TY  - THES
A1  - Peindl, Matthias
T1  - Refinement of 3D lung cancer models for automation and patient stratification with mode-of-action studies
T1  - Weiterentwicklung von 3D Lungentumormodellen zur Automatisierung und Patienten-Stratifizierung mit Untersuchungen zur Wirkungsweise
N2  - Lung cancer is the main cause of cancer-related deaths worldwide. Despite the availability of several targeted therapies and immunotherapies in the clinics, the prognosis for lung cancer remains poor. A major problem for the low benefit of these therapies is intrinsic and acquired resistance, asking for pre-clinical models for closer investigation of predictive biomarkers for refined personalized medicine and testing of possible combination therapies as well as novel therapeutic approaches to break resistances. 
One third of all lung adenocarcinoma harbor mutations in the KRAS gene, of which 39 % are transitions from glycine to cysteine in codon 12 (KRASG12C). Being considered “undruggable” in previous decades, KRASG12C-inhibitors now paved the way into the standard-of-care for lung adenocarcinoma treatment in the clinics. Still, the overall response rates as well as overall survival of patients treated with KRASG12C-inhibitors are sobering. Therefore, 3D KRASG12C-biomarker in vitro models were developed based on a decellularized porcine jejunum (SISmuc) using commercial and PDX-derived cell lines and characterized in regards of epithelial-mesenchymal-transition (EMT), stemness, proliferation, invasion and c-MYC expression as well as the sensitivity towards KRASG12C-inhibiton. The phenotype of lung tumors harboring KRAS mutations together with a c-MYC overexpression described in the literature regarding invasion and proliferation for in vivo models was well represented in the SISmuc models. A higher resistance towards targeted therapies was validated in the 3D models compared to 2D cultures, while reduced viability after treatment with combination therapies were exclusively observed in the 3D models. In the test system neither EMT, stemness nor the c-MYC expression were directly predictive for drug sensitivity. Testing of a panel of combination therapies, a sensitizing effect of the aurora kinase A (AURKA) inhibitor alisertib for the KRASG12C-inhibitor ARS-1620 directly correlating with the level of c-MYC expression in the corresponding 3D models was observed. Thereby, the capability of SISmuc tumor models as an in vitro test system for patient stratification was demonstrated, holding the possibility to reduce animal experiments.
Besides targeted therapies the treatment of NSCLC with oncolytic viruses (OVs) is a promising approach. However, a lack of in vitro models to test novel OVs limits the transfer from bench to bedside. In this study, 3D NSCLC models based on the SISmuc were evaluated for their capability to perform efficacy and risk assessment of oncolytic viruses (OVs) in a pre-clinical setting. Hereby, the infection of cocultures of tumor cells and fibroblasts on the SISmuc with provided viruses demonstrated that in contrast to a wildtype herpes simplex virus 1 (HSV-1) based OV, the attenuated version of the OV exhibited specificity for NSCLC cells with a more advanced and highly proliferative phenotype, while fibroblasts were no longer permissive for infection. This approach introduced SISmuc tumor models as novel test system for in vitro validation of OVs. 
Finally, a workflow for validating the efficacy of anti-cancer therapies in 3D tumor spheroids was established for the transfer to an automated platform based on a two-arm-robot system. In a proof-of-concept process, H358 spheroids were characterized and treated with the KRASG12C-inhibitor ARS-1620. A time- and dose-dependent reduction of the spheroid area after treatment was defined together with a live/dead-staining as easy-to-perform and cost-effective assays for automated drug testing that can be readily performed in situ in an automated system.
N2  - Lungentumoren sind die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle weltweit. Trotz der Verfügbarkeit diverser zielgerichteter Therapien und Immuntherapien im klinischen Alltag ist die Prognose für Lungenkrebs nach wie vor schlecht. Eine Hauptursache hierfür sind intrinsische und erworbene Resistenzen. Hieraus ergibt sich ein Bedarf für präklinische Modelle zur genaueren Untersuchung prädiktiver Biomarker für eine verbesserte personalisierte Medizin und zur Testung von Kombinationstherapien sowie neuartiger therapeutischer Ansätze, um bestehende Resistenzen zu brechen. Ein Drittel aller Lungen-Adenokarzinome weisen Mutationen im KRAS-Gen auf, von denen 39 % Transitionen von Glycin zu Cystein in Codon 12 (KRASG12C) darstellen. Obwohl KRAS in den vergangenen Jahrzehnten als "unbehandelbar" galt, haben sich KRASG12C-Inhibitoren nun den Weg in die klinische Standardbehandlung von Lungen-Adenokarzinomen gebahnt. Jedoch sind die Ansprech- und Überlebensraten von Patienten, die mit KRASG12C-Inhibitoren behandelt werden, ernüchternd. Daher wurden in dieser Arbeit 3D KRASG12C-Biomarker in vitro Modelle basierend auf dezellularisierten Schweinedünndarm (SISmuc) unter Verwendung kommerzieller und PDX-abgeleiteter Zelllinien aufgebaut und hinsichtlich der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT), Stammzell-Eigenschaften, Proliferation, Invasion und c MYC-Expression sowie der Sensitivität gegenüber KRASG12C-Inhibitoren charakterisiert. Der in der Literatur für in vivo Modelle beschriebene Phänotyp von Lungentumoren mit KRAS-Mutationen und c-MYC-Überexpression in Bezug auf Invasion und Proliferation war in den SISmuc-Modellen reproduzierbar. Während in den 3D Modellen erhöhte Resistenz gegenüber zielgerichteten Therapien im Vergleich zu 2D beobachtet wurde, konnte eine verringerte Viabilität nach der Behandlung mit Kombinationstherapien ausschließlich in den 3D Modellen beobachtet werden. Im Test-System zeigten sich weder EMT noch die c-MYC-Expression als direkt prädiktiv für die Sensitivität gegenüber KRASG12C-Inhibitoren. Bei der Prüfung von verschiedenen Kombinationstherapien, wurde eine sensibilisierende Wirkung des Aurora-Kinase A (AURKA)-Inhibitors Alisertib für den KRASG12C-Inhibitor ARS-1620 beobachtet, welche direkt mit dem Grad der c-MYC-Expression in den entsprechenden 3D-Modellen korrelierte.  Hierdurch konnte die Eignung von SISmuc Tumor Modellen als in vitro Test-System zur Patienten-Stratifizierung gezeigt werden, welches die Möglichkeit einer Reduktion von Tierversuchen birgt. Neben zielgerichteten Therapien ist die Behandlung von NSCLC mit onkolytischen Viren (OVs) ein vielversprechender Ansatz. Es mangelt jedoch an in vitro Modellen, um neue OVs in einer präklinischen Umgebung zu testen. Hierfür wurden 3D-NSCLC-Modelle auf der Grundlage der SISmuc bezüglich ihrer Eignung zur Durchführung von Wirksamkeits- und Risikobewertungen von OVs untersucht. Dabei zeigte die Infektion von Kokulturen aus Tumorzellen und Fibroblasten auf der SISmuc mit bereitgestellten Viren, dass die abgeschwächte Version des OV im Gegensatz zu einem auf dem Wildtyp des Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) basierenden OV eine Spezifität für NSCLC-Zellen mit einem fortgeschritteneren und stark proliferativen Phänotyp aufwies, während Fibroblasten sich für eine Infektion nicht länger permissiv zeigten. Dieser Ansatz stellt unter Beweis, dass SISmuc-Tumormodelle sich als neues Test-System zur in vitro Prüfung von OVs eignen. Schließlich wurde ein Arbeitsablauf zur Validierung der Wirksamkeit von Krebstherapien in 3D-Tumor-Sphäroiden für die Übertragung auf eine automatisierte Plattform auf der Grundlage eines zweiarmigen Robotersystems entwickelt. In einem Proof-of-Concept-Prozess wurden H358-Sphäroide charakterisiert und mit dem KRASG12C-Inhibitor ARS-1620 behandelt. Eine zeit- und dosisabhängige Reduktion der Sphäroid-Fläche nach der Behandlung wurde zusammen mit einer Lebend/Tot-Färbung als einfach durchzuführender und kostengünstiger Assay für automatisierte Medikamententests definiert, welche in situ in einer automatisierten Umgebung durchgeführt werden können.
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Tissue Engineering
KW  - Tumor models
KW  - Cancer
KW  - Targeted therapies
KW  - Automation
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-310693
ER  - 
TY  - THES
A1  - Doll, Julia
T1  - Identifizierung und Charakterisierung neuer, mit Hörstörungen assoziierter Gene und Varianten mittels Exom-Sequenzierung
T1  - Identification and characterization of novel hearing loss associated genes and variants by Exome Sequencing
N2  - Laut des aktuellen Reports der Weltgesundheitsorganisation sind ca. 466 Millionen Menschen weltweit von einer Hörstörung (HS) betroffen. Durch die enorme Heterogenität und die klinische Variabilität, die diese Erkrankung ausmacht, und viele bisher nicht mit HS assoziierte Gene, bleibt ein großer Teil der erblich bedingten HS in vielen Familien unaufgeklärt. Die Entwicklung moderner Techniken, wie die Next-Generation Sequenzierung (NGS) und der Fortschritt bei der Untersuchung von Modellorganismen trugen jedoch in den letzten Jahren immens dazu bei, neue Gene zu identifizieren, die innerhalb des auditorischen Signalwegs oder damit assoziierten Strukturen beteiligt sind. Die vorliegende Arbeit umfasst Ergebnisse dreier Veröffentlichungen, in denen iranische und pakistanische Familien und eine deutsche Familie mit erblich bedingter HS untersucht und neue, krankheitsverursachende Varianten identifiziert und funktionell charakterisiert wurden. Im ersten Abschnitt konnten zwei neue rezessive Varianten im CDC14A-Gen als krankheitsverursachend identifiziert werden, die zu einem potentiellen Funktionsverlust des kodierten Proteins in einer iranischen und einer pakistanischen Familie führen. Mit Hilfe einer funktionellen Charakterisierung auf RNA-Ebene (Spleiß-Assay und RT-qPCR) konnte der Funktionsverlust beider Varianten bestätigt werden. Der zweite Abschnitt umfasst eine deutsche Familie mit sieben von einer HS betroffenen Familienmitgliedern, in der eine heterozygote missense Variante in MYO3A identifiziert wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte somit die erste autosomal dominante Variante in einer europäischen Familie mit einer bilingualen, sensorineuralen Hochtonschwerhörigkeit beschrieben werden und der dominante Charakter von MYO3A bestätigt werden. Im dritten Abschnitt konnten die krankheitsverursachenden Varianten in 13 Familien aus einer Kohorte mit 21 pakistanischen Familien mit einer syndromalen und nicht-syndromalen HS ausfindig gemacht werden. Hierbei wurden sowohl bekannte, als auch bisher nicht beschriebene Varianten detektiert. Die Aufklärungsrate innerhalb dieser Kohorte betrug 61,9% und es konnte somit das Spektrum syndromaler und nicht-syndromaler HS erweitert werden. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschreibt eine iranische Familie mit einer milden HS und milden Intelligenzminderung, in der eine homozygote missense Variante im Kandidatengen DBN1 ausfindig gemacht wurde. Um die Funktion und die Auswirkungen eines potentiellen Verlusts des codierten Proteins Drebrin zu untersuchen, wurden immunhistochemische Färbungen und auditorische Messungen an Dbn1 Knockout (KO)-Mäusen durchgeführt. Hierbei konnte eine Expression innerhalb der Nervenfasern, die innere Haarzellen innervieren, nachgewiesen werden. Eine leicht verlängerte Latenz für die ABR-Welle IV in KO-Mäusen im Vergleich zum Wildtyp ergab den Hinweis auf einen Defekt innerhalb des zentralen auditorischen Signalwegs, der möglicherweise mit einer Sprachverarbeitungsstörung im Menschen korreliert.
N2  - According to the latest World Health Organization report, approximately 466 million people are affected by hearing loss (HL) worldwide. Due to the enormous heterogeneity and clinical variability that comes with this disorder and the previously unassociated HL genes, a large proportion of hereditary HL remains unexplained in many families. However, the development of modern techniques such as next-generation sequencing (NGS) and constant progress in the study of model organisms contributed immensely to the identification of new genes involved within the auditory pathway or associated structures. This thesis includes results of three publications in which Iranian and Pakistani families and a German family with HL were studied and novel disease-causing variants were identified and characterized. In the first section, two novel recessive variants in the CDC14A gene were identified as disease-causing, leading to a loss-of-function of the encoded protein in an Iranian and a Pakistani family. Functional characterization on RNA level (splice assay and RT-qPCR) confirmed the loss of function of both variants. The second section includes a German family with seven family members affected by HL, in which a heterozygous missense variant in MYO3A was identified. Thus, the first autosomal dominant variant in a European family with a bilingual sensorineural high-frequency hearing loss could be described in the current work. In the third section, the disease-causing variants were established in 13 families from a cohort of 21 Pakistani families with syndromic and non-syndromic HL. Both known and previously undescribed variants were detected. The detection rate within this cohort was 61.9% and thus the spectrum of syndromic and non-syndromic HL could be expanded. The final section of this work describes an Iranian family with mild HL and mild intellectual disability in which a homozygous missense variant in the candidate gene DBN1 was detected. To investigate the function and effects of a potential loss of the encoded protein Drebrin, immunohistochemical staining and auditory measurements were performed in Dbn1 knockout mice. Here, expression within nerve fibers innervating inner hair cells was detected. A slightly prolonged latency for ABR wave IV in the auditory pathway in KO mice compared to wild type mice provided evidence for a defect within the central auditory pathway that might correlate with a speech processing disorder in humans.
KW  - Hörstörung
KW  - Exomsequenzierung
KW  - Konsanguinität
KW  - Hörstörungen
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-261097
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lüffe, Teresa Magdalena
T1  - Behavioral and pharmacological validation of genetic zebrafish models for ADHD
T1  - Pharmakologische und verhaltensbasierte Validierung genetischer Zebrafischmodelle für ADHS
N2  - Attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) is the most prevalent neurodevelopmental disorder described in psychiatry today. ADHD arises during early childhood and is characterized by an age-inappropriate level of inattention, hyperactivity, impulsivity, and partially emotional dysregulation. Besides, substantial psychiatric comorbidity further broadens the symptomatic spectrum. Despite advances in ADHD research by genetic- and imaging studies, the etiopathogenesis of ADHD remains largely unclear. Twin studies suggest a heritability of 70-80 % that, based on genome-wide investigations, is assumed to be polygenic and a mixed composite of small and large, common and rare genetic variants. In recent years the number of genetic risk candidates is continuously increased. However, for most, a biological link to neuropathology and symptomatology of the patient is still missing. Uncovering this link is vital for a better understanding of the disorder, the identification of new treatment targets, and therefore the development of a more targeted and possibly personalized therapy. 
The present thesis addresses the issue for the ADHD risk candidates GRM8, FOXP2, and GAD1. By establishing loss of function zebrafish models, using CRISPR/Cas9 derived mutagenesis and antisense oligonucleotides, and studying them for morphological, functional, and behavioral alterations, it provides novel insights into the candidate's contribution to neuropathology and ADHD associated phenotypes. Using locomotor activity as behavioral read-out, the present work identified a genetic and functional implication of Grm8a, Grm8b, Foxp2, and Gad1b in ADHD associated hyperactivity. Further, it provides substantial evidence that the function of Grm8a, Grm8b, Foxp2, and Gad1b in activity regulation involves GABAergic signaling. Preliminary indications suggest that the three candidates interfere with GABAergic signaling in the ventral forebrain/striatum. However, according to present and previous data, via different biological mechanisms such as GABA synthesis, transmitter release regulation, synapse formation and/or transcriptional regulation of synaptic components. Intriguingly, this work further demonstrates that the activity regulating circuit, affected upon Foxp2 and Gad1b loss of function, is involved in the therapeutic effect mechanism of methylphenidate. Altogether, the present thesis identified altered GABAergic signaling in activity regulating circuits in, presumably, the ventral forebrain as neuropathological underpinning of ADHD associated hyperactivity. Further, it demonstrates altered GABAergic signaling as mechanistic link between the genetic disruption of Grm8a, Grm8b, Foxp2, and Gad1b and ADHD symptomatology like hyperactivity. Thus, this thesis highlights GABAergic signaling in activity regulating circuits and, in this context, Grm8a, Grm8b, Foxp2, and Gad1b as exciting targets for future investigations on ADHD etiopathogenesis and the development of novel therapeutic interventions for ADHD related hyperactivity. Additionally, thigmotaxis measurements suggest Grm8a, Grm8b, and Gad1b as interesting candidates for prospective studies on comorbid anxiety in ADHD. Furthermore, expression analysis in foxp2 mutants demonstrates Foxp2 as regulator of ADHD associated gene sets and neurodevelopmental disorder (NDD) overarching genetic and functional networks with possible implications for ADHD polygenicity and comorbidity. Finally, with the characterization of gene expression patterns and the generation and validation of genetic zebrafish models for Grm8a, Grm8b, Foxp2, and Gad1b, the present thesis laid the groundwork for future research efforts, for instance, the identification of the functional circuit(s) and biological mechanism(s) by which Grm8a, Grm8b, Foxp2, and Gad1b loss of function interfere with GABAergic signaling and ultimately induce hyperactivity.
N2  - Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) ist mit einer weltweiten Prävalenz von rund 5 % die am häufigsten vorkommende Neuroentwicklungsstörung. Das Krankheitsbild, das zumeist im Kindesalter auftritt und bis ins Erwachsenenalter bestehen kann, zeigt sich im Wesentlichen durch eine Beeinträchtigung der Aufmerksamkeit, der Aktivität, der Impuls-kontrolle und zum Teil durch emotionale Dysregulation. Darüber hinaus führt das vermehrte Auftreten von psychischen Begleiterkrankungen (so genannte Komorbiditäten) zu einer komplexen Symptomatik vieler Betroffener, die über die klassischen Merkmale von ADHS hinausgeht. Während das Krankheitsbild vielfach beschrieben wurde, ist die Ätiopathogenese trotz intensiver wissenschaftlicher Bemühungen bis heute weitestgehend ungeklärt. Zwillingsstudien weisen darauf hin, dass ADHS zu 70-80 % erblich bedingt ist. Aufgrund mehrerer Genom-Studien wird vermutet, dass es sich dabei um eine polygene Vererbbarkeit handelt und sowohl kleine (SNPs), verhältnismäßig häufig auftretende, als auch große (CNVs) verhältnismäßig seltene Genpolymorphismen beteiligt sind. Die Anzahl der potenziellen Risikogene für ADHS ist in den letzten Jahren kontinuierlich gestiegen, jedoch ist es nach wie vor unklar, inwiefern und durch welche biologischen Prozesse die meisten zur Neuropathologie und Symptomatik von ADHS Patienten beitragen. Diese Prozesse zu identifizieren ist von zentraler Bedeutung für ein besseres Verständnis der Erkrankung, der Identifizierung neuer Angriffsziele und somit, der Entwicklung gezielterer und möglicherweise personalisierter Behandlungsmöglichkeiten. 
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit diesen Prozessen am Beispiel der potenziellen Risikogene GRM8, FOXP2 und GAD1. Durch die Etablierung und Validierung entsprechender (geneti-scher) Knockout und Knockdown Zebrafischmodelle und der anschließenden Untersuchung auf Verhaltens-, morphologische und funktionelle Veränderungen liefert die vorliegende Dissertation wichtige Erkenntnisse über die funktionelle Relevanz der einzelnen Kandidaten für die Neuropathologie und die Symptomatik von ADHS. Beispielsweise zeigen die erfassten Aktivitätsdaten von Knockdown und Knockout Larven, dass Grm8a, Grm8b, Foxp2 und Gad1b an der Regulation von Bewegungsaktivität beteiligt sind und dass dies, die korrekte Funktion GABAerger Prozesse bedarf. Des Weiteren liefert die Arbeit Hinweise, dass der Effekt im Subpallium/Striatum verankert ist. Jedoch ist aufgrund vorliegender und bereits publizierter Daten anzunehmen, dass im Falle der einzelnen Kandidaten, zum Teil unterschiedliche Me-chanismen wie die Transmittersynthese, die Transmitterfreisetzung, die Synapsenbildung und die Expression synaptischer Komponenten betroffen sind. Interessanterweise scheinen die durch die Kandidaten betroffenen Signalwege außerdem, laut erhobener Daten, am Wirkmechanismus von Methylphenidat beteiligt zu sein. Kurzum, die vorliegende Dissertation identifiziert die Beeinträchtigung GABAerger Signalübertragung eines, mutmaßlich subpallialen/striatalen aktivitäts-regulierenden neuronalen Netzwerks als neurobiologische Grundlage ADHS-assoziierter Hyperaktivität. Gleichzeitig präsentiert die Arbeit diese Prozesse als funktionelles Bindeglied zwischen der genetischen Veränderung von GRM8, FOXP2 und GAD1 und Hyperaktivität in ADHS. Folglich sind die entwicklungs- und neurobiologischen Mechanismen rund um die GABAerge Übertragung in diesem Netzwerk, und in diesem Zusammenhang die Funktion von Grm8a, (Grm8b), Foxp2 und Gad1b, spannende Ziele für zukünftige Projekte zur Erforschung der Ätiopathogenese und der Entwicklung neuer Therapien von Hyperakti-vität in ADHS. Neben der Rolle in ADHS-assoziierter Hyperaktivität, präsentieren die erhobenen Verhaltensdaten Grm8a, Grm8b und Gad1b außerdem, als interessante Kandidaten für die Erforschung komorbider Angststörung in ADHS. Foxp2 dagegen, wurde mit Hilfe einer Genexpressionsanalyse als Regulator zahlreicher ADHS Risikogene und Entwicklungsstörungs-übergreifenden genetischen und funktionellen Netzwerken, mit möglicher Relevanz für die Polygenie und Komorbidität von ADHS, identifiziert. Im Allgemeinen schafft die vorliegende Dissertation mit der Bestimmung der Genexpressionsmuster und Etablierung und Validierung der (genetischen) Zebrafischmodelle für Grm8a, Grm8b, Foxp2 und Gad1b die Grundlage, diese und weitere Aspekte in zukünftigen Forschungsprojekten zu untersuchen. Beispielsweise die Identifizierung der Netzwerke und Mechanismen, mit dessen Hilfe Grm8a, (Grm8b), Foxp2 und Gad1b in die GABAerge Signalübertragung eingreifen und so letztlich die Aktivität beeinflussen.
KW  - ADHD
KW  - Zebrafish
KW  - FOXP2
KW  - GRM8
KW  - GAD1
KW  - Genetic etiology
KW  - Animal model
KW  - Thigmotaxis
KW  - Locomotor activity
KW  - Hyperactivity
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-257168
ER  - 
TY  - THES
A1  - Somody, Joseph Christian Campbell
T1  - Leveraging deep learning for identification and structural determination of novel protein complexes from \(in\) \(situ\) electron cryotomography of \(Mycoplasma\) \(pneumoniae\)
T1  - Tiefenlernen als Werkzeug zur Identifizierung und Strukturbestimmung neuer Proteinkomplexe aus der \(in\)-\(situ\)-Elektronenkryotomographie von \(Mycoplasma\) \(pneumoniae\)
N2  - The holy grail of structural biology is to study a protein in situ, and this goal has been fast approaching since the resolution revolution and the achievement of atomic resolution. A cell's interior is not a dilute environment, and proteins have evolved to fold and function as needed in that environment; as such, an investigation of a cellular component should ideally include the full complexity of the cellular environment. Imaging whole cells in three dimensions using electron cryotomography is the best method to accomplish this goal, but it comes with a limitation on sample thickness and produces noisy data unamenable to direct analysis. This thesis establishes a novel workflow to systematically analyse whole-cell electron cryotomography data in three dimensions and to find and identify instances of protein complexes in the data to set up a determination of their structure and identity for success. Mycoplasma pneumoniae is a very small parasitic bacterium with fewer than 700 protein-coding genes, is thin enough and small enough to be imaged in large quantities by electron cryotomography, and can grow directly on the grids used for imaging, making it ideal for exploratory studies in structural proteomics. As part of the workflow, a methodology for training deep-learning-based particle-picking models is established.

As a proof of principle, a dataset of whole-cell Mycoplasma pneumoniae tomograms is used with this workflow to characterize a novel membrane-associated complex observed in the data. Ultimately, 25431 such particles are picked from 353 tomograms and refined to a density map with a resolution of 11 Å. Making good use of orthogonal datasets to filter search space and verify results, structures were predicted for candidate proteins and checked for suitable fit in the density map. In the end, with this approach, nine proteins were found to be part of the complex, which appears to be associated with chaperone activity and interact with translocon machinery.

Visual proteomics refers to the ultimate potential of in situ electron cryotomography: the comprehensive interpretation of tomograms. The workflow presented here is demonstrated to help in reaching that potential.
N2  - Der heilige Gral der Strukturbiologie ist die Untersuchung eines Proteins in situ, und dieses Ziel ist seit der Auflösungsrevolution und dem Erreichen der atomaren Auflösung in greifbare Nähe gerückt. Das Innere einer Zelle ist keine verdünnte Umgebung, und Proteine haben sich so entwickelt, dass sie sich falten und so funktionieren, wie es in dieser Umgebung erforderlich ist; daher sollte die Untersuchung einer zellulären Komponente idealerweise die gesamte Komplexität der zellulären Umgebung umfassen. Die Abbildung ganzer Zellen in drei Dimensionen mit Hilfe der Elektronenkryotomographie ist die beste Methode, um dieses Ziel zu erreichen, aber sie ist mit einer Beschränkung der Probendicke verbunden und erzeugt verrauschte Daten, die sich nicht für eine direkte Analyse eignen. In dieser Dissertation wird ein neuartiger Workflow zur systematischen dreidimensionalen Analyse von Ganzzell-Elektronenkryotomographiedaten und zur Auffindung und Identifizierung von Proteinkomplexen in diesen Daten entwickelt, um eine erfolgreiche Bestimmung ihrer Struktur und Identität zu ermöglichen. Mycoplasma pneumoniae ist ein sehr kleines parasitäres Bakterium mit weniger als 700 proteinkodierenden Genen. Es ist dünn und klein genug, um in grossen Mengen durch Elektronenkryotomographie abgebildet zu werden, und kann direkt auf den für die Abbildung verwendeten Gittern wachsen, was es ideal für Sondierungsstudien in der strukturellen Proteomik macht. Als Teil des Workflows wird eine Methodik für das Training von Deep-Learning-basierten Partikelpicken-Modellen entwickelt.

Als Proof-of-Principle wird ein Dataset von Ganzzell-Tomogrammen von Mycoplasma pneumoniae mit diesem Workflow verwendet, um einen neuartigen membranassoziierten Komplex zu charakterisieren, der in den Daten beobachtet wurde. Insgesamt wurden 25431 solcher Partikel aus 353 Tomogrammen gepickt und zu einer Dichtekarte mit einer Auflösung von 11 Å verfeinert. Unter Verwendung orthogonaler Datensätze zur Filterung des Suchraums und zur Überprüfung der Ergebnisse wurden Strukturen für Protein-Kandidaten vorhergesagt und auf ihre Eignung für die Dichtekarte überprüft. Letztendlich wurden mit diesem Ansatz neun Proteine als Bestandteile des Komplexes gefunden, der offenbar mit der Chaperonaktivität in Verbindung steht und mit der Translocon-Maschinerie interagiert.

Das ultimative Potenzial der In-situ-Elektronenkryotomographie – die umfassende Interpretation von Tomogrammen – wird als visuelle Proteomik bezeichnet. Der hier vorgestellte Workflow soll dabei helfen, dieses Potenzial auszuschöpfen.
KW  - Kryoelektronenmikroskopie
KW  - Tomografie
KW  - Mycoplasma pneumoniae
KW  - Deep learning
KW  - cryo-EM
KW  - cryo-ET
KW  - tomography
KW  - mycoplasma
KW  - pneumoniae
KW  - deep learning
KW  - particle picking
KW  - membrane protein
KW  - visual proteomics
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313447
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TY  - THES
A1  - Schulz, Ellina
T1  - Lokale Ultraschall-vermittelte Zytostatika-Applikation  zur Behandlung von Hirntumoren
T1  - Local ultrasound mediated cytostatic drug application for the treatment of brain tumors
N2  - Glioblastoma (GBM) sind bösartige hirneigene Tumore, deren schlechte Prognose einer innovativen Therapie bedarf. Aus diesem Grund wurde ein neuer Therapieansatz entwickelt, der auf einer lokalen Ultraschall-vermittelten Zytostatika Applikation beruht. Hierfür wurden stabile Microbubbles (MB) bestehend aus Phospholipiden synthetisiert. Es konnte gezeigt werden, dass MB als auch fokussierter Ultraschall niedriger Intensität (LIFU) keinen negativen Einfluss auf GBM-Zellen hat. MB hingegen konnten mittels LIFU destruiert werden, wodurch das in den MB eingeschlossene Chemotherapeutikum freigesetzt werden kann. Es wurden verschiedene Platin(II)- und Palladium(II)-Komplexe auf GBM Zellen getestet. Zur Beladung der MB wurde Doxorubicin (Dox) verwendet. Es konnte eine Beladungseffizienz der MB mit Dox von 52 % erreicht werden, auch eine Aufreinigung dieser mittel Ionenaustausch-Chromatographie und Dialyse war erfolgreich. Die Austestung der mit Dox beladenen MB (MBDox) erfolgte auf GBM-Zellen in 2D- und 3D-Zelkulturmodellen. Dabei zeigte sich, dass die Behandlung mit MBDox und LIFU für 48 h eine zytotoxische Wirkung hatte, die sich signifikant von der Behandlung mit MBDox ohne LIFU unterschied. Zur Austestung der MBDox in 3D-Zellkulturmodellen wurden zwei Scaffold-Systeme eingesetzt. Es zeigte sich in den Versuchen, dass MBDox mit LIFU im Vergleich zu MBDox ohne LIFU Applikation einen zytotoxischen Effekt auf GBM-Zellen haben. Somit konnte die Wirksamkeit der Zytostatika Applikation mittels MB und LIFU in 2D- und 3D-Zellkulturmodellen erfolgreich etabliert werden. Als weiterer Schritt wurden zwei 3D in vitro Modelle erarbeitet. Dabei wurden zunächst organotypische hippocampale Slice Kulturen (organotypic hippocampal brain slice cultures, OHSC) aus der Maus hergestellt und anschließend mit fluoreszent-markierten Mikrotumoren aus GBM-Zelllinien, Primärzellen (PZ) und aus Patienten generierten GBM-Organoiden hergestellt. Diese GBM-Modelle wurden mit Tumor Treating Fields (TTFields) behandelt. Dabei war eine Abnahme der Tumorgröße von Mikrotumoren aus GBM-Zellen und PZ unter TTFields-Behandlung für 72 h messbar. Als weiteres in vitro Modell wurden humane Tumorschnitte aus intraoperativ entferntem GBM-Patientenmaterial hergestellt. Die Schnitte wiesen ein heterogenes Ansprechen nach 72 h TTFields-Applikation auf. Dies spiegelt die Heterogenität des GBM sehr gut wider und bestärkt die Eignung des Modelles zur Untersuchung von neuen Therapieansätzen zur Behandlung von GBM.
N2  - Glioblastoma (GBM) are malignant brain tumor with a poor prognosis requiring innovative therapy. For this reason, a new therapeutic approach based on local ultrasound-mediated cytostatic application is now being established. For this purpose, stable microbubbles (MB) consisting of phospholipids were synthesized. It could be shown that MB as well as focused low intensity ultrasound (LIFU) had no negative effect on GBM cells. MB, on the other hand, could be destroyed by LIFU, allowing the release of the chemotherapeutic agent entrapped in MB. Different platinum(II) and palladium(II) complexes were tested on GBM cells. Doxorubicin (Dox) was used to load the MB. Loading efficiency of MB with Dox of 52% was achieved, and purification of these by ion-exchange chromatography and dialysis was also successful. Dox-loaded MB (MBDox) was tested on GBM cells in 2D and 3D cell culture models. This showed that treatment with MBDox and LIFU for 48 h had a cytotoxic effect that was significantly different from treatment with MBDox without LIFU. Two scaffold systems were used to test MBDox in 3D cell culture models. It was shown in the experiments that MBDox with LIFU had a cytotoxic effect on GBM cells compared with MBDox without LIFU application. Thus, the efficacy of cytostatic drug application using MB and LIFU was successfully established in 2D and 3D cell culture models. As a further step, two 3D in vitro models were developed. Here, organotypic hippocampal brain slice cultures (OHSC) were first prepared from mice and then with fluorescent-labeled microtumors from GBM cell lines, primary cells (PZ), and GBM organoids generated from patients. These GBM models were treated with tumor treating fields (TTFields). Thereby, a decrease in tumor size of microtumors derived from GBM cells and PZ was measurable under TTFields treatment for 72 h. As another in vitro model, human tumor sections were prepared from intraoperatively removed GBM patient material. The sections showed heterogeneous responses after 72 h of TTFields application. This reflects the heterogeneity of GBM very well and reinforces the suitability of the model to investigate new therapeutic approaches for the treatment of GBM.
KW  - Glioblastom
KW  - Hirntumor
KW  - Ultraschall
KW  - Microbubbles
KW  - Glioblastoma
KW  - Slice Culture
KW  - 3D cell culture
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320168
ER  - 
TY  - THES
A1  - Eckert, Ina-Nathalie
T1  - Molecular markers of myeloid-derived suppressor cells and their functional role for homing and in disease models in mice
T1  - Molekulare Marker von myeloiden Suppressorzellen und ihre funktionelle Rolle für deren zielgerichtete Migration und bei Krankheitsmodellen in Mäusen
N2  - MDSCs are suppressive immune cells with a high relevance in various pathologies including cancer, autoimmunity, and chronic infections. Surface marker expression of MDSCs resembles monocytes and neutrophils which have immunostimulatory functions instead of suppressing T cells. Therefore, finding specific surface markers for MDSCs is important for MDSC research and therapeutic MDSC manipulation. In this study, we analyzed if the integrin VLA-1 has the potential as a novel MDSC marker. VLA-1 was expressed by M-MDSCs but not by G-MDSCs as well as by Teff cells. VLA-1 deficiency did not impact iNOS expression, the distribution of M-MDSC and G-MDSC subsets, and the suppressive capacity of MDSCs towards naïve and Teff cells in vitro. In mice, VLA-1 had no effect on the homing capability of MDSCs to the spleen, which is a major reservoir for MDSCs. Since the splenic red pulp contains collagen IV and VLA-1 binds collagen IV with a high affinity, we found MDSCs and Teff cells in this area as expected. We showed that T cell suppression in the spleen, indicated by reduced T cell recovery and proliferation as well as increased apoptosis and cell death, partially depended on VLA-1 expression by the MDSCs. In a mouse model of multiple sclerosis, MDSC injection prior to disease onset led to a decrease of the disease score, and this effect was significantly reduced when MDSCs were VLA-1 deficient. The expression of Sema7A by Teff cells, a ligand for VLA-1 which is implicated in negative T cell regulation, resulted in a slightly stronger Teff cell suppression by MDSCs compared to Sema7A deficient T cells. Live cell imaging and intravital 2-photon microscopy showed that the interaction time of MDSCs and Teff cells was shorter when MDSCs lacked VLA 1 expression, however VLA-1 expression had no impact on MDSC mobility. Therefore, the VLA-1-dependent interaction of MDSC and Teff cells on collagen IV in the splenic red pulp is implicated MDSC-mediated Teff cell suppression.
N2  - MDSCs sind suppressive Immunzellen mit hoher Relevanz bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, Autoimmunerkrankungen und chronischen Infektionen. Die Expression der Oberflächenmarker von MDSCs ähnelt Monozyten und Neutrophilen, welche im Gegensatz zu MDSCs immunstimulatorische Funktionen haben. Daher es wichtig für die Forschung und die therapeutische Manipulation von MDSCs, spezifische Oberflächenmarker für MDSCs zu identifizieren. In dieser Studie haben wir analysiert, ob das Integrin VLA-1 das ein möglicher neuer MDSC-Marker ist.
Effektor-T-Zellen und M-MDSCs, aber nicht G-MDSCs exprimierten VLA-1. VLA-1-Defizienz hatte keinen Einfluss auf die iNOS-Expression, die Verteilung der M-MDSC- und G-MDSC-Subpopulationen und die suppressive Kapazität von MDSCs gegenüber naiven und Effektor-T-Zellen in vitro. In Mäusen hatte VLA-1 keinen Einfluss auf die Fähigkeit zur zielgerichteten Migration von MDSCs zur Milz, welche ein wichtiges Reservoir für MDSCs ist. Da die rote Pulpa der Milz Kollagen IV enthält und VLA-1 Kollagen IV mit hoher Affinität bindet, fanden wir wie erwartet MDSCs und Effektor-T-Zellen in diesem Bereich. Wir konnten zeigen, dass die T Zell-Suppression in der Milz, indiziert durch verringerte T-Zell-Wiederfindung und  Proliferation sowie erhöhte Apoptose und Zelltod, teilweise von der VLA 1-Expression von MDSCs abhing. In einem Mausmodell für Multiple Sklerose führte die MDSC-Injektion vor Induktion der Krankheit zu einer Verringerung des Krankheits-Scores, und dieser Effekt war signifikant verringert, wenn MDSCs VLA-1-defizient waren. Die Expression von Sema7A durch Effektor-T-Zellen, ein Ligand für VLA-1, der mit negativer T Zell-Regulierung assoziiert ist, führte zu einer etwas stärkeren Effektor-T-Zell-Suppression durch MDSCs im Vergleich zu Sema7A-defizienten T-Zellen. Live-Cell-Imaging und intravitale 2-Photonen-Mikroskopie zeigten eine kürzere Interaktionszeit von MDSCs und Effektor-T-Zellen bei VLA-1 defizienten MDSCs, jedoch hatte die VLA-1-Expression keinen Einfluss auf die MDSC-Mobilität. Die Verwendung von VLA-1 bei der Identifizierungsstrategie von in vitro generierten MDSCs führte zu einer reineren Trennung von iNOS+ und Arg1+ Zellen von Zellen ohne Expression von Suppressormarkern. In Brusttumor-tragenden Mäusen und BCG-infizierten Mäusen, welche etablierte Modelle für die MDSC-Generierung in vivo sind, wurde VLA-1 nicht von endogenen MDSCs hochreguliert, daher ist VLA-1 möglicherweise kein geeigneter MDSC Marker in vivo. In BCG-infizierten Mäusen fanden wir CD16.2 (FcγRIV), welcher möglicherweise an der MDSC-vermittelten Immunsuppression beteiligt ist, in M-MDSCs und G-MDSCs hochreguliert, daher könnte CD16.2 ein neuer potenzieller MDSC-Marker in vivo sein. Die Analyse veröffentlichter RNA-Sequenzierungs- und Proteomikdaten von MDSCs ergab Markerkandidaten, die von MDSCs hochreguliert wurden, einschließlich VCAN und FCN1.
KW  - Immunologie
KW  - Immunsuppression
KW  - Maus
KW  - Myeloid-derived suppressor cells
KW  - Integrin
KW  - VLA-1
KW  - Homing
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-319974
ER  - 
TY  - THES
A1  - Riemens, Renzo J. M.
T1  - Neuroepigenomics in Alzheimer’s disease: The single cell ADds
T1  - Neuroepigenomik bei der Alzheimer-Krankheit: Die Einzelzell ADds
N2  - Die Forschung, die in dieser Arbeit zusammengestellt wird, kann in zwei Teile geteilt werden. Der erste Teil, bestehend aus vier Kapiteln, konzentriert sich auf die Rolle der epigenetischen Dysregulation in der Ätiopathophysiologie der sporadischen Alzheimer-Krankheit (sAD). Neben Einblicken in die neuesten Entwicklungen in neuroepigenomischen Studien zu dieser Krankheit geht der erste Teil der Arbeit auch auf verbleibende Herausforderungen ein und gibt einen Ausblick auf mögliche Entwicklungen auf diesem Gebiet. Der zweite Teil, der drei weitere Kapitel umfasst, konzentriert sich auf die Anwendung von auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierenden Krankheitsmodellen für das Studium der AD, einschließlich, aber nicht beschränkt auf mechanistische Studien zur epigenetischen Dysregulation unter Verwendung dieser Plattform. Neben der Skizzierung der bisherigen Forschung mit iPSC-basierten Modellen für sAD gibt der zweite Teil der Arbeit auch Einblicke in die Gewinnung krankheitsrelevanter Nervenkulturen auf Basis der gezielten Differenzierung von iPSCs und beinhaltet darüber hinaus einen experimentellen Ansatz für den Aufbau eines solchen Modellsystems.
N2  - The research that is compiled in this thesis can be divided in two parts. The first part, consisting of four chapters, is centered around the role of epigenetic dysregulation in the etiopathophysiology of sporadic alzheimer's disease (sAD). In addition to providing insights into the most recent developments in neuroepigenomic studies of this disease, the first part of the thesis also touches upon remaining challenges, and provides a future outlook on possible developments in the field. The second part, which includes three more chapters, is focused on the application of induced pluripotent stem cell (iPSC)-based disease models for the study of AD, including but not limited to mechanistic studies on epigenetic dysregulation using this platform. Aside from outlining the research that has been conducted using iPSC-based models for sAD to date, the second part of the thesis also provides insights into the acquisition of disease-relevant neural cultures based on directed differentiation of iPSCs, and furthermore includes an experimental approach for the establishment of such a model system.
KW  - Epigenetik
KW  - Alzheimerkrankheit
KW  - Neuroepigenomics
KW  - Alzheimer's disease
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-254574
SN  - 978-94-6423-524-1
ER  - 
TY  - THES
A1  - Steinfatt, Tim Alexander
T1  - Modulation of regulatory T cells for the immunotherapy of inflammatory diseases and cancer
T1  - Modulation regulatorischer T-Zellen zur Immuntherapie von inflammatorischen Krankheiten und Krebs
N2  - Regulatory T cells (Tregs) are the masters of immune regulation controlling inflammation and tolerance, tissue repair and homeostasis. Multiple immunological diseases result from altered Treg frequencies and Treg dysfunction. We hypothesized that augmenting Treg function and numbers would prevent inflammatory disease whereas inhibiting or depleting Tregs would improve cancer immunotherapy.
In the first part of this thesis, we explored whether in vivo activation and expansion of Tregs would impair acute graft-versus-host disease (aGvHD). In this inflammatory disease, Tregs are highly pathophysiological relevant and their adoptive transfer proved beneficial on disease outcome in preclinical models and clinical studies. IL-2 has been recognized as a key cytokine for Treg function. Yet, attempts in translating Treg expansion via IL-2 have remained challenging, due to IL-2s extremely broad action on other cell types including effector T cells, NK cells, eosinophils and vascular leakage syndrome, and importantly, due to poor pharmacokinetics in vivo. We addressed the latter issue using an IL-2-IgG-fusion protein (irrIgG-IL-2) with improved serum retention and demonstrated profound Treg expansion in vivo in FoxP3-luciferase reporter mice. Further, we augmented Treg numbers and function via the selective-TNF based agonists of TNFR2 (STAR2). Subsequently, we tested a next-generation TNFR2 agonist, termed NewSTAR, which proved even more effective. TNFR2 stimulation augmented Treg numbers and function and was as good as or even superior to the IL-2 strategy. Finally, in a mouse model of aGvHD we proved the clinical relevance of Treg expansion and activation with irrIgG-IL-2, STAR2 and NewSTAR. Notably, the TNFR2 stimulating constructs were outstanding as we observed not the IL-2 prototypic effects on other cell populations and no severe side effects.
In the second part of this thesis, we explored Tregs in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and developed targeting strategies. Among several tumor entities in which Tregs impact survival, preclinical and clinical data demonstrated their negative role on PDAC. In our studies we employed the orthotopic syngeneic Panc02 model in immunocompetent mice. Based on flow cytometric analysis of the tumor microenvironment we propose TIGIT and TNFRSF members as novel therapeutic targets. Surprisingly, we found that blocking TNFR2 did not interfere with intratumoral Treg accumulation. However, we decreased the highly abundant intratumoral Tregs when we disrupted the tumor extracellular matrix. In PDAC, Treg manipulation alone did not lead to tumor regression and we propose that an additional immune boost may be necessary for efficient tumor immune surveillance and cancer clearance. This contrasts with aGvHD, in which Treg manipulation alone was sufficient to improve disease outcome. 
Conclusively, we demonstrated the enormous medical benefit of Treg manipulation. Our promising data obtained with our newly developed powerful tools highlight the potential to translate our findings into clinical practice to therapeutically target human Tregs in patients. With novel TNFR2 agonists (STAR2, NewSTAR) we augmented Treg numbers and function as (or even more) effectively than with IL-2, without causing adverse side effects. Importantly, exogenous in vivo Treg expansion protected mice from aGvHD. For the therapy of PDAC, we identified novel targets on Tregs, notably TIGIT and members of the TNFRSF. We demonstrated that altering the extracellular tumor matrix can efficiently disrupt the Treg abundance in tumors. These novel targeting strategies appear as attractive new treatment options and they may benefit patients suffering from inflammatory disease and cancer in the future.
N2  - Regulatorische T-Zellen (Tregs) gelten als die Meister der Immunregulation und entscheiden über Entzündungen und Immuntoleranz, Geweberegeneration und -homöostase. Eine Vielzahl von immunologischen Erkrankungen resultiert aus Veränderung der Treg-Anzahl oder ihrer Funktion. Wir stellten die Hypothese auf, dass Steigerung der Treg-Frequenz und  Funktion entzündliche Erkrankungen verhindert und dass eine Treg-Depletion die Immuntherapie gegen Krebs unterstützt.
Im ersten Teil dieser Studie untersuchten wir, ob eine exogene Aktivierung und Expansion von Tregs in vivo eine akute Graft-versus-Host-Reaktion (aGvHD) therapeutisch verhindern oder abschwächen kann. Für dieses Krankheitsbild sind Tregs pathologisch hochrelevant und präklinische Modelle sowie klinische Studien zeigen, dass ein adoptiver Treg-Transfer sich positiv auf das Auftreten bzw. den Verlauf des Immunsyndroms auswirkt. IL-2 ist ein Schlüsselzytokin für die Funktion der Tregs. Dennoch bleibt die klinische Entwicklung eine große Herausforderung, da IL-2 eine breite Wirkung auf weitere Zelltypen wie Effektor T Zellen, NK-Zellen, eosinophile Granulozyten und Endothelzellen hat. Dadurch können schwerwiegende Nebenwirkungen auftreten, wie zum Beispiel das gefürchtete Vascular-Leak-Syndrom oder eine Eosinophilie. Ein weiteres großes Hindernis für den klinischen Einsatz von IL-2 stellt auch die schlechte in vivo Pharmakokinetik von IL-2 dar. Diese adressierten wir durch die Fusion von IL-2 mit einem IgG (irrIgG-IL-2), wodurch die Serumretention deutlich verbessert werden konnte. Durch die Applikation von irrIgG-IL-2 konnten wir Tregs in vivo in FoxP3-Reportermäusen expandieren. IrrIgG-IL2 verbesserte auch die Funktionen und Anzahl der Tregs, ähnlich wie der selektive, TNF-basierte Agonist des TNFR2 (STAR2). Die nächste Generation von STAR2 (NewSTAR) hatte sogar noch einen größeren Effekt auf Tregs in vivo und war STAR2 überlegen. Exogene TNFR2-Stimulation zeigte vergleichbare (oder sogar bessere) Effekte auf die Tregs in vivo wie IL-2-Stimulation ohne, dass unerwünschte Nebenwirkungen zu beobachten waren. Die medizinische Relevanz dieser Treg-Agonisten zeigte sich in der in vivo Treg-Aktivierung und -Expansion mittels irrIgG-IL-2, STAR2 und NewSTAR in einem präklinischen aGvHD Modell. Herausragend war die exogene TNFR2 Stimulation, da die für IL-2 typischen Effekte auf andere Immunzellen nicht zu beobachten waren.
Im zweiten Teil dieser Arbeit untersuchten wir Tregs im duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) zur Entwicklung neuner therapeutischer Targeting-Strategien. Unter den vielen Tumorentitäten in welchen Tregs das Überleben beeinflussen, zeigen besonders die präklinischen und klinischen Daten im PDAC ihre negative Rolle. Für unsere Studien verwendeten wir das orthotope, syngene Panc02 Modell in immunkompetenten Mäusen. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysierten wir das Tumormikromilieu und präsentieren TIGIT und Mitglieder der TNFRSF als neue therapeutische Targets. Eine Blockade des TNFR2 reduzierte nicht die intratumorale Akkumulation von Tregs. Jedoch gelang es durch Manipulation der extrazellulären Tumormatrix deutlich die Anzahl an Tregs im Tumor zu reduzieren. Allerdings reichte im PDAC die Treg-Manipulation allein nicht zur Tumorregression aus und wir postulieren, dass eine weitere Verstärkung der Immunantwort nötig ist, um eine Tumorregression bzw. -kontrolle zu erreichen.
Zusammenfassend zeigten wir das hohe therapeutische Potenzial der Manipulation von Tregs in vivo und stellen wirkungsvolle Strategien zu ihrer Umsetzung vor. Mit neuartigen TNFR2 Agonisten (STAR2, NewSTAR) konnten wir die Funktion und Anzahl der Tregs verstärken. Der Effekt war genauso gut (oder sogar besser) wie nach IL-2 Stimulation, jedoch ohne unerwünschte Nebenwirkungen. Bemerkenswert war der therapeutische Nutzen zur Verhinderung der aGvHD nach allogener Stammzelltransplantation. Als neue therapeutische Targets im PDAC identifizierten wir TIGIT und Mitglieder der TNFRSF. Durch Veränderung der extrazellulären Tumormatrix gelang es uns die Anzahl der tumorinfiltrierenden Tregs zu reduzieren. Diese neuen Behandlungsstrategien erscheinen als höchst attraktive Therapieoptionen, welche Patienten mit Entzündungserkrankungen bzw. mit einer Krebsdiagnose in Zukunft nutzen könnten.
KW  - Immunotherapy
KW  - ModulationTregs
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192600
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TY  - THES
A1  - Amatobi, Kelechi Michael
T1  - Circadian clocks determine transport and membrane lipid oscillation in \(Drosophila\) hemolymph in complex interactions between nutrient-type, photic conditions and feeding behaviour
T1  - Die innere Uhr bestimmt den Transport und die Membranlipid-Oszillation in der \(Drosophila\) Hämolymphe in komplexen Interaktionen zwischen Nährstofftyp, photischen Bedingungen und Fressverhalten
N2  - The interaction between circadian clocks and metabolism is of increasing interest, since clock dysfunction often correlates with metabolic pathologies. Many research articles have been published analysing the impact of factors such as circadian clock, light, feeding time and diet-type on energy homeostasis in various tissues/organs of organisms with most of the findings done in mammals. Little is known about the impact of circadian clock and the above-mentioned factors on circulating lipids, especially the transport form of lipids - diacylglycerol (DG) and membrane lipids such as phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylcholine (PC) in the Drosophila hemolymph. The fruit fly Drosophila is a prime model organism in circadian, behaviour and metabolism research.

To study the role of circadian clock and behaviour in metabolism, we performed an extensive comparative hemolymph lipid (diacylglycerol: DG, phosphatidylethanolamine: PE, phosphatidylcholine: PC) analysis using ultra performance liquid chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry (UPLC-MS) between wild-type flies (WTCS) and clock disrupted mutants (per01). In addition, clock controlled food intake– feeding behaviour was investigated. Time-dependent variation of transport (DG) and membrane lipids (PE and PC) were not rhythmic in WTCS under constant darkness and in per01 under LD, suggesting an impact of light and clock genes on daily lipid oscillations. Day-time and night-time restriction of food led to comparable lipid profiles, suggesting that lipid oscillations are not exclusively entrained by feeding but rather are endogenously regulated. Ultradian oscillations in lipid levels in WTCS under LD were masked by digested fatty acids since lipid levels peaked more robustly at the beginning and end of light phase when flies were fed a lipid- and protein-free diet. These results suggest that metabolite (DG, PE and PC) oscillation is influenced by complex interactions between nutrient-type, photic conditions, circadian clock and feeding time.

In conclusion, the results of this thesis suggest that circadian clocks determine transport and membrane lipid oscillation in Drosophila hemolymph in complex interactions between nutrient-type, photic conditions and feeding behaviour.
N2  - Die Interaktion zwischen Innerer Uhr und Metabolismus ist von zunehmendem Interesse, weil Störungen der Inneren Uhr oft mit metabolischen Störungen assoziiert sind. Zahlreiche Untersuchungen zum Einfluss verschiedener Faktoren, u.a. der Inneren Uhr, Lichtregime, Zeitpunkt der Nahrungsaufnahme und Art der Diät, auf die Energiehomöostase in verschiedenen Geweben und Organen wurden vor allem in Säugetieren durchgeführt. Der Einfluss der Inneren Uhr und der oben genannten weiteren Faktoren auf zirkulierende Lipide in der Hämolymphe von Drosophila, insbesondere auf die Transportform Diacylglycerol (DG) und Membranlipide (wie z.B. Phosphatidylethanolamin (PE) und Phospathidylcholine (PC)), ist jedoch kaum untersucht. Die Taufliege Drosophila dient dabei als hervorragendes Modell in der circadianen Verhaltens- und Metabolismusforschung.

Um die Rolle der Inneren Uhr und circadianen Verhaltens auf den Metabolismus zu untersuchen, haben wir eine extensive und vergleichende Lipidanalyse (DG, PE, PC) in der Hämolymphe von Wildtyp-Fliegen (WTCS) und Uhrmutanten (per01) mittels

Ultrahochleistungs-Flüssigkeits-chromatographie gekoppelt mit Flugzeit-Massenspektrometrie (UPLC-MS) durchgeführt. Gleichzeitig wurde auch die circadian gesteuerte Nahrungsaufnahme untersucht. Die zeitabhängigen Schwankungen der Transport-(DG) und Membranlipide (PE, PC) unterlagen keiner tageszeitlichen Rhythmik in konstanter Dunkelheit in Wildtypfliegen, und unter Licht-Dunkelwechsel (LD) in per01 Mutanten. Dies weist auf einen Einfluss der Inneren Uhr und des Lichts auf tägliche Lipidschwankungen hin. Restriktion der Futtergabe auf entweder Tag oder Nacht ergab ähnliche Lipidprofile, was darauf hinweist, daß Schwankungen in den Lipidkonzentrationen nicht ausschliesslich durch die Nahrungsaufnahme, sondern auch endogen geregelt werden. Ultradiane Oszillationen in der Lipidkonzentration in WTCS unter LD-Bedingungen wurden durch mit der Nahrung aufgenommene Fettsäuren maskiert, zeigten sich aber deutlicher zu Beginn und Ende der Lichtphase wenn die Fliegen auf einer Lipid- und Protein-freien Diät gehalten wurden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß Oszillationen in Lipiden (DG, PE und PC) in der Hämolymphe durch eine komplexe Interaktion zwischen Diättyp, Lichtregime, Innerer Uhr und Zeitpunkt der Nahrungsaufnahme bestimmt wird.

Zusammengenommen zeigen die Resultate dieser Arbeit, dass die Innere Uhr in komplexer

Interaktion mit Diättyp, Lichtregime und Freßverhalten das zeitliche Profil von Transport- und

Membranlipiden in der Drosophila-Hämolymphe bestimmt.
KW  - Pharmaceutische Biologie
KW  - DG diacyglycerol
KW  - PE Phosphoethanolamine
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244462
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TY  - THES
A1  - Strack, Stefanie
T1  - Rolle der Polycomb Faktoren PCGF6 und E2F6 in undifferenzierten und differenzierenden embryonalen Stammzellen der Maus
T1  - Role of Polycomb Factors PCGF6 and E2F6 in undifferentiated and differentiating embryonic stem cells of mice
N2  - To investigate the role of PCGF6 and E2F6 in murine embryonic stem cells (mESCs) and at the beginning of differentiation, knockout cell lines of both proteins and in combination were generated by the CRISPR/Cas9n system. Characterization of these knockout cell lines (KO) was performed by growth analysis in mESCs and differentiating murine stem cells (EBs). It was found that Pcgf6 KO cells formed smaller EBs that also could not be maintained in culture for an extended period. To resolve this specific phenotype, further molecular analyses were performed by flow cytometry (FACS). Cells of the Pcgf6 KO exhibited an increased proportion of cells in G1 phase during differentiation as well as an increased apoptotic frequency. Supporting the assumption of a cell cycle defect, RNASeq data were analysed. It could be shown that cells of the Pcgf6 KO differentiated in a temporally uncontrolled manner. Evaluation of differentially expressed genes revealed that expression of E2f6, a regulator of the cell cycle and another component of the non-canonical PRC1.6, was downregulated in mESC and EB cultures, whereas cell cycle-specific targets of E2F6-dependent gene regulation were upregulated at day 2 of differentiation. These results indicated that deletion of Pcgf6 at the beginning of differentiation must have effects on E2F6-dependent cell cycle regulation. Due to mycoplasma contamination in the cell culture at this time point, the Pcgf6 KO cell line had to be re-established. In addition, KO cell lines of E2f6 in Wt and in Pcgf6 KO mESCs were established. The replication of cellular characterization of the phenotype revealed that EB cultures of the Pcgf6 KO and the double knockout of Pcgf6 and E2f6 (dKOPcgf6/E2f6) exhibited reduced cell numbers during differentiation. Molecular characterizations of the phenotype revealed that the increased proportion of cells in the G1 phase of the Pcgf6 KO, which was detected before mycoplasma contamination, could not be reproduced. However, an increased frequency of cells in the G2 phase of dKOPcgf6/E2f6 was detected in mESC and EB culture. Analysis of apoptotic frequency in all KO cell lines indicated an increase during differentiation. RNASeq data from two publications of PCGF6 and E2F6 were used to support the analyses performed to this point (Qui et al, 2021; Dahlet et al, 2021). Gene Ontology Enrichment analyses of these data revealed that germline genes were independently upregulated in both KO cell lines in mESCs. However, both KO cell lines also showed an overlap of commonly upregulated germline genes. Following these publications, gene expression analysis of individual germline genes revealed that loss of E2f6 leads to de-repression of genes that have a binding site for E2F6. In contrast, loss of Pcgf6 had no effect on expression of these targets.
These results, as well as previously published data, support the assumption that there are distinct subcomplexes that regulate the expression of germline genes in mESC and EB cultures.
N2  - Im Rahmen dieser Arbeit wurde zur Untersuchung der Rolle von PCGF6 und E2F6 in murinen embryonalen Stammzellen (mESCs) und zu Beginn der Differenzierung Knockout-Zelllinien beider Proteine und in Kombination durch das CRISPR/Cas9n Systems erstellt. Die Charakterisierung dieser Knockout-Zelllinien erfolgte durch Wachstumsanalysen in mESCs und differenzierenden murinen Stammzellen (EBs). Es konnte festgestellt werden, dass Zellen des Pcgf6 Knockout (KO) kleinere Ebs bildeten, die zudem nicht über einen längeren Zeitraum in Kultur gehalten werden konnten. Zur Klärung dieses spezifischen Phänotyps wurden weitere molekulare Analysen mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Zellen des Pcgf6 KO wiesen während der Differenzierung einen erhöhten Anteil an Zellen in der G1-Phase sowie eine erhöhte apoptotische Frequenz auf. Unterstützend zur Annahme eines Zellzyklusdefekts wurden RNASeq-Daten analysiert. Die Auswertung ergab, dass Zellen des Pcgf6 KO zeitlich unkontrolliert differenzierten. Die Auswertung differenziell exprimierter Gene ergab zudem, dass die Expression von E2f6, ein Regulator des Zellzyklus und weitere Untereinheit des nicht-kanonischen PRC1.6, in mESC und EB-Kulturen herunter reguliert war, während Zellzyklus-spezifische Targets der E2F6-abhängigen Genregulation an Tag 2 der Differenzierung hochreguliert waren. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass eine Deletion von Pcgf6 zu Beginn der Differenzierung Auswirkungen auf eine E2F6-abhängige Zellzyklusregulation haben muss. Auf Grund einer zu diesem Zeitpunkt aufgetretenen Mykoplasmenkontamination in der Zellkultur musste die Pcgf6 KO-Zelllinie neu erstellt werden. Zusätzlich wurden KO-Zelllinien von E2f6 in Wt und in Pcgf6 KO mESCs erstellt. Die anschließende Wiederholung der zellulären Charakterisierung des Phänotyps ergab, dass EB-Kulturen des Pcgf6 KO und des Doppelknockout von Pcgf6 und E2f6 (dKOPcgf6/E2f6) während der Differenzierung eine verringerte Zellzahl aufwiesen. Die molekularen Charakterisierungen des Phänotyps ergaben, dass der erhöhte Anteil an Zellen in der G1-Phase des Pcgf6 KO, welche vor der Mykoplasmenkontamination detektiert wurde, nicht reproduziert werden konnte. Es wurde jedoch eine erhöhte Frequenz an Zellen in der G2-Phase des dKOPcgf6/E2f6 in der mESC-und EB-Kultur ermittelt. Die Analyse der apoptotischen Frequenz in allen KO-Zelllinien zeigte einen Anstieg während der Differenzierung. Zur Unterstützung der bis dahin durchgeführte Analysen wurden RNASeq-Daten zweier Publikationen zu PCGF6 und E2F6 herangezogen (Qui et al., 2021; Dahlet et al, 2021). Gene Ontology Enrichtment Analysen dieser Daten ergaben, dass in beiden KO-Zelllinien in mESCs unabhängig voneinander Keimbahngene hochreguliert waren. Beide KO-Zelllinien zeigten aber auch eine Schnittmenge gemeinsam hochregulierter Keimbahngene. In Anlehnung an diese Veröffentlichungen, ergaben Genexpressionsanalysen einzelner Keimbahngene, dass ein Verlust von E2f6 zu einer De-Repression von Genen führt, die eine Bindestelle für E2F6 besitzen. Der Verlust von Pcgf6 hingegen hatte keine Auswirkung auf Expression dieser Targets. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass es unterschiedliche Subkomplexe gibt, die die Expression von Keimbahngenen in mESC- und EB-Kulturen regulieren.
KW  - Murine embryonale Stammzellen
KW  - Pcgf6
KW  - PRC1.6
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-255600
ER  -