TY - THES A1 - Schilling, Klaus Jussi T1 - Liquid chromatographic analysis of weakly- and non-chromophore compounds focusing on Charged Aerosol Detection T1 - Flüssigchromatographische Analyse von schwach- und nicht-chromophoren Substanzen mit Schwerpunkt auf Charged Aerosol Detektion N2 - Liquid chromatography has become the gold standard for modern quality control and purity analytics since its establishment in the 1930s. However, some analytical questions remain very challenging even today. Several molecules and impurities do not possess a suitable chromophore for the application of UV detection or cannot be retained well on regular RP columns. Possible solutions are found in derivatization procedures, but they are time consuming and can be prone to errors. In order to detect non chromophore molecules underivatized, the concept of aerosol based universal detection was established with the introduction of the evaporative light scattering detector (ELSD) in the 1970s and the charged aerosol detector (CAD) followed in 2002. These two challenging fields – polar and non chromophore molecules – are tackled in this thesis. An overview of applications of the CAD in the literature and a comparison to its aerosol based competitors and MS is presented, emphasizing on its high sensitivity and robustness. Parameters and techniques to overcome the drawbacks of CAD, such as the use of gradient compensation or adjusted evaporation temperatures are discussed. A consideration of aspects and drawbacks of data transformation such as the integrated power function value (PFV) in the GMP environment is performed. A method for the fatty acid analysis in polysorbate 80 that was developed on HPLC CAD was transferred to UHPLC CAD. Time and eluent savings of over 75% and 40%, respectively, as well as ways to determine the optimal CAD parameters resulted from this investigation. The evaporation temperature was determined as the most crucial setting, which has to be adjusted with care. Optimal signal to noise ratios are found at a compromise between maintaining analyte signal and reducing background noise. The incorporation of semi volatile short chain fatty acids enabled the observation of differences based on volatility of the analyte. E.g. for semi volatiles, an improved linearity by means of adjusting the PFV is achieved at values below 1.0 instead of at elevated PFVs. Using sugars and sugar related antibiotics, a proof-of-concept was given that artificial neural networks can describe correlations between the structure and physicochemical properties of molecules and their response in CAD. Quantitative structure property relationships obtained by design of experiment approaches were able to predict the response of unseen substances and yielded insights on the response generation of the detector, which heavily relies on the formed surface area of the dried particle. Further work can substantiate upon these findings, eventually building a library of diverse eluent compositions, analytes and settings. In order to cope with a chromatographically challenging substances, the application of ion pairing reversed phase chromatography coupled to low wavelength UV detection has been shown as a possible approach for the amino acid L asparagine. A method capable of compendial purity analysis in one single HPLC approach, thus making the utilization of the semi quantitative TLC-ninhydrin analysis obsolete, resulted from this. One cyclic dipeptide impurity (diketoasparagine) that was formerly not assessed, could be identified in several batches and added to the monograph of the Ph.Eur. Studying ibandronate sodium with CAD and ELSD, it was found that randomly occurring spike peaks represent a major flaw of the ELSD when high sample load is present. The research with this non chromophore bisphosphonate drug furthermore shed light on possible drawbacks of mixed mode chromatography methods and ways to overcome these issues. Due to strong adsorption of the analyte onto the column, over ten injections of the highly concentrated test solution were found to be necessary to ensure reproducible peak areas. Preconditioning steps should thus be evaluated for mixed mode approaches during method development and validation. Last, using a ternary mixed mode stationary phase coupled to CAD, a method for the impurity profiling of pamidronate disodium, also applicable to the assessment of phosphate and phosphite in four other bisphosphonate drugs, has been developed. This represents a major advantage over the Ph.Eur. impurity profiling of pamidronate, which requires two different methods, one of which is only a semi quantitative TLC approach. N2 - Flüssigchromatographische Untersuchungen sind seit deren Einführung in den 1930er Jahren zum Goldstandard für die moderne Qualitätskontrolle und Reinheitsanalytik geworden. Allerdings sind auch noch heutzutage einige Fragestellungen sehr herausfordernd. Viele Moleküle und Verunreinigungen besitzen keinen geeigneten Chromophor, das die Anwendung klassischer UV Detektion ermöglicht, oder erfahren auf gewöhnlichen Umkehrphasen keine ausreichende Retention. Lösungsansätze in Form von Derivatisierungsverfahren sind zeitaufwändig und fehleranfällig. Um underivatisierte Moleküle ohne geeignetes Chromophor zu analysieren, wurde das Prinzip der auf Aerosolen basierenden universellen Detektion mit dem „Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)“ in den 1970er Jahren entwickelt und 2002 folgte der „Charged Aerosol Detector (CAD)“. Diese zwei Felder - polare und nicht chromophore Analyte - werden in der vorliegenden Dissertation bearbeitet. Eine Literaturübersicht und analyse von Applikationen des CAD, sowie ein Vergleich zu seinen auf Aerosoltechnik basierenden Konkurrenten und der Massenspektroskopie wird dargestellt; besonders die hohe Sensitivität und Robustheit werden ersichtlich. Geräteeinstellungen und Techniken, mit denen sich Nachteile des CAD ausgleichen lassen, werden erläutert und diskutiert. Hierbei werden beispielsweise die Gradientenkompensation oder die Veränderung der Verdampfungstemperatur diskutiert. Ein Überblick über Möglichkeiten und Nachteile der Datentransformation des CAD Signals mittels des eingebauten „Power Function Values (PFV)“ im GMP Umfeld wird gegeben. Ein Methodentransfer der Analytik von Fettsäuren in Polysorbat 80 von HPLC CAD zu UHPLC CAD wurde durchgeführt. Chemikalien und Zeitersparnisse jenseits von 40 bzw. 75%, sowie Herangehensweisen für die Optimierung der CAD Einstellungen resultierten hieraus. Die Verdampfungstemperatur ist der wichtigste Parameter des Detektors und sollte stets feinjustiert werden. Die höchste Sensitivität findet sich für einen Kompromiss aus verringertem Rauschen und auch erhaltenem Analytsignal. Durch die Analyse von semi flüchtigen Fettsäuren konnten Unterschiede, die auf der Flüchtigkeit von Substanzen basieren, erarbeitet werden. Für semi flüchtige Stoffe ist die Linearisierung mittels PFV bespielsweise bei Werten unter 1.0 erfolgreich, wohingegen für nicht flüchtige Analyte Werte jenseits von 1.0 optimal sind. Für Zucker und zuckerverwandte Antibiotika konnte ein konzeptioneller Beweis erbracht werden, dass künstliche neuronale Netzwerke Korrelationen zwischen den physikochemischen Eigenschaften der Moleküle und deren Signal im CAD herstellen können. Ein solches Netzwerk wurde mittels Methoden des experimentellen Designs erstellt. Die CAD Detektorantwort, die stark von der Oberfläche der Partikel abhängt, konnte auf diese Weise für Substanzen innerhalb des Experimentalraumes vorhergesagt werden. Hierauf aufbauend kann eine Bibliothek aus Analyten, Fließmitteln und Detektorparametern erarbeitet werden, um weiteres Detailwissen über den CAD zu erhalten. Die Aminosäure L Asparagin stellt eine chromatographische Herausforderung dar. Es wurde eine Ionenpaar Umkehrphasen Methode mit UV Detektion bei 210 nm als erfolgreicher Ansatz gezeigt. Die arzneibuchkonforme Bestimmung des Verunreinigungsprofils ist mit dieser Methode in einem Lauf möglich, wodurch die Nutzung der halbquantitativen Dünnschichtchromatographie obsolet wird. Weiterhin konnte ein cyclisches Dipeptid (Diketoasparagin), welches zuvor nicht im Verunreinigungsprofil gelistet war, in einigen Batches gefunden und so der Monographie des Ph.Eur. hinzugefügt werden. Bei der Untersuchung von Natrium-Ibandronat mit dem CAD und dem ELSD konnte gezeigt werden, dass zufällig auftretende „spike peaks“ bei hohen Probenkonzentrationen ein enormes analytisches Problem des ELSD darstellen. Weiterhin wurde mit der Analyse der nicht chromophoren Bisphosphonaten ein Problem von „mixed mode“ Chromatographie aufgedeckt. Durch die starke Adsorption des Analyten auf der Säule waren über zehn Injektionen der konzentrierten Testlösung notwendig, um reproduzierbare Peakflächen zu erhalten. Derartige Sättigungs- und Vorkonditionierungsprozesse sollten für „mixed mode“ Chromatographie während der Entwicklung und Validierung untersucht werden. Zuletzt wurde eine ternäre „mixed mode“ stationäre Phase gekoppelt mit CAD verwendet, um das Verunreinigungsprofil von Pamidronat Dinatrium zu analysieren. Diese entwickelte Methode konnte auch für die Bestimmung von Phosphat und Phosphit in vier anderen Bisphosphonaten genutzt werden. Erneut ergibt sich ein Vorteil gegenüber der Arzneibuchmethode für Pamidronat, welche zwei verschiedene Methoden - eine davon nur eine halbquantitative Dünnschichtchromatographie - nutzt. KW - HPLC KW - Flüssigkeitschromatographie KW - Instrumentelle Analytik KW - Chemische Reinheit KW - Charged Aerosol Detection KW - mixed-mode chromatography KW - ion-pair chromatography KW - non-chromophore analytes Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202114 ER - TY - THES A1 - Reggane, Maude T1 - Lowering lattice forces of crystalline bases T1 - Erniedrigung der Gitterenergie von kristallinen basischen Wirkstoffen N2 - The number of active pharmaceutical ingredients (APIs) exhibiting a low solubility in aqueous media or a slow dissolution rate kept rising over the past years urging formulation scientists to explore new ways to tackle poor solubility and to enable oral absorption from such compounds. Bioavailability of poorly water-soluble compounds can be improved by increasing the dissolution rate and/or by increasing the gastro intestinal concentration through transient supersaturation. The dissolution rate of the API can be typically modified by the choice of the physical form, the polymorphic form, the powder surface area, and the local pH, while a transient supersaturation can be extended mainly by nucleation or crystallization inhibiting effects. In the present thesis, three strategies were explored to tailor the dissolution rate, the supersaturation and the hydrotropic solubilization of APIs, weak bases, respectively. The first part of this thesis followed a bioinspired approach to extend the kinetic solubility of salts and co-crystals. API salts and co-crystals are high energy forms that can generate supersaturated solutions with respect to any more stable form, typically the most stable API form in physiological environment. The transient kinetic stabilization of supersaturated states, also termed “parachute effect”, is considered to improve bioavailability and is one aspect of the formulation that can be tailored. Inspiration from plants, which store high concentrations of aromatic bases in their vacuoles via complexation with polyphenols, sparked the evaluation to use hydroxybenzoic acid derivatives for salt or co-crystal engineering. Imatinib was chosen as the model compound for this investigation as its aromaticity and flat molecular architecture could favor interactions with hydroxybenzoic acid derivatives. One 1:1 Imatinib syringate co-crystal (I-SYA (1:1)) and one 1:2 Imatinib syringate co-crystal salt (I-SYA (1:2)) were obtained. Their dissolution assays in simulated intestinal fluid (SIF; a 50 mM phosphate buffer of pH 6.8) revealed that they formed stable solutions for several hours and days, respectively, in contrast to the marketed Imatinib mesylate salt (approx. 1h). This kinetic stability in solution was linked to the nucleation inhibition of the less soluble Imatinib hydrate by syringic acid (SYA). In solution 1H-NMR studies evidenced the aggregation of Imatinib and SYA. The amphiphilic nature of both Imatinib and SYA is considered to drive their association in solution, additionally, multiple intermolecular interactions such as hydrogen bonds and π-π stacking are likely to contribute. The association in solution enabled a phase of extended supersaturation, i.e., a parachute against desupersaturation, while no negative impact of aggregation on the permeability of both Imatinib and SYA was observed. A prerequisite to reach supersaturation is a rapid dissolution and release of the API from the formulation. Accordingly, the second and third part of this thesis is focused on the so-called “spring effect” of amorphous solid dispersions (ASDs). The addition of a hydrotropic agent, meaning a molecule that can solubilize poorly water-soluble APIs in aqueous solutions (well-known examples of hydrotropes are benzoic acid and nicotinamide) into an amorphous Ciprofloxacin-polymer matrix led to ternary systems with a significantly faster release and higher concentration of the API in SIF as compared to binary ASDs consisting of Ciprofloxacin (CPX) and polymer only. The stronger spring could be rationalized by an improved wetting of the ASD, or/and by a hydrotropic solubilization effect, although these hypotheses need further investigation. Marked differences in the dissolution profiles of binary ASDs were observed in biorelevant fasted simulated intestinal fluid (FaSSIF; a medium containing Na taurocholate (3 mM) and lecithin (0.75 mM) at pH 6.5) as compared to SIF. In FaSSIF, API release from binary polymeric ASDs was largely improved, and the duration of supersaturation was extended. This suggests that the bile salt Na taurocholate and lecithin present in FaSSIF do improve both dissolution rate and supersaturation of ASDs, the two pillars of ASDs as oral enabling formulations. Indeed, bile salts are endogenous surfactants which, together with phospholipids, play an important role in the wetting, solubilization, and absorption of lipophilic compounds. The aim of the third part of the present thesis was to study ASDs as formulation principles reducing the strong positive food effect of Compound A. By inclusion of Na taurocholate (NaTC) within the matrix of polymeric ASDs a significant improvement of the dissolution rate and the kinetic solubility in SIF were achieved. Transient supersaturated states of up to four orders of magnitude over the equilibrium solubility were obtained. Two ASDs were selected for further in vivo evaluation in dog. The first was a NaTC/Eudragit E based ASD meant to dissolve and release Compound A in the acidic environment of the stomach, where its solubility is the highest. The second relied on the release of Compound A in the neutral environment of the duodenum and jejunum by using an enterically dissolving polymer, HPMC-P. Releasing the API at the site of its putative absorption was an attempt to control supersaturation levels in the duodenum and to prevent portioning and thus dilution effects during transfer from the stomach. In fasted dogs, exposure from the NaTC/HPMC-P ASD was close to that of the reference Compound A formulation under fed conditions, which suggests an improved dissolution rate and kinetic solubility under fasted conditions (historical data). The exposure from the NaTC/Eudragit E ASD was twice as low as from the NaTC/HPMC-P ASD, and also lower compared to Compound A reference formulation, whereas in vitro the parachute effect of the NaTC/Eudragit E ASD was largely superior to that of the NaTC/HPMC-P ASD. A difference in the extend of the parachute could be related to differences in the thermodynamic activity of dissolved molecules from the two ASDs. Indeed, the high instability of the NaTC/HPMC-P ASD could stem from a high thermodynamic activity driving diffusion through membranes, whereas less instable solutions of NaTC/Eudragit E could indicate solubilization effects which often translate into a lower flux through the biological membrane. Additionally, the pH of the environment where dissolution takes place might be an important factor for absorption, and could also account for the difference in exposure from the two ASDs. The aim of this thesis was to explore how the intimate environment of weak, poorly soluble bases could be functionalized to improve dissolution rate and kinetic solubility. The investigations highlighted that the performance of enabling oral delivery formulations of weak bases in aqueous media can be enhanced at different levels. At one end initial dissolution rate of ASDs can be tailored by introducing hydrotropes or/and bile salts within the polymeric matrix of ASDs. Bile salts, when combined with appropriate polymers, had also a precipitation inhibition effect enabling the maintenance of supersaturation for a bio-relevant period of time. These results set the ground for further investigations to comprehend specific interactions between bile salts and APIs, and potentially polymers at the molecular level. It will be interesting to explore how such complex systems can be exploited in the formulation design of poorly water-soluble APIs. In addition, it was observed that the duration of supersaturation generated by salts/co-crystals can be extended by the pertinent selection of counterions or coformers. The in vivo relevance of these tunings remains to be evaluated, as translation from closed, in vitro systems to the highly dynamic gastrointestinal environment is not straightforward. A better understanding of the contribution of each kinetic stage (dissolution, supersaturation, and precipitation) and their interplay with physiological factors impacting absorption is essential to facilitate the design of formulations with improved pharmacokinetics. N2 - Die Anzahl chemischer Wirkstoffe, welche sich schlecht oder langsam auflösen, hat in den vergangenen Jahren stetig zugenommen. Aus diesem Grunde müssen Entwickler neuer Formulierungen Wege finden, um die Löslichkeit und damit die Absorbtion dieser Wirkstoffe zu verbessern. Grundsätzlich kann die Bioverfügbarkeit schlecht wasserlöslicher Wirkstoffe verbessert werden, wenn die Auflöserate verbessert wird und/oder durch höhere Konzentrationen der Wirkstoffe am Resorptionsort, beispielsweise durch kontrollierte Übersättigungen. Die Auflösungsrate eines Wirkstoffes kann durch die Wahl der physikalischen Form (Salz und Polymorph), Modifikation der spezifischen Oberfläche (Mahlen) und lokalem pH Wert (Ionisierungszustand) maßgeblich beeinflusst werden. Im Falle von kontrollierten Übersättigungen, kann die Verlängerung der Dauer der Übersättigung durch die Unterdrückung der Bildung von Kristallisationskeimen erreicht werden. In der vorliegenden Promotionsarbeit wurden neue Strategien entlang dieser Herausforderungen für schwach basische Wirkstoffe untersucht und entwickelt. Im ersten Teil der Arbeit wurden biomimetische Strategien angewandt, um die physikalischen und biopharmazeutischen Eigenschaften basischer Wirkstoffe zu verbessern. Dieses erfolgte mit der Absicht, durch strukturelles Design von Salzen oder Co-Kristallen das Ausfallen des Wirkstoffes aus Lösungen hinauszögern und eine Aufklärung der zugrundeliegenden Mechanismen vorzunehmen. Dabei konnten mit ausgesuchten Wirkstoff-Salzen oder Co-Kristallen Lösungen erzeugt werden, welche zu Übersättigungen führten. Diese thermodynamisch instabilen allerdings (vorübergehend) kinetisch gehemmt vorliegenden Zustände sind mit dem Begriff „Fallschirm Effekt“ in der Literatur verknüpft, womit die Verlängerung der Übersättigungen durch geeignete Salz-/Cokristallbildung metaphorisch umschrieben ist. Diese kinetisch gehemmten und somit langanhaltend vorliegenden Übersättigungen sind entscheidend für die Verbesserung der Bioverfügbarkeit. Pflanzen nutzen diese Effekte ebenfalls aus. So können Pflanzen aromatische und schlecht wasserlösliche Basen in übersättigten Lösungen kinetisch „stabilisieren“, in dem diese an Polyphenol-Komplexe in den Vacuolen ihrer Zellen komplexiert vorliegen. Hier wurden diese bei Pflanzen beobachteten Effekte für Hydroxybenzoesäure-Derivate übernommen untersucht und zur pharmazeutischen Verbesserung des Wirkstoffes Imatinib angewandt. Das aromatische Imatinib hat eine flache molekulare Struktur, die mit Hydroxybenzoesäure-Derivaten interagieren sollte. Es wurde ein 1:1 Imatinib-Syringat Co-Kristall (I-SYA (1:1)) sowie ein 1:2 Imatinib-Syringat Co-Kristall Salz (I-SYA (1:2)) hergestellt. Mittels dieser Salze konnten beeindruckende kinetisch „stabilisierte“ und übersättigte Lösungen des Imatinib realisiert werden, die beispielsweise in künstlicher Darmflüssigkeit (SIF) über Stunden beziehungsweise Tage vorlagen. Dieses steht im Gegensatz zum handelsüblichen Imatinib-Mesylat (Dauer der Übersättigung ca. 1 Stunde). Die kinetische „Stabilisierung“ der Lösung wurde mechanistisch mittels 1H-NMR Studien auf eine Unterdrückung/Verzögerung der Kristallkeimbildung des weniger löslichen Imatinib Hydrates durch Anwesenheit der Polyphenolsäure (Syringasäure) zurückgeführt. In-vitro Transportstudien durch biologische Barrieren zeigten, dass die Syringasäure die Permeabilität des Imatinib nicht nachteilig beeinflusste. Während in diesem Kapitel die Verlängerung von Übersättigungszuständen das Ziel war (Fallschirm Effekt; „parachute“), ist die Optimierung des Ausmaßes der Übersättigung das Ziel der folgenden Kapitel, welches in der Literatur als „Feder-Effekt“ („spring“) bekannt geworden ist. Eine Voraussetzung zum Erreichen von Übersättigung ist die rasche Auflösung und Freisetzung des Wirkstoffes aus der Formulierung. Diesen „Feder-Effekt“ wurde hier in amorphen Feststoffdispersionen (ASDs) erreicht. Zielführend war die Anwendung hydrotroper Moleküle, welche in wässerigen Lösungen lösungsvermittelnd auf schlecht wasserlösliche Substanzen wirken. Diese Formulierungen führten bei amorphen Wirkstoff-Polymer Gemischen zu ternären Systemen mit deutlich schnellerer Wirkstofffreisetzung und es konnten deutlich höhere Konzentration an gelöstem Wirkstoff in simulierten gastrointestinalen Flüssigkeiten erreicht werden, als dieses im Vergleich zu binären ASDs der Fall war, die lediglich aus Wirkstoff und Polymer zusammengesetzt waren. Im Übrigen konnte gezeigt werden, dass sich die Auflösungsprofile der ASDs in verschiedenen Medien unterschieden. Durch diesen Vergleich in unterschiedlichen Medien konnte die Bedeutung des Taurocholats und des Lezithins (beide Moleküle sind Bestandteil der Gallenflüssigkeit) für die Verbesserung der Auflösungsrate von ASDs gezeigt werden. Gallensalze können in diesem Sinne als „endogene Tenside“ verstanden werden, die zusammen mit Phospholipiden eine wichtige Rolle in der Lösungsvermittlung und Absorption von lipophilen Substanzen haben. Während im vorhergehenden Teil die Bedeutung von Gallensalzen für Auflösungsphänomene aus ASDs im Zentrum des Interesses lag, wurde nun eine andere Herausforderung pharmazeutischer Entwicklungen adressiert, der sogenannte „Food effect“. Dieser Effekt meint die nahrungsbedingte Änderung der Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen. In diesen Arbeiten führte der Zusatz von Natriumtaurocholat in eine ASD Matrix zu einer Verbesserung der Auflösungsrate und der kinetischen Löslichkeit in simulierten intestinalen Flüssigkeiten mit der bemerkenswerten Verbesserung der kinetischen Löslichkeit um bis zu vier log Einheiten im Vergleich zur thermodynamischen Löslichkeit. Zwei ASD Formulierungen wurden für eine Studie am Hund ausgewählt, die eine bestehend aus Natriumtaurocholat/Eudragit E (Eudragit E löst sich in der sauren Umgebung des Magens auf) und die andere aus Natriumtaurocholat/HPMC-P (HPMC-P setzt Wirkstoffe in der pH-neutraler Umgebung des Dünndarms frei). Unerwartet waren die resultierenden Wirkstoff-Blutspiegel. Die Blutspiegel nach Verabreichung der NaTC/Eudragit E ASD waren nur etwa halb so hoch als jene von NaTC/HPMC-P, was im Gegensatz zu den in-vitro Konzentrationsprofilen steht. Eine mögliche Erklärung ist, dass instabile Lösungen, wie sie für die Natriumtaurocholat/HPMC-P ASD in vitro beobachtet wurden, die Diffusion durch die biologische Membran antreiben, wogegen dieser Effekt umso geringer ausfällt, je stabiler die erzeugte Lösung ist, wie das im Falle der Natriumtaurocholat/Eudragit E ASD in vitro der Fall war. Ein anderer Faktor, der in diesem Zusammenhang zu diskutieren ist, ist der unterschiedliche pH–Wert am Ort, an dem beide ASD den Wirkstoff freisetzen. Übergreifendes Ziel der Promotionsarbeit war die Optimierung der unmittelbaren Umgebung von schwachen, schlecht löslichen Basen, um die Auflösungsgeschwindigkeit und kinetische Löslichkeit der Wirkstoffe zu verbessern. Einerseits lässt sich die Auflösungsrate durch den Zusatz von hydrotropen Substanzen und/oder Gallensalzen zur Polymermatrix von ASDs steigern. Die Kombination von Gallensalzen mit geeigneten Polymeren konnte effektiv das Ausfallen des Wirkstoffes begrenzen und die Dauer von Übersättigungen deutlich verbessern. Diese interessanten Kombinationen sollten für andere Polymere zukünftig untersucht werden, so dass die spezifischen Wechselwirkungen zwischen Gallensalzen und Wirkstoff, gegebenenfalls auch mit Polymeren, auf molekularer Ebene besser verstanden werden können. In einem Teil der Promotionsarbeit wurde auch gezeigt, dass die Dauer der Übersättigung durch eine gezielte Auswahl von Gegenionen oder von Co-Kristallbildnern verlängert werden kann. Die in vivo Relevanz dieser Ansätze, sind vor dem Hintergrund der sehr dynamischen Verhältnisse im Magen-Darm-Trakt zu bewerten. Darüber hinaus ist ein besseres Verständnis des Zusammenspiels der kinetischen Phasen der Freisetzung (Auflösung, Übersättigung und Ausfällung) mit physiologischen Einflussgrößen zu erarbeiten, um zuverlässig Darreichungsformen mit besseren pharmazeutischen Eigenschaften zu entwickeln. KW - Kokristallisation KW - Bioverfügbarkeit KW - Löslichkeit KW - Gallensalze KW - Arzneimittel KW - amorphous solid dispersion KW - cocrystal KW - Imatinib KW - lattice forces KW - solubility KW - bioavailability KW - permeability Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163803 ER - TY - THES A1 - Schüßler [geb. Hecht], Nina Kristin Petra T1 - Novel formulation principles for bioavailability enhancement of poorly water-soluble and poorly permeable drugs T1 - Neue Formulierungen zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit von schlecht wasserlöslichen und schlecht permeablen Arzneistoffen N2 - Since four decades, high-throughput screenings have been conducted in drug discovery, fuelling the identification of potential new drug candidates. This approach, however, often promotes the detection of compounds with undesired physico-chemical properties like poor aqueous solubility or low membrane permeability. Indeed, dissolution and absorption of a drug are prerequisites for systemic exposure and therapeutic effects. Therefore, innovative strategies to optimize unfavourable performance of new drug candidates are in great demand in order to increase drug concentrations at the site of action whilst simultaneously reducing drug variability. In chapter I of this research work, hydrophobic ion pairing (HIP) is discussed as a promising strategy to improve the bioavailability of BCS class III compounds, which have high aqueous solubility and low permeability. The review points out the limitations of poorly absorbable drugs and details the approach of pairing these APIs with hydrophobic counterions. Apart from the motivation to tailor physico-chemical, biopharmaceutical and toxicological properties of BCS class III compounds, the hydrophobic ion pairing facilitates their formulation into drug delivery systems. Besides advantageous effects, disadvantages of the ion pair formation, such as the decreased aqueous solubility of the ions pair, are critically outlined. Finally, the review covers an overview of non-invasive administration routes permitted after ion pair formation, including oral/enteral, buccal, nasal, ocular and transdermal drug administration. Overall, the HIP approach offers substantial benefits regarding the bioavailability enhancement of BCS class III compounds. Chapter II concerns GHQ168 developed by Holzgrabe et al., a BCS class II compound characterized by low aqueous solubility and high permeability. GHQ168 was developed for the treatment of human African trypanosomiasis (HAT), a tropical disease for which novel active compounds are urgently needed. This lead compound was found to be very active against trypanosoma brucei brucei and trypanosoma brucei rhodesiense in cell culture assays, however, the low aqueous solubility prevented further preclinical development. To target this drawback, two different approaches were selected, including (I) the chemical modification and (II) the spray drying of GHQ168. The newly synthesized set of derivatives as well as the spray dried GHQ168 were subjected to a physico-chemical and microbiological characterization. It turned out that both approaches successfully improved aqueous solubility, however, for the derivatives of GHQ168 at the expense of activity. Furthermore, the pharmacokinetic parameters of GHQ168 and of the most active derivatives, GHQ242 and GHQ243, were evaluated. Elimination half-lives between 1.5 to 3.5 h after intraperitoneal administration and modest to strong serum albumin binding for GHQ243 (45%) and GHQ168 (80%) and very high binding (> 99%) for GHQ242 were detected. The spray dried formulation of GHQ168, as well as GHQ242 and GHQ243 were investigated in two in vivo studies in mice infected with t. b. rhodesiense (STIB900), referred to as (I) stringent model and (II) early-treatment model. In the stringent model (2 applications/day on day 3-6 after infection) the mean survival duration (MSD) of mice treated with spray dried GHQ168 exceeded the MSD of the untreated control group (17 days versus 9 days), a difference that was statistically significant. In contrast, no statistical difference was observed for GHQ242 (14 days) and GHQ243 (12 days). GHQ168 was further assessed in the early-treatment model (2 applications/day on day 1-4 after infection) and again a statistically significant improvement of MSD (32 days (end of observation period) versus 7 days) was observed. Finally, exciting antitrypanosomal efficacy for the spray dried formulation of GHQ168 was demonstrated. NADPH oxidases (NOX) were found to be the main source of endothelial reactive oxygen species (ROS) formation. Chapter III reports on the formulation studies on triazolopyrimidine derivatives from the VAS library, a set of NADPH oxidase inhibitors. These were developed for the treatment of elevated ROS levels, which contribute to the development of cardiovascular diseases. Although in vitro results from numerous studies indicated promising efficacy and selectivity for the VAS-compounds, the low water solubility impeded the in vivo translation and further preclinical development. For this reason, three derivatives, VAS2870, VAS3947, and VAS4024 were physico-chemically characterized and VAS3947, the most soluble compound, was selected for further formulation studies. These approaches included (I) spray drying, (II) microemulsification and (III) complexation with cyclodextrins in order to develop formulations for oral and parenteral application. Solubility improvement of VAS3947 was successfully demonstrated for all preparations as expressed by supersaturation ratios in comparison to the solubility of the unformulated compound. For seven spray dried formulations, the ratio ranged from 3-9, and the ratio for four microemulsions was 8-19 after 120 min, respectively. The six cyclodextrin formulations achieved the highest supersaturation ratio between 3 and 174 after 20 hours. NMR measurements elucidated the inclusion of VAS3947 within the CD’s cavity as well as the interaction with its outer surface. Ultimately, NOX inhibitors were opened for oral and parenteral administration for the first time. After successful solubility improvement of VAS3947, further investigations towards in vivo studies were conducted including stability studies with a focus on stability in solution and in plasma as presented in chapter IV. Furthermore, permeability and cytotoxicity assays were performed for the first time. It turned out that VAS3947 was instable in buffer and when exposed to light. Moreover, the compound showed decomposition in the presence of mouse microsomes and in human plasma. The VAS compounds contain an oxazol moiety linked to the triazolopyrimidine skeleton via a thioether. This structural element is responsible for the efficacy of the compound class, however it is susceptible to hydrolysis and to further degradation reactions. Moreover, VAS3947 harmed membrane integrity in the cell permeability assays and cytotoxicity investigations in HEK-293 and HEP-G2 cells revealed IC50 values in the same concentration range as reported for efficacy assays. Summarized, it was demonstrated that substances from the VAS library were no appropriate model compounds for ROS investigations nor suitable candidates for further preclinical development. N2 - Seit vier Jahrzehnten werden Hochdurchsatz-Screenings in der Arzneimittelforschung durchgeführt, was die Erkennung von potentiellen Wirkstoffkandidaten vorantreibt. Diese Vorgehensweise begünstigt jedoch häufig die Identifizierung von Substanzen mit unerwünschten physikochemischen Eigenschaften wie geringer Wasserlöslichkeit oder geringer Membranpermeabilität. Der Bioverfügbarkeitstheorie zufolge sind die Auflösung und die Absorption eines Arzneistoffs Voraussetzung für die systemische Verfügbarkeit und die therapeutische Wirkung. Daher werden innovative Strategien, die die ungünstigen Eigenschaften neuer Wirkstoffkandidaten optimieren, dringend benötigt, um die Arzneistoffkonzentration am Wirkort zu erhöhen und gleichzeitig Wirkstoffschwankungen zu reduzieren. In Kapitel I dieser Forschungsarbeit wird die hydrophobe Ionenpaarbildung als vielversprechende Strategie diskutiert, um die Bioverfügbarkeit von BCS Klasse III Substanzen zu verbessern, die sich durch hohe Wasserlöslichkeit und geringe Permeabilität auszeichnen. Der Review zeigt die Grenzen von schlecht absorbierbaren Arzneistoffen auf und stellt den Ansatz vor, diese mit hydrophoben Gegenionen zu kombinieren. Abgesehen von der Motivation, die physikochemischen, biopharma-zeutischen und toxikologischen Eigenschaften von BCS Klasse III Substanzen positiv zu beeinflussen, wird die Formulierung der hydrophoben Ionenpaare in Trägersysteme erleichtert. Neben den Vorteilen werden auch die Nachteile der hydrophoben Ionenpaarbildung, wie beispielsweise die geringere Wasserlöslichkeit der Ionenpaare, kritisch dargestellt. Abschließend gibt der Review eine Übersicht über die verschiedenen nicht-invasiven Applikationsrouten, die nach hydrophober Ionenpaarbildung realisierbar sind, was die orale/enterale, bukkale, nasale, okulare und transdermale Arzneistoffgabe umfasst. Insgesamt bietet dieser Formulierungsansatz wesentliche Vorteile im Hinblick auf die Verbesserung der Bioverfügbarkeit von BCS Klasse III Substanzen. Kapitel II befasst sich mit GHQ168, entwickelt von Holzgrabe et al., einer BCS Klasse II Substanz mit geringer Wasserlöslichkeit und hoher Permeabilität. GHQ168 wurde zur Behandlung der afrikanischen Schlafkrankheit entwickelt, einer tropischen Erkrankung, für die neue Arzneistoffe dringend benötigt werden. Diese Leitsubstanz bewies in Zellkulturversuchen sehr hohe Aktivität gegen Trypanosoma brucei brucei und Trypanosoma brucei rhodesiense, die geringe Wasserlöslichkeit verhinderte jedoch die weitere präklinische Entwicklung. Um diese Herausforderung anzugehen, wurden zwei verschiedene Ansätze gewählt, zum einen (I) die chemische Modifikation und zum anderen (II) die Sprühtrocknung von GHQ168. Die neu synthetisierten Derivate und das sprühgetrocknete GHQ168 wurden physikochemisch und mikrobiologisch charakterisiert. Beide Ansätze verbesserten erfolgreich die Wasserlöslichkeit, im Fall der Derivate von GHQ168 jedoch zu Lasten der Aktivität. Weiterhin wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften von GHQ168 und den aktivsten Derivaten, GHQ242 und GHQ243, untersucht. Nach intraperitonealer Applikation resultierten Halbwertszeiten zwischen 1.5 und 3.5 Stunden und eine mittlere bis hohe Plasmaproteinbindung für GHQ243 (45%) und GHQ168 (80%) und eine sehr hohe Plasmaproteinbindung für GHQ242 (> 99%). Die sprühgetrocknete Formulierung von GHQ168 sowie GHQ242 und GHQ243 wurden in zwei in vivo Studien in Mäusen, die mit t. b. rhodesiense (STIB900) infiziert waren, untersucht, die Modelle werden als (I) stringent model und (II) early-treatment model bezeichnet. Im stringent model (2x tägliche Gabe an Tag 3-6 nach Infektion) war die durchschnittliche Überlebensdauer von Mäusen, die mit sprühgetrocknetem GHQ168 behandelt worden waren, statistisch signifikant höher als die der unbehandelten Kontrollgruppe (17 gegenüber 9 Tagen). Im Gegensatz hierzu wurde kein statistisch signifikanter Unterschied für GHQ242 (14 Tage) und GHQ243 (12 Tage) festgestellt. GHQ168 wurde im early-treatment model (2x tägliche Gabe an Tag 1-4 nach Infektion) weiter untersucht und erneut wurde eine statistisch signifikante Verbesserung der durchschnittlichen Überlebensdauer (32 Tage (Ende der Beobachtungsphase) gegenüber 7 Tagen) bewiesen. Letztendlich konnte für die sprühgetrocknete Formulierung von GHQ168 eine erstaunliche Aktivität gegenüber Trypanosomen gezeigt werden. NADPH-Oxidasen (NOX) wurden als Hauptproduzenten von endothelialem reaktivem Sauerstoff erkannt. Kapitel III befasst sich mit Formulierungsstudien von Triazolopyrimidinderivaten aus der VAS-Substanzbibliothek, einer Reihe von NADPH-Oxidase-Inhibitoren. Diese Substanzen wurden zur Behandlung erhöhter reaktiver Sauerstoffspezies Werte entwickelt, denn diese tragen zur Entstehung von kardiovaskulären Erkrankungen bei. Obwohl die in vitro Ergebnisse zahlreicher Studien auf die vielversprechende Wirksamkeit und Selektivität der VAS-Substanzen hinweisen, verhinderte die geringe Wasserlöslichkeit den Übertrag auf in vivo Studien sowie die weitere präklinische Entwicklung. Daher wurden drei Derivate, VAS2870, VAS3947 und VAS4024, physikochemisch charakterisiert und VAS3947, die wasserlöslichste Substanz, wurde für weitere Formulierungsentwicklungen ausgewählt. Die Formulierungsansätze umfassten (I) die Sprühtrocknung, (II) die Herstellung von Mikroemulsionen und (III) die Komplexierung mit Cyclodextrinen, um Formulierungen für die orale und parenterale Verabreichung zu entwickeln. Die Löslichkeitsverbesserung von VAS3947 konnte für alle Ansätze erfolgreich gezeigt werden und wurde als Übersättigungsrate im Vergleich zur Löslichkeit der unformulierten Substanz dargestellt. Für sieben sprühgetrocknete Formulierungen und für vier Mikroemulsionen ergab sich eine Übersättigungsrate von 3-9, beziehungsweise von 8-19 nach 120 Minuten. Die sechs Cyclodextrin-Formulierungen erreichten mit 3-174 nach 20 Stunden die höchste Übersättigungsrate. Der Einschluss von VAS3947 in die Kavität der Cyclodextrine sowie die Interaktion mit deren Außenseite wurde mittels NMR aufgeklärt. Schließlich wurde erstmals die Möglichkeit der oralen und parenteralen Gabe der NOX-Inhibitoren eröffnet. Nach erfolgreicher Löslichkeitsverbesserung von VAS3947 wurden weitere Untersuchungen mit dem Ziel von in vivo Studien durchgeführt, was Stabilitätsuntersuchungen mit besonderem Schwerpunkt auf Stabilität in Lösung und in Plasma einschließt, wie im Kapitel IV aufgezeigt. Weiterhin wurden erstmals Permeabilitäts- und Zytotoxizitätsstudien durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass VAS3947 in Puffer und bei Lichtexposition instabil war. Zudem wurde die Substanz in Gegenwart von Maus-Mikrosomen und in menschlichem Plasma abgebaut. Die VAS-Substanzen enthalten eine Oxazol-Ringstruktur, die über einen Thioether mit dem Triazolopyrimidin-Gerüst verbunden ist. Diese Strukturelemente sind für die Wirksamkeit der Substanzklasse verantwortlich, sind jedoch auch hydrolyseempfindlich und anfällig für weitere Abbaureaktionen. Zudem schädigte VAS3947 die Membranintegrität in den Permeabilitätsversuchen und die Zytotoxizitätsuntersuchungen in HEK-293 und HEP-G2 Zellen ergaben IC50-Werte im gleichen Konzentrationsbereich wie in Aktivitätsuntersuchungen berichtet. Zusammenfassend wurde aufgezeigt, dass die VAS-Substanzen weder ein geeignetes Modell für die Untersuchung reaktiver Sauerstoffspezies sind, noch geeignet für die weitere präklinische Entwicklung. KW - Löslichkeit KW - Permeabilität KW - Bioverfügbarkeit KW - Chinolonderivate KW - Formulierungsentwicklung KW - NOX-Inhibitoren Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162766 ER - TY - THES A1 - Götz, Marcus Rudolf T1 - Effiziente Synthese von Dronabinol und weiterer cannabinoider Derivate und deren pharmakologische Charakterisierung T1 - An efficient synthesis of Dronabinol and further cannabinoid derivatives and their pharmacological characterization N2 - In dieser Arbeit wurde ein Verfahren zur effizienten Herstellung von (−)-trans-Cannabidiol (CBD, 10), (−)-trans-Δ9-Tetrahydrocannabinol (Dronabinol, 21) und (−)-trans-Cannabidivarin (CBDV, 30) durch kontinuierliche Synthese untersucht und entwickelt. CBD konnte durch kontinuierliche Synthese in drei Schritten aus Olivetolcarbonsäuremethylester (OM, 6) und Menthadienol G (3) mit einer Ausbeute von 41 % synthetisiert werden. Bei optimierten Bedingungen betrug die Reinheit nach Kristallisation > 99 %. Die Stereochemie konnte durch Röntgenstrukturanalyse eindeutig als 1R,6R bestimmt werden. Vorteilhaft war dabei, dass Toluol anstatt eines chlorierten Lösungsmittels verwendet werden konnte. Weitere Vorteile waren die kurze Reaktionszeit und die Tatsache, dass die Synthese bei Raumtemperatur durchgeführt werden konnte. Es konnten fünf Nebenprodukte detektiert und identifiziert werden, wovon eines Dronabinol war. Bei optimierten Reaktionsparametern konnte eine Ausbeute an Dronabinol von 64,5 % erreicht werden. Durch Simulated Moving Bed (SMB)-Chromatographie konnte Dronabinol kontinuierlich mit einem Gehalt von > 95 % hergestellt werden. Nach der Synthese waren vier Verunreinigungen detektierbar, und zwar Olivetol (17), CBD, Exo-Tetrahydrocannabinol (Exo-THC, 23) und Δ8-Tetrahydrocannabinol (Δ8-THC, 22). Durch die SMB-Aufreinigung konnten alle Verunreinigungen auf einen monographiekonformen (USP 37) Gehalt abgereichert werden. Nach der finalen destillativen Aufarbeitung trat eine noch nicht identifizierte Verunreinigung in einem Gehalt von ca. 0,4 Flächen-% auf. CBDV konnte durch kontinuierliche Synthese in drei Schritten aus Divarincarbonsäuremethylester (DM, 25) und Menthadienol G synthetisiert werden. Die Ausbeute betrug ca. 30 %, die Reinheit nach Kristallisation > 99 %. Es konnten fünf Nebenprodukte detektiert werden, die im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter charakterisiert wurden. Der Syntheseweg bietet durch Modifikation der Seitengruppen an Position 6 (R1) und Position 5 (R2) der Alkylbenzol-Gruppe Zugang zu synthetischen Cannabinoiden mit einem CBD- oder CBDV-Grundgerüst. Es wurden neun neue Cannabinoide hergestellt: 2-Hydroxyethylcannabidiolat (2-HEC, 31), 2-Hydroxypentylcannabidiolat (2 HPC, 32), Glycerylcannabidiolat (GCBD, 33), Cyclohexylcannabidiolat (CHC, 34), Hexylcannabidiolat (HC, 35), N-Methylsulfonylcannabidiolat (NMSC, 36), 2 Hydroxyethylcannabidivarinolat (2-HECBDV, 37), Cyclohexylcannabidivarinolat (CHCBDV, 38) und Hexylcannabidivarinolat (HCBDV, 39). Die Bindungsaffinität wurde in Cannabinoid-Rezeptor-transfizierten HEK293EBNA-Zellen untersucht, die intrinsische Aktivität in CHO-Zellen, die Induktion von NF-κB (nuclear factor kappa B) sowie von NFAT (nuclear factor of activated T cells) in Jurkat-T Zellen, die Induktion proinflammatorischer Zytokine und Chemokine (Interleukin(IL)-6, IL-1β, CC Chemokinligand 2' (CCL2) und Tumornekrosefaktor(TNF)-α) auf mRNA-Ebene in RAW264.7-Makrophagen und die Expression von proinflammatorischen Zytokinen (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α) und Prostaglandin E2 (PGE2) auf Proteinebene in primären humanen Monozyten. Die CBD-Derivate zeigten eine höhere Selektivität für CB2-Rezeptoren. Die CBDV-Derivate HCBDV und CHCBDV zeigten eine spezifische Bindung an CB1- und CB2-Rezeptoren im nanomolaren Bereich. 2-HEC, 2-HPC, GCBD und NMSC wirkten als Agonisten an CB2- und als Antagonisten am CB1-Rezeptor. CHC band an CB1 und CB2 im submikromolaren Bereich und schien ein Agonist für beide Rezeptoren zu sein. 2- HECBD wirkte als Agonist auf CB2-Rezeptoren und als Antagonist auf CB1-Rezeptoren. In Jurkat-T Zellen hemmte NMSC dosisabhängig die Aktivität von NF-κB sowie von NFAT. 2-HEC, 2-HPC und GCBD hemmten die Expression von NFAT ebenfalls dosisabhängig. CHC und HC reduzierten dosisabhängig die Expression von IL-1β- und CCL2-mRNA in RAW264.7-Makrophagen. NMSC hemmte in geringeren Dosen IL-1β, CCL2 sowie TNF-α und induzierte in höheren Dosen einen starken Anstieg der IL-6-mRNA. In primären humanen Monozyten hemmten 2 HEC und GCBD konzentrationsabhängig die Synthese von IL-1β, IL-6 und TNF-α. 2-HPC hemmte dosisabhängig die Bildung von TNF-α und IL-6. HC verminderte dosisabhängig die Freisetzung von TNF-α und IL-6. NMSC steigerte die durch LPS erhöhte Freisetzung von IL-1β noch weiter, hemmte aber TNF-α, IL-8 und PGE2. Die hier untersuchten CBD- und CBDV-Derivate sind geeignet, gezielt an Cannabinoid-Rezeptoren zu wirken. Einige der Derivate könnten als selektive CB2-Agonisten genutzt werden. Die Länge des aliphatischen Rests an R2 von CBD (Pentyl-Cannabinoiden) und CBDV (Propyl-Cannabinoiden) korrelierte nicht mit der Bindungsaffinität. Eine höhere Polarität an R1 (2-HECBDV > NMSC > GCBD > 2-HEC) schien demgegenüber die agonistische Aktivität an CB2 zu begünstigen. Um den Ergebnissen zur Beziehung zwischen Struktur und Wirkung noch mehr Bedeutung zu geben, wären weitere synthetische Derivate und deren Testung notwendig. N2 - In this thesis a process for the efficient production of (−)-trans-cannabidiol (CBD, 10), (−)-trans-Δ9-tetrahydrocannabinol (dronabinol, 21) und (−)-trans-cannabidivarin (CBDV, 30) by means of continuous synthesis was researched and developed. CBD was synthesized in three steps using a continuous synthesis process from olivetol-carboxylic acid methyl ester (OM, 6) and Menthadienol G (3) with a yield of 41%. With optimized conditions, the purity after crystallization was >99%. The stereochemistry was distinctly determined as 1R,6R by X-ray crystal analysis. Beneficial was the fact that toluene was used instead of a chlorinated solvent. Further advantages comprised a short reaction time and the fact that the synthesis can be carried out at room temperature. Five by-products were detected and identified, one of them being dronabinol. With optimized reaction parameters, a yield of up to 64.5% of dronabinol was achieved. By simulated moving bed (SMB) chromatography, dronabinol was produced repeatedly with a purity of >95%. After the synthesis process, four impurities were detectable, namely olivetol (17), CBD, exo-tetrahydrocannabinol (exo-THC, 23) and Δ8-tetrahydrocannabinol (Δ8-THC, 22). All impurities were depleted to a monograph (USP 37) conforming level through SMB purification. After the final distillation, one further unidentified impurity occurred with a content of about 0.4 area%. CBDV was synthesized through continuous synthesis in three steps from divarin-carboxylic acid methyl ester (DM, 25) und Menthadienol G. The yield was approximately 30%, the purity after crystallization >99%. Five by-products were detected which were not further characterized within the scope of this thesis. Through modification of the side groups at position 6 (R1) and position 5 (R2) of the alkyl benzene moiety, the synthesis route offers access to synthetic cannabinoids with a CBD or CBDV scaffold. Nine new cannabinoids have been produced: 2-hydroxyethyl cannabidiolate (2-HEC, 31), 2-hydroxypentyl cannabidiolate (2-HPC, 32), glyceryl cannabidiolate (GCBD, 33), cyclohexyl cannabidiolate (CHC, 34), hexyl cannabidiolate (HC, 35), N-methyl-sulfonyl cannabidiolate (NMSC, 36), 2-hydroxyethyl cannabidivarinolate (2-HECBDV, 37), cyclohexyl cannabidivarinolate (CHCBDV, 38), hexyl cannabidivarinolate (HCBDV, 39). Binding affinity was studied in CB receptor-transfected HEK293EBNA cells, the intrinsic activity in CHO cells, the induction of nuclear factor kappa B (NF-κB) and nuclear factor of activated T cells (NFAT) in Jurkat T cells, the induction of pro-inflammatory cytokines and chemokines (interleukin (IL)-6, IL 1β, CC chemokine ligand 2 (CCL2) and tumor necrosis factor (TNF)-α) on the mRNA level in RAW264.7 macrophages and the expression of pro-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α) and prostaglandin E2 (PGE2) on the protein level in primary human monocytes. The CBD derivatives showed higher selectivity for CB2. The CBDV derivatives HCBDV and CHCBDV showed specific binding at CB1 and CB2 receptors in the nanomolar range. 2-HEC, 2-HPC, GCBD and NMSC acted as agonists at CB2 and as antagonists at CB1 receptors. CHC bound CB1 and CB2 at the submicromolar range, and acted as an agonist for both receptors. 2-HECBDV was demonstrated to be an agonist at CB2 and an agonist at CB1. In Jurkat T cells, NMSC inhibited both NF-κB and NFAT activity in a dose-dependent fashion. 2-HEC, 2-HPC and GCBD inhibited the expression of NFAT, also in a dose-dependent manner. CHC and HC dose-dependently reduced the expression of IL-1β and CCL2 mRNA in RAW264.7 macrophages. NMSC inhibited at lower doses IL-1β, CCL2 and TNF-α and at higher doses induced a pronounced increase in IL-6 mRNA. In human primary monocytes, 2-HEC and GCBD inhibited IL-1β, IL-6 and TNF-α synthesis in a dose-dependent fashion. 2-HPC dose-dependently prevented the expression of TNF-α and IL-6 in high concentrations. HC decreased TNF-α and IL-6 release in a dose-dependent fashion. NMSC further increased LPS-elevated IL-1β release but inhibited TNF-α, IL-8 und PGE2. The CBD and CBDV derivatives studied here are suitable for targeting CB receptors. Some of the derivatives might be used as selective CB2 agonists. The length of the aliphatic rest at R2 of CBD (pentyl) and CBDV (propyl) did not correlate with binding affinity. Higher polarity at R1 (2-HECBDV > NMSC > GCBD > 2 HEC) however appeared to favor the agonistic activity at CB2 receptors. To give the results on the relationship between structure and effect more significance, further synthetic derivatives and their testing would be necessary. KW - Dronabinol KW - Cannabinoide KW - Cannabidiol KW - Cannabidivarin Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166625 ER - TY - THES A1 - Wahl, Joachim T1 - The Use of Ionic Liquids in Capillary Electrophoresis Enantioseparation T1 - Die Nutzung Ionischer Flüssigkeiten in der kapillarelektrophoretischen Enantiomerentrennung N2 - Two chiral chemical molecules being mirror images of each other, also referred to as enantiomers, may have different pharmacokinetic, pharmacodynamic, and toxicological effects. Thus, pharmaceutical manufacturers and authorities are increasingly interested in the approval of enantiopure drugs. However, the isomeric purity and the limits for isomeric impurities have to be specified applying enantioselective analytical methods, such as capillary electrophoresis. The separation of enantiomers in capillary electrophoresis may be improved by the addition of ionic liquids to the background electrolyte. The aim of this work was to investigate the influence of different separation conditions on the enantioseparation of phenethylamines in background electrolytes containing ionic liquids based on tetrabutylammonium cations. Best chiral separations were achieved at acidic pH values using phosphate buffers containing 125 mmol/L tetrabutylammonium based salts. Different reasons explaining enhanced enantioseparations in buffers containing ionic liquids were found. First, due to an improvement of the cyclodextrin solubility, the addition of ionic liquids to the background electrolyte enables the use of higher concentrations of these chiral selector. Furthermore, the adsorption of tetrabutylammonium cations to the negatively charged capillary surface results in a reduction of the electroosmotic flow. Hence, the resulting prolongation of migration times leads to a longer period of time for the separation of temporarily formed diastereomeric analyte cyclodextrin complexes, which yields improved enantioseparation. Additionally, due to a decrease of the adsorption of positively charged phenethylamine analyte molecules to capillary surface silanol groups, the adsorption of ionic liquid cations inhibits peak broadening. A further reason explaining an enhanced enantioseparation by the addition of ionic liquids to the background electrolyte is a competition between tetrabutylammonium cations and analyte enantiomers for the inclusion into cyclodextrin cavities. Furthermore, the influence of different chiral counterions, combined with tetrabutylammonium cations, on the enantioseparation of phenethylamines was investigated. Solely anions based on the basic proteinogenic amino acids L lysine and L arginine yielded chiral separation results superior to those achieved using achiral tetrabutylammonium chloride as background electrolyte additive. Especially the application of tetrabutylammonium L argininate gave very good enantioseparations of all investigated ephedrine derivatives, which might be explained by the ability of L arginine to affect the formation of complexes between analytes and cyclodextrins. Besides the investigation of the influence of ionic liquids on the enantioseparation, complexes between phenethylamine enantiomers and β cyclodextrin derivatives were characterized by affinity capillary electrophoresis. The binding constants between analyte enantiomers and cyclodextrins and the electrophoretic mobilities of the temporarily formed complexes were determined and compared to the observed chiral resolution values. While neither the calculated binding constants nor their differences correlated with the quality of the enantioseparation, a strong correlation between the differences of the electrophoretic mobilities of the complexes and the chiral resolution values was found. N2 - Chemische Moleküle, die sich zueinander wie Bild und Spiegelbild verhalten, so genannte Enantiomere, können im menschlichen Organismus unterschiedliche pharmakodynamische und toxikologische Wirkungen zeigen. Aus diesem Grund legen pharmazeutische Unternehmen und Arzneimittelbehörden vermehrten Wert auf die Zulassung enantiomerenreiner Arzneistoffe. Da sowohl die Reinheit eines Enantiomers als auch der Gehalt an isomeren Verunreinigungen spezifiziert werden müssen, besteht ein zunehmender Bedarf an analytischen Methoden zur Enantiomerentrennung, wie zum Beispiel der Kapillarelektrophorese. Das Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der kapillarelektrophoretischen Enantiomerentrennung von Ephedrin Derivaten unter Zuhilfenahme von auf Tetrabutylammonium basierenden Ionische Flüssigkeiten. Der Einfluss diverser Parameter auf die Trennung von Phenethylamin-Enantiomeren in Puffern, die Ionische Flüssigkeiten enthalten, wurde systematisch untersucht. Dabei konnten die besten Trennergebnisse unter stark sauren Bedingungen in Phosphatpuffern, die 125 mmol/L Tetrabutylammonium Salze enthielten, erreicht werden. Verschiedene Faktoren, die zu einer Verbesserung der Enantiomerentrennung führten, konnten festgestellt werden. Erstens wurde eine Verbesserung der Cyclodextrin-Löslichkeit durch die Zugabe von Ionischen Flüssigkeiten zum Trennpuffer festgestellt. Dies ermöglicht eine Verwendung höherer Konzentrationen dieser chiralen Selektoren. Des Weiteren führt eine Anlagerung von Tetrabutylammonium-Kationen an die negativ geladene Oberfläche der Kapillare zu einer Reduktion des elektroosmotischen Flusses. Daraus resultiert einerseits eine Verlängerung der Migrationszeiten, die bewirkt, dass eine längere Zeit zur Trennung der temporär gebildeten diastereomeren Cyclodextrin-Einlagerungskomplexe zur Verfügung steht. Andererseits wird durch die Adsorption von Tetrabutylammonium-Kationen an die Kapillarwand die Anlagerung von positiv geladenen Phenethylamin-Analyten an die Silanoloberfläche verhindert. Dies führt durch eine Reduktion der Peakbreite zu einer Verbesserung der Trennergebnisse. Als dritter Grund für verbesserte Trennungen nach Zugabe von Ionischer Flüssigkeit zum Trennpuffer kann ein kompetitiver Mechanismus zwischen Analyt Enantiomeren und Tetrabutylammonium-Kationen um den Einschluss in Cyclodextrine aufgeführt werden. Zusätzlich wurde der Einfluss verschiedener chiraler Gegenionen, die mit Tetrabutylammonium-Kationen kombiniert wurden, auf die Trennung von Phenethylamin-Enantiomeren untersucht. Dabei konnte ausschließlich unter Verwendung von Anionen der basischen proteinogenen Aminosäuren L Lysin und L Arginin eine Verbesserung der Trennung beobachtet werden. Vor allem die Verwendung von L Arginin, für welches eine Beeinflussung der Komplexbildung zwischen Analyten und Cyclodextrin vermutet wird, ergab eine starke Verbesserung der Trennung aller Ephedrin Derivate. Neben der Untersuchung des Einflusses von Ionischen Flüssigkeiten auf die kapillarelektrophoretische Trennung wurde auch die Komplexbildung zwischen Phenethylamin-Enantiomeren und verschiedenen β Cyclodextrin Derivaten mittels Affinitätskapillarelektro-phorese untersucht. Die Bindungskonstanten zwischen Analyt-Enantiomeren und Cyclodextrinen und die elektrophoretische Mobilität der gebildeten Komplexe wurden bestimmt und mit den dabei beobachteten chiralen Trennungen verglichen. Dabei konnte eine starke Korrelation zwischen den Unterschieden in den elektrophoretischen Mobilitäten der Komplexe und der Güte der Enantiomerentrennung festgestellt werden, während kein Zusammenhang zwischen den Bindungskonstanten, beziehungsweise deren Differenzen, und der chiralen Auflösung zwischen Phenethylamin Enantiomeren zu beobachten war. KW - Capillary Electrophoresis KW - Ionic Liquid KW - Kapillarelektrophorese KW - Enantiomerentrennung KW - Ionische Flüssigkeit Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176397 ER - TY - THES A1 - Berninger, Michael T1 - Development of Novel Quinolone Amides Against the African Sleeping Sickness - A Fluorine Walk T1 - Entwicklung von neuen Chinolonamiden gegen die Afrikanische Schlafkrankheit - Ein "Flourine Walk" N2 - In recent years the transmission of the Human African Trypanosomiasis could be significantly reduced. The reported cases in 2016 reached a historic low level of 2184 cases and these achievements can be ascribed to intense control and surveillance programmes.118 However, most of the reported cases (>1000 in 2015) occurred in the Democratic Republic of the Congo and thus, need to be treated adequately. In particular, when the parasites have traversed the blood-brain barrier (BBB), treatment proved to be even more difficult. In addition, the number of cases always came in waves due to many reasons, e.g., development of resistances. Thus, it can be expected from experiences of the past that the number of cases will increase again. Hence, novel chemical entities are desperately needed in order to overcome the drawbacks which are associated with the current treatment options. Our drug discovery approach included an initial drug repurposing strategy combined with a phenotypic screening. S. Niedermeier found novel active compounds derived from commercial fluoroquinolones. The most promising hit compound was further developed by G. Hiltensperger resulting in the lead quinolone amide GHQ168 (IC50 = 0.047 µM). This doctoral thesis is about new insights into the SAR of the quinolone amides and the enhancement of the lead compound. Special consideration was given to the fluorine atom in the quinolone amides and how certain fluorine substitution patterns influence the antitrypanosomal activity, physicochemical properties and pharmacokinetics (i.e. ‘fluorine walk’). Moreover, the ability of the compound class crossing the BBB should be investigated. This feature is inevitable necessary in order to potentially treat African sleeping sickness stage II. The Gould-Jacobs protocol was predominantly used for the synthesis of the quinolone core. Since former SAR studies mainly concentrated on the variation in positions 1, 3 and 7, quinolone scaffolds (2a-i) with diverse substitution patterns regarding positions 5, 6, 7 and 8 were synthesised in this thesis. The resulting quinolone amides were evaluated for their antitrypanosomal activity. Voluminous residues in position C-5 resulted in diminished activities (compounds 13, 16 and 18) and solely small-sized moieties were tolerated. In particular the fluorine atom in position 5 revealed beneficial trypanocidal effects as shown for compounds 6 (IC50 = 0.05 µM), 8 (IC50 = 0.04 µM), and 24 (IC50 = 0.02 µM). Furthermore, having fluorine only in position 5 of the quinolone core could considerably reduce the cytotoxic effects (CC50 >100 µM, SI = >2000 for 6). Hence, the 5-fluoro-substituted quinolone amides were considered superior to GHQ168. Regarding the C-6 position all other moieties (e.g., H in 9, OCH3 in 10, CF3 in 12) except of a fluorine atom decreased the activity against Trypanosoma brucei brucei. A double fluorination in C-6 and C-8 was not beneficial (IC50 = 0.06 µM for 7) and a single fluorine atom in C-8 even showed a negative effect (IC50 = 0.79 µM for 5). The logP value is considered a surrogate parameter for lipophlicity and thus, affecting permeability and solubility processes. In particular the fluorine atom influences the lipophilicity due to versatile effects: Lipophilicity is increased by additional fluorine atoms on aromatic rings (7, 23) and reduced by fluorine atoms at an alkyl chain (49), respectively. Additionally, the 5-fluoro-substituted quinolone amides (6, 8, and 24) could prove the contrary effect of decreasing lipophilicity when the aromatic fluorine substituent is in vicinity to a carbonyl group. For the most promising drug candidates 6, 23, and 24 the respective metabolites and the metabolic turnover were investigated by C. Erk. In comparison to GHQ168 the hydroxylation of the benzylamide was prevented by the para-fluorine atom. Hence, half-life was extended for compound 23 (t1/2 = 6.4 h) and N-desalkylation was the predominant pathway. Moreover, the respective fluorine substitution pattern of the quinolone core affected the metabolism of compound 6. The 5-fluoro-substituted quinolone amide was less prone for biotransformation (t1/2 = 7.2 h) and half-life could even be further prolonged for compound 24 (t1/2 = 7.7 h). Due to the most appropriate safety profile of compound 6, this particular drug candidate was considered for in vivo study. Its poor solubility made a direct intraperitoneal administration unfeasible. Thus, an amorphous solid dispersion of 6 was generated using the spray-drying method according to the previous protocol. Unfortunately, the required solubility for the predicted in vivo study was not achieved. Furthermore, the compound class of the quinolone amide was evaluated for its ability for brain penetration. The methanesulfonyl precursor 48 was synthesised and subsequently radiofluorinated in the group of Prof. Dr. Samnick (Department of Nuclear Medicine, University Hospital of Würzburg). The labelled compound [18F]49 was administered to mice, and its distribution throughout the body was analysed using positron emission tomography and autoradiography, respectively. The autoradiography of the murine brains revealed medium to high concentrations of [18F]49. Therefore, the quinolone amides are generally suitable for treating Human African Trypanosomiasis stage II. A scaffold hopping approach was performed starting from the quinolone amides and concluding with the compound class of pyrazoloquinolin-3-ones. The intramolecular hydrogen bond between the sec. amide and the C-4 carbonyl moiety was replaced by a covalent bond. The two compound classes were comparable regarding the antitrypanosomal activity to some degree (IC50 = 7.9 µM (EK02) vs. 6.37 µM (53a)). However, a final evaluation of 59 was not possible due to poor solubility. N2 - Die Verbreitung der Afrikanischen Schlafkrankheit konnte in den vergangenen Jahren deutlich verringert werden. Die dokumentierten Fallzahlen aus 2016 erreichten ein historisch niedriges Niveau, was auf eine engmaschige Kontrolle und Überwachung zurückzuführen ist. Dennoch gibt es nach wie vor zahlreiche Krankheitsfälle (>1000 Fälle im Jahr 2015 für die Demokratische Republik Kongo), die entsprechend behandelt werden müssen. Die Therapie wird insbesondere dann erschwert, wenn die Parasiten die Blut-Hirn-Schranke überwunden haben. Außerdem treten die Krankheitsfälle aus mehreren Gründen, wie beispielsweise durch Resistenzentwicklung immer wieder schubweise auf. Die Erfahrungen aus der Vergangenheit zeigen, dass die Fallzahlen jederzeit wieder ansteigen können. Deshalb sind neue Arzneistoffe dringend notwendig, um die Nachteile der aktuellen Behandlungmöglichkeiten umgehen zu können. Unsere Suche nach neuen Wirkstoffen beinhaltete eine anfängliche Umwidmung eines zugelassenen Arzneistoffes in Verbindung mit einem Phänotyp-basierten Screening. S. Niedermeier entdeckte neue aktive Verbindungen, die sich von handelsüblichen Fluorchinolonen ableiteteten. Die vielversprechenste Substanz wurde von G. Hiltensperger zum Chinolonamid GHQ168 (IC50 = 0.047 µM) weiter optimiert. Diese Arbeit befasst sich mit neuen Erkenntnissen zur Struktur-Wirkungs Beziehung der Chinolonamiden und mit der Verbesserung der Leitsubstanz. Besondere Berücksichtigung fanden dabei die Fluor-Substitutionen an den Chinolonamiden. Es sollte untersucht werden, inwiefern gewisse Fluorsubstitutionsmuster die antitrypanosomale Wirkung, physiko-chemische Eigenschaften und Pharmakokinetik beeinflussen („Fluor Walk“). Außerdem sollte ermittelt werden, ob diese Substanzklasse die Blut-Hirn-Schranke überwinden kann. Dieses Merkmal muss unabdingbar vorhanden sein, um die Afrikanische Schlafkrankheit in Stufe II potentiell behandeln zu können. Das Gould-Jacobs-Verfahren wurde hauptsächlich für die Synthese des Chinolongrundgerüstes angewandt. Da sich die vorausgegangene Analyse der Struktur-Wirkungs Beziehungen vornehmlich auf das Variieren der Substitutenten in den Positionen 1, 3 und 7 konzentrierte, wurden in dieser Arbeit Chinolone (2a-i) mit diversen Substitutionsmustern in den Positionen 5, 6, 7 und 8 synthetisiert. Die erhaltenen Chinolonamide wurden auf ihre antitrypanosomale Aktivität untersucht. Voluminöse Reste in der Position C-5 verursachten verringerte Aktivitäten (Verbindungen 13, 16 and 18), d.h. nur kleine Reste waren hinnehmbar. Vor allem ein Fluor-Atom in Position 5 wirkte sich günstig auf die antitrypanosomale Wirkung aus, was mit Verbindungen 6 (IC50 = 0.05 µM), 8 (IC50 = 0.04 µM), und 24 (IC50 = 0.02 µM) gezeigt werden konnte. Des Weiteren reduzierte sich die zytotoxische Wirkung (CC50 >100 µM, SI = >2000 für 6), wenn sich das Fluor-Atom nur in Position 5 des Chinolongrundgerüsts befindet. Deshalb wurden die Chinolonamide mit Fluor in Position 5 gegenüber GHQ168 als überlegen erachtet. In Bezug auf Position 6 zeigen die Reste (z. B. H in 9, OCH3 in 10, CF3 in 12), mit Ausnahme des Fluor-Atoms, eine verringerte Aktivität gegenüber Trypanosoma brucei brucei. Eine zweifache Fluorsubstitution in C-6 und C-8 war nicht vorteilhaft (IC50 = 0.06 µM für 7) und ein einfaches Fluor-Atom in C-8 zeigte einen negativen Effekt (IC50 = 0.79 µM für 5). Der logP Wert wird als Surrogatparameter der Lipophilie betrachtet und wirkt sich somit auf Permeabilität- und Löslichkeitsprozesse aus. Insbesondere das Fluor-Atom beeinflusst die Lipophilie durch vielfältige Effekte: die Lipophilie wird durch zusätzliche Fluor-Atome am Aromaten erhöht (7, 23), beziehungsweise durch Fluor-Atome an einer Alkylkette verringert (49). Zusätzlich konnte für die 5-fluoro-substituierten Chinolonamide (6, 8, 24) der paradoxe Effekt gezeigt werden, dass die Lipophilie verringert wird, sobald ein aromatischer Fluorsubstituent in unmittelbarer Nähe zu einer Carbonylgruppe steht. Für die vielversprechensten Wirkstoffkandidaten 6, 23 und 24 wurden die jeweiligen Metabolite und der metabolische Umsatz von C. Erk untersucht. Im Vergleich zu GHQ168 wurde einer Hydroxylierung des Benzylamid-Restes durch eine para-Fluor-Substitution vorgebeugt. Dadurch wurde die Halbwertszeit der Verbindung 23 verlängert (t1/2 = 6.4 h) und eine N-Desalkylierung war der vorrangige Abbauweg. Außerdem wirkte sich das entsprechende Fluorsubstitutionsmuster auf den Metabolismus von Substanz 6 aus. Das 5-fluoro-substitutierte Chinolonamid war weniger anfällig für Biotransformationen (t1/2 = 7.2 h) und die Halbwertszeit konnte für die Substanz 24 sogar noch weiter verlängert werden (t1/2 = 7.7 h). Aufgrund des geeigneten Sicherheitsprofils der Verbindung 6, wurde für diesen Wirkstoffkandidaten eine In-vivo-Studie in Betracht gezogen. Die schlechte Wasserlöslichkeit machte jedoch eine direkte intraperitoneale Gabe unpraktikabel. Deshalb wurde durch Sprühtrocknung der Verbindung 6, gemäß der früheren Vorgehensweise, eine „amorphous solid dispersion“ erzeugt. Die benötigte Löslichkeit für die vorausberechnete In-vivo-Studie wurde dabei leider nicht erreicht. Darüber hinaus wurde die Substanzklasse der Chinolonamide hinsichtlich ihrer Fähigkeit, ins Gehirn zu gelangen, untersucht. Dazu wurde die Methansulfonyl-Vorstufe 48 in der Gruppe von Prof. Dr. Samnick (Institut für Nuklearmedizin, Universitätsklink Würzburg) synthetisiert und mit [18F]Fluor markiert. Die markierte Verbindung [18F]49 wurde anschließend in Mäuse injiziert und dessen Verteilung im Körper mittels Positronen-Emissions-Tomographie, beziehungsweise mittels Autoradiographie analysiert. Die Autoradiographie der Mäusegehirne zeigte mittlere bis hohe Konzentrationen von [18F]49. Demnach sind die Chinolonamide generell dafür geeignet, die Afrikanische Schlafkrankheit in Stufe II zu behandeln. Ein “Scaffold Hopping”-Ansatz wurde für die Chinolonamide angestrebt und ergab schließlich die Substanzklasse der Pyrazolochinolin-3-one. Die intramolekulare Wasserstoffbrückenbindung zwischen dem sek. Amid und der Carbonylgruppe in C-4 wurde durch eine kovalente Bindung ersetzt. Die beiden Substanzklassen waren im Ansatz, bezogen auf ihre antitrypanosomale Wirkung, miteinander vergleichbar (IC50 = 7.9 µM (EK02) vs. 6.37 µM (53a)). Dennoch konnte eine abschließende Bewertung aufgrund mangelnder Löslichkeit nicht stattfinden. KW - Trypanosomiase KW - Gyrasehemmer KW - Fluorverbindungen KW - Quinolone amides KW - African Trypanosomiasis KW - Fluorine Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176428 ER - TY - THES A1 - Mohsen, Amal Mahmoud Yassin T1 - Structure Activity Relationships of Monomeric and Dimeric Strychnine Analogs as Ligands Targeting Glycine Receptors T1 - Strukturaktivitätsbeziehungen von monomeren und dimeren Strychninanaloga als Liganden, die Glycinrezeptoren N2 - The inhibitory glycine receptors are one of the major mediators of rapid synaptic inhibition in the mammalian brainstem, spinal cord and higher brain centres. They are ligand-gated ion channels that are mainly involved in the regulation of motor functions. Dysfunction of the receptor is associated with motor disorders such as hypereklepxia or some forms of spasticity. GlyR is composed of two glycosylated integral membrane proteins α and β and a peripheral membrane protein of gephyrin. Moreover, there are four known isoforms of the α-subunit (α1-4) of GlyR while there is a single β-subunit. Glycine receptors can be homomeric including α subunits only or heteromeric containing both α and β subunits. To date, strychnine is the ligand that has the highest affinity as glycine receptor ligand. It acts as a competitive antagonist of glycine that results in the inhibition of Cl- ions permeation and consequently reducing GlyR-mediated inhibition. For a long time, the details of the molecular mechanism of GlyRs inactivation by strychnine were insufficient due to the lack of high-resolution structures of the receptor. Only homology models based on structures of other cys-loop receptors have been available. Recently, 3.0 Å X-ray structure of the human glycine receptor- α3 homopentamer in complex with strychnine, as well as electro cryo-microscopy structures of the zebra fish α1 GlyR in complex with strychnine and glycine were published. Such information provided detailed insight into the molecular recognition of agonists and antagonists and mechanisms of GlyR activation and inactivation. Very recently, a series of dimeric strychnine analogs obtained by diamide formation of two molecules of 2-aminostrychnine with diacids of different chain length was pharmacologically evaluated at human α1 and α1β glycine receptors. None of the dimeric analogs was superior to strychnine. The present work focused on the extension of the structure-activity relationships of strychnine derivatives at glycine receptors All the synthesized compounds were pharmacologically evaluated at human α1 and α1β glycine receptors in a functional FLIPRTM assay and the most potent analogs were pharmacologically evaluated in a whole cell patch-clamp assay and in [3H]strychnine binding studies. It was reported that 11-(E)-isonitrosostrychnine displayed a 2-times increased binding to both α1 and α1β glycine receptors which prompted us to choose the hydroxyl group as a suitable attachment point to connect two 11-(E)-isonitrosostrychnine molecules using a spacer. In order to explore the GlyR pocket tolerance for oxime extension, a series of oxime ethers with different spacer lengths and sterical/lipophilic properties were synthesized biologically evaluated. Among all the oxime ethers, methyl, allyl and propagyl oxime ethers were the most potent antagonists displaying IC50 values similar to that of strychnine. These findings indicated that strychnine binding site at GlyRs comprises an additional small lipophilic pocket located in close proximity to C11 of strychnine and the groups best accommodated in this pocket are (E)-allyl and (E)-propagyl oxime ethers. Moreover, 11-aminostrychnine, and the corresponding propionamide were prepared and pharmacologically evaluated to examine the amide function at C11 as potential linker. A series of dimeric strychnine analogs designed by linking two strychnine molecules through amino groups in position 11 with diacids were synthesized and tested in binding studies and functional assays at human α1 and α1β glycine receptors. The synthesized bivalent ligands were designed to bind simultaneously to two α-subunits of the pentameric glycine receptors causing a possibly stronger inhibition than the monomeric strychnine. However, all the bivalent derivatives showed no significant difference in potency compared to strychnine. When comparing the reference monomeric propionamide containing ethylene spacer to the dimeric ligand containing butylene spacer, a 3-fold increase in potency was observed. Since the dimer containing (CH2)10 spacer length was found to be equipotent to strychnine, it is assumed that one molecule of strychnine binds to the receptor and the ‘additional’ strychnine molecule in the dimer probably protrudes from the orthosteric binding sites of the receptor. N2 - Die inhibitorischen Glycin-Rezeptoren (GlyR) gehören zu den wichtigsten Mediatoren der schnellen synaptischen Hemmung im Säugetierhirnstamm, Rückenmark und in höheren Gehirnzentren. Sie sind ligandgesteuerte Ionenkanäle, die hauptsächlich an der Regulation der motorischen Funktionen beteiligt sind. Dysfunktion des Rezeptors ist assoziiert mit motorischen Störungen wie Hyperekplexie und einigen Formen von Spastizität. GlyR sind Proteinkomplexe, die aus zwei glykosylierten integralen Membranproteinen α und β und dem peripheren Membranprotein Gephyrin bestehen. Von der α-Untereinheit sind vier Isoformen bekannt (α1-4), von der β-Untereinheit nur eine. GlyR können homomer (nur α-Untereinheiten) oder heteromer (α und ß-Untereinheiten) sein. Das Alkaloid Strychnin weist eine sehr hohe Affinität zu den GlyR auf. Es wirkt als kompetitiver Antagonist von Glycin und führt nach Bindung zu einer Hemmung des Chlorid-Ionen-Einstroms und folglich zu einer Verringerung der GlyR-vermittelten Inhibition. Lange Zeit waren die genauen Details des molekularen Mechanismus der GlyR-Inaktivierung durch Strychnin aufgrund des Fehlens von hochauflösenden Röntgenstrukturen des Rezeptors nicht bekannt; es standen nur Homologie-Modelle basierend auf Strukturen anderer cys-Loop-Rezeptoren zur Verfügung. Vor kurzem wurden eine 3.0-Å-Röntgenstruktur des humanen GlyR (α3-Homopentamer) im Komplex mit Strychnin sowie eine Kryoelektronenmikroskopie-Struktur des Zebrafisches (α1-GlyR im Komplex mit Strychnin und Glycin) veröffentlicht. Dadurch erhielt man detailliertere Informationen über die molekulare Erkennung von Agonisten und Antagonisten sowie den Mechanismen der Aktivierung und Inaktivierung von GlyR. Kürzlich wurde eine Reihe von dimeren Strychnin-Analoga, bei denen jeweils zwei Moleküle 2-Aminostrychnin durch Reaktion mit Disäuren unterschiedlicher Kettenlänge zu den entsprechenden Diamiden miteinander verknüpft wurden, pharmakologisch an humanen α1- und α1β-GlyR untersucht. Keines der dimeren Analoga war Strychnin überlegen. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf der Erweiterung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Strychnin-Derivaten bzgl. der Aktivität an Glycin-Rezeptoren. Die strukturellen Änderungen, die an Strychnin durchgeführt wurden, sind in Abbildung 27 dargestellt. ... KW - Strychnin KW - strychnine KW - Monomere KW - Dimere KW - Ligand KW - Glycinrezeptor KW - dimeric strychnine ligands Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142228 ER - TY - THES A1 - Messerer, Regina T1 - Synthesis of Dualsteric Ligands for Muscarinic Acetylcholine Receptors and Cholinesterase Inhibitors T1 - Synthese von dualsteren Liganden für muskarinerge Acetylcholinrezeptoren sowie Inhibitoren der Cholinesterasen N2 - The study is dealing with the synthesis and pharmacological investigation of newly designed dualsteric ligands of muscarinic acetylcholine receptors belonging to the superfamily of G protein-coupled receptors. Such bipharmacophoric ligands combine the advantages of the orthosteric binding site (high-affinity) and of the topographically distinct allosteric binding site (subtype-selectivity) resulting in compounds with reduced side effects. This opens the way to a new therapeutic approach in the treatment of e.g. chronic pain, drug withdrawal, Parkinson`s and Alzheimer`s disease. Furthermore, the newly synthesized dualsteric compounds were pharmacologically investigated in order to get a better understanding of the activation and signaling processes in muscarinic acetylcholine receptors, especially with regard to partial agonism. The development of the “dynamic ligand binding” concept offers new perspectives for ligand binding and signaling at G protein-coupled receptors. GPCRs are no longer considered as simple on/off switches. Dualsteric ligands can bind in a dualsteric pose, reflecting an active receptor state as well as in a purely allosteric binding pose, characterized by an inactive receptor state resulting in partial agonism. The degree of partial agonism depends on the ratio of active versus inactive receptor populations. On this basis, orthosteric/orthosteric hybrid ligands consisting of the antagonist atropine and scopolamine, respectively, as well as of the agonist iperoxo and isoxazole, respectively, linked via different alkyl chain length were synthesized in order to investigate partial agonism (Figure 1). Figure 1: Structures of the synthesized iperoxo/isoxazole-atropine/scopolamine-hybrids. Furthermore, different sets of quaternary and tertiary homodimers consisting either of two iperoxo or two acetylcholine units were synthesized in order to study their extent on partial agonism (Figure 2). The two agonists were connected by varying alkyl chain length. Binding studies on CHO-hM2 cells of the quaternary compounds revealed that dimerization of the agonist results in a loss of potency. The iperoxo-dimers reached higher maximum effects on the Gi- as well as on the Gs pathway in comparison to the acetylcholine-dimers. Besides the choice of the orthosteric building block (potency of the agonist), the alkyl chain length is also crucial for the degree of partial agonism. Figure 2: Structures of the synthesized quat./tert. iperoxo/acetylcholine-homodimers. Quinolone-based hybrids connected to the superagonist iperoxo and to the endogenous ligand acetylcholine, respectively, linked through an alkyl chain of different length were synthesized in order to develop further partial agonists (Figure 3). FRET studies confirmed M1 subtype-selectivity as well as linker dependent receptor response. The greatest positive FRET signal was observed with quinolone-C6-iper resulting from a positive cooperativity between the two separated moieties, alloster and orthoster. However, the corresponding hybrids with a longer linker led to an inverse FRET signal indicating a different binding mode, e.g. purely allosteric, in contrast to the shorter linked hybrids. Furthermore, the flexible alkyl spacer was replaced by a rigidified linker resulting in the hybrid quinolone-rigid-iperoxo (Figure 3). FRET studies on the M1 receptor showed reduced FRET kinetics, resulting from interactions between the bulky linker and the aromatic lid, located between the orthosteric and allosteric binding site. A bitopic binding mode of the rigidified hybrid is presumed. For further clarity, mutational studies are necessary. Figure 3: M1-selective hybrid compounds. Another aim of this work was the design and synthesis of new hybrid compounds, acting as agonists at the M1 and M2 receptor and as inhibitors for AChE and BChE in the context of M. Alzheimer. Several sets of hybrid compounds consisting of different pharmacophoric units (catalytic active site: phthalimide, naphthalimide, tacrine; peripheric anionic site: iperoxo, isoxazole) linked through a polymethylene chain of varying length were synthesized. Tac-C10-iper (Figure 4), consisting of tacrine and the superagonist iperoxo linked by a C10 polymethylene spacer, was found to have excellent anticholinesterase activity for both AChE (pIC50 = 9.81) and BChE (pIC50 = 8.75). Docking experiments provided a structural model to rationalize the inhibitory power towards AChE. Additionally, the tacrine related hybrids showed affinity to the M1 and M2 receptor. Such compounds, addressing more than one molecular target are favorable for multifactorial diseases such as Alzheimer. Figure 4: Structure of the most active compound regarding anticholinesterase activity. In summary, the choice of the pharmacophoric units, their connecting point as well as the nature, length, and flexibility of the linker play an important role for the activity of designed bivalent ligands. A shorter linker length cannot bridge both binding sites simultaneously in contrast to longer linker chains. On the other hand, too long linker chains can result in unwanted steric interactions. Further investigations with respect to structural variations of hybrid compounds, with or without quaternary ammonium groups, are necessary in the light of drug development. N2 - Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit der Synthese und der pharmakologischen Untersuchung von neu entwickelten dualsteren Liganden des muskarinischen Acetylcholinrezeptors, welcher zur Superfamilie der G-Proteine gehört. In derartigen bipharmakophoren Liganden sind die Vorteile des orthosteren Bindemodus und des räumlich davon getrennten allosteren Bindemodus vereint. Der orthostere Bindemodus bewirkt eine hohe Affinität zum Rezeptor, während der allostere Bindemodus Subtypselektivität vermittelt. Dadurch weisen diese Verbindungen weniger Nebenwirkungen auf. Dies eröffnet einen neuen Therapieansatz in der medikamentösen Behandlung von z.B. chronischen Schmerzen, Drogenentzug, Morbus Parkinson und Morbus Alzheimer. Die neu synthetisierten, dualsteren Verbindungen wurden pharmakologisch untersucht, um ein besseres Verständnis über das Bindungsverhalten und die Signalweiterleitung an muskarinischen Acetylcholinrezeptoren zu erhalten, besonders in Hinblick auf Partialagonismus. Die Entwicklung des Konzeptes der „dynamischen Ligandenbindung“ bietet neue Perspektiven in Hinblick auf das Bindungsverhalten und die Signalweiterleitung an G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Somit werden GPCRs nicht mehr nur in ihrem aktiven oder inaktiven Zustand betrachtet. Vielmehr können dualstere Liganden sowohl einen dualsteren Bindemodus, welcher den aktiven Rezeptorzustand widerspiegelt, als auch einen rein allosteren Bindemodus, welcher durch einen inaktiven Rezeptorzustand charakterisiert ist, einnehmen, was schließlich zu Partialagonismus führt. Die Stärke des resultierenden Partialagonismus hängt vom Verhältnis zwischen aktiver und inaktiver Rezeptorbesetzung ab. Auf Basis dessen wurden orthostere/orthostere Hybridverbindungen, bestehend aus einem Antagonisten, Atropin oder Scopolamin, und einem Agonisten, Iperoxo oder Isoxazol, die über eine Alkylkette unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft sind, synthetisiert, um mit deren Hilfe den Partialagonismus zu steuern (Abbildung 1). Abbildung 1: Strukturen der synthetisierten Iperoxo/Isoxazol-Atropin/Scopolamin-Hybride. Es wurden verschiedene quartäre sowie tertiäre Homodimere, welche entweder aus zwei Iperoxo-Einheiten oder aus zwei Acetylcholin-Einheiten bestehen, synthetisiert, um deren Ausmaß in Bezug auf Partialagonismus untersuchen zu können (Abbildung 2). Die beiden Agonisten wurden über unterschiedlich lange Alkylketten miteinander verknüpft. Bindungsstudien an CHO-hM2 Zellen der quartären Verbindungen zeigten, dass die Dimerisierung eines Agonisten zu einer verringerten Wirkstärke führt. Die Dimere von Iperoxo erreichten sowohl auf dem Gi- als auch auf dem Gs-Signalweg höhere Maximaleffekte als die Dimere von Acetylcholin. Neben der Wahl des orthosteren Bausteins (Wirkstärke des Agonisten) spielt auch die Länge der Alkylkette eine entscheidende Rolle für die Stärke des Partialagonismus. Abbildung 2: Strukturen der synthetisierten quart./tert. Iperoxo/Acetylcholin-Homodimere. Um weitere Partialagonisten zu entwickeln, wurden Chinolon-basierte Verbindungen, die mit dem Superagonisten Iperoxo oder mit dem endogenen Liganden Acetylcholin über eine Alkylkette mit unterschiedlicher Länge verknüpft sind, synthetisiert (Abbildung 3). FRET-Messungen bestätigen, dass es sich bei den Hybriden um M1-subtypselektive Substanzen handelt und das FRET-Signal von der Länge der Zwischenkette abhängig ist. Das stärkste positive FRET-Signal wurde mit der Verbindung Chinolon-C6-Iper erzielt, welches durch positive Kooperativität zwischen den beiden Liganden, Alloster und Orthoster, zustande kommt. Im Gegensatz zu den kurzkettigen Hybriden beobachtete man bei den langkettigen Hybriden ein inverses FRET-Signal, welches auf einen anderen Bindemodus zum Rezeptor hindeutet, z.B. könnte es sich um eine rein allostere Bindung handeln. Außerdem wurde die flexible Alkylkette durch einen starren Linker ersetzt, welches im Hybrid Chinolon-rigide-Iperoxo verwirklicht ist (Abbildung 3). FRET-Messungen dieser starren Hybridverbindung am M1-Rezeptor zeigten eine verzögerte FRET-Kinetik, welche vermutlich auf Wechselwirkungen zwischen dem starren Linker und dem aromatischen Deckel, der sich zwischen der orthosteren und der allosteren Bindestelle befindet, zurückzuführen ist. Es wird vermutet, dass das starre Hybrid bitopisch in den Rezeptor bindet. Um diese Annahme bestätigen zu können, müssten Mutationsstudien durchgeführt werden. Abbildung 3: M1-selektive Hybridverbindungen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war das Wirkstoffdesign und die Synthese von neuen Hybridverbindungen, die als Agonisten am M1- und am M2-Rezeptor sowie als Inhibitoren der AChE als auch der BChE im Hinblick auf die Alzheimer`sche Krankheit wirken sollen. Verschiedenartige Hybridverbindungen, bestehend aus unterschiedlichen pharmakophoren Gruppen (katalytische, aktive Seite: Phthalimid, Naphthalimid, Tacrin; periphere, anionische Seite: Iperoxo, Isoxazol), die über eine Polymethylenkette unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft sind, wurden synthetisiert. Tac-C10-Iper (Abbildung 4), bestehend aus Tacrin und dem Superagonisten Iperoxo, welche über eine C10 Polymethylenkette miteinander verknüpft sind, zeigte exzellente Anticholinesterase-Aktivitäten sowohl für die AChE (pIC50 = 9.81) als auch für die BChE (pIC50 = 8.75). Docking-Experimente lieferten ein Strukturmodell, welches die inhibitorische Aktivität in Bezug auf die AChE begründet. Zusätzlich zeigten die aus Tacrin bestehenden Hybride Affinität zum M1- als auch zum M2-Rezeptor. Solche Verbindungen, die mehr als ein Zielmolekül adressieren, sind für multifaktorielle Krankheiten, wie z.B. die Alzheimer`sche Krankheit, von Vorteil. Abbildung 4: Struktur der aktivsten Substanz in Bezug auf die Anticholinesterase-Aktivität. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass sowohl die Wahl des Pharmakophors, deren Verbindungsstelle als auch die Zusammensetzung, Länge und Flexibilität des Linkers eine große Rolle für die Aktivität der entwickelten bivalenten Verbindungen spielen. Kurzkettige Linker können im Gegensatz zu längeren Zwischenketten nicht beide Bindestellen gleichzeitig überbrücken. Andererseits können zu lange Zwischenketten unerwünschte sterische Wechselwirkungen hervorrufen. Weitere Untersuchungen in Bezug auf strukturelle Veränderungen der Hybridverbindungen, mit oder ohne quartäre Ammoniumgruppen, sind in Bezug auf die Arzneimittelentwicklung notwendig.   KW - Cholinesteraseinhibitor KW - Muscarinrezeptor KW - Ligand KW - GTP-bindende Proteine KW - dualsteric ligands KW - muscarinic acetylcholine receptor KW - cholinesterase inhibitors KW - receptors KW - coupled KW - gprotein KW - inhibitors KW - cholinesterase Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149007 ER - TY - THES A1 - Hebron Mwalwisi, Yonah T1 - Assessment of Counterfeit and Substandard Antimalarial Medicines using High Performance Thin Layer Chromatography and High Performance Liquid Chromatography T1 - Untersuchung der Qualität gefälschter Antimalaria-Medikamente mittels Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie und Hochleistungs-Flüssigchromatographie N2 - Although the prevalence of substandard and counterfeit pharmaceutical products is a global problem, it is more critical in resource-constrained countries. The national medicines regulatory authorities (MNRA) in these countries have limited resources to cater for regular quality surveillance programmes aimed at ensuring that medicines in circulation are of acceptable quality. Among the reasons explained to hinder the implementation of these strategies is that compendial monographs are too complicated and require expensive infrastructures in terms of environment, equipment and consumables. In this study it was therefore aimed at developing simple, precise, and robust HPLC and HPTLC methods utilizing inexpensive, readily available chemicals (methanol and simple buffers) that can determine the APIs, other API than declared one, and which are capable of impurity profiling. As an outcome of this study, three isocratic and robust HPLC and two HPTLC methods for sulfadoxine, sulfalene, pyrimethamine, primaquine, artesunate, as well as amodiaquine have been developed and validated. All HPLC methods are operated using an isocratic elution mode which means they can be implemented even with a single pump HPLC system and standard C18 columns. The densitometric sulfadoxine/sulfalene and pyrimethamine method utilizes standard TLC plates as well as inexpensive, readily available and safe chemicals (toluene, methanol, and ethyl acetate), while that for artesunate and amodiaquine requires HPTLC plates as well as triethylamine and acetonitrile due to challenges associated with the analysis of amodiaquine and poorly the detectable artesunate. These HPTLC methods can be implemented as alternative to those requiring HPLC equipment e.g. in countries that already have acquired densitometer equipment. It is understood that HPTLC methods are less sensitive, precise and accurate when compared to HPLC methods, but this hindrance can easily be addressed by sending representative samples to third party quality control laboratories where the analytical results are verified using compendial HPLC methods on a regular basis. It is therefore anticipated that the implementation of these methods will not only address the problem of limited resources required for medicines quality control but also increase the number of monitored targeted antimalarial products as well as the number of resource- constrained countries participating in quality monitoring campaigns. Moreover, the experiences and skills acquired within this work will be applied to other API groups, e. g. antibiotics, afterwards. N2 - Trotz der weltweiten Verbreitung gefälschter Arzneimittel und solcher, die nicht die deklarierte Menge an Wirkstoff enthalten, sind vor allem Entwicklungs- und Schwellenländer von dieser Problematik betroffen. Die Arzneimittelüberwachungs- bzw. Zulassungsbehörden dieser Länder verfügen nur über eingeschränkte Möglichkeiten, die Arzneimittelqualität regelmäßig zu überwachen und somit sicherzustellen, dass die im Markt befindlichen Medikamente eine gute Qualität aufweisen. Einer der Gründe hierfür ist unter anderem, dass die in Arzneibüchern beschriebenen Methoden oftmals sehr komplex sind und eine umfassende Laborausstattung, spezielle Geräte oder teure Chemikalien benötigen. In dieser Arbeit wurden einfache, genaue und robuste flüssigchromatographische Methoden entwickelt, die lediglich günstige, überall verfügbare Chemikalien (z. B. Methanol oder einfache Puffersalze) benötigen und mit denen der Gehalt des deklarierten Arzneistoffes, Arzneistoffverwechslungen sowie das Verunreinigungsprofil bestimmt werden kann. Es konnten drei isokratische, robuste flüssigchromatographische sowie zwei dünnschichtchromatographische Methoden zur Bestimmung von Sulfadoxin, Sulfalen, Pyrimethamin, Primaquin, Artesunat sowie Amodiaquin entwickelt und validiert werden. Alle flüssigchromatographischen Methoden arbeiten isokratisch, folglich können sie auch mit sehr einfachen HPLC-Geräten mit beispielsweise nur einem Pumpenkopf genutzt werden. Zudem werden nur einfache, kommerziell erhältliche C18-Säulen benötigt. Die densitometrischen Methoden für Sulfadoxin/Sulfalen sowie Pyrimethamin benötigen standardisierte Dünnschichtchromatographie-Platten sowie günstige, überall verfügbare und wenig toxische Chemikalien wie beispielsweise Toluol, Methanol oder Ethylacetat. Für die Methode zur Bestimmung von Artesunat und Amodiaquin werden Hochleistungsdünnschichtchromatographie-Platten und Triethylamin sowie Acetonitril benötigt. Dieser Umstand ist der Tatsache geschuldet, dass Amodiaquin und Artesunat sich anderweitig nur ungenügend trennen ließen. Die dünnschichtchromatographischen Protokolle können als Alternative zur HPLC eingesetzt werden, beispielsweise überall dort, wo bereits die entsprechenden Gerätschaften vorhanden sind. Natürlich weisen dünnschichtchromatographische Methoden im Vergleich zur Flüssigchromatographie eine geringere Sensitivität, Präzision und Richtigkeit auf, dies kann jedoch dadurch umgangen werden, die entsprechenden Methoden nur zum Screening zu verwenden und die zu analysierenden Proben anderweitig, z. B. in externen Laboratorien, detailliert zu untersuchen. Dort können beispielsweise Methoden aus gängigen Arzneibüchern verwendet werden. Durch die Implementierung der neu entwickelten Methoden kann zum einen das Problem schlecht verfügbarer Chemikalien umgangen werden und gleichzeitig die Anzahl an untersuchten Arzneimitteln erhöht werden. Dies ist ein wichtiger Beitrag zur Qualitätskontrolle in Ländern mit eingeschränkten Infrastrukturen. KW - Instrumentelle Analytik KW - Arzneimittel KW - Fälschung KW - Malaria KW - HPLC KW - Counterfeit Medicines KW - HPLC KW - Pharmaceutical Analysis KW - Impurity Profiling Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145821 ER - TY - THES A1 - Zilker, Markus T1 - The stability of finished pharmaceutical products and drug substances beyond their labeled expiry dates T1 - Die Stabilität von Fertigarzneimitteln und Wirkstoffen nach Ablauf des Verfalldatums N2 - Upon approval of a drug, the stability of the API and the FPP has to be studied intensively because it determines the shelf-life. If a drug is found to be stable, the expiry date is arbitrary set to five years at the maximum, if a drug tends to undergo degradation, the expiry date is set shorter. The drug product must comply with predefined specifications in accordance with the ICH guidelines Q6A and Q6B during its entire market life. The content of the active substance is required to be within a specification of 95–105% of its labeled claim until expiry corresponding to the ICH guideline Q1A(R2). However, there is little or scattered literature information addressing the stability of drug products beyond their expiry dates. The objective of this thesis was to study and assess the long-term stability of a collection involving numerous pure drug substances and ampoules manufactured in the 20th century. The content and the impurity profile were examined by means of appropriate analytical methods, mainly using liquid chromatography. The results were compared to data being available in the literature. Assessing the stability regarding the dosage form and the affiliation of the drug class was conducted. The experimental studies comprise the examination of 50 drug substances manufactured 20–30 years ago and 14 long expired ampoules which were older than 40 years in the time of analysis, exceeding many times the maximum shelf life of five years. For investigation of the solid drug substances, pharmacopoeial methods were applied as far as possible. Indeed, results of the study showed that 44 tested substances still complied with the specification of the Ph. Eur. with regard to the content and impurity profile, even after more than two decades of storage. For analysis of the injection solutions, HPLC-UV and HPLC-ESI/MS techniques were applied, commonly based on liquid chromatography methods of the Ph. Eur. for determination of related substances. Each method was further validated for its application to ensure accurate API quantification corresponding to ICH Q2(R1). Quite a few ampoules were identified to show surprisingly high stability. In spite of their age of 53–72 years, APIs such as caffeine, etilefrine, synephrine, metamizole sodium, furosemide, and sodium salicylate complied with the specified content that is valid nowadays, respectively. Nevertheless, typical degradation reaction, e.g. hydrolysis, oxidation, or isomerization, was observed in all remaining ampoules. Various degrees of hydrolysis were revealed for scopolamine, procaine, and adenosine triphosphate, the contents were decreased to 71%, 70%, and 15% of the declared concentrations, respectively. In the epinephrine and dipyridamole ampoules, oxidative degradation has been occurred, finding respective API contents of more or less 70%. For dihydroergotamine, excessive decomposition by epimerization was observed, resulting in an API content of 21% and degradation by isomerization was found in lobeline, still containing 64% of the labeled claim. In conclusion, supported by the data of the present studies and the literature, defining and authorizing a longer shelf-life may be applicable to numerous pharmaceuticals which should be considered by pharmaceutical manufacturers and regulatory authorities, if justified based on stability studies. A general extension of the shelf-lives of drug products and the abolishment or extension of the maximum shelf-life limit of five years would prevent disposing of still potent medications and save a lot of money to the entire health care system. N2 - Bei der Zulassung eines Arzneimittels muss die Stabilität sowohl des Wirkstoffes als auch des Fertigarzneimittels umfassend untersucht werden, da dies für die Festlegung der Haltbarkeit wesentlich ist. Wenn sich herausstellt, dass ein Arzneimittel stabil ist, wird das Verfallsdatum auf höchstens fünf Jahre festgelegt. Neigt ein Arzneimittel zum Abbau, so wird ein kürzeres Verfallsdatum gewählt. Das Arzneimittel muss innerhalb der Haltbarkeitsfrist definierten Spezifikationen entsprechen, welche in den ICH-Richtlinien Q6A und Q6B festgelegt sind. Dabei muss insbesondere der Wirkstoff-Gehalt des Arzneimittels gemäß der ICH-Richtlinie Q1A(R2) innerhalb der Spezifikation von 95–105 % der deklarierten Konzentration liegen. In der Literatur gibt es jedoch wenige Informationen darüber, wie stabil Arzneimittel lange nach Ablauf des Verfallsdatums sind. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Stabilität zahlreicher Feststoffe und Ampullen, die aus einer Altarzneimittel-Sammlung stammten und während des 20. Jahrhunderts hergestellt wurden, zu untersuchen und zu bewerten. Der Gehalt und das Verunreinigungsprofil wurden mittels geeigneter instrumenteller Analyseverfahren bestimmt, wobei hauptsächlich flüssigchromatographische Methoden zur Anwendung kamen. Die Untersuchungsergebnisse wurden mit Literaturdaten verglichen und es wurde eine Beurteilung der Stabilität in Abhängigkeit von der Darreichungsform und der Zugehörigkeit zu einer Arzneistoffklasse vorgenommen. Die experimentellen Studien umfassten die Untersuchung von 50 Feststoffen, die vor 20 bis 30 Jahren hergestellt worden waren, und 14 Alt-Ampullen, die ein Alter von mindestens 40 Jahre aufwiesen und damit die maximale Haltbarkeit von fünf Jahren um ein Vielfaches überschritten hatten. Zur Untersuchung der Feststoffe wurden meist Arzneibuchmethoden verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass 44 geprüfte Substanzen auch nach mehr als zwei Jahrzehnten hinsichtlich ihres Gehalts und Verunreinigungsprofils den jeweiligen Spezifikationen des Europäischen Arzneibuchs entsprachen. Zur Analyse der Alt Ampullen wurden HPLC-UV- und HPLC-ESI/MS-Techniken eingesetzt. Diese basierten häufig auf Arzneibuch-Methoden zur Prüfung auf verwandte Substanzen. Für die Gehaltsbestimmungen wurden entsprechend der ICH-Richtlinie Q2(R1) die erforderlichen Parameter validiert. Einige Ampullen zeigten eine überraschend hohe Stabilität des Wirkstoffs, trotz ihres Alters von 53 bis 72 Jahren. Dabei entsprachen die Wirkstoffe Koffein, Etilefrin, Synephrin, Metamizol Natrium, Furosemid und Natriumsalicylat dem heute gültigen Spezifikationsbereich von 95–105 %. Nichtsdestoweniger wurden bei einigen Ampullen typische Abbaureaktionen wie Hydrolyse, Oxidation oder Isomerisierung festgestellt. Die Hydrolyse der Arzneistoffe Scopolamin, Procain und Adenosintriphosphat führte zu verringerten Gehalten von 71 %, 70 % bzw. 15 % der jeweiligen gekennzeichneten Wirkstoffkonzentration. Die Epinephrin- und Dipyridamol-Injektionslösungen waren von oxidativem Abbau betroffen. Der Wirkstoffgehalt dieser Ampullen lag jeweils bei ca. 70 %. In der Dihydroergotamin Ampulle trat eine massive Epimerisierung auf, wobei ein Gehalt von 21 % bestimmt wurde. Aufgrund der Isomerisierung des Arzneistoffes Lobelin reduzierte sich der Wirkstoffgehalt auf 64 %. Als Schlussfolgerung der experimentellen Studien und der verfügbaren Daten aus der Literatur sollten die pharmazeutischen Unternehmer und die Aufsichtsbehörden erwägen, die Haltbarkeitsdauer für zahlreiche Arzneimittel zu verlängern, wenn dies basierend auf Stabilitätsuntersuchungen gerechtfertigt ist. Eine generelle Ausweitung der Verwendbarkeit von Arzneimitteln sowie die Abschaffung oder Erweiterung der maximalen Haltbarkeitsdauer von fünf Jahren würde die Entsorgung noch wirksamer Medikamente verhindern und dem Gesundheitssystem viel Geld einsparen. KW - Stabilität KW - Fertigarzneimittel KW - Wirkstoff KW - Chromatographie KW - Chemical stability KW - Shelf-life KW - Expiry date Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-180695 ER - TY - THES A1 - Skaf, Joseph T1 - Antileishmanial and antitrypanosomal compounds from \(Achillea\) \(fragrantissima\) T1 - Antileishmanien- und Antitrypanosomen-Wirkstoffe aus \(Achillea\) \(fragrantissima\) N2 - This PhD thesis is dealing with the bioassay-guided fractionation of a dichloromethane extract of the aerial parts of Achillea fragrantissima with the aim of isolation and structure isolation of the antileishmanial and/or antitrypanosomal principles in the plant. N2 - Diese Dissertation beschäftigt sich mit der aktivitätsgeleiteten Fraktionierung eines Dichlormethanextrakts aus den oberirdischen Teilen von Achillea fragrantissima mit dem Ziel der Isolierung und Strukturaufklärung der anti-leishmanialen und/oder anti-trypanosomalen Verbindungen der Pflanze. KW - Schafgarbe KW - Antitrypanosomal KW - Antitrypanosomen KW - Flavonoinds KW - Sesquiterpene lactones KW - Alkamides KW - Achillea Fragrantissima KW - Flavoniden KW - Sesquiterpenlactonen KW - Alkamiden KW - Arzneimittelforschung KW - Trypanosomen KW - Leishmania Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-167841 ER - TY - THES A1 - Kühnreich, Raphael T1 - Development and Validation of Methods for Impurity Profiling of Amino Acids T1 - Entwicklung und Validierung von Methoden für die Reinheitsanalytik von Aminosäuren N2 - The requirements for the impurity profiling of substances for pharmaceutical use have become greater over time. They can be accomplished by the use of modern instrumental analysis techniques, which have been evolved in the last decades. New types of columns with HILIC, mixed-mode and chiral stationary phases are suitable for the separation of all kinds of substances mixtures, that were previously hardly possible with the use of common reversed phase columns. Modern, almost universal detectors like CAD, ELSD and CNLSD can be applied for a sensitive detection of substances without a chromophore. However, in addition to some small individual disadvantages to these methods, the costs are high and applications are still kind of rare. Thus, the introduction of these devices at a broader level has not yet taken place. While this presumably will change over time, there is a need for methods that enable the impurity profiling of challenging substances with widespread analytics devices. Methionine is a substance with hydrophobic and hydrophilic impurities. With the help of a mixed-mode stationary phase, which is a combination of a reversed phase and a strong cationic exchanger, the separation of all putative impurities was found possible with good sensitivity and selectivity. The method requires apart from the column only standard isocratic HPLC equipment and was successfully validated. The evaluation of the enantiomeric purity of amino acids is challenging. Two approaches were made. The first method utilizes CE by means of in-capillary derivation with OPA and the subsequent separation with a cyclodextrin. With the use of OPA/NAC and γ-cyclodextrin, a simple and cost-effective method for the indirect enantioseparation of 16 amino acids was developed. With the second approach, racemic amino acids can be analyzed with HPLC and in-needle derivatization. For this, different columns and chiral thiols were evaluated and the chromatographic parameters were optimized. A method with OPA/NIBLC, a pentafluorophenyl column made the enantioseparation of 17 amino acids feasible. A LOQ of the minor enantiomer down to 0.04 % can be achieved with UV spectrophotometric detection. A similar method was developed for impurity profiling of L-amino acids. This can be used alternatively for the amino acid analysis performed by the European Pharmacopoeia. A simple, robust, precise and accurate method for the evaluation of impurities in glyceryl trinitrate solution was developed and validated. The four impurities of glyceryl trinitrate are separated by means of an acetonitrile-water gradient and the assay for this substance is also possible. N2 - Die Anforderungen an die Reinheitsanalytik von Substanzen für pharmazeutische Zwecke sind mit der Zeit größer geworden. Diese können durch die Verwendung von modernen instrumentellen Analysetechniken, die sich in den letzten Jahrzehnten entwickelt haben, erfüllt werden. Neue Arten von Säulen mit HILIC, mixed-mode und chiralen Phasen sind geeignet für die Trennung von allen möglichen Substanzgemischen, die vorher mit der Verwendung von gewöhnlichen Umkehrphasensäulen kaum möglich waren. Moderne, fast universelle Detektoren wie CAD, ELSD und CNLSD können für eine sensitive Detektion von Substanzen ohne Chromophor verwendet werden. Allerdings, neben ein paar individuellen Nachteilen von diesen Methoden, sind die Kosten sehr hoch und die Anwendungen noch eher selten. Daher haben sich diese Geräte noch nicht auf breiter Ebene durchgesetzt. Auch wenn sich das mit der Zeit ändern wird, gibt es die Notwendigkeit für Analysemethoden mit denen die Reinheitsanalytik von herausfordernden Substanzen auf verbreiteten analytischen Geräten ermöglicht wird. Methionin ist eine Substanz mit hydrophilen und hydrophoben Verunreinigungen. Mit der Hilfe einer „mixed-mode“-Phase, welche eine Kombination aus Umkehrphase und starker Kationenaustauscher ist, wurde die Trennung von allen mutmaßlichen Verunreinigungen mit guter Sensitivität und Selektivität ermöglicht. Die Methode benötigt abgesehen von der Säule nur eine normale isokratische HPLC und wurde erfolgreich validiert. Die Untersuchung der chiralen Reinheit von Aminosäuren ist anspruchsvoll. Zwei Ansätze wurden durchgeführt. Die erste Methode verwendet CE mittels In-Capillary- Derivatisierung durch OPA und der anschließenden Trennung mit Hilfe von einem Cyclodextrin. Durch den Gebrauch von OPA/NAC und γ-Cyclodextrin, wurde eine einfache und kosteneffektive Methode für die indirekte Enantioseparation von 16 Aminosäuren entwickelt. Mit dem zweiten Ansatz können Aminosäuren mittels HPLC und einer In-Needle- Derivatisierung analysiert werden. Dafür wurden verschiedene Säulen und chirale Thiole getestet und die chromatographischen Parameter optimiert. Eine Methode mit OPA/NIBLC, einer Pentafluorophenyl-Säule ermöglichte die Trennung on 17 Aminosäuren. Ein LOQ des kleinen Enantiomers von 0,04 % kann mit UV-spektroskopischer Detektion erreicht werden. Eine ähnliche Methode wurde für die Reinheitsanalytik von L-Aminosäuren entwickelt. Diese kann alternativ zur Aminosäurenanalyse im Europäischen Arzneibuch verwendet werden. Zusammenfassung 163 Eine einfache, robuste, präzise und richtige Methode zur Untersuchung der Verunreinigungen in Glyceryltrinitratlösung wurde entwickelt und validiert. Die vier Verunreinigungen von Glyceryltrinitrat werden mit Hilfe eines Acetonitril-Wasser-Gradienten getrennt und die Gehaltsbestimmung dieser Substanz ist ebenfalls möglich. KW - Aminosäuren KW - HPLC KW - Enantiomere KW - Trennung KW - amino acid KW - impurity profiling KW - chiral separation KW - Aminosäure KW - Reinheitsanalytik KW - chirale Trennung Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145718 ER - TY - THES A1 - Slopianka, Markus T1 - Evaluation von Gallensäuren als Biomarker für Lebertoxizität in der präklinischen Arzneimittelentwicklung T1 - Evaluation of Bile acids as Biomarkers for Liver Toxicity in Preclinical Drug Development N2 - Die Detektion Arzneimittel-induzierter Leberschädigung (engl. DILI – Drug induced liver injury) stellt eine Herausforderung in der präklinischen Entwicklung von Arzneistoffen dar. Die zur Verfügung stehenden konventionellen klinisch-chemischen Marker, wie Alanin-Aminotransferase (ALAT), Aspartat-Aminotransferase (ASAT) und Alkalische Phosphatase (APh), zeigen z. B. bei minimaler bis leichter Leberpathologie keine Veränderungen im Serum an und besitzen somit nur eine geringe Sensitivität für den frühzeitigen Nachweis einer Lebertoxizität. Des Weiteren besitzen klinisch-chemische Serummarker gleichzeitig eine geringe Spezifität und sind somit für die Differenzierung unterschiedlicher Lebertoxizitäten nur limitiert geeignet. Neben den beschriebenen diagnostischen Herausforderungen können u. a. auch histopathologische Befunde in der Leber, ohne eine Veränderung der klinisch-chemischen Serummarker auftreten und umgekehrt. Die Histopathologie ist als Goldstandard zwar spezifisch, als invasive Technik für eine Verlaufskontrolle in toxikologischen und klinischen Studien aber ungeeignet. In den vergangenen Jahren lieferten Studien zum Gallensäure-Profiling mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) mit Modellsubstanzen, die unterschiedliche Formen einer Lebertoxizität in Ratten induzierten Hinweise, dass individuelle Gallensäuren ein diagnostisches Potential für die Bewertung einer Leberschädigung besitzen. Ziel dieser Arbeit ist es, dass Gallensäure-Profiling in die vorgeschriebene Diagnostik der Lebertoxizität in der präklinischen Arzneimittelentwicklung zu implementieren und zu bewerten, ob diese Marker einen wertvollen Beitrag zur Charakterisierung einer Lebertoxizität leisten können. Hierzu wurde eine quantitative LC-MS/MS-Methode etabliert und validiert, die es ermöglicht, 20 verschiedene endogene Gallensäuren in Ratten zu analysieren. Die quantitative Analytik ermöglichte eine selektive Bestimmung von primären, konjugierten und sekundären Gallensäuren. Für die Quantifizierung der individuellen Gallensäuren wurden 2 MRM-Übergänge bestimmt. Zur Bestimmung des Arbeitsbereiches wurden 20 Referenzstandards von Gallensäuren verwendet. Eine Kalibrierung mit sieben Kalibrierpunkten in aufsteigender Konzentration wurde für die Bestimmung der endogenen Konzentrationen genutzt. Zur Kompensation des Matrixeffektes wurden 10 isotopenmarkierte interne Standards in die Analytik eingefügt. Die Reproduzierbarkeit laufender Messungen wurde durch eingefügte Qualitätskontrollen (QCs) in drei verschiedenen Konzentrationsbereichen überwacht. Es wurde ein Gallensäure-Profiling mittels LC-MS/MS im Plasma und Lebergewebe von Ratten, die mit verschiedenen Arzneimitteln behandelt wurden, durchgeführt. Histopathologische Zusammenfassung Untersuchungen konnten aufzeigen, dass sich in den Lebern von männlichen Ratten, die mit dem Arzneimittel Amitriptylin über 14 Tage behandelt wurden, eine makrovesikuläre Steatose in der Leber manifestierte. Die klassischen Serummarker, wie ALAT, ASAT und Gamma-Glutamyltransferase (γGT), konnten diese Art des Leberschadens nicht detektieren. Dagegen erhöhten sich die Konzentrationen Glycin-konjugierter Gallensäuren mit parallel absinkenden Konzentrationen von Taurin-konjugierten Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Ratten. Gleichzeitig ergaben sich signifikant erhöhte Konzentrationen der primären Gallensäuren CA und CDCA im Plasma behandelter Ratten. Andere Gallensäure-Profile konnten nach einer Methapyrilen-induzierten Leberzellnekrose mit hepatobiliärer Schädigung beobachtet werden. Nach einer 14-tägigen Behandlungsphase mit 80 mg/kg KG Methapyrilen, erhöhten sich die Konzentrationen von 11 Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Tiere. Gleichzeitig stiegen die Konzentrationen von allen 20 individuellen Gallensäuren im Plasma behandelter Ratten an. Zusätzlich zur quantitativen Analyse von Gallensäuren mittels LC-MS/MS wurde die Expression von Genen der Gallensäure-Biosynthese, des Gallensäure-Transports und die Regulation der Gallensäure-Homöostase mittels Multiplex-Analyse untersucht. Die erhöhte Expression von Genen für Efflux-Transporter der Multidrug Resistance-Related Protein (MRP)-Familie deutet auf einen gesteigerten Abtransport von Gallensäuren ins Blut hin und korrespondierte mit erhöhten Gallensäure-Konzentrationen im Plasma der behandelten Ratten. Des Weiteren wurden die Erkenntnisse der Gallensäure-Profile aus den tierexperimentellen Studien als Grundlage genutzt, um Arzneimittel-induzierte Lebertoxizität auf ein zellbiologisches In-vitro-System zu übertragen. Es wurden In-vitro-Experimente mit primären Rattenhepatozyten zwischen zwei Kollagenmatrices (Sandwich-Kultivierung) durchgeführt. Dieses etablierte System wird u. a. für Untersuchungen an hepatobiliären Transportsystemen (z. B. Bile Salt Export Pump, BSEP) genutzt. Das Gallensäure-Profiling in den Zellkulturüberständen belegt, dass die primären Hepatozyten konjugierte Gallensäuren bilden, dass sie bei einer Inkubation mit primären Gallensäuren diese verstoffwechseln und dadurch, neben den bereits vorhandenen Gallensäuren, weitere konjugierte Gallensäuren produzieren. Eine Exposition mit den Hepatotoxinen Troglitazon und Methapyrilen führte zu Veränderungen in der Gallensäure-Homöostase der Hepatozyten. In den In-vivo-Experimenten wurde eine Methapyrilen-induzierte Nekrose mit hepatobiliärer Schädigung in den behandelten Ratten festgestellt. Bei der Behandlung mit Methapyrilen ergaben sich starke Konzentrationsanstiege der Gallensäuren im Plasma (u. a. von GCA und TCA), die mit den histopathologischen Befunden korrelierten. Anhand dieser Daten und der Zusammenfassung pharmakokinetischen Eigenschaften von Methapyrilen wurde ein Studiendesign für Rattenhepatozyten in Sandwich-Kulturen entwickelt, um eine initiale Abschätzung der Konzentrationsveränderungen von Gallensäuren im In-vitro-Testsystem durchzuführen. Ab Tag 8 der Behandlung kam es zu einem erhöhten Anstieg der GCA- und TCA-Konzentrationen im Zellkulturmedium. Daher besitzt das In-vitro-Testsystem möglicherweise das Potential, tierexperimentelle Studien bei der Bewertung einer Hepatotoxizität zu unterstützen oder sogar zu reduzieren. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse aus dieser Arbeit, dass Gallensäure-Profiling in männlichen und weiblichen Ratten eine geeignete Methode zur Detektion und Differenzierung von Leberschäden ist. Die Technologie ist flexibel einsetzbar und kann bereits etablierte Testverfahren, wie die Bestimmung von Serummarkern in der Klinischen Chemie und die Histopathologie unterstützen. Damit besitzt das Gallensäure-Profiling das Potential, die Bewertung beim Nachweis und bei der Charakterisierung einer Lebertoxizität im Rahmen der Evaluierung von präklinischen Arzneimittelkandidaten zu verbessern. N2 - Drug-induced liver injury (DILI) remains a significant challenge in preclinical drug development. Nonclinical studies provide an opportunity to correlate the biochemical and morphological findings; however, liver injury is often complex and heterogeneous, confounding the ability to relate biochemical changes to specific, histopathological patterns of liver injury. The diagnostic performance of the available hepatobiliary markers, such as alanine aminotransferase (ALAT), aspartate aminotransferase (ASAT) or alkaline phosphatase (APh), for specific manifestations of liver injury, is often limited and insensitive, e.g. minimal to slight liver pathology might not result in changes to the serum marker. Furthermore, histopathological findings in the liver can occur without there being significant changes in the serum markers and vice versa. Although histopathology is the gold standard, its invasive nature makes it unsuitable for monitoring liver injury in toxicological and non-clinical studies. In recent years, study results of bile acid profiling, using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), indicated diagnostic potential regarding the detection of hepatotoxicity. This work aims to establish bile acid profiling in preclinical drug development and to demonstrate that bile acids can provide a valuable contribution to characterizing liver injury in preclinical safety diagnostics. For this purpose, a quantitative LC-MS/MS method was established and validated, in order to analyze 20 different endogenous bile acids in rats. The quantitative analysis enabled the selective determination of primary, conjugated and secondary bile acids. 2 MRM-transitions for qualitative and quantitative analysis were used for the quantification of the individual bile acids. Twenty bile acid reference standards were used for the calibration range. A seven-point calibration, in ascending concentration, was performed to quantify the absolute endogenous bile acid concentrations. Ten isotopically labeled internal standards were employed in the analyses to compensate for matrix effects. The reproducibility of the current measurements was monitored by quality controls (QCs) inserted into three different concentration ranges. Bile acid profiling was performed by LC-MS/MS of plasma and liver tissue of rats that had been treated with different hepatotoxins. The results of the bile acid profiling and histopathological evaluation revealed correlation between bile acid profiles and histopathological graded liver toxicity, e.g., the quantitative analysis and histopathological examination showed that macrovesicular steatosis was induced in the livers of male rats which had been treated with amitriptyline for 14 days. Classic serum markers, such as ALAT, ASAT, and gamma-glutamyltransferase (γGT), were unable to detect this specific manifestation of liver injury. In contrast, the concentrations of glycine-conjugated bile acids Summary increased while there was a parallel decrease in the levels of taurine-conjugated bile acids in the treated rats’ liver tissue. At the same time, there was a significant increase in the concentration of primary bile acids, CA and CDCA, in plasma of treated rats. Different bile acid profiles were observed following methapyrilene-induced liver cell necrosis with hepatobiliary damage. After a 14-day treatment phase with 80 mg/kg body weight methapyrilene, the concentrations of 11 bile acids increased in liver tissue of treated animals. At the same time, the levels of all 20 individual bile acids increased in plasma of treated rats. In addition to the quantitative analysis of bile acids with LC-MS/MS, the expression of specific genes associated with bile acid biosynthesis, and the transport and regulation of bile acid homeostasis, was analyzed using multiplex analysis of targeted mRNA. The increased expression of efflux transporter genes belonging to the multidrug resistance-related protein (MRP) family, indicated an increase in the efflux transport of bile acids into blood, and corresponded to increased bile acid concentrations in the plasma of treated rats. Furthermore, bile acid profiles originated from the animal studies, were used as reference to evaluate bile acid profiles regarding liver toxicity on a liver cell-based biological system. In vitro experiments were performed using primary rat hepatocytes between two collagen matrices (sandwich cultivation). This traditional in vitro model is used to study of hepatobiliary transport alterations (e.g., Bile Salt Export Pump, BSEP). Bile acid profiling of the cell culture supernatants demonstrated that the primary hepatocytes produced conjugated bile acids. Incubation with primary bile acids resulted in an improvement of the in vitro system by producing conjugated bile acids, in addition to those already existed. Exposure to troglitazone and methapyrilene resulted in changes in the hepatocytes’ bile acid homeostasis. In the in vivo experiments, methapyrilene treatment induced necrosis and hepatobiliary damage in the treated rats. There was a substantial increase in the concentration of plasma bile acids in the methapyrilene treatment group (including GCA and TCA), which correlated with the histopathological findings. Based on these data and the pharmacokinetic properties of methapyrilene, a study design was developed that used rat hepatocytes in sandwich cultures to provide an initial estimate of bile acid concentration changes in the in vitro test system. There was an increase in GCA and TCA concentrations in the cell culture medium from day 8 of the methapyrilene treatment. Therefore, the in vitro test system may have the potential to support or even reduce animal studies for evaluating hepatotoxicity. Bile acid profiling in male and female rats is a suitable method for detecting and differentiating liver injury. The technology can be used flexibly and can support already established test procedures, such as the determination of serum markers in clinical chemistry and histopathology. Summary Thus, bile acid profiling has the potential to fill the gap in the detection and characterization of hepatotoxicity, as part of the evaluation of preclinical drug candidates. KW - Hepatotoxizität KW - Biomarker KW - Gallensäuren KW - UHPLC-ESI-MS/MS KW - Biomarker KW - Gallensäuren KW - UHPLC KW - Lebertoxizität KW - Instrumentelle Analytik Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204627 ER - TY - THES A1 - Theiss, Christiane T1 - Qualitative Charakterisierung polydisperser Macrogole sowie strukturell verwandter Hilfsstoffe mittels HPLC-CAD T1 - Qualitative characterization of polydisperse macrogols and related excipients with HPLC-CAD N2 - The class of macrogols and macrogol-based excipients, i.e. macrogol fatty alcohol ethers, macrogol fatty acid esters, and polysorbates, plays an important role in modern galenic formulations. Formerly used as simple emulsifiers, they are nowadays utilized in fields such as targeted drug release to increase bioavailability, and as solubilizers for complex systems. For these multifaceted applications, and regarding the polydisperse structures of the macrogols, a reproducible and significant analytical procedure is required. For the characterization of excipients, the European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) provides some compendial protocols which are able to describe the number of functional groups present in the substance. Some examples of these bulk parameters are the hydroxyl value, the iodine value, the peroxide value, or the acid value. Thus, these bulk parameters allow an overview of the average molar weight or possible degradation processes (e.g. autoxidation), but they provide no further information about the polymeric distribution which can heavily depend on the manufacturing process. Furthermore, bulk parameter investigations are very time-consuming and prone to errors due to their stringent reaction processes and numerous reaction steps. Since several years, the HPLC has been the gold standard of pharmaceutical analytics particularly due to the fact of automation. Coupled to UV detection, it offers the opportunity for a quick, easy, and robust analysis for many drugs. In the field of excipients, the development progress of HPLC-analysis is much slower due to the fact that most excipients lack a UV-chromophore. The application of the highly sensitive mass spectrometry would be eligible for detection but is rather complex and expensive. However, the development of the aerosol-based detectors such as the ELSD (evaporative light scattering detection), the CAD (charged aerosol detection), and the NQADTM (nano quantity aerosol detection) enables the application of HPLC for analyzing non-chromophoric substances. This work aimed to develop a generic HPLC-CAD method to analyze a wide range of macrogols and macrogol-based excipients. The separation was performed on a C18-column. A gradient method was developed based upon several linear gradient steps in order to be able to separate the different chain lengths. The mobile phases were water and acetonitrile, respectively, to which 0.1% formic acid was added. Macrogols in the average size range of PEG 300 to PEG 3000 were separated with acceptable resolution. The separation results were verified by mass spectrometry for PEG 300 - 1500. Five saturated and two non-saturated fatty acids, as well as two fatty alcohols of different chain lengths were successfully separated. 13 macrogol-based excipients were analyzed with the developed method and separated successfully. The macrogol fatty alcohol ethers, macrogol stearates, and polysorbates were separated to sufficient extent to analyze the polymeric distribution. The free PEGs in the excipients were separated and identified. Based on these free PEGs, different manufactural processes could be determined. Depending on the average chain lengths of the processed PEGs, the free fatty acids or alcohols could be identified and separated from the esters or ethers, respectively. For the smaller average chain lengths, the free fatty acids and alcohols coeluted with the esters and ethers. Macrogol glycerol hydroxy stearate (Cremophor® RH40) was separated into its components except for the linear monoesters which partially coeluted with the free PEGs, and the glycerol triesters which showed effects of size exclusion. The developed method was also used for stability tests of the non-saturated fatty acids, i.e. oleic and linoleic acid. Here, the fatty acid solutions were chemically (hydrogen peroxide) and thermally (60 °C) stressed and analyzed after different time spans. A time and temperature dependent degradation was observed. An assignment of some degradation products was performed by determining the m/z values with mass spectrometry. The method proved to be capable of separating the degradation products of the main substance and allows to estimate the dimension of degradational processes and partly identify the structures of the degradational products. In general, the provided method offers a good basis for analyzing and characterizing a wide field of substance classes. It provides an extension of bulk parameters (e.g. hydroxyl value) with a reduction of analytical effort. It offers a good starting point for more specific observations such as long-term stability or other related substance classes. N2 - Der Gruppe der Macrogole sowie den darauf basierenden Abkömmlingen, den Macrogolfettalkoholethern, Macrogolfettsäureestern und Polysorbaten, kommt in der modernen Galenik eine wichtige Rolle zu. Dienten sie vormals nur als gewöhnliche Emulgatoren, so finden sie heutzutage vor allem im Bereich der gezielten Wirkstofffreisetzung, der Erhöhung der Bioverfügbarkeit sowie als Löslichkeitsvermittler komplexer Systeme Anwendung. Diese vielschichtigen Anwendungsgebiete erfordern, auch aufgrund der polydispersen Strukturen der Macrogole, eine reproduzierbare und aussagekräftige Analytik. Das Europäische Arzneibuch (Ph. Eur.) bietet zur Charakterisierung der Hilfsstoffe eine Handvoll Messgrößen, die sog. Fettkennzahlen, die eine Größenordnung vorhandener funktioneller Gruppen liefern. Zu diesen gehören Werte wie Hydroxylzahl, Iodzahl, Peroxidzahl oder Säurezahl. Diese bieten zwar einen Überblick über den Größenbereich der mittleren Kettenlängen oder einen möglichen Abbau der Strukturen, beispielsweise durch Autoxidation, jedoch geben sie keine Auskunft über die Polymerverteilung. Insbesondere diese kann jedoch, je nach Herstellungsweise, stark variieren. Außerdem ist die Methodik der Fettkennzahlenbestimmungen aufgrund der strikten Reaktionsabläufe und zahlreicher Reaktionsschritte einerseits sehr zeitaufwändig und andererseits anfällig für Fehler. Die HPLC hat, insbesondere aufgrund der Automation, bereits seit Jahren den Status des Goldstandards in der pharmazeutischen Analytik inne. Gekoppelt mit der UV-Detektion bietet sie für zahlreiche Wirkstoffe die Möglichkeit zur schnellen, einfachen und robusten Analyse. Im Bereich der Hilfsstoffe verbreitet sich die HPLC-Analytik langsamer, da viele Hilfsstoffe keinen Chromophor aufweisen. Eine Anwendung der hochsensitiven Massenspektrometrie wäre zwar zur Detektion geeignet, würde sich für die Routineanwendung jedoch als zu komplex und kostenintensiv gestalten. Doch mit der Entwicklung der Aerosol-basierten Detektoren wie dem ELSD (evaporative light scattering detector), dem CAD (charged aerosol detector) und dem NQADTM (nano quantity aerosol detector) wurde auch für nicht-chromophore Substanzen ein Einsatz der HPLC möglich. Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Entwicklung einer HPLC-CAD-Methode, die eine möglichst große Bandbreite der Macrogole und der darauf basierenden Hilfsstoffe erfassen kann. Die Trennung erfolgte an einer C18-Trennsäule. Es wurde eine Gradienten-Methode entwickelt, die aus mehreren linearen Gradientenstufen zusammengesetzt wurde, um verschiedene Kettenlängen der Polymere besser voneinander zu trennen. Als mobile Phasen dienten Wasser und Acetonitril, denen jeweils 0.1 % Ameisensäure zugesetzt wurden. Es konnten Macrogole im Bereich PEG 300 bis PEG 3000 mit akzeptabler Auflösung aufgetrennt werden. Diese Ergebnisse wurden für PEG 300 – 1500 mittels Massenspektrometrie verifiziert. Es konnten fünf gesättigte und zwei ungesättigte Fettsäuren, sowie zwei Fettalkohole verschiedener Kettenlängen voneinander getrennt werden. Es wurden 13 Macrogol-basierte Hilfsstoffe mit der entwickelten Methode untersucht und erfolgreich getrennt. Die Macrogolfettalkoholether, -stearate und Polysorbate wurden insoweit aufgetrennt, dass die Polymerverteilung beobachtet werden konnte. Freie PEGs in den Hilfsstoffen wurden getrennt und identifiziert. Anhand dieser konnten unterschiedliche Herstellungsweisen zugeordnet werden. Abhängig von der mittleren Kettenlänge der verarbeiteten PEGs konnten teilweise die freien Fettsäuren bzw. -alkohole von den Estern bzw. Ethern getrennt und identifiziert werden. Im Bereich der kürzeren mittleren Kettenlängen wurden die freien Fettsäuren und -alkohole von den Estern und Ethern überlagert. Macrogolglycerolhydroxystearat (Cremophor® RH40) wurde in seine Komponenten aufgetrennt, mit Ausnahme der linearen Monoester, die mit den freien PEGs partiell koeluierten und die Glyceroltriester, die Größenausschlusseffekte zeigten. Die Methode wurde für Stabilitätsuntersuchungen der ungesättigten Fettsäuren, Öl- und Linolsäure, eingesetzt. Hierzu wurden diese Säuren in Lösung chemisch (Wasserstoffperoxid) und thermisch (60 °C) gestresst und in bestimmten Zeitabständen analysiert. Es zeigte sich ein zeit- und temperaturabhängiger Abbau. Die teilweise Zuordnung der Abbauprodukte erfolgte durch Bestimmung des m/z mittels Massenspektrometrie. Die Methode war geeignet, um das Ausmaß eines oxidativen Abbaus von der Hauptsubstanz zu trennen und strukturell einzuordnen. Generell bietet die Methode eine gute Basis, die eine Vielzahl an Substanzgruppen erfassen und charakterisieren kann. Sie bietet eine Ergänzung der Fettkennzahlen, die einen verringerten Arbeitsaufwand mit sich bringt. Für spezifischere Betrachtungen (Langzeitstabilität, verwandte Substanzgruppen) stellt sie einen guten Ausgangspunkt dar. KW - HPLC KW - Macrogol KW - Pharmazeutischer Hilfsstoff KW - Charged Aerosol Detection KW - Excipients KW - Pharmacy KW - Chromatographie KW - Macrogole KW - Hilfsstoffanalytik Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179274 ER - TY - THES A1 - Munz, Martin Reinhold T1 - Individualization of drug therapy considering pharmacokinetic and clinical factors T1 - Individualisierung der Arzneimitteltherapie anhand pharmakokinetischer und klinischer Faktoren N2 - In the „Position Paper of the Division of Clinical Pharmacy of the German Pharmaceutical Society (DPhG)” clinical pharmacy is defined as the science and practice of the rational use of drugs1, which includes the individualization of drug therapy. Clinical pharmacists therefore need a profound knowledge of the pharmacokinetic properties of relevant drugs, and clinical factors that are influencing these properties. Against the background of individualizing drug therapy, pharmacokinetic and clinical factors are studied in this thesis. In order to obtain an overview of the existing data on the pharmacokinetics of imipenem / cilastatin and meropenem in critically ill patients, a literature review for each of these carbapenem antibiotics was performed. These reviews included studies in critically ill patients as well as studies in healthy volunteers. While the reported results of studies in healthy volunteers had a small variability, studies in critically ill patients show significant differences in the resulting pharmacokinetics. These differences were not only between, but also within these studies, resulting in a high variability of the pharmacokinetic parameters of the carbapenems in critically ill patients. Furthermore, the results of studies in critically ill patients indicate that clinical factors and in particular renal function have different effects on the pharmacokinetics of imipenem and cilastatin. A therapeutic drug monitoring (TDM) program for antibiotics was initiated in an intensive care unit. The calculation of the pharmacokinetics of imipenem / cilastatin and meropenem was carried out with a population pharmacokinetic approach (POP-PK) and in addition with a non-compartmental approach (NCA). The POP-PK analysis showed that the pharmacokinetics of imipenem and cilastatin could be described adequately with a 1-compartment model. The resulting mean total body clearance (CL) of imipenem and cilastatin was 11.6 L/h (4.24 to 27.5) and 6.14 L/h (0.520 to 26.6 L/h). The nonrenal clearance was estimated to be 5.30 L / h (24.9% CV) for imipenem and 0.138 L / h (33.3% CV) for cilastatin. The results of the NCA were in good agreement with the results of the POP-PK approach, as the NCA resulted in an imipenem clearance of 15.5 ± 7.3 L / hr and cilastatin clearance of 10.1 ± 9.9 L / h. The individual clearances resulting from the different pharmacokinetic approaches were in good correlation showing correlation coefficients (r) of 0.882 (p <0.001) and 0.908 (p <0.001) for imipenem and cilastatin. In summary, this study identified and quantified significant differences between the individual clearance mechanisms of imipenem and cilastatin. This is particularly true for patients with impaired renal function and sepsis. As imipenem / cilastatin is only available in a fixed dose combination, those patients might be treated inadequately with this combination. The great variability in the pharmacokinetics of imipenem and cilastatin in septic patients underscores the importance of a TDM program of both substances. For meropenem, a PK/PD model was developed that predicts the concentration gradients of meropenem, serum creatinine, C-reactive protein and procalcitonin simultaneously. A non-linear relationship between the clearance of creatinine and meropenem was identified and the resulting equation for the calculation of the total body clearance of meropenem (for a 70 kg patient) was: 0.480 L/h + 9.86 L/h. (CLCR/6L/h)0.593, with 0.480 L/h representing the nonrenal clearance of meropenem. The resulting mean meropenem clearance of the NCA was 11.9 ± 8.7 L/h. The individual clearances resulting from the different pharmacokinetic approaches were poorly correlated showing a correlation coefficient (r) of 0.502 (p <0.001). In summary, this study showed a non-linear relationship of meropenem clearance and creatinine clearance. The model shows that the renal function may change rapidly and to a significant extent in patients with sepsis and septic shock, which in turn, underscores that creatinine concentrations are not in steady state in these patients. Conversely, dose adjustment based on creatinine values might lead to inappropriate therapy. This underlines the importance of a TDM program for meropenem in critically ill patients. The two most important considerations when choosing an antibiotic for the prophylaxis of postoperative bone infections are its activity against the whole spectrum of bacteria, which might be involved in bone infections, and its ability to penetrate bone tissue and thus to achieve concentrations above the minimum inhibitory concentration (MIC) of the corresponding pathogens. In order to gain information on this data, a study was conducted which investigated the pharmacokinetics of ampicillin / sulbactam in plasma, cortical and cancellous bone. Pharmacokinetic parameters in plasma were determined using NCA. The bone penetration represents the ratio of the concentration in the bone tissue to plasma concentration at the time of bone removal. The resulting half-life of ampicillin and sulbactam in plasma was 1.60  0.37 h and 1.70  0.42 h. The elimination of both substances was in a good correlation with creatinine clearance and resulted in correlation coefficients (r) of 0.729 (p = 0.003) for ampicillin and 0.699 (p = 0.005) for sulbactam. The mean clearance and the mean volume of distribution of ampicillin and sulbactam were 10.7  3.9 and 10.3  3.3 L/h, and 23.9  7.9 and 24.3  6.8 L. The mean concentrations of ampicillin in the cortical and cancellous bone were 6.60  4.22 and 10.15  7.40 µg/g, resulting in bone penetration ratios of 9.1  5.7 and 16.2  16.9 %. For sulbactam the corresponding concentrations were 3.91  2.52 and 5.73  4.20 µg/g, resulting in bone penetration ratios of 10.6  6.3 and 17.5  16.1 %. In summary, this study shows that the bone penetration of both substances is on average rather unsatisfactory and has a high variability, which can lead to inadequate bone concentrations for the prophylaxis of bone infections. One factor that could be identified for the penetration of both substances into cancellous bone was the period between the application of the drug and the removal of the bone. Therefore, a time interval between the administration of the antibiotic and the incision should be considered. Immunosuppression is a risk factor for the development of various malignancies, including hematologic diseases. While the relationship between the use of immunosuppressive therapy with methotrexate and the development of an Epstein-Barr virus (EBV) associated lymphoproliferative disease (LPD) has been well established, this connection is less evident for immunosuppressive therapy with azathioprine. The patient presented by us was immunosuppressed with azathioprine for autoimmune hepatitis. The development of an EBV-associated Hodgkin-like lymphoma under this immunosuppressive therapy and especially the regression of the lymphoma after cessation of azathioprine confirms the relationship between this immunosuppressant, EBV-infection and the development of Hodgkin-like lymphoma. Therefore, albeit in rare cases, azathioprine-related lymphomas may respond to mere cessation of immunosuppressive therapy without need for chemotherapy. Apart from viral infections, drugs are a major cause of acute liver failure. Due to the lack of specific symptoms or tests, it is difficult to diagnose a drug-induced liver injury. We report a case of a young patient in whom different antibiotics, the analgesic and antipyretic acetaminophen or a combination of these drugs may have led to DILI resulting in life-threatening ALF. Based on this case report, we describe a procedure to exclude non-drug related causes and discuss the hepatotoxic potential of the involved drugs in this case. N2 - Im Positionspapier der Fachgruppe für Klinische Pharmazie der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft (DPhG) wird Klinische Pharmazie als Wissenschaft und Praxis vom rationalen Arzneimitteleinsatz definiert1. Dies schließt auch die Therapie- und Dosisindividualisierung ein. Grundlage hierzu sind profunde Kenntnisse insbesondere der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Arzneimittels, sowie klinischer Faktoren, welche diese beeinflussen. In dieser Dissertation werden pharmakokinetische und klinische Einflussfaktoren untersucht, welche als Entscheidungsgrundlage für eine Dosis- und Therapie- Individualisierung dienen können. Um einen Überblick über bereits existierende Daten zur Pharmakokinetik der Carbapenem-Antibiotika Imipenem / Cilastatin und Meropenem bei kritisch kranken Patienten zu erhalten, wurde für beide Carbapeneme eine Literaturübersicht erstellt, welche sowohl Studien an kritisch kranken Patienten, als auch an gesunden Probanden einbezieht. Während die Studien an gesunden Probanden zu relativ ähnlichen Ergebnissen bei den pharmakokinetischen Parametern führten, ergaben die Studien an kritisch kranken Patienten zum Teil erhebliche Unterschiede in der resultierenden Pharmakokinetik. Diese Unterschiede zeigten sich nicht nur zwischen, sondern auch innerhalb der Studien, was in einer hohen Variabilität der pharmakokinetischen Parameter bei kritisch kranken Patienten resultierte. Des Weiteren deuten die Ergebnisse der Studien an Patienten mit eingeschränkter Nierenfunktion darauf hin, dass klinische Faktoren wie insbesondere die Nierenfunktion, einen unterschiedlichen Einfluss auf die Pharmakokinetik von Imipenem und Cilastatin haben, welche ausschließlich in fixer Kombination verabreicht werden. Im Folgenden wurde die Pharmakokinetik von Imipenem und Cilastatin bei kritisch kranken Patienten untersucht, deren Imipenem / Cilastatin Blutspiegel im Rahmen eines Therapeutischen Drug Monitoring (TDM) Programms bestimmt wurden. Die Berechnung der Pharmakokinetik erfolgte hier sowohl mit einem populationspharmakokinetischen Ansatz (POP-PK), als auch mit einer nicht-kompartimentellen Analyse (NCA). Die POP-PK Analyse ergab, dass die Pharmakokinetik beider Substanzen mit einem 1-Kompartiment Modell hinreichend beschrieben werden kann. Für die Gesamt-Clearance (CL) ergaben sich Werte von 11.6 L/h (4.24 – 27.5) für Imipenem und 6.14 L/h (0.520 – 26.6) für Cilastatin. Für die nicht-renale Clearance ergab sich ein Wert von 5.30 L/h (24.9% CV) für Imipenem und 0.138 L/h (33.3% CV) für Cilastatin. Die Ergebnisse der NCA waren in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen des POP-PK Ansatzes. Für die Clearance von Imipenem und Cilastatin ergaben sich hier 15.5 ± 7.3 L/h bzw. 10.1 ± 9.9 L/h. Aus der Korrelation der Clearances beider PK-Analyse-Methoden ergaben sich Korrelationskoeffizienten (r) von 0.882 (p<0.001) und 0.908 (p<0.001) für Imipenem bzw. Cilastatin. In Zusammenfassung identifizierte diese Untersuchung deutliche Unterschiede der einzelnen Clearance-Mechanismen von Imipenem und Cilastatin und quantifizierte diese. Diese Unterschiede kommen bei Patienten zum Tragen, deren Nierenfunktion eingeschränkt ist, insbesondere wenn diese Patienten septisch sind. Die große Variabilität der Pharmakokinetik von Imipenem und Cilastatin bei septischen Patienten unterstreicht die Bedeutung eines TDM-Programms beider Substanzen. Bei Patienten mit stark beeinträchtigter Nierenfunktion kann die Verwendung der fixen Kombination von Imipenem / Cilastatin aufgrund der unterschiedlichen Pharmakokinetik ungeeignet sein. In einem gesonderten Ansatz wurde die Pharmakokinetik von Meropenem bei kritisch kranken Patienten untersucht, deren Meropenem Blutspiegel ebenfalls im Rahmen des genannten TDM-Programms bestimmt wurden. Wie bei Imipenem / Cilastatin erfolgte die pharmakokinetische Analyse hier ebenfalls zuerst mit einem POP-PK Ansatz, der dann mit einem NCA-Ansatz nachvollzogen wurde. Für Meropenem wurde ein PK/PD-Modell entwickelt, welches gleichzeitig die Konzentrationsverläufe von Meropenem, Serumkreatinin, C-reaktivem Protein und Procalcitonin vorhersagt. Dadurch konnte ein nicht-linearer Zusammenhang zwischen der Clearance von Meropenem und Kreatinin identifiziert werden. Die Gesamt-Clearance von Meropenem (für einen 70 kg Patienten) lässt sich anhand des Modells abschätzen nach: 0.480 L/h + 9.86 L/h . (CLCR/6 L/h)0.593, wobei 0.480 L/h die nicht-renale Clearance von Meropenem repräsentiert. Der NCA-Ansatz ergab eine Meropenem Clearance von 11.9 ± 8.7 L/h, wobei die Korrelation zum POP-PK Ansatz mit einem Korrelationskoeffizienten (r) von 0.502 (p<0.001) wesentlich schwächer war, als bei Imipenem und Cilastatin. In Zusammenfassung zeigte diese Untersuchung einen nicht-linearen Zusammenhang der Meropenem-Clearance und der Kreatinin-Clearance. Das entwickelte Modell zeigt, dass sich die Nierenfunktion bei Patienten mit Sepsis und septischem Schock rapide und in erheblichem Ausmaß verändern kann, was wiederum dazu führt, dass sich die Kreatinin-Konzentrationen bei diesen Patienten in keinem Steady-State-Zustand befinden. Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass eine Dosisanpassung anhand der Kreatinin-Werte zu einer inadäquaten Therapie führen kann. Dies unterstreicht die Bedeutung eines TDM-Programms für Meropenem bei kritisch kranken Patienten. Die zwei bedeutsamsten Überlegungen bei der Auswahl eines Antibiotikums zur Prophylaxe einer postoperativen Knocheninfektion sind dessen Aktivität gegen das in Frage kommende Erregerspektrum, sowie die Fähigkeit des Antibiotikums Gewebe und insbesondere Knochengewebe zu penetrieren und damit Konzentrationen zu erreichen, welche über der minimalen Hemm-Konzentration (MHK) entsprechender Erreger liegen. Um eine Entscheidungsgrundlage für diese Fragestellung zu liefern, wurde eine Untersuchung durchgeführt, bei der die Pharmakokinetik von Ampicillin / Sulbactam in Plasma, kortikalem und spongiösem Knochen untersucht wurde. Die pharmakokinetischen Parameter im Plasma wurden dabei mittels einer nicht-kompartimentellen Analyse bestimmt. Die Knochenpenetration stellt das Verhältnis der Konzentration im Knochengewebe zur Konzentration im Plasma zum Zeitpunkt der Knochenentnahme dar. Im Plasma ergab sich eine Halbwertszeit von 1.60  0.37 h für Ampicillin und 1.70  0.42 h für Sulbactam. Die Elimination beider Substanzen war damit in einer guten Korrelation mit der Kreatinin-Clearance, was in Korrelationskoeffizienten (r) von 0.729 (p=0.003) für Ampicillin und 0.699 (p=0.005) für Sulbactam resultierte. Die mittlere Clearance und das mittlere Verteilungsvolumen von Ampicillin bzw. Sulbactam waren 10.7  3.9 bzw. 10.3  3.3 L/h, und 23.9  7.9 bzw. 24.3  6.8 L. Die mittleren Konzentrationen von Ampicillin im kortikalen und spongiösen Knochen waren 6.60  4.22 und 10.15  7.40 µg/g, was in einer Knochenpenetration von 9.1  5.7 und 16.2  16.9 % resultierte. Für Sulbactam betrugen die entsprechenden Konzentrationen 3.91  2.52 und 5.73  4.20 µg/g, was in einer Knochenpenetration von 10.6  6.3 und 17.5  16.1 % resultierte. In Zusammenfassung zeigt diese Untersuchung auf, dass die Knochenpenetration beider Substanzen im Mittel eher ungenügend ist und eine hohe Variabilität besitzt, wodurch es zu inadäquaten Knochenkonzentrationen kommen kann. Ein Faktor, der zumindest für die Penetration in den spongiösen Knochen identifiziert werden konnte, war die Zeitspanne zwischen der Applikation und der Entnahme des Knochens, was eine Administration des Antibiotikums in zeitlichem Abstand zur Inzision sinnvoll erscheinen lässt. Immunsuppression ist ein Risikofaktor für die Entwicklung verschiedener maligner Erkrankungen inklusive hämatologischer Erkrankungen. Während der Zusammenhang zwischen einer immunsuppressiven Therapie mit Methotrexat und der Entwicklung einer Eppstein-Barr-Virus (EBV) assoziierten lymphoproliferativen Erkrankung (LPD) durch die Datenlage gut belegt ist, ist dieser Zusammenhang für eine immunsuppressive Therapie mit Azathioprin weniger evident. Anhand eines Fallberichtes wird die Entwicklung eines Hodgkin-Lymphoms unter Therapie einer Auto-Immunhepatitis mit Azathioprin beschrieben, welches durch alleiniges Absetzen der immunsuppressiven Therapie reversibel war. Neben viralen Erkrankungen sind Arzneimittel eine der Hauptursachen für akutes Leberversagen. Aufgrund des Fehlens spezifischer Symptome oder Tests ist es jedoch schwierig, eine Arzneimittel-induzierte Lebertoxizität zu diagnostizieren. Anhand eines Fallberichtes, welcher die Entwicklung eines akuten Leberversagens unter Therapie mit verschiedenen Antibiotika und Paracetamol beschreibt, wird ein Vorgehen zum Ausschluss sonstiger Ursachen beschrieben, sowie das lebertoxische Potential der beteiligten Arzneistoffe diskutiert. KW - Pharmakokinetik KW - antibiotics KW - clinical pharmacy KW - dose individualization KW - pharmacokinetics KW - Pharmakotherapie KW - Dosis Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173396 ER - TY - THES A1 - Bank, Stephanie T1 - LC-ESI und MALDI-Massenspektrometrische Analyse nativer und derivatisierter Zucker und Glykane T1 - LC-ESI and MALDI mass spectrometric analysis of native and derivatised carbohydrates and glycans N2 - Glykane sind weitverbreitete Biomoleküle, die meist in Form von Glykokonjugaten, wie beispielsweise als Glykoproteine oder Glykolipide, vorliegen. Durch die Interaktion von Glykanen mit Glykan-bindenden Proteinen wird eine Vielzahl an biochemischen Prozessen ausgelöst, sowohl physiologischer, als auch pathologischer Art. Die Aufklärung der beteiligten Glykanstrukturen ist daher nicht nur wichtig für das Verständnis dieser Prozesse, sondern kann auch Hinweise auf verschiedene Erkrankungen geben. Die Identifizierung von Glykanstrukturen kann über verschiedene Wege erfolgen. In der instrumentellen Analytik spielt dabei vor allem die ESI- und MALDI Massenspektrometrie eine wichtige Rolle, da diese sowohl für Detektion, als auch Fragmentierung großer Biomoleküle geeignet sind. Um die Analyse von Zuckern mittels chromatographischer und massenspektrometrischer Methoden zu erleichtern, werden häufig Derivatisierungsreagenzien eingesetzt. Diese verringern die Polarität der Zucker und erleichtern die Detektion durch das Einbringen von Chromo- oder Fluorophoren. Zur Derivatisierung am reduzierenden Terminus von Glykanen und Zuckern eignen sich vor allem Aminierungsreagenzien oder Hydrazide. Hydrazide haben gegenüber anderen Derivatisierungsreagenzien den Vorteil einer einfachen, salzfreien Umsetzung, aus der ein stabiles Derivat mit geschlossenem terminalen Zuckerring hervorgeht. Für die vorliegende Arbeit wurde die Derivatisierung mit den neuen Hydrazid Reagenzien INH und BINH, sowie dem bereits von Dr. P. Kapková bearbeiteten BACH untersucht. Als Vergleich dienten die underivatisierten Kohlenhydrate, wie auch das standardmäßig eingesetzte Aminierungsreagenz 2-AB. Dabei sollte das Ver-halten verschiedener Zucker und Glykane in Bezug auf chromatographische Trennung, Signalintensität und Fragmentierung analysiert werden. Zunächst wurde die Umsetzung von Mono-, Di- und Trisacchariden mit den neuen Derivatisierungsreagenzien INH und BINH optimiert. Dadurch konnte bei beiden Substanzen die komplette Umsetzung der Zucker in ihre Derivate gewährleistet werden. Auch die Derivatisierung mit Hilfe der Mikrowelle konnte bei INH erfolgreich durchgeführt werden. Auf diese Weise ließ sich die Reaktionszeit, im Vergleich zu den im Thermo-mixer® benötigten 90 Minuten, auf 20 Minuten verkürzen. Aufgrund der großen Men-gen an Zucker und Derivatisierungsreagenz, die für die Umsetzung in der Mikrowelle nötig sind, war der Versuch jedoch nur für INH geeignet. Im nächsten Schritt wurde das Trennverhalten der verschiedenen Mono-, Di- und Tri-saccharid-Derivate auf RP-C18- und HILIC-Phasen untersucht. Bei den Monosaccha-riden konnte durch keines der Derivate eine vollständige Trennung auf einer der Pha-sen erreicht werden. Das beste Ergebnis wurde durch INH auf der HILIC-Säule erzielt, doch auch dort konnten die Epimere Glucose, Mannose und Galactose nicht vollstän-dig separiert werden. Die Trennung der Disaccharide Maltose, Cellobiose und Lactose konnte auf der HILIC-Phase mit allen Derivaten außer BACH erfolgreich durchgeführt werden, auf der RP-C18 erwies sich dagegen nur 2-AB als geeignet. Bei den Trisac-chariden 3'SLN und 6'SLN konnten sowohl underivatisierte Zucker, als auch sämtliche Derivate mittels HILIC getrennt werden. Auch auf der C18-Phase war eine Trennung der BINH, BACH und 2-AB-Derivate möglich. Des Weiteren konnte durch die Derivati-sierungen die Signalintensität gegenüber den underivatisierten Zuckern deutlich gesteigert werden. Nach ihrer Trennung lassen sich massegleiche Di- und Trisaccharide anhand des Fragmentierungsmusters unterscheiden. Während bei den underivatisierten Disaccha-riden Maltose, Cellobiose und Lactose die charakteristischen Fragmente nur schwach sichtbar waren, konnte mit Hilfe der Hydrazide INH, BINH und BACH die Differenzie-rung deutlich erleichtert werden. Die 2-AB-Derivatisierung zeigte dagegen keine Ver-besserung der Fragmentierungseigenschaften. Bei der Unterscheidung der Trisaccharide 3’SLN und 6’SLN waren ebenfalls sowohl underivatisierte, als auch Hydrazid-derivatisierte Zucker im Vorteil gegenüber den 2-AB-Derivaten. Die Derivatisierung der N-Glykane von Ribonuclease B und Ovalbumin führte bei der Analyse mittels MALDI-TOF zu einer deutlichen Steigerung der Sensitivität. Beispiels-weise ließen sich bei den Glykanen des Ovalbumins durch die Derivatisierungen drei zusätzliche Strukturen im Vergleich zu den nativen Glykanen detektieren. Auch das Fragmentierungsverhalten der Glykane am MALDI-TOF/TOF konnte mit Hilfe der Derivatisierungen erheblich verbessert werden. Besonders die Umsetzung mit BINH führte zu einer Vielzahl charakteristischer Ringfragmente, wodurch die Aufklärung der verschiedenen Glykanstrukturen deutlich vereinfacht wurde. Auch im Vergleich zu 2 AB zeigten die Hydrazid-Derivate sowohl bessere Fragmentierungseigenschaften, als auch eine einfachere Handhabung für die Messung mittels MALDI-MS. Eine weitere Möglichkeit zur Identifikation von Glykanstrukturen liegt in der spezifischen Bindung durch Lektine. Diese Untersuchung gibt des Weiteren auch einen Hinweis auf funktionelle Eigenschaften der Glykane. Dafür wird die hohe Affinität von Biotin-haltigen Derivatisierungsreagenzien zu Avidin und Streptavidin genutzt. Nach der auf diese Weise erfolgten Immobilisierung der Glykane können diese mittels spezifischer Lektine nachgewiesen werden. Die Eignung des neuen Derivatisierungsreagen-zes BINH für diese Zwecke wurde anhand eines Glykan-Arrays getestet. Dadurch ließ sich bestätigen, dass BINH-derivatisierte Glykane und Zucker sowohl in der Lage sind an Streptavidin zu binden, als auch durch Lektine nachgewiesen werden können. Daher kann davon ausgegangen werden, dass BINH grundsätzlich für den Einsatz in bio-chemischen Methoden geeignet ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Derivatisierung von Kohlenhydraten mit INH, BINH und BACH zu einer deutlichen Verbesserung der Trenn- und Fragmentierungseigenschaften führten. Dadurch konnten Identifizierung und Strukturanalyse sowohl von kleinen Zuckern, als auch von Glykanen erleichtert werden. Im Vergleich zu dem Standard-Derivatisierungsreagenz 2-AB zeigten die Hydrazide nicht nur im Bereich der Fragmentierungen, sondern auch durch die einfachere Derivatisierungsreaktion wesentliche Vorteile. N2 - Glycans are widely spreaded biomolecules, which are commonly presented as gly-coconjugates, e.g. glycoproteins or glycolipids. The interaction of glycans with glycan-binding proteins triggers numerous physiological and pathological processes in bio-chemistry. Therefore the determination of the participating glycanstructures is of immens interest for the understanding of such processes. The structures of the involved glycans may even provide evidence on several diseases. Identification of glycan structures can be performed by means of various techniques. Favorable techniques in analytical chemistry are ESI- and MALDI- mass spectrometry, since they can be used for the detection, as well as for the fragmentation of large bio-molecules. To simplify the analysis of carbohydrates by means of chromatographic and mass spectrometric methods, different derivatization reagents are available. The chemical modification of the sugars leads to a decrease in polarity and to an enhanced detection by coupling to chromo- or fluorophores. Derivatization at the reducing end of saccharides and glycans can be performed through reductive amination, or coupling to hydrazide reagents. The advantage of hydrazides in comparison to other derivatization reagents lies in a simple, salt-free reaction and results in a stable derivative with closed terminal sugar ring, as the reduction step is not necessary. The present work concentrates on the derivatization of sugars and glycans using the newly developed hydrazides INH and BINH, in addition to BACH, which was already used by Dr. P. Kapková [99]. The derivatives of those reagents were compared to the underivatized carbohydrates, as well as to the commonly used derivatization reagent 2 AB, in order to observe the characteristics related to liquid chromatography, signal intensity and fragmentation behavior. In the first step, the derivatization reaction of mono, di- and trisaccharides with INH and BINH was optimized, in order to ensure a complete transformation of the carbohy-drates into their derivatized equivalents. The derivatization with INH was also per-formed via microwave. In this way, the reaction time was reduced from 90 minutes us-ing the thermomixer®, to 20 minutes. Since this method required a high amount of sample, it was only performed with INH. Next, the chromatographic behaviour of the different saccharide derivatives was ana-lyzed by reversed phase and HILIC high performance liquid chromatography. In case of the monosaccharides, none of the mixtures of derivatives could be separated com-pletely on either of these columns. For HILIC the best effect was achieved with INH, even though glucose and its epimers, mannose and galactose could not be separated completely. On reversed phase, derivatization with BACH and 2-AB showed the best results for the separation of the monomers, but here as well the epimers were not dis-solved. The separation of the INH, BINH and 2-AB derivatives of the disaccharides maltose, cellobiose and lactose was performed successfully on HILIC, with RP-C18 only 2-AB was proved to be suitable. For the trisaccharides 3’SLN and 6’SLN the na-tive forms, as well as all of the derivatives were separated using HILIC. Even by using reversed-phase, the separation of the BINH, BACH and 2-AB derivatives was possible. Furthermore the signal intensity of the derivatized carbohydrates was considerably en-hanced compared to the native saccharides. The chromatography of sugars on HILIC phase showed presence of isomers (very probably the anomers) of the analyzed sug-ars. If the appearance of these isomers is not desirable, separation on reversed-phase can be applied. After separation, di- and trisaccharides of the same mass can be distinguished, based on their fragmentation pattern. Whereas the native disaccharides maltose, cellobiose and lactose showed only slight differences in fragmentation, the derivatization with INH, BINH and BACH increased the number of characteristic fragments. In contrast, with 2-AB no improvement was achieved. The discrimination between 3’SLN and 6’SLN was also simplified by derivatization with the different hydrazides. In contrast to the 2-AB derivatives, the native trisaccharides showed a high content of characteristic fragments as well. For the glycans of ribonuclease B and ovalbumin, the sensitivity was clearly improved through derivatization. In the case of ovalbumin, three additional structures were detected, compared to the native glycans. Regarding the fragmentation by means of MALDI TOF/TOF, the fragmentation behaviour of the glycans was considerably better after derivatization. Especially the BINH derivatives generated a high amount of characteristic cross-ring fragmentations. This way, the elucidation of different isomeric glycan structures was enhanced. Again, 2-AB had worse characteristics in terms of fragmentation behaviour and application properties, compared to the hydrazide derivatives. Another option for the investigation of glycan structures is the specific recognition by lectins. This kind of study also provides information on the functional properties of gly-cans. Biotinylated derivatives possess a high affinity to avidin and streptavidin. This feature is used to immobilise glycans on (strept-)avidin coated surfaces, so they can be further analyzed by specific lectins. Due to this, the suitability of BINH for functional studies was tested. In initial studies BINH derivatized glycans and sugars were con-firmed to bind to streptavidin and were recognized by lectins as well. Hence, it can be assumed that BINH derivatives are suitable for this kind of biochemical analysis. In summary, the derivatization of carbohydrates using INH, BINH and BACH improved the behaviour of the analytes during liquid chromatography and mass spectrometric fragmentation. Hence, identification and structural analysis of small saccharides, as well as glycans were considerably simplified. Compared to common derivatization reagents like 2-AB, the hydrazides showed significant advantages, not only in terms of mass spectrometric fragmentation, but also because of their simple derivatization reaction. KW - MALDI-MS KW - Glykane KW - Zucker KW - Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie KW - N-Glykane KW - Massenspektrometrie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106085 ER - TY - THES A1 - Ilko, David T1 - The use of charged aerosol detection for the analysis of excipients and active pharmaceutical ingredients T1 - Die Verwendung des "Charged Aerosol Detectors" zur Analytik von Hilfs- und Wirkstoffen N2 - The Corona® charged aerosol detector (CAD) is an aerosol-based detector first de-scribed by Dixon and Peterson in 2002. It is capable of detecting compounds inde-pendent from their physico-chemical properties presumed the analyte is sufficiently non-volatile. Consequently, the CAD is often applied to the analysis of substances that do not possess a suitable UV chromophore. Major drawbacks are however, the detector signal is non-linear and depending on the content of organic solvent in the mobile phase. This thesis tried to explore possible applications of the CAD for pharmaceutical analysis. Therefore, several substances from different compound classes were in-vestigated. Newly developed or existing methods were validated. Thus the perfor-mance of the CAD could be examined. Both assay and impurity determination were evaluated for their compliance with ICH Q2(R1) “Validation of Analytical Proce-dures” and the “Technical Guide for the Elaboration of Monographs”. In the course of the establishment of reference substances at the EDQM, a generic screening method for the identification of organic and inorganic pharmaceutical counterions was needed. An HPLC-CAD method developed by Zhang et al. was therefore investigated for its suitability for pharmacopoeial purpose. Method valida-tion was performed. It was found that 23 ions could be separated and detected. Iden-tification was achieved via retention time of an authentic standard of the corre-sponding ions. Alternatively, peak assignment was performed by determination of the exact mass using TOF-MS. Ions could be quantified as impurities or for stoichi-ometric purpose. For the impurity control in topiramate, the performance characterstics of the CAD were compared to that of an ELSD. CAD was superior to ELSD in terms of repeata-bility, sensitivity and linearity. However, impurities could be quantified with satisfac-tory accuracy with both detectors. The application of the ELSD was not feasible due to non-reproducible spike peaks eluting after the principle peak in the chromatogram of the test solution. One of the impurities, topiramate impurity A (diacetonide), gave no or a vastly diminished signal in the ELSD and the CAD, respectively. It is evapo-rated during the detection process due to its relatively high vapor pressure. The re-sponse could be enhanced by a factor of nine via post-column addition of acetoni-trile and a lower nebulizer temperature. As the response of topiramate impurity A was still about thousand-fold lower than the response of all other impurities, its quantification was not feasible. Additionally, the HPLC-CAD was successfully vali-dated as an assay procedure for topiramate. There seems to be a great potential in the application of the CAD to the analysis of excipients as most compounds do not possess a suitable UV chromophore. Here, a simple and rapid HPLC-CAD method for the determination of polidocanol (PD) was developed. The method was successfully validated as a potential assay procedure for the Ph. Eur. as none is described in either of the two PD monographs. The same method was applied to the determination of the PD release from a pharmaceutical polymer matrix. A method for the determination of the fatty acid (FA) composition of polysorbate 80 (PS80) was developed and validated. Using the CAD and mass spectrometry, we were able to identify two new FAs in 16 batches from four manufacturers. All batch-es complied with pharmacopoeial specification. Furthermore, the overall composi-tion of the different PS80 species (“fingerprinting”) and the peroxide content were determined. In addition to the chemical characterization, functionality related charac-teristics (FRCs) were determined. Correlations between chemical composition and FRCs were found. The validation data of the above mentioned methods suggests that the CAD repre-sents a viable detection technique for pharmaceutical analysis. The CAD was suffi-ciently sensitive for non-volatile analytes. Impurity control down to concentrations of 0.05 or 0.03%, as demanded by ICH Q3A (R2), is achievable. However, the response of semi-volatile compounds may be drastically diminished. It could be confirmed that the response of the CAD is linear when the range does not exceed two orders of magnitude. Exceptions may be observed depending on the actual method setup. When the measuring range is sufficiently narrow, quantification can be done using single-point calibration which is common practice in pharmaceutical anlysis. Impuri-ties may also be quantified against a single calibration solution. However, correction factors may be needed and the accuracy is considerably lower compared to an as-say method. If a compound is to be quantified over a large concentration range, log-log transformation of the calibration curve is needed and a decreased accuracy has to be accepted. N2 - Der “Corona® charged aerosol detector” (CAD) ist ein aerosol-basierter Detektor, welcher 2002 von Dixon und Peterson vorgestellt wurde. Damit lassen sich nicht-flüchtige Substanzen unabhängig von ihren physiko-chemischen Eigenschaften detektieren. Daraus folgt, dass der CAD oft zur Analyse von Substanzen ohne UV-Chromophor angewandt wird. Großes Manko ist jedoch, dass das Signal nicht linear und abhängig vom Anteil organischen Lösemittels in der mobilen Phase ist. Ziel dieser Arbeit war es, mögliche Anwendungen des CAD in der pharmazeuti-schen Analytik zu erschließen. Dies wurde anhand von Beispielen aus unter-schiedlichen Substanzklassen untersucht. Dabei wurden neu entwickelte oder be-stehende Methoden validiert um die Leistung des CAD beurteilen zu können. So-wohl Gehaltsbestimmungen als auch Methoden zur Erfassung von Verunreinigun-gen wurden hinsichtlich ihrer Konformität mit dem Europäischen Arzneibuch (Ph. Eur.) geprüft. Im Zuge der Charakterisierung von Referenzsubstanzen beim EDQM wurde eine Methode zur Identifikation von pharmazeutischen Gegenionen benötigt. Zu diesem Zweck wurde eine HPLC-CAD-Methode von Zhang et al. hinsichtlich ihrer Eignung für das Ph. Eur. überprüft. Mit dieser Methode ließen sich 23 pharmazeutisch rele-vante Ionen trennen und detektieren. Die Ionen wurden durch Vergleich der Re-tentionszeiten eines Standards erreicht. Zusätzlich wurde die Peakzuordnung mit-tels der Bestimmung der Präzisionsmasse des Gegenions oder des Arzneistoffes durch ein TOF-MS durchgeführt. Die Methode ließ die Quantifizierung von Ionen als Verunreinigung oder zur Bestimmung der Stöchiometrie eines Salzes zu. Bei der Bestimmung von Verunreinigungen von Topiramat wurde ein Vergleich zwischen CAD und ELSD angestellt. Es zeigte sich, dass der CAD in den Punkten Wiederholbarkeit, Empfindlichkeit und Linearität überlegen war. Mit beiden Detekto-ren wurde eine ähnlich gute Richtigkeit erzielt. Durch das Auftreten von nicht re-produzierbaren Peaks, welche nach dem Hauptpeak im Chromatogramm der Testlö-sung auftraten, war die Anwendung des ELSD hier auszuschließen. Eine der Ver-unreinigungen, Topiramat Verunreinigung A (Diacetonid) lieferte kein bzw. ein ver-ringertes Signal in ELSD und CAD. Aufgrund des relativ hohen Dampfdrucks der Substanz wurde sie während des Detektionsvorgangs verdampft. Das Signal konn-te durch Zugabe von Acetonitril nach der Säule und durch eine Verringerung der Temperatur des Vernebler um das neunfache vergrößert werden. Da aber die Emp-findlichkeit für alle anderen Verunreinigungen dennoch um das tausendfache hö-her war, war eine Quantifizierung von Topiramat Verunreinigung A nicht möglich. Die HPLC-CAD Methode wurde zusätzlich als Gehaltsbestimmungsmethode für Topiramat validiert. Die Anwendung des CAD zur Analyse von Hilfsstoffen birgt großes Potenzial, da viele Substanzen nicht über ein Chromophor verfügen. Im Zuge dieser Arbeit wurde eine einfache und schnelle Methode zur Gehaltsbestimmung von Polidocanol (PD) entwickelt. Diese wurde als mögliche Methode für das Ph. Eur. validiert. Zusätzlich wurde die Methode zur Bestimmung der Freisetzung von PD aus einer pharmazeu-tischen Matrix verwendet. Es wurde eine Methode zur Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung von Poly-sorbat 80 (PS80) entwickelt und validiert. Mittels CAD und Massenspektrometrie war es möglich zwei neue Fettsäuren in 16 Chargen von vier verschiedenen Herstellern zu identifizieren. Alle Chargen entsprachen den Anforderungen des Ph. Eur. Wei-terhin wurde die Zusammensetzung der einzelnen PS80-Spezies („fingerprinting“) sowie der Peroxidgehalt untersucht. Neben dieser chemischen Charakterisierung wurden auch funktionalitätsbezogene Eigenschaften (FRCs) bestimmt. Korrelatio-nen zwischen chemischen Zusammensetzung und FRCs wurden gefunden. Die Validierungsdaten der genannten Methoden legen nahe, dass der CAD sinn-voll zur pharmazeutischen Analytik angewendet werden kann. Für nicht-flüchtige Substanzen wurde stets eine ausreichende Empfindlichkeit erreicht. Somit können Verunreinigungen bis zu einer Konzentration von 0.05 bzw. 0.03%, wie von der ICH Richtlinie Q3A (R2) gefordert, quantifiziert werden. Jedoch kann das Detektorsignal bei halb-flüchtigen Substanzen stark erniedrigt sein. Es konnte bestätigt werden, dass sich das Detektorsignal über zwei Größenordnungen linear verhält. Abwei-chungen davon sind in Abhängigkeit der jeweiligen Methode möglich. Ist der Mess-bereich genügen klein, so kann ein Stoff mittels Einpunkt-Kalibrierung quantifiziert werden. Dieses Vorgehen sollte bei Gehaltsbestimmungen angewandt werden. Ebenfalls mittels Einpunkt-Kalibrierung können Verunreinigungen erfasst werden. Jedoch kann es notwendig sein, Korrekturfaktoren zu bestimmen. Die Richtigkeit ist hier deutlich niedriger als bei einer Gehaltsbestimmungsmethode. Über einen gro-ßen Konzentrationsbereich muss eine Ausgleichskurve mit log-log-Transformation verwendet werden. Die Richtigkeit ist hierbei ebenfalls geringer als bei einer Ge-haltsbestimmung. KW - Analyse KW - Chemische Reinheit KW - Verunreinigung KW - Detektor KW - Pharmazie KW - charged aerosol detector KW - pharmaceutical analysis KW - Analytik Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118377 ER - TY - THES A1 - Wiest, Johannes T1 - Synthese und Charakterisierung neuer Ionischer Flüssigkeiten zur Verbesserung der Auflösungsrate und Löslichkeit eines schwer wasserlöslichen Wirkstoffes T1 - Synthesis and characterization of novel ionic liquids to improve the dissolution rate and solubility of a poorly water-soluble active ingredient N2 - Ionische Flüssigkeiten (engl. Ionic Liquids = IL) sind organische Salze mit einem Schmelzpunkt von unter 100 °C und bieten einen interessanten Ansatz um die orale Bioverfügbarkeit von schlecht wasserlöslichen Arzneistoffen zu verbessern. Aufgrund seiner schlechten Wasserlöslichkeit wurde aus dem Wirkstoff BGG492 der Novartis AG eine Ionische Flüssigkeit (IL) mit dem sterisch anspruchsvollen Gegenion Tetrabutylphosphonium hergestellt. Die IL ist ein amorpher, glasartiger Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 57 °C. Die freie Säure (FS), das Kaliumsalz (BGG-K+) und die IL (siehe Abb. 69) wurden in festem Zustand mittels polarisationsmikroskopischen Aufnahmen, Röntgen-Pulverdiffraktometrie, Röntgenkristallstrukturanalysen, Infrarot-Spektroskopie und Festkörper-NMR-Spektroskopie untersucht. Der ionische Charakter der IL in festem Zustand konnte mittels Bandenverschiebung der deprotonierten Sulfonamidgruppe im IR-Spektrum bestätigt werden. In der Röntgenkristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass sich die Moleküle der FS in Schichten anordneten, in denen jedes Molekül mit vier Nachbarmolekülen über Wasserstoffbrücken verbunden war. Das BGG-K+ kristallisierte als Monohydrat. In dieser Kristallstruktur bildeten die Kaliumkationen in der bc-Ebene mit den BGG-Anionen ober- und unterhalb Schichten. Im Gegensatz zu der FS waren keine intermolekularen Wasserstoffbrücken zu beobachten. Die 15N-Festkörper-NMR-Spektren des BGG-K+ und der IL zeigten die gleiche chemische Verschiebung für den unsubstituierten Stickstoffes N-1‘ der Pyrazolgruppe und belegten somit ebenfalls die ionische Struktur der IL im festen Zustand. Die amorphe Struktur der IL wurde mittels Röntgen-Pulverdiffraktometrie und Polarisationsmikroskop bestätigt und eine flüssigkristalline Phase konnte ausgeschlossen werden. Die IL zeigte im Vergleich zu der FS eine 700-fach schnellere Auflösungsrate J und eine signifikante Verlängerung der Dauer der Übersättigung in wässriger Lösung. Der sprunghafte Anstieg der Kon-zentration in Lösung („spring“) und die Dauer der Übersättigung („parachute“) wurden mittels photometrischen und potentiometrischen Titrationen untersucht. Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie konnte der Mechanismus der Übersättigung aufgeklärt werden. Das sterisch anspruchsvolle Gegenion Tetrabutylphosphonium verhinderte die Protonierung der deprotonierten Sulfonamidgruppe von BGG. In Lösung kam es zur Bildung von Aggregaten („Cluster“), in die sich das Gegenion teilweise einlagerte. Nach der Protonierung und der Bildung von Kristallisationskeimen präzipitierte die ungeladenen FS und der metastabile Zustand der Übersättigung („parachute“) brach zusammen. Um den Einfluss der Struktur des Gegenions auf die Auflösungsrate und die Dauer der Übersättigung zu untersuchen, wurden ca. 40 Phosphonium- und Ammonium-Kationen synthetisiert. Die Schmelzpunkte der Phosphonium- und Ammonium-Salze wurden mittels dynamischer Differenzkalorimetrie (DSC) ermittelt. Für das Phosphonium-Salz P3332OH-Bromid konnte eine enantiotrope Umwandlung der Modifikationen mittels temperaturabhängiger XRPD-Messungen bestätigt werden. Die Zelltoxizitäts-Untersuchungen der Phosphonium- und Ammonium-Salze an humanen Leberzellen (HepG2), Nierenzellen (HEK 293T) und murinen Makro-phagenzellen (J774.1) zeigten, dass mit höherer Lipophilie die Zelltoxizität zunahm. Polare Kationen zeigten keine Zytotoxizität (IC50 > 1000 µM). Die Zelltoxizität der Ammonium-Salze war im direkten Vergleich mit den Phosphonium-Salzen etwas geringer. Die synthetisierten Phosphonium- und Ammonium-Salze, die als Chloride-, Bromide- und Iodide vorlagen, wurden durch Anionenaustausch in Hydroxide umgewandelt. Die Ionischen Flüssigkeiten wurden in einer Säure-Base-Reaktion mit der freien Säure des BGG-Moleküls und den Hydroxiden hergestellt. Der ionische Charakter konnte mittels Bandenverschiebung der deprotonierten Sulfonamidgruppe im IR-Spektrum bestätigt werden. Die Substanzen waren amorph (XRPD) und die Glasübergangstemperaturen (DSC) bewegten sich für die Mono-Kationen im Bereich zwischen 40 °C – 97 °C, für Dikationen 81 °C - 124 °C und für Trikationen 124 °C - 148 °C. Damit erfüllten einige Substanzen die Definition einer Ionischen Flüssigkeit nicht (Smp. < 100 °C) und wurden daher als Niedrig-Gitter-Enthalpie-Salze (low lattice enthalpy salt = LLES) bezeichnet. Die ILs und LLES zeigten signifikante Unterschiede in der Auflösungsrate J, der Übersättigungszeit und der Wasserdampfsorption. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass allein durch die Auswahl des Gegenions wichtige Parameter für die orale Bioverfügbarkeit gesteuert werden können. Durch diesen Ansatz war es möglich, aus dem sehr schlecht wasserlöslichen Arzneistoff BGG492 Ionische Flüssigkeiten bzw. LLES herzustellen, die sich drastisch schneller auflösten und teilweise über mehrere Stunden übersättigte Lösungen bildeten. Insgesamt zeigte sich, dass durch eine Zunahme der Polarität des Gegenions eine größere Auflösungsrate J und eine geringere Zelltoxizität erzielt werden konnten. Jedoch verringerte sich dadurch die Dauer der Übersättigung in Lösung und erhöhte die Hygroskopizität der ILs und LLES. N2 - Ionic Liquids (IL) are organic salts with a melting point below 100 °C and are a promising approach for improving oral bioavailability of poorly water soluble drugs. The poor water soluble drug BGG492 of the Novartis AG was prepared as Ionic Liquid (IL) using the sterically demanding counterion tetrabutylphosphonium. The IL is an amorphous, glass-like solid with a melting point of 57 °C. The free acid (FS), potassium salt of BGG (BGG-K+) and IL were characterized in solid state by means of polarization light microscopy (PLM), X-ray powder diffraction (XRPD), single crystal x-ray diffraction, infrared spectroscopy (IR) and solid state NMR spectroscopy. The ionic state of the IL in solid state could be confirmed by band shifts of the deprotonated sulfonamide group in the IR spectrum. The free acid crystallized in an orthorhombic space (Pbca) group and molecules were arranged in layers indicated by means of singly x-ray diffraction. Within each layer, one molecule was connected to four neighboring molecules via hydrogen bonds. The potassium salt crystallized as monohydrate. In this crystal structure, potassium ions formed layers in the crystallographic bc-plane with the anions placed atop and below the potassium ions. In contrast to the crystal structure of the free acid no hydrogen bonds between the molecules were detected. The 15N solid state NMR spectra of BGG-K+ and IL showed almost the same chemical shift of the unsubstituted nitrogen N-1’ of the pyrazole group and confirmed therefore the ionic state in solid state too. The amorphous structure of IL was confirmed by XRPD and polarization light microscopy; therefore a mesophase could be excluded. The comparison of the IL to free acid revealed a 700-fold faster dissolution rate and a significant extension of supersaturation time (Abb. 72). The rapid increase of concentration (“spring”) and the supersaturation time (“parachute”) were measured by photometrically and potentiometric titration. The super-saturating mechanism was elucidated by NMR spectroscopy. The sterically demanding counterion tetrabutylphosphonium hindered the protonation of the deprotonated sulfonamide group of BGG. In solution a formation of aggregates was observed (“Cluster”), in which the counterion was partially included. After protonation, the free acid crystallized and the metastable condition of supersaturation collapsed. In order to study the structural impact of the counterions on dissolution rate and supersaturation time, approximately 40 phosphonium and ammonium based counterions were synthesized. The melting points were obtained by differential scanning calorimetry (DSC). For the phosphonium bromide salt (P3332OH) an enantiotropic conversion was confirmed by temperature dependent XRPD measurements. The cytotoxicity studies of these phosphonium- and ammonium salts indicated at human liver cells (HepG2) and kidney cells (HEK), and at murine macrophage cells (J774.1) a higher cytotoxicity with increasing lipophilicity of the counterions. Polar counterions of the di- and trication-, hydroxyl- and amino series showed no cytotoxicity (IC50 > 1000 µM). The IC50 values of ammonium based counterions were slightly higher than their corresponding phosphonium counterions. The synthesized phosphonium and ammonium chloride, bromide or iodide salts were transformed into hydroxides via anion exchange in solution. The Ionic Liquids were prepared in an acid-base reaction with the free acid of BGG and the hydroxides. The substances were amorphous (XRPD) and the glass transition temperatures (DSC) were for monocations 40 °C – 97 °C, dications 81 °C – 124 °C and trications 124 °C – 148 °C. Therefore some substances do not fulfill the definition of Ionic Liquids (mp < 100 °C) and were named as low lattice enthalpy salts (LLES). The ILs and LLES showed significant differences in dissolution rate, supersaturation time and water sorption. This work showed that the choice of counterion can tune important parameter for oral bioavailability. Using the Ionic Liquid approach it was possible to create substances with strongly improved dissolution rates and long supersaturation times from the poor water soluble drug BGG492. The results revealed the more polar the counterion of the Ionic Liquid or LLES, the higher the dissolution rate and lower the cytotoxicity, but the shorter the supersaturation time and the higher the hygroscopicity. KW - Bioverfügbarkeit KW - Wirkstoff KW - Wasserlöslichkeit KW - Ionische Flüssigkeiten KW - Ionic Liquids KW - orale Bioverfügbarkeit KW - oral bioavailability KW - schwer wasserlöslich KW - poorly water soluble KW - active pharmaceutical ingredient Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121733 ER - TY - THES A1 - Mandel, Philipp T1 - Entstehung von oxidativen Stressmarkern in DNA und RNA nach der Behandlung mit den Hormonen Angiotensin II und Aldosteron in vitro und in vivo : Vergleich von drei Analysemethoden zum Nachweis von 8-Oxo-2'-desoxyguanosin in LLC-PK1-Zellen T1 - Formation of oxidative stress markers in DNA and RNA after treatment with aldosterone and angiotensin II in vitro and in vivo N2 - The detection of oxidative stress markers has gained increasing importancy in the early investigation of diseases like diabetes, cancer or hypertension. 8 oxo 2' deoxyguanosine (8-oxodG) is the main marker, which is used for the intracellular detection of oxidative stress levels. However, the oxidative stress markers 8 oxoguanine (8-oxoGua), a product of the DNA base excision repair and 8 oxoguanosine (8-oxoGuo), a marker for oxidative damaged RNA have received less attention up to now. The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) plays an important role in the regulation processes of the blood pressure system. During hypertension angiotensin II (Ang II) and aldosterone (Aldo) are released in high concentrations over a longer period leading to non-physiological effects of the RAAS hormones. Subsequently, an increase of the intracellular oxidative stress level in kidney cells can be measured. The aim of this thesis is the in vitro and in vivo detection of the oxidative damage in DNA and RNA by measuring oxidative stress markers, especially 8-oxodG which is triggered by Ang II and Aldo. In vitro experiments were carried out in LLC-PK1, a cell line originated from porcine kidney cells. It could been shown that Ang II and Aldo led to a dose-dependent increase of DNA damage in the cells. A time-dependent increase was detected for the first 30 minutes of the treatment. For the rest of the experimental set up (4 h) the level of detected DNA damage remained constant. The FPG comet assay and the immunocytochemical staining showed a significant increase of 8-oxodG in the cells, whereas the HPLC-MS/MS measurement only detected a small increase of 8-oxodG in the DNA. The FPG enzyme, which recognises also other oxidized purines besides 8-oxodG, which led to an overestimation of 8-oxodG in the comet assay. Also, the 8 oxodG antibody, which was used in the immunocytochemical analysis, detected higher amounts of 8-oxodG most likely due to its side reactions with other oxidized DNA structures. One of the main advantages of the last mentioned methods is the direct measurement in damaged cells, whereas the HPLC-MS/MS requires an isolation of the DNA. During this isolation process the oxidative stress markers can be oxidized and the detection can become imprecise. The main purpose of the in vivo experiments was the detection of the oxidative stress marker 8-oxoGua, 8-oxodG and 8-oxoGuo in the urine of test animals. The treatment of C57BL/6 mice and Sprague Dawley (SD) rats with the RAAS hormones led to an increase of the blood pressure, higher DNA damage due to oxidative stress as well as an increased excretion rate of oxidative stress markers. The inhibition of the angiotensin II type 1- or mineralocorticoid receptor and a mutation of the AT1a gene could show, that the DNA damage is independent from the hypertension. In addition, it was shown that the NOX4 is not alone responsible for the oxidative stress. Other NADPH oxidases must contribute to the induction of oxidative stress inside the cell. Moreover, the activation of the Nrf2 pathway has an influence on the effect of Aldo in SD rats. The excretion rate of the oxidative stress markers in the 20 h urine of the treated animals showed how the equilibrium between the DNA repair and the oxidative stress level was changing over time. The measurement of 8-oxoGuo became more and more popular, because up to the fact that 80 % of the DNA is translated into RNA. Overall, the detection of 8-oxodG and 8-oxoGuo is feasible for monitoring the disease or the healing process, because the measurement is non-invasive. The detection of 8-oxodG and 8-oxoGuo in nucleic acids is a first step into the field of basic research methods, because it reveals a snapshot of the nucleic acid damage in the cell at a specific time point. Usually, there will be an overestimation of the oxidative stress marker resulting from the analytical method. Although, it is possible to detect an underestimation of oxidative stress markers in tissue samples if not all cell types are damaged equally. Therefore, a primary goal should be the detection of a stable oxidation product of guanine to insure a reliable detection strategy and for a better understanding of the equilibrium of DNA oxidation and repair. N2 - Der Nachweis von oxidativen Stressmarkern hat bei der Untersuchung von Krankheiten wie Diabetes, Krebs und Hypertonie an großer Bedeutung gewonnen. Vor allem 8-Oxo-2’-desoxyguanosin (8-oxodG) wird gezielt mit verschiedenen Methoden gemessen und als Marker für oxidativen Stress herangezogen. Daneben haben 8 Oxoguanin (8-oxoGua), als Produkt aus der Basenexzisionsreparatur der DNA, sowie 8-Oxoguanosin (8-oxoGuo), als Biomarker für oxidativ geschädigte RNA, bisher weniger Aufmerksamkeit bekommen. Das Renin-Angiotensin Aldosteron System (RAAS) spielt eine wichtige Rolle in der Regulierung des Blutdrucks. Im Falle einer Hypertonie werden Angiotensin II (Ang II) und Aldosteron (Aldo) über einen langen Zeitraum in erhöhter Konzentration ausgeschüttet. Dieser Umstand bewirkt eine nicht physiologische Wirkung der Hormone des RAAS, welche zu einer Induktion von oxidativem Stress führt. Die Zielsetzung dieser Arbeit ist es, die oxidative Schädigung, ausgelöst durch Ang II und Aldo, in der DNA und der RNA in vitro und in vivo nachzuweisen und dabei speziell den Biomarker 8-oxodG zu untersuchen. In-vitro-Experimente wurden mit LLC PK1-Zellen, einer Schweinenierenzelllinie, durchgeführt. Ang II und Aldo lösten einen dosisabhängigen Anstieg der DNA Schäden in LLC PK1 Zellen aus. Eine Zeitabhängigkeit wurde für die ersten 30 Minuten gezeigt. Für die restliche Zeit (4 h) blieb der nachgewiesene DNA Schaden konstant. Der FPG Comet-Assay und die immunzytochemische Färbung zeigten jeweils eine signifikante Zunahme von 8-oxodG in LLC-PK1-Zellen an, während die HPLC MS/MS Messung nur geringe Veränderungen nachwies. Das FPG Enzym erkennt neben 8-oxodG auch andere oxidierte Purine und sorgte so für eine Überbestimmung des DNA-Schadens. Bei der immunzytochemischen Färbung entsteht die Überbestimmung durch Kreuzreaktionen des 8 oxodG Antikörpers mit oxidierten Strukturen in der DNA. Der Vorteil beider Analysemethoden ist die direkte Messung von Schädigungen in der Zelle, während die HPLC-MS/MS eine Isolierung der Nukleinsäuren voraussetzt. Bei diesem Schritt kann es zur Oxidation der Marker für oxidativen Stress kommen, welche einen genauen Nachweis erschwert. In vivo-Versuche hatten zum Ziel, die oxidativen Stressmarker 8-oxoGua, 8-oxodG und 8-oxoGuo im Urin nachzuweisen. Die Behandlung der C57BL/6-Mäuse und Sprague Dawley-Ratten (SD-Ratten) mit den Hormonen des RAAS zeigten einen Anstieg des Blutdrucks, erhöhte DNA Schäden durch oxidativen Stress sowie erhöhte Exkretionsraten der oxidativen Stressmarker. Durch eine Inhibierung des Angiotensin II-Typ1- oder Mineralkortikoidrezeptors sowie die Mutation des Gens AT1a konnte gezeigt werden, dass die Schädigungen unabhängig vom Blutdruck sind. Zudem konnte gezeigt werden, dass neben NOX4 auch andere NADPH Oxidasen für den oxidativen Stress verantwortlich sein müssen. Eine Aktivierung des Nrf2 Signalweges in den SD-Ratten hat Einfluss auf die Wirkung von Aldo. Die Exkretionsrate der oxidativen Biomarker im 20-h-Urin der behandelten Tiere zeigen, wie sich das Gleichgewicht zwischen DNA-Reparatur und oxidativem Stress verändert. Da 80 % der DNA in RNA umgeschrieben werden, ist der Nachweis von 8 oxoGuo in den Fokus gerückt. In der praktischen Anwendung kann mit der Messung von 8 oxodG und 8-oxoGuo ein Krankheits- oder Heilungsprozess auf nicht invasive Weise verfolgt werden. Der Nachweis von 8-oxodG und 8-oxoGuo in den Nukleinsäuren stellt einen Einstieg für die Grundlagenforschung dar, da sie nur eine Momentaufnahme der Nukleinsäureschädigung in der Zelle zeigen. Meist findet eine Überbestimmung, ausgelöst durch die Messmethode, statt. In Gewebeproben kann eine Unterbestimmung vorliegen, falls nicht alle Zelltypen vom oxidativen Stress betroffen sind. Daher sollte es ein vorrangiges Ziel sein, ein stabileres Oxidationsprodukt des Guanins nachzuweisen, um das Gleichgewicht der DNA-Oxidation und Reparatur besser zu verstehen. KW - Oxidativer Stress KW - Aldosteron KW - Renin-Angiotensin-Aldosteron-System KW - Angiotensin II KW - LC-MS KW - oxidative Stressmarker KW - 8-Oxo-2’-desoxyguanosin KW - Hydroxylradikal KW - DNA-Reparatur KW - Mineralokortikoidrezeptor KW - 8-oxo-2'-deoxyguanosine KW - DNA base excision repair KW - hypertension KW - oxidative stress marker KW - RNA degradation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111190 ER - TY - THES A1 - Hafer [geb. Zailer], Elina T1 - Tagging - Development of new qNMR methods T1 - Tagging - Die Entwicklung neuer Quantifizierungmethoden in der NMR Spektroskopie N2 - High-resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used in structure elucidation and qualitative as well as quantitative examination of product components. Despite the worldwide development of numerous innovative NMR spectroscopic methods, several official methods that analyze specific substances and do not represent a holistic analysis, are still in use for the quality control of drugs, food and chemicals. Thus, counterfeit or contaminated products of inferior quality can be brought onto the market and distributed despite previous quality controls. To prevent this, three NMR spectroscopic methods have been developed within the scope of this work (1) to study the peroxide value in vegetable and animal oils, (2) for the qualitative and quantitative analysis of metal cations and (3) to determine the enantiomeric excess in chiral alcohols. In oil analysis, titration methods are used to determine the bulk quality parameters such as peroxide value, which represents the concentration of peroxides. Titrations show several drawbacks, such as the need of a large amount of sample and solvents, cross reactions and the low robustness. Thus, an alternative NMR spectroscopic method was developed to improve the peroxide analysis by using triphenylphosphine as a derivatization reagent, which reacts with peroxides in a stoichiometric ratio of 1:1 forming triphenylphosphine oxide. In the 1H-31P decoupled NMR spectrum, the signals of the unreacted triphenylphosphine and the reacted triphenylphosphine oxide are detected at 7.4 ppm and 7.8 ppm, respectively. The ratio of the two signals is used for the calculation of the peroxide concentration. 108 oil samples with a peroxide value between 1 meq/kg and 150 meq/kg were examined using the developed method. Oils with a very low peroxide value of less than 3 meq/kg showed a relative standard deviation of 4.9%, highly oxidized oils with a peroxide value of 150 meq/kg of 0.2%. The NMR method was demonstrated as a powerful technique for the analysis of vegetable and krill oils. Another 1H NMR spectroscopic method was developed for the qualitative determination of Be2+, Sr2+ and Cd2+, and for the qualitative and quantitative determination of Ca2+, Mg2+, Hg2+, Sn2+, Pb2+ and Zn2+ by using ethylenediamine tetraacetate (EDTA) as complexing agent. EDTA is a hexadentate ligand that forms stable chelate complexes with divalent cations. The known amount of added EDTA and the signal ratio of free and complexed EDTA are used to calculate the concentrations of the divalent cations, which makes the use of an internal standard obsolete. The use of EDTA with Be2+, Sr2+, Cd2+, Ca2+, Mg2+, Hg2+, Sn2+, Pb2+ and Zn2+ result in complexes whose signals are pH-independent, showing cation-specific chemical shifts and couplings in the 1H NMR spectrum that are used for identification and quantification. In the presented NMR method, the limit of quantification of the cations Ca2+, Mg2+, Hg2+, Sn2+, Pb2+, and Zn2+ was determined with 5-22 μg/mL. This method is applicable in the food and drug sectors. The third NMR spectroscopic method introduced an alternative determination of the enantiomer excess (ee) of the chiral alcohols menthol, borneol, 1-phenylethanol and linalool using phosgene as a derivatizing reagent. Phosgene reacts with a chiral alcohol to form carboxylic acid diesters, made of two identical (RR, SS) or two different enantiomers (RS, SR). These two different types of diastereomers can be examined by the difference of their chemical shifts. In the presented method, the integration values of the carbonyl signals in the 13C NMR spectrum are used for the determination of the enantiomer excess. The limit of quantification depends, among others, on the sample and on the non-labelled or 13C-labelled phosgene used for the analysis. In the case of menthol, a quantification limit of ee=99.1% was determined using non-labelled phosgene and ee=99.9% using 13C-labelled phosgene. The 13C NMR method was also applied for the quality control of the enantiomeric purity of borneol, 1-phenylethanol and linalool. The developed 13C NMR method represents a powerful alternative to Mosher’s reagent for investigating the enantiomeric excess in chiral alcohols. This work demonstrates the variety of possibilities of applications for the quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopy in the chemical analysis of drugs, food and chemicals using tagging reactions such as derivatizations and complexations. The nuclear resonance spectroscopic methods developed in this research work represent powerful alternatives to the previously used quality control techniques. N2 - Die hochauflösende Kernresonanzspektroskopie findet heute primär Anwendung in derStrukturaufklärung und der qualitativen sowie quantitativen Untersuchung von Produkt-inhaltsstoffen. Trotz der weltweiten Entwicklung von innovativen kernresonanzspektrosko-pischen Methoden sind noch zahlreiche, offiziell anerkannte Methoden zur Qualitätskon-trolle von Arzneimitteln, Lebensmitteln und Chemikalien in Verwendung, die spezifischeSubstanzen kontrollieren und keine ganzheitliche Untersuchung darstellen. Somit könnenverunreinigte, qualitativ minderwertige oder gefälschte Produkte trotz vorheriger Quali-tätskontrollen auf den Markt gebracht und vertrieben werden. Um dies zu verhindern,wurden im Rahmen dieser Arbeit drei kernresonanzspektroskopische Methoden entwickelt,die zur (1) Bestimmung der primären Oxidation in pflanzlichen und tierischen Ölen anhandder Peroxidzahl, (2) zur qualitativen und quantitativen Analyse von Metallkationen und(3) zur Ermittlung des Enantiomerüberschusses in chiralen Alkoholen dienen.In der Ölanalytik werden Titrationsverfahren zur Bestimmung der Bulkqualitätsparameterwie auch der Peroxidzahl, welche die Konzentration an Peroxiden aufzeigt, eingesetzt. Dadie Titration neben dem Einsatz von größeren Mengen an Probenmaterial und Lösungsmit-teln, auch Kreuzreaktionen und eine geringe Robustheit aufweist, wurde eine kernreso-nanzspektroskopische Methode entwickelt, in der Triphenylphosphin als Derivatisierungs-reagenz eingesetzt wird, welches mit Peroxiden im stöchiometrischen Verhältnis von 1:1zu Triphenylphosphinoxid reagiert. Im1H-31P entkoppelten Kernresonanzspektrum wer-den die Signale des nicht reagierten Triphenylphosphins bei 7,4 ppm und des reagiertenTriphenylphosphinoxid bei 7,8 ppm detektiert. Das Verhältnis beider Signale wird in dieKonzentration der Peroxide umgerechnet. 108 Ölproben mit einer Peroxidzahl zwischen 1meq/kg und 170 meq/kg wurden mit der entwickelten Methode untersucht. Hierbei zeigtenÖle mit einer sehr geringen Peroxidzahl von weniger als 3 meq/kg eine relative Standard-abweichung von 4,9%, hochoxidierte Öle mit einer Peroxidzahl von 150 meq/kg 0,2%. Diekernresonanzspektroskopische Methode findet Anwendung in der Untersuchung von Krill-und pflanzlichen Ölen.Eine weitere1H kernresonanzspektroskopische Methode wurde zur qualitativen Analyse. Zusammenfassungvon Be2+, Sr2+und Cd2+und zur qualitatitativen sowie quantitativen Bestimmung vonCa2+, Mg2+, Hg2+, Sn2+, Pb2+und Zn2+entwickelt. Hierbei wurde Ethylendiamintetra-acetat (EDTA) als Komplexbildner verwendet. EDTA ist ein sechszähniger-Ligand, derstabile Chelatkomplexe mit zweiwertigen Kationen bildet. Die definierte Menge an EDTAund das Verhältnis von freier und komplexierter EDTA nach Zugabe der Probe werdenfür die Rückrechnung der Konzentration der Kationen verwendet. Somit ist der Einsatzeines internen Standards obsolet. EDTA komplexiert Be2+, Sr2+, Cd2+, Ca2+, Mg2+, Hg2+,Sn2+, Pb2+und Zn2+zu stabilen Komplexen, deren Signale im Protonen-Kernresonanz-spektrum pH-unabhängige und kationenspezifische chemische Verschiebungen und Kop-plungen aufweisen, die zur Identifizierung und Quantifizierung verwendet werden. DieKoaleszenz der∆undΛKonfigurationen des EDTA-Komplexes mit Be2+, Sr2+und Cd2+führt bei 298K zu einer Signalverbreiterung, die eine Quantifizierung bei den vorliegendenParametern unmöglich macht. Die Kationen Ca2+, Mg2+, Hg2+, Sn2+, Pb2+und Zn2+sindab einer Konzentration von 5-22μg/mL quantitativ in wässriger Lösung quantifizierbar.Diese Methode kann im Lebensmittel- und Arzneimittelbereich eingesetzt werden.Die dritte kernresonanzspektroskopische Methode stellt eine neue Bestimmung des Enan-tiomerüberschusses (ee) in den chiralen Alkoholen Menthol, Borneol, 1-Phenylethanol undLinalool unter Einsatz von Phosgen als Derivatisierungsreagenz vor. Phosgen reagiert miteinem chiralen Alkohol zu Carbonsäurediestern, die aus zwei gleichen (RR, SS) oder zweiunterschiedlichen Enantiomeren (RS, SR) entstehen. Diese zwei Diastereomertypen kön-nen anhand der unterschiedlichen, chemischen Verschiebungen ihrer Signale identifiziertwerden. In der vorgestellten Methode wird das Carbonylsignal integriert und zur Bes-timmung des Enantiomerenüberschusses eingesetzt. Die Bestimmungsgrenze ist hierbeiu. a. von dem eingesetzten Phosgen und der Probe abhängig. Bei Menthol wurdeeine Bestimmungsgrenze mittels nicht markiertem Phosgen von ee = 99,1% und mit-tels13C-markiertem Phosgen von ee = 99,9% ermittelt. Die13C Methode wurde zudemzur Qualitätskontrolle der Enantiomerreinheit von Borneol, 1-Phenylethanol sowie vonLinalool eingesetzt. Hierbei enthielten die käuflich erworbenen Chemikalien (-)-Borneolund (S)-1-Phenylethanol jeweils 1,7% des anderen Enantiomers (+)-Borneol bzw. (R)-1-Phenylethanol. Bei (-)-Linalool konnte ein Enantiomerüberschuss von ee = 66,4% undsomit eine größere Verunreinigung durch (+)-Linalool identifiziert werden. Bei Proben,die einen Enantiomerüberschuss von ee < 95,0% aufweisen, sollte eine potentielle, asym-metrische Induktion mittels Kalibrationskurven anhand von künstlichen Enantiomeren-mischungen vorab untersucht werden. Die entwickelte13C kernresonanzspektroskopischeMethode präsentiert eine leistungsstarke Alternative zur Analyse mittels Mosher’s Reagenzfür die Untersuchung des Enantiomerüberschusses in chiralen Alkoholen.Diese Arbeit weist eine Vielfalt an Möglichkeiten der Anwendungen der quantitativen Kern-resonanzspektroskopie in der chemischen Untersuchung von Arzneimitteln, Lebensmittelnund Chemikalien unter Einsatz von Tagging, wie Derivatisierungen und Komplexierun-gen auf. Die hierbei entwickelten kernresonanzspektroskopischen Methoden repräsentierenleistungsstarke Alternativen zu bisher eingesetzten Techniken der Qualitätskontrolle KW - NMR Spektroskopie KW - EDTA KW - Lipid-Peroxide KW - Chiralität KW - Derivsatisierung KW - Peroxidzahl KW - Enantiomerüberschuss KW - qNMR Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219583 ER -