above-described project have been published to date. By applying my newly developed assembly pipeline to a metagenomic dataset of A. aerophoba consisting of a PacBio long-read dataset and six Illumina short-read datasets optimized for subsequent differential coverage binning, I aimed at sequencing a larger number and greater diversity of symbionts. The results of this project are currently in review by The ISME Journal. The complementation of Illumina short-read with PacBio long-read sequencing data for binning of this highly complex metagenome greatly improved the overall assembly statistics and improved the quality of the binned genomes. Thirty-seven genomes from 13 bacterial phyla and candidate phyla were binned representing the most prominent members of the microbiome of A. aerophoba. A statistical comparison revealed an enrichment of genes involved in restriction modification and toxin-antitoxin systems in most symbiont genomes over selected reference genomes. Both are defense features against incoming foreign DNA, which may be important for sponge symbionts due to the sponge’s filtration and phagocytosis activity that exposes the symbionts to high levels of free DNA. Also host colonization and matrix utilization features were significantly enriched. Due to the diversity of the binned symbiont genomes, a within-symbionts genome comparison was possible, that revealed three guilds of symbionts characterized by i) nutritional specialization on the metabolization of carnitine, ii) specialization on sulfated polysaccharides, and iii) apparent nutritional generalism. Both carnitine and sulfated polysaccharides are abundant in the sponge extracellular matrix and therefore available to the sponge symbionts as substrates. In summary, the genomes of the diverse community of symbionts in A. aerophoba were united in their defense features, but specialized regarding their nutritional preferences. N2 - Schwämme (Phylum Porifera) sind evolutionär alte, sessile Filtrierer, die eine äußerst vielfältige mikrobielle Gemeinschaft in ihrer internen Mesohylmatrix beherbergen. Das Ziel meiner Doktorarbeit war es, die Anpassungen dieser Symbionten an das Leben in ihrem Schwammwirt zu erforschen. Dazu habe ich die Genome einer Vielzahl von Bakterien aus dem Mikrobiom des Mittelmeer-Schwammes Aplysina aerophoba sequenziert und analysiert. Meine angewandten Methoden waren die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit anschließender so genannter „multiple displacement amplification“ und Einzelzell- / „Mini-Metagenom“-Sequenzierung und metagenomischer Sequenzierung gefolgt von „differential coverage binning“. Diese beiden Ansätze zielten darauf ab, Genomsequenzen von bakteriellen Symbionten von A. aerophoba zu erhalten, die dann sowohl miteinander, als auch mit Referenzen aus anderen Habitaten verglichen wurden. So sollten Informationen gewonnen werden über Anpassungen an ein Leben im Wirtsschwamm und über mögliche Interaktionen mit dem Wirt und innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft. Cyanobakterien sind häufig Mitglieder der bakteriellen Gemeinschaft in Schwämmen. Mein "Mini-Metagenom"-Sequenzierprojekt lieferte drei Genom-Entwürfe von „Candidatus Synechococcus spongiarum,“ dem cyanobakteriellen Symbionten von A. aerophoba und vieler weiterer Schwämme, die die photische Zone bewohnen. Das vollständigste dieser Genome wurden mit anderen Kladen dieses Symbionten verglichen und mit nah verwandten, freien lebenden Cyanobakterien-Referenzen in Burgsdorf I *, Slaby BM * et al. (2015; * geteilte Erstautorenschaft). Obwohl die vier Kladen von „Ca. Synechococcus spongiarum“ aus den vier Schwammarten A. aerophoba, Ircinia variabilis, Theonella swinhoei und Carteriospongia foliascens auf der Ebene der 16S-rRNA-Gensequenzen zu etwa 99% identisch waren, unterschieden sie sich deutlich auf Genom-Ebene. Nicht nur die Genomgrößen waren von Klade zu Klade verschieden, sondern auch der Gengehalt und eine Reihe von Merkmalen, einschließlich Proteinen mit genannten „eukaryotic-like domains,“ leucinreiche „repeats“ oder Tetratricopeptid-„repeats“. Auf der anderen Seite teilten die vier Kladen eine Reihe von Merkmalen wie Ankyrin-„repeat“-Domänen-haltige Proteine, die auch in anderen Phyla von Schwammsymbionten in verschiedenen Wirtsschwämmen und aus verschiedenen geografischen Orten konserviert zu sein schienen. Ein möglicher neuartiger Mechanismus zur Phagozytose-Vermeidung und zur Phagenresistenz mittels eines veränderten O-Antigens des Lipopolysaccharids wurde identifiziert. Um vorherige Hypothesen über die Anpassung von Schwamm-assoziierten Bakterien auf ein breiteres Spektrum des Mikrobioms von A. aerophoba zu testen und gleichzeitig in der Methodik voran zu schreiten, entwickelte ich einen bioinformatischen Arbeitsablauf, um metagenomische Illumina-„short-read“-Sequenzdaten mit PacBio-„long-reads“ zu kombinieren. Zu Beginn dieses Projektes gab es keine veröffentlichte Methodik zur Verknüpfung von „short-reads“ und „long-reads“ für die Metagenomik, und auch jetzt gibt es keine veröffentlichten Projekte mit einem vergleichbaren Ziel von nicht-gezieltem „Assembly“, „Binning“ und Analyse eines Metagenoms. Ich habe eine Auswahl von „Assembly“-Programmen und Einstellungen auf einem simulierten Testdatensatz getestet, der die Eigenschaften der realen metagenomischen Daten widerspiegelt. Die entwickelte „Assembly“-Methode verbesserte nicht nur die Gesamtstatistik, sondern auch die Qualität der einzelnen, „gebinnten“ Genome, die durch Vergleich zu den ursprünglich veröffentlichten Genom-Sequenzen evaluiert wurde. Das Mikrobiom von A. aerophoba wurde in den letzten Jahren aus verschiedenen Blickwinkeln untersucht, aber nur Genome des Candidatus-Phylum Poribakterien und die Cyanobakteriensequenzen aus meinem oben beschriebenen Projekt wurden bisher veröffentlicht. Durch die Anwendung meiner neu entwickelten „Assembly“-Methodik auf einen metagenomischen Datensatz von A. aerophoba bestehend aus einem PacBio-„long-read“-Datensatz und sechs Illumina-„short-read“-Datensätzen, die für das anschließende „differential coverage binning“ optimiert waren, zielte ich darauf ab, eine größere Anzahl und Vielfalt von Symbionten zu sequenzieren. Die Ergebnisse dieses Projektes sind derzeit bei The ISME Journal in Review. Die Komplementierung von Illumina „short-read“ mit PacBio „long-read“-Sequenzdaten für das „binning“ dieses hochkomplexen Metagenoms hat die Gesamt-„assembly“-Statistik sowie die Qualität der „gebinnten“ Genome deutlich verbessert. Siebenunddreißig Genome aus 13 Bakterienphyla und Candidatus-Phyla wurden „gebinnt“, die die prominentesten Mitglieder des Mikrobioms von A. aerophoba darstellten. Ein statistischer Vergleich zeigte eine Anreicherung von Genen, die mit Restriktionsmodifikationen und Toxin-Antitoxin-Systemen zusammenhängen, in den meisten Symbionten-Genomen im Vergleich zu ausgewählten Referenzgenomen. Beides sind Mechanismen zur Verteidigung gegen eindringende Fremd-DNA, die für Schwamm-Symbionten aufgrund der Schwamm-Filtration und Phagozytose-Aktivität wichtig sein können, die die Symbionten hohen Konzentrationen von freier DNA aussetzen. Auch mögliche Wirtskolonisations- und Matrixnutzungsmechanismen waren signifikant angereichert. Wegen der Vielfalt der „gebinnten“ Symbionten-Genome war ein Genom-Vergleich innerhalb der Symbionten möglich, der drei Gilden von Symbionten zum Vorschein brachte, die gekennzeichnet waren durch i) Ernährungsspezialisierung auf die Metabolisierung von Carnitin, ii) Spezialisierung auf sulfatierte Polysaccharide und iii) scheinbaren Nahrungs-Generalismus. Sowohl Carnitin als auch sulfatierte Polysaccharide sind in der extrazellulären Schwammmatrix reichlich vorhanden und stehen so den Schwammsymbionten als Substrat zur Verfügung. Die Genome der diversen Symbionten-Gemeinschaft in A. aerophoba waren in ihren Verteidigungsmechanismen vereint, aber spezialisiert hinsichtlich ihrer Ernährung. KW - Metagenom KW - metagenomics KW - single-cell genomics KW - sponge microbiome KW - differential coverage binning KW - PacBio sequencing KW - Illumina HiSeq KW - hybrid assembly KW - Aplysina aerophoba KW - Mikroorganismus Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151869 ER -