TY - THES A1 - Gupta, Sanjay Kumar T1 - The human CCHC-type Zinc Finger Nucleic Acid Binding Protein (CNBP) binds to the G-rich elements in target mRNA coding sequences and promotes translation T1 - Das humane CCHC-Typ-Zinkfinger-Nukleinsäure-Binde-Protein (CNBP) bindet an G-reiche Elemente in der kodierenden Sequenz seiner Ziel-mRNAs und fördert deren Translation N2 - The genetic information encoded with in the genes are transcribed and translated to give rise to the functional proteins, which are building block of a cell. At first, it was thought that the regulation of gene expression particularly occurs at the level of transcription by various transcription factors. Recent discoveries have shown the vital role of gene regulation at the level of RNA also known as post-transcriptional gene regulation (PTGR). Apart from non-coding RNAs e.g. micro RNAs, various RNA binding proteins (RBPs) play essential role in PTGR. RBPs have been implicated in different stages of mRNA life cycle ranging from splicing, processing, transport, localization and decay. In last 20 years studies have shown the presence of hundreds of RBPs across eukaryotic systems many of which are widely conserved. Given the rising number of RBPs and their link to human diseases it is quite evident that RBPs have major role in cellular processes and their regulation. The current study is aimed to describe the so far unknown molecular mechanism of CCHC-type Zinc Finger Nucleic Acid Binding Protein (CNBP/ZNF9) function in vivo. CNBP is ubiquitously expressed across various human tissues and is a highly conserved RBP in eukaryotes. It is required for embryonic development in mammals and has been implicated in transcriptional as well as post-transcriptional gene regulation; however, its molecular function and direct target genes remain elusive. Here, we use multiple systems-wide approaches to identify CNBP targets and document the consequences of CNBP binding. We established CNBP as a cytoplasmic RNA-binding-protein and used Photoactivatable Ribonucleoside Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation (PAR-CLIP) to identify direct interactions of CNBP with 4178 mRNAs. CNBP preferentially bound a G-rich motif in the target mRNA coding sequences. Functional analyses, including ribosome profiling, RNA sequencing, and luciferase assays revealed the CNBP mode of action on target transcripts. CNBP binding was found to increase the translational efficiency of its target genes. We hypothesize that this is consistent with an RNA chaperone function of CNBP helping to resolve secondary structures, thus promoting translation. Altogether this study provides a novel mechanism of CNBP function in vivo and acts as a step-stone to study the individual CNBP targets that will bring us closer to understand the disease onset. N2 - Die in der DNA kodierte genetische Information wird transkribiert und translatiert, um funktionelle Proteine zu bilden, welche die Bausteine von Zellen sind. Lange Zeit wurde vermutet, dass die Regulation der Genexpression insbesondere auf dem Level der Transkription erfolgt. Kürzlich gemachte Entdeckungen haben jedoch die zentrale Rolle der Genregulation auf dem Level der RNA, auch bekannt als posttranskriptionelle Genregulation (PTGR), gezeigt. Neben nicht-kodierenden RNAs wie microRNAs, besitzen verschiedene RNA-Binde-Proteine (RBP) eine Schlüsselrolle in der PTGR. RBPs wurden mit diversen Ebenen des mRNA- Lebenszyklus, wie Speißen, Prozessieren, Transport, Lokalisation und Abbau in Verbindung gebracht. In den letzten 20 Jahren haben Studien die Existenz von Hunderten von RBPs in unterschiedlichen eukaryotischen Systemen gezeigt, von denen viele weithin konserviert sind. Bedenkt man die steigende Anzahl entdeckter und charakterisierter RBPs und ihren Bezug zu Krankheiten des Menschen, so ist es offensichtlich, dass RBPs eine große Rolle in der Regulation zellulärer Prozesse besitzen. Das Ziel der hier vorliegenden Studie bestand darin, die bis jetzt unbekannten molekularen Mechanismen der Funktion des CCHC-Typ-Zinkfinger-Nukleinsäure- Binde-Proteins (CNBP/ZNF9) in vivo zu beschreiben. CNBP ist in verschiedenen humanen Geweben ubiquitär exprimiert und ein hoch konserviertes RBP in Eukaryoten. Es ist für die embryonale Entwicklung in Säugetieren notwendig und wurde mit der transkriptionellen und posttranskriptionellen Genregulation in Verbindung gebracht. Seine molekulare Funktion sowie die unmittelbaren Zielgene blieben jedoch unklar. In dieser Studie verwendeten wir systemweit analysierende Methoden um CNPB-Zieltranskripte zu identifizieren und dokumentierten die Folgen der Bindung von CNBP an diese. Wir haben CNBP als ein zytoplasmatisches RNA-Binde-Protein charakterisiert und Quervernetzung und Immunpräzipitation mit photoaktivierbaren Ribonukleotiden (PAR-CLIP) angewendet. Dabei wurden direkte Interaktionen von CNBP mit 4178 mRNAs identifiziert. CNBP bindet bevorzugt an ein G-reiches Motiv in der kodierenden Sequenz der Ziel-mRNA. Funktionale Analysen, unter anderem Ribosom-Profil-Untersuchungen, RNA Sequenzierung und Luciferaseproben, zeigten die Art und Weise, wie CNBP auf die Zieltranskripte wirkt. Die Bindung von CNBP an seine Zieltranskripte erhöht deren Translationseffizienz. Wir vermuten, dass dies eine RNA-Chaperon- Funktion von CNBP darstellt, die hilft Sekundärstrukturen aufzulösen und die Translation zu fördern. Zusammengefasst liefert diese Studie einen neuen Mechanismus der Funktion von CNBP in vivo und kann als Startpunkt dienen um einzelne CNBP Ziele zu untersuchen. Dies wird uns helfen dem Verständnis der Krankheitsentstehung näher zu kommen. ... KW - CNBP KW - RNA binding potein CNBP Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142917 ER - TY - THES A1 - Garcia Guerrero, Estefania T1 - Strategies to Obtain Tumor-Reactive Cells for Cancer Immunotherapy by Cell Sorting and Genetic Modifications of T Lymphocytes T1 - Zellsortierung und genetische Modifikation von T-Lymphozyten zur Gewinnung tumorreaktiver Zellen für die Krebsimmuntherapie N2 - Recent advances in the field of cancer immunotherapy have enabled this therapeutic approach to enter the mainstream of modern cancer treatment. In particular, adoptive T cell therapy (ACT) is a potentially powerful immunotherapy approach that relies on the administration of tumor-specific T cells into the patient. There are several strategies to obtain tumor-reactive cytotoxic T lymphocytes (CTLs), which have already been shown to induce remarkable responses in the clinical setting. However, there are concerns and limitations regarding the conventional approaches to obtain tumor-reactive T cells, such as accuracy of the procedure and reproducibility. Therefore, we aimed to develop two approaches to improve the precision and efficacy of tumor-reactive T cells therapy. These two techniques could constitute effective, safe and broadly applicable alternatives to the conventional methods for obtaining tumor-specific CTLs. The first approach of this study is the so called “Doublet Technology”. Here, we demonstrate that peptide-human leukocyte antigen-T cell receptor (pHLA-TCR) interactions that involve immune reactive peptides are stable and strong. Therefore, the CTLs that are bound by their TCR to tumor cells can be selected and isolated through FACS-based cell sorting taking advantage of this stable interaction between the CTLs and the target cells. The CTLs from acute myeloid leukemia (AML) patients obtained with this technique show cytolytic activity against blast cells suggesting a potential clinical use of these CTLs. “Doublet Technology” offers a personalized therapy in which there is no need for a priori knowledge of the exact tumor antigen. The second approach of this study is the Chimeric Antigen Receptor (CAR) Technology. We design several CARs targeting the B-Cell Maturation Antigen (BCMA). BCMA CAR T cells show antigen-specific cytolytic activity, production of cytokines including IFN-γ and IL-2, as well as productive proliferation. Although we confirm the presence of soluble BCMA in serum of multiple myeloma (MM) patients, we demonstrate that the presence of soluble protein does not abrogate the efficacy of BCMA CAR T cells suggesting that BCMA CAR T cells can be used in the clinical setting to treat MM patients. The high antigen specificity of CAR T cells allows efficient tumor cell eradication and makes CAR Technology attractive for broadly applicable therapies. N2 - Durch jüngste Fortschritte auf dem Gebiet der Krebsimmuntherapie konnte dieser therapeutische Ansatz in der Mitte moderner Krebsbehandlungen ankommen. Insbesondere die adoptive T-Zelltherapie (ACT), die auf der Verabreichung tumorspezifischer T-Zellen an den Patienten beruht, stellt einen potentiell schlagkräftigen immuntherapeutischen Ansatz dar. Es existieren bereits verschiedene Strategien um tumorreaktive zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) herzustellen, von denen bereits gezeigt wurde, dass sie klinisch bemerkenswerte Antworten hervorrufen. Dennoch gibt es Bedenken und Grenzen bezüglich dieser konventionellen Ansätze zur Herstellung tumorreaktiver T-Zellen, wie zum Beispiel die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Verfahrens. Daher arbeiteten wir an der Entwicklung zweier Ansätze um die Präzision und Effizienz der tumorreaktiven T-Zelltherapie zu verbessern. Diese beiden Techniken könnten effektive, sichere und breit anwendbare Alternativen zu den konventionellen Methoden der tumorspezifischen CTL-Gewinnung darstellen. Der erste Ansatz dieser Studie wird als „Doublet Technology“ bezeichnet. Hierbei zeigen wir, dass die Interaktionen zwischen Peptid/MHC-Komplex und T-Zellrezeptor (pHLA-TCR), die immunreaktive Peptide involvieren, stabil und solide sind. Außerdem zeigen wir, dass CTLs, die über ihren TCR an Tumorzellen gebunden sind, selektioniert und durch FACS-basierte Zellsortierung isoliert werden können. Hierbei wird die Stabilität der Interaktion von CTLs und Zielzellen genutzt. Die CTLs von Patienten mit Akuter Myeloischer Leukämie (AML), die auf diese Weise gewonnen werden, zeigen zytolytische Aktivität gegenüber Blasten, was auf einen potentiellen klinischen Nutzen dieser CTLs hinweisen könnte. Die „Doublet Technology“ bietet eine personalisierte Therapie, die kein vorheriges Wissen über ein exaktes Tumorantigen erfordert. Der zweite Ansatz dieser Studie ist die Chimere Antigenrezeptor (CAR) Technologie. Wir entwickeln verschiedene CARs gegen das B-Zellmaturationsantigen (BCMA). BCMA-CAR T-Zellen zeigen antigenspezifische zytolytische Aktivität, Produktion der Zytokine IFN-γ und IL-2 sowie produktive Proliferation. Obwohl wir bestätigen, dass lösliches BCMA im Serum von Multiplen Myelompatienten zu finden ist, zeigen wir auch, dass dieses lösliche Protein nicht die Effizienz von BCMA-CAR T-Zellen beeinträchtigt und somit BCMA-CAR T-Zellen zur Behandlung von Multiplen Myelompatienten klinisch genutzt werden können. Die hohe Antigenspezifität der CAR-T-Zellen erlaubt eine effiziente Vernichtung von Tumorzellen und macht die CAR-Technologie attraktiv für breit einsetzbare Therapien. KW - Immunotherapy KW - Cancer KW - Strategies to Obtain Tumor-Reactive Cells Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150547 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Franziska T1 - Neuronal basis of temporal polyethism and sky-compass based navigation in \(Cataglyphis\) desert ants T1 - Die neuronale Grundlage von Alterspolyethismus und Himmelskompassnavigation in der Wüstenameise \(Cataglyphis\) N2 - Desert ants of the genus Cataglyphis (Formicinae) are widely distributed in arid areas of the palearctic ecozone. Their habitats range from relatively cluttered environments in the Mediterranean area to almost landmark free deserts. Due to their sophisticated navigational toolkit, mainly based on the sky-compass, they were studied extensively for the last 4 decades and are an exceptional model organism for navigation. Cataglyphis ants exhibit a temporal polyethism: interior workers stay inside the dark nest and serve as repletes for the first ∼2 weeks of their adult life (interior I). They then switch to nursing and nest maintenance (interior II) until they transition to become day-active outdoor foragers after ∼4 weeks. The latter switch in tasks involves a transition phase of ∼2-3 days during which the ants perform learning and orientation walks. Only after this last phase do the ants start to scavenge for food as foragers. In this present thesis I address two main questions using Cataglyphis desert ants as a model organism: 1. What are the underlying mechanisms of temporal polyethism? 2. What is the neuronal basis of sky-compass based navigation in Cataglyphis ants? Neuropeptides are important regulators of insect physiology and behavior and as such are promising candidates regarding the regulation of temporal polyethism in Cataglyphis ants. Neuropeptides are processed from large precursor proteins and undergo substantial post-translational modifications. Therefore, it is crucial to biochemically identify annotated peptides. As hardly any peptide data are available for ants and no relevant genomic data has been recorded for Cataglyphis, I started out to identify the neuropeptidome of adult Camponotus floridanus (Formicinae) workers (manuscript 1). This resulted in the first neuropeptidome described in an ant species – 39 neuropeptides out of 18 peptide families. Employing a targeted approach, I identified allatostatin A (AstA), allatotropin (AT), short neuropeptide F (sNPF) and tachykinin (TK) using mass spectrometry and immunohistology to investigate the distribution of AstA, AT and TK in the brain (manuscript 2). All three peptides are localized in the central complex, a brain center for sensory integration and high-order control of locomotion behavior. In addition, AstA and TK were also found in visual and olfactory input regions and in the mushroom bodies, the centers for learning and memory formation. Comparing the TK immunostaining in the brain of 1, 7 and 14 days old dark kept animals revealed that the distribution in the central complex changes, most prominently in the 14 day old group. In the Drosophila central complex TK modulates locomotor activity levels. I therefore hypothesize that TK is involved in the internal regulation of the interior I–interior II transition which occurs after ∼2 weeks of age. I designed a behavioral setup to test the effect of neuropeptides on the two traits: ’locomotor activity level’ and ’phototaxis’ (manuscript 3). The test showed that interior I ants are less active than interior II ants, which again are less active than foragers. Furthermore, interior ants are negatively phototactic compared to a higher frequency of positive phototaxis in foragers. Testing the influence of AstA and AT on the ants’ behavior revealed a stage-specific effect: while interior I behavior is not obviously influenced, foragers become positively phototactic and more active after AT injection and less active after AstA injection. I further tested the effect of light exposure on the two behavioral traits of interior workers and show that it rises locomotor activity and results in decreased negative phototaxis in interior ants. However, both interior stages are still more negatively phototactic than foragers and only the activity level of interior II ants is raised to the forager level. These results support the hypothesis that neuropeptides and light influence behavior in a stage-specific manner. The second objective of this thesis was to investigate the neuronal basis of skycompass navigation in Cataglyphis (manuscript 4). Anatomical localization of the sky-compass pathway revealed that its general organization is highly similar to other insect species. I further focused on giant synapses in the lateral complex, the last relay station before sky-compass information enters the central complex. A comparison of their numbers between newly eclosed ants and foragers discloses a rise in synapse numbers from indoor worker to forager, suggesting task-related synaptic plasticity in the sky-compass pathway. Subsequently I compared synapse numbers in light preexposed ants and in dark-kept, aged ants. This experiment showed that light as opposed to age is necessary and sufficient to trigger this rise in synapse number. The number of newly formed synapses further depends on the spectral properties of the light to which the ants were exposed to. Taken together, I described neuropeptides in C. floridanus and C. fortis, and provided first evidence that they influence temporal polyethism in Cataglyphis ants. I further showed that the extent to which neuropeptides and light can influence behavior depends on the animals’ state, suggesting that the system is only responsive under certain circumstances. These results provided first insight into the neuronal regulation of temporal polyethism in Cataglyphis. Furthermore, I characterized the neuronal substrate for sky-compass navigation for the first time in Cataglyphis. The high level of structural synaptic plasticity in this pathway linked to the interior–forager transition might be particularly relevant for the initial calibration of the ants’ compass system. N2 - Wüstenameisen der Gattung Cataglyphis sind weit verbreitet in ariden Gebieten der paläarktischen Ökozone. Die von ihnen bewohnten Habitate reichen von landmarkenreichen Arealen im Mittelmeerraum, zu beinahe landmarkenfreien Wüstengebieten. Aufgrund ihres hochentwickelten Navigationssystems, welches größtenteils auf dem Himmelskompass basiert, wurden sie in den letzten 4 Jahrzehnten extensiv studiert und sind ein einzigartiges Modellsystem für Navigation. Cataglyphis weisen einen alterskorrelierten Polyethismus auf: Innendienstler dienen als Speichertiere für die ersten ∼2 Wochen ihres adulten Lebens (Interior I). Sie gehen daraufhin zu Brutpflege und Nestbau (Interior II) über bis sie nach ∼4 Wochen zu tagaktiver Furagiertätitkeit außerhalb ihres Nestes wechseln. Dieser letzte Übergang dauert ∼2-3 Tage und wird von den Ameisen genutzt, um Lernund Orientierungsläufe durchzuführen. In der vorliegenden Arbeit befasse ich mich vor allem mit zwei Fragen, die ich mit Hilfe von Cataglyphis als Modellorganismus beantworten möchte: 1. Welches sind die zugrunde liegenden Mechanismen des Alterspolyethismus? 2. Was ist die neuronale Grundlage von Navigation, die auf dem Himmelskompass basiert? Neuropeptide sind bedeutende Regulatoren der Physiologie und des Verhaltens von Insekten und als solche vielversprechende Kandidaten im Hinblick auf die Regulation des Alterspolyethismus in Cataglyphis Ameisen. Neuropeptide werden aus größeren Vorläuferproteinen herausgeschnitten und posttranslational stark modifiziert. Daher ist es wichtig, annotierte Peptide auch biochemisch zu identifizieren. Da für Ameisen kaum Peptiddaten zur Verfügung stehen und es zudem keine relevanten genomischen Daten für Cataglyphis gibt, identifizierte ich zunächst das Neuropeptidom adulter Camponotus floridanus (Formicinae) Arbeiterinnen (Manuskript 1). Daraus resultierte das erste Neuropeptidom, das für eine Ameisenart beschrieben wird—39 Neuropeptide aus 18 Peptidfamilien. In einer weiteren Studie identifizierte ich gezielt die Neuropeptidfamilien Allatostatin A (AstA), Allatotropin (AT), das kurze Neuropeptid F (sNPF) und Tachykinin (TK) mittels Massenspektroskopie und untersuchte die Verteilung von AstA, AT und TK im Gehirn mit Hilfe der Immunhistologie (Manuskript 2). Alle drei Peptide sind im Zentralkomplex lokalisiert, dem Gehirnzentrum welches sensorische Eingänge integriert und in einer übergeordneten Rolle Lokomotorverhalten steuert. AstA und TK sind zudem in den visuellen und olfaktorischen Eingangsregionen, sowie den Pilzkörpern, den Zentren für Lernen und Gedächtnisbildung, zu finden. Ein Vergleich der TK-Immunfärbung im Gehirn von 1, 7 und 14 Tage alten im Dunkeln gehaltenen Tieren zeigt, dass sich die Verteilung im Zentralkomplex verändert— dies ist besonders prominent in der 14 Tage alten Gruppe. In Drosophila moduliert TK im Zentralkomplex Lokomotoraktivität. Basierend darauf stelle ich die Hypothese auf, dass TK in der internen Regulierung des Übergangs von Interior I zu Interior II involviert ist, welchen die Tiere im Alter von ∼2 Wochen durchlaufen. Für eine dritte Studie konstruierte ich ein Verhaltenssetup um den Einfluss von Neuropeptiden und Licht auf die beiden Verhaltensmerkmale ’Lokomotoraktivität’ und ’Phototaxis’ zu testen (Manuskript 3). Der Test zeigte, dass Interior I Ameisen weniger aktiv sind als Interior II Ameisen, welche wiederum weniger aktiv sind als Furageure. Zudem sind Interior Ameisen negativ phototaktisch, verglichen mit einer häufiger zu beobachtenden positiven Phototaxis bei Furageuren. Im Test zeigte sich auch, dass der Einfluss von AstA und AT stadiumsspezifisch ist: während das Verhalten von Interior I Tieren nicht offensichtlich beeinflusst wird, werden Furageure durch die Injektion von AT positiv phototaktisch, sowie aktiver und AstA-Injektion führt zu geminderter Lokomotoraktivität. Darüber hinaus testete ich den Lichteinfluss auf beide Verhaltensmerkmale in den Innendienststadien und zeige, dass er Lokomotoraktivität steigert und in einer geminderten negativen Phototaxis resultiert. Beide Innendienststadien sind jedoch weiterhin negativer phototaktisch als Furageure und nur die Lokomotoraktivtät von Interior II Ameisen wird auf das Niveau von Furageuren angehoben. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass Neuropeptide und Licht stadiumsspezifisch Verhalten beeinflussen. Der zweite Aspekt dieser Thesis war es, die neuronale Grundlage der Himmelskompassnavigation in Cataglyphis aufzuklären (Manuskript 4). Die neuroanatomische Lokalisation der Himmelskompasssehbahn zeigt, dass die allgemeine Organisation dieser neuronalen Bahn der bei bisher untersuchten anderen Insekten stark ähnelt. Ich habe mich daraufhin auf Riesensynapsen im lateralen Komplex konzentriert, der letzten Verschaltungsstation ehe die Himmelskompassinformation in den Zentralkomplex übertragen wird. Ein Vergleich zwischen der Synapsenzahl in frisch geschlüpfte Ameisen und erfahrenen Furageueren zeigte einen Anstieg der Synapsenzahl von Innendienst zu Furaguer, was aufgabenabhängige synaptische Plastizität in der Himmelskompasssehbahn suggeriert. In einem weiteren Versuch verglich ich die Riesensynapsenzahlen lichtexponierter Tiere und dunkel gehaltener, gealteter Tiere. Dieses Experiment zeigte, dass der Zuwachs an Riesensynapsen durch den Lichteinfluss ausgelöst wird und keinen altersabhängigen Prozess darstellt. Zudem verändert sich die Anzahl der neu gebildeten Riesensynapsen in Abhängigkeit von den spektralen Eigenschaften des Lichts, dem die Ameisen ausgesetzt sind. Zusammengefasst beschrieb ich in dieser Thesis Neuropeptide in C. floridanus und Cataglyphis und lieferte erste Evidenz, dass diese den Alterspolyethismus in Cataglyphis beeinflussen. Zudem zeigte ich, dass das Ausmaß in dem Neuropeptide und Lichtexposition Verhalten beeinflussen können, stadiumsspezifisch ist. Dies suggeriert, dass das System nur unter bestimmten Bedingungen auf externe Einflüsse reagiert. Diese Ergebnisse lieferten erste wichtige Einblicke in die neuronale Grundlage von Alterspolyethismus in Cataglyphis. Zudem charakterisierte ich erstmals das neuronale Substrat der Himmelskompassnavigation in Cataglyphis. Das hohe Maß an synaptischer Plastizität in dieser Sehbahn beim Übergang von Innenzu Außendienst, könnte besondere Relevanz für die initiale Kalibrierung des Kompasssystems haben. KW - Cataglyphis KW - Neuroethologie KW - Neuropeptide KW - Neuronale Plastizität KW - Soziale Insekten KW - Verhaltensplastizität KW - Himmelskompass KW - Riesensynapsen KW - Neuropeptidom KW - Neuromodulation KW - Arbeitsteilung Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142049 ER -