TY - THES A1 - Rücker, Viktoria T1 - Time trends and determinants of stroke mortality in Germany T1 - Zeitliche Trends und Einflussfaktoren auf die Schlaganfall-Sterblichkeit in Deutschland N2 - In several countries, a decline in mortality, case-fatality and recurrence rates of stroke was observed. However, studies investigating sex-specific and subtype-specific (pathological and etiological) time trends in stroke mortality, case-fatality and recurrence rates are scarce, especially in Germany. The decline in ischemic stroke mortality and case-fatality might be associated with the high quality of acute care of ischemic stroke, but the exact determinants of early outcome remains unknown for Germany. Therefore, as first step of this thesis, we investigated the time trends of subtype- and sex-specific age- standardized stroke mortality rates in Germany from 1998 to 2015, by applying joinpoint regression on official causes of death statistics, provided by the Federal Statistical Office. Furthermore, a regional comparison of the time trends in stroke mortality between East and West was conducted. In the second step, time trends in case-fatality and stroke recurrence rates were analyzed using data from a population- based stroke register in Germany between 1996 and 2015. The analysis was stratified by sex and etiological subtype of ischemic stroke. In the third step, quality of stroke care and the association between adherence to measures of quality of acute ischemic stroke care and in-hospital mortality was estimated based on data from nine regional hospital-based stroke registers in Germany from the years 2015 and 2016. We showed that in Germany, age-standardized stroke mortality declined by over 50% from 1998 to 2015 both, in women and men. Stratified by the pathological subtypes of stroke, the decrease in mortality was larger in ischemic stroke compared to hemorrhagic stroke. Different patterns in the time trends of stroke were observed for stroke subtypes, regions in Germany (former Eastern part of Germany (EG), former Western part of Germany (WG)) and sex, but in all strata a decline was found. By applying joinpoint regression, the number of changes in time trend differed between the regions and up to three changes in the trend in ischemic stroke mortality were detected. Trends in hemorrhagic stroke were in parallel between the regions with up to one change (in women) in joinpoint regression. Comparing the regions, stroke mortality was higher in EG compared to WG throughout the whole observed time period, however the differences between the regions started to diminish from 2007 onwards. Further it was found that, based on the population-based Erlangen Stroke Project (ESPro), case-fatality and recurrence rates in ischemic stroke patients are still high in Germany. 46% died and 20% got a recurrent stroke within the first five years after stroke. Case-fatality rates declined statistically significant from 1996 to 2015 across all ischemic stroke patients and all etiological subtypes of ischemic stroke. Based on Cox regression no statistically significant decrease in stroke recurrence was observed. Based on the pooled data of nine regional hospital-based stroke registers from the years 2015 and 2016 covering about 80% of all hospitalized stroke patients in Germany, a high quality of care of acute ischemic stroke patients, measured via 11 evidence-based quality indicators (QI) of process of care, was observed. Across all registers, most QI reached the predefined target values for good quality of stroke care. 9 out of 11 QI showed a significant association with 7-day in-hospital mortality. An inverse linear association between overall adherence to QI and 7-day in-hospital mortality was observed. In conclusion, stroke mortality and case-fatality showed a favorable development over time in Germany, which might partly be due to improvements in acute treatment. This is supported by the association between overall adherence to quality of care and in-hospital mortality. However, there might be room for improvements in long-term secondary prevention, as no clear reduction in recurrence rates was observed. N2 - Ein Rückgang der Mortalität-, Letalität- und Rezidivraten nach einem Schlaganfall konnte in einigen Ländern in den letzten Jahren beobachtet werden. Es gibt, insbesondere für Deutschland, jedoch nur wenige Daten, die diese zeitlichen Trends stratifiziert nach Geschlecht und Schlaganfallsubtyp (pathologischer und ätiologischer Subtyp) ausgewertet haben. Der Rückgang der Mortalität und Letalität nach ischämischem Schlaganfall könnte mit der beobachteten hohen Qualität der Versorgung des akuten ischämischen Schlaganfalls zusammenhängen, jedoch sind für Deutschland die genauen Determinanten der frühen Sterblichkeit nach Schlaganfall noch unbekannt. Aus diesem Grunde wurden in der vorliegenden Dissertation, im ersten Schritt zeitliche Trends von 1998 bis 2015 der altersstandardisierten und nach Subtyp und Geschlecht stratifizierten Mortalitätsraten untersucht. Dazu wurden die vom Statistischen Bundesamtes bereitgestellten Daten zur Todesursachenstatistik mittels Joinpoint Regression ausgewertet. Zusätzlich wurde ein regionaler Vergleich der zeitlichen Trends in der Schlaganfallmortalität zwischen der östlichen und westlichen Region von Deutschland durchgeführt. Im zweiten Schritt, wurde basierend auf einem deutschem bevölkerungsbasierten Schlaganfallregister mittels Cox Regression die zeitlichen Trends der Letalitätsraten und Rezidivraten des ischämischen Schlaganfalls zwischen 1996 und 2015 geschätzt. Die Analyse wurde stratifiziert nach Geschlecht und ätiologischem Subtyp des ischämischen Schlaganfalls. Im dritten Schritt wurde, basierend auf Daten von neun regionalen krankenhausbasierten Schlaganfallregistern der Jahre 2015 und 2016, die Qualität der Behandlung des akuten ischämischen gemessen und ein möglicher Zusammenhang zwischen dem Grad der Erfüllung von evidenzbasierten Qualitätsindikatoren und der Krankenhaussterblichkeit untersucht. Wir konnten zeigen, dass von 1998 bis 2015 die altersstandardisierten Schlaganfall Mortalitätsraten über 50%, sowohl bei Männern als auch bei Frauen, abgenommen haben. Stratifiziert nach pathologischem Schlaganfallsubtyp zeigte sich ein stärkerer Rückgang in den Mortalitätsraten nach ischämischem Schlaganfall als in der Mortalitätsrate nach hämorrhagischem Schlaganfall. In allen Strata sind die Mortalitätsraten gesunken, jedoch unterschieden sich die zeitlichen Verläufe zwischen den Strata (Geschlecht, Region). Die mittels Joinpoint Regression geschätzten Anzahlen an Änderungen im zeitlichen Trend der ischämischen Schlaganfall Mortalitätsraten variierten zwischen 0 und maximal 3 Änderungen, zwischen den Regionen und Geschlechtern. Die zeitlichen Trends der Mortalitätsraten nach hämorrhagischem Schlaganfall der beiden Regionen verliefen hingegen parallel zueinander und es zeigte sich nur bei Frauen eine Änderung in der Mortalitätsrate nach der Joinpoint Regression. Die Schlaganfall Mortalitätsraten im östlichen Teil von Deutschland waren über die gesamte Zeit hinweg höher als im westlichen Teil von Deutschland, jedoch glichen sich die Raten ab 2007 immer mehr einander an und es zeigte sich nur noch ein geringer Unterschied in 2015. Die altersadjustierten Letalitätsraten und Rezidivraten nach ischämischem Schlaganfall waren in Deutschland, basierend auf Daten des bevölkerungsbasierten Erlanger Schlaganfall Registers, relativ hoch. Innerhalb der ersten fünf Jahre nach einem ischämischen Schlaganfall sterben 46% und 20% aller Patienten bekommen einen erneuten Schlaganfall. Von 1996 bis 2015 haben die Letalitätsraten nach Schlaganfall signifikant abgenommen, dies zeigte sich in allen Subtypen des ischämischen Schlaganfalls. Die Rezidivraten zeigten keinen signifikanten Rückgang. Basierend auf gepoolten Daten aus den Jahren 2015/2016 von neun krankenhausbasierten Schlaganfall Registern in Deutschland, die ca. 80% aller hospitalisierten Schlaganfälle in Deutschland abdecken, ist die, mittels 11 evidenzbasierter Prozessindikatoren gemessene Qualität der Behandlung des ischämischen Schlaganfalls, hoch. In allen Registern lagen die meisten Qualitätsindikatoren über dem vorabdefinierten Referenzwert für eine gute Qualität an Schlaganfallversorgung. Ein Zusammenhang zwischen 7-Tage Krankenhaussterblichkeit und Erfüllung von einzelnen Qualitätsindikatoren, konnte bei 9 von 11 Qualitätsindikatoren gezeigt werden. Zusätzlich zeigte sich ein inverser Zusammenhang zwischen der Gesamteinhaltung von Qualitätsindikatoren und 7-Tage Krankenhaussterblichkeit. Schlaganfall Mortalitätsrate und Letalitätsraten zeigten eine positive Entwicklung in allen Subtypen des Schlaganfalls über die letzten 20 Jahre. Dies könnte mit Verbesserungen in der Behandlung des akuten ischämischen Schlaganfalls im Krankenhaus zusammenhängen, da ein Zusammenhang zwischen der Erfüllung von Qualitätsindikatoren und der Krankenhaussterblichkeit besteht. Jedoch besteht möglicherweise noch Verbesserungspotenzial in der langfristigen Sekundärprävention, da in den Rezidivraten kein klarer Rückgang erkennbar war. KW - Schlaganfall KW - Sterblichkeit KW - Rezidiv KW - Letalität KW - Trend KW - Qualitätsindikator Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233116 ER - TY - THES A1 - Ye, Mingyu T1 - Immunotherapy with Vaccinia virus co-expressing tumor-associated antigens and mouse IL-2 cytokine in mice with mammary cancer T1 - Immuntherapie von Brustkrebs in tumortragenden Mäusen mit genetisch modifizierten Vaccinia Viren, die simultan Interleukin-2 und tumorassoziierte Antigene exprimieren N2 - Interleukin 2 (IL-2) was the first cytokine applied for cancer treatment in human history. It has been approved as monotherapy for renal cell carcinoma and melanoma by the FDA and does mediate the regression of the tumors in patients. One of the possible mechanisms is that the administration of IL-2 led to T lymphocytes expansion, including CD4+ and CD8+ T cells. In addition, a recent study demonstrated that antigen-specific T cells could also be expanded through the induction of IL-2, which plays a crucial role in mediating tumor regression. However, despite the long-term and extensive use of IL-2 in the clinic, the ratio of patients who get a complete response was still low, and only about one-fifth of patients showed objective tumor regression. Therefore, the function of IL-2 in cancer treatment should continue to be optimized and investigated. A study by Franz O. Smith et al. has shown that the combination treatment of IL-2 and tumor-associated antigen vaccine has a strong trend to increased objective responses compared to patients with melanoma receiving IL-2 alone. Peptide vaccines are anti-cancer vaccines able to induce a powerful tumor antigenspecific immune response capable of eradicating the tumors. According to the type of antigens, peptide vaccines can be classified into two distinct categories: Tumor-associated antigens (TAA) vaccine and tumor-specific neoantigens (TSA) vaccine. Currently, Peptide vaccines are mainly investigated in phase I and phase II clinical trials of human cancer patients with various advanced cancers such as lung cancer, gastrointestinal tumors, and breast cancers. Vaccinia virus (VACV) is one of the safest viral vectors, which has been wildly used in cancer treatment and pathogen prevention. As an oncolytic vector, VACV can carry multiple large foreign genes, which enable the virus to introduce diagnostic and therapeutic agents without dramatically reducing the viral replication. Meanwhile, the recombinant vaccinia virus (rVACV) can be easily generated by homologous recombination. Here, we used the vaccinia virus as the therapeutic cancer vector, expressing mouse Interleukin 2 (IL-2) and tumor-associated antigens simultaneously to investigate the combined effect of anti-tumor immune response in the 4T1 mouse tumor model. As expected, the VACV driven mIL-2 expression remarkably increased both CD4+ and CD8+ populations in vivo, and the virus-expressed tumor-associated peptides successfully elicited theantigen-specific T cell response to inhibit the growth of tumors. Furthermore, the experiments with tumor-bearing animals showed that the mIL-2 plus tumor antigens expressing VACV vector gave a better anti-cancer response than the mIL-2 alone expressing vector. The combinations did significantly more inhibit tumor growth than mIL-2 treatment alone. Moreover, the results confirmed our previous unpublished data that the mIL-2 expression driven by synthetic early/late promoter in the Lister strain VACV could enhance the tumor regression in the 4T1 mouse model. N2 - Interleukin 2 (IL-2) war das erste Zytokin in der Geschichte des Menschen, das zur Krebsbehandlung eingesetzt wurde. Es ist von der FDA als Monotherapie für Nierenzellkarzinome und Melanome zugelassen und kann bei Patienten die Rückbildung von Tumorerkrankungen fördern. Einer der möglichen Mechanismen ist, dass die Verabreichung von IL-2 zu einer T-Zell- Expansion führte. Darüber hinaus zeigte eine aktuelle Studie, dass auch antigenspezifische T- Zellen vermehrt werden können, was eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der Tumorregression spielt. Trotz des langjährigen und umfangreichen Einsatzes von IL-2 in der Klinik war der Anteil der Patienten, die eine komplette Antwort Zeigten, jedoch immer noch gering, und nur etwa ein Fünftel der Patienten weist eine objektive Tumorregression auf. Daher sollte die Funktion von IL-2 in der Krebsbehandlung weiter optimiert und untersucht werden. Eine Studie von Franz O. Smith et al. hat gezeigt, dass die Kombinationsbehandlung von IL-2 und tumorassoziiertem Antigenimpfstoff im Vergleich zu Melanomapatienten, die IL-2 allein erhalten, einen starken Trend zu verstärkten objektiven Reaktionen aufweist. Peptidimpfstoff ist ein Anti- Krebs-Impfstoff, der in der Lage ist, eine starke tumorantigenspezifische Immunantwort zu induzieren, die die Tumore ausrotten kann. Je nach Art der Antigene kann es in zwei verschiedene Kategorien eingeteilt werden: Impfstoff gegen tumorassoziierte Antigene (TAA) und Impfstoff gegen tumorspezifische Neoantigene (TSA). Derzeit werden Peptidimpfstoffe hauptsächlich in klinischen Studien in Phasen I und II an Patienten mit verschiedenen fortgeschrittenen Krebsarten wie Lungenkrebs, Magen-Darm-Tumoren und Brustkrebs untersucht ... KW - Immunotherapy KW - Vaccinia virus Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-253095 ER - TY - THES A1 - Selig, Christian T1 - The ITS2 Database - Application and Extension N2 - Der internal transcribed spacer 2 (ITS2) des ribosomalen Genrepeats ist ein zunehmend wichtiger phylogenetischer Marker, dessen RNA-Sekundärstruktur innerhalb vieler eukaryontischer Organismen konserviert ist. Die ITS2-Datenbank hat zum Ziel, eine umfangreiche Ressource für ITS2-Sequenzen und -Sekundärstrukturen auf Basis direkter thermodynamischer als auch homologiemodellierter RNA-Faltung zu sein. Ergebnisse: (a) Eine komplette Neufassung der ursprünglichen die ITS2-Datenbank generierenden Skripte, angewandt auf einen aktuellen NCBI-Datensatz, deckte mehr als 65.000 ITS2-Strukturen auf. Dies verdoppelt den Inhalt der ursprünglichen Datenbank und verdreifacht ihn, wenn partielle Strukturen mit einbezogen werden. (b) Die Endbenutzer-Schnittstelle wurde neu geschrieben, erweitert und ist jetzt in der Lage, benutzerdefinierte Homologiemodellierungen durchzuführen. (c) Andere möglichen RNA-Strukturaufklärungsmethoden (suboptimales und formenbasiertes Falten) sind hilfreich, können aber Homologiemodellierung nicht ersetzen. (d) Ein Anwendungsfall der ITS2-Datenbank in Zusammenhang mit anderen am Lehrstuhl entwickelten Werkzeugen gab Einblick in die Verwendung von ITS2 für molekulare Phylogenie. N2 - The internal transcribed spacer 2 (ITS2) of the ribosomal gene repeat is an increasingly important phylogenetic marker whose RNA secondary structure is widely conserved across eukaryotic organisms. The ITS2 database aims to be a comprehensive resource on ITS2 sequence and secondary structure, based on direct thermodynamic as well as homology modelled RNA folds. Results: (a) A rebuild of the original ITS2 database generation scripts applied to a current NCBI dataset reveal more than 60,000 ITS2 structures. This more than doubles the contents of the original database and triples it when including partial structures. (b) The end-user interface was rewritten, extended and now features user-defined homology modelling. (c) Other possible RNA structure discovery methods (namely suboptimal and shape folding) prove helpful but are not able to replace homology modelling. (d) A use case of the ITS2 database in conjunction with other tools developed at the department gave insight into molecular phylogenetic analysis with ITS2. KW - Phylogenie KW - Bioinformatik KW - Würzburg / Universität / Lehrstuhl für Bioinformatik KW - Datenbank KW - Perl KW - SQL KW - Trichoplax adhaerens KW - Placozoa KW - RNS KW - S KW - internal transcribed spacer 2 KW - ITS-2 KW - ITS2 KW - Phylogeny KW - Database KW - Perl KW - SQL KW - Placozoa Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23895 ER - TY - THES A1 - Ok [geb. Hofmann], Claudia Barbara T1 - Isoform-spezifische Analyse der PI3-Kinase (Klasse I) im Multiplen Myelom T1 - Isoform-specific analysis of the PI3-kinase (class I) in multiple myeloma N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist eine unheilbare Erkrankung, die aus einer klonalen Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark hervorgeht. Dabei liegt ein komplexes Signalnetzwerk vor, das zum Überleben und Wachstum der MM-Zellen führt. Das MM ist durch eine enorme genetische und phänotypische Heterogenität gekennzeichnet. Die konstitutive Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs spielt bei ungefähr der Hälfte der Patienten mit MM eine wichtige Rolle für das Überleben der MM-Zellen und ist daher ein potentieller therapeutischer Ansatzpunkt. Isoform-spezifische Untersuchungen der katalytischen Untereinheiten der Klasse I-PI3K (p110α, p110β, p110γ, p110δ) sollten zur Erkenntnis führen, welche dieser Isoformen für das MM Zellüberleben wichtig sind, um spezifischere Behandlungen mit möglichst geringen Nebenwirkungen zu erlauben. Dafür wurden zunächst Isoform-spezifische Knockdown-Experimente mit MM Zelllinien durchgeführt und sowohl deren Überleben als auch die Aktivierung der nachgeschalteten Komponenten im PI3K Signalweg untersucht. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden sowohl MM Zelllinien als auch Primärzellen mit Isoform-spezifischen PI3K-Inhibitoren behandelt (BYL 719 für p110α, TGX 221 für p110β, CAY10505 für p110γ und CAL 101 für p110δ) und in gleicher Weise untersucht. In beiden Versuchsansätzen stellte sich die katalytische Untereinheit p110α als wichtigste Isoform für das Überleben von MM Zellen mit konstitutiv phosphoryliertem Akt Signal heraus. Weder der Knockdown noch die pharmakologische Inhibition der anderen drei Isoformen (p110β, p110γ, p110δ) führten in MM-Zelllinien zur Beeinträchtigung des Zellüberlebens. Auch reagierten die Primärzellen von MM Patienten größtenteils nicht mit Apoptose auf eine Behandlung mit TGX 221, CAY10505 oder CAL 101. Aufbauend auf der postulierten Bedeutung von p110α, wurde der dafür spezifische Inhibitor BYL 719 mit bereits klinisch etablierten Therapeutika in Kombination verwendet, woraus eine im Vergleich zur Einzelbehandlung verstärkte Apoptose resultierte. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass PI3K/p110α eine therapeutisch nutzbare Zielstruktur zur Behandlung des Multiplen Myeloms darstellt. Daher scheinen weitergehende prä-klinische Studien mit p110α Inhibitoren erfolgversprechend. N2 - Multiple myeloma (MM) is an incurable disease, which results from clonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow. Thereby, a complex signaling network regulates the survival and growth of MM cells. This malignant hematological disease is characterized by profound genetic and phenotypical heterogeneity. The PI3K/Akt signaling pathway is constitutively activated in about 50% of patients with MM and therefore plays an important role for the survival of MM cells. Accordingly, treatment of MM patients with the most isoform-specific drugs may be a desirable goal to achieve therapeutic utility with a minimum of undesired side effects. Therefore, an isoform-specific analysis of the catalytic subunits of the PI3K class I (p110α, p110β, p110γ, p110δ) was undertaken to reveal their individual role(s) for MM cell survival. Initially, isoform-specific knockdown experiments in MM cell lines were performed to assess their survival and the activation states of down-stream components of the PI3K pathway. These experiments were then complemented using isoform-specific pharmacological inhibitors (BYL 719 for p110α, TGX 221 for p110β, CAY10505 for p110γ and CAL 101 for p110δ) in MM cells and primary MM cells. Cell lines with constitutively phosphorylated Akt reduced this signal after p110α knockdown or pharmacologic inhibition and these treatments also affected their survival. Conversely, neither knockdown nor drug-mediated inhibition of any of the other three p110 isoforms influenced MM cell survival. In addition, whereas most primary MM samples were sensitive against BYL-719 only a few samples displayed apoptotic effects when treated with TGX 221, CAY10505 or CAL-101. These results showed that p110α is the major contributor of PI3K-mediated cell survival, and therefore the inhibitor BYL 719 was tested in combination with clinically relevant therapeutics for MM. Such treatment led to increased rates of apoptosis in MM cell lines in comparison to the respective single drug treatments. Taken together, we assume that PI3K/p110α is a therapeutically valuable target structure for the treatment of MM that would warrant more extensive pre-clinical studies. KW - Phosphatidylinositolkinase KW - Isomer KW - Signaltransduktion KW - Plasmozytom KW - p110alpha KW - BYL-719 KW - Carfilzomib KW - Melphalan KW - Lenalidomid KW - Pomalidomid KW - Bortezomib KW - synergistische Effekte KW - Phospho-Akt KW - Zellüberleben KW - pi3kinase KW - Multiples Myelom KW - Knochenmark KW - Isoform Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108466 ER - TY - THES A1 - Weyhmüller Reboredo, Jenny T1 - Tissue Engineering eines Meniskus - Vom Biomaterial zum Implantat T1 - Tissue Engineering of a meniscus - from a biomaterial to the implant N2 - Der Meniskus, ein scheibenförmiger Faserknorpel, spielt im Kniegelenk eine bedeutende Rolle, weil er Kräfte und Druck im Kniegelenk gleichmäßig verteilt, Stöße dämpft sowie der Kraftübertragung und Stabilisierung dient. Durch die Entfernung des Gewebes, der sogenannten Totalmeniskektomie, nach einer Meniskusverletzung oder einem Riss, verändern sich die mechanischen Eigenschaften des Gelenks stark und verursachen durch die erhöhte Belastung der Gelenkflächen Arthrose. Arthrose ist weltweit die Häufigste aller Gelenkerkrankungen. Der Erhalt der körperlichen Leistungsfähigkeit und Mobilität bis ins hohe Alter sowie die Bewahrung der Gesundheit von Herz-Kreislauf- und Stoffwechselorganen zählen aufgrund des demografischen Wandels zu den großen medizinischen Herausforderungen. Die Erkrankung des muskuloskelettalen Systems stellte 2010 im Bundesgebiet die am häufigsten vorkommende Krankheitsart dar. Während Risse in den äußeren Teilen des Meniskus aufgrund des Anschlusses an das Blutgefäßsystem spontan heilen können, können sie dies in tieferen Zonen nicht. Durch die begrenzte Heilungsfähigkeit des Knorpels bleibt langfristig der Einsatz eines Ersatzgewebes die einzige therapeutische Alternative. In der vorliegenden Arbeit wurde als therapeutische Alternative erfolgreich ein vaskularisiertes Meniskusersatzgewebe mit Methoden des Tissue Engineering entwickelt. Es soll in Zukunft als Implantat Verwendung finden. Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Forschungsfeld, in dem Gewebe außerhalb des Körpers generiert werden. Schlüsselkomponenten sind Zellen, die aus einem Organismus isoliert werden, und Trägerstrukturen, die mit Zellen besiedelt werden. Die Biomaterialien geben den Zellen eine geeignete Umgebung, die die Extrazelluläre Matrix (EZM) ersetzen soll, um die Funktion der Zellen beizubehalten, eigene Matrix zu bilden. Zum Erhalt eines funktionelles Gewebes werden oftmals dynamische Kultursysteme, sogenannte Bioreaktoren, verwendet, die natürliche Stimuli wie beispielsweise den Blutfluss oder mechanische Kompressionskräfte während der in vitro Reifungsphase des Gewebes, zur Verfügung stellen. Das Gewebekonstrukt wurde auf Basis natürlicher Biomaterialien aufgebaut, unter Verwendung ausschließlich primärer Zellen, die später direkt vom Patienten gewonnen werden können und damit Abstoßungsreaktionen auszuschließen sind. Da der Meniskus teilvaskularisiert ist und die in vivo Situation des Gewebes bestmöglich nachgebaut werden sollte, wurden Konstrukte mit mehreren Zelltypen, sogenannte Ko-Kulturen aufgebaut. Neben mikrovaskulären Endothelzellen (mvEZ) und Meniskuszellen (MZ) erfolgten Versuche mit mesenchymalen Stammzellen (MSZ). Zur Bereitstellung einer zelltypspezifischen Matrixumgebung, diente den mvEZ ein Stück Schweinedarm mit azellularisierten Gefäßstrukturen (BioVaSc®) und den MZ diente eine geeig- nete Kollagenmatrix (Kollagen Typ I Hydrogel). Die Validierung und Charakterisierung des aufgebauten 3D Meniskuskonstrukts, welches in einem dynamischen Perfusions-Bioreaktorsystem kultiviert wurde, erfolgte mit knorpeltypischen Matrixmarkern wie Aggrekan, Kollagen Typ I, II und X sowie mit den Transkriptionsfaktoren RunX2 und Sox9, die in der Knorpelentstehung von großer Bedeutung sind. Zusätzlich erfolgten Auswertungen mit endothelzellspezifischen Markern wie vWF, CD31 und VEGF, um die Vaskularisierung im Konstrukt nachzuweisen. Analysiert wurden auch die Zellvitalitäten in den Konstrukten. Aufgrund einer nur geringen Verfügbarkeit von MZ wurden Kulturansätze mit alternativen Zellquellen, den MSZ, durchgeführt. Dafür erfolgte zunächst deren Isolation und Charakterisierung und die Auswahl einer geeigneten 3D Kollagenmatrix. Die beste Zellintegration der MSZ konnte auf einer eigens hergestellten elektrogesponnenen Matrix beobachtet werden. Die Matrix besteht aus zwei unterschiedlichen Kollagentypen, die auf insgesamt fünf Schichten verteilt sind. Die Fasern besitzen weiter unterschiedliche Ausrichtungen. Während die Kollagen Typ I Fasern in den äußeren Schichten keiner Ausrichtung zugehören, liegen die Kollagen Typ II Fasern in der mittleren Schicht parallel zueinander. Der native Meniskus war für den Aufbau einer solchen Kollagen-Trägerstruktur das natürliche Vorbild, das imitiert werden sollte. Nach der Besiedelung der Matrix mit MSZ, konnte eine Integration der Zellen bereits nach vier Tagen bis in die Mittelschicht sowie eine spontane chondrogene Differenzierung nach einer insgesamt dreiwöchigen Kultivierung gezeigt werden. Das Biomaterial stellt in Hinblick auf die Differenzierung der Zellen ohne die Zugabe von Wachstumsfaktoren eine relevante Bedeutung für klinische Studien dar. Zur Kultivierung des 3D Meniskuskonstrukts wurde ein Bioreaktor entwickelt. Mit diesem können neben Perfusion der Gefäßsysteme zusätzlich Kompressionskräfte sowie Scherspannungen auf das Ersatzgewebe appliziert und die Differenzierung von MZ bzw. MSZ während der in vitro Kultur über mechanische Reize stimuliert werden. Ein anderes Anwendungsfeld für den neuartigen Bioreaktor ist seine Verwendung als Prüftestsystem für die Optimierung und Qualitätssicherung von Gewebekonstrukten. N2 - The meniscus, a disk-shaped fibrous cartilage, plays an important role in the equal distribution of pressure, shock absorption, power transmission and stability within the knee joint. After a meniscus injury or a meniscus tear, a total meniscectomy is done where the complete tissue is removed. This leads to a change of mechanical properties in the joint and causes arthrosis by an increased strain on the joint surfaces. Wordwide arthrosis is the most frequent of all joint diseases. Due to the demographic change, maintaining physical fitness and mobility up to an old age are the main challenges besides ensuring health of the heart and circulatory system and of the metabolic organs. Musculoskeletal disorders represented the most frequent type of disease in Germany in 2010. While tears in the outer zone of the meniscus heal spontaneously because of its connection to the blood vessel system, tears in the deeper zones do not heal. Due to the limited healing capacity of cartilage the use of a replacement tissue is the only therapeutic alternative in the long run. In the present work a vascularized meniscus construct as therapeutic alternatives has been developed with the Tissue Engineering method for the further use as an implant. Tissue En- gineering is an interdisciplinary research field to generate tissues outside the body. The key components are isolated cells from an organism, and scaffolds, which are seeded with cells. Biomaterials provide a suitable environment that replaces the extracellular matrix (ECM) to maintain cell functionality to let cells build up their own matrix. To maintain a functional tissue during in vitro dynamic culture, bioreactor systems are used to provide natural stimuli such as blood flow or mechanical compression forces. The tissue construct is based on natural biomaterials and solely on primary cells, which later can be isolated directly from the patient and thereby exclude repulsion reactions. Due to its limited vascularity of the meniscus and the aim to build up at its best the in vivo situation more than one cell type is used to generate constructs, so called co-culture systems. Mesen- chymal stem cells (MSZ) besides microvascular endothelial cells (mvEZ) and meniscus cells (MZ) were used in the experiments. To supply a cell type specific matrix environment, a segment of a porcine jejunum with decellularized vascular structures (BioVaSc®) for the mvEZ and a collagen based matrix (collagen type I hydrogel) for the MZ were employed. The validation and characterization of the de- veloped 3D meniscus construct, that was cultured in a dynamic perfusion bioreactor system, was performed by using cartilage matrix specific markers, such as aggrecan, collagen type I, II and X, as well as the transcription factors RunX2 and Sox9 that are of major importance for cartilage development. Further analysis with endothelial cell specific markers, such as vWF, CD31 and VEGF were performed to evaluate the vascularization of the construct. Furthermore, cell vitality tests of the construct were made. Because of the limited availability of primary MZ, culture approaches with MSZ as an alter- native cell source were investigated. Cell isolation and characterization were performed and a suitable 3D collagen matrix was selected. The best cell integration of the MSZ could be observed on a specifically engineered electrospun matrix. The matrix consists of two different collagen types that are arranged in a total of five layers. The fibers are further orientated in different directions. While outer layers consist of randomly-aligned collagen type I fibers, the collagen type II fibers in the middle layer are aligned parallel to each other. The native meniscus tissue serves as natural example and its structure is replicated in such a collagen scaffold. After seeding the scaffold with MSZ, cell integration into the middle layer could be observed after four days, as well as a spontanous chondrogenic differentation after three weeks of culture. The biomaterial developed in this work has to be considered as relevant for clinical studies with regard to cell differentiation without adding growth factors to the culture. For the culture of 3D meniscus construct a bioreactor was successfully developed, that can apply compressive strength and shear stress to the tissue model in addition to perfusing the vascular system. With these measures the differentiation of MZ or MSZ could be induced with mechanical strains during the in vitro culture. Another field of application for the new bioreactor is its use as a test system for the optimization and quality control of the tissue models. KW - Tissue Engineering KW - Meniskustransplantation KW - Bioreaktor KW - Gewebekultur KW - Biomaterial KW - Elektrospinning KW - Implantatentwicklung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108477 ER - TY - THES A1 - Schaefer, Frauke T1 - Diagnosis and therapy of malaria under the conditions of a developing country - the example of Burkina Faso T1 - Diagnose und Therapie der Malaria unter den Bedingungen eines Entwicklungslandes - das Beispiel Burkina Fasos N2 - Malaria is a challenging infection with increasing and wide-spread treatment failure risk due to resistance. With a estimated death toll of 1-3 Million per year, most cases of Malaria affect children under the age of five years in Sub-Saharan Africa. In this thesis, I analyse the current status of malaria control (focussing on diagnosis and therapy) in Burkina Faso to show how this disease burdens public health in endemic countries and to identify possible approaches to improvement. MB is discussed as a therapeutic option under these circumstances. Burkina Faso is used as a representative example for a country in Sub-Saharan Africa with high endemicity for malaria and is here portrayed, its health system characterised and discussed under socioeconomic aspects. More than half of this country’s population live in absolute poverty. The burden that malaria, especially treatment cost, poses on these people cannot be under-estimated. A retrospective study of case files from the university pediatric hospital in Burkina Faso’s capital, Ouagadougou, shows that the case load is huge, and especially the specific diagnosis of severe malaria is difficult to apply in the hospital’s daily routine. Treatment policy as proposed by WHO is not satisfactorily implemented neither in home treatment nor in health services, as data for pretreatment clearly show. In the face of growing resistance in malaria parasites, pharmacological combination therapies are important. Artemisinins currently are the last resort of malaria therapy. As I show with homology models, even this golden bullet is not beyond resistance development. Inconsidered mass use has rendered other drugs virtually useless before. Artemisinins should thus be protected similar to reserve antibiotics against multi-resistant bacteria. There is accumulating evidence that MB is an effective drug against malaria. Here the biological effects of both MB alone and in combination therapy is explored via modeling and experimental data. Several different lines of MB attack on Plasmodium redox defense were identified by analysis of the network effects. Next, CQ resistance based on Pfmdr1 and PfCRT transporters as well as SP resistance were modeled in silico. Further modeling shows that MB has a favorable synergism on antimalarial network effects with these commonly used antimalarial drugs, given their correct application. Also from the economic point of view MB shows great potential: in terms of production price, it can be compared to CQ, which could help to diminuish the costs of malaria treatment to affordable ranges for those most affected and struk by poverty. Malaria control is feasible, but suboptimal diagnosis and treatment are often hindering the achievment of this goal. In order to achieve malaria control, more effort has to be made to implement better adjusted and available primary treatment strategies for uncomplicated malaria that are highly standardised. Unfortunately, campaigns against malaria are chronically underfinanced. In order to maximize the effect of available funds, a cheap treatment option is most important, especially as pharmaceuticals represent the biggest single matter of expense in the fight against malaria. N2 - Malaria ist eine Krankheit, die uns vor große Herausforderungen stellt. Insbesondere die weltweit verbreiteten Resistenzen, die viele Therapieoptionen nutzlos werden lassen, haben den Kampf gegen die Malaria in den letzten Jahrzehnten deutlich verkompliziert. Schätzungen gehen davon aus, dass Malaria jährlich 1 bis 3 Millionen Todesopfer fordert. Mortalität und Morbidität der Erkrankung konzentrieren sich dabei in besonderer Weise auf Kinder unter fünf Jahren in Afrika südlich der Sahara. In der hier vorgestellten Doktorarbeit analysiere ich den aktuellen Stand der Malaria-Kontrolle in Burkina Faso und zeige beispielhaft auf, warum diese Krankheit eine derart große Bürde für die Volksgesundheit darstellt und wo Ansatzpunkte zur Verbesserung der Kontrollmaßnahmen zu sehen sind, mit einem besonderen Fokus auf Diagnostik und Therapieoptionen. Dabei wird MB als Therapieoption genauer beleuchtet. Um die besonderen Gegebenheiten eines Landes wie Burkina Faso - welches hier als repräsentatives Beispiel für einen Staat mit hoher Endemizität für Malaria herangezogen wird - aufzuzeigen, wird ein Porträt des Landes und seines Gesundheitssystems insbesondere unter Sozio- Ökonomischen Gesichtspunkten gezeichnet. Burkina Faso ist ein sehr armes Land, über die Hälfte seiner Bevölkerung lebt unterhalb der Armutsgrenze. Die Kosten von Malaria sind für diese Menschen gigantisch, und insbesondere die Kosten von Medikamenten wiegen schwer. Eine retrospektive Studie aus Fallakten des Universitäts-Kinderkrankenhauses in Burkina Fasos Hauptstadt Ouagadougou zeigt vor allem, dass allein die Fallzahlen überwältigend sind, und vor allem die spezifische Diagnose der schweren Verlaufsform der Malaria ist unter den vorherrschenden Bedingungen eine Mammutaufgabe. Die Behandlungsvorschriften wie von der WHO vorgegeben werden weder vom Gesundheitssystem noch von der Therapie zu Hause erfüllt, wie in den präsentierten Daten für die Vorbehandlung zeigen. Die zur Verfügung stehenden Malaria-wirksamen Therapeutika sind leider dank Resistenzentwicklung - oft durch unbedachten Masseneinsatz verursacht - sehr begrenzt. Artemisinine sind momentan das einzige Mittel gegen welches noch keine Resistenzen im Feld nachgewiesen wurden. Mittels Homologie-Modellierung zeige ich auf wie einfach eine solche Resistenzentwicklung jedoch denkbar wäre. Artemisinine sollten daher durch sehr gezielten Einsatz als ”letzter Trumpf” möglichst lange vor Resistenzentwicklung geschützt werden, ähnlich wie Reserveantibiotika gegen Multi-resistente Keime. MB ist ein hervorragender Kandidat für eine Kombinationsbehandlung gegen Malaria und eventuell eine Option, Artemisinine länger zu ”schonen”. Hier wird dieses Medikament mit bioinformatischen Mitteln genauer in seinen Wirkmechanismen beleuchtet und in Kombination mit anderen Medikamenten getestet mittels einer experimentell gestützten bioinformatischen Pathway-Modellierung. Durch diese Netzwerk-Analyse wurden verschiedene Angriffspunkte von MB auf das Redox-Netzwerk der Malariaerreger identifiziert. Daraufhin wurden CQ und SP-Resistenzen in silico simuliert. Weitere Analysen zeigten dabei, dass MB synergisitische Wirkungen mit anderen Therapeutika gegen Malaria aufzeigt, wenn sie zielgerichtet eingesetzt werden. Finanziell gesehen hat MB Potenzial, ein zweites CQ zu werden, und somit endlich wieder die Kosten der Behandlung für Menschen die in Armut leben erschwinglich zu machen. Malaria Kontrolle ist erreichbar, aber suboptimale Diagnosestellung und Behandlung behindern das Erreichen dieses Zieles. Hierfür muss eine angepasste, dezentrale und hochgradig standardisierte Primärbehandlung unkomplizierter Malaria implementiert werden und für eine bessere Verfügbarkeit dieser gesorgt werden. Leider leidet die Finanzierung der Kampagnen gegen Malaria an chronischer Unterversorgung. Um den maximalen Nutzen aus den vorhandenen Mitteln ziehen zu können ist eine günstigere medikamentöse Therapie ein entscheidender Beitrag, zumal Medikamente den größten Einzelbetrag im Kampf gegen Malaria verbrauchen. KW - Malaria KW - bioinformatic KW - socioeconomic KW - Methylene blue KW - developing country KW - therapy KW - diagnosis Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102863 ER - TY - THES A1 - Zeeshan [geb. Majeed], Saman T1 - Implementation of Bioinformatics Methods for miRNA and Metabolic Modelling T1 - Die Umsetzung der Bioinformatik-Methoden für miRNA-und der Metabolischen Modellierung N2 - Dynamic interactions and their changes are at the forefront of current research in bioinformatics and systems biology. This thesis focusses on two particular dynamic aspects of cellular adaptation: miRNA and metabolites. miRNAs have an established role in hematopoiesis and megakaryocytopoiesis, and platelet miRNAs have potential as tools for understanding basic mechanisms of platelet function. The thesis highlights the possible role of miRNAs in regulating protein translation in platelet lifespan with relevance to platelet apoptosis and identifying involved pathways and potential key regulatory molecules. Furthermore, corresponding miRNA/target mRNAs in murine platelets are identified. Moreover, key miRNAs involved in aortic aneurysm are predicted by similar techniques. The clinical relevance of miRNAs as biomarkers, targets, resulting later translational therapeutics, and tissue specific restrictors of genes expression in cardiovascular diseases is also discussed. In a second part of thesis we highlight the importance of scientific software solution development in metabolic modelling and how it can be helpful in bioinformatics tool development along with software feature analysis such as performed on metabolic flux analysis applications. We proposed the “Butterfly” approach to implement efficiently scientific software programming. Using this approach, software applications were developed for quantitative Metabolic Flux Analysis and efficient Mass Isotopomer Distribution Analysis (MIDA) in metabolic modelling as well as for data management. “LS-MIDA” allows easy and efficient MIDA analysis and, with a more powerful algorithm and database, the software “Isotopo” allows efficient analysis of metabolic flows, for instance in pathogenic bacteria (Salmonella, Listeria). All three approaches have been published (see Appendices). N2 - Dynamische Wechselwirkungen und deren Veränderungen sind wichtige Themen der aktuellen Forschung in Bioinformatik und Systembiologie. Diese Promotionsarbeit konzentriert sich auf zwei besonders dynamische Aspekte der zellulären Anpassung: miRNA und Metabolite. miRNAs spielen eine wichtige Rolle in der Hämatopoese und Megakaryozytopoese, und die Thrombozyten miRNAs helfen uns, grundlegende Mechanismen der Thrombozytenfunktion besser zu verstehen. Die Arbeit analysiert die potentielle Rolle von miRNAs bei der Proteintranslation, der Thrombozytenlebensdauer sowie der Apoptose von Thrombozyten und ermöglichte die Identifizierung von beteiligten Signalwegen und möglicher regulatorischer Schlüsselmoleküle. Darüber hinaus wurden entsprechende miRNA / Ziel-mRNAs in murinen Thrombozyten systematisch gesammelt. Zudem wurden wichtige miRNAs, die am Aortenaneurysma beteiligt sein könnten, durch ähnliche Techniken vorhergesagt. Die klinische Relevanz von miRNAs als Biomarker, und resultierende potentielle Therapeutika, etwa über eine gewebsspezifische Beeinflussung der Genexpression bei Herz-Kreislauf Erkrankungen wird ebenfalls diskutiert. In einem zweiten Teil der Dissertation wird die Bedeutung der Entwicklung wissenschaftlicher Softwarelösungen für die Stoffwechselmodellierung aufgezeigt, mit einer Software-Feature-Analyse wurden verschiedene Softwarelösungen in der Bioinformatik verglichen. Wir vorgeschlagen dann den "Butterfly"-Ansatz, um effiziente wissenschaftliche Software-Programmierung zu implementieren. Mit diesem Ansatz wurden für die quantitative Stoffflussanalyse mit Isotopomeren effiziente Software-Anwendungen und ihre Datenverwaltung entwickelt: LS-MIDA ermöglicht eine einfache und effiziente Analyse, die Software "Isotopo" ermöglicht mit einem leistungsfähigeren Algorithmus und einer Datenbank, eine noch effizientere Analyse von Stoffwechselflüssen, zum Beispiel in pathogenen Bakterien (Salmonellen, Listerien). Alle drei Ansätze wurden bereits veröffentlicht (siehe Appendix). KW - miRNS KW - Bioinformatics KW - miRNA KW - Metabolic Modelling KW - Spectral Data Analysis KW - Butterfly KW - Thrombozyt KW - Bioinformatik KW - Stoffwechsel KW - Modellierung KW - Metabolischen Modellierung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102900 ER - TY - THES A1 - Morowski, Martina T1 - Relevance of platelet count and ITAM-signalling pathway in murine models of haemostasis, thrombosis and thrombo-inflammation T1 - Relevanz der Thrombozytenzahl und des ITAM-Signalwegs in Mausmodellen der Hämostase, Thrombose und Thromboinflammation N2 - Platelets are important players in haemostasis and their activation is essential to limit post-traumatic blood loss upon vessel injury. On the other hand, pathological platelet activation may lead to thrombosis resulting in myocardial infarction and stroke. Platelet activation and subsequent thrombus formation are, therefore, tightly regulated and require a well-defined interplay of platelet surface receptors, intracellular signalling molecules, cytoskeletal rearrangements and the activation of the coagulation cascade. In vivo thrombosis and haemostasis models mimic thrombus formation at sites of vascular lesions and are frequently used to assess thrombotic and haemostatic functions of platelets. In this dissertation, different in vivo models were used in mice to address the question at what level a reduced platelet count (PC) compromises stable thrombus formation. To study this, mice were rendered thrombocytopenic by low-dose anti-GPIbα antibody treatment and subjected to a tail bleeding time assay as well as to four different in vivo thrombosis models. Haemostasis and occlusive thrombus formation in small vessels were only mildly affected even at severe reductions of the PC. In contrast, occlusive thrombus formation in larger arteries required higher PCs demonstrating that considerable differences in the sensitivity for PC reductions exist between these models. In a second part of this study, mice were rendered thrombocytopenic by injection of high-dose anti-GPIbα antibody which led to the complete loss of all platelets from the circulation for several days. During recovery from thrombocytopenia, the newly generated platelet population was characterised and revealed a defect in immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-signalling. This defect translated into impaired arterial thrombus formation. To further investigate ITAM-signalling in vivo, genetically modified mice were analysed which display a positive or negative regulation of platelet ITAM-signalling in vitro. Whereas mice lacking the adapter Grb2 in platelets showed a delayed thrombus formation in vivo after acetylsalicylic acid treatment, Clp36ΔLIM bone marrow chimeric mice and SLAP/SLAP2-deficient mice displayed pro-thrombotic properties in vivo. Finally, mice lacking the adapter protein EFhd2 were analysed in vitro and in vivo. However, EFhd2-deficient platelets showed only a minor increase in the procoagulant activity compared to control. N2 - Thrombozyten sind wichtige Zellen für die Hämostase, die bei einer Verletzung der Gefäßwand aktiviert werden, um den Blutverlust zu begrenzen. Auf der anderen Seite kann die pathologische Aktvierung von Thrombozyten jedoch zu Thromboseereignissen und in Konsequenz zu Schlaganfall und Herzinfarkt führen. Die Aktivierung von Thrombozyten und die nachfolgende Thrombusbildung sind daher streng reguliert und setzen ein enges Zusammenspiel von Thrombozytenoberflächenrezeptoren, intrazellulären Signalmolekülen, Zytoskelettumstrukturierungen und die Aktivierung der Koagulationskaskade voraus. In vivo Thrombose- und Hämostase-Modelle ahmen die Thrombusbildung in Gefäßen nach und werden häufig benutzt um die hämostatische und thrombotische Funktion von Thrombozyten zu untersuchen. In dieser Dissertation wurden verschiedene in vivo Modelle in Mäusen genutzt, um zu klären, ab welcher Thrombozytenzahl eine stabile Thrombusbildung beeinträchtigt ist. Für diese Untersuchung wurden Mäuse mit geringen Dosen anti-GPIbα Antikörper behandelt, die zu einer Reduktion der Thrombozytenzahl führen. Anschließend wurden die Mäuse in einem Blutungszeitmodel und vier verschiedenen thrombotischen Modellen untersucht. Hämostase oder okklusive Thrombusbildung in kleinen Gefäßen waren auch bei einer sehr starken Reduktion der Thrombozytenzahl kaum beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu war für eine normale Thrombusbildung in größeren Gefäßen eine höhere Thrombozytenzahl nötig. Verschiedene in vivo Modelle zeigen daher eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber einer Reduktion der Thrombozytenzahl. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Mäuse mit einer hohen Dosis anti-GPIbα Antikörper behandelt, die zu einem völligen, mehrtägigen Verlust aller Thrombozyten im Blutkreislauf führte. Während sich die Thrombozytenzahl erholte, wurden neu generierte Thrombozyten charakterisiert, die einen deutlichen Defekt im ITAM-Signalweg zeigten. Dieser Defekt führte zu einer verminderten arteriellen Thrombusbildung. Um Auswirkungen eines Defektes im ITAM-Signalweg detaillierter in vivo zu untersuchen, wurden genetisch veränderte Mäuse, die in vitro eine reduzierte oder verstärkte ITAM-Signaltransduktion in Thrombozyten zeigen, untersucht. Während Mäuse, die in Thrombozyten kein Grb2 exprimieren nach Acetylsalicylsäurebehandlung in vivo eine verlangsamte Thrombusbildung zeigten, war die Thrombusbildung in Clp36ΔLIM Knochenmarkchimären und SLAP/SLAP2-defizienten Mäusen beschleunigt. Darüber hinaus wurden EFhd2-defiziente Mäuse in vitro und in vivo analysiert. EFhd2-defiziente Thrombozyten zeigten jedoch nur eine geringe Steigerung in der prokoagulatorischen Aktivität im Vergleich zu Kontrolltieren. KW - Thrombozyt KW - Platelet count KW - ITAM-signalling KW - Murine models of thrombosis and haemostasis KW - Maus KW - Blutstillung KW - Thrombose Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99193 ER - TY - THES A1 - Audretsch, Christof T1 - Analysing Quorum Sensing and Biofilm formation in Staphylococcus aureus T1 - Untersuchungen des Quorum-Sensing und der Biofilm-Bildung in Staphylokokkus aureus N2 - Staphylococcus aureus (SA) causes nosocomial infections including life threatening sepsis by multi-resistant strains (MRSA). It has the ability to form biofilms to protect it from the host immune system and from anti staphylococcal drugs. Biofilm and planctonic life style is regulated by a complex Quorum-Sensing (QS) system with agr as a central regulator. To study biofilm formation and QS mechanisms in SA a Boolean network was build (94 nodes, 184 edges) including two different component systems such as agr, sae and arl. Important proteins such as Sar, Rot and SigB were included as further nodes in the model. System analysis showed there are only two stable states biofilm forming versus planctonic with clearly different subnetworks turned on. Validation according to gene expression data confirmed this. Network consistency was tested first according to previous knowledge and literature. Furthermore, the predicted node activity of different in silico knock-out strains agreed well with corresponding micro array experiments and data sets. Additional validation included the expression of further nodes (Northern blots) and biofilm production compared in different knock-out strains in biofilm adherence assays. The model faithfully reproduces the behaviour of QS signalling mutants. The integrated model allows also prediction of various other network mutations and is supported by experimental data from different strains. Furthermore, the well connected hub proteins elucidate how integration of different inputs is achieved by the QS network. For in silico as well as in vitro experiments it was found that the sae-locus is also a central modulator of biofilm production. Sae knock-out strains showed stronger biofilms. Wild type phenotype was rescued by sae complementation. To elucidate the way in which sae takes influence on biofilm formation the network was used and Venn-diagrams were made, revealing nodes regulated by sae and changed in biofilms. In these Venn-diagrams nucleases and extracellular proteins were found to be promising nodes. The network revealed DNAse to be of great importance. Therefore qualitatively the DNAse amount, produced by different SA mutants was measured, it was tried to dissolve biofilms with according amounts of DNAse and the concentration of nucleic acids, proteins and polysaccharides were measured in biofilms of different SA mutants. With its thorough validation the network model provides a powerful tool to study QS and biofilm formation in SA, including successful predictions for different knock-out mutant behaviour, QS signalling and biofilm formation. This includes implications for the behaviour of MRSA strains and mutants. Key regulatory mutation combinations (agr–, sae–, sae–/agr–, sigB+, sigB+/sae–) were directly tested in the model but also in experiments. High connectivity was a good guide to identify master regulators, whose detailed behaviour was studied both in vitro and in the model. Together, both lines of evidence support in particular a refined regulatory role for sae and agr with involvement in biofilm repression and/or SA dissemination. With examination of the composition of different mutant biofilms as well as with the examination of the reaction cascade that connects sae to the biofilm forming ability of SA and also by postulating that nucleases might play an important role in that, first steps were taken in proving and explaining regulatory links leading from sae to biofilms. Furthermore differences in biofilms of different mutant SA strains were found leading us in perspective towards a new understanding of biofilms including knowledge how to better regulate, fight and use its different properties. N2 - Staphylococcus aureus (SA) ist Auslöser nosocomialer Infektionen, darunter auch die, durch multiresistente Stämme (MRSA) verursachte, lebensbedrohliche Sepsis. Er hat die Fähigkeit Biofilme zu bilden, um sich vor dem Immunsystem des Wirtes und vor Antibiotika zu schützen. Biofilm und planktonische Lebensweise werden durch ein komplexes Quorum-Sensing (QS) System mit agr als zentralem Regulator gesteuert. Um die Biofilm Bildung und QS Mechanismen in SA zu untersuchen, wurde ein Boole´sches Netzwerk erstellt (94 Knoten, 184 Kanten) das verschiedene Zwei-Komponenten-Systeme wie agr, sae und arl mit einschließt. Wichtige Proteine wie Sar, Rot und SigB wurden als weitere Knoten im Modell eingefügt. Die Systemanalyse zeigte, dass es nur zwei stabile Zustände gibt, Biofilm bildend versus planktonisch, in denen deutlich unterschiedliche Subnetzwerke angeschaltet sind. Überprüfungen anhand von Gen-Expressions-Daten bestätigten dies. Die Netzwerkstabilität wurde zuerst an Hand von bestehendem Wissen und Literatur getestet. Zudem stimmte die vorhergesagte Aktivität der Knoten in verschiedenen in silico Knock-out Stämmen sehr gut mit den zugehörigen Micro-array Experimenten und Daten überein. Zusätzliche Validierungen schlossen die Expression weiterer Knoten (Northern Blots) und die Biofilm Produktion, verglichen durch Biofilm adherence assays, in verschiedenen Knock-out Stämmen mit ein. Das Modell spiegelt zuverlässig das Verhalten von QS-Signal Mutanten wieder. Das integrierte Modell erlaubt auch Vorhersagen von diversen anderen Netzwerk Mutationen und wird durch experimentelle Daten unterschiedlicher Stämme gestützt. Außerdem zeigen die gut vernetzten Hubproteine im Detail auf, wie die Verarbeitung unterschiedlicher Eingangssignale durch das QS-Netzwerk erreicht wird. Sowohl für in silico als auch für in vitro Experimente konnte gezeigt werden, dass der sae-Locus auch einen zentralen Modulator der Biofilm Produktion darstellt, sae Knock-out Stämme zeigten stärkere Biofilme. Der Wildtyp Phänotyp wurde durch sae Komplementierung wiederhergestellt. Um die Art und Weise, mit der sae Einfluss auf die Biofilm Bildung nimmt, aufzuklären wurde das Netzwerk genutzt und Venn-Diagramme angefertigt, welche Knoten aufzeigten, die durch sae reguliert- und in Biofilmen verändert sind. In den Venn-Diagrammen wurden Nucleasen und extrazelluläre Proteine als vielversprechende Knoten gefunden. Das Netzwerk zeigte, dass DNAse von großer Bedeutung ist. Deswegen wurde qualitativ die, durch unterschiedliche SA Mutanten produzierte, DNAse-Menge gemessen, es wurde versucht den Biofilm mit vergleichbaren DNAse-Mengen aufzulösen und die Konzentration von Nukleinsäuren, Proteinen und Polysacchariden wurde in Biofilmen unterschiedlicher SA Mutanten gemessen. Aufgrund seiner sorgfältigen Überprüfung stellt das Netzwerk-Modell ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung von QS und Biofilm Bildung in SA dar, erfolgreiche Vorhersagen über das Verhalten unterschiedlicher Knock-out Mutanten, QS Signale und Biofilm Bildung eingeschlossen. Dies beinhaltet Prognosen für das Verhalten von MRSA Stämmen und Mutanten. Zentrale regulatorische Mutationskombinationen (agr–, sae–, sae–/agr–, sigB+, sigB+/sae–) wurden direkt im Model aber auch in Experimenten getestet. Hohe Konektivität war ein guter Anhaltspunkt, um Hauptregulatoren zu identifizieren, deren Verhalten in vitro und im Modell untersucht wurde. Zusammen unterstützen beide Beweisführungen im Besonderen eine präzise regulatorische Rolle von sae und agr in Bezug auf Biofilm Unterdrückung und/oder SA Ausbreitung. Mit der Untersuchung der Zusammensetzung von Biofilmen unterschiedlicher Mutanten, ebenso wie mit der Untersuchung der Reaktionskaskade die sae mit der Biofilm Bildungsfähigkeit von SA verbindet und auch dem Überprüfen der Annahme, dass Nukleasen eine bedeutende Rolle hierin spielen könnten, wurden erste Schritte unternommen, um regulatoische Interaktionen zwischen sae und Biofilmen zu belegen und zu untersuchen. Des Weiteren wurden Unterschiede in Biofilmen verschiedener mutierter SA Stämme gefunden, die uns voraussichtlich zu einem neuem Verständnis von Biofilmen und damit zu Wissen führen, wie ihre Eigenschaften reguliert, bekämpft und genutzt werden können. KW - Staphylococcus aureus KW - Biofilm KW - Simulation KW - Staphylococcus aureus KW - Quorum-Sensing KW - Simulation KW - Biofilm KW - sae KW - agr KW - sar KW - DNAse Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-92189 ER - TY - THES A1 - Heydenreich, Nadine T1 - Studies on the contact-kinin system and macrophage activation in experimental focal cerebral ischemia T1 - Untersuchungen zum Kontakt-Kinin-System und zur Makrophagen-Aktivierung beim Experimentellen Schlaganfall N2 - Traditionally, ischemic stroke has been regarded as the mere consequence of cessation of cerebral blood flow, e.g. due to the thromboembolic occlusion of a major brain supplying vessel. However, the simple restoration of blood flow via thrombolysis and/or mechanical recanalization alone often does not guarantee a good functional outcome. It appears that secondary detrimental processes are triggered by hypoxia and reoxygenation, which are referred to as ischemia/reperfusion (I/R) injury. During recent years it became evident that, beside thrombosis inflammation and edema formation are key players in the pathophysiology of cerebral ischemia. The contact-kinin system represents an interface between thrombotic, inflammatory and edematous circuits. It connects the intrinsic coagulation pathway with the plasma kallikrein-kinin system (KKS) via coagulation factor FXII. The serine protease inhibitor C1-inhibitor (C1-INH) has a wide spectrum of inhibitory activities and counteracts activation of the contact-kinin system at multiple levels. The first part of the thesis aimed to multimodally interfere with infarct development by C1-INH and to analyze modes of actions of human plasma derived C1-INH Berinert® P in a murine model of focal cerebral ischemia. It was shown that C57BL/6 mice following early application of 15.0 units (U) C1-INH, but not 7.5 U developed reduced brain infarctions by ~60% and less neurological deficits in the model of transient occlusion of the middle cerebral artery (tMCAO). This protective effect was preserved at more advanced stages of infarction (day 7), without increasing the risk of intracerebral bleeding or affecting normal hemostasis. Less neurological deficits could also be observed with delayed C1-INH treatment, whereas no improvement was achieved in the model of permanent MCAO (pMCAO). Blood-brain-barrier (BBB) damage, inflammation and thrombosis were significantly improved following 15.0 U C1-INH application early after onset of ischemia. Based on its strong antiedematous, antiinflammatory and antithrombotic properties C1-INH constitutes a multifaceted therapeutic compound that protects from ischemic neurodegeneration in ‘clinically meaningful’ settings. The second part of the thesis addresses the still elusive functional role of macrophages in the early phase of stroke, especially the role of the macrophage-specific adhesion molecule sialoadhesin (Sn). For the first time, sialoadhesin null (Sn-/-) mice, homozygous deficient for Sn on macrophages were subjected to tMCAO to assess the clinical outcome. Neurological and motor function was significantly improved in Sn-/- mice on day 1 after ischemic stroke compared with wildtype (Sn+/+) animals. These clinical improvements were clearly detectable even on day 3 following tMCAO. Infarctions on day 1 were roughly the same size as in Sn+/+ mice and did not grow until day 3. No intracerebral bleeding could be detected at any time point of data acquisition. Twenty four hours after ischemia a strong induction of Sn was detectable in Sn+/+ mice, which was previously observed only on perivascular macrophages in the normal brain. Deletion of Sn on macrophages resulted in less disturbance of the BBB and a reduced number of CD11b+ (specific marker for macrophages/microglia) cells, which, however, was not associated with altered expression levels of inflammatory cytokines. To further analyze the function of macrophages following stroke this thesis took advantage of LysM-Cre+/-/IKK2-/- mice bearing a nuclear factor (NF)-ϰB activation defect in the myeloid lineage, including macrophages. Consequently, macrophages were not able to synthesize inflammatory cytokines under the control of NF-ϰB. Surprisingly, infarct sizes and neurological deficits upon tMCAO were roughly the same in conditional knockout mice and respective wildtype littermates. These findings provide evidence that macrophages do not contribute to tissue damage and neurological deficits, at least, not by release of inflammatory cytokines in the early phase of cerebral ischemia. In contrast, Sn which is initially expressed on perivascular macrophages and upregulated on macrophages/microglia within the parenchyma following stroke, influenced functional outcome. N2 - Der ischämische Schlaganfall wird traditionell als unmittelbare und „einfache“ Folge der Unterbrechung des Blutflusses zum Gehirn z.B. durch thromboembolische Gefäßverschlüsse gesehen. Häufig führt die alleinige Wiederherstellung des Blutflusses durch Lysetherapie bzw. mechanische Rekanalisation jedoch nicht zu einer Funktionserholung. Dies rückt sekundäre pathophysiologische Prozesse in den Fokus, die durch die Hypoxie und anschließende Wiederversorgung mit Sauerstoff angestoßen werden und zu einem sogenannten Reperfusionsschaden führen. In den letzten Jahren wurde klar, dass neben der Thrombenbildung Entzündungsprozesse und Hirnschwellung zentrale Bestandteile der Pathophysiologie von ischämischen Schlaganfällen sind, die über ein komplexes Netzwerk von Signalwegen eng miteinander verknüpft sind. An dieser Schnittstelle setzt die vorliegende Dissertation an. Das Kontakt-Kinin-System verbindet das plasmatische Kallikrein-Kinin-System (KKS), welches entzündliche und ödematöse Prozesse anstößt, über den Blutgerinnungsfaktor FXII mit dem intrinsischen Blutgerinnungsweg, der letztlich für die Thrombenbildung verantwortlich ist. Der endogene Serinprotease-Inhibitor C1-Inhibitor (C1-INH) besitzt ein breites Wirkungsspektrum und wirkt der Aktivierung des Kontakt-Kinin-Systems auf verschiedenen Ebenen entgegen. Ziel des ersten Teils der vorliegenden Dissertation war es, mittels C1-INH auf multimodale Weise ins Infarktgeschehen einzugreifen und die Wirkmechanismen des humanen C1-INH Berinert® P im Mausmodell nach fokaler zerebraler Ischämie zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die frühe Behandlung von C57BL/6 Mäusen mit 15.0 Units (U) C1-INH im Modell der transienten Okklusion der Arteria cerebri media (tMCAO) eine drastische Reduzierung der Infarktvolumina um annähernd 60%, sowie deutlich weniger neurologische und funktionelle Defizite zur Folge hatte. Diese Schutzwirkung war auch im fortgeschrittenen Stadium (Tag 7) der Schlaganfallentwicklung zu beobachten, ohne das Risiko einer intrazerebralen Blutung zu erhöhen oder die normale Hämostase zu beeinflussen. Die Applikation von 7.5 U C1-INH hatte dagegen keinen Effekt. Ein wesentlich verbessertes neurologisches Verhalten konnte auch nach verzögerter Injektion von 15.0 U C1-INH erzielt werden. Im Gegensatz dazu bewirkte die Behandlung im Modell der permanenten MCAO (pMCAO) keine Verbesserung. Mechanistisch führte die Gabe von 15.0 U C1-INH zu einer deutlichen Stabilisierung der Bluthirnschranke und weniger Ödembildung. Darüber hinaus war die lokale Entzündungsreaktion nach C1-INH-Applikation abgeschwächt und es bildeten sich weniger Thromben in der zerebralen Mikrozirkulation. Basierend auf seiner vielfältigen antithrombotischen, antientzündlichen und antiödematösen Potenz stellt C1-INH einen vielversprechenden Ansatz zum Schutz vor ischämischer Neurodegeneration nach Schlaganfall unter ‚klinisch relevanten‘ Bedingungen dar. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der bislang ungeklärten funktionellen Rolle von Makrophagen in der Frühphase nach Schlaganfall, speziell der Rolle des Makrophagen-spezifischen Signalmoleküls Sialoadhesin (Sn). Hierzu wurden erstmals Sialoadhesin-defiziente (Sn-/-) Mäuse, deren Makrophagen kein Sn exprimieren, der tMCAO unterzogen und die klinischen Folgen bewertet. Sn-/- Tiere zeigten verglichen mit Wildtypen (Sn+/+) verbesserte neurologische und motorische Funktionen an Tag 1 nach Schlaganfall. Diese Verbesserung war auch an Tag 3 nach Schlaganfall eindeutig nachweisbar. Die Infarkte an Tag 1 waren größenmäßig vergleichbar mit Sn+/+ Mäusen und nahmen bis Tag 3 nicht an Größe zu. Zu keinem Zeitpunkt wurde eine intrazerebrale Blutung beobachtet. 24 Stunden nach Schlaganfall kam es bei Sn+/+ Mäusen zu einer starken Induktion von Sn, welches im normalen Gehirn nur auf perivaskulären Makrophagen exprimiert wurde. Die Deletion von Sn auf Makrophagen wirkte einer Bluthirnschrankenstörung entgegen und hatte eine deutlich geringere Infiltration von CD11b+ (spezifischer Marker für Makrophagen/Mikroglia) Zellen ins ischämische Gewebe zur Folge. Dies war interessanterweise nicht mit einer Veränderung der Zytokinexpression verknüpft. Zur weiteren Untersuchung der Makrophagenrolle nach Schlaganfall wurde die Dissertation auf LysM-Cre+/-/IKK2-/- Mäuse ausgedehnt. Diese wiesen einen Makrophagen-spezifischen Defekt in der Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nuklearfaktor (NF)-ϰB auf, und konnten folglich inflammatorische Zytokine unter der Transkriptionskontrolle von NF-ϰB nicht synthetisieren. Die Infarktgrößen und neurologischen Defizite der transgenen Tiere waren überraschenderweise vergleichbar mit wildtypischen Wurfgeschwistern. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Makrophagen zumindest nicht durch die Synthese von inflammatorischen Zytokinen zum Gewebeschaden und zu neurologischen Defiziten in der Frühphase nach Schlaganfall beitragen, während Sn, das initial nur auf perivaskulären Makrophagen exprimiert und später im ischämischen Parenchym auf Makrophagen/Mikroglia hochreguliert wird, Einfluss auf das funktionelle Outcome hatte. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Thrombose KW - Entzündung KW - Schlaganfall KW - Makrophage KW - C1-inibitor KW - Sialoadhesin KW - Contact-Kinin System KW - Ischämischer Schlaganfall KW - Bluthirnschranke Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-94534 ER - TY - THES A1 - Kraus, Amelie Johanna T1 - H2A.Z – a molecular guardian of RNA polymerase II transcription in African trypanosomes T1 - H2A.Z – eine molekulare Wächterin der RNA Polymerase II Transkription in Afrikanischen Trypanosomen N2 - In eukaryotes, the enormously long DNA molecules need to be packaged together with histone proteins into nucleosomes and further into compact chromatin structures to fit it into the nucleus. This nuclear organisation interferes with all phases of transcription that require the polymerase to bind to DNA. During transcription – the process in which the hereditary information stored in DNA is transferred to many transportable RNA molecules - nucleosomes form a physical obstacle for polymerase progression. Thus, transcription is usually accompanied by processes mediating nucleosome destabilisation, including post-translational histone modifications (PTMs) or exchange of canonical histones by their variant forms. To the best of our knowledge, acetylation of histones has the highest capability to induce chromatin opening. The lysine modification can destabilise histone-DNA interactions within a nucleosome and can serve as a binding site for various chromatin remodelers that can modify the nucleosome composition. For example, H4 acetylation can impede chromatin folding and can stimulate the exchange of canonical H2A histone by its variant form H2A.Z at transcription start sites (TSSs) in many eukaryotes, including humans. As histone H4, H2A.Z can be post-translationally acetylated and as acetylated H4, acetylated H2A.Z is enriched at TSSs suggested to be critical for transcription. However, thus far, it has been difficult to study the cause and consequence of H2A.Z acetylation. Even though, genome-wide chromatin profiling studies such as ChIP-seq have already revealed the genomic localisation of many histone PTMs and variant proteins, they can only be used to study individual chromatin marks and not to identify all factors important for establishing a distinct chromatin structure. This would require a comprehensive understanding of all marks associated to a specific genomic locus. However, thus far, such analyses of locus-specific chromatin have only been successful for repetitive regions, such as telomeres. In my doctoral thesis, I used the unicellular parasite Trypanosoma brucei as a model system for chromatin biology and took advantage of its chromatin landscape with TSSs comprising already 7% of the total T. brucei genome (humans: 0.00000156%). Atypical for a eukaryote, the protein-coding genes are arranged in long polycistronic transcription units (PTUs). Each PTU is controlled by its own ~10 kb-wide TSS, that lies upstream of the PTU. As observed in other eukaryotes, TSSs are enriched with nucleosomes containing acetylated histones and the histone variant H2A.Z. This is why I used T. brucei to particularly investigate the TSS-specific chromatin structures and to identify factors involved in H2A.Z deposition and transcription regulation in eukaryotes. To this end, I established an approach for locus-specific chromatin isolation that would allow me to identify the TSSs- and non-TSS-specific chromatin marks. Later, combining the approach with a method for quantifying lysine-specific histone acetylation levels, I found H2A.Z and H4 acetylation enriched in TSSs-nucleosomes and mediated by the histone acetyltransferases HAT1 and HAT2. Depletion of HAT2 reduced the levels of TSS-specific H4 acetylation, affected targeted H2A.Z deposition and shifted the sites of transcription initiation. Whereas HAT1 depletion had only a minor effect on H2A.Z deposition, it had a strong effect on H2A.Z acetylation and transcription levels. My findings demonstrate a clear link between histone acetylation, H2A.Z deposition and transcription initiation in the early diverged unicellular parasite T. brucei, which was thus far not possible to determine in other eukaryotes. Overall, my study highlights the usefulness of T. brucei as a model system for studying chromatin biology. My findings allow the conclusion that H2A.Z regardless of its modification state defines sites of transcription initiation, whereas H2A.Z acetylation is essential co-factor for transcription initiation. Altogether, my data suggest that TSS-specific chromatin establishment is one of the earliest developed mechanisms to control transcription initiation in eukaryotes. N2 - In Eukaryoten muss die genomische DNA zusammen mit Histonproteinen zu Nukleosomen und weiter zu kompakten Chromatinstrukturen verpackt werden, damit sie in den Zellkern passt. Diese Organisation behindert die Transkription bei jedem Schritt, bei dem die Polymerase an der DNA bindet. Während der Transkription – dem Prozess bei dem die in der DNA gespeicherte Erbinformation in viele transportable RNA Molekülen umgewandelt wird – stellen Nukleosomen ein physikalisches Hindernis für das Vorankommen der Polymerase dar. Aus diesem Grund wird die Transkription üblicherweise von Prozessen begleitet, die für die Destabilisierung der Nukleosomen sorgen, wie zum Beispiel post-translationale Modifizierung (PTM) der Histone oder der Austausch von kanonischen Histonproteinen durch eine ihrer Varianten. Soweit bisher bekannt ist Histonacetylierung am besten dafür geeignet, eine offene Chromatinstruktur bereit zu stellen. Die Lysinmodifizierung kann Interaktionen zwischen der DNA und den Histonen innerhalb eines Nukleosomes destabilisieren und als Andockstelle für einige Proteinkomplexe sogenannte Chromatin-Modellierer fungieren, die die Zusammensetzung eines Nukleosomes verändern können. Zum Beispiel, kann Acetylierung am Histon H4 das „Zusammenfalten“ des Chromatins erschweren und den Austausch von kanonischem H2A mit ihrer Variante H2A.Z an den Transkriptiosinitiationsstellen (TSSen) in vielen eukaryotischen Organismen, Menschen eingeschlossen, stimulieren. Wie Histon H4, kann auch H2A.Z post-translationell acetyliert werden und wie acetyliertes H4, findet man auch acetyliertes H2A.Z vor allem an TSSen. Deswegen geht man davon aus, dass es sehr wichtig für die Transkriptioninitiierung ist. Allerdings war es bisher nicht möglich, die Ursache und Wirkung von H2A.Z Acetylierung genauer zu untersuchen. Genom-weite Chromatinprofilstudien wie z.B. ChIP-Seq ermöglichen es die genomische Lokalisierung von vielen Histon-Modifizierungen und -Varianten zu bestimmen. Dennoch reichen sie nicht dafür aus alle Faktoren, die für die Bildung einer bestimmten Chromatinstruktur notwendig sind, gleichzeitig herauszufinden. Das würde voraussetzen, dass man alle Merkmale der genomischen Stelle kennt. Bisher waren Analysen von spezifischen Chromatinstellen nur erfolgreich, wenn das Chromatin von einer repetitiven Region, wie z.B. Telomeren, stammt. In meiner Doktorarbeit verwendete ich den einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei als Modelsystem für Chromatinbiologie. Dabei machte ich mir dessen Chromatinorganisation zunutze, die eher untypisch für einen eukaryotische Organismus ist. TSSen machen hier ungefähr 7% des gesamten Genoms aus (Mensch: 0.00000156%). Protein-kodierende Gene sind in langen polycistronischen Transkriptionseinheiten (PTE) angeordnet. Jede dieser Einheiten besitzt eine eigene TSS, die vor der PTE liegt, und bis zu 10 kb lang sein kann. Jedoch, wie in anderen Eukaryoten, sind an den TSSen Nukleosomen angereichert, die sich durch acetylierte Histone und den Einbau der Histonvariante H2A.Z auszeichnen. Aus diesen Gründen verwendete ich T. brucei, um während meiner Doktorarbeit die Chromatinstrukturen, die TSSen auszeichnen, genauer zu untersuchen und die Faktoren, die bei der H2A.Z Positionierung und dadurch bei der Transkriptionsregulation in Eukaryoten eine Rolle spielen, herauszufinden. Dafür etablierte ich zuerst eine Methode, mit der man Chromatin von einer bestimmten genomischen Stelle isolieren kann und die es mir ermöglichen würde, die Merkmale von TSS-spezifischen und -unspezifischen Chromatin zu identifizieren. Später konnte ich das entwickelte Protokoll mit einer Methode zur Quantifizierung von Lysin-spezifischen Histonacetylierung kombinieren. Dadurch konnte ich herausfinden, dass Nukleosomen an trypanosomischen TSSen stark acetyliertes H2A.Z und H4 enthalten und dass für diese Modifizierungen die Histonacetyltransferasen HAT1 und HAT2 verantwortlich sind. Eine Reduzierung der HAT2-Levels führte zu einer Reduzierung von H4 Acetylierung, verschlechterte die gezielte H2A.Z Positionierung und führte dazu, dass die Transkriptioninitiierung sich verlagerte. Wohingegen eine Reduzierung von HAT1, die zwar nur einen kleinen Einfluss auf die H2A.Z Positionierung hatte, eine sehr starke Verringerung von acetyliertem H2A.Z und der Transkriptionsrate zur Folge hatte. Durch meine Ergebnisse konnte ich zeigen, dass in T. brucei, einem evolutionär divergenten eukaryotischem Organismus, die Prozesse der Histonacetylierung, H2A.Z Positionierung und Transkriptionsinitiierung sehr stark miteinander verbunden sind. Meine Arbeit ist des weiteren ein Beweis dafür, dass T. brucei ein sehr wichtiger Modellorganismus für die Forschung an Chromatin ist. Insgesamt erlauben meine Ergebnisse die Schlussfolgerung, dass H2A.Z, egal ob modifiziert oder nicht, ein Herausstellungsmerkmal für TSSen ist, während acetyliertes H2A.Z essentiell für die Transkriptionsinitiierung darstellt. Zusammengefasst, weisen die Daten meiner Doktorarbeit darauf hin, dass die Etablierung von bestimmten Chromatinstrukturen an TSSen eines der frühesten entwickelten Mechanismen zur Kontrolle der Transkriptionsinitiierung in Eukaryoten ist. KW - Chromatin KW - Histone KW - Histonacetyltransferase KW - Transcription KW - Acetylation KW - H2A.Z KW - Trypanosoma Brucei KW - Histone Acetylation KW - Transcription KW - Chromatin KW - Histone KW - Histone modification KW - Histone variant Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250568 ER - TY - THES A1 - Jürges, Christopher Sebastian T1 - Algorithmic methods for elucidating the transcriptomic landscape of herpesviruses T1 - Algorithmische Methoden zur Aufklärung der transkriptomischen Landschaft von Herpesviren N2 - Transcription describes the process of converting the information contained in DNA into RNA. Although, tremendous progress has been made in recent decades to uncover this complex mechanism, it is still not fully understood. Given the advances and reduction in cost of high-throughput sequencing experiments, more and more data have been generated to help elucidating this complex process. Importantly, these sequencing experiments produce massive amounts of data that are incomprehensible in their raw form for humans. Further, sequencing techniques are not always 100% accurate and are subject to a certain degree of variability and, in special cases, they might introduce technical artifacts. Thus, computational and statistical methods are indispensable to uncover the information buried in these datasets. In this thesis, I worked with multiple high throughput datasets from herpes simplex virus 1 (HSV-1) and human cytomegalovirus (HCMV) infections. During the last decade, it has became clear that a gene might not have a single, but multiple sites at which transcription initiates. These multiple transcription start sites (TiSS) demonstrated to have regulatory effects on the gene itself depending on which TiSS is used. Specialized experimental approaches were developed to help identify TiSS (TiSS-profiling). In order to facilitate the identification of all potential TiSS that are used for cell type- and condition-specific transcription, I developed the tool iTiSS. By using a new general enrichment-based approach to predict TiSS, iTiSS proved to be applicable in integrated studies and made it less prone to false positives compared to other TiSS-calling tools. Another improvement in recent years was made in metabolic labeling experiments such as SLAM-seq. Here, they removed the time consuming and laborious step of physically separating new from old RNA in the samples. This was achieved by inducing specific nucleotide conversions in newly synthesized RNA that are later visible in the data. Consequently, the separation of new and old RNA is now done computationally and, hence, tools are needed that accurately quantify these fold-changes. My second tool that I developed, called GRAND-SLAM proved to be capable to accomplish this task and outperform competing programs. As both of my tools, iTiSS and GRAND-SLAM are not specifically tailored to my own goals, but could also facilitate the research of other groups in this field, I made them publicly available on GitHub. I applied my tools to datasets generated in our lab as well as to publicly available data sets from HSV-1 and HCMV, respectively. For HSV-1, I was able to predict and validate TiSS with nucleotide precision using iTiSS. This has lead to the most comprehensive annotation for HSV-1 to date, which now serves as the fundamental basis of any future transcriptomic research on HSV-1. By combining both my tools, I was further able to uncover parts of the highly complex gene kinetics in HCMV and to resolve the limitations caused by the densely packed genome of HCMV. With the ever-increasing advances in sequencing techniques and their decrease in cost, the amounts of data produced will continue to rise massively in the future. Additionally, more and more specialized omics approaches are appearing, calling for new tools to leverage their full information potential. Consequently, it has become apparent that specialized computational tools such as iTiSS and GRAND-SLAM are needed and will become an essential and indispensable part of the analysis. N2 - Transkription beschreibt den Prozess des Umwandelns von DNA-Information in RNA- Information. Obwohl in den letzten Jahrzehnten enorme Fortschritte bei der Aufdeckung dieses komplexen Mechanismus erzielt wurden, ist dieser Prozess bis heute noch nicht vollends verstanden. Mit den Fortschritten und der Kostensenkung bei den Hochdurchsatzexperimenten wurden immer mehr Daten gewonnen, die zur Aufklärung dieses komplexen Prozesses beitragen. Diese Sequenzierungsexperimente erzeugen allerdings riesige Datenmengen, welche in ihrer Rohform für den Menschen unverständlich sind. Darüber hinaus sind Sequenzierungstechniken nicht immer zu 100% genau und unterliegen einer gewissen Variabilität. In besonderen Fällen können sie sogar technische Artefakte enthalten. Daher sind computergestützte und statistische Methoden unerlässlich, um die in diesen Datensätzen verborgenen Informationen aufzudecken. In dieser Arbeit habe ich mit mehreren Hochdurchsatzdatensätzen von Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) und Humanem Cytomegalovirus (HCMV) gearbeitet. In den letzten Jahrzehnten wurde deutlich, dass ein Gen möglicherweise nicht nur eine einzige, sondern mehrere Transkriptionsstartpunkte (TiSS) besitzt. Diese multiplen TiSS haben nachweislich regulatorische Auswirkungen auf das Gen selbst, je nachdem, welche TiSS verwendet wird. Nachfolgend wurden demnach spezielle experimentelle Ans ̈atze entwickelt, um TiSS zu identifizieren (TiSS-Profiling). Um die Identifizierung aller potenziellen TiSS zu erleichtern, die für die zelltyp- und zustandsspezifische Transkription verwendet werden, habe ich das Programm iTiSS entwickelt. Durch die Verwendung eines neuen, auf allgemeiner Anreicherung basierenden Ansatzes zur Vorhersage von TiSS erwies sich iTiSS in integrier- ten Studien als anwendbar und war im Vergleich zu anderen TiSS-Erkennungsprogrammen weniger anfällig für falsch positive Ergebnisse. Eine weitere Verbesserung in jüngster Zeit wurde bei metabolischen Markierungsexperimenten wie SLAM-seq erzielt. Hier wurde der zeitaufwändige und mühsame Schritt der physischen Trennung von neuer und alter RNA in den Proben entfernt. Dies wurde erreicht, indem spezifische Nukleotidumwandlungen in neu synthetisierter RNA induziert wurden, die später in den Daten sichtbar sind. Da- her wird die Trennung von neuer und alter RNA jetzt per Computer vorgenommen. Dies benötigt daraufhin nun aber neue Programme, welche in der Lage sind diese Werte genau zu quantifizieren. Mein zweites von mir entwickeltes Tool namens GRAND-SLAM hat sich als fähig erwiesen, diese Aufgabe zu erfüllen und übertraf konkurrierende Programme. Da meine beiden Tools, iTiSS und GRAND-SLAM, nicht speziell auf meine eigenen Ziele zugeschnitten sind, sondern auch die Forschung anderer Gruppen in diesem Bereich erleichtern könnten, habe ich sie auf GitHub öffentlich zugänglich gemacht. Ich habe meine Tools auf Datensätze angewandt, die in unserem Labor erzeugt wurden, sowie auf öffentlich verfügbare Datensätze von HSV-1 bzw. HCMV. Fu ̈r HSV-1 konnte ich mit iTiSS TiSS mit Nukleotidpräzision vorhersagen und validieren. Dies hat zu der bisher umfassendsten Annotation für HSV-1 geführt, die nun als grundlegende Basis für jede zukünftige transkriptomische Forschung zu HSV-1 dient. Durch die Kombination meiner beiden Programme konnte ich außerdem Teile der hochkomplexen Genkinetik von HCMV aufdecken und die durch das dicht gepackte Genom von HCMV verursachten Einschränkungen überwinden. Mit den zunehmenden Fortschritten bei den Sequenzierungstechniken und den sinkenden Kosten wird die Menge der produzierten Daten in Zukunft weiter massiv ansteigen. Darüber hinaus gibt es immer mehr spezialisierte ”Omics”-Ansätze, die neue Programme erfordern, um ihr Informationspotenzial vollständig auszuschöpfen. Folglich ist es offensichtlich geworden, dass spezialisierte Computerprogramme wie iTiSS und GRAND-SLAM benötigt werden und zu einem wesentlichen und unverzichtbaren Teil der Analyse werden. KW - Herpesviren KW - Herpesviruses Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-272825 ER - TY - THES A1 - Somody, Joseph Christian Campbell T1 - Leveraging deep learning for identification and structural determination of novel protein complexes from \(in\) \(situ\) electron cryotomography of \(Mycoplasma\) \(pneumoniae\) T1 - Tiefenlernen als Werkzeug zur Identifizierung und Strukturbestimmung neuer Proteinkomplexe aus der \(in\)-\(situ\)-Elektronenkryotomographie von \(Mycoplasma\) \(pneumoniae\) N2 - The holy grail of structural biology is to study a protein in situ, and this goal has been fast approaching since the resolution revolution and the achievement of atomic resolution. A cell's interior is not a dilute environment, and proteins have evolved to fold and function as needed in that environment; as such, an investigation of a cellular component should ideally include the full complexity of the cellular environment. Imaging whole cells in three dimensions using electron cryotomography is the best method to accomplish this goal, but it comes with a limitation on sample thickness and produces noisy data unamenable to direct analysis. This thesis establishes a novel workflow to systematically analyse whole-cell electron cryotomography data in three dimensions and to find and identify instances of protein complexes in the data to set up a determination of their structure and identity for success. Mycoplasma pneumoniae is a very small parasitic bacterium with fewer than 700 protein-coding genes, is thin enough and small enough to be imaged in large quantities by electron cryotomography, and can grow directly on the grids used for imaging, making it ideal for exploratory studies in structural proteomics. As part of the workflow, a methodology for training deep-learning-based particle-picking models is established. As a proof of principle, a dataset of whole-cell Mycoplasma pneumoniae tomograms is used with this workflow to characterize a novel membrane-associated complex observed in the data. Ultimately, 25431 such particles are picked from 353 tomograms and refined to a density map with a resolution of 11 Å. Making good use of orthogonal datasets to filter search space and verify results, structures were predicted for candidate proteins and checked for suitable fit in the density map. In the end, with this approach, nine proteins were found to be part of the complex, which appears to be associated with chaperone activity and interact with translocon machinery. Visual proteomics refers to the ultimate potential of in situ electron cryotomography: the comprehensive interpretation of tomograms. The workflow presented here is demonstrated to help in reaching that potential. N2 - Der heilige Gral der Strukturbiologie ist die Untersuchung eines Proteins in situ, und dieses Ziel ist seit der Auflösungsrevolution und dem Erreichen der atomaren Auflösung in greifbare Nähe gerückt. Das Innere einer Zelle ist keine verdünnte Umgebung, und Proteine haben sich so entwickelt, dass sie sich falten und so funktionieren, wie es in dieser Umgebung erforderlich ist; daher sollte die Untersuchung einer zellulären Komponente idealerweise die gesamte Komplexität der zellulären Umgebung umfassen. Die Abbildung ganzer Zellen in drei Dimensionen mit Hilfe der Elektronenkryotomographie ist die beste Methode, um dieses Ziel zu erreichen, aber sie ist mit einer Beschränkung der Probendicke verbunden und erzeugt verrauschte Daten, die sich nicht für eine direkte Analyse eignen. In dieser Dissertation wird ein neuartiger Workflow zur systematischen dreidimensionalen Analyse von Ganzzell-Elektronenkryotomographiedaten und zur Auffindung und Identifizierung von Proteinkomplexen in diesen Daten entwickelt, um eine erfolgreiche Bestimmung ihrer Struktur und Identität zu ermöglichen. Mycoplasma pneumoniae ist ein sehr kleines parasitäres Bakterium mit weniger als 700 proteinkodierenden Genen. Es ist dünn und klein genug, um in grossen Mengen durch Elektronenkryotomographie abgebildet zu werden, und kann direkt auf den für die Abbildung verwendeten Gittern wachsen, was es ideal für Sondierungsstudien in der strukturellen Proteomik macht. Als Teil des Workflows wird eine Methodik für das Training von Deep-Learning-basierten Partikelpicken-Modellen entwickelt. Als Proof-of-Principle wird ein Dataset von Ganzzell-Tomogrammen von Mycoplasma pneumoniae mit diesem Workflow verwendet, um einen neuartigen membranassoziierten Komplex zu charakterisieren, der in den Daten beobachtet wurde. Insgesamt wurden 25431 solcher Partikel aus 353 Tomogrammen gepickt und zu einer Dichtekarte mit einer Auflösung von 11 Å verfeinert. Unter Verwendung orthogonaler Datensätze zur Filterung des Suchraums und zur Überprüfung der Ergebnisse wurden Strukturen für Protein-Kandidaten vorhergesagt und auf ihre Eignung für die Dichtekarte überprüft. Letztendlich wurden mit diesem Ansatz neun Proteine als Bestandteile des Komplexes gefunden, der offenbar mit der Chaperonaktivität in Verbindung steht und mit der Translocon-Maschinerie interagiert. Das ultimative Potenzial der In-situ-Elektronenkryotomographie – die umfassende Interpretation von Tomogrammen – wird als visuelle Proteomik bezeichnet. Der hier vorgestellte Workflow soll dabei helfen, dieses Potenzial auszuschöpfen. KW - Kryoelektronenmikroskopie KW - Tomografie KW - Mycoplasma pneumoniae KW - Deep learning KW - cryo-EM KW - cryo-ET KW - tomography KW - mycoplasma KW - pneumoniae KW - deep learning KW - particle picking KW - membrane protein KW - visual proteomics Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313447 ER - TY - THES A1 - Landwehr, Laura-Sophie T1 - Steroid Hormones and Cancer Immunity - learning from Adrenocortical Carcinoma T1 - Steroidhormone und Tumorimmunität im Nebennierenrindenkarzinom N2 - Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare, but highly aggressive endocrine malignancy. Tumor-related hypercortisolism is present in 60 % of patients and associated with worse outcome. While cancer immunotherapies have revolutionized the treatment of many cancer entities, the results of initial studies of different immune checkpoint inhibitors in ACC were heterogeneous. Up to now, five small clinical trials with a total of 121 patients have been published and demonstrated an objective response in only 17 patients. However, one of the studies, by Raj et al., reported a clinically meaningful disease control rate of 52 % and a median overall survival of almost 25 months suggesting that a subgroup of ACC patients may benefit from immunotherapeutic approaches. Following the hypothesis that some ACCs are characterized by a glucocorticoid-induced T lymphocytes depletion, several studies were performed as part of the presented thesis. First, the immune cell infiltration in a large cohort of 146 ACC specimens was investigated. It was demonstrated for the first time, and against the common assumption, that ACCs were infiltrated not only by FoxP3+ regulatory T cells (49.3 %), but also that a vast majority of tumor samples was infiltrated by CD4+ TH cells (74 %) and CD8+ cytotoxic T cells (84.3 %), albeit the immune cell number varied heterogeneously and was rather low (median: 7.7 CD3+ T cells / high power field, range: 0.1-376). Moreover, the presence of CD3+-, CD4+- and CD8+ ACC-infiltrating lymphocytes was associated with an improved recurrence-free (HR: 0.31 95 % CI 0.11-0.82) and overall survival (HR: 0.47 96 % CI 0.25-0.87). Particularly, patients with tumor-infiltrating CD4+ TH cells without glucocorticoid excess had a significantly longer overall survival compared to patients with T cell-depleted ACC and hypercortisolism (121 vs. 27 months, p = 0.004). Hence, the impact of glucocorticoids might to some extent be responsible for the modest immunogenicity in ACC as hypercortisolism was reversely correlated with the number of CD4+ TH cells. Accordingly, CD3+ T cells co-cultured with steroidogenic NCI-H295R ACC cells demonstrated in vitro an enhanced anti-tumoral cytotoxicity by secreting 747.96 ±225.53 pg/ml IFN-γ in a therapeutically hormone-depleted microenvironment (by incubation with metyrapone), versus only 276.02 ±117.46 pg/ml IFN-γ in a standard environment with glucocorticoid excess. Other potential biomarkers to predict response to immunotherapies are the immunomodulatory checkpoint molecules, programmed cell death 1 (PD-1) and its ligand PD-L1, since both are targets of antibodies used therapeutically in different cancer entities. In a subcohort of 129 ACCs, expressions of both molecules were heterogeneous (PD-1 17.4 %, range 1-15; PD-L1 24.4 %, range 1 - 90) and rather low. Interestingly, PD-1 expression significantly influenced ACC patients´ overall (HR: 0.21 95 % CI 0.53-0.84) and progression- free survival (HR: 0.30 95 % CI 0.13-0.72) independently of established factors, like ENSAT tumor stage, resection status, Ki67 proliferation index and glucocorticoid excess, while PD-L1 had no impact. In conclusion, this study provides several potential explanations for the heterogeneous results of the immune checkpoint therapy in advanced ACC. In addition, the establishment of PD-1 as prognostic marker can be easily applied in routine clinical care, because it is nowadays anyway part of a detailed histo-pathological work-up. Furthermore, these results provide the rationale and will pave the way towards a combination therapy using immune checkpoint inhibitors as well as glucocorticoid blockers. This will increase the likelihood of re-activating the immunological anti-tumor potential in ACC. However, this will have to be demonstrated by additional preclinical in vivo experiments and finally in clinical trials with patients. N2 - Das Nebennierenrindenkarzinom (ACC) ist ein seltenes, aber äußerst aggressives endokrines Malignom. Ein tumorbedingter Hyperkortisolismus liegt bei 60 % der Patienten vor und ist mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Während Krebsimmuntherapien die Behandlung vieler Krebsentitäten revolutioniert haben, waren die Ergebnisse der ersten Studien zu verschiedenen Immun-Checkpoint-Inhibitoren beim ACC heterogen. Die fünf klinischen Studien mit insgesamt 121 Patienten zeigten ein objektives Ansprechen bei nur 17 Patienten. Eine Studie von Raj et al. berichtete über eine klinisch bedeutsame Krankheitskontrollrate von 52 % und ein medianes Gesamtüberleben von fast 25 Monaten. Diese beträchtliche Anti-Tumor-Aktivität legt nahe, dass eine Subgruppe von ACC-Patienten von immuntherapeutischen Ansätzen profitieren könnte. Der Hypothese folgend, dass einige ACCs durch eine Glukokortikoid-induzierte T Lymphozyten-Depletion gekennzeichnet sind, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit mehrere Studien durchgeführt. Zunächst wurde die Immunzellinfiltration in einer großen Kohorte von 146 ACC-Proben untersucht. Entgegen der verbreiteten Annahme konnte erstmals gezeigt werden, dass ACCs nicht nur von FoxP3+ regulatorischen T Zellen (49,3 %), sondern die Mehrheit der ACCs von CD4+ TH (74 %) und CD8+ zytotoxischen T Zellen (84,3 %) infiltriert wurde, wenngleich die Immunzellanzahl heterogen und eher gering war (7,7 CD3+ T Zellen/HPF). Darüber hinaus war die Präsenz von CD3+-, CD4+- und CD8+ ACC-infiltrierenden Lymphozyten mit einem rezidivfreien (HR:0,31;95%CI0,11-0,82) und verbesserten Gesamtüberleben (HR:0,47;95%CI 0,25-0,87) assoziiert. Insbesondere Patienten mit tumorinfiltrierenden CD4+ TH Zellen ohne Glukokortikoid-Überschuss hatten im Vergleich zu Patienten mit T Zell-depletiertem ACC und Hyperkortisolismus ein signifikant län- geres Gesamtüberleben (121 vs. 27 Monate; p = 0.004). Daher könnte die Wirkung von Glukokortikoiden für die moderate Immunogenität verantwortlich sein, da Hyperkortisolismus umgekehrt mit der Zahl der CD4+ TH Zellen korreliert war. Dementsprechend zeigten CD3+ T Zellen, die mit steroid-produzierenden NCI-H295R ACC-Zellen co-kultiviert wurden, in vitro eine erhöhte anti-tumorale Zytotoxizität in einem durch Metyrapon-induzierten Mikromilieu ohne Glukokortikoide im Vergleich zu einem Glukokortikoid- Überschuss (IFN-γ Sekretion: 747,96 pg/ml vs. 276,02 pg/ml). Andere potenzielle Biomarker zur Vorhersage des Ansprechens auf Immuntherapien sind die immunmodulatorischen Checkpoint-Moleküle, Programmed cell death 1 (PD-1) und sein Ligand PD-L1, da beide Ziele von Antikörpern sind, die therapeutisch bei verschiedenen Krebsentitäten eingesetzt werden. In einer Subkohorte von 129 ACCs waren die Expressionen beider Moleküle heterogen (PD-1 17,4 %, PD-L1 24,4 %). Interessanterweise beeinflusste die PD-1-Expression signifikant das Gesamtüberleben (HR: 0,21; 95 % CI 0,53-0,84) und das progressionsfreie Überleben (HR: 0,30; 95 % CI 0,13-0.72) unabhängig von etablierten Faktoren, wie dem ENSAT Tumorstadium, Resektionsstatus, Ki67 Proliferationsindex und Glukokortikoid-Überschuss, während PD-L1 keinen Einfluss hatte. Zusammenfassend liefert diese Studie mehrere mögliche Erklärungen für die heterogenen Ergebnisse der Immun-Checkpoint-Therapie bei fortgeschrittenem ACC. Darüber hinaus ist die Etablierung von PD-1 als prognostischer Marker anwendbar als Teil einer detaillierten histo-pathologischen Untersuchung. Zudem liefern diese Ergebnisse die Rationale und ebnen den Weg für eine Kombinationstherapie von Immun-Check- point-Inhibitoren sowie Anti-Glukokortikoiden, um die Wahrscheinlichkeit einer Reaktivierung des immu- nologischen Anti-Tumor-Potenzials beim ACC zu erhöhen. Dies muss jedoch durch zusätzliche präklinische in vivo Experimente und schließlich in klinischen Studien mit Patienten nachgewiesen werden. KW - Steroidhormon KW - Nebenniere KW - Krebs KW - Immuntherapie KW - Immunsuppression KW - Immune Checkpoint Therapy KW - Immune System KW - T Lymphocyte KW - T Helper Cell KW - Glucocorticoids KW - Cytotoxic T cell KW - Programmed Cell Death 1 KW - Programmed Cell Death Ligand 1 KW - Adrenocortical Carcinoma KW - Nebennierenrindenkarzinom Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251895 ER - TY - THES A1 - Gensler, Marius E. T1 - Simultaneous printing of tissue and customized bioreactor T1 - Simultanes Drucken von Gewebe und angepasstem Bioreaktor N2 - Additive manufacturing processes such as 3D printing are booming in the industry due to their high degree of freedom in terms of geometric shapes and available materials. Focusing on patient-specific medicine, 3D printing has also proven useful in the Life Sciences, where it exploits the shape fidelity for individualized tissues in the field of bioprinting. In parallel, the current systems of bioreactor technology have adapted to the new manufacturing technology as well and 3D-printed bioreactors are increasingly being developed. For the first time, this work combines the manufacturing of the tissue and a tailored bioreactor, significantly streamlining the overall process and optimally merging the two processes. This way the production of the tissues can be individualized by customizing the reactor to the tissue and the patient-specific wound geometry. For this reason, a common basis and guideline for the cross-device and cross-material use of 3D printers was created initially. Their applicability was demonstrated by the iterative development of a perfusable bioreactor system, made from polydimethylsiloxane (PDMS) and a lignin-based filament, into which a biological tissue of flexible shape can be bioprinted. Cost-effective bioink-replacements and in silico computational fluid dynamics simulations were used for material sustainability and shape development. Also, nutrient distribution and shear stress could be predicted in this way pre-experimentally. As a proof of functionality and adaptability of the reactor, tissues made from a nanocellulose-based Cellink® Bioink, as well as an alginate-based ink mixed with Me-PMeOx100-b-PnPrOzi100-EIP (POx) (Alginate-POx bioink) were successfully cultured dynamically in the bioreactor together with C2C12 cell line. Tissue maturation was further demonstrated using hMSC which were successfully induced to adipocyte differentiation. For further standardization, a mobile electrical device for automated media exchange was developed, improving handling in the laboratory and thus reduces the probability of contamination. N2 - Additive Fertigungsverfahren wie der 3D-Druck boomen in der Industrie aufgrund ihres hohen Freiheitsgrads in Bezug auf geometrische Formen und verfügbare Materialien. Mit Blick auf die patientenspezifische Medizin hat sich der 3D-Druck auch in den Biowissenschaften bewährt, wo er die Formtreue für individualisierte Gewebe im Bereich des Bioprinting nutzt. Parallel dazu haben sich auch die derzeitigen Systeme der Bioreaktortechnologie an die neue Fertigungstechnologie angepasst, und es werden zunehmend 3D-gedruckte Bioreaktoren entwickelt. In dieser Arbeit werden erstmals die Herstellung des Gewebes und ein maßgeschneiderter Bioreaktor kombiniert, wodurch der Gesamtprozess erheblich gestrafft und beide Verfahren optimal zusammengeführt werden. Auf diese Weise kann die Herstellung der Gewebe individualisiert werden, indem der Reaktor an das Gewebe und die patientenspezifische Wundgeometrie angepasst wird. Aus diesem Grund wurde zunächst eine gemeinsame Basis und Leitlinie für den Geräte- und Materialübergreifenden Einsatz von 3D-Druckern geschaffen. Deren Anwendbarkeit wurde durch die iterative Entwicklung eines perfundierbaren Bioreaktorsystems aus Polydimethylsiloxan (PDMS) und einem Lignin-basierten Filament demonstriert, in das ein biologisches Gewebe mit flexibler Form gedruckt werden kann. Kostengünstige Biotintenalternativen und emph in silico Computational Fluid Dynamics Simulationen wurden für eine materialschonende Formentwicklung verwendet. Nährstoffverteilung und Scherspannung konnten auf diese Weise präexperimentell vorhergesagt werden. Als Beweis für die Funktionalität und Anpassbarkeit des Reaktors wurden Gewebe aus einer Cellink® Bioink auf Nanocellulosebasis sowie einer Tinte auf Alginatbasis, welche mit Me-PMeOx100-b-PnPrOzi100-EIP (POx) gemischt wurde (Alginat-POx-Bioink), erfolgreich zusammen mit C2C12-Zelllinie dynamisch im Reaktor kultiviert. Die Gewebereifung wurde außerdem mit hMSC demonstriert, die erfolgreich zur adipozyten Differenzierung induziert wurden. Zur weiteren Standardisierung wurde ein mobiles elektrisches Gerät für den automatischen Medienwechsel entwickelt, welches die Handhabung im Labor verbessert und damit die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination deutlich verringert. KW - 3 D bioprinting KW - Tissue Engineering KW - Bioreactor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-280190 ER - TY - THES A1 - Allgaier, Johannes T1 - Machine Learning Explainability on Multi-Modal Data using Ecological Momentary Assessments in the Medical Domain T1 - Erklärbarkeit von maschinellem Lernen unter Verwendung multi-modaler Daten und Ecological Momentary Assessments im medizinischen Sektor N2 - Introduction. Mobile health (mHealth) integrates mobile devices into healthcare, enabling remote monitoring, data collection, and personalized interventions. Machine Learning (ML), a subfield of Artificial Intelligence (AI), can use mHealth data to confirm or extend domain knowledge by finding associations within the data, i.e., with the goal of improving healthcare decisions. In this work, two data collection techniques were used for mHealth data fed into ML systems: Mobile Crowdsensing (MCS), which is a collaborative data gathering approach, and Ecological Momentary Assessments (EMA), which capture real-time individual experiences within the individual’s common environments using questionnaires and sensors. We collected EMA and MCS data on tinnitus and COVID-19. About 15 % of the world’s population suffers from tinnitus. Materials & Methods. This thesis investigates the challenges of ML systems when using MCS and EMA data. It asks: How can ML confirm or broad domain knowledge? Domain knowledge refers to expertise and understanding in a specific field, gained through experience and education. Are ML systems always superior to simple heuristics and if yes, how can one reach explainable AI (XAI) in the presence of mHealth data? An XAI method enables a human to understand why a model makes certain predictions. Finally, which guidelines can be beneficial for the use of ML within the mHealth domain? In tinnitus research, ML discerns gender, temperature, and season-related variations among patients. In the realm of COVID-19, we collaboratively designed a COVID-19 check app for public education, incorporating EMA data to offer informative feedback on COVID-19-related matters. This thesis uses seven EMA datasets with more than 250,000 assessments. Our analyses revealed a set of challenges: App user over-representation, time gaps, identity ambiguity, and operating system specific rounding errors, among others. Our systematic review of 450 medical studies assessed prior utilization of XAI methods. Results. ML models predict gender and tinnitus perception, validating gender-linked tinnitus disparities. Using season and temperature to predict tinnitus shows the association of these variables with tinnitus. Multiple assessments of one app user can constitute a group. Neglecting these groups in data sets leads to model overfitting. In select instances, heuristics outperform ML models, highlighting the need for domain expert consultation to unveil hidden groups or find simple heuristics. Conclusion. This thesis suggests guidelines for mHealth related data analyses and improves estimates for ML performance. Close communication with medical domain experts to identify latent user subsets and incremental benefits of ML is essential. N2 - Einleitung. Unter Mobile Health (mHealth) versteht man die Nutzung mobiler Geräte wie Handys zur Unterstützung der Gesundheitsversorgung. So können Ärzt:innen z. B. Gesundheitsinformationen sammeln, die Gesundheit aus der Ferne überwachen, sowie personalisierte Behandlungen anbieten. Man kann maschinelles Lernen (ML) als System nutzen, um aus diesen Gesundheitsinformationen zu lernen. Das ML-System versucht, Muster in den mHealth Daten zu finden, um Ärzt:innen zu helfen, bessere Entschei- dungen zu treffen. Zur Datensammlung wurden zwei Methoden verwendet: Einerseits trugen zahlreiche Personen zur Sammlung von umfassenden Informationen mit mo- bilen Geräten bei (sog. Mobile Crowdsensing), zum anderen wurde den Mitwirkenden digitale Fragebögen gesendet und Sensoren wie GPS eingesetzt, um Informationen in einer alltäglichen Umgebung zu erfassen (sog. Ecologcial Momentary Assessments). Diese Arbeit verwendet Daten aus zwei medizinischen Bereichen: Tinnitus und COVID-19. Schätzungen zufolge leidet etwa 15 % der Menschheit an Tinnitus. Materialien & Methoden. Die Arbeit untersucht, wie ML-Systeme mit mHealth Daten umgehen: Wie können diese Systeme robuster werden oder neue Dinge lernen? Funktion- ieren die neuen ML-Systeme immer besser als einfache Daumenregeln, und wenn ja, wie können wir sie dazu bringen, zu erklären, warum sie bestimmte Entscheidungen treffen? Welche speziellen Regeln sollte man außerdem befolgen, wenn man ML-Systeme mit mHealth Daten trainiert? Während der COVID-19-Pandemie entwickelten wir eine App, die den Menschen helfen sollte, sich über das Virus zu informieren. Diese App nutzte Daten der Krankheitssymptome der App Nutzer:innen, um Handlungsempfehlungen für das weitere Vorgehen zu geben. Ergebnisse. ML-Systeme wurden trainiert, um Tinnitus vorherzusagen und wie er mit geschlechtsspezifischen Unterschieden zusammenhängen könnte. Die Verwendung von Faktoren wie Jahreszeit und Temperatur kann helfen, Tinnitus und seine Beziehung zu diesen Faktoren zu verstehen. Wenn wir beim Training nicht berücksichtigen, dass ein App User mehrere Datensätze ausfüllen kann, führt dies zu einer Überanpassung und damit Verschlechterung des ML-Systems. Interessanterweise führen manchmal einfache Regeln zu robusteren und besseren Modellen als komplexe ML-Systeme. Das zeigt, dass es wichtig ist, Experten auf dem Gebiet einzubeziehen, um Überanpassung zu vermeiden oder einfache Regeln zur Vorhersage zu finden. Fazit. Durch die Betrachtung verschiedener Langzeitdaten konnten wir neue Empfehlun- gen zur Analyse von mHealth Daten und der Entwicklung von ML-Systemen ableiten. Dabei ist es wichtig, medizinischen Experten mit einzubeziehen, um Überanpassung zu vermeiden und ML-Systeme schrittweise zu verbessern. KW - Maschinelles Lernen KW - Explainable Artificial Intelligence KW - Mobile Health KW - Machine Learning KW - Explainable AI KW - Mobile Crowdsensing KW - Ecological Momentary Assessments Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-351189 ER - TY - THES A1 - Schulz, Ellina T1 - Lokale Ultraschall-vermittelte Zytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren T1 - Local ultrasound mediated cytostatic drug application for the treatment of brain tumors N2 - Glioblastoma (GBM) sind bösartige hirneigene Tumore, deren schlechte Prognose einer innovativen Therapie bedarf. Aus diesem Grund wurde ein neuer Therapieansatz entwickelt, der auf einer lokalen Ultraschall-vermittelten Zytostatika Applikation beruht. Hierfür wurden stabile Microbubbles (MB) bestehend aus Phospholipiden synthetisiert. Es konnte gezeigt werden, dass MB als auch fokussierter Ultraschall niedriger Intensität (LIFU) keinen negativen Einfluss auf GBM-Zellen hat. MB hingegen konnten mittels LIFU destruiert werden, wodurch das in den MB eingeschlossene Chemotherapeutikum freigesetzt werden kann. Es wurden verschiedene Platin(II)- und Palladium(II)-Komplexe auf GBM Zellen getestet. Zur Beladung der MB wurde Doxorubicin (Dox) verwendet. Es konnte eine Beladungseffizienz der MB mit Dox von 52 % erreicht werden, auch eine Aufreinigung dieser mittel Ionenaustausch-Chromatographie und Dialyse war erfolgreich. Die Austestung der mit Dox beladenen MB (MBDox) erfolgte auf GBM-Zellen in 2D- und 3D-Zelkulturmodellen. Dabei zeigte sich, dass die Behandlung mit MBDox und LIFU für 48 h eine zytotoxische Wirkung hatte, die sich signifikant von der Behandlung mit MBDox ohne LIFU unterschied. Zur Austestung der MBDox in 3D-Zellkulturmodellen wurden zwei Scaffold-Systeme eingesetzt. Es zeigte sich in den Versuchen, dass MBDox mit LIFU im Vergleich zu MBDox ohne LIFU Applikation einen zytotoxischen Effekt auf GBM-Zellen haben. Somit konnte die Wirksamkeit der Zytostatika Applikation mittels MB und LIFU in 2D- und 3D-Zellkulturmodellen erfolgreich etabliert werden. Als weiterer Schritt wurden zwei 3D in vitro Modelle erarbeitet. Dabei wurden zunächst organotypische hippocampale Slice Kulturen (organotypic hippocampal brain slice cultures, OHSC) aus der Maus hergestellt und anschließend mit fluoreszent-markierten Mikrotumoren aus GBM-Zelllinien, Primärzellen (PZ) und aus Patienten generierten GBM-Organoiden hergestellt. Diese GBM-Modelle wurden mit Tumor Treating Fields (TTFields) behandelt. Dabei war eine Abnahme der Tumorgröße von Mikrotumoren aus GBM-Zellen und PZ unter TTFields-Behandlung für 72 h messbar. Als weiteres in vitro Modell wurden humane Tumorschnitte aus intraoperativ entferntem GBM-Patientenmaterial hergestellt. Die Schnitte wiesen ein heterogenes Ansprechen nach 72 h TTFields-Applikation auf. Dies spiegelt die Heterogenität des GBM sehr gut wider und bestärkt die Eignung des Modelles zur Untersuchung von neuen Therapieansätzen zur Behandlung von GBM. N2 - Glioblastoma (GBM) are malignant brain tumor with a poor prognosis requiring innovative therapy. For this reason, a new therapeutic approach based on local ultrasound-mediated cytostatic application is now being established. For this purpose, stable microbubbles (MB) consisting of phospholipids were synthesized. It could be shown that MB as well as focused low intensity ultrasound (LIFU) had no negative effect on GBM cells. MB, on the other hand, could be destroyed by LIFU, allowing the release of the chemotherapeutic agent entrapped in MB. Different platinum(II) and palladium(II) complexes were tested on GBM cells. Doxorubicin (Dox) was used to load the MB. Loading efficiency of MB with Dox of 52% was achieved, and purification of these by ion-exchange chromatography and dialysis was also successful. Dox-loaded MB (MBDox) was tested on GBM cells in 2D and 3D cell culture models. This showed that treatment with MBDox and LIFU for 48 h had a cytotoxic effect that was significantly different from treatment with MBDox without LIFU. Two scaffold systems were used to test MBDox in 3D cell culture models. It was shown in the experiments that MBDox with LIFU had a cytotoxic effect on GBM cells compared with MBDox without LIFU application. Thus, the efficacy of cytostatic drug application using MB and LIFU was successfully established in 2D and 3D cell culture models. As a further step, two 3D in vitro models were developed. Here, organotypic hippocampal brain slice cultures (OHSC) were first prepared from mice and then with fluorescent-labeled microtumors from GBM cell lines, primary cells (PZ), and GBM organoids generated from patients. These GBM models were treated with tumor treating fields (TTFields). Thereby, a decrease in tumor size of microtumors derived from GBM cells and PZ was measurable under TTFields treatment for 72 h. As another in vitro model, human tumor sections were prepared from intraoperatively removed GBM patient material. The sections showed heterogeneous responses after 72 h of TTFields application. This reflects the heterogeneity of GBM very well and reinforces the suitability of the model to investigate new therapeutic approaches for the treatment of GBM. KW - Glioblastom KW - Hirntumor KW - Ultraschall KW - Microbubbles KW - Glioblastoma KW - Slice Culture KW - 3D cell culture Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320168 ER - TY - THES A1 - Baumann, Juliane T1 - Studies on the influence of mutations in the Myh9 gene on platelet function T1 - Studien zum Einfluss von Mutationen im Myh9 Gen auf die Thrombozytenfunktion N2 - The platelet cytoskeleton ensures normal size and discoid shape under resting conditions and undergoes immediate reorganization in response to changes in the extracellular environment through integrin-based adhesion sites, resulting in actomyosin-mediated contractile forces. Mutations in the contractile protein non-muscle myosin heavy chain IIA display, among others, macrothrombocytopenia and a mild to moderate bleeding tendency in human patients. It is insufficiently understood which factors contribute to the hemostatic defect found in MYH9-related disease patients. Therefore, a better understanding of the underlying biophysical mechanisms in thrombus formation and stabilization is warranted. This thesis demonstrates that an amino acid exchange at the positions 702, 1424 and 1841 in the heavy chain of the contractile protein non-muscle myosin IIA, caused by heterozygous point mutations in the gene, resulted in macrothrombocytopenia and increased bleeding in mice, reflecting the clinical hallmark of the MYH9-related disease in human patients. Basic characterization of biological functions of Myh9 mutant platelets revealed overall normal surface glycoprotein expression and agonist-induced activation when compared to wildtype platelets. However, myosin light chain phosphorylation after thrombin-activation was reduced in mutant platelets, resulting in less contractile forces and a defect in clot retraction. Altered biophysical characteristics with lower adhesion and interaction forces of Myh9 mutant platelets led to reduced thrombus formation and stability. Platelets from patients with the respective mutations recapitulated the findings obtained with murine platelets, such as impaired thrombus formation and stiffness. Besides biological and biophysical characterization of mutant platelets from mice and men, treatment options were investigated to prevent increased bleeding caused by reduced platelet forces. The antifibrinolytic agent tranexamic acid was applied to stabilize less compact thrombi, which are presumably more vulnerable to fibrinolysis. The hemostatic function in Myh9 mutant mice was improved by interfering with the fibrinolytic system. These results show the beneficial effect of fibrin stabilization to reduce bleeding in MYH9-related disease. N2 - Das thrombozytäre Zytoskelett gewährleistet eine normale Zellgröße und diskoide Form unter ruhenden Bedingungen. Als Reaktion auf Veränderungen in der extrazellulären Umgebung wird das Zytoskelett durch Integrin-basierte Adhäsionsstellen reorganisiert, was zu Aktomyosin-vermittelten kontraktilen Kräften führt. Mutationen in der schweren Kette des kontraktilen nicht-muskulären Proteins Myosin IIA führen bei Patienten u. a. zu einer Makrothrombozytopenie und einer leichten bis mittelschweren Blutungsneigung. Es ist unzureichend geklärt, welche Faktoren zum hämostatischen Defekt bei Patienten mit MYH9-bedingter Erkrankung beitragen. Daher ist ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden biophysikalischen Mechanismen bei der Thrombusbildung und -stabilisierung erforderlich. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Austausch von einzelnen Aminosäuren an den Positionen 702, 1424 und 1841 im kontraktilen Protein Myosin IIA, hervorgerufen durch Punktmutationen im kodierenden Gen, zu einer Makrothrombozytopenie und zu einer verlängerten Blutungszeit in Mäusen führt. Dies spiegelt die klinischen Merkmale der MYH9-assoziierte Erkrankungen bei Patienten wider. Die basale Charakterisierung der biologischen Funktionen von Myh9-mutierten Thrombozyten im Vergleich zu Wildtyp-Thrombozyten ergab eine insgesamt normale Oberflächenglykoproteinexpression und Agonisten-induzierte Aktivierung. Interessanterweise war die Phosphorylierung der leichten Myosinkette in den mutierten Thrombozyten nach Aktivierung reduziert, was zu einer geringeren Kontraktionskraft und damit zu einem Defekt beim Zusammenziehen des Gerinnsels führte. Mit Hilfe von biophysikalischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass geringere Adhäsions- und Interaktionskräfte von Thrombozyten mit Punktmutationen im Myh9 Gen zu einer verminderten Thrombusbildung und -stabilität führen. Thrombozyten von Patienten mit den entsprechenden Mutationen rekapitulierten die mit murinen Thrombozyten erhaltenen Ergebnisse, wie z. B. eine beeinträchtigte Thrombusbildung und -steifigkeit. Neben der biologischen und biophysikalischen Charakterisierung der Thrombozyten von Mäusen und Menschen mit den Punktmutationen wurden Behandlungsmöglichkeiten untersucht, um die erhöhte Blutungsneigung aufgrund der verminderten Thrombozytenkräfte zu verhindern. Das Antifibrinolytikum Tranexamsäure wurde eingesetzt, um weniger kompakte Thromben zu stabilisieren, die vermutlich anfälliger für Fibrinolyse sind. Die hämostatische Funktion von Mäusen mit Myh9-Mutationen konnte durch die Gabe von Tranexamsäure verbessert werden. Diese Ergebnisse zeigen die positive Wirkung der Fibrinstabilisierung zur Verringerung von Blutungsneigungen bei MYH9-assoziierte Erkrankungen. KW - Thrombozyt KW - Zellskelett KW - Platelets KW - Cytoskeleton KW - Biomechanics KW - Myosin IIA KW - Biomechanik Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-287953 ER - TY - THES A1 - Schurr, Yvonne T1 - Studies on the role of cytoskeletal-regulatory and -crosslinking proteins in platelet function T1 - Studien zur Rolle von Zytoskelett-regulierenden und -vernetzenden Proteinen in der Thrombozytenfunktion N2 - Cytoskeletal reorganization in platelets is highly regulated and important for proper platelet function during activation and aggregation at sites of vascular injury. In this thesis, the role of three different cytoskeletal-regulatory and -crosslinking proteins was studied in platelet physiology using megakaryocyte- and platelet-specific knockout mice. The generation of branched actin filaments is regulated by nucleation promoting factors (NPF) and the Arp2/3 complex. (1.) The WAVE complex is a NPF, which upregulates the Arp2/3 complex activity at the plasma membrane. As shown in this thesis, the loss of the WAVE complex subunit Cyfip1 in mice did not alter platelet production and had only a minor impact on platelet activation. However, Cyfip1 played an essential role for branching of actin filaments and consequently for lamellipodia formation in vitro. The importance of lamellipodia for thrombus formation and stability has been controversially discussed. Cyfip1-deficient platelets were able to form a stable thrombus ex vivo and in vivo and a hemostatic plug comparable to controls. Moreover, Cyfip1-deficient mice maintained vascular integrity at the site of inflammation. These data show that platelet lamellipodia formation is not required for hemostatic function and pathophysiological thrombus formation. (2.) The WASH complex is another NPF, which mediates actin filament polymerization on endosomal vesicles via the Arp2/3 complex. Loss of the WASH complex subunit Strumpellin led to a decreased protein abundance of the WASH protein and to a 20% reduction in integrin αIIbβ3 surface expression on platelets and megakaryocytes, whereas the expression of other surface receptors as well as the platelet count, size, ex vivo thrombus formation and bleeding time remained unaltered. These data point to a distinct role of Strumpellin in maintaining integrin αIIbβ3 expression and provide new insights into regulatory mechanisms of platelet integrins. (3.) MACF1 has been described as a cytoskeletal crosslinker of microtubules and F-actin. However, MACF1-deficient mice displayed no alterations in platelet production, activation, thrombus formation and hemostatic function. Further, no compensatory up- or downregulation of other proteins could be found that contain an F-actin- and a microtubule-binding domain. These data indicate that MACF1 is dispensable for platelet biogenesis, activation and thrombus formation. Nevertheless, functional redundancy among different proteins mediating the cytoskeletal crosstalk may exist. N2 - Sowohl bei der Thrombozytenproduktion als auch bei der Thrombozytenaktivierung nach einer Gefäßverletzung findet eine schnelle Umstrukturierung des Zytoskeletts statt, bei der Zytoskelett-regulierenden Proteine eine wichtige Rolle spielen. In dieser Dissertation wurde die Rolle von drei verschiedenen Zytoskelett-regulierenden und vernetzenden Proteinen in der Thrombozytenphysiologie mittels Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen knockout Mäusen untersucht. Die Bildung von verzweigten Aktinfilamenten wird durch Nucleation promoting factors (NPF) und den Arp2/3-Komplex gesteuert. (1.) Der WAVE-Komplex ist ein NPF der die Aktivität des Arp2/3-Komplexes an der Plasmamembran reguliert. Wie in dieser Arbeit gezeigt, hatte die Defizienz der WAVE-Komplex-Untereinheit Cyfip1 keinen Einfluss auf die Thrombozytenproduktion und nur einen geringen Einfluss auf die Thrombozytenaktivierung. Cyfip1 spielte jedoch eine wesentliche Rolle für die Verzweigung von Aktinfilamenten und folglich für die in vitro Bildung von Lamellipodien. Die Bedeutung der Lamellipodienausbildung in Thrombozyten für die Thrombusbildung und –stabilität wurde bisher kontrovers diskutiert. Thrombozyten von Cyfip1-defizienten Mäusen bildeten ex vivo und in vivo einen stabilen Thrombus und einen hämostatischen Blutpfropfen, vergleichbar zu Thrombozyten von Kontrollmäusen. Darüber hinaus konnten Cyfip1-defiziente Mäuse die Gefäßintegrität am Ort der Entzündung aufrechterhalten. Diese Daten zeigen, dass die Ausbildung von Lamellipodien sowohl für die hämostatische Funktion als auch für die pathologische Thrombusbildung nicht erforderlich ist. (2.) Der WASH-Komplex ist ein weiterer NPF, der die Polymerisation von Aktinfilamenten an endosomalen Vesikeln über den Arp2/3-Komplex vermittelt. Die Defizienz der WASH-Komplexuntereinheit Strumpellin führte zu einer verringerten WASH- Proteinkonzentration und resultierte in einer Abnahme der Oberflächenexpression des αIIbβ3-Integrins um 20 %, wohingegen die Expression anderer Oberflächenrezeptoren sowie die Thrombozytenzahl, -größe, ex vivo Thrombusbildung und die Blutungszeit unverändert blieb. Diese Daten weisen auf eine wichtige Rolle von Strumpellin bei der Aufrechterhaltung der αIIbβ3-Integrin Expression hin und liefern neue Erkenntnisse über Regulationsmechanismen von Integrinen in Thrombozyten. (3.) MACF1 wurde aufgrund seiner Interaktion mit Mikrotubuli- und Aktinfilamenten als Zytoskelett-vernetzendes Protein beschrieben. Bei MACF1-defizienten Mäusen wurden jedoch keine Veränderungen bei der Thrombozytenproduktion, Aktivierung, Thrombusbildung und der hämostatischen Funktion festgestellt. Des Weiteren wurde keine kompensatorische Hoch- oder Herunterregulation anderer Proteine gefunden, welche ebenfalls eine F-Aktin- und eine Mikrotubuli-Bindungsdomäne besitzen. Diese Daten deuten darauf hin, dass MACF1 keine essentiellen Funktionen in Thrombozyten übernimmt. Nichtsdestotrotz besteht möglicherweise eine funktionelle Redundanz zwischen verschiedenen Proteinen, die Zytoskelett-vernetzende Interaktionen vermitteln. KW - Cytoskeleton KW - Platelet KW - Zellskelett Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218924 ER - TY - THES A1 - Prada Salcedo, Juan Pablo T1 - Image Processing and other bioinformatic tools for Neurobiology T1 - Bildbearbeitung und andere bioinformatische Werkzeuge für die Neurobiologie N2 - Neurobiology is widely supported by bioinformatics. Due to the big amount of data generated from the biological side a computational approach is required. This thesis presents four different cases of bioinformatic tools applied to the service of Neurobiology. The first two tools presented belong to the field of image processing. In the first case, we make use of an algorithm based on the wavelet transformation to assess calcium activity events in cultured neurons. We designed an open source tool to assist neurobiology researchers in the analysis of calcium imaging videos. Such analysis is usually done manually which is time consuming and highly subjective. Our tool speeds up the work and offers the possibility of an unbiased detection of the calcium events. Even more important is that our algorithm not only detects the neuron spiking activity but also local spontaneous activity which is normally discarded because it is considered irrelevant. We showed that this activity is determinant in the calcium dynamics in neurons and it is involved in important functions like signal modulation and memory and learning. The second project is a segmentation task. In our case we are interested in segmenting the neuron nuclei in electron microscopy images of c.elegans. Marking these structures is necessary in order to reconstruct the connectome of the organism. C.elegans is a great study case due to the simplicity of its nervous system (only 502 neurons). This worm, despite its simplicity has taught us a lot about neuronal mechanisms. There is still a lot of information we can extract from the c.elegans, therein lies the importance of reconstructing its connectome. There is a current version of the c.elegans connectome but it was done by hand and on a single subject which leaves a big room for errors. By automatizing the segmentation of the electron microscopy images we guarantee an unbiased approach and we will be able to verify the connectome on several subjects. For the third project we moved from image processing applications to biological modeling. Because of the high complexity of even small biological systems it is necessary to analyze them with the help of computational tools. The term in silico was coined to refer to such computational models of biological systems. We designed an in silico model of the TNF (Tumor necrosis factor) ligand and its two principal receptors. This biological system is of high relevance because it is involved in the inflammation process. Inflammation is of most importance as protection mechanism but it can also lead to complicated diseases (e.g. cancer). Chronic inflammation processes can be particularly dangerous in the brain. In order to better understand the dynamics that govern the TNF system we created a model using the BioNetGen language. This is a rule based language that allows one to simulate systems where multiple agents are governed by a single rule. Using our model we characterized the TNF system and hypothesized about the relation of the ligand with each of the two receptors. Our hypotheses can be later used to define drug targets in the system or possible treatments for chronic inflammation or lack of the inflammatory response. The final project deals with the protein folding problem. In our organism proteins are folded all the time, because only in their folded conformation are proteins capable of doing their job (with some very few exceptions). This folding process presents a great challenge for science because it has been shown to be an NP problem. NP means non deterministic Polynomial time problem. This basically means that this kind of problems cannot be efficiently solved. Nevertheless, somehow the body is capable of folding a protein in just milliseconds. This phenomenon puzzles not only biologists but also mathematicians. In mathematics NP problems have been studied for a long time and it is known that given the solution to one NP problem we could solve many of them (i.e. NP-complete problems). If we manage to understand how nature solves the protein folding problem then we might be able to apply this solution to many other problems. Our research intends to contribute to this discussion. Unfortunately, not to explain how nature solves the protein folding problem, but to explain that it does not solve the problem at all. This seems contradictory since I just mentioned that the body folds proteins all the time, but our hypothesis is that the organisms have learned to solve a simplified version of the NP problem. Nature does not solve the protein folding problem in its full complexity. It simply solves a small instance of the problem. An instance which is as simple as a convex optimization problem. We formulate the protein folding problem as an optimization problem to illustrate our claim and present some toy examples to illustrate the formulation. If our hypothesis is true, it means that protein folding is a simple problem. So we just need to understand and model the conditions of the vicinity inside the cell at the moment the folding process occurs. Once we understand this starting conformation and its influence in the folding process we will be able to design treatments for amyloid diseases such as Alzheimer's and Parkinson's. In summary this thesis project contributes to the neurobiology research field from four different fronts. Two are practical contributions with immediate benefits, such as the calcium imaging video analysis tool and the TNF in silico model. The neuron nuclei segmentation is a contribution for the near future. A step towards the full annotation of the c.elegans connectome and later for the reconstruction of the connectome of other species. And finally, the protein folding project is a first impulse to change the way we conceive the protein folding process in nature. We try to point future research in a novel direction, where the amino code is not the most relevant characteristic of the process but the conditions within the cell. N2 - Neurobiologie wird durch Bioinformatik unterstützt, aufgrund der großen Datenmengen, die von biologischer Seite her anfallen, bedarf es eines rechnerischen Ansatzes, um diese Daten sinnvoll zu interpretieren. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation werden vier Werkzeuge aus dem Bereich der Bioinformatik für die Anwendung in der Neurobiologie vorgestellt. Die ersten beiden Werkzeuge gehören zum Bereich der digitalen Bildverarbeitung. Das erste Werkzeug nutzt einen Algorithmus basierend auf der Wavelet-Transformation, um Calciumaktivität in Neuronenkulturen zu bewerten. Hierzu wurde Open-Source-Software entwickelt, die Neurobiologen bei der Analyse von Videoaufnahmen unterstützt. Diese Analyse wird herkömmlicherweise manuell vorgenommen, sodass der Prozess zeitintensiv und sehr subjektiv ist. Die entwickelte Software beschleunigt den Arbeitsprozess und ermöglicht eine unverzerrte Detektion der Ereignisse in Bezug auf Calcium. Von noch größerer Bedeutsamkeit ist die Tatsache, dass der entwickelte Algorithmus nicht nur neuronale Spiking-Aktivität detektiert, sondern auch lokale Spontanaktivität, die herkömmlicherweise als irrelevant betrachtet und daher verworfen wird. Wir konnten zeigen, dass diese Spontanaktivität hohe Relevanz für die Dynamik von Calcium in den Neuronen besitzt und wahrscheinlich an wichtigen Funktionen beteiligt ist, wie der Signalmodulation, Lernen und Gedächtnis. Beim zweiten Projekt handelt es sich um eine Segmentierungsaufgabe. Wir sind daran interessiert, die neuronalen Zellkerne in elektromikroskopischen Aufnahmen des C.elegans zu segmentieren. Die Kennzeichnung dieser Struktur ist notwendig, um das Konnektom dieses Organismus zu rekonstruieren. Als Studienobjekt eignet sich C.elegans aufgrund der Simplizität seines Nervensystems (er besteht lediglich aus 502 Neuronen). Trotz der Simplizität des Nervensystems dieses Wurms konnten wichtige Erkenntnisse im Hinblick auf neuronale Mechanismen durch die Untersuchung dieses Modellorganismus gewonnen werden. Daher ist die Bestimmung des Konnektoms bedeutsam. Es existiert bereits eine Version des Konnektoms, doch diese wurde händig für lediglich ein Subjekt rekonstruiert und ist daher möglicherweise fehlerbehaftet. Die automatisierte Segmentierung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen ermöglicht einen weniger verzerrten Ansatz, der zudem die Verifizierung an mehreren Subjekten gestattet. Das dritte Projekt dieser Dissertation ist ein Projekt zur Modellierung und Simulation eines biologischen Systems. Aufgrund der hohen Komplexität selbst kleinster biologischer Systeme ist die computergestützte Analyse notwendig. Der Begriff in silico wurde für die computergestützte Simulation biologischer Systeme geprägt. Wir haben ein in silico Modell des TNF (Tumornekrosefaktor) Ligand und seiner zwei Hauptrezeptoren entwickelt. Dieses biologische System ist von hoher Bedeutsamkeit, da es am Entzündungsprozess beteiligt ist, der höchste Wichtigkeit als Schutzmechanismus hat, aber es kann auch komplizierte Erkrankungen auslösen (beispielsweise Krebs), falls es zu einer chronischen Entzündungsreaktion kommt. Derartige Entzündungsprozesse können besonders gefährlich im Gehirn sein. Das System muss eine schwierige Balance zwischen protektiver Funktion und möglicher Krankheitsursache behalten. Um die Dynamiken besser zu verstehen, die das TNF System leiten, haben wir ein Modell mittels der BioNetGen Sprache erstellt. Diese regelbasierte Sprache ermöglicht es ein System zu simulieren, in dem multiple Agenten geleitet werden von einer Regel. Mithilfe unseres Modells charakterisieren wir das TNF System und stellen Hypothesen über die Beziehung des Liganden mit den beiden Rezeptoren auf. Diese Hypothesen können später genutzt werden, um mögliche Ziele im System für Arzneimittel, mögliche Behandlungen für chronische Entzündungen oder das Fehlen einer Entzündungsreaktion zu bestimmen. Im abschießenden Projekt wird das Proteinfaltungsproblem behandelt. In unserem Organismus werden ständig Proteine gefaltet, denn nur im gefalteten Zustand können sie ihrer Aufgabe nachkommen (mit sehr wenigen Ausnahmen). Dieser Faltungsprozess stellt eine große Herausforderung für die Wissenschaft dar, weil gezeigt wurde, dass der Faltungsprozess ein NP Problem ist. NP steht dabei für nichtdeterministisch polynomielles Zeitproblem. Dies bedeutet im Grunde, dass es nicht effizient gelöst werden kann. Nichtsdestotrotz ist der Körper in der Lage, ein Protein in Millisekunden zu falten. Dieses Phänomen stellt nicht nur Biologen sondern auch Mathematiker vor Rätsel. In der Mathematik wurde diese Probleme schon lange studiert und es ist bekannt, dass die Kenntnis der Lösung eines NP Problems die Lösung vieler bedeuten würde (insbesondere NP-kompletter Probleme). Daher ist die Idee, dass viele Probleme gelöst werden könnten, durch das Verständnis davon, wie die Natur das Problem löst. Unsere Forschung zielt darauf ab, zu dieser Diskussion beizutragen, allerdings nicht durch die Erklärung davon, wie die Natur das Problem löst, sondern durch die Erklärung, dass die Natur das Problem nicht löst. Dies scheint zunächst widersprüchlich, da der Körper ständig Proteine faltet. Unsere Hypothese besagt jedoch, dass der Organismus gelernt hat, eine vereinfachte Version des NP Problems zu lösen. Die Natur löst das Problem nicht in seiner vollen Komplexität, sondern nur eine kleine Instanz davon. Eine Instanz, die ein konvexes Optimierungsproblem darstellt. Wir formulieren das Proteinfaltungsproblem als konvexes Optimierungsproblem und zur Illustrierung unserer Behauptung nutzen wir theoretische Beispiele. Wenn die Hypothese zutrifft, bedeutet dies, dass das Proteinfaltungsproblem ein einfaches ist und wir müssen lediglich die Ausgangskonstellation der Umgebung in der Zelle verstehen und modellieren, in dem Moment in dem die Faltung passiert. Sobald wir die Ausgangskonstellation und den Einfluss auf den Faltungsprozess verstehen, können wir Behandlungen für Amyloid-Krankheiten, wie Alzheimer-Demenz und Morbus Parkinson entwickeln. Zusammenfassend trägt die vorliegende Dissertation zu neurobiologischer Forschung durch vier Ansätze bei. Zwei sind praktische Beiträge mit sofortigem Nutzen für die Forschung, dazu zählen das Videoanalyse Tool für Calcium Aufnahmen und das TNF in silico Modell. Die neuronale Zellkernsegmentierung ist ein Beitrag für die nahe Zukunft – ein Schritt zur Vervollständigung des Konnektoms des C.elegans und langfristig zur Rekonstruktion der Konnektome anderer Spezies. Und schließlich ist das Proteinfaltungsprojekt ein erster Impuls den Proteinfaltungsprozess anders zu denken. Wir versuchen zukünftige Forschung in eine andere Richtung zu lenken, wobei nicht der Aminosäurecode das relevanteste Charakteristikum des Prozesses ist, sondern vielmehr die Bedingungen innerhalb der Zelle. KW - Bildverarbeitung KW - Neurobiologie KW - Model simulation KW - Protein folding KW - Bioinformatik KW - Image Processing KW - Simulation Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157721 ER -