TY - THES A1 - Potabattula, Ramya Sri Krishna T1 - Male aging and obesity effects on sperm methylome and consequences for the next generation T1 - Alters- und Adipositas-Effekte auf das Spermien-Methylom und die Konsequenzen für die nächste Generation N2 - Besides a growing tendency for delayed parenthood, sedentary lifestyle coupled with overnutrition has dramatically increased worldwide over the last few decades. Epigenetic mechanisms can help us understand the epidemics and heritability of complex traits like obesity to a significant extent. Majority of the research till now has focused on determining the impact of maternal factors on health and disease risk in the offspring(s). This doctoral thesis is focused on deciphering the potential effects of male aging and obesity on sperm methylome, and consequences/transmission via germline to the next generation. In humans, this was assessed in a unique cohort of ~300 sperm samples, collected after in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection, as well as in conceived fetal cord blood samples of the children. Furthermore, aging effect on sperm samples derived from a bovine cohort was analyzed. The study identified that human male aging significantly increased the DNA methylation levels of the promoter, the upstream core element, the 18S, and the 28S regions of ribosomal DNA (rDNA) in sperm. Prediction models were developed to anticipate an individual’s age based on the methylation status of rDNA regions in his sperm. Hypermethylation of alpha satellite and LINE1 repeats in human sperm was also observed with aging. Epimutations, which are aberrantly methylated CpG sites, were significantly higher in sperm of older males compared to the younger ones. These effects on the male germline had a negative impact on embryo quality of the next generation. Consistent with these results, DNA methylation of rDNA regions, bovine alpha satellite, and testis satellite repeats displayed a significant positive correlation with aging sperm samples within the same individual and across different age-grouped bulls. A positive association between human male obesity/body mass index (BMI) and DNA methylation of the imprinted MEG3 gene and the obesity-related HIF3A gene was detected in sperm. These BMI-induced sperm DNA methylation signatures were transmitted to next generation fetal cord blood (FCB) samples in a gender-specific manner. Males, but not female offsprings exhibited a significant positive correlation between father’s BMI and FCB DNA methylation in the two above-mentioned amplicons. Additionally, hypomethylation of IGF2 with increased paternal BMI was observed in female FCB samples. Parental allele-specific in-depth methylation analysis of imprinted genes using next generation sequencing technology also revealed significant correlations between paternal factors like age and BMI, and the corresponding father’s allele DNA methylation in FCB samples. Deep bisulphite sequencing of imprinted genes in diploid somatic cord blood cells of offspring detected that the levels of DNA methylation signatures largely depended on the underlying genetic variant, i.e. sequence haplotypes. Allele-specific epimutations were observed in PEG1, PEG5, MEG3, H19, and IGF2 amplicons. For the former three genes, the non-imprinted unmethylated allele displayed more epimutations than the imprinted methylated allele. On the other hand, for the latter two genes, the imprinted allele exhibited higher epimutation rate than that of the non-imprinted allele. In summary, the present study proved that male aging and obesity impacts the DNA methylome of repetitive elements and imprinted genes respectively in sperm, and also has considerable consequences on the next generation. Nevertheless, longitudinal follow-up studies are highly encouraged to elucidate if these effects can influence the risk of developing abnormal phenotype in the offspring during adulthood. N2 - Weltweit kann ein Trend zur späteren Elternschaft sowie die dramatische Zunahme eines bewegungsarmen Lebensstils in Kombination mit einer Überernährung beobachtet werden. Die Verbreitung sowie die Vererbung derartig komplexer Merkmale oder Erkrankungen lassen sich oftmals unter Berücksichtigung epigenetischer Mechanismen besser verstehen. Vorangegangene Studien untersuchten hierbei jedoch primär den Einfluss maternaler Faktoren auf die Gesundheit und das Krankheitsrisiko der nächsten Generation. Diese Doktorarbeit hat das Ziel potentielle Altersinduzierte sowie Adipositas-bedingte Effekte auf das Methylom von Spermien sowie die damit einhergehenden Konsequenzen für die nächste Generation zu identifizieren. Hierfür stand eine humane Kohorte bestehend aus ~300 Spermienproben, welche nach einer in vitro Fertilisation bzw. Intrazytoplasmatischen Spermieninjektion gesammelt wurden, und das entsprechende Nabelschnurblut der mit Hilfe dieser Behandlungen gezeugten Kinder zur Verfügung. Ergänzend dazu wurde der Alterseffekt in bovinen Spermienproben analysiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine signifikante Korrelation des männlichen Alterungsprozesses mit einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA (rDNA) in der Promotorregion, dem strangaufwärts gelegenen Promotorelement (Upstream Core Element), der 18S- sowie der 28S-Region von Keimzellen aufgezeigt werden. Hierauf basierend wurde ein Vorhersageprogramm entwickelt, welches es ermöglicht anhand des Methylierungslevels der rDNA in den Spermien das Alter des entsprechenden Mannes zu berechnen. Weiterhin konnte beobachtet werden, dass mit dem Alterungsprozess in Spermien eine Hypermethylierung der Long Interspersed Nuclear Elements (LINE-1) und der Alpha-Satelliten-DNA einhergeht. Des Weiteren zeigte der Vergleich von Spermien alter und junger Männer auf, dass Epimutationen, welche als fehlerhaft methylierte CpG-Stellen definiert werden, signifikant häufiger in Spermien alter Männer detektierbar sind. Allgemein zeigte sich zudem, dass diese altersabhängigen Effekte auf die Keimzellen sich negativ auf die Qualität der Embryonen auswirken. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen konnte auch in Spermien von Rindern dieser Alterseffekt nachgewiesen werden. Es zeigte sich mit zunehmendem Alter eine signifikant erhöhte Methylierung der rDNA-Regionen und der Alpha-/ Testis-Satelliten-DNAs sowohl innerhalb eines Individuums, als auch zwischen verschiedenen altersgruppierten Individuen. Weiterhin konnte eine positive Korrelation des Body-Mass-Index (engl. body mass index; kurz: BMI) eines Mannes und der Methylierung in MEG3 und HIF3A in dessen Spermien detektiert werden. Anhand der untersuchten Nabelschnurblute konnte aufgezeigt werden, dass diese BMI-induzierten Methylierungsveränderungen in einem geschlechter-spezifischen Kontext an die nächste Generation weitergegeben werden. So war ausschließlich bei männlichen Nachkommen eine signifikant positive Assoziation des väterlichen BMIs und der DNA-Methylierung dieser beiden Gene im Nabelschnurblut nachweisbar. Eine mit dem väterlichen BMI einhergehende Hypomethylierung des Gens IGF2 war hingegen ausschließlich in den Nabelschnurblut-Proben weiblicher Nachkommen messbar. Die Auftrennung der Allele nach ihrer parentalen Herkunft, zeigte eine signifikante Korrelation zwischen den paternalen Faktoren, wie Alter und BMI, und dem Methylierungslevel des korrespondierenden paternalen Allels im Nabelschnurblut. Mit Hilfe der Deep Bisulfite Sequenzierung diploider Zellen aus dem Nabelschnurblut der Nachkommen wurde die DNA-Methylierung geprägte Gene untersucht. Hierbei konnte aufgezeigt werden, dass das Methylierungslevel stark von der zu Grunde liegenden genetischen Variante (Haplotyp) abhängt. Allel-spezifische Epimutationen wurden in den untersuchten Amplikons der Gene PEG1, PEG5, MEG3, H19 und IGF2 nachgewiesen. Bei PEG1, PEG5 und MEG3 waren mehr Epimutationen der nicht-geprägten unmethylierten Allele, als der geprägten methylierten Allele detektierbar. Konträr hierzu war bei den Genen H19 und IGF2 eine erhöhte Epimutationsrate der geprägten und somit methylierten Allele nachweisbar. Diese Doktorarbeit offenbart altersinduzierte sowie Adipositas-bedingte Einflüsse auf die DNA-Methylierung repetitiver Elemente und geprägter Gene in männlichen Keimzellen, sowie damit einhergehende potentielle Konsequenzen für die nächste Generation. Um schlussendlich jedoch eine Aussage treffen zu können, ob aufgrund dieser Effekte eine erhöhte Prädisposition der nächsten Generation zur Entwicklung anormaler Phänotypen besteht, müssen longitudinale Folgestudien durchgeführt werden. KW - Paternal age and BMI effects Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165481 ER - TY - THES A1 - Maierhofer, Anna T1 - Altersassoziierte und strahleninduzierte Veränderungen des genomweiten DNA-Methylierungs-Profils T1 - Age-associated and radiation-induced changes in genome-wide DNA methylation N2 - Der Prozess des Alterns ist ein komplexer multifaktorieller Vorgang, der durch eine sukzessive Verschlechterung der physiologischen Funktionen charakterisiert ist. Ein hohes Alter ist der Hauptrisikofaktor für die meisten Krankheiten, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Das Verständnis der epigenetischen Mechanismen, die in den Prozess des Alterns involviert sind, könnte zur Entwicklung pharmakologischer Interventionen beitragen, die nicht nur die Lebenserwartung erhöhen, sondern auch den Beginn des altersassoziierten funktionellen Abbaus verzögern könnten. Durch die Langzeit-Kultivierung primärer humaner Fibroblasten wurde ein in vitro Modell für das Altern etabliert, das die Identifizierung altersassoziierter DNA-Methylierungs-Veränderungen ermöglichte. Die in vitro Alterung konnte mit einer globalen Hypomethylierung und einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA assoziiert werden. Darüber hinaus konnten DNA-Methylierungs-Veränderungen in Genen und Signalwegen, die für das Altern relevant sind, und ein erhöhtes epigenetisches Alter nachgewiesen werden. Das in vitro Modell für das Altern wurde verwendet, um neben den direkten Effekten ionisierender Strahlung auf die DNA-Methylierung auch deren Langzeit-Effekte zu untersuchen. Die Strahlentherapie ist ein entscheidendes Element der Krebstherapie, hat aber auch negative Auswirkungen und kann unter anderem das Risiko für die Entwicklung eines Zweittumors erhöhen. Bei externer Bestrahlung wird neben dem Tumor auch gesundes Gewebe ionisierender Strahlung ausgesetzt. Daher ist es wichtig zu untersuchen, wie Zellen mit intakten DNA-Reparatur-Mechanismen und funktionierenden Zellzyklus-Checkpoints durch diese beeinflusst werden. In der frühen Phase der DNA-Schadensantwort auf Bestrahlung wurden in normalen Zellen keine wesentlichen DNA-Methylierungs-Veränderungen beobachtet. Mehrere Populations-Verdoppelungen nach Strahlenexposition konnten dagegen eine globale Hypomethylierung, eine erhöhte DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und ein erhöhtes epigenetisches Alter detektiert werden. Des Weiteren zeigten Gene und Signalwege, die mit Krebs in Verbindung gebracht wurden, Veränderungen in der DNA-Methylierung. Als Langzeit-Effekte ionisierender Strahlung traten somit die mit der in vitro Alterung assoziierten DNA-Methylierungs-Veränderungen verstärkt auf und ein epigenetisches Muster, das stark an das DNA-Methylierungs-Profil von Tumorzellen erinnert, entstand. Man geht davon aus, dass Veränderungen der DNA-Methylierung eine aktive Rolle in der Entwicklung eines Tumors spielen. Die durch ionisierende Strahlung induzierten DNA-Methylierungs-Veränderungen in normalen Zellen könnten demnach in die Krebsentstehung nach Strahlenexposition involviert sein und zu dem sekundären Krebsrisiko nach Strahlentherapie beitragen. Es ist bekannt, dass Patienten unterschiedlich auf therapeutische Bestrahlung reagieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die individuelle Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung auch auf epigenetischer Ebene beobachtet werden kann. In einem zweiten Projekt wurden Gesamtblutproben von Patienten mit Werner-Syndrom, einer segmental progeroiden Erkrankung, und gesunden Kontrollen analysiert, um mit dem vorzeitigen Altern in Verbindung stehende DNA-Methylierungs-Veränderungen zu identifizieren. Werner-Syndrom konnte nicht mit einer globalen Hypomethylierung, jedoch mit einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und einem erhöhten epigenetischen Alter assoziiert werden. Das vorzeitige Altern geht demzufolge mit spezifischen epigenetischen Veränderungen einher, die eine Beschleunigung der mit dem normalen Altern auftretenden DNA-Methylierungs-Veränderungen darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Bedeutung epigenetischer Mechanismen im Prozess des Alterns hervorgehoben werden und gezeigt werden, dass sowohl exogene Faktoren, wie ionisierende Strahlung, als auch endogene Faktoren, wie das in Werner-Syndrom-Patienten mutiert vorliegende WRN-Gen, altersassoziierte DNA-Methylierungs-Veränderungen beeinflussen können. N2 - Aging is a complex, multifactorial process that is characterized by the successive deterioration of normal physiological functions. Age is the main risk factor for most diseases, including cancer. Understanding the epigenetic mechanisms that are involved in the aging process could contribute to the development of pharmacological interventions not only increasing lifespan but also delaying the onset of age-dependent functional decline. An in vitro model for aging was established by long-term culturing of primary human fibroblasts and used to identify age-associated changes in DNA methylation. In vitro aging could be linked to global hypomethylation, elevated DNA methylation of ribosomal DNA, a higher epigenetic age and alterations in DNA methylation of genes and pathways being relevant for aging. The in vitro model for aging allowed to analyse the long-term effects of ionizing radiation on DNA methylation in addition to their direct effects. Radiotherapy is an important element of cancer treatment but can also have negative effects and increase the risk of second cancers. Although radiotherapy is targeted to the tumour, it also affects the surrounding healthy tissue. Therefore, it is important to analyse the impacts of ionizing radiation on normal cells with intact DNA repair and cell cycle checkpoints. The early phase of DNA damage response to radiation does not seem to include great changes in DNA methylation in normal cells. In contrast, several population doublings after radiation exposure, global hypomethylation and DNA methylation changes of genes and pathways being linked to tumorigenesis were detected. Furthermore, DNA methylation of ribosomal DNA and the epigenetic age were increased. Thus, as long-term effects of ionizing radiation the age-associated changes in DNA methylation were enhanced and an epigenetic pattern strongly resembling the DNA methylation profile of tumour cells was observed. It is assumed that alterations in DNA methylation are not only side effects of carcinogenesis but rather play an active role during this process. Radiation-induced changes in DNA methylation could thus be involved in tumour development and contribute to the secondary cancer risk after radiotherapy. It is well known that patients react differently to therapeutic radiation. The results of this study suggest that individual radiation sensitivity is also reflected on epigenetic level. In a second project whole blood samples from patients with Werner syndrome, a segmental progeroid syndrome, and healthy controls were analysed to identify changes in DNA methylation associated with premature aging. Werner syndrome could not be linked to global hypomethylation, but to an increased epigenetic age and elevated methylation levels of ribosomal DNA. Hence, premature aging seems to be accompanied by specific alterations in DNA methylation representing an acceleration of the DNA methylation changes associated with normal aging. This work outlines the importance of epigenetic mechanisms in the aging process and shows that not only exogenous factors like ionizing radiation but also endogenous factors like Werner syndrome causing mutations in the WRN gene can influence age-associated changes in DNA methylation. KW - Methylierung KW - Ionisierende Strahlung KW - Altern KW - Progeria adultorum KW - Epigenetik KW - Epigenetische Uhr Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174134 ER - TY - THES A1 - Al-Hazza, Aseel T1 - Zu Grad, Konfiguration und Verlauf der Schallempfindungsschwerhörigkeit bei Kindern mit einer Connexin-26-Mutation T1 - The level, configuration and progression of the sensorineural hearing loss of children with Connexin-26-mutation N2 - Verschiedene Forschungsergebnisse der letzten zehn Jahre ergaben, dass die weitaus häufigeren, nicht-syndromalen Schwerhörigkeiten durch Mutation eines Gens (GJB2-Gen) entstehen, welches im Cortischen Organ des Innenohrs exprimiert wird. Das GJB2-Gen (Connexin-26-Gen), dessen Veränderung etwa 50 % der Fälle von autosomal rezessiver Schwerhörigkeit ausmacht, liegt im Chromosomenbereich 13q11–12. Aktuell identifiziert sind mehr als 70 weitere Loki, die in Verbindung mit nicht-syndromalen Formen von Schwerhörigkeit stehen. Die Prävalenz von NSHL beträgt nach neusten Studien ca. 1,33 pro 1000 Neugeborenen. In Würzburg wurden bis zum Jahr 2011 auf der Neugeborenenstation der Frauenklinik der Universitätsklinik in einem bewährten zweistufigen Neugeborenen-Hörscreening ca. 12853 Babys untersucht. Ziel des Neugeborenen-Hörscreenings ist eine frühestmögliche Erkennung von Schwerhörigkeit bei Neugeborenen, damit durch die Behandlung eine ungehinderte Sprachentwicklung gewährleistet werden kann. In dieser Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Mutation im Connexin-26-Gen und dem Grad, dem Verlauf und der Konfiguration der Hörminderung untersucht. Hierfür wurden 59 Patienten im Alter von 1 bis 15 Jahren mit beidseitigen, nicht-syndromalen Hörstörungen der Schallempfindung verschiedenen Grades rekrutiert. Mithilfe der molekulargenetischen Befunde konnten Veränderungen im Connexin-26-Gen diagnostiziert werden. Anschließend wurde versucht, unter Zuhilfenahme aller vorhandenen Befunde der individuellen Audiogramm- und BERA- oder ASSR-Befunde eine Genotyp-Phänotyp-Korrelation abzuleiten. N2 - Different research studies in the last ten years resulted, that the more frequently and non-syndromal hearing loss result of mutation in the gene (GJB2-Gen), witch express in cortical organ the inner ear. The GJB2-Gen (Connexin-26-Gen) plays a decisive role in the 50% the autosomal recessive cases of hearing loss and it is localized on chromosome 13q11–12. Up to now there are more than 70 Loci identified, witch also connected with the non-syndromal hearing loss. The prevalence of NSHL amounts according to the newest studies about 1,33 per 1000 newborn. Until 2011, about 12853 babies have been examined at the neonatal ward of the gynecological university hospital in Würzburg in a proven two-stage newborn hearing screening. Goal of the screening was, to detect deafness in neonates as early as possible. Consequently, unhindered language development throughout the treatment can be assured . In this thesis, the relation between mutation in connexin-26 gene and the degree, course and configuration of hearing loss was investigated. For this purpose, 59 patients aged 1 to 15 years with bilateral, non-syndromic hearing loss of a variety acoustic perception form, were gathered. Using molecular genetic examenation methods, changes of the connexin-26 gene were diagnosed. Subsequently, by analyzing all available findings of individual audiogram and BERA or ASSR, a genotype-phenotype correlation was established. KW - Connexin-26-Mutation KW - Nichtsyndromale Schallemfindungsschwerhörigkeit Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150966 ER - TY - THES A1 - Mattern, Felix T1 - Alterungsbedingte Effekte auf DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene in Eizellen und Embryonen am Modellorganismus Bos taurus T1 - Aging-induced effects on DNA methylation profiles of developmental genes in oocytes and embryos on the model organism Bos taurus N2 - Die postovulatorische Alterung sowie die ovarielle Alterung konnten bei der Anwendung assistierter Reproduktionstechniken (ARTs) als entscheidende Faktoren identifiziert werden, die den Reproduktionserfolg nachhaltig beeinträchtigen. Die postovulatorische Alterung tritt ein, sobald die reife Eizelle nicht mehr innerhalb ihres physiologischen Zeitfensters befruchtet wird. Die ovarielle Alterung beschreibt hingegen die Abnahme des Follikel-Vorrats mit zunehmendem Alter des weiblichen Individuums bzw. des Ovars. Sowohl die postovulatorische Alterung als auch die ovarielle Alterung führen u.a. zu einer reduzierten Oozytenqualität und einer geringeren Blastozystenrate. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss der postovulatorischen Alterung und der ovariellen Alterung im Holstein-Rind (Bos taurus) auf die DNA-Methylierung entwicklungsrelevanter Gene in Eizellen und Embryonen zu untersuchen. Aus Schlachthof-Ovarien wurden Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) isoliert. Eizellen aus Follikeln der Größe 3-5 mm wurden für 24h (physiologisch) und 48h (gealtert) in vitro gereift (IVM). Die gereiften Oozyten wurden anschließend in vitro fertilisiert und Embryonen im 4-6 Zellstadium generiert. Sowohl in den unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe als auch in den gereiften Oozyten und den Embryonen wurde die Promotormethylierung der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo und bDNMT3Ls analysiert. Zur Untersuchung der ovariellen Alterung wurden mittelgroßen Antralfollikel aus Ovarien lebender Rinder (in vivo) unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) gewonnen. In den daraus isolierten unreifen Eizellen wurde die DNA-Methylierung der Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN bestimmt. Als Methode zur Analyse der Promotormethylierung wurde die Limiting Dilution Bisulfit-Sequenzierung angewendet. In unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) konnte ein erhöhtes Auftreten abnormal methylierter Allele in den geprägten Genen bH19 und bSNRPN von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) identifiziert werden. Dieses Ergebnis könnte eine mögliche Ursache einer bereits bekannten und mehrfach beschriebenen geringeren Entwicklungskompetenz von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) auf epigenetischer Ebene darstellen. Die verlängerte Reifungsdauer der IVM-Eizellen hatte eine signifikante Hypermethylierung in der Promotorregion des Gens DNMT3Lo von 48h-gereiften Eizellen zur Folge. Beim Übergang von 48h-gereiften Eizellen zum Embryo konnte eine signifikante Hypomethylierung von CpG7 des stammzellspezifischen Transkripts DNMT3Ls beobachtet werden. Diese CpG-Stelle wies ebenfalls einen signifikanten Anstieg von CpGs mit nicht-eindeutigem Methylierungszustand in unreifen Eizellen mit steigender Follikelgröße auf. Da sich die CpG-Position innerhalb eines Sequenz-Motivs einer Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors CREB befindet, könnten die Methylierungsdaten auf eine Interaktion zwischen dem Transkriptionsfaktor CREB und der DNA-Methylierung während der Entwicklung und Reifung der Eizelle sowie der Transition von der Eizelle zum Embryo hindeuten. Die DNA-Methylierungsprofile der untersuchten Gene in unreifen Eizellen aus Kühen unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) wiesen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Altersgruppen auf. Die ovarielle Alterung bei Rindern zwischen 9 Monaten und 11 Jahren zeigte damit keinen Effekt auf die DNA-Methylierung der untersuchten Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN. Nach einer simulierten postovulatorischen Alterung durch eine in vitro Reifung für 48h konnte eine Veränderung der DNA-Methylierung der Oozyten-spezifischen (DNMT3Lo) und Stammzell-spezifischen (DNMT3Ls) Promotoren des katalytisch inaktiven Cofaktors von DNMT3A, DNMT3L, beobachtet werden. Die veränderte DNA-Methylierung von DNMT3Ls tritt dabei erst im frühen Embryo in Erscheinung und interagiert vermutlich mit dem Transkriptionsfaktor CREB. Die Veränderungen von DNMT3Lo in Eizellen und DNMT3Ls in den daraus generierten Embryonen lässt vermuten, dass es sich hierbei um eine dynamische Anpassung des Embryos auf äußere Umweltbedingungen der Eizelle über die Methylierung der DNA handelt. N2 - Postovulatory aging and ovarian aging have been identified as key factors in assisted reproductive techniques (ARTs) and have a lasting effect on reproductive success. Postovulatory aging occurs if the mature egg is not fertilized within its physiological time window. On the other hand, ovarian aging describes the decrease in the follicular reserve with increasing age of the female or the ovary, respectively. Both post-ovulatory aging and ovarian aging result in reduced oocyte quality and lower blastocyst rate. The aim of this thesis was to explore the effects of postovulatory aging and ovarian aging in Holstein cattle (Bos taurus) on the DNA methylation of developmentally important genes in oocytes and embryos. Antral follicles of different sizes (<2 mm, 3-5 mm and> 6 mm) were isolated from slaughterhouse ovaries. Female germ cells from middle-sized follicles (3-5 mm) were matured for 24h (physiological conditions) and 48h (aged conditions) in vitro (IVM). The IVM- oocytes were subsequently fertilized in vitro and embryos at the 4-6 cell stage were generated. Promoter methylation of the genes bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo and bDNMT3Ls was analysed in immature oocytes from antral follicles of different sizes as well as in matured oocytes and the respective embryos. For studying ovarian aging, middle-sized antral follicles were obtained in vivo from animals of different age groups (9-12 months, 3-7 years and 8-11 years). In the extracted immature gametes, the DNA methylation of the promoter regions of bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN was examined. The limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing method was applied to determine the promoter methylation of the candidate genes at the single allele level. In immature oocytes from antral follicles of different diameters (<2 mm, 3-5 mm and> 6 mm) an increased occurrence of abnormally methylated alleles of the imprinted genes bH19 and bSNRPN was identified in small follicles (<2 mm). This failure to establish imprinting could be a possible cause of a well-known reduced developmental potential of small follicles (<2 mm) at the epigenetic level. The extended maturation time of the IVM-oocytes resulted in a significant hypermethylation in the promoter region of DNMT3Lo in 48h matured oocytes. After transition from 48h matured oocytes to embryos, a significant hypomethylation of CpG7 of the stem cell specific transcript DNMT3Ls was detected. The same CpG site showed a significant increase of CpGs with unclear methylation state in immature female germ cells with increasing follicular size. This CpG position is located within a potential binding site of the transcription factor CREB. Thus, the methylation data indicates an interaction between the transcription factor CREB and the DNA methylation during development and maturation of oocytes as well as during transition from the oocyte to the embryo. The DNA methylation profiles of the analysed genes in immature oocytes from cows of different age (9-12 months, 3-7 years and 8-11 years) showed no significant differences between age groups. Hence, the ovarian aging in cattle between 9 months and 11 years caused no effect on the DNA methylation of bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN. After a simulated postovulatory aging by in vitro maturation for 48h, a change in the DNA methylation of the oocyte-specific (DNMT3Lo) and stem cell-specific (DNMT3Ls) promoters of the catalytically inactive DNA-methyltransferase DNMT3L was observed. The altered DNA methylation of DNMT3Ls occurs in the early embryo and probably interacts with the transcription factor CREB. The changes of DNMT3Lo in oocytes and DNMT3Ls in the resulting embryos might represent a dynamic adaptation to external environmental conditions. KW - Oozyte KW - Epigenetik KW - Altern KW - DNS-Methyltransferase KW - Ovarielle Alterung KW - Postovulatorische Alterung KW - Antralfollikel KW - Holstein Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144562 ER - TY - THES A1 - Stumpf, Miriam T1 - Untersuchungen zum Ausbreitungsweg follikulärer Lymphome: Erhaltene reaktive Keimzentren sind ein deutlicher Hinweis auf ein (noch) lokales Erkrankungsstadium T1 - Preserved reactive germinal centers in follicular lymphoma is a strong histopathologic indicator of limited disease stage N2 - Follikuläre Lymphome (FL) zählen zu den Non-Hodgkin-Lymphomen und stellen die größte Untergruppe der B-Zell-Lymphome dar. Bedingt durch ihren meist indolenten Verlauf werden sie oft erst in einem fortgeschrittenen klinischen Stadium III/IV diagnostiziert und stellen dann eine systemische Erkrankung dar. Gelegentlich wird in der histopathologischen Untersuchung eines befallenen Lymphknotens eine nur partielle Infiltration beobachtet, die häufig auch in den angeschlossenen Stagingmaßnahmen mit einer nur lokalen Tumorausbreitung (klinisches Stadium I/II) assoziiert ist. Ein solches lokal begrenztes Stadium kann gemäß der Standard-Behandlungsprotokolle mit einer alleinigen Strahlentherapie ausreichend kontrolliert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zum einen, eine mögliche Assoziation einer nur partiellen Lymphknoteninfiltration beim FL mit einem lokal begrenzten klinischen Stadium zu untersuchen. Zum anderen sollte die Inzidenz einer nur partiellen Lymphknoten- Infiltration beim FL bestimmt werden. Der Vergleich der Studienkohorte mit einer nur partiellen Lymphknoteninfiltration, definiert als zumindest ein vollständig erhaltener Lymphfollikel, mit der Kontrollkohorte zeigte einen hochsignifikanten Unterschied: In der Studienkohorte befanden sich 38 von 40 Fälle (95%) in einem lokalen Stadium, wohingegen die Kontrollkohorte mit vollständiger Lymphknoteninfiltration nur bei 10 von 49 Patienten (20%) ein lokales Krankheitsstadium (p<0.001) aufwies. Um die erhaltenen Ergebnisse zu validieren, wurden alle FL Grad 1-3A aus dem exemplarischen Jahr 2001 untersucht. Hier zeigte sich in 34 Fällen (11 %) eine nur partielle Infiltration. In allen 18 Fällen mit mindestens einem vollständig erhaltenen reaktiven Keimzentrum lag in Übereinstimmung mit der initialen Studienkohorte ein lokales Krankheitsstadium I/II vor (p<0.001). Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eindrücklich, dass follikuläre Lymphome mit einem nur partiellen Befall der Lymphknoten häufig mit einem (noch) lokalen klinischen Stadium assoziiert sind. In diesen Fällen käme eine alleinige Bestrahlung als Therapieoption in Betracht. N2 - Follicular lymphoma belongs to the non-Hodgkin lymphoma and represents the greatest subtype of B-cell-lymphomas. Due to their mostly indolent clinical course they are often diagnosed in clinical stages III/IV, i.e. as a systemic disease. We occasionally observed in cases with preserved reactive follicle structures (so called partial infiltration) an association with an only limited clinical stage I/II. According to standard protocolsthese cases can be controlled with radiotherapy alone. The purpose of this study was to analyze a possible association of a partial infiltration of follicular lymphoma with a limited stage I/II of disease and to determine the incidence of a partial infiltration in FL. Comparing the study group of 53 lymph node biopsies with a partial infiltration defined as at least one totally preserved follicle with the control group we found a highly significant difference: In the study group 38 of 40 cases (95%) showed a local clinical stage, while the control groupwith total infiltration of the lymph node only in 10 of 49 patients (20%) presented a local stage of disease (p<0.001). To validate these results all follicular lymphoma cases WHO grade1-3A in the exemplary year 2001 were examined. In 34 cases (11%) a partial lymph node infiltration was found. In all the 18 cases with at least one totally preserved reactive GC a local stage of disease I/II (p<0.001) was found according to the results of the initial study group. The results show impressively that follicular lymphoma with a partial infiltration of the lymph node are often associated with a (still) local clinical stage of disease. In these cases radiotherapy alone can be regarded as a treatment option. KW - follikulärer KW - Lymphknoten KW - Keimzentrum KW - follikuläre Lymphome erhaltene reaktive Keimzentren KW - follicular lymphoma reactive germinal centers Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170077 ER - TY - THES A1 - Vona, Barbara C. T1 - Molecular Characterization of Genes Involved in Hearing Loss T1 - Molekulare Charakterisierung der in Hörstörungen involvierten Genen N2 - The auditory system is an exquisitely complex sensory organ dependent upon the synchronization of numerous processes for proper function. The molecular characterization of hereditary hearing loss is complicated by extreme genetic heterogeneity, wherein hundreds of genes dispersed genome-wide play a central and irreplaceable role in normal hearing function. The present study explores this area on a genome-wide and single gene basis for the detection of genetic mutations playing critical roles in human hearing. This work initiated with a high resolution SNP array study involving 109 individuals. A 6.9 Mb heterozygous deletion on chromosome 4q35.1q35.2 was identified in a syndromic patient that was in agreement with a chromosome 4q deletion syndrome diagnosis. A 99.9 kb heterozygous deletion of exons 58-64 in USH2A was identified in one patient. Two homozygous deletions and five heterozygous deletions in STRC (DFNB16) were also detected. The homozygous deletions alone were enough to resolve the hearing impairment in the two patients. A Sanger sequencing assay was developed to exclude a pseudogene with a high percentage sequence identity to STRC from the analysis, which further solved three of the six heterozygous deletion patients with the hemizygous, in silico predicted pathogenic mutations c.2726A>T (p.H909L), c.4918C>T (p.L1640F), and c.4402C>T (p.R1468X). A single patient who was copy neutral for STRC and without pathogenic copy number variations had compound heterozygous mutations [c. 2303_2313+1del12 (p.G768Vfs*77) and c.5125A>G (p.T1709A)] in STRC. It has been shown that STRC has been previously underestimated as a hearing loss gene. One additional patient is described who does not have pathogenic copy number variation but is the only affected member of his family having hearing loss with a paternally segregating translocation t(10;15)(q26.13;q21.1). Twenty-four patients without chromosomal aberrations and the above described patient with an USH2A heterozygous deletion were subjected to a targeted hearing loss gene next generation sequencing panel consisting of either 80 or 129 hearing-relevant genes. The patient having the USH2A heterozygous deletion also disclosed a second mutation in this gene [c.2276G>T (p.C759F)]. This compound heterozygous mutation is the most likely cause of hearing loss in this patient. Nine mutations in genes conferring autosomal dominant hearing loss [ACTG1 (DFNA20/26); CCDC50 (DFNA44); EYA4 (DFNA10); GRHL2 (DFNA28); MYH14 (DFNA4A); MYO6 (DFNA22); TCF21 and twice in MYO1A (DFNA48)] and four genes causing autosomal recessive hearing loss were detected [GJB2 (DFNB1A); MYO7A (DFNB2); MYO15A (DFNB3), and USH2A]. Nine normal hearing controls were also included. Statistical significance was achieved comparing controls and patients that revealed an excess of mutations in the hearing loss patients compared to the control group. The family with the GRHL2 c.1258-1G>A mutation is only the second family published worldwide with a mutation described in this gene to date, supporting the initial claim of this gene causing DFNA28 hearing loss. Audiogram analysis of five affected family members uncovered the progressive nature of DFNA28 hearing impairment. Regression analysis predicted the annual threshold deterioration in each of the five family members with multiple audiograms available over a number of years. N2 - Das Gehör als komplexes Sinnesorgan ist für eine einwandfreie Funktion abhängig von der Synchronisation zahlreicher Prozesse. Durch die extreme genetische Heterogenität wird die molekulare Charakterisierung einer erblich bedingten Schwerhörigkeit erschwert, da hunderte genomweit verteilter Gene eine zentrale und unersetzliche Rolle beim Hören spielen. Die vorliegende Studie untersucht dieses Forschungsgebiet auf genomweiter Ebene und auf der Basis von Einzelgenen, um genetische Mutationen zu ermitteln, die eine entscheidende Rolle bei der menschlichen auditiven Wahrnehmung besitzen. Diese Arbeit beginnt mit einer Studie an 109 Personen unter Zuhilfenahme von hochauflösenden SNP-Arrays. In dieser Studie wurde eine 6,9 Mb heterozygote Deletion auf Chromosom 4q35.1q35.2 bei einem syndromalen Patienten identifiziert, die eine Übereinstimmung mit einem Chromosom 4q-Deletionssyndrom aufwies. Bei einem weiteren Patienten wurde eine 99,9 kb heterozygote Deletion der Exons 58-64 in USH2A nachgewiesen. Zwei homozygote Deletionen und fünf heterozygote Deletionen in STRC (DFNB16) wurden ebenfalls detektiert. Die homozygoten Deletionen waren ausreichend, um die Schwerhörigkeit bei beiden Patienten zu klären. Ein Sanger-Sequenzierungs-Assay wurde entwickelt, um ein Pseudogen mit einer hohen prozentualen Sequenzidentität zu STRC von der Analyse auszuschließen. Dadurch konnten drei der sechs heterozygoten Deletionspatienten mit hemizygot in silico vorhergesagten pathogenen Mutationen, c.2726A>T (p.H909L), c.4918 C>T (p.L1640F) und c.4402C>T (p.R1468X), aufgeklärt werden. Ein Patient, der eine kopieneutrale STRC Variation und keine pathogenen Kopienzahlvariationen besaß, zeigte eine compound heterozygote Mutation [c.2303_2313+1del12 (p.G768Vfs*77) und c.5125A>G (p.T1709A)] in STRC. Es wurde gezeigt, daß die Beurteilung von STRC als Hörstörungsgen bisher unterschätzt wurde. Zusätzlich wird ein Patient beschrieben, der keine pathogenen Kopienzahlvariationen aufwies, aber das einzige Familienmitglied mit einer Schwerhörigkeit und einer paternalen segregierten Translokation t(10;15)(q26.13;q21.1) war. Vierundzwanzig Patienten ohne Chromosomenstörungen und der oben beschriebene Patient mit einer USH2A heterozygoten Deletion wurden mit einem Next Generation Sequencing Panel bestehend aus entweder 80 oder 129 für das Hören relevanter Gene untersucht. Der Patient mit einer USH2A heterozygoten Deletion zeigte eine zweite Mutation in diesem Gen [c.2276G>T (p.C759F)]. Diese compound heterozygote Mutation ist die wahrscheinlichste Ursache für die Schwerhörigkeit des Patienten. Neun Mutationen in Genen, die zu einem autosomal dominanten Hörverlust führen [ACTG1 (DFNA20/26); CCDC50 (DFNA44); EYA4 (DFNA10); GRHL2 (DFNA28); MYH14 (DFNA4A); MYO6 (DFNA22); TCF21], sowie zwei MYO1A (DFNA48) Mutationen und Mutationen in vier weiteren Genen, verantwortlich für autosomal rezessive Schwerhörigkeit [GJB2 (DFNB1A); MYO7A (DFNB2); MYO15A (DFNB3) und USH2A], konnten identifiziert werden. Neun normal hörende Kontrollen waren ebenfalls in diese Studie einbezogen worden. Durch einen Vergleich der Kontrollen mit den Patienten konnte eine statistische Signifikanz erreicht werden, die einen Überschuss an Mutationen bei der Patientengruppe gegenüber der Kontrollgruppe aufzeigte. Die Familie mit einer GRHL2 c.1258-1G>A Mutation ist die erst zweite Familie weltweit, die mit einer Mutation in diesem Gen publiziert worden ist. Dies unterstützt die initiale Behauptung, dass dieses Gen für eine DFNA28 Schwerhörigkeit verantwortlich ist. Die Audiogrammanalyse von fünf der betroffenen Familienmitglieder lässt eine voranschreitende Natur der DFNA28 Hörschädigung erkennen. Eine jährliche Verschlechterung der Hörschwelle bei jedem der fünf Familienmitglieder konnte eine Regressionsanalyse anhand von Audiogrammen, die über eine Anzahl von Jahren zur Verfügung standen, vorhersagen. KW - Molekularbiologie KW - Hearing loss KW - Hörverlust Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112170 N1 - Dieses Dokument wurde aus Datenschutzgründen - ohne inhaltliche Änderungen - erneut veröffentlicht. Die ursprüngliche Veröffentlichung war am: 09.07.2014 ER - TY - THES A1 - Taschik, Julia T1 - Zytokingenpolymorphismen bei Kindern mit akuter lymphatischer Leukämie T1 - Genetic cytokine polymorphism in children with acute lymphoblastic leukamie N2 - Die akute lymphatische Leukämie ist die häufigste maligne Erkrankung im Kindesalter. Trotz systematischer Erhebung und Auswertung von Daten im Rahmen der ALL-BFM-Studiengruppe und der damit verbundenen kontinuierlichen Verbesserung der Prognose hat man noch immer keine Ursache für eine ALL gefunden. Daher nimmt eine umfangreiche Risikostratifizierung eine zentrale Rolle in der Behandlungsplanung einer ALL ein. Basierend auf einer exakten Stratifizierung kann die Therapie risikoadaptiert und individualisiert werden, um eine Übertherapie zu vermeiden und letztlich die Heilungschancen zu verbessern. Pro- und antiinflammatorische Zytokine kommt in den komplexen Wirkungsmechanismen des Immunsystems eine Schlüsselrolle zu. Viele Infektions-, Auto-immun- oder Tumorerkrankungen werden durch das Produktionsprofil der Zyto-kine beeinflusst. Da genetisch determinierte Zytokingenpolymorphismen Krank-heitsverläufe beeinflussen und verändern, wurde untersucht, ob Zytokine einen Einfluss auf pädiatrische Patienten mit einer ALL haben. Im Zuge dieser Arbeit wurden 95 pädiatrische Patienten mit ALL auf Polymorphismen der Zytokine TNF-α, TGF-β1, IL-10, IL-6 und IFN-γ analysiert, die im Zeitraum vom 21.06.2004 bis zum 30.04.2014 an der Kinderklinik des Universitätsklinikums Würzburg behandelt wurden. Mittels DNA-Extraktion, sequenz-spezifischer PCR und Gelelektropherese wurden 35 Proben bei Erstdiagnose und 93 zum Zeitpunkt der Remission mit folgender zentralen Fragestellung untersucht: Gibt es genetische Risikofaktoren, die Einfluss auf • die Risikogruppe • die Art der Leukämie • die Genfrequenz • die Rezidivrate und • das Gesamtüberleben einer akuten lymphatische Leukämie im Kindesalter haben und sich zudem durch Einzelnukleotidpolymorphismen in pro- und antiinflammatorischen Zytokinen auszeichnen? Im Rahmen dieser Studie konnte festgestellt werden, dass das immunsuppressive Zytokin IL-10 einen Einfluss auf die Genfrequenz, die Risikogruppe, die Rezidivrate sowie die Prognose bei Kindern mit ALL hat. Patienten mit niedrigen Zytokinexpressionsraten (Genotypen ACC/ACC und ACC/ATA) wurden häufiger in der Hochrisikogruppe therapiert, hatten mehr Rezidive und eine schlechtere Prognose als Patienten mit hohen Zytokinexpressionsraten. Dar-über hinaus ist der Genotyp GCC/ACC signifikant häufiger bei ALL-Patienten anzutreffen als im gesunden Kollektiv. Beim immunsuppressiven IL-6 konnte festgestellt werden, dass der Genotyp C/C signifikant häufiger bei Patienten mit einer ALL auftritt als bei gesunden Patienten. Ferner zeigte sich, dass es so-wohl für IL-6 als auch für TNF-α eine Änderung des Genotyps zwischen Erstdiagnose und in Remission auftrat, die Hinweise auf einen blastenspezifischen „immune-escape“-Mechanismus geben. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass das immunmodulatorische Zytokin TGF-β1 einen Einfluss auf die Risikogruppe sowie die Rezidivrate hat. Patienten, die eine T/T Kombination am Codon 10 aufwiesen wurden häufiger im Hochrisikozweig therapiert als Patienten mit den Genotypen T/C oder C/C. Des Weiteren wurde demonstriert, dass Patienten mit einem C/C an Codon 25 häufiger an Rezidiven erkrankten als Patienten mit ei-nem G/C oder G/G. Für die TH1 Zytokine IFN-γ sowie TNF-α wurde kein Zusammenhang zwischen der Genfrequenz, der Risikogruppe, der Art der Leukämie, der Rezidivrate oder dem Gesamtüberleben gefunden. Auch wenn man bisher noch nicht genau weiß, wie Zytokingenpolymorphismen Einfluss auf pädiatrische ALL nehmen, wird anhand dieser Arbeit gezeigt, dass Zytokine einen Beitrag zur Pathogenese der ALL leisten und daher zukünftig für eine umfassendere Risikostratifizierung geeignet sind. Darüber hinaus können diese Ergebnisse dazu beitragen, dass Zytokine als biologische Marker etabliert werden, um eine weniger toxische immunmodulierende bzw. -suppressive Therapie zu gewährleisten. Dies führt dazu, dass eine Therapie anhand des Risikoprofils individuell und prognoseverbessernd abgestimmt werden kann. Je-doch wäre für eine nachfolgende Untersuchung eine größere multizentrische Stichprobe sowie eine prospektive Evaluation der Daten erstrebenswert. Gera-de bei hereditären Erkrankungen haben einzelne Gene nur einen geringen Einfluss auf das Gesamtrisiko, sodass größere Fallzahlen erforderlich wären, um auch schwache Effekte zu detektieren. N2 - Acute lymphoblastic leukaemia (ALL) is the most common malignant disease in childhood. Although survival rates in paediatric patients with ALL have greatly improved since effective drug combinations and risk-adapted therapy protocols were introduced, possible causes for ALL are yet to be determined. The incomplete information on the pathogenesis of ALL heightens the need for extensive risk stratification in order to develop and improve treatment methods. Exact stratification helps to continuously improve and develop risk-adapted and individual therapy approaches to minimise over- or under-treatment. Based on the empirical finding that cytokines play a decisive role in immune responses and that many autoimmune and malignant diseases are influenced by cytokine production, this study hypothesized that genetically determined cy-tokine gene polymorphisms might have an impact on children with ALL. 95 pediatric ALL patients were examined between June 2004 and April 2013 at the Children’s Hospital of the University of Würzburg with regard to cytokine gene polymorphisms in TNF-α, TGF-β1, IL-10, IL-6 and IFN-γ. Applying DNA extraction, sequence-specific PCR and gel electrophoresis, 35 samples at initial diagnosis and 93 samples in remission were obtained in order to find an answer to the following question: Are there any genetic risk factors, which influence the • risk group • type of leukaemia • gene frequency • relapse rate • overall survival with acute lymphoblastic leukaemia in childhood? Within the scope of this study the immunosuppressive IL-10 has an influence on gene frequency, risk group, relapse rate and overall survival. IL-10 high-producer-haplotypes were reduced in ALL-patients compared with healthy controls and resulted in a reduced relapse rate, a superior overall survival and resulted more often in the low risk group compared with IL-10 low producer haplotypes. By analysing immunosuppressive IL-6, it was demonstrated, that the genotype C/C is significantly more frequent in ALL-patients in comparison to healthy patients. Interestingly, with regard to IL-6 as well as to TNF-α genotypes a change in the genotype from initial diagnosis to remission was found in some patients, which may indicate a blast specific immune-escape mechanism. Moreover, the immune-modulatory cytokine TGF-β1 has an influence on risk group and relapse rate. Patients with a C/C in Codon 10 suffered more often from relapses than patients with G/C or G/G. TGF-β1 high producer haplotypes were correlated with a high initial blast-count (Codon 25 G/G) and were elevated in high-risk ALL-patients (Codon 10 T/T). For the TH1 cytokines IFN-γ and TNF-α no correlation between frequencies, risk group, type of leukaemia, re-lapse rate or overall survival could be found. Even though the mechanisms by which the cytokine polymorphisms influence the outcome of paediatric ALL remain to be determined, the data of the present study suggest an important contribution of cytokines to the pathogenesis of ALL and demonstrate their potential applicability in the clinical evaluation of prognosis in paediatric patients. Confirmatory studies correlating cytokine alleles with disease markers will support the concept of cytokine-mediated immune surveil-lance in humans as well as the importance of the genetic background of the patient for strong anti-tumour immunity and responses to therapy. These data can finally help to establish biomarkers for therapy stratification as well as immune-therapeutic tools in childhood ALL for a more risk-adapted therapy, in order to adapt the therapy intensity. However, for further studies an increase in sample size and a prospective multicentre evaluation would be desirable. Especially in hereditary diseases, single genes have only a small influence on the overall risk. That is why it is crucial to have a sufficiently high number of cases to detect even small effects. KW - Cytokine KW - Polymorphismus KW - Akute lymphatische Leukämie KW - Zytokingenpolymorphismus KW - akute lymphatische Leukämie bei Kindern KW - genetic cytokine polymorphism KW - acute lymphoblastic leukaemia KW - pediatric hematology oncology KW - Cancer biology KW - molecular biology of cytokines KW - Zytokin Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133312 ER - TY - THES A1 - Kuhtz, Juliane T1 - Epimutationen humaner Keimzellen und Infertilität T1 - Epimutations of human germ cells and infertility N2 - Infertilität stellt in unserer heutigen Gesellschaft ein zunehmendes Problem dar. Bei der Suche nach den der Infertilität zugrunde liegenden Ursachen gerät immer mehr die Epigenetik in den Fokus. Epigenetische Prozesse sind nicht nur in die Embryo-nalentwicklung und Wachstumsprozesse des Kindes involviert, sondern auch in korrekte Funktionsweisen von Gameten. Störungen können die Fertilität beeinträch-tigen. Eine besondere Rolle spielen geprägte Gene, die auf einem ihrer Allele, je nach parentaler Herkunft, ein Imprint in Form von DNA-Methylierung tragen. Fehl-regulationen solcher geprägter Gene können zu Imprinting-Erkrankungen führen. Seit Einführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) wurden verschiedene assistierte Re-produktionstechniken (ART) entwickelt, um infertilen Paaren zu helfen. Die Sicher-heit dieser Techniken ist nicht abschließend geklärt. Immer wieder wird von nach ART-Behandlung gehäuft auftretenden Imprinting-Erkrankungen berichtet. Diese Erkrankungen stehen jedoch eher in Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Infertilität, als mit ART selbst. Dennoch ist es notwendig zu untersuchen inwieweit sich ART eventuell auf den Gesundheitszustand dieser Kinder auswirken könnte. In der hier vorgelegten Arbeit wurde der Zusammenhang von Epigenetik, Infertilität und ART von verschiedenen Standpunkten aus beleuchtet. In humanen Spermien wurde die DNA-Methylierung verschiedener geprägter Gene hinsichtlich Epimutationen untersucht. ICSI (intracytoplasmatic sperm injection) und IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) sind verschiedene Techniken zur Selektion von Spermien für eine ART-Behandlung. Hier wurde un-tersucht, ob IMSI epigenetisch bessere Spermien selektiert als die konventionelle ICSI-Methode. Außerdem ist bekannt, dass in Spermienköpfen fertiler und infertiler Männer Vakuolen vorkommen können, deren epigenetische Bedeutung jedoch un-bekannt ist. Ob diese Vakuolen in Zusammenhang mit Epimutationen stehen könn-ten, wurde ebenfalls überprüft. Dazu wurde bisulfitkonvertierte DNA weniger Sper-mien (11 je Probe) mithilfe der Limiting Dilution (LD)–Technik und Pyrosequenzie-rung analysiert. Insgesamt standen 880 Spermien für diese Untersuchung zur Ver-fügung. Es konnte kein Unterschied zwischen IMSI- und ICSI-selektierten Spermien gefunden werden. Vorhandene Vakuolen im Spermienkopf beeinträchtigten nicht die DNA-Methylierung der Gene hGTL2, hLIT1 und hPEG3. Ein weiteres Projekt befasste sich mit der Frage, inwieweit die Technik der In-vitro-Maturation (IVM) DNA-Methylierung in humanen Oocyten beeinflussen könnte. Bisulfitkonvertierte DNA einzelner humaner Oocyten wurde mit LD und Pyrose-quenzierung analysiert. Verglichen wurden IVM und in vivo gereifte Oocyten. Hier-für standen 139 Oocyten zur Verfügung, wovon 90 mittels IVM und 49 in vivo gereift waren. Untersucht wurden vier geprägte Gene (hGTL2, hLIT1, hPEG3 und hSNRPN) und drei nicht geprägte Gene (hDNMT3Lo, hNANOG und hOCT4). Es konnten keine IVM-bedingten Epimutationen gefunden werden. Im dritten Projekt wurde untersucht, ob sich die DNA-Methylierung normaler Sper-mien von Spermien aus Oligozoospermie-Asthenozoospermie-Teratozoospermie (OAT)–Syndrom-Patienten unterscheidet. Eine weitere Frage war, ob Epimutationen einen Einfluss auf den ART-Ausgang haben. Untersucht wurden 54 Spermienpro-ben von Paaren in ART-Behandlung. Zur Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster der geprägten Gene hGTL2 und hPEG3 sowie der beiden nicht geprägten Pluripotenzgene hNANOG und hOCT4 wurde die Methode Deep Bisulfite Sequencing (DBS) verwendet. Dies ist eine Next Generation Sequencing (NGS)–Technik, angewandt an bisulfitkonvertierter DNA. Diese Technik ermöglicht es mehrere Proben sowie Gene gleichzeitig zu analysieren. Es zeigte sich, dass OAT-Spermien, die zu einer Lebendgeburt geführt hatten, sich epigenetisch nicht von normalen Spermien unterschieden. Besonders viele Epimutationen konnten hingegen in OAT-Spermien gefunden werden, die zu keiner Schwangerschaft ge-führt hatten. Zwischen Spermien die zu einer Lebendgeburt oder keiner Schwan-gerschaft geführt hatten, zeigten sich Unterschiede in der Häufigkeit von hGTL2-Epimutationen. Über die Häufigkeit von Epimutationen konnte eine prädiktive Aus-sage zum ART-Ausgang getroffen werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass sich eine Häu-fung von Epimutationen darauf auswirkt, ob eine Schwangerschaft erreicht werden kann oder nicht. Diese Epimutationen liegen bereits im parentalen Genom vor. Sie werden nicht durch ART verursacht. Allerdings muss man Techniken finden, mit denen man Gameten mit möglichst wenig Epimutationen selektiert, um eine Über-tragung solcher auf das Kind zu verhindern. N2 - Infertility is an increasing problem in today’s society. The search for the underlying causes of infertility reveals more and more the role of epigenetics. Epigenetic pro-cesses are involved in embryo development and growth, but also in the proper func-tion of gametes. Disturbances have been shown to impair fertility. Imprinted genes play an important role. They carry a parental-specific DNA methylation imprint on one of their alleles. Deregulation of these genes leads to imprinting diseases. Since the introduction of in vitro fertilisation (IVF), different assisted reproductive technologies (ART) have been developed to treat infertile couples. The safety of these techniques is not finally solved. Increased rates of imprinting diseases in ART offspring have been reported, but seem more likely to be linked to the underlying parental infertility problems than to ART itself. Nevertheless it is of importance to in-vestigate how ART could affect the health of those children. In the work presented here the relations between epigenetics, infertility and ART have been investigated from different points of view. Firstly, the DNA methylation pattern of different imprinted genes has been investi-gated in human sperm with regard to the frequency of epimutations. ICSI (intracyto-plasmatic sperm injection) and IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) are different techniques to select sperm for ART treatment. It was analysed whether IMSI selects epigenetically superior sperm than the conventional ICSI method. Furthermore it is known that sperm from fertile and infertile men can carry vacuoles in their sperm heads. Their epigenetic relevance is unknown. Whether these vacuoles are linked to epimutations has also been investigated here. Bisulfite converted DNA of a few sperm (11 per sample) was analysed using the Limiting Dilution (LD) technique followed by pyrosequencing. In total 880 sperm were available for analysis. No difference between IMSI and ICSI selected sperm was found. Further, no influence of sperm head vacuoles on the DNA methylation patterns of the genes hGTL2, hLIT1 and hPEG3 could be observed. Secondly, it was of interest whether the in vitro maturation (IVM) technique has an influence on DNA methylation in human oocytes. Bisulfite converted DNA of single human oocytes was analysed with LD and pyrosequencing. IVM oocytes were com-pared to in vivo grown oocytes. A total of 139 oocytes were available, of which 90 oocytes were IVM treated while 49 oocytes were grown in vivo. Four imprinted genes (hGTL2, hLIT1, hPEG3 and hSNRPN) and three non-imprinted genes (hDNMT3Lo, hNANOG and hOCT4) were analysed. No IVM-induced epimutations were detected. Finally, it was investigated whether DNA methylation patterns of normal sperm would differ from sperm of oligozoospermia-asthenozoospermia-teratozoospermia (OAT) syndrome patients. Furthermore it was of interest whether epimutations would influence the ART outcome. A total of 54 sperm samples from couples undergoing ART treatment were investigated. To analyse DNA methylation of the imprinted genes hGTL2 and hPEG3 as well as the non-imprinted pluripotency genes hNANOG and hOCT4, Deep Bisulfite Sequencing (DBS) was applied. This is a Next Generation Sequencing (NGS) technique applied on bisulfite converted DNA, al-lowing the analysis of several samples and genes at once. The obtained results showed that OAT samples, which had led to a live-birth, did not differ epigenetically from normal sperm. Much more epimutations were found in OAT sperm which had failed to achieve a pregnancy. Sperm not being able to achieve a pregnancy differed from sperm that had led to a live-birth with regard to hGTL2 epimutation frequency. In addition, ART outcome can be predicted using the frequency of epimutations. Taken together this work shows that the amount of epimutations influences whether a pregnancy can be achieved or not. Epimutations already exist within the parental genome. They are not caused by ART. Nevertheless, one needs to find techniques with which gametes with as few as possible epimutations are being selected to pre-vent the transmission of these onto the offspring. KW - Epigenetik KW - Sterilität KW - Epimutationen KW - geprägte Gene KW - humane Keimzellen KW - Infertilität Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108248 ER - TY - THES A1 - Vona, Barbara C. T1 - Molecular Characterization of Genes Involved in Hearing Loss T1 - Molekulare Charakterisierung der in Hörstörungen involvierten Genen N2 - The auditory system is an exquisitely complex sensory organ dependent upon the synchronization of numerous processes for proper function. The molecular characterization of hereditary hearing loss is complicated by extreme genetic heterogeneity, wherein hundreds of genes dispersed genome-wide play a central and irreplaceable role in normal hearing function. The present study explores this area on a genome-wide and single gene basis for the detection of genetic mutations playing critical roles in human hearing. This work initiated with a high resolution SNP array study involving 109 individuals. A 6.9 Mb heterozygous deletion on chromosome 4q35.1q35.2 was identified in a syndromic patient that was in agreement with a chromosome 4q deletion syndrome diagnosis. A 99.9 kb heterozygous deletion of exons 58-64 in USH2A was identified in one patient. Two homozygous deletions and five heterozygous deletions in STRC (DFNB16) were also detected. The homozygous deletions alone were enough to resolve the hearing impairment in the two patients. A Sanger sequencing assay was developed to exclude a pseudogene with a high percentage sequence identity to STRC from the analysis, which further solved three of the six heterozygous deletion patients with the hemizygous, in silico predicted pathogenic mutations c.2726A>T (p.H909L), c.4918C>T (p.L1640F), and c.4402C>T (p.R1468X). A single patient who was copy neutral for STRC and without pathogenic copy number variations had compound heterozygous mutations [c. 2303_2313+1del12 (p.G768Vfs*77) and c.5125A>G (p.T1709A)] in STRC. It has been shown that STRC has been previously underestimated as a hearing loss gene. One additional patient is described who does not have pathogenic copy number variation but is the only affected member of his family having hearing loss with a paternally segregating translocation t(10;15)(q26.13;q21.1). Twenty-four patients without chromosomal aberrations and the above described patient with an USH2A heterozygous deletion were subjected to a targeted hearing loss gene next generation sequencing panel consisting of either 80 or 129 hearing-relevant genes. The patient having the USH2A heterozygous deletion also disclosed a second mutation in this gene [c.2276G>T (p.C759F)]. This compound heterozygous mutation is the most likely cause of hearing loss in this patient. Nine mutations in genes conferring autosomal dominant hearing loss [ACTG1 (DFNA20/26); CCDC50 (DFNA44); EYA4 (DFNA10); GRHL2 (DFNA28); MYH14 (DFNA4A); MYO6 (DFNA22); TCF21 and twice in MYO1A (DFNA48)] and four genes causing autosomal recessive hearing loss were detected [GJB2 (DFNB1A); MYO7A (DFNB2); MYO15A (DFNB3), and USH2A]. Nine normal hearing controls were also included. Statistical significance was achieved comparing controls and patients that revealed an excess of mutations in the hearing loss patients compared to the control group. The family with the GRHL2 c.1258-1G>A mutation is only the second family published worldwide with a mutation described in this gene to date, supporting the initial claim of this gene causing DFNA28 hearing loss. Audiogram analysis of five affected family members uncovered the progressive nature of DFNA28 hearing impairment. Regression analysis predicted the annual threshold deterioration in each of the five family members with multiple audiograms available over a number of years. N2 - Das Gehör als komplexes Sinnesorgan ist für eine einwandfreie Funktion abhängig von der Synchronisation zahlreicher Prozesse. Durch die extreme genetische Heterogenität wird die molekulare Charakterisierung einer erblich bedingten Schwerhörigkeit erschwert, da hunderte genomweit verteilter Gene eine zentrale und unersetzliche Rolle beim Hören spielen. Die vorliegende Studie untersucht dieses Forschungsgebiet auf genomweiter Ebene und auf der Basis von Einzelgenen, um genetische Mutationen zu ermitteln, die eine entscheidende Rolle bei der menschlichen auditiven Wahrnehmung besitzen. Diese Arbeit beginnt mit einer Studie an 109 Personen unter Zuhilfenahme von hochauflösenden SNP-Arrays. In dieser Studie wurde eine 6,9 Mb heterozygote Deletion auf Chromosom 4q35.1q35.2 bei einem syndromalen Patienten identifiziert, die eine Übereinstimmung mit einem Chromosom 4q-Deletionssyndrom aufwies. Bei einem weiteren Patienten wurde eine 99,9 kb heterozygote Deletion der Exons 58-64 in USH2A nachgewiesen. Zwei homozygote Deletionen und fünf heterozygote Deletionen in STRC (DFNB16) wurden ebenfalls detektiert. Die homozygoten Deletionen waren ausreichend, um die Schwerhörigkeit bei beiden Patienten zu klären. Ein Sanger-Sequenzierungs-Assay wurde entwickelt, um ein Pseudogen mit einer hohen prozentualen Sequenzidentität zu STRC von der Analyse auszuschließen. Dadurch konnten drei der sechs heterozygoten Deletionspatienten mit hemizygot in silico vorhergesagten pathogenen Mutationen, c.2726A>T (p.H909L), c.4918 C>T (p.L1640F) und c.4402C>T (p.R1468X), aufgeklärt werden. Ein Patient, der eine kopieneutrale STRC Variation und keine pathogenen Kopienzahlvariationen besaß, zeigte eine compound heterozygote Mutation [c.2303_2313+1del12 (p.G768Vfs*77) und c.5125A>G (p.T1709A)] in STRC. Es wurde gezeigt, daß die Beurteilung von STRC als Hörstörungsgen bisher unterschätzt wurde. Zusätzlich wird ein Patient beschrieben, der keine pathogenen Kopienzahlvariationen aufwies, aber das einzige Familienmitglied mit einer Schwerhörigkeit und einer paternalen segregierten Translokation t(10;15)(q26.13;q21.1) war. Vierundzwanzig Patienten ohne Chromosomenstörungen und der oben beschriebene Patient mit einer USH2A heterozygoten Deletion wurden mit einem Next Generation Sequencing Panel bestehend aus entweder 80 oder 129 für das Hören relevanter Gene untersucht. Der Patient mit einer USH2A heterozygoten Deletion zeigte eine zweite Mutation in diesem Gen [c.2276G>T (p.C759F)]. Diese compound heterozygote Mutation ist die wahrscheinlichste Ursache für die Schwerhörigkeit des Patienten. Neun Mutationen in Genen, die zu einem autosomal dominanten Hörverlust führen [ACTG1 (DFNA20/26); CCDC50 (DFNA44); EYA4 (DFNA10); GRHL2 (DFNA28); MYH14 (DFNA4A); MYO6 (DFNA22); TCF21], sowie zwei MYO1A (DFNA48) Mutationen und Mutationen in vier weiteren Genen, verantwortlich für autosomal rezessive Schwerhörigkeit [GJB2 (DFNB1A); MYO7A (DFNB2); MYO15A (DFNB3) und USH2A], konnten identifiziert werden. Neun normal hörende Kontrollen waren ebenfalls in diese Studie einbezogen worden. Durch einen Vergleich der Kontrollen mit den Patienten konnte eine statistische Signifikanz erreicht werden, die einen Überschuss an Mutationen bei der Patientengruppe gegenüber der Kontrollgruppe aufzeigte. Die Familie mit einer GRHL2 c.1258-1G>A Mutation ist die erst zweite Familie weltweit, die mit einer Mutation in diesem Gen publiziert worden ist. Dies unterstützt die initiale Behauptung, dass dieses Gen für eine DFNA28 Schwerhörigkeit verantwortlich ist. Die Audiogrammanalyse von fünf der betroffenen Familienmitglieder lässt eine voranschreitende Natur der DFNA28 Hörschädigung erkennen. Eine jährliche Verschlechterung der Hörschwelle bei jedem der fünf Familienmitglieder konnte eine Regressionsanalyse anhand von Audiogrammen, die über eine Anzahl von Jahren zur Verfügung standen, vorhersagen. KW - Hearing loss KW - Molekularbiologie KW - Hörverlust Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98031 N1 - Aus datenschutzrechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. Eine inhaltlich identische neue Version ist erhältlich unter: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-112170 ER - TY - THES A1 - Schneider [geb. Hansmann], Tamara T1 - Epigenetische Effekte der in vitro-Maturation von Eizellen auf DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene im Modellorganismus Bos taurus T1 - Epigenetic effects of in vitro maturation of oocytes on DNA methylation profiles of developmentally important genes in the model organism Bos taurus N2 - Assistierte Reproduktionstechniken (ARTs) zur Behandlung von Infertilität werden mit einer erhöhten Häufigkeit von epigenetischen Aberrationen während der Gametogenese und der frühen Embryonalentwicklung in Verbindung gebracht, speziell durch eine Beeinträchtigung von geprägten Genen. Die in vitro-Maturation (IVM) von Eizellen ist eine ART, die bereits routinemäßig zur Reproduktion von ökonomisch wertvollen Zuchttieren wie dem Hausrind (Bos taurus) eingesetzt wird. IVM-Oozyten weisen jedoch eine verringerte Entwicklungs-kompetenz zum Blastozystenstadium dar, welche möglicherweise auf eine beeinträchtigte epigenetische Regulation zurückzuführen ist. Von allen bekannten epigenetischen Mechanismen ist die DNA-Methylierung die meist untersuchte DNA-Modifikation. In dieser Arbeit wurden zur Klärung der Frage nach den Auswirkungen der IVM auf die DNA-Methylierung geprägter als auch nicht geprägter Gene Oozyten des Hausrinds analysiert. Diese Tierart weist eine ähnliche Präimplantations-entwicklung und Tragezeit wie der Mensch auf und wird daher zunehmend als Modell zum Studium der humanen Keimzell- und Embryonalentwicklung herangezogen. Im Gegensatz zu Mensch und Maus gibt es bislang nur wenig Information über bovine geprägte Gene. Das erste Ziel der hier dargestellten Forschungsarbeiten war daher die Identifizierung und Charakterisierung der bovinen differenziell methylierten Regionen (DMRs) der drei geprägten Genorte von IGF2/H19, SNRPN und PEG3, welche mit Imprintingdefekten des Menschen und/oder im Mausmodell assoziiert werden. Die hier erstmalig erfolgte Beschreibung von mehreren intergenischen DMRs mittels Bisulfitsequenzierung und Pyrosequenzierung belegt die Existenz und evolutionäre Konservierung der IGF2/H19-Imprintingkontrollregion (ICR) beim Rind. Der geprägte Zustand der IGF2/H19-ICR sowie der bovinen Gene SNRPN und PEG3 wurde durch den Nachweis differenzieller Methylierung in plazentalen und somatischen Geweben sowie in Spermien und parthenogenetischen Embryonen bestätigt. Die beobachteten Methylierungsprofile waren typisch für genomische Prägung. Die direkte Bisulfitsequenzierung nach vorangegangener Limiting Dilution (LD) erlaubt die Analyse von Methylierungsmustern einzelner Allele (DNA-Moleküle) von einigen wenigen oder auch nur einer einzigen Zelle (El Hajj et al., 2011). In einem ersten LD-Versuch an bovinen Oozyten wurden die drei vorab charakterisierten und geprägten Gene hinsichtlich möglicher epigenetischer Veränderungen untersucht, welche durch verschiedene IVM-Bedingungen und -Medien (TCM und mSOF) hervorgerufen werden könnten. Die Gesamtrate von Methylierungsfehlern einzelner CpG-Stellen sowie die von ganzen Allelen (Imprintingfehlern) unterschied sich nicht wesentlich zwischen den beiden IVM-Gruppen und der in vivo-Gruppe. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die gängigen IVM-Protokolle keinen oder nur einen geringfügigen Einfluss auf diese entscheidenden epigenetischen Markierungen haben. IVM-Oozyten präpuberaler Kälber weisen eine herabgesetzte Entwicklungskompetenz im Vergleich zu IVM-Oozyten aus adulten Tieren auf. Aus diesem Grund wurde in einem zweiten LD-Versuchsansatz die Promotormethylierung von drei entwicklungsrelevanten, nicht geprägten Genen (SLC2A1, PRDX1, ZAR1) nach ovarieller Stimulation mit FSH und/oder IGF1 untersucht. Sowohl ungereifte als auch in vitro-gereifte Oozyten präpuberaler und adulter Kühe zeigten eine deutliche, unbeeinträchtige Hypomethylierung der drei Genpromotoren ohne jegliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Alterstypen der Spendertiere oder deren Behandlung. Weder das Alter, die hormonelle Stimulation noch die IVM scheinen somit einen Einfluss auf den Methylierungsstatus dieser drei Gene zu haben. Zusammenfassend spiegelte sich die reduzierte Entwicklungsfähigkeit von IVM-Eizellen aus adulten und präpuberalen Kühen nicht in abnormalen Methylierungsmustern der untersuchten geprägten und ungeprägten Gene wider. Dies lässt auf eine generelle Stabilität der etablierten DNA-Methylierungsprofile in Oozyten schließen. Aus diesem Grund müssen andere epigenetische Mechanismen als die DNA-Methylierung wie beispielsweise ncRNAs oder Histonmodifikationen zur Reduktion der Entwicklungskompetenz von präpuberalen und IVM-Oozyten beitragen. Diese Veränderungen behindern mutmaßlich die zytoplasmatische Reifung der Eizelle, welche wiederum zu einer späteren Beeinträchtigung der Entwicklung der Zygote und des Embryos führt. N2 - Infertility treatments by assisted reproductive technologies (ARTs) are associated with an increased incidence of epigenetic aberrations during gametogenesis and early embryo-genesis, specifically in imprinted genes. In vitro-maturation (IVM) of oocytes is an ART which is routinely applied for reproduction of agriculturally and economically important species like cattle (Bos taurus). However, IVM oocytes exhibit a reduced developmental competence to the blastocyst stage which may be caused by an impaired epigenetic regulation. Of all known epigenetic mechanisms DNA-methylation is the most studied DNA-modification. In this thesis, bovine oocytes have been analyzed in order to investigate the impact of IVM on the DNA-methylation of imprinted and non-imprinted genes. Because this species exhibits a similar preimplantation development and gestation length as humans, it is increasingly being used as a model for human germ-cell and embryo development. In contrast to humans and mice, only little information on bovine imprinted genes is available. Thus, the first attempt of the research presented here was to identify and characterize the bovine differentially methylated regions (DMRs) of the three imprinted loci, namely IGF2/H19, SNRPN and PEG3 which are each associated with imprinting defects in humans and/or the mouse model. The first description of several intergenic DMRs by bisulfite sequencing and pyrosequencing proved the existence of an intergenic IGF2/H19 imprinting control region (ICR) in the bovine. The imprinted status of the IGF2/H19-ICR as well as the bovine genes SNRPN and PEG3 was confirmed by differential methylation consistent with genomic imprinting in placental and somatic bovine tissues, in sperm and parthenogenetic embryos. Limiting Dilution (LD) Bisulfite Sequencing (El Hajj et al., 2011) followed by direct bisulfite sequencing allows the analysis of methylation profiles of individual alleles (DNA molecules) from only a few or even single cells. In a first approach using LD, the three characterized imprinted regions were analyzed to determine putative epigenetic alterations in bovine oocytes cultured with different types of IVM conditions and media (TCM and mSOF). The total rate of individual CpG and entire allele methylation errors did not differ significantly between the two IVM and the in vivo group, indicating that current IVM protocols have no or only marginal effects on these critical epigenetic marks. The developmental capacity of IVM oocytes from prepubertal calves is reduced compared with their IVM oocyte counterparts from adult animals. Therefore, in a second LD approach, the promoter methylation of three developmentally important, non-imprinted genes (SLC2A1, PRDX1, ZAR1) has been studied in IVM oocytes from prepubertal cattle after ovarial stimulation with FSH and/or IGF1. Both immature and in vitro matured prepubertal and adult oocytes showed unimpaired hypomethylation of the three gene promoters without differences between the different ages of donors and treatments. Thus, neither age nor hormonal treatment or IVM seem to influence the methylation status of these three genes. In conclusion, the reduced developmental capacity of IVM oocytes from adult and prepubertal cattle were not associated with aberrant methylation patterns of the investigated imprinted and non-imprinted genes suggesting a general stability of established DNA-methylation marks in oocytes. Therefore, epigenetic mechanisms other than DNA-methylation such as ncRNAs or histone modifications might confer to the reduced developmental competence of prepubertal and IVM oocytes. These factors are supposed to interfere with cytoplasmic maturation of the oocyte leading to an impaired development of the zygote and embryo rather than to influence nuclear maturation of the oocyte. KW - Epigenetik KW - DNA-Methylierung KW - Epigenetik KW - DNA-Methylierung KW - Bos taurus KW - Oozyten KW - Rind KW - DNS KW - Oozyte KW - Extrakorporale Befruchtung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98888 ER - TY - THES A1 - Kiene, Carmen T1 - Immunozytogenetische Analysen an Interphase-Zellen und Meiose-Stadien der Maus T1 - Immunocytogenetic analysis of mouse interphase cells and meiotic stages N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden mittels 5-Methylcytosin Immunofärbung zytogenetische Analysen an Metaphasechromosomen aus der Mitose, an Interphase-Zellen verschiedener Organe und an Meiose-Stadien der Maus (Mus musculus) zur Detektion hypermethylierter DNA durchgeführt. Zusätzlich erfolgte eine C-Bänderung an Metaphasechromosomen und Meiose-Stadien zum Nachweis von konstitutivem Heterochromatin. N2 - In the present work, 5-methylcytosine immunostaining was used to perform cytogenetic analysis on metaphase chromosomes from mitosis, on interphase cells from various organs and on meiotic stages of the mouse (Mus musculus) to detect hypermethylated DNA. In addition, C-banding was performed on metaphase chromosomes and meiosis stages to detect constitutive heterochromatin. KW - Cytogenetik KW - Maus KW - Immunfluoreszenz KW - Meiose KW - Zellkern KW - DNA-Methylierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-279109 ER - TY - THES A1 - Nürnberg, Sebastian T1 - Invasive \(Haemophilus\) \(influenzae\)-Isolate in Deutschland: Methodenvalidierung des VITEK MS IVD MALDI-TOF-MS und Untersuchung von Resistenzen gegen Imipenem und Cefotaxim T1 - Invasive \(Haemophilus\) \(influenzae\) Isolates in Germany: Method Validation of the VITEK MS IVD MALDI-TOF-MS and Investigation of Imipenem and Cefotaxime Resistance N2 - Die Inzidenz invasiver H. influenzae-Infektionen in Deutschland steigt seit Jahren an. Die akkurate Identifizierung und Resistenztestung dieses Erregers sind von großer klinischer und epidemiologischer Bedeutung. Daher wurden im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit umfangreiche Untersuchungen zur Diagnostik und zur Epidemiologie von Antibiotikaresistenzen bei H. influenzae durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die in der Routinediagnostik mittlerweile weit verbreitete MALDI-TOF-MS-Diagnostik durch das VITEK MS IVD nur eingeschränkt zur sicheren Unterscheidung von H. influenzae und H. haemolyticus einsetzbar ist. H. influenzae-Isolate erkannte das System mit einer Genauigkeit von 100 %. Bei H. haemolyticus-Isolaten wurden dagegen 42 % der untersuchten Stämme fälschlicherweise als H. influenzae erkannt. Dieser Fragestellung wurde mit der bisher umfangreichsten molekularbiologisch charakterisierten Studienpopulation beider Bakterienspezies nachgegangen. Die kalkulierte antibiotische Therapie einer Sepsis oder Meningitis erfolgt häufig mit Carbapenemen, die leitliniengerechte Therapie invasiver H. influenzae-Infektionen mit Drittgenerations-Cephalosporinen. Imipenem und Cefotaxim gehören zu den Hauptvertretern dieser Gruppen. Bezüglich der Antibiotikaresistenztestung wurde erstmalig für H. influenzae herausgefunden, dass die routinemäßig verwendete Gradientenagardiffusion (GAD) bei der Testung von Cefotaxim im Vergleich zum Goldstandard Bouillon-Mikrodilution gleichwertig und bei Imipenem sogar sensitiver in der Detektion von Heteroresistenzen ist. Die Epidemiologie dieser Resistenzen wurde in dieser Arbeit erstmalig für Deutschland systematisch erfasst, indem alle verfügbaren invasiven Isolate gemeldeter H. influenzae-Infektionen der Jahre 2016 (Imipenem) beziehungsweise 2016-2019 (Cefotaxim) untersucht wurden. Es wurde eine hohe Prävalenz einer Imipenem-Resistenz von 13,5 % festgestellt. Die Prävalenz einer Cefotaxim-Resistenz lag bei 0,9 %. Zur molekularen Typisierung wurde bei den Imipenem-resistenten Isolaten eine Multilocus-Sequenztypisierung, bei den Cefotaxim-resistenten Stämmen eine Sequenzierung des vollständigen Genoms durchgeführt. Hierbei wurde eine hohe genetische Diversität der Stämme festgestellt, was die Schlussfolgerung zulässt, dass resistente Mutanten sporadisch entstehen. Die Untersuchung möglicher spatio-temporaler Cluster führte zum Nachweis einer sehr selten vorkommenden Übertragung eines Imipenem-resistenten Stamms. Durch die Sequenzierung von Resistenzgenen wurde die Epidemiologie und Relevanz bekannter Aminosäuresubstitutionen beleuchtet. Unter anderem wurde für die PBP3-Substitutionen L389F und Y557H eine hochsignifikante Korrelation mit dem Auftreten von Cefotaxim-Resistenzen nachgewiesen. Die gewonnenen Genomdaten bieten die Grundlage für die Forschung an weiteren Antibiotikaresistenzdeterminanten von H. influenzae. N2 - Haemophilus influenzae is a fastidious, facultative anaerobic, Gram-negative bacillus that colonizes the respiratory tract and can cause respiratory and invasive infection such as meningitis and sepsis. Invasive H. influenzae infections are potentially life-threatening and incidence rates have been increasing for years. Therefore, fast and accurate diagnostics, reliable testing of antibiotic resistance and a successful antibiotic treatment is of great importance. Therefore, the objective of the first part of this thesis was to evaluate the diagnostic and discriminative potential of the MALDI-TOF-MS system VITEK® MS regarding H. influenzae and H. haemolyticus. H. influenzae can cause invasive infections, whereas H. haemolyticus is mostly apathogenic. The system showed excellent accuracy for the identification of H. influenzae isolates, as 100 % of the 236 isolates were correctly identified. When testing 50 H. haemolyticus strains, however, the system showed significant limitations, since 42 % of these strains were misidentified as H. influenzae. According to the current German guidelines for the treatment of sepsis and meningitis, treatment of invasive H. influenzae infections is carried out using carbapenems, such as imipenem, or third-generation cephalosporins, such as cefotaxime. Therefore, the prevalence of antibiotic resistances to these substances was investigated and possible resistance mechanisms were examined. The two antibiotic susceptibility testing methods Gradient agar diffusion (GAD) and broth microdilution (BMD) were compared. As a result, for the determination of the cefotaxime MIC, the two methods showed an excellent correlation, whereas for imipenem there were significant differences in the measured MIC values. Since strains tested by GAD often showed double or fuzzy inhibition zones, heteroresistances may be more apparent using this method and GAD may be more sensitive at detecting imipenem resistance. The prevalence of imipenem resistance was determined for the year 2016. The analysis of 474 different invasive isolates showed a high prevalence of 5.5 %. If including all resistant isolates according to GAD, the prevalence would be even as high as 13.5 %. MLST was performed on all isolates to investigate the genetic relationship. As a result, however, some sequence types were observed more frequently, it revealed a significant diversity. Both the analysis of ftsI and acrR showed previously described amino acid substitutions. Cefotaxime resistance was investigated for all 2432 invasive H. influenzae for the years 2016-2019. The low prevalence of 0.9 % shows that cefotaxime is still well suited for the treatment of invasive H. influenzae infections. For the investigation of the genetic relationship and possible causes of cefotaxime resistance whole genome sequencing (WGS) was performed on all resistant isolates. The strains showed high genetic diversity and the geographic analysis also showed that the resistant strains were evenly spread throughout the population in Germany. This led to the conclusion that cefotaxime resistance is more likely caused by sporadic mutation events rather than by specific clones spreading in certain areas. The analysis of the ftsI gene showed that the amino acid substitutions L389F and Y557H are significantly associated with elevated cefotaxime MICs. This dissertation provides comprehensive data regarding diagnostics, antimicrobial susceptibility testing and the epidemiology of antibiotic resistances of invasive H. influenzae. It could be shown that the VITEK MS IVD, although established in the routine diagnostics, can only be used to a limited extent for reliably differentiating H. influenzae and H. haemolyticus isolates. Regarding antibiotic susceptibility testing, it was found that GAD showed similar results compared to the gold standard BMD when testing cefotaxime. When testing imipenem, this method was even more sensitive in detecting heteroresistances compared to the gold standard. For the first time, the epidemiology of antibiotic resistance against cefotaxime and imipenem was carried out using a large set of precisely defined invasive H. influenzae isolates to obtain representative data for the prevalence of imipenem and cefotaxime resistance in Germany. By investigating amino acid substitutions in the ftsI and acrR gene the epidemiology and relevance of these substitutions could be shown. A well-founded statement on the relationship of the resistant strains could be made using the state-of-the-art typing methods MLST and whole genome sequencing. The genome data also offers the possibility of examining other genes of these strains in more detail. KW - Haemophilus influenzae KW - MALDI-MS KW - Antibiotikum KW - Cefotaxim KW - Imipenem KW - Haemophilus haemolyticus KW - MALDI-TOF-MS KW - Antibiotikaresistenzen Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345067 ER - TY - THES A1 - Prell, Andreas T1 - The effects of paternal age on DNA methylation of developmentally important genes in human and bovine sperm T1 - Der väterliche Alterseffekt auf DNA-Methylierung in entwicklungsrelevanten Genen im menschlichen und bovinen Spermienepigenom N2 - Western societies are steadily becoming older undergoing a clear trend of delayed parenthood. Children of older fathers have an undeniably higher risk for certain neurodevelopmental disorders and other medical conditions. Changes in the epigenetic landscape and especially in DNA methylation patterns are likely to account for a portion of this inherited disease susceptibility. DNA methylation changes during the ageing process are a well-known epigenetic feature. These so-called age-DMRs exist in developmentally important genes in the methylome of several mammalian species. However, there is only a minor overlap between the age-DMR datasets of different studies. We therefore replicated age-DMRs (which were obtained from a genome wide technique) by applying a different technical approach in a larger sample number. Here, this study confirmed 10 age-DMRs in the human and 4 in the bovine sperm epigenome from a preliminary candidate list based on RRBS. For this purpose, we used bisulphite Pyrosequencing in 94 human and 36 bovine sperm samples. These Pyrosequencing results confirm RRBS as an effective and reliable method to screen for age-DMRs in the vertebrate genome. To decipher whether paternal age effects are an evolutionary conserved feature of mammalian development, we compared methylation patterns between human and bovine sperm in orthologous regulatory regions. We discovered that the level of methylation and the age effect are both species-specific and speculate that these methylation marks reflect the lineage-specific development of each species to hit evolutionary requirements and adaptation processes. Different methylation levels between species in developmentally important genes also imply a differing mutational burden, representing a potential driver for point mutations and consequently deviations in the underlying DNA sequence of different species. Using the example of different haplotypes, this study showed the great effect of single base variations on the methylation of adjacent CpGs. Nonetheless, this study could not provide further evidence or a mechanism for the transfer of epigenetic marks to future generations. Therefore, further research in tissues from the progeny of old and young fathers is required to determine if the observed methylation changes are transmitted to the next generation and if they are associated with altered transcriptional activity of the respective genes. This could provide a direct link between the methylome of sperm from elderly fathers and the development potential of the next generation. N2 - Unsere westliche Gesellschaft wird immer älter und unterliegt einem eindeutigen Trend zur verzögerten Elternschaft. Kinder von älteren Vätern haben ein unbestreitbar höheres Risiko für bestimmte neurologische Entwicklungsstörungen und andere Erkrankungen. Epigenetische Veränderungen insbesondere im DNA-Methylierungsmuster sind wahrscheinlich für einen Teil dieser vererbten Krankheitsanfälligkeit verantwortlich. Altersbedingte Veränderungen im DNA-Methylierungsmuster sind ein bekanntes und gut erforschtes Phänomen in der Epigenetik. Diese so genannten Alters-DMRs konnten im Methylom mehrerer Säugetierarten nachgewiesen werden, insbesondere in entwicklungsrelevanten Genen. Allerdings gibt es nur geringe Überschneidungen zwischen den Alters-DMR-Datensätzen verschiedener Studien. Unser Ziel war es daher, die Vertrauenswürdigkeit eines laborinternen Datensatzes, der auf Reduced Representation Bisulphite Sequencing (RRBS) basierte, zu erhöhen, indem wir einen anderen technischen Ansatz in einer unabhängigen Kohorte anwenden. Mit der Methode des Bisulphite Pyrosequencing konnten wir in dieser Studie 10 Alters-DMRs im menschlichen und 4 im Rinder-Spermienepigenom aus einer vorläufigen Kandidatenliste basierend auf RRBS validieren. Diese Ergebnisse bestätigen, dass RRBS eine wirksame und zuverlässige Methode ist, um neue Alters-DMRs im Wirbeltiergenom zu finden. Um festzustellen, ob väterliche Alterseffekte in der Evolution verschiedener Säugetierarten konserviert wurden, verglichen wir die Methylierungsmuster orthologer Regionen zwischen dem menschlichem und dem Rinderspermienepigenom. Es zeigte sich, dass sowohl der Methylierungsgrad als auch der Alterseffekt artspezifisch sind. Daher vermuten wir, dass diese Methylierungsmuster die artspezifische Entwicklung als Antwort auf evolutionäre Anforderungen und durchlebte Anpassungsprozesse darstellen. Diese unterschiedlichen Methylierungslevel zwischen verschiedenen Arten in entwicklungswichtigen Genen implizieren auch eine unterschiedliche Mutationslast, die einen potenziellen Treiber für Punktmutationen und folglich Abweichungen in der zugrunde liegenden DNA-Sequenz der verschiedenen Arten darstellt. Am Beispiel verschiedener Haplotypen konnten wir exemplarisch den ausgeprägten Einfluss bereits einzelner DNA-Basenvariationen auf die Methylierung benachbarter CpGs demonstrieren. Allerdings konnte diese Studie keinen weiteren Beweis oder einen Mechanismus für die Übertragung von epigenetischen Markierungen auf künftige Generationen liefern. Daher sind weitere Untersuchungen an embryonalen, fötalen und adulten Geweben von Nachkommen alter bzw. junger Väter unabdingbar, um festzustellen, ob die beobachteten Methylierungsveränderungen auch auf die nächste Generation übertragen werden. Ferner ist festzustellen, ob sie die Transkriptionsaktivität der betroffenen Gene beeinflussen. Dies könnte einen direkten Einfluss des Spermienmethyloms älterer Väter auf das Entwicklungspotenzial der nächsten Generation belegen. KW - Epigenetik KW - Spermium KW - Methylierung KW - DNA-Methylation KW - Paternal age effect Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-347866 ER - TY - THES A1 - Ittner, Cora T1 - Veränderte Barriereeigenschaften der Blut-Hirn-Schranke durch Katecholamine und Entzündungsmediatoren bei Sauerstoff-Glucose-Entzug \(in\) \(vitro\) T1 - Altered barrier properties of the blood brain barrier caused by catecholamines and inflammatory mediators during oxygen glucose deprivation \(in\) \(vitro\) N2 - Das zeitgleiche Auftreten eines ischämischen Schlaganfalls sowie eines Takotsubo-Syndroms (TTS) scheint eine relevante, bisher nicht ausreichend verstandene klinische Konstellation zu sein. Die Pathologien können als über die Hirn-Herz-Achse gekoppelt verstanden werden, in die die Blut-Hirn-Schranke (BHS) als funktionale Komponente integriert ist. Das klinisch-neurologische Outcome dieses Patient:innen-Kollektivs scheint signifikant schlechter zu sein als nach solitärem ischämischen Insult. Es wurde hypothetisiert, dass die BHS in besonderem Maße kompromittiert sein könnte. Das vorwiegend weibliche, postmenopausale Patient:innenkollektiv präsentierte laborchemisch elevierte Katecholaminspiegel sowie Entzündungsparameter. Diese Konditionen wurden unter Sauerstoff-Glucose-Entzug (OGD) in vitro simuliert und resultierende Alterationen eines etablierten BHS-Modells aus murinen cEND-Zellen der cerebralen Mikrozirkulation untersucht. Die Evaluation der BHS-Integrität erfolgte anhand von spezifischen Junktionsproteinen sowie Integrinuntereinheiten. Alle Versuche wurden parallel unter Östrogen-Applikation (E2) durchgeführt, um die mögliche BHS-Protektion durch das weibliche Sexualhormon zu untersuchen. Die getrennte Applikation von Katecholaminen (KAT) sowie Entzündungsmediatoren (INF) führte gegenüber der simultanen Applikation zu einem geringeren BHS-Schaden. Dieser erschien zeitgebunden, wobei sich das Ausmaß gewissermaßen proportional zur Einwirkdauer verhielt. Auswirkungen von OGD sowie einer Reoxygenierung, im Sinne einer simulierten Reperfusion, potenzierten sich mit den Effekten von KAT/INF. Überwiegend kompromittierten OGD und KAT/INF die BHS-Integrität, wobei nach Reoxygenierung eine „Erholung“ oder ein „Reperfusionsschaden“ vorlag. Eine Protektion durch E2 war morphologisch nachweisbar, speziell gegenüber OGD, KAT/INF sowie einem „Reperfusionsschaden“. Auf Ebene der Gen- sowie Proteinexpression konnte dies nicht gezeigt werden. Die Homöostase des ZNS würde in vivo beeinträchtigt, Katecholamine sowie Entzündungsmediatoren könnten ungehindert das bereits durch die Ischämie geschädigte neuronale Gewebe erreichen. Insgesamt trägt diese Arbeit zu einem Verständnis der molekularen BHS-Veränderungen im Kontext des zeitgleichen Auftretens von TTS und einem ischämischem Insult bei. Es wurde eine experimentelle Grundlage geschaffen, um zukünftig pathogenetische Hintergründe weiter erforschen zu können. Darauf aufbauend könnten, nach weiterer in vitro- sowie in vivo-Forschung, klinische Therapiekonzepte optimiert werden. N2 - The simultaneous occurrence of ischemic stroke and Takotsubo syndrome (TTS) seems to be a relevant clinical constellation that is not yet sufficiently understood. The pathologies can be understood as being linked via the brain-heart axis, into which the blood-brain barrier (BBB) is integrated as a functional component. The clinical and neurological outcome of these patients appears to be significantly worse than after a solitary ischemic insult. It has been hypothesized that the BBB may be compromised. The predominantly female, postmenopausal patients presented elevated catecholamine levels and inflammatory markers. These conditions were simulated in vitro under oxygen-glucose deprivation (OGD) condition. Resulting alterations were examined by using an established BBB model: cEND cells of the murine cerebral microcirculation. The BBB integrity was evaluated by investigating specific junction proteins and integrin subunits. All experiments were conducted parallel with estrogen application (E2) in order to investigate a possible BBB protection by the female sexhormone. The separate application of catecholamines (CAT) or inflammatory mediators (INF) led to less BBB damage compared to simultaneous application. This appeared to be time-bound being proportional to the duration of exposure. The effects of OGD and reoxygenation, in the sense of simulated reperfusion therapy, were potentiated by the effects of CAT/INF. Predominantly, OGD and KAT/INF compromised BBB integrity. “Recovery” or “reperfusion injury” occurred after reoxygenation. Protection by E2 was morphologically detectable, especially against OGD, CAT/INF and “reperfusion injury”. This could not be shown at the level of gene or protein expression, respectively. The homeostasis of the CNS would be impaired in vivo, catecholamines and inflammatory mediators would be able to reach the neuronal tissue that had already been damaged by ischemia. Overall, this work contributes to an understanding of the molecular changes in the BBB in the context of the simultaneous occurrence of TTS and ischemia. An experimental basis was created to enable further research into pathogenetic background. Based on this, clinical therapies could be optimized after further in vitro and in vivo research. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Endothelzelle KW - cEND-Zellen KW - Katecholamine KW - Takotsubo-Syndrom KW - Catecholamine KW - Entzündung KW - in vitro KW - Stress-Kardiomyopathie KW - Schlaganfall Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346497 ER - TY - THES A1 - Riemens, Renzo J. M. T1 - Neuroepigenomics in Alzheimer’s disease: The single cell ADds T1 - Neuroepigenomik bei der Alzheimer-Krankheit: Die Einzelzell ADds N2 - Die Forschung, die in dieser Arbeit zusammengestellt wird, kann in zwei Teile geteilt werden. Der erste Teil, bestehend aus vier Kapiteln, konzentriert sich auf die Rolle der epigenetischen Dysregulation in der Ätiopathophysiologie der sporadischen Alzheimer-Krankheit (sAD). Neben Einblicken in die neuesten Entwicklungen in neuroepigenomischen Studien zu dieser Krankheit geht der erste Teil der Arbeit auch auf verbleibende Herausforderungen ein und gibt einen Ausblick auf mögliche Entwicklungen auf diesem Gebiet. Der zweite Teil, der drei weitere Kapitel umfasst, konzentriert sich auf die Anwendung von auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierenden Krankheitsmodellen für das Studium der AD, einschließlich, aber nicht beschränkt auf mechanistische Studien zur epigenetischen Dysregulation unter Verwendung dieser Plattform. Neben der Skizzierung der bisherigen Forschung mit iPSC-basierten Modellen für sAD gibt der zweite Teil der Arbeit auch Einblicke in die Gewinnung krankheitsrelevanter Nervenkulturen auf Basis der gezielten Differenzierung von iPSCs und beinhaltet darüber hinaus einen experimentellen Ansatz für den Aufbau eines solchen Modellsystems. N2 - The research that is compiled in this thesis can be divided in two parts. The first part, consisting of four chapters, is centered around the role of epigenetic dysregulation in the etiopathophysiology of sporadic alzheimer's disease (sAD). In addition to providing insights into the most recent developments in neuroepigenomic studies of this disease, the first part of the thesis also touches upon remaining challenges, and provides a future outlook on possible developments in the field. The second part, which includes three more chapters, is focused on the application of induced pluripotent stem cell (iPSC)-based disease models for the study of AD, including but not limited to mechanistic studies on epigenetic dysregulation using this platform. Aside from outlining the research that has been conducted using iPSC-based models for sAD to date, the second part of the thesis also provides insights into the acquisition of disease-relevant neural cultures based on directed differentiation of iPSCs, and furthermore includes an experimental approach for the establishment of such a model system. KW - Epigenetik KW - Alzheimerkrankheit KW - Neuroepigenomics KW - Alzheimer's disease Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-254574 SN - 978-94-6423-524-1 ER - TY - THES A1 - Doll, Julia T1 - Identifizierung und Charakterisierung neuer, mit Hörstörungen assoziierter Gene und Varianten mittels Exom-Sequenzierung T1 - Identification and characterization of novel hearing loss associated genes and variants by Exome Sequencing N2 - Laut des aktuellen Reports der Weltgesundheitsorganisation sind ca. 466 Millionen Menschen weltweit von einer Hörstörung (HS) betroffen. Durch die enorme Heterogenität und die klinische Variabilität, die diese Erkrankung ausmacht, und viele bisher nicht mit HS assoziierte Gene, bleibt ein großer Teil der erblich bedingten HS in vielen Familien unaufgeklärt. Die Entwicklung moderner Techniken, wie die Next-Generation Sequenzierung (NGS) und der Fortschritt bei der Untersuchung von Modellorganismen trugen jedoch in den letzten Jahren immens dazu bei, neue Gene zu identifizieren, die innerhalb des auditorischen Signalwegs oder damit assoziierten Strukturen beteiligt sind. Die vorliegende Arbeit umfasst Ergebnisse dreier Veröffentlichungen, in denen iranische und pakistanische Familien und eine deutsche Familie mit erblich bedingter HS untersucht und neue, krankheitsverursachende Varianten identifiziert und funktionell charakterisiert wurden. Im ersten Abschnitt konnten zwei neue rezessive Varianten im CDC14A-Gen als krankheitsverursachend identifiziert werden, die zu einem potentiellen Funktionsverlust des kodierten Proteins in einer iranischen und einer pakistanischen Familie führen. Mit Hilfe einer funktionellen Charakterisierung auf RNA-Ebene (Spleiß-Assay und RT-qPCR) konnte der Funktionsverlust beider Varianten bestätigt werden. Der zweite Abschnitt umfasst eine deutsche Familie mit sieben von einer HS betroffenen Familienmitgliedern, in der eine heterozygote missense Variante in MYO3A identifiziert wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte somit die erste autosomal dominante Variante in einer europäischen Familie mit einer bilingualen, sensorineuralen Hochtonschwerhörigkeit beschrieben werden und der dominante Charakter von MYO3A bestätigt werden. Im dritten Abschnitt konnten die krankheitsverursachenden Varianten in 13 Familien aus einer Kohorte mit 21 pakistanischen Familien mit einer syndromalen und nicht-syndromalen HS ausfindig gemacht werden. Hierbei wurden sowohl bekannte, als auch bisher nicht beschriebene Varianten detektiert. Die Aufklärungsrate innerhalb dieser Kohorte betrug 61,9% und es konnte somit das Spektrum syndromaler und nicht-syndromaler HS erweitert werden. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschreibt eine iranische Familie mit einer milden HS und milden Intelligenzminderung, in der eine homozygote missense Variante im Kandidatengen DBN1 ausfindig gemacht wurde. Um die Funktion und die Auswirkungen eines potentiellen Verlusts des codierten Proteins Drebrin zu untersuchen, wurden immunhistochemische Färbungen und auditorische Messungen an Dbn1 Knockout (KO)-Mäusen durchgeführt. Hierbei konnte eine Expression innerhalb der Nervenfasern, die innere Haarzellen innervieren, nachgewiesen werden. Eine leicht verlängerte Latenz für die ABR-Welle IV in KO-Mäusen im Vergleich zum Wildtyp ergab den Hinweis auf einen Defekt innerhalb des zentralen auditorischen Signalwegs, der möglicherweise mit einer Sprachverarbeitungsstörung im Menschen korreliert. N2 - According to the latest World Health Organization report, approximately 466 million people are affected by hearing loss (HL) worldwide. Due to the enormous heterogeneity and clinical variability that comes with this disorder and the previously unassociated HL genes, a large proportion of hereditary HL remains unexplained in many families. However, the development of modern techniques such as next-generation sequencing (NGS) and constant progress in the study of model organisms contributed immensely to the identification of new genes involved within the auditory pathway or associated structures. This thesis includes results of three publications in which Iranian and Pakistani families and a German family with HL were studied and novel disease-causing variants were identified and characterized. In the first section, two novel recessive variants in the CDC14A gene were identified as disease-causing, leading to a loss-of-function of the encoded protein in an Iranian and a Pakistani family. Functional characterization on RNA level (splice assay and RT-qPCR) confirmed the loss of function of both variants. The second section includes a German family with seven family members affected by HL, in which a heterozygous missense variant in MYO3A was identified. Thus, the first autosomal dominant variant in a European family with a bilingual sensorineural high-frequency hearing loss could be described in the current work. In the third section, the disease-causing variants were established in 13 families from a cohort of 21 Pakistani families with syndromic and non-syndromic HL. Both known and previously undescribed variants were detected. The detection rate within this cohort was 61.9% and thus the spectrum of syndromic and non-syndromic HL could be expanded. The final section of this work describes an Iranian family with mild HL and mild intellectual disability in which a homozygous missense variant in the candidate gene DBN1 was detected. To investigate the function and effects of a potential loss of the encoded protein Drebrin, immunohistochemical staining and auditory measurements were performed in Dbn1 knockout mice. Here, expression within nerve fibers innervating inner hair cells was detected. A slightly prolonged latency for ABR wave IV in the auditory pathway in KO mice compared to wild type mice provided evidence for a defect within the central auditory pathway that might correlate with a speech processing disorder in humans. KW - Hörstörung KW - Exomsequenzierung KW - Konsanguinität KW - Hörstörungen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-261097 ER - TY - THES A1 - Witzig, Raphael T1 - Identifikation und Charakterisierung von Progressionsfaktoren Follikulärer Non-Hodgkin Lymphome in einem Kollektiv des Verbundprojektes "Molekulare Mechanismen bei malignen Lymphomen (MMML)" T1 - Identification and characterization of progression factors in follicular Non-Hodgkin’s lymphomas in a collective of the project Molecular Mechanisms of Malignant Lymphomas N2 - Das follikuläre Lymphom (FL) wird nach der aktuellen Klassifikation der WHO (World Health Organization Classification of Lymphoid Tumours) anhand der Zahl der Zentroblasten in drei Grade und der Grad 3 weiter in 3A und 3B eingeteilt. Bis heute ist die Rolle der FL3B aufgrund der morphologischen und genetischen Unterschiede zu den anderen FL umstritten, es wird eine eigene Entität und Pathogenese des FL3B diskutiert. Durch das Verbundprojekt „Molekulare Mechanismen in malignen Lymphomen“ (MMML) Daten zu FISH-, Genexpressionsanalysen und immunhistochemischen Färbungen bearbeitet werden. Diesen Daten zufolge sind FL3B in ihrer Genexpression nicht von FL3A trennbar. Es konnte jedoch eine Abgrenzung der FL1/2 zu den FL3A/B durch die erhöhte Expression von 13 Genen in den FL3A/B gefunden werden, von denen Homolog, double strand break repair nuclease (MRE11A), Topoisomerase II alpha (TOP2A) und Thioredoxin (TXN) schon zuvor im Rahmen von FL und NHL diskutiert wurden. N2 - According to the WHO classification (World Health Organization Classification of Lymphoid Tumours) follicular lymphomas (FL) are classified into three grades of which FL3 is further categorized into FL3A and FL3B, according to their histology. Until now, the role of FL3B is debated, due to morphologic and genetic differences compared to other FL. The data of the project Molecular Mechanisms in Malignant Lymphomas (MMML) was used to compare FISH, gene expression, and immunohistochemistry between those grades. Comparing gene expression, FL3B is not distinguishable from FL3A. However, a distinction can be seen in a higher expression of 13 genes in FL3A/B compared to FL1/2. Of these genes, Homolog double strand break repair nuclease (MRE11A), Topoisomerase II alpha (TOP2A), and Thioredoxin (TXN) have been previously found to play a role in the etiology and treatment in Non-Hodgkin’s lymphomas. KW - Follikuläres Lymphom KW - FL KW - FL3B KW - follicular lymphoma Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174430 ER - TY - THES A1 - Deutschmann, Sally T1 - Prävalenz und Epidemiologie von Infektionen mit \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\) und deren Resistenzlage gegenüber Cephalosporinen der dritten Generation bei tansanischen Patientinnen und Patienten mit bestehender HIV-Infektion eines Referenzkrankenhauses im Nordwesten Tansanias T1 - Prevalence and epidemiology of \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\) infections and their resistance status to third-generation cephalosporins in Tanzanian patients with existing HIV infection at a reference hospital in northwestern Tanzania N2 - Die Prävalenz von Infektionen mit Neisseria gonorrhoeae (NG) bei HIV-positiven Patientinnen und Patienten einer auf HIV-Infektionen spezialisierten Klinik in Mwanza im Nordwesten Tansani- as erwies sich mit 0,4% bei Männern und 3,9% bei Frauen als relativ niedrig. In dieser aktuellen Studie gab es unter Verwendung molekularer Antibiotikaresistenz(AMR)-Tests keine Hinweise auf eine Resistenz gegen Cephalosporine der dritten Generation. Weitere Kontrollen und Entwicklungen von NG- und AMR-Tests müssen implementiert werden. Molekulare Diagnoseverfahren auf der Basis von Urinproben als diagnostisches Material zum Nachweis von NG weisen wesentliche Vorteile für das Screening auf. Die Durchführung eines Urinstreifentests hatte keinen positiven Vorhersagewert bezüglich einer Infektion mit NG oder einer AMR. Künftige Untersuchungen sind anzuregen, um einerseits eine exaktere Angabe der Prävalenzraten und Risikofaktoren von Infektionen mit NG sowie deren Resistenzlage zu ermöglichen und andererseits eine effizientere Versorgung bzw. Behandlung der Gonorrhoe gewährleisten zu können. N2 - The prevalence of Neisseria gonorrhoeae (NG) infections in HIV-positive patients at a clinic specializing in HIV infection in Mwanza, northwestern Tanzania, was found to be relatively low, 0.4% in men and 3.9% in women. In this current study, using molecular antibiotic resistance testing, there was no evidence of resistance to third-generation cephalosporins. Future studies should be encouraged, both to provide a more accurate indication of the prevalence rates and risk factors of infections with NG and their resistance status, and to ensure more effective treatment of gonorrhea. KW - HIV KW - Cephalosporine KW - Tripper KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Gonorrhoe KW - Tansania KW - Antimikrobielle Resistenz Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317735 ER - TY - THES A1 - Bergauer, Lisa T1 - Die Bedeutung des neurotrophen Faktors Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) für die Integrität der intestinalen Epithelbarriere T1 - The importance of Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) for the integrity of the intestinal epithelial barrier N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte des neurotrophen Faktors GDNF auf die Struktur und Funktion der intestinalen Epithelbarriere untersucht. Zellkulturen mit Caco2 beziehungsweise HT29B6 dienten als Modellsysteme für die Epithelschicht der Darmschleimhaut. Transwellsassays und TER-Messungen mittels ECIS-Gerät fungierten als zentrale Untersuchungsmethoden zur Evaluation der funktionellen Barriereeigenschaft der Zellmonolayer. Die morphologischen und quantitativen Veränderungen von Zelljunktionsproteinen wurden mittels indirekter Immunfluoreszenzfärbungen beziehungsweise Western Blot-Untersuchungen dargestellt. Um Migration- und Proliferationsverhalten nach Verletzung des Zellmonolayers zu untersuchen, führten wir in vitro-Scratch-Assays durch. Zunächst wurde bestätigt, dass intestinale Epithelzellen die GDNF-Rezeptoren GFRα1, GFRα2 und RET exprimieren. Es zeigte sich sowohl in Immunfärbungen gegen Junktionsproteine als auch in Permeabilitätsmessungen, dass GDNF zu einer verstärkten Differenzierung der intestinalen Epithelbarriere führt. In Inhibitions- und Aktivierungsexperimenten mit verschiedenen Mediatoren wurde als zugrunde liegender Mechanismus die Inaktiverung der p38 MAPK durch GDNF identifiziert. Weiterhin zeigten Versuche mit epithelialen Wundheilungsassays, dass GDNF, über eine cAMP/PKA-abhängige Induktion der Proliferation, zu einer Verbesserung der Wundheilung führt. In Immunfärbungen und Western Blot-Analysen wurde beobachtet, dass auch intestinale Epithelzelllinien in der Lage sind GDNF zu synthetisieren. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass der neurotrophe Faktor GDNF direkt auf die Differenzierung und Proliferation von kultivierten Enterozyten Einfluss nehmen kann. Die Tatsache, dass intestinale Epithelzellen selbst GDNF synthetisieren und sezernieren können, weist auf einen neuen autokrinen- oder parakrinen Wirkmechanismus des neurotrophen Faktors hin. N2 - Recent data suggest that neurotrophic factors that derive from the enteric nervous system are involved in intestinal epithelial barrier regulation. In this context the glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) was shown to affect gut barrier properties in vivo directly or indirectly by largely undefined processes in a model of inflammatory bowel disease (IBD). Here, we further investigated the potential role and mechanisms of GDNF in the regulation of intestinal epithelial barrier functions. In Western blot analyses of serum-starved intestinal epithelial cell lines Caco2 and HT29B6 significant amounts of GDNF were detected suggesting that enterocytes may represent an additional source of GDNF secretion. Application of recombinant GDNF on Caco2 monolayers for 24h resulted in significant epithelial barrier stabilisation in Caco2 and HT29B6 monolayers with immature barrier functions. Wound healing assays in cell monolayers showed a significantly faster closure of the wounded areas after GDNF application. GDNF augmented cAMP levels and led to significant inactivation of p38MAPK in immature epithelial cells. While inactivation of p38MAPK signalling by SB202190 mimicked GDNF-induced barrier maturation, coincubation of GDNF with p38MAPK activator anisomycin blocked GDNF effects. Increasing cAMP levels by forskolin and rolipram had adverse effects on barrier maturation as revealed by permeability measurements. However, increased cAMP augmented the proliferation rate in Caco2 cells and GDNF-induced proliferation of epithelial cells was abrogated by PKA-inhibitor H89. In summary, our data show that enterocytes represent an additional source of GDNF synthesis. GDNF contributes to wound healing in a cAMP/PKA-dependent manner and promotes barrier maturation in immature enterocytes cells by inactivation of p38MAPK signalling. KW - Epithel KW - Epithelgewebe KW - epithelial KW - Darmchirurgie KW - GDNF KW - Intestinale Epithelbarriere KW - Glia KW - Stabilität Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155259 ER -