TY - THES A1 - Lerch, Maike Franziska T1 - Characterisation of a novel non-coding RNA and its involvement in polysaccharide intercellular adhesin (PIA)-mediated biofilm formation of \(Staphylococcus\) \(epidermidis\) T1 - Charakterisierung einer neuen nicht-kodierenden RNA und deren Beteiligung an der PIA-vermittelten Biofilmbildung von \(Staphylococcus\) \(epidermidis\) N2 - Coagulase-negative staphylococci, particularly Staphylococcus epidermidis, have been recognised as an important cause of health care-associated infections due to catheterisation, and livestock-associated infections. The colonisation of indwelling medical devices is achieved by the formation of biofilms, which are large cell-clusters surrounded by an extracellular matrix. This extracellular matrix consists mainly of PIA (polysaccharide intercellular adhesin), which is encoded by the icaADBC-operon. The importance of icaADBC in clinical strains provoking severe infections initiated numerous investigations of this operon and its regulation within the last two decades. The discovery of a long transcript being located next to icaADBC, downstream of the regulator gene icaR, led to the hypothesis of a possible involvement of this transcript in the regulation of biofilm formation (Eckart, 2006). Goal of this work was to characterise this transcript, named ncRNA IcaZ, in molecular detail and to uncover its functional role in S. epidermidis. The ~400 nt long IcaZ is specific for ica-positive S. epidermidis and is transcribed in early- and mid-exponential growth phase as primary transcript. The promotor sequence and the first nucleotides of icaZ overlap with the 3' UTR of the preceding icaR gene, whereas the terminator sequence is shared by tRNAThr-4, being located convergently to icaZ. Deletion of icaZ resulted in a macroscopic biofilm-negative phenotype with highly diminished PIA-biofilm. Biofilm composition was analysed in vitro by classical crystal violet assays and in vivo by confocal laser scanning microscopy under flow conditions to display biofilm formation in real-time. The mutant showed clear defects in initial adherence and decreased cell-cell adherence, and was therefore not able to form a proper biofilm under flow in contrast to the wildtype. Restoration of PIA upon providing icaZ complementation from plasmids revealed inconsistent results in the various mutant backgrounds. To uncover the functional role of IcaZ, transcriptomic and proteomic analysis was carried out, providing some hints on candidate targets, but the varying biofilm phenotypes of wildtype and icaZ mutants made it difficult to identify direct IcaZ mRNA targets. Pulse expression of icaZ was then used as direct fishing method and computational target predictions were executed with candidate mRNAs from aforesaid approaches. The combined data of these analyses suggested an involvement of icaR in IcaZ-mediated biofilm control. Therefore, RNA binding assays were established for IcaZ and icaR mRNA. A positive gel shift was maintained with icaR 3' UTR and with 5'/3' icaR mRNA fusion product, whereas no gel shift was obtained with icaA mRNA. From these assays, it was assumed that IcaZ regulates icaR mRNA expression in S. epidermidis. S. aureus instead lacks ncRNA IcaZ and its icaR mRNA was shown to undergo autoregulation under so far unknown circumstances by intra- or intermolecular binding of 5' UTR and 3' UTR (Ruiz de los Mozos et al., 2013). Here, the Shine-Dalgarno sequence is blocked through 5'/3' UTR base pairing and RNase III, an endoribonuclease, degrades icaR mRNA, leading to translational blockade. In this work, icaR mRNA autoregulation was therefore analysed experimentally in S. epidermidis and results showed that this specific autoregulation does not take place in this organism. An involvement of RNase III in the degradation process could not be verified here. GFP-reporter plasmids were generated to visualise the interaction, but have to be improved for further investigations. In conclusion, IcaZ was found to interact with icaR mRNA, thereby conceivably interfering with translation initiation of repressor IcaR, and thus to promote PIA synthesis and biofilm formation. In addition, the environmental factor ethanol was found to induce icaZ expression, while only weak or no effects were obtained with NaCl and glucose. Ethanol, actually is an ingredient of disinfectants in hospital settings and known as efficient effector for biofilm induction. As biofilm formation on medical devices is a critical factor hampering treatment of S. epidermidis infections in clinical care, the results of this thesis do not only contribute to better understanding of the complex network of biofilm regulation in staphylococci, but may also have practical relevance in the future. N2 - Koagulase-negative Staphylokokken besiedeln die menschliche und tierische Haut, sowie die Schleimhäute. Durch Läsionen oder das Einbringen von medizinischen Instrumenten wie Kathetern gelangen sie in tiefere Hautschichten oder die Blutbahn und können dort schwerwiegende Infektionen auslösen, vor Allem bei Risikopersonen. Besonders Staphylococcus epidermidis hat sich als Verursacher von nosokomialen Infektionen, aber auch als Pathogen in der Tierhaltung etabliert. Die Bakterien bilden bei der Besiedlung sogenannte Biofilme aus (d.h. eine Akkumulation der Keime, die von einer extrazellulären Matrix umgeben sind). Diese Matrix besteht neben Proteinen und eDNA hauptsächlich aus einem Polysaccharid, dem interzellulären Adhäsin PIA (engl.: polysaccharide intercellular adhesin). Dieses wird durch die Ica-Proteine synthetisiert, die im icaADBC-Operon (engl.: intercellular adhesin operon) kodiert sind. Das Operon hat große Bedeutung in klinischen Stämmen und wurde daher innerhalb der letzten beiden Jahrzehnte eingehend untersucht, auch im Hinblick auf seine Regulation. In der unmittelbaren Umgebung des icaADBC-Operons, stromabwärts des icaR Gens, das für den Repressor des ica-Operons (IcaR) kodiert, wurde ein großes Transkript identifiziert, von dem vermutet wird, dass es möglicherweise an der Regulation der Biofilmbildung beteiligt ist (Eckart, 2006). Ziel dieser Arbeit war es, dieses Transkript zu charakterisieren und seine Funktion in S. epidermidis aufzudecken. Die nicht-kodierende RNA, genannt IcaZ, hat eine Länge von ~400 nt und ist spezifisch für ica-positive S. epidermidis. Sie wird in der frühen bis mittleren exponentiellen Phase temperaturabhängig exprimiert. Stromaufwärts überlappt das icaZ-Gen und dessen Promotor mit der 3' UTR vom icaR-Gen. Stromabwärts wird das icaZ-Gen vom einem Transkriptionsterminator begrenzt, der auch für das tRNAThr-4-Gen benutzt wird, das auf dem gegenüberliegenden Strang in Richtung des icaZ-Gens lokalisiert ist. Die Deletion der RNA führte zu einem makroskopisch sichtbaren Biofilm-negativen Phänotyp mit deutlich verminderter PIA Bildung. Die Biofilmzusammensetzung wurde in vitro mittels eines klassischen Kristallviolett-Assays gemessen und die Biofilmbildung in vivo in Echtzeit mittels konfokaler Mikroskopie (CLSM) betrachtet. Dabei wurde mit einer peristaltischen Pumpe ein Mediumfluss appliziert. Die Mutante zeigte klare Defekte in der initialen Adhärenz und in der Zell-Zell Adhäsion. Sie bildete im Gegensatz zum Wildtyp keinen strukturierten Biofilm aus. Zur Komplementierung des Biofilms wurde die IcaZ von einem Plasmid exprimiert und die Biofilmzusammensetzung nach 18-20 Stunden Wachstum gemessen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen in den verschiedenen Mutanten waren nicht eindeutig. Um die Funktion von IcaZ aufzudecken, wurden Transkriptom- und Proteomvergleiche zwischen Wildtyp und Mutante gemacht. Diese lieferten einige Hinweise, aber da der metabolische Unterschied eines Biofilmbildners zu einem Nicht-Biofilmbildner zu groß war, wurde eine direktere Methode angewandt, die induzierte Expression (Pulsexpression). Zudem wurden potentielle Interaktionspartner der IcaZ mittels computer-basierter Bindungsvorhersagen analysiert. Die icaR mRNA kristallisierte sich dabei als Target heraus und die Interaktion zwischen IcaZ und icaR mRNA wurde mit Gelshift-Assays (EMSA) untersucht. Eine Bandenverschiebung wurde mit icaR 3' UTR und mit dem icaR-5'-3' UTR-Fusionsprodukt detektiert, wohingegen keine Interaktion zwischen IcaZ und icaA mRNA stattfand. Aufgrund dieser Assays wurde vermutet, dass IcaZ die Translation von icaR in S. epidermidis reguliert. In S. aureus fehlt die nicht-kodierende RNA IcaZ und für icaR mRNA wurde eine Autoregulation gezeigt, bei der die icaR 5' UTR mit der icaR 3' UTR intramolekular oder intermolekular durch Basenpaarung interagiert, wodurch die Shine-Dalgarno Sequenz blockiert wird und es aufgrund dessen zu einer Hemmung der Translation kommt. Die Umweltfaktoren, die dazu führen sind bisher unbekannt. Der Komplex wird durch eine Endoribonuklease, RNase III, abgebaut (Ruiz de los Mozos et al., 2013). In S. epidermidis wurde eine solche Interaktion theoretisch ausgeschlossen. Experimentelle Analysen dieser Arbeit haben gezeigt, dass diese Autoregulation in S. epidermidis nicht stattfinden kann und es wird angenommen, dass IcaZ diese Regulation übernimmt. Um die Interaktion zu visualisieren wurden GFP-Reporter Plasmide generiert, die aber für weitere Experimente noch zu verbessern sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass IcaZ mit der icaR mRNA interagiert, was höchstwahrscheinlich zu einer Hemmung der Translation des Repressors IcaR führt und damit letztlich PIA-Synthese und Biofilmbildung positiv reguliert. Zusätzlich wurde gefunden, dass Ethanol die Expression der IcaZ-RNA induziert, während NaCl nur schwache Effekte zeigte und Glucose keinen Einfluss auf die Expression von icaZ hatte. Ethanol ist ein Bestandteil von Desinfektionsmitteln, die in Krankenhäusern verwendet werden und ist bekannt dafür Biofilmbildung auszulösen. Da die Bildung von Biofilmen auf medizinischen Geräten kritisch ist und diese die Behandlung von S. epidermidis Infektionen erschweren, tragen die Ergebnisse dieser Arbeit nicht nur zu einem besseren Verständnis des komplexen Netzwerks der Biofilmregulation bei, sondern haben möglicherweise auch praktischen Nutzen in der Zukunft. KW - Biofilm KW - Staphylococcus epidermidis KW - Non-coding RNA KW - Hospitalismus KW - icaADBC KW - Nosocomial Infections KW - Polysaccharide intercellular adhesin (PIA) KW - Biofilm formation KW - non-coding RNA KW - ncRNA KW - Nosokomiale Infektionen Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155777 ER - TY - THES A1 - Garcia Betancur, Juan Carlos T1 - Divergence of cell-fates in multicellular aggregates of \(Staphylococcus\) \(aureus\) defines acute and chronic infection cell types T1 - Divergenz von Zelldifferenzierung in multizellulären Aggregaten von \(Staphylococcus\) \(aureus\) grenzt Zelllinien für akute und chronische Infektionen voneinander ab N2 - Staphylococcus aureus is a versatile human pathogen that normally develops acute or chronic infections. The broad range of diseases caused by this bacterium facilitates the escape from the host's immune response as well as from target-specific antimicrobial therapies. Nevertheless, the underlying cellular and molecular mechanisms that enable S. aureus to cause these disparate types of infections are largely unknown. In this work, we depicted a novel genetic program involved in the development of cell-fate decision, which promotes the differentiation of the staphylococcal cells into two genetically identical but differently heritable cell lines capable of defining the course of an infection, by simultaneously progressing to (i) a biofilm-associated chronic infection or (ii) a disperse acute bacteremia. Here, S. aureus growing in architecturally complex multicellular communities harbored different cell types that followed an exclusive developmental plan, resulting in a clonal heterogeneous population. We found that these cell types are physiologically specialized and that, this specialization impacts the collective behavior within the multicellular aggregates. Whereas one cell line that we named BRcells, promotes biofilm formation that engenders chronic infections, the second cell line, which we termed DRcells is planktonic and synthetizes virulence factors, such as toxins that can drive acute bacteremia. We identified that the positive feedback loop present in Agr quorum sensing system of S. aureus acts a bimodal switch able to antagonistically control the divergence of these two physiologically distinct, heritable cell lines. Also, we found that this bimodal switch was triggered in response to environmental signals particularly extracellular Mg2+, affecting the size of the subpopulations in specific colonization environments. Specifically, Mg2+-enriched environments enhanced the binding of this cation to the staphylococcal teichoic acids, increasing the rigidity of the cell wall and triggering a genetic program involving the alternative sigma factor σB that downregulated the Agr bimodal switch, favoring the enrichment of the BRcells type. Therefore, colonization environments with different Mg2+ content favored different outcomes in the bimodal system, defining distinct ratio in the BRcells/DRcells subpopulations and the S. aureus outcome in our in vitro model of development of multicellular aggregates and, the infection outcome in an in vivo mice infection model. In this prime human pathogen cell-fate decision-making generates a conserved pattern of heritable, physiological heterogeneity that actively contributes to determine the course of an infection through the emergence and spatio-temporal dynamics of distinct and specialized cell types. In conclusion, this work demonstrates that cell differentiation in pathogenic bacteria is a fundamental phenomenon and its understanding, is central to understand nosocomial infections and to designing new anti-infective strategies N2 - Staphylococcus aureus ist ein wandlungsfähiges humanes Pathogen, das im Allgemeinen akute oder chronische Infektionen entwickelt. Das breite Spektrum von Krankheiten, die von diesem Bakterium verursacht werden, erleichtert es, sowohl der Immunantwort des Wirts als auch gezielten antimikrobiellen Therapien zu entgehen. Dennoch sind die zellulären und molekularen Mechanismen, die S. aureus die Entwicklung dieser verschiedenartigen Infektionsarten ermöglichen, weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit beschreiben wir ein neues genetisches Programm, das bei der Entwicklung der Zelldifferenzierung beteiligt ist und die Differenzierung der Staphylokokken-Zellen in zwei genetisch identische, aber unterschiedliche, erbliche Zelllinien fördert. Diese können den Verlauf einer Infektion bestimmen, indem sie sich gleichzeitig entwickeln zu (i) einer Biofilm-assoziierten chronischen Infektion oder (ii) einer sich ausbreitenden akuten Bakteriämie. Hier verbirgt S. aureus, der in architektonisch komplexen multizellulären Bakteriengemeinschaften wächst, verschiedene Zelltypen, die einem einzigartigen Entwicklungsplan folgen, resultierend in einer klonal heterogenen Population. Wir haben festgestellt, dass diese Zellzypen physiologisch spezialisiert sind, und dass diese Spezialisierung das kollektive Verhalten innerhalb der multizellulären Aggregate beeinflusst. Während eine Zelllinie, die wir als BRcells benennen, Biofilm-Bildung fördert, was chronische Infektionen erzeugt, ist die zweite Zelllinie, als DRcells bezeichnet, planktonisch und synthetisiert Virulenzfaktoren wie Toxine, die eine akute Bakteriämie verursachen können. Wir haben identifiziert, dass die im Agr Quorum sensing System von S. aureus vorhandene positive Rückkopplung als bimodaler Schalter agiert, der antagonistisch die Divergenz dieser beiden physiologisch unterschiedlichen, vererbbaren Zelllinien kontrolliert. Wir haben auch gefunden, dass dieser bimodale Schalter durch Signale aus der Umgebung ausgelöst wird, insbesondere durch extrazelluläres Mg2+, wodurch die Größe der Subpopulationen in spezifischen Kolonisierungsumgebungen beeinflusst wird. Besonders Mg2+-angereicherte Umgebungen fördern die Bindung dieses Kations mit den Teichonsäuren von Staphylokokken, welche die Steifigkeit der Zellwand erhöhen und ein genetisches Programm initialisieren, welches den alternativen Sigmafaktor σB beinhaltet. Dieser regelt den bimodalen Agr Schalter herunter und begünstigt die Anreicherung des Brcells Zelltyps. Daher begünstigen verschiedene Kolonisierungsumgebungen mit verschiedenem Mg2+ Gehalt unterschiedliche Ergebnisse im bimodalen System, welche sich in individuellen Verhältnissen der Brcells/Drcells Subpopulationen und dem Ergebnis für S. aureus – sowohl in unserem in vitro Modell der Entwicklung multizellulärer Aggregate als auch der Entzündungsentwicklung in einem in vivo Maus-Infektionsmodell. In diesem primären Humanpathogen generiert die Zelldifferenzierung ein bleibendes Muster von vererbbarer, physiologischer Heterogenität, die aktiv dazu beiträgt, den Infektionsverlauf durch das Auftreten und die räumlich-zeitliche Dynamik verschiedener spezialisierter Zelltypen zu bestimmen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass Zelldifferenzierung in pathogenen Bakterien ein grundlegendes Phänomen ist. Diese zu erfassen ist zentral für das Verständnis nosokomialer Infektionen und die Konzeption neuer Strategien gegen Infektionen. KW - Staphylococcus aureus KW - Zelldifferenzierung KW - Pathogenität KW - Biofilm KW - Cell differentiation KW - Multicellular aggregates KW - Biofilms KW - Multizellulären Bakteriengemeinschaften Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-148059 ER - TY - THES A1 - Makgotlho, Phuti Edward T1 - Molecular characterization of the staphylococcal two component system sae and its role in the regulation of the adhesin Eap under SDS stress stimulation T1 - Die molekulare charakterisierung des zwei komponenten-systems sae in staphylokokken und seiner rolle in der Regulation des Eap adhäsins unter SDS vermittelten stress bedingungen N2 - The Staphylococcus aureus two component system (TCS) sae governs expression of numerous virulence factors, including Eap (extracellular adherence protein), which in turn among other functions also mediates invasion of host cells. The sae TCS is encoded by the saePQRS operon, with saeS coding for the sensor histidine kinase (SaeS) and saeR encoding the response regulator (SaeR). The saeRS system is preceded by two additional open reading frames (ORFs), saeP and saeQ, which are predicted to encode a lipoprotein (SaeP) and a membrane protein (SaeQ), respectively. Earlier, we have shown that SDS-containing subinhibitory concentrations of biocides (Perform®) and SDS alone activate sae transcription and increase cellular invasiveness in S. aureus strain Newman. The effect is associated with an amino acid exchange in the N-terminus of SaeS (L18P), specific to strain Newman. In this work, the role of whether the two additional genes, saePQ coding for the accessory proteins SaeP and SaeQ, respectively, are involved in SDS-mediated saeRS was investigated. It could demonstrated that the lack of the SaeP protein resulted in an increased saeRS transcription without SDS stress in both SaeSL/P variants, while the SDS effect was less pronounced on sae and eap expression compared to the Newman wildtype, suggesting that the SaeP protein represses the sae system. Also, SDS-mediated inductions of sae and eap transcription along with enhanced invasion were found to be dependent on presence of the SaeSP variant in Newman wildtype. On the other hand, the study also shows that the saePQ region of the sae operon is required for fully functional two-component system saeRS under normal growth conditions, but it is not involved in SDS-mediated activation of the saeS signaling and sae-target class I gene, eap. In the second approach, the study investigates whether SDS-induced sae expression and host cell invasion is common among S. aureus strains not carrying the (L18P) point mutation. To demonstrate this strain Newman, its isogenic saeS mutants, and various S. aureus isolates were analysed for sae, eap expression and cellular invasiveness. Among the strains tested, SDS exposure resulted only in an increase of sae transcription, Eap production and cellular invasiveness in strain Newman wild type and MRSA strain ST239-635/93R, the latter without an increase in Eap. Interestingly, the epidemic community-associated MRSA strain, USA300 LAC showed a biphasic response in sae transcription at different growth stages, which, however, was not accompanied by increased invasiveness. All other clinical isolates investigated displayed a decrease of the parameters tested. While in strain Newman the SDS effect was due to the saeSP allele, this was not the case in strain ST239-635/93R and the biphasic USA300 strains. Also, increased invasiveness of ST239-635/93R was found to be independent of Eap production. Furthermore, to investigate the global effect of SDS on sae target gene expression, strain Newman wild-type and Newman ∆sae were treated with SDS and analyzed for their transcription profiles of sae target genes using microarray assays. We could show that subinhibitory concentrations of SDS upregulate and downregulate gene expression of several signaling pathways involved in biosynthetic, metabolic pathways as well as virulence, host cell adherence, stress reponse and many hypothetical proteins. In summary, the study sheds light on the role of the upstream region saePQ in SDS-mediated saeRS and eap expression during S. aureus SDS stress. Most importantly, the study also shows that subinhibitory SDS concentrations have pronounced strain-dependent effects on sae transcription and subsequent host cell invasion in S. aureus, with the latter likely to be mediated in some strains by other factors than the known invasin Eap and FnBP proteins. Moreover, there seems to exist more than the saeSP-mediated mechanism for SDS-induced sae transcription in clinical S. aureus isolates. These results help to further understand and clarify virulence and pathogenesis mechanisms and their regulation in S. aureus. N2 - Das Zwei Komponenten-Systems (TCS) Sae in S. aureus reguliert die Expression einer Vielzahl von Virulenzfaktoren, dazu gehört unter anderem das extrazelluläre Adhärenzprotein Eap, welches neben weiteren Funktionen, die Invasion in eukaryotische Wirtszellen vermittelt. Die Gene des sae TCS sind in einem Operon organisiert (saePQRS), wobei saeS für die sensorische Histidinkinase (SaeS) und saeR für den „Response Regulator“ (SaeR) kodieren. Diesen Genen sind zwei weitere Genabschnitte, saeP und saeQ, vorangestellt, wobei saeP vermutlich für ein Lipoprotein (SaeP) und saeQ für ein Membranprotein (RelQ) kodieren. In einer früheren Arbeit konnten wir zeigen, dass SDS-haltige Biozide (Perform©) unter sub- inhibitorischen Konzentrationen, sowie reines SDS, die sae Transkription aktiviert und dadurch zu einer erhöhten Invasion des S. aureus Stamms Newman in Wirtszellen führt. Dieser Effekt ist assoziiert mit einem spezifischen Aminosäureaustausch im N-terminus von SaeS (L18P) des Stamm Newman. In dieser Arbeit soll nun die Beteiligung der zwei zusätzlichen Gene, saeP und saeQ, an der SDS vermittelten transkriptionellen Induktion von saeR/S untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass ohne SaeP, die saeR/S Transkription in beiden SaeL/P Varianten erhöht war, wobei eine zusätzliche SDS Behandlung hierfür nicht notwendig war. Im Gegenteil, es zeigte sich, dass der SDS Effekt auf die sae und eap Expression in der saeP Mutante deutlich weniger ausgeprägt ist als im Wildtyp Stamm. Das läßt vermuten, dass das Lipoprotein SaeP repremierend auf das sae System einwirkt. Des Weiteren wurde festgestellt, dass die SDS vermittelte transkriptionelle Induktion von sae und eap, zusammen mit der erhöhten Invasion, abhängig vom vorhanden sein der SaeSP Variante im Newman Wildtyp Stamm ist. Die Arbeit zeigt, dass die saePQ Region wichtig ist für die vollständige Funktion des Zwei Komponenten Systems SaeRS unter normalen Wachstumsbedingungen. Jedoch ist diese Region nicht involviert in der Aktivierung von SaeS, mit SDS als Signalgeber, sowie der darauffolgenden Aktivierung des sae Zielgens eap. In einem zweiten Ansatz wurde untersucht, ob die SDS induzierte sae Expression und Wirtszellinvasion auch häufig in S. aureus Stämmen auftritt, welche keine (L18P) Punktmutation besitzen. Dafür wurde Stamm Newman, die isogene saeS Mutante und verschiedene S. aureus Klinikisolate auf ihre sae, eap Expression, sowie zelluläre Invasionsfähigkeit hin analysiert. Von den getesteten Stämmen reagiert nur Wildtyp Stamm Newman und ein MRSA Stamm ST239-635/93R mit gesteigerter sae Transkription, Eap Produktion und zellulärer Invasion. Der MRSA Stamm jedoch ohne erhöhte Eap Produktion. Interessanterweise zeigt der „community- associated“ MRSA Stamm USA300 LAC eine biphasische sae Transkription in verschiedenen Wachstumsphasen, welche jedoch nicht einhergeht mit erhöhter Invasion. Alle anderen Klinikisolate zeigten abnehmende Tendenzen in den getesteten Parametern. Während im Stamm Newman der SDS Effekt auf das saeSP Allel zurückzuführen ist, gilt dies nicht für den Stamm ST239-635/93R, sowie den biphasischen Stamm USA300. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die erhöhte Invasion des Stamms ST239-635/93R unabhängig von seiner Eap Produktion ist. Des Weiteren zeigten wir den globalen Effekt von SDS auf die sae Zielgenexpression. Dafür behandelten wir Wildtyp Stamm Newman mit SDS und analysierten die Transkription der sae Zielgene mittels Microarray Analyse. Wir konnten zeigen, dass subinhibitorische SDS Konzentrationen, induzierende als auch repremierende Auswirkungen auf die Genexpression haben. Dabei sind Gene betroffen, die involviert sind in verschiedene Signalwege, Biosynthese/Metabolismus als auch in Virulenz, Wirtzelladhärenz und Stressantwort. Zusammenfassend gibt die Arbeit Aufschluss über die Rolle der „upstream“ Region saePQ hinsichtlich der SDS-abhängigen saeRS und eap Expression in S. aureus. Am wichtigsten ist hierbei die Erkenntnis, das subinhibitorische SDS Konzentrationen einen deutlichen stammabhängigen Effekt auf die sae Transkription und daraus folgernd auf die Wirtszellinvasion von S. aureus haben. Letzteres wird vermutlich in manchen Stämmen durch andere Faktoren als die bekannten Invasinproteine Eap und FnBP vermittelt. Außerdem scheint es in den klinischen S. aureus Isolaten mehr als nur den saeSP abhängigen Mechanismus der sae Induktion durch SDS zu geben. Diese Ergebnisse helfen uns die Virulenz und pathogenen Mechanismen als auch deren Regulation in S. aureus zu verstehen. Die Beobachtungen tragen zu unserem Verständnis bei, wie das sae System Signale der Umgebung detektieren kann. Dies ist bis jetzt eine Fragestellung mit vielen Unbekannten. KW - Staphylococcus aureus KW - Eap KW - Newman strain sae KW - virulence KW - Cellular invasion Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149403 ER - TY - THES A1 - Wencker, Freya Dorothea Ruth T1 - The methionine biosynthesis operon in \(Staphylococcus\) \(aureus\): Role of concerted RNA decay in transcript stability and T-box riboswitch turnover T1 - Das Methioninbiosynthese-Operon in \(Staphylococcus\) \(aureus\): Der Einfluss von koordiniertem RNA Abbau auf Transkriptstabilität und T-Box-Riboswitch-Prozessierung N2 - Methionine is the first amino acid of every newly synthesised protein. In combination with its role as precursor for the vital methyl-group donor S-adenosylmethionine, methionine is essential for every living cell. The opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is capable of synthesising methionine de novo, when it becomes scarce in the environment. All genes required for the de novo biosynthesis are encoded by the metICFE-mdh operon, except for metX. Expression is controlled by a hierarchical network with a methionyl-tRNA-specific T-box riboswitch (MET-TBRS) as centrepiece, that is also referred to as met leader (RNA). T-box riboswitches (TBRS) are regulatory RNA elements located in the 5’-untranslated region (5’-UTR) of genes. The effector molecule of T-box riboswitches is uncharged cognate tRNA. The prevailing mechanism of action is premature termination of transcription of the nascent RNA in the absence of the effector (i.e. uncharged cognate tRNA) due to formation of a hairpin structure, the Terminator stem. In presence of the effector, a transient stabilisation of the alternative structure, the Antiterminator, enables transcription of the downstream genes (‘read-through’). Albeit, after the read-through the thermodynamically more stable Terminator eventually forms. The Terminator and the Antiterminator are two mutually exclusive structures. Previous work of the research group showed that in staphylococci the MET-TBRS ensures strictly methionine-dependent control of met operon expression. Uncharged methionyl-tRNA that activates the system is only present in sufficient amounts under methionine-deprived conditions. In contrast to other bacterial TBRS, the staphylococcal MET-TBRS has some characteristic features regarding its length and predicted secondary structure whose relevance for the function are yet unkown. Aim of the present thesis was to experimentally determine the structure of the met leader RNA and to investigate the stability of the met operon-specific transcripts in the context of methionine biosynthesis control. Furthermore, the yet unknown function of the mdh gene within the met operon was to be determined. In the context of this thesis, the secondary structure of the met leader was determined employing in-line probing. The structural analysis revealed the presence of almost all highly conserved T-box riboswitch structural characteristics. Furthermore, three additional stems, absent in all T-box riboswitches analysed to date, could be identified. Particularly remarkable is the above average length of the Terminator stem which renders it a potential target of the double-strand-specific endoribonuclease III (RNase III). The RNase III-dependent cleavage of the met leader could be experimentally verified by the use of suitable mutants. Moreover, the exact cleavage site within the Terminator was determined. The unusual immediate separation of the met leader from the met operon mRNA via the RNase III cleavage within the Terminator stem induces the rapid degradation of the met leader RNA and, most likely, that of the 5’-region of the met mRNA. The met mRNA is degraded from its 5’-end by the exoribonuclease RNase J. The stability of the met mRNA was found to vary over the length of the transcript with an instable 5’-end (metI and metC) and a longer half-life towards the 3’-end (metE and mdh). The varying transcript stability is reflected by differences in the available cellular protein levels. The obtained data suggest that programmed mRNA degradation is another level of regulation in the complex network of staphylococcal de novo methionine biosynthesis control. In addition, the MET-TBRS was studied with regard to a future use as a drug target for novel antimicrobial agents. To this end, effects of a dysregulated methionine biosynthesis on bacterial growth and survival were investigated in met leader mutants that either caused permanent transcription of the met operon (‘ON’) or prevented operon transcription (‘OFF’), irrespective of the methionine status in the cell. Methionine deprivation turned out to be a strong selection pressure, as ‘OFF’ mutants acquired adaptive mutations within the met leader to restore met operon expression that subsequently re-enabled growth. The second part of the thesis was dedicated to the characterisation of the Mdh protein that is encoded by the last gene of the met operon and whose function is unknown yet. At first, co-transcription and -expression with the met operon could be demonstrated. Next, the Mdh protein was overexpressed and purified and the crystal structure of Mdh was solved to high resolution by the Kisker research group (Rudolf-Virchow-Zentrum Würzburg). Analysis of the structure revealed the amino acid residues crucial for catalytic activity, and zinc was identified as a co-factor of Mdh. Also, Mdh was shown to exist as a dimer. However, identification of the Mdh substrate was, in the context of this thesis, (still) unsuccessful. Nevertheless, interactions of Mdh with enzymes of the met operon could be demonstrated by employing the bacterial two-hybrid system. This fact and the high conservation of mdh/Mdh on nucleotide and amino acid level among numerous staphylococcal species suggests an important role of Mdh within the methionine metabolism that should be a worthwhile subject of future research. N2 - Methionin ist die erste Aminosäure in jedem neu gebildeten Protein. Zusammen mit seiner Funktion als Vorläufermolekül für die Synthese des essenziellen Methylgruppendonors S-Adenosylmethionin ist Methionin damit für jede lebende Zelle unverzichtbar. Staphylococcus aureus, ein opportunistisches Humanpathogen, ist in der Lage, Methionin de novo zu synthetisieren, wenn es nicht in ausreichender Menge in der Umgebung vorhanden ist. Mit Ausnahme von MetX sind alle für die Methioninsynthese benötigten Enzyme im metICFE-mdh-Operon kodiert. Die Expression des Operons wird durch ein komplexes hierarchisches Netzwerk reguliert, dessen zentrales Steuerelement ein Methionyl-tRNA-spezifischer T-Box-Riboswitch (MET-TBRS) ist, der auch als met-leader (RNA) bezeichnet wird. T-Box Riboswitches (TBRS) sind regulatorische RNA-Elemente, die in der untranslatierten Region am 5'-Ende (5'-UTR) ihrer zu kontrollierenden Gene liegen. Sie nutzen unbeladene tRNAs als Effektormoleküle. Die Funktionsweise der meisten TBRS beruht auf dem vorzeitigen Abbruch der Transkription der naszierenden mRNA, der durch die Ausbildung einer Haarnadelstruktur (Terminator) im Transkript herbeigeführt wird, wenn das Effektormolekül (i.e. unbeladene tRNA) fehlt. Sobald passende unbeladene tRNA verfügbar ist und bindet, wird eine alternative Struktur, der Antiterminator, kurzzeitig stabilisiert, der die Transkription und damit ein "Durchlesen" in die stromabwärtsliegenden Gene ermöglicht. Terminator und Antiterminator sind zwei sich gegenseitig ausschließende Strukturen, wobei der Terminator die thermodynamisch deutlich stabilere Struktur des TBRS ist, die sich dementsprechend auch in den vollständigen Transkripten erneut ausbildet. Bisherige Vorarbeiten der Arbeitsgruppe zeigten, dass in Staphylokokken der MET-TBRS die Kontrolle der Methioninsynthese in strikter Abhängigkeit von Methionin gewährleistet. Unbeladene Methionyl-tRNA, die nur unter Methioninmangelbedingungen in ausreichenden Konzentrationen vorliegt, aktiviert das System. Im Unterschied zu anderen bakteriellen TBRS weist der Staphylokokken-MET-TBRS (met-leader) hinsichtlich seiner Länge und vorhergesagten Struktur einige Besonderheiten auf, deren Bedeutung für die Funktion bislang unklar sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Struktur der met-leader-RNA experimentell zu bestimmen und die Stabilität met-Operon-spezifischer Transkripte im Kontext der Methioninbiosynthesekontrolle zu untersuchen. Ebenso sollte die bisher unbekannte Funktion des mdh-Genes im Operon aufgeklärt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Sekundärstruktur der met-leader-RNA mit Hilfe des so genannten In-line Probings bestimmt. Die Sekundärstruktur weist neben fast allen hochkonservierten Strukturmerkmalen eines T-Box-Riboswitches auch drei zusätzliche Haarnadelstrukturen auf, die bisher in keinem anderen T-Box-Riboswitch gefunden wurden. Besonders auffällig ist die überdurchschnittliche Länge des met-leader-Terminators, der dadurch zur potentiellen Zielstruktur für die Doppelstrang-spezifische Endoribonuklease RNase III wird. Mittels geeigneter Mutanten konnte die RNase III-abhängige Prozessierung der met-leader-RNA experimentell bewiesen werden. Ebenso wurde die exakte Schnittstelle im Terminator bestimmt. Die ungewöhnliche Prozessierung des Terminators durch die RNase III spaltet die met-leader-RNA von der met-mRNA ab, was den raschen weiteren Abbau der met-leader-RNA und sehr wahrscheinlich auch den der met-mRNA einleitet. So wird die met-mRNA durch die Exoribonuklease RNase J vom 5'-Ende her abgebaut, wobei die Stabilität bezogen auf die Gesamtheit des Moleküls stark variiert: Das 5'-Ende mit den Genen metI und metC wird äußerst schnell degradiert, während das 3'-Ende mit metE und mdh deutlich stabiler ist. Die variierende mRNA-Stabilität spiegelt sich auch in Unterschieden hinsichtlich der verfügbaren zellulären Proteinmengen wider. Die Daten legen daher nahe, dass programmierte mRNA-Degradation eine weitere Ebene im komplexen Kontrollnetzwerk darstellt, durch die in Staphylokokken die Methioninbiosynthese sehr exakt den jeweiligen Bedürfnissen angepasst wird. Des Weiteren wurde der MET-TBRS im Hinblick auf eine zukünftige Nutzung als Angriffspunkt für neue antibakterielle Wirkstoffe untersucht. Dazu wurden die Auswirkungen einer dysregulierten Methioninbiosynthese auf das bakterielle Wachstum und Überleben mit Hilfe von met-leader-Mutanten analysiert, die entweder zu einer permanenten Aktivierung („ON“) oder Deaktivierung („OFF“) der met-Operon-Transkription, unabhängig vom Methioninstatus in der Zelle, führten. Es zeigte sich, dass Methioninmangel einen starken Selektionsdruck darstellt, da die „OFF“-Mutanten in der Lage waren, durch den Erwerb von adaptiven Mutationen innerhalb der met-leader-Sequenz, das met-Operon erneut zu aktivieren und wieder zu wachsen. Der zweite Teil dieser Arbeit widmete sich der Charakterisierung des Mdh-Proteins, das im letzten Gen des met-Operons kodiert ist und dessen Funktion derzeit gänzlich unbekannt ist. Zunächst konnte die Kotranskription und -expression von mdh mit dem met-Operon gezeigt werden. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Kisker (Rudolf-Virchow-Zentrum Würzburg) wurden anhand von Kristallstrukturanalysen die Aminosäuren identifiziert, die entscheidend für die katalytische Aktivität des Mdh-Enzyms sind, wobei Zink als ein Kofaktor fungiert. Ebenso zeigte sich, dass Mdh als Dimer vorliegt. Allerdings ist die Identifizierung des Mdh-Substrates im Rahmen dieser Arbeit (noch) nicht gelungen. Mittels eines bakteriellen Zwei-Hybridsystems wurde jedoch nachgewiesen, dass Mdh mit den anderen Enzymen des met-Operons interagiert. Dies und die hohe Konservierung von mdh/Mdh auf Nukleotid- und Aminosäureebene in verschiedenen Staphylokokkenarten legt eine wichtige Funktion von Mdh im Methioninstoffwechsel nahe, die lohnenswerter Gegendstand weiterer Untersuchungen sein sollte. KW - Staphylococcus aureus KW - RNA Abbau KW - Methioninbiosynthese KW - MET-T-box riboswitch KW - riboswitch KW - methionine biosynthesis KW - RNA decay Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207124 ER - TY - THES A1 - Blättner, Sebastian T1 - The role of the non-ribosomal peptide synthetase AusAB and its product phevalin in intracellular virulence of Staphylococcus aureus T1 - Die Rolle der nicht-ribosomalen Peptidsynthetase AusAB und ihres Produktes Phevalin in der intrazellulären Virulenz von Staphylococcus aureus N2 - Staphylococcus aureus is a prevalent commensal bacterium which represents one of the leading causes in health care-associated bacterial infections worldwide and can cause a variety of different diseases ranging from simple abscesses to severe and life threatening infections including pneumonia, osteomyelitis and sepsis. In recent times multi-resistant strains have emerged, causing severe problems in nosocomial as well as community-acquired (CA) infection settings, especially in the United States (USA). Therefore S. aureus has been termed as a superbug by the WHO, underlining the severe health risk originating from it. Today, infections in the USA are dominated by S. aureus genotypes which are classified as USA300 and USA400, respectively. Strains of genotype USA300 are responsible for about 70% of the CA infections. The molecular mechanisms which render S. aureus such an effective pathogen are still not understood in its entirety. For decades S. aureus was thought to be a strictly extracellular pathogen relying on pore-forming toxins like α-hemolysin to damage human cells and tissue. Only recently it has been shown that S. aureus can enter non-professional phagocytes, using adhesins like the fibronectin-binding proteins which mediate an endocytotic uptake into the host cells. The bacteria are consequently localized to endosomes, where the degradation of enclosed bacterial cells through phagosome maturation would eventually occur. S. aureus can avoid degradation, and translocate to the cellular cytoplasm, where it can replicate. The ability to cause this so-called phagosomal escape has mainly been attributed to a family of amphiphilic peptides called phenol soluble modulins (PSMs), but as studies have shown, they are not sufficient. In this work I used a transposon mutant library in combination with automated fluorescence microscopy to screen for genes involved in the phagosomal escape process and intracellular survival of S. aureus. I thereby identified a number of genes, including a non-ribosomal peptide synthetase (NRPS). The NRPS, encoded by the genes ausA and ausB, produces two types of small peptides, phevalin and tyrvalin. Mutations in the ausAB genes lead to a drastic decrease in phagosomal escape rates in epithelial cells, which were readily restored by genetic complementation in trans as well as by supplementation of synthetic phevalin. In leukocytes, phevalin interferes with calcium fluxes and activation of neutrophils and promotes cytotoxicity of intracellular bacteria in both, macrophages and neutrophils. Further ausAB is involved in survival and virulence of the bacterium during mouse lung pneumoniae. The here presented data demonstrates the contribution of the bacterial cyclic dipeptide phevalin to S. aureus virulence and suggests, that phevalin directly acts on a host cell target to promote cytotoxicity of intracellular bacteria. N2 - Staphylococcus aureus ist ein weit verbreitetes kommensales Bakterium, welches zugleich einer der häufigsten Verursacher von Krankenhausinfektionen ist, und eine Reihe verschiedener Krankheiten, angefangen bei simplen Abszessen, bis hin zu schweren Erkrankungen wie Lungenentzündung, Osteomylitis und Sepsis verursachen kann. Das Risiko durch nosokomiale sowie epidemische S. aureus Infektionen ist in den vergangenen Jahren weiter gestiegen. Dazu beigetragen hat das Auftreten multiresistenter und hoch cytotoxischer Stämme, vor allem in den USA. Als Konsequenz hat die WHO S. aureus inzwischen als „Superbug“ tituliert und als globales Gesundheitsrisiko eingestuft. Bei CA-Infektionen dominieren die Isolate der Klassifizierung USA300 und USA400, wobei den Erstgenannten bis zu 70% aller in den USA registrierten CA-MRSA Infektionen der letzten Jahre zugesprochen werden. Lange Zeit wurde angenommen, dass S. aureus strikt extrazellulär im Infektionsbereich vorliegt und die cytotoxische Wirkung von z.B. α-Toxin für Wirtszelltod und Gewebeschädigungen verantwortlich ist. Erst vor kurzem wurde festgestellt, dass S. aureus auch durch fakultativ phagozytotische Zellen, wie Epithel- oder Endothelzellen, mittels zahlreicher Adhäsine aufgenommen wird. Die Aufnahme in die Zelle erfolgt zunächst in ein Phagoendosom, in dem die Pathogene durch antimikrobielle Mechanismen abgebaut würden. Um dies zu verhindern, verfügt S. aureus über Virulenzfaktoren, welche die endosomale Membran schädigen. Die Bakterien gelangen so in das Zellzytoplasma, wo sie sich vervielfältigen können, bevor die Wirtszelle schließlich getötet wird. Eine wichtige Funktion in diesem Vorgang konnte bereits in mehreren Studien den Phenol löslichen Modulinen (PSM) zugesprochen werden, Arbeiten unserer Gruppe deuten jedoch darauf hin, dass diese nicht alleine für den phagosomalen Ausbruch von S. aureus verantwortlich sind. In dieser Arbeit verwendete ich eine Transposon Mutantenbibliothek des S. aureus Stammes JE2 (USA300) in Verbindung mit automatisierter Fluoreszenzmikroskopie, um Gene zu identifizieren, die den phagosomalen Ausbruch von S. aureus beeinflussen. Unter den Mutanten, welche eine Minderung der Ausbruchsraten zeigten, fanden sich auch Mutanten in beiden Genen eines Operons, welches für die nicht-ribosomale Peptidsynthetase AusA/B codiert, die die beiden Dipeptide Phevalin und Tyrvalin produziert. Verminderte Ausbruchsraten konnten sowohl durch genetische Komplementation als auch mittels des Zusatzes synthetischen Phevalins wiederhergestellt werden. In Leukozyten verhindert Phevalin effizienten Calcium-Flux und die Aktivierung von Neutrophilen. Zudem fördert Phevalin die Cytotoxizität intrazellulärer Bakterien sowohl in Makrophagen, als auch Neutrophilen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die NRPS AusAB und ihre Produkte eine Rolle beim Überleben der Bakterien während einer Infektion im Tiermodell einnehmen. Die hier präsentierten Daten hinsichtlich des Einflusses von Phevalin auf Virulenz und der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen lassen den Schluss zu, dass Phevalin direkt auf einen Wirtszellfaktor wirkt, um die Cytotoxicität intrazellulärer Bakterien zu stärken. KW - Staphylococcus aureus KW - MRSA KW - Virulenz KW - Intracellular virulence KW - Non-ribosomal peptide synthetase KW - USA300 Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146662 ER - TY - THES A1 - Jarick, Marcel T1 - Molekulare und funktionelle Charakterisierung der Serin/Threonin-Proteinkinase Stk und -Proteinphosphatase Stp von \(Staphylococcus\) \(aureus\) T1 - Molecular and functional characterization of the serine/threonine protein kinase Stk and Protein phosphatase Stp of \(Staphylococcus\) \(aureus\) N2 - Staphylococcus aureus ist ein Kommensale, der die menschliche Haut und Schleimhaut der Nase und des Rachens besiedelt. Der Keim verursacht aufgrund zahlreicher Virulenzfaktoren leichte aber auch schwere Infektionen wie Pneumonie, Endokarditis oder Sepsis. Die Behandlung von S. aureus-Infektionen gestaltet sich heutzutage schwierig, da der Keim Resistenzen gegen verschiedenste Antibiotika ausgebildet hat. Zur Bekämpfung dieser Resistenzen werden neue Antibiotika benötigt, die u.a. mit der Zellphysiologie und der Zellwandwandsynthese der Bakterien interferieren. Die Zellphysiologie und Zellwandsynthese wird abhängig von der Wachstumsphase und Umwelt-einflüssen in den Bakterien streng reguliert. Neben den Zweikomponentensystemen sind Serin/Threonin-Proteinkinasen und -Phosphatasen wesentliche Sensoren und Regulatoren der Bakterien. Durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung bewirken diese beiden Systeme eine Hemmung oder Aktivierung der entsprechenden Zielproteine. Dadurch kann sich die Bakterienzelle an innere und äußere Reize anpassen. In dieser Arbeit wurde die konservierte Serin/Threonin-Proteinkinase Stk und die Serin/Threonin-Phosphatase Stp von S. aureus untersucht. Die beiden Proteine Stk und Stp haben einen großen Einfluss auf die Signalweiterleitung, den zentralen Metabolismus, die Stressantwort, die Antibiotikaresistenz und die Virulenz von S. aureus. Im ersten Teil dieser Arbeit wird dargelegt, dass Stk und Stp in der bakteriellen Membran lokalisiert sind, dort miteinander interagieren und antagonistisch Zielproteine phosphorylieren bzw. dephospho-rylieren. Die Deletion der Phosphatase Stp bewirkt, dass zahlreiche Proteine in der Zelle permanent phosphoryliert und daher vermutlich nur noch eingeschränkt funktionstüchtig sind. Die ausbleibende Dephosphorylierung der Proteine in der stp-Mutante hat einen dramatischen Effekt auf die Zellwand-synthese und die Virulenz von S. aureus. So hat die stp-Mutante eine verdickte Zellwand und ist weniger virulent als die stk-Mutante und der Wildtypstamm. Im Rahmen dieser Arbeit wird erstmals eine Erklärung präsentiert, die die strukturellen Besonderheiten von Stk und deren Auswirkung auf die Zellwandsynthese zusammenführt: In der stp-Mutante akkumulieren Zellwandvorläufer in der Zelle, da vermutlich die entsprechenden Zellwandsyntheseproteine durch Stk-vermittelte Phosphorylierung gehemmt werden. Die Proteine FemXAB nehmen eine zentrale Rolle in der Zellwandsynthese ein, indem sie die Pentaglycin-Interpeptidbrücke des Zellwandvorläufers Pentaglycin-Lipid II syntheti-sieren. Stk wird durch die Bindung seiner extrazellulären Domänen an Pentaglycin-Lipid II aktiviert. In der vorliegenden Arbeit konnte FemX als in vitro Substrat von Stk und Stp identifiziert werden. Die permanente Phosphorylierung von FemX in der stp-Mutante führt zur verminderten Synthese der Pentaglycin-Brücken am Lipid II und infolgedessen zum Einbau von unvollständigen Muropeptiden in den neuen Peptidoglycanstrang. Diese strukturelle Veränderung führt zur Verdickung der Zellwand und folglich zur verminderten Empfindlichkeit gegenüber der Glycyl-Glycinpeptidase Lysostaphin. Neben FemX interagiert Stk mit weiteren Zellwandsyntheseproteinen wie FemAB und einigen Zellteilungsproteinen. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Stk das Vorkommen seines extrazellulären Liganden Lipid II detektiert und dementsprechend die Zellwandsynthese über FemX reguliert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde anhand verschiedener Omics-Techniken die stk-, stp- und stk/stp-Mutante im Vergleich zum S. aureus NewmanHG Wildtyp charakterisiert. Dabei zeigten sich teilweise große Unterschiede zwischen der stp-Mutante und den anderen Stämmen. Mit diesen Unter-suchungen konnten Ergebnisse aus anderen Studien bestätigt und mit weiteren Daten untermauert werden. So lässt sich die verminderte Virulenz der stp-Mutante mit der reduzierten Expression und Sekretion von Toxinen wie Hämolysinen und Leukozidinen erklären. Dies führt zu einer verminderten Hämolyse von Erythrozyten und einer verminderten Immunantwort gegen diese Toxine im Infektions-versuch. Stk und Stp phosphorylieren bzw. dephosphorylieren Transkriptionsfaktoren und Antwort-regulatoren von Zweikomponentensystemen, was zu der veränderten Expression und Sekretion der Virulenzfaktoren führt. Die Analyse der Mutanten offenbart, dass Stk ein negativer und Stp ein positiver Regulator der Virulenz in S. aureus ist. Außerdem regulieren Stk und Stp zentrale Aspekte des Metabolismus in S. aureus. So ist die Konzentration an Nukleotidtriphosphaten in der stp-Mutante reduziert, was auf eine verminderte Expression der Gene der Pyrimidinsynthese zurückzuführen ist. Anhand dieser Ergebnisse wird deutlich, dass Stk und Stp wesentliche Aspekte der Zellphysiologie wie die Zellwandsynthese, den zentralen Metabolismus und die Virulenz von S. aureus regulieren. N2 - Staphylococcus aureus is a commensal that inhabits the human skin and mucosa. S. aureus causes a large variety of nosocomial and community-acquired infections. Nowadays, it is difficult to treat S. aureus infections because this bacterium has acquired resistance to multiple drugs. Therefore, there is a need for new antimicrobial drugs against S. aureus. The most promising strategy to combat antibiotic resistance is to find novel antibiotics which interfere with the cell physiology and cell wall synthesis pathway. The cell physiology and cell wall synthesis is tightly regulated depending on the bacterial growth phase and environmental influences. In addition to the two-component systems, serine/threonine protein kinases are essential sensors and regulators of bacteria. By phosphorylation and dephosphorylation, these systems cause inhibition or activation of the corresponding target proteins. This allows the bacterial cell to adapt to internal and external stimuli. In this work, the conserved serine/threonine protein kinase Stk and the phosphatase Stp in S. aureus were investigated. The two proteins Stk and Stp influence signal transduction, central metabolism, stress response, antibiotic resistance and virulence of S. aureus. In the first part of this work it is shown that Stk and Stp are localized in the bacterial membrane, where they interact with each other and phosphorylate or dephosphorylate target proteins antagonistically. The deletion of the phosphatase Stp leads to numerous proteins in the cell being permanently phosphorylated, which renders them partially unfunctional. The lack of protein dephosphorylation in the stp mutant has a dramatic effect on cell wall synthesis and virulence of S. aureus. Thus, the stp mutant has a thickened cell wall and is less virulent than the stk mutant and the wild-type strain. This work brings together the structural characteristics of Stk and their effect on cell wall synthesis for the first time. In the stp mutant, cell wall precursors accumulate in the cell, presumably because the corresponding cell wall synthesis proteins are inhibited by Stk-mediated phosphorylation. The proteins FemXAB play a key role in cell wall synthesis by synthesizing the pentaglycine interpeptide bridge of the final cell wall precursor pentaglycine lipid II. The pentaglycine lipid II is bound by the extracellular domains of Stk, thereby activating Stk. In the present work, FemX was identified as an in vitro substrate of Stk and Stp. The permanent phosphorylation of FemX in the stp mutant leads to inhibited synthesis of the pentaglycine bridges on the lipid II and consequently to the incorporation of incomplete muropeptides into the new peptidoglycan strand. This structural change leads to thickening of the cell wall and consequently reduced sensitivity to the glycyl-glycine peptidase lysostaphin. In addition to FemX, Stk interacts with other cell wall synthesis proteins such as FemAB and some cell division proteins. These results illustrate that Stk detects the presence of its extracellular ligand lipid II. This leads to an inhibition of FemX and a downregulation of the cell wall synthesis pathway. In the second part of this work, the stk, stp and stk/stp mutants were characterized by different omics- techniques in comparison to the S. aureus NewmanHG wild-type. There were some major differences between the stp mutant and the other strains. With these investigations, results from other studies were confirmed and substantiated with further data. Thus, the reduced virulence of the stp mutant can be explained by the reduced expression and secretion of toxins such as hemolysins and leukocidines. This leads to a reduced hemolysis of erythrocytes and a reduced immune response to these toxins in the infection experiment. Stk and Stp phosphorylate or dephosphorylate transcription factors and response regulators of two-component systems resulting in altered expression and secretion of virulence factors. Analysis of the mutants reveals that Stk is a negative and Stp is a positive regulator of virulence in S. aureus. In addition, Stk and Stp regulate central aspects of S. aureus metabolism. Thus, the concentration of nucleotide triphosphates in the stp mutant is reduced, which is due to a reduced expression of the genes of pyrimidine synthesis. From these results it becomes clear that Stk and Stp regulate essential aspects of cell physiology such as cell wall synthesis, central and virulence in S. aureus. This study of the function of Stk and Stp contributes significantly to the understanding of regulatory processes by phosphorylation in the bacterial cell. KW - Kinase KW - Phosphatase KW - Stk KW - Stp KW - Staphylococcus KW - Zellwand KW - FemX Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176542 ER - TY - THES A1 - Popp, Christina T1 - Evolution of antifungal drug resistance of the human-pathogenic fungus \(Candida\) \(albicans\) T1 - Evolution der Antimykotikaresistenz im humanpathogenen Pilz \(Candida\) \(albicans\) N2 - Infections with the opportunistic yeast Candida albicans are frequently treated with the first-line drug fluconazole, which inhibits ergosterol biosynthesis. An alarming problem in clinics is the development of resistances against this azole, especially during long-term treatment of patients. Well-known resistance mechanisms include mutations in the zinc cluster transcription factors (ZnTFs) Mrr1 and Tac1, which cause an overexpression of efflux pump genes, and Upc2, which results in an overexpression of the drug target. C. albicans strains with such gain-of-function mutations (GOF) have an increased drug resistance conferring a selective advantage in the presence of the drug. It was previously shown that this advantage comes with a fitness defect in the absence of the drug. This was observed in different conditions and is presumably caused by a deregulated gene expression. One aim of the present study was to examine whether C. albicans can overcome the costs of drug resistance by further evolution. Therefore, the relative fitness of clinical isolates with one or a combination of different resistance mutations in Mrr1, Tac1 and/or Upc2 was analyzed in competition with the matched fluconazole-susceptible partner. Most fluconazole-resistant isolates had a decreased fitness in competition with their susceptible partner in vitro in rich medium. In contrast, three fluconazole-resistant strains with Mrr1 resistance mutations did not show a fitness defect in competition with their susceptible partner. In addition, the fitness of four selected clinical isolate pairs was examined in vivo in mouse models of gastrointestinal colonization (GI) and disseminated infection (IV). In the GI model all four fluconazole-resistant strains were outcompeted by their respective susceptible partner. In contrast, in the IV model only one out of four fluconazole-resistant isolates did show a slight fitness defect in competition with its susceptible partner during infection of the kidneys. It can be stated, that in the present work the in vitro fitness did not reflect the in vivo fitness and that the overall fitness was dependent on the tested conditions. In conclusion, C. albicans cannot easily overcome the costs of drug resistance caused by a deregulated gene expression. In addition to GOFs in Mrr1, Tac1 and Upc2, resistance mutations in the drug target Erg11 are a further key fluconazole resistance mechanism of C. albicans. Clinical isolates often harbor several resistance mechanisms, as the fluconazole resistance level is further increased in strains with a combination of different resistance mutations. In this regard, the question arises of how strains with multiple resistance mechanisms evolve. One possibility is that strains acquire mutations successively. In the present study it was examined whether highly drug-resistant C. albicans strains with multiple resistance mechanisms can evolve by parasexual recombination as another possibility. In a clonal population, cells with individually acquired resistance mutations could combine these advantageous traits by mating. Thereupon selection could act on the mating progeny resulting in even better adapted derivatives. Therefore, strains heterozygous for a resistance mutation and the mating type locus (MTL) were grown in the presence of fluconazole. Derivatives were isolated, which had become homozygous for the resistance mutation and at the same time for the MTL. This loss of heterozygosity was accompanied by increased drug resistance. In general, strains which are homozygous for one of both MTL configurations (MTLa and MTLα) can switch to the opaque phenotype, which is the mating-competent form of the yeast, and mate with cells of the opposite MTL. In the following, MTLa and MTLα homozygous strains in the opaque phenotype were mated in all possible combinations. The resulting mating products with combined genetic material from both parents did not show an increased drug resistance. Selected products of each mating cross were passaged with stepwise increasing concentrations of fluconazole. The isolated progeny showed high levels of drug resistance and loss of wild-type alleles of resistance-associated genes. In conclusion, selective pressure caused by fluconazole exposure selects for resistance mutations and at the same time induces genomic rearrangements, resulting in mating competence. Therefore, in a clonal population, cells with individually acquired resistance mutations can mate with each other and generate mating products with combined genetic backgrounds. Selection can act on these mating products and highly drug-resistant und thus highly adapted derivatives can evolve as a result. In summary, the present study contributes to the current understanding of the evolution of antifungal drug resistance by elucidating the effect of resistance mutations on the fitness of the strains in the absence of the drug selection pressure and investigates how highly drug-resistant strains could evolve within a mammalian host. N2 - Infektionen mit dem opportunistischen Hefepilz Candida albicans werden häufig mit dem First-Line-Medikament Fluconazol behandelt, welches die Ergosterol-Biosynthese hemmt. Ein besorgniserregendes Problem in der Klinik, insbesondere bei der Langzeitbehandlung von Patienten, ist die Entwicklung von Resistenzen gegen dieses Azol. Zu den bekannten Resistenzmechanismen gehören Resistenzmutationen in den Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren (ZnTFs) Mrr1 und Tac1, die eine Überexpression von Effluxpumpen-Genen bewirken und Resistenzmutationen in Upc2, die zu einer Überexpression des Wirkstofftargets führen. C. albicans Stämme mit solchen Gain-of-Function-Mutationen (GOF) weisen eine erhöhte Medikamentenresistenz auf, was einen selektiven Vorteil in Gegenwart des Medikaments bedeutet. Es wurde zuvor gezeigt, dass dieser Vorteil mit einem Fitnessdefekt in Abwesenheit des Medikaments einhergeht. Dies wurde in verschiedenen Bedingungen nachgewiesen und wird vermutlich durch eine deregulierte Genexpression verursacht. Ein Ziel der vorliegenden Studie war es zu untersuchen, ob C. albicans die Kosten der Medikamentenresistenz durch Evolution kompensieren kann. Daher wurde die relative Fitness von klinischen Isolaten mit einer oder einer Kombination verschiedener Resistenzmutationen in Mrr1, Tac1 und/oder Upc2 im Wettbewerb mit dem zugehörigen Fluconazol-sensitiven Partner analysiert. Die meisten Fluconazol-resistenten Isolate hatten eine verminderte Fitness im Wettbewerb mit ihrem sensitiven Partner in vitro in vollwertigem Medium. Dennoch zeigten drei Fluconazol-resistente Stämme mit Mrr1-Resistenzmutationen keinen Fitnessdefekt im Wettbewerb mit ihrem jeweiligen Partner. Zusätzlich wurde die Fitness von vier ausgewählten klinischen Isolat-Paaren in vivo in Mausmodellen für gastrointestinale Kolonisation (GI) und disseminierte Infektion (IV) untersucht. Im GI-Modell wurden alle vier Fluconazol-resistenten Stämme von ihren sensitiven Partnern überwachsen. Im Gegensatz dazu zeigte im IV-Modell nur einer der vier Fluconazol-resistenten Isolate einen leichten Fitnessdefekt im Wettbewerb mit dem jeweiligen Fluconazol-sensitiven Partner während der Infektion der Nieren. Es kann festgestellt werden, dass in der vorliegenden Arbeit die in vitro-Fitness nicht die in vivo-Fitness widerspiegelt und dass die Gesamtfitness von den getesteten Bedingungen abhängig ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass C. albicans die Kosten der Medikamentenresistenz, die durch eine deregulierte Genexpression verursacht werden, nur schwer überwinden kann. Neben GOFs in Mrr1, Tac1 und Upc2 sind Resistenzmutationen im Wirkstofftarget Erg11 ein wichtiger Resistenzmechanismus von C. albicans. Klinische Isolate weißen oft mehrere Resistenzmechanismen auf, da die Kombination verschiedener Resistenzmutationen die Fluconazol-Resistenz potenziert. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, wie sich Stämme mit mehreren Resistenzmechanismen entwickeln. Eine Möglichkeit ist, dass Stämme Mutationen sequenziell erwerben. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob als weitere Möglichkeit hochresistente C. albicans Stämme mit multiplen Resistenzmechanismen durch parasexuelle Rekombination evolvieren können. In einer klonalen Population könnten Zellen mit individuell erworbenen Resistenzmutationen diese vorteilhaften Eigenschaften durch Paarung kombinieren. Daraufhin könnte Selektionsdruck auf die Matingprodukte wirken und so die Entstehung von besser angepassten Derivaten begünstigen. Daher wurden Resistenzmutation und Mating Type Locus (MTL) heterozygote Stämme in Gegenwart von Fluconazol kultiviert. So konnten Derivate isoliert werden, die homozygot für die Resistenzmutation und gleichzeitig für den MTL geworden waren. Dieser Verlust der Heterozygotie ging mit einer erhöhten Medikamentenresistenz einher. Generell können Stämme, die homozygot für eine der beiden MTL-Konfigurationen (MTLa und MTLα) sind, in den opaque Phänotyp wechseln, der die paarungskompetente Form der Hefe darstellt, und sich mit Zellen des gegensätzlichen MTL paaren. Im Folgenden wurden MTLa und MTLα homozygote Stämme im opaque Phänotyp in allen möglichen Kombinationen verpaart. Die resultierenden Matingprodukte mit kombiniertem genetischem Material beider Elternteile wiesen keine erhöhte Medikamentenresistenz auf. Ausgewählte Paarungsprodukte jeder Kreuzung wurden mit stufenweise ansteigenden Konzentrationen von Fluconazol passagiert. Die isolierten Nachkommen zeigten ein hohes Maß an Medikamentenresistenz und den Verlust von Wildtyp-Allelen der resistenzassoziierten Gene. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der selektive Druck, der durch die Fluconazol-Exposition verursacht wird, für Resistenzmutationen selektiert und gleichzeitig genomische Umlagerungen induziert, die eine Paarung ermöglichen. Daher können sich in einer klonalen Population Zellen mit individuell erworbenen Resistenzmutationen miteinander paaren und Matingprodukte mit kombiniertem genetischem Hintergrund generieren. Auf diese Matingprodukte kann die Selektion wirken, woraufhin sich hochresistente und damit stark an ihre Umwelt angepasste Derivate entwickeln können. Zusammenfassend trägt die vorliegende Studie zum aktuellen Verständnis der Evolution der Antimykotika-Resistenz bei, indem sie den Effekt von Resistenzmutationen auf die Fitness der Stämme in Abwesenheit des Medikamenten-Selektionsdrucks untersucht und aufklärt, wie sich hochgradig resistente Stämme in einem Säugetierwirt entwickeln könnten. KW - Evolution KW - Resistenz KW - Fitness KW - Candida albicans KW - Fluconazol KW - Resistance KW - Fluconazole KW - Drug resistance KW - Human-pathogenic KW - Yeast Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243515 ER - TY - THES A1 - Ibrahim, Eslam Samir Ragab T1 - Unraveling the function of the old yellow enzyme OfrA in \(Staphylococcus\) \(aureus\) stress response T1 - Entschlüsselung der Funktion des “alten gelben Enzyms” OfrA in der Stressreaktion von \(Staphylococcus\) \(aureus\) N2 - Biological systems are in dynamic interaction. Many responses reside in the core concepts of biological systems interplay (competition and cooperation). In infection situation, the competition between a bacterial system and a host is shaped by many stressors at spatial and temporal determinants. Reactive chemical species are universal stressors against all biological systems since they potentially damage the basic requirements of these systems (nucleic acids, proteins, carbohydrates, and lipids). Either produced endogenously or exogenously, reactive chemical species affect the survival of pathogens including the gram-positive Staphylococcus aureus (S. aureus). Therefore, bacteria developed strategies to overcome the toxicity of reactive species. S. aureus is a widely found opportunistic pathogen. In its niche, S. aureus is in permanent contact with surrounding microbes and host factors. Deciphering the deterministic factors in these interactions could facilitate pinpointing novel bacterial targets. Identifying the aforementioned targets is crucial to develop new strategies not only to kill the pathogenic organisms but also to enhance the normal flora to minimize the pathogenicity and virulence of potential pathogens. Moreover, targeting S. aureus stress response can be used to overcome bacterial resistance against host-derived factors. In this study, I identify a novel S. aureus stress response factor against reactive electrophilic, oxygen, and hypochlorite species to better understand its resilience as a pathogen. Although bacterial stress response is an active research field, gene function is a current bottleneck in characterizing the understudied bacterial strategies to mediate stress conditions. I aimed at understanding the function of a novel protein family integrated in many defense systems of several biological systems. In bacteria, fungi, and plants, old yellow enzymes (OYEs) are widely found. Since the first isolation of the yellow flavoprotein, OYEs are used as biocatalysts for decades to reduce activated C=C bonds in α,β-unsaturated carbonyl compounds. The promiscuity of the enzymatic catalysis is advantageous for industrial applications. However, the physiological function of OYEs, especially in bacteria, is still puzzling. Moreover, the relevance of the OYEs in infection conditions remained enigmatic.   Here, I show that there are two groups of OYEs (OYE flavin oxidoreductase, OfrA and OfrB) that are encoded in staphylococci and some firmicutes. OfrA (SAUSA300_0859) is more conserved than OfrB (SAUSA300_0322) in staphylococci and is a part of the staphylococcal core genome. A reporter system was established to report for ofrA in S. aureus background. The results showed that ofrA is induced under electrophilic, oxidative, and hypochlorite stress. OfrA protects S. aureus against quinone, methylglyoxal, hydrogen peroxide, and hypochlorite stress. Additionally, the results provide evidence that OfrA supports thiol-dependent redox homeostasis. At the host-pathogen interface, OfrA promotes S. aureus fitness in murine macrophage cell line. In whole human blood, OfrA is involved in S. aureus survival indicating a potential clinical relevance to bacteraemia. In addition, ofrA mutation affects the production of the virulence factor staphyloxanthin via the upper mevalonate pathway. In summary, decoding OfrA function and its proposed mechanism of action in S. aureus shed the light on a conserved stress response within multiple organisms. N2 - Biologische Systeme unterliegen ständig dynamischen Interaktionen. Diese werden geprägt von Konkurrenz und Kooperation. Im Falle einer Infektion wird die Konkurrenz zwischen einem bakteriellen Organismus und dem infizierten Wirt von der Einwirkung vieler Stressoren in allen biologischen Nischen geprägt. Eine fundamentale Rolle spielen dabei reaktive chemische Verbindungen die als universale Stressoren alle biologischen Systeme mit ihren fundamentalen Makromolekülen (Nukleinsäuren, Proteine, Kohlenhydrate und Lipide) potenziell schädigen. Reaktive chemische Verbindungen, entweder endogen oder exogen gebildet, beeinträchtigen das Überleben aller Pathogene, auch das Überleben des in dieser Arbeit behandelten gram-positiven Bakteriums Staphylococcus aureus (S. aureus). Um die lebensbedrohende Toxizität der reaktiven Verbindungen zu umgehen, haben Bakterien eine Vielzahl hoch spezialisierter Überlebensstrategien entwickelt. S. aureus ist ein weit verbreiteter opportunistischer Krankheitserreger. Er unterliegt dem permanenten Kontakt mit dem umgebenden Mikrobiom und den verschiedenartigen Wirtsfaktoren. Das Wissen um die Mechanismen der bakteriellen Stressabwehr während einer Pathogen-Wirts-Beziehung könnte als Grundlage für die Identifizierung neuer antibakterieller Zielstrukturen dienen. Eine spezifische Inaktivierung solcher Strukturen könnte dann den pathogenen Organismus schädigen ohne die normale Flora zu schwächen. Ferner können Untersuchungen an der Stressantwort von S. aureus genutzt werden, um die bakterielle Resistenz gegen wirtseigene Faktoren zu schwächen. Im Mittelpung dieser Arbeit steht die Charakterisierungeines neuartigen Faktors in der Stressantwort von S. aureus, der sowohl gegen elektrophilen Stress als auch gegen reaktive Sauerstoff- und Hypochlorit-Verbindungen aktiv ist. Die Ergebnisse der Arbeiten tragen zu einem besseren Verständnis der Stressantwort von dem wichtigen pathogenen Bakterium S. aureus bei. Trotz der Tatsache, dass die Untersuchung bakterieller Stressantworten Gegenstand der aktuellenForschung ist, sind viele Prozesse und die daran beteiligten Faktoren nur unzureichend charakterisiert. Daher war die Zielsetzung dieser Thesisdie Funktion eines Vertreters einer neuen Proteinfamilie, die mglw. in vielen Abwehrsystemen gegen chemische Stressoren eine wichtige Rolle spielt, zu untersuchen. Die von Otto Warburg erstmalig als “old yellow enzymes” (OYEs) bezeichnete Proteinfamilie ist im Bakterien-, Pilz- und Pflanzenreich weit verbreitet. Nach der erstmaligen Isolation des gelben Flavoproteins, werden OYEs seit vielen Jahrzehnten als Biokatalysatoren verwendet, um aktivierte C=C-Doppelbindungen in α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen zu reduzieren. Die Promiskuität der enzymatischen Katalyse ist für industrielle Anwendungen sehr vorteilhaft. Nichtsdestotrotz konnte die physiologische Funktion von OYEs besonders in Bakterien bislang nur ansatzweise aufgeklärt werden und die Beteiligung der OYEs unter Infektionsbedingungen ist weiterhin unbekannt. In dieser Arbeit wurden zwei Vertreterder OYEs (OYE flavin oxidoreductase OfrA und OfrB) im Genom von Staphylokokken und Firmicuten identifiziert. OfrA (SAUSA300_0859) ist in Staphylokokken stärker konserviert als OfrB (SAUSA300_0322) und ist Teil des Kerngenoms. Es wurde ein Reportersystem etabliert, um die Expression von ofrA in S. aureus-Stämmen zu untersuchen. Die Daten dieser Arbeit zeigen, dass ofrA unter elektrophilen, oxidativen und hypochloriten Stressbedingungen induziert wird. OfrA schützt S. aureus vor Stress durch Quinone, Methylglyoxal, Wasserstoffperoxid und Hypochlorit. Weiterhin liefern die Ergebnisse Evidenz, dass OfrA die Thiol-abhängige Redox-Homöostase unterstützt. Weiterhin ist OfrA an der Fitness und dem Überleben von S. aureus nach Phagozytose in murinen Makrophagen beteiligt. Das Überleben von S. aureus in humanem Vollblut war ebenfalls sehr stark von der OfrA Expression abhängig. Somit kann auf eine wichtige Rolle von OfrA während des Infektionsgeschehens z.B. bei Bakteriämie geschlossen werden. Weiterhin zeigt sich, dass Mutationen in ofrA, die Produktion des Virulenzfaktors Staphyloxanthin über den oberen Mevalonatweg beeinflussen. Insgesamt liefert die vorliegende Arbeit neue Einblicke in die Funktion und Verbeitung von OfrA, einem neuen Vertreter aus der Klasse der OYEs. Die vorliegenden Ergebnisse ermöglichen somit auch ein besseres Verständnis konservierter Strategien der Stressantwort bei Bakterien und deren Bedeutung während des Infektionsgeschehens. KW - Staphylococcus aureus KW - stress response KW - ROS KW - Bacteria KW - Stressreaktion Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289600 ER -