TY - THES A1 - Dünnes, Sarah T1 - Einfluss der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase auf den cGMP/cAMP-Crosstalk und die Steifigkeit der murinen Aorta T1 - Influence of NO-sensitive guanylyl-cyclase on cGMP/cAMP crosstalk and the stiffness of the murine aorta N2 - Die NO/cGMP-vermittelte Signalkaskade ist im vaskulären System entscheidend an der Regulation des Blutdrucks beteiligt. Innerhalb der Kaskade nimmt die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) eine Schlüsselfunktion als wichtigster Rezeptor für das Signalmolekül Stickstoffmonoxids (NO) ein. NO wird endogen von verschiedenen Isoformen der NO Synthase produziert. Die Bindung von NO an die NO GC führt zur Produktion des sekundären Botenstoffs cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP). Dieser Botenstoff aktiviert verschiedene Effektor-Moleküle und bewirkt letztlich eine Relaxation der glatten Muskulatur. Ein weiterer sekundärer Botenstoff, das Signalmolekül cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP), ist ebenfalls an der Regulation des Tonus der glatten Muskulatur und dadurch an der Blutdruckregulation beteiligt. Unterschiedliche Phosphodiesterasen (PDE) bauen die sekundären Botenstoffe ab und beenden dadurch die Signalkaskaden. Die PDE3 spielt hierbei eine besondere Rolle, da sie eine gemischte Substratspezifität besitzt. Um den Einfluss der NO-GC auf das kardiovaskuläre System zu untersuchen, wurden NO-GC Knockout(KO)-Mäuse mit globaler (GCKO) oder Glattmuskel-spezifischer (SMC-GCKO) Deletion der NO-GC generiert. Um das Zusammenspiel von cAMP und cGMP näher zu beleuchten, wurde im ersten Teil dieser Arbeit die PDE3 genauer untersucht. Im Gefäßsystem wird lediglich die PDE3A und nicht die PDE3B exprimiert. Die Aorten von GCKO- und SMC-GCKO-Tieren reagieren sensitiver auf PDE3A-Blockade als die Kontroll-Tiere. Auch die akute Blockade der NO-GC führt zu diesem Sensitivitätseffekt. Die PDE3A ist in Folge der NO-GC-Deletion sowohl in ihrer Expression, als auch ihrer Aktivität um die Hälfte reduziert. Dies dient vermutlich kompensatorisch dazu, das cAMP-Signal weitgehend zu erhalten und so eine cAMP-induzierte Relaxation der Gefäße zu gewährleisten. Ohne Rückkopplung zwischen den beiden Signalwegen käme es vermutlich zu weiteren negativen Konsequenzen für das Herz-Kreislaufsystem. Diese Daten weisen auf eine direkte Regulation der PDE3 in glatten Muskelzellen durch die NO/cGMP-Signalkaskade und einen PDE3-vermittelten cAMP/cGMP-Crosstalk hin. Der genaue Mechanismus dieser Expressionsregulation ist noch unklar. Denkbar wäre eine cGMP-vermittelte Transkriptionsregulation oder eine Modulation der Translation der PDE3A. Der Verlust der NO-GC führt in GCKO- und SMC-GCKO-Mäusen zu einem erhöhten systolischen Blutdruck von ~30 mmHg. Bei der Entwicklung der arteriellen Hypertonie könnte eine erhöhte Aortensteifigkeit beteiligt sein, die im zweiten Teil dieser Arbeit näher untersucht wurde. In GCKO-Mäusen ist die aortale Steifigkeit und daraus resultierend die Pulswellengeschwindigkeit (PWV) deutlich erhöht. Die Steigerung der PWV wird in den GCKO-Tieren zusätzlich durch den verminderten Aorten-Durchmesser bedingt. Außerdem weisen die Aorten dieser Tiere eine veränderte Wandstruktur auf, die zu einer Verminderung der aortalen Windkesselfunktion führt. Diese Veränderungen könnten die Blutdruckerhöhung in GCKO-Mäusen erklären. In SMC-GCKO-Tieren tritt keine dieser Gefäß-Modifikationen auf. Eine Aortensteifigkeit als mögliche Ursache für den erhöhten systolischen Blutdruck in den SMC-GCKO-Tieren kann somit ausgeschlossen werden. Zur Aufklärung müssen weitere Versuche zum Aufbau der Gefäßwände und zur Bestimmung des peripheren Widerstands gemacht werden. Auch der Einfluss anderer Zelltypen, wie z.B. Perizyten oder Fibroblasten, auf die Blutdruckregulation sollte untersucht werden. N2 - The NO/cGMP-mediated signaling cascade is crucially involved in the regulation of blood pressure. Within the cascade, NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) plays a key role as the most important receptor for the signaling molecule nitric oxide (NO). NO is endogenously produced by three different isoforms of NO synthase. Binding of NO to NO-GC stimulates the production of the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP). cGMP, in turn, activates various effector molecules, finally leading to smooth muscle relaxation. Another second messenger, the signalling molecule cyclic adenosine monophosphate (cAMP), also participates in the regulation of smooth muscle tone and is thus also involved in the regulation of blood pressure. Phosphodiesterases (PDE) degrade cyclic nucleotides thereby ending their signalling. In order to investigate the effect of NO-GC on the cardiovascular system, mice with global (GCKO) or smooth muscle-specific (SMC-GCKO) deletion of NO-GC have been generated. To shed light into the interplay of cAMP and cGMP, PDE3 was studied in the first part of this thesis. PDE3 plays a special role in cGMP/cAMP crosstalk based on its mixed substrate specificity. From the two PDE3 isoenzymes (PDE3A and PDE3B), only PDE3A is expressed in the aorta. The aortas of GCKO- and SMC-GCKO animals are more sensitive to PDE3A inhibition than those from control animals. The acute blockade of NO-GC using ODQ also leads to this sensitivity effect. As a result of NO-GC deletion, PDE3A expression and activity are reduced by approx. 50%. This is probably a compensatory response in order to maintain functional cAMP signalling and to guarantee cAMP-induced relaxation of blood vessels. These results indicate a direct regulation of PDE3A in smooth muscle cells by the NO/cGMP-signalling cascade and a PDE3-mediated cAMP/cGMP crosstalk. The exact mechanism how NO-GC/cGMP regulates PDE3A expression remains unclear; conceivable options are a cGMP-mediated regulation of transcription or a modulation of PDE3A translation. Loss of NO-GC in GCKO and SMC-GCKO mice leads to an elevated systolic blood pressure by around 30 mmHg. In the second part of this thesis, stiffness of aortae from these KO animals was examined. In GCKO mice, the pulse wave velocity (PWV) was significantly faster than in control animals indicating an increased aortic stiffness. The increase in PWV in GCKO animals is likely to be explained by a reduced aortic diameter. Even though elastin and collagen content were unchanged, the aortas of these animals have an altered wall structure. SMC-GCKO animals show neither an increase in PWV nor morphological changes of the aorta. Thus, an increased aortic stiffness can be excluded as cause for the elevated systolic blood pressure in GCKO animals. KW - Knock-Out KW - Maus KW - Guanylatcyclase KW - Cyclo-GMP KW - Aorta KW - Guanylyl-Cyclase KW - Cyclo-AMP KW - Stickstoffmonoxid KW - Phosphodiesterase 3 KW - Pulswellengeschwindigkeit Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141479 ER - TY - THES A1 - Gupta, Sanjay Kumar T1 - The human CCHC-type Zinc Finger Nucleic Acid Binding Protein (CNBP) binds to the G-rich elements in target mRNA coding sequences and promotes translation T1 - Das humane CCHC-Typ-Zinkfinger-Nukleinsäure-Binde-Protein (CNBP) bindet an G-reiche Elemente in der kodierenden Sequenz seiner Ziel-mRNAs und fördert deren Translation N2 - The genetic information encoded with in the genes are transcribed and translated to give rise to the functional proteins, which are building block of a cell. At first, it was thought that the regulation of gene expression particularly occurs at the level of transcription by various transcription factors. Recent discoveries have shown the vital role of gene regulation at the level of RNA also known as post-transcriptional gene regulation (PTGR). Apart from non-coding RNAs e.g. micro RNAs, various RNA binding proteins (RBPs) play essential role in PTGR. RBPs have been implicated in different stages of mRNA life cycle ranging from splicing, processing, transport, localization and decay. In last 20 years studies have shown the presence of hundreds of RBPs across eukaryotic systems many of which are widely conserved. Given the rising number of RBPs and their link to human diseases it is quite evident that RBPs have major role in cellular processes and their regulation. The current study is aimed to describe the so far unknown molecular mechanism of CCHC-type Zinc Finger Nucleic Acid Binding Protein (CNBP/ZNF9) function in vivo. CNBP is ubiquitously expressed across various human tissues and is a highly conserved RBP in eukaryotes. It is required for embryonic development in mammals and has been implicated in transcriptional as well as post-transcriptional gene regulation; however, its molecular function and direct target genes remain elusive. Here, we use multiple systems-wide approaches to identify CNBP targets and document the consequences of CNBP binding. We established CNBP as a cytoplasmic RNA-binding-protein and used Photoactivatable Ribonucleoside Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation (PAR-CLIP) to identify direct interactions of CNBP with 4178 mRNAs. CNBP preferentially bound a G-rich motif in the target mRNA coding sequences. Functional analyses, including ribosome profiling, RNA sequencing, and luciferase assays revealed the CNBP mode of action on target transcripts. CNBP binding was found to increase the translational efficiency of its target genes. We hypothesize that this is consistent with an RNA chaperone function of CNBP helping to resolve secondary structures, thus promoting translation. Altogether this study provides a novel mechanism of CNBP function in vivo and acts as a step-stone to study the individual CNBP targets that will bring us closer to understand the disease onset. N2 - Die in der DNA kodierte genetische Information wird transkribiert und translatiert, um funktionelle Proteine zu bilden, welche die Bausteine von Zellen sind. Lange Zeit wurde vermutet, dass die Regulation der Genexpression insbesondere auf dem Level der Transkription erfolgt. Kürzlich gemachte Entdeckungen haben jedoch die zentrale Rolle der Genregulation auf dem Level der RNA, auch bekannt als posttranskriptionelle Genregulation (PTGR), gezeigt. Neben nicht-kodierenden RNAs wie microRNAs, besitzen verschiedene RNA-Binde-Proteine (RBP) eine Schlüsselrolle in der PTGR. RBPs wurden mit diversen Ebenen des mRNA- Lebenszyklus, wie Speißen, Prozessieren, Transport, Lokalisation und Abbau in Verbindung gebracht. In den letzten 20 Jahren haben Studien die Existenz von Hunderten von RBPs in unterschiedlichen eukaryotischen Systemen gezeigt, von denen viele weithin konserviert sind. Bedenkt man die steigende Anzahl entdeckter und charakterisierter RBPs und ihren Bezug zu Krankheiten des Menschen, so ist es offensichtlich, dass RBPs eine große Rolle in der Regulation zellulärer Prozesse besitzen. Das Ziel der hier vorliegenden Studie bestand darin, die bis jetzt unbekannten molekularen Mechanismen der Funktion des CCHC-Typ-Zinkfinger-Nukleinsäure- Binde-Proteins (CNBP/ZNF9) in vivo zu beschreiben. CNBP ist in verschiedenen humanen Geweben ubiquitär exprimiert und ein hoch konserviertes RBP in Eukaryoten. Es ist für die embryonale Entwicklung in Säugetieren notwendig und wurde mit der transkriptionellen und posttranskriptionellen Genregulation in Verbindung gebracht. Seine molekulare Funktion sowie die unmittelbaren Zielgene blieben jedoch unklar. In dieser Studie verwendeten wir systemweit analysierende Methoden um CNPB-Zieltranskripte zu identifizieren und dokumentierten die Folgen der Bindung von CNBP an diese. Wir haben CNBP als ein zytoplasmatisches RNA-Binde-Protein charakterisiert und Quervernetzung und Immunpräzipitation mit photoaktivierbaren Ribonukleotiden (PAR-CLIP) angewendet. Dabei wurden direkte Interaktionen von CNBP mit 4178 mRNAs identifiziert. CNBP bindet bevorzugt an ein G-reiches Motiv in der kodierenden Sequenz der Ziel-mRNA. Funktionale Analysen, unter anderem Ribosom-Profil-Untersuchungen, RNA Sequenzierung und Luciferaseproben, zeigten die Art und Weise, wie CNBP auf die Zieltranskripte wirkt. Die Bindung von CNBP an seine Zieltranskripte erhöht deren Translationseffizienz. Wir vermuten, dass dies eine RNA-Chaperon- Funktion von CNBP darstellt, die hilft Sekundärstrukturen aufzulösen und die Translation zu fördern. Zusammengefasst liefert diese Studie einen neuen Mechanismus der Funktion von CNBP in vivo und kann als Startpunkt dienen um einzelne CNBP Ziele zu untersuchen. Dies wird uns helfen dem Verständnis der Krankheitsentstehung näher zu kommen. ... KW - CNBP KW - RNA binding potein CNBP Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142917 ER - TY - THES A1 - Garcia Guerrero, Estefania T1 - Strategies to Obtain Tumor-Reactive Cells for Cancer Immunotherapy by Cell Sorting and Genetic Modifications of T Lymphocytes T1 - Zellsortierung und genetische Modifikation von T-Lymphozyten zur Gewinnung tumorreaktiver Zellen für die Krebsimmuntherapie N2 - Recent advances in the field of cancer immunotherapy have enabled this therapeutic approach to enter the mainstream of modern cancer treatment. In particular, adoptive T cell therapy (ACT) is a potentially powerful immunotherapy approach that relies on the administration of tumor-specific T cells into the patient. There are several strategies to obtain tumor-reactive cytotoxic T lymphocytes (CTLs), which have already been shown to induce remarkable responses in the clinical setting. However, there are concerns and limitations regarding the conventional approaches to obtain tumor-reactive T cells, such as accuracy of the procedure and reproducibility. Therefore, we aimed to develop two approaches to improve the precision and efficacy of tumor-reactive T cells therapy. These two techniques could constitute effective, safe and broadly applicable alternatives to the conventional methods for obtaining tumor-specific CTLs. The first approach of this study is the so called “Doublet Technology”. Here, we demonstrate that peptide-human leukocyte antigen-T cell receptor (pHLA-TCR) interactions that involve immune reactive peptides are stable and strong. Therefore, the CTLs that are bound by their TCR to tumor cells can be selected and isolated through FACS-based cell sorting taking advantage of this stable interaction between the CTLs and the target cells. The CTLs from acute myeloid leukemia (AML) patients obtained with this technique show cytolytic activity against blast cells suggesting a potential clinical use of these CTLs. “Doublet Technology” offers a personalized therapy in which there is no need for a priori knowledge of the exact tumor antigen. The second approach of this study is the Chimeric Antigen Receptor (CAR) Technology. We design several CARs targeting the B-Cell Maturation Antigen (BCMA). BCMA CAR T cells show antigen-specific cytolytic activity, production of cytokines including IFN-γ and IL-2, as well as productive proliferation. Although we confirm the presence of soluble BCMA in serum of multiple myeloma (MM) patients, we demonstrate that the presence of soluble protein does not abrogate the efficacy of BCMA CAR T cells suggesting that BCMA CAR T cells can be used in the clinical setting to treat MM patients. The high antigen specificity of CAR T cells allows efficient tumor cell eradication and makes CAR Technology attractive for broadly applicable therapies. N2 - Durch jüngste Fortschritte auf dem Gebiet der Krebsimmuntherapie konnte dieser therapeutische Ansatz in der Mitte moderner Krebsbehandlungen ankommen. Insbesondere die adoptive T-Zelltherapie (ACT), die auf der Verabreichung tumorspezifischer T-Zellen an den Patienten beruht, stellt einen potentiell schlagkräftigen immuntherapeutischen Ansatz dar. Es existieren bereits verschiedene Strategien um tumorreaktive zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) herzustellen, von denen bereits gezeigt wurde, dass sie klinisch bemerkenswerte Antworten hervorrufen. Dennoch gibt es Bedenken und Grenzen bezüglich dieser konventionellen Ansätze zur Herstellung tumorreaktiver T-Zellen, wie zum Beispiel die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Verfahrens. Daher arbeiteten wir an der Entwicklung zweier Ansätze um die Präzision und Effizienz der tumorreaktiven T-Zelltherapie zu verbessern. Diese beiden Techniken könnten effektive, sichere und breit anwendbare Alternativen zu den konventionellen Methoden der tumorspezifischen CTL-Gewinnung darstellen. Der erste Ansatz dieser Studie wird als „Doublet Technology“ bezeichnet. Hierbei zeigen wir, dass die Interaktionen zwischen Peptid/MHC-Komplex und T-Zellrezeptor (pHLA-TCR), die immunreaktive Peptide involvieren, stabil und solide sind. Außerdem zeigen wir, dass CTLs, die über ihren TCR an Tumorzellen gebunden sind, selektioniert und durch FACS-basierte Zellsortierung isoliert werden können. Hierbei wird die Stabilität der Interaktion von CTLs und Zielzellen genutzt. Die CTLs von Patienten mit Akuter Myeloischer Leukämie (AML), die auf diese Weise gewonnen werden, zeigen zytolytische Aktivität gegenüber Blasten, was auf einen potentiellen klinischen Nutzen dieser CTLs hinweisen könnte. Die „Doublet Technology“ bietet eine personalisierte Therapie, die kein vorheriges Wissen über ein exaktes Tumorantigen erfordert. Der zweite Ansatz dieser Studie ist die Chimere Antigenrezeptor (CAR) Technologie. Wir entwickeln verschiedene CARs gegen das B-Zellmaturationsantigen (BCMA). BCMA-CAR T-Zellen zeigen antigenspezifische zytolytische Aktivität, Produktion der Zytokine IFN-γ und IL-2 sowie produktive Proliferation. Obwohl wir bestätigen, dass lösliches BCMA im Serum von Multiplen Myelompatienten zu finden ist, zeigen wir auch, dass dieses lösliche Protein nicht die Effizienz von BCMA-CAR T-Zellen beeinträchtigt und somit BCMA-CAR T-Zellen zur Behandlung von Multiplen Myelompatienten klinisch genutzt werden können. Die hohe Antigenspezifität der CAR-T-Zellen erlaubt eine effiziente Vernichtung von Tumorzellen und macht die CAR-Technologie attraktiv für breit einsetzbare Therapien. KW - Immunotherapy KW - Cancer KW - Strategies to Obtain Tumor-Reactive Cells Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150547 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Franziska T1 - Neuronal basis of temporal polyethism and sky-compass based navigation in \(Cataglyphis\) desert ants T1 - Die neuronale Grundlage von Alterspolyethismus und Himmelskompassnavigation in der Wüstenameise \(Cataglyphis\) N2 - Desert ants of the genus Cataglyphis (Formicinae) are widely distributed in arid areas of the palearctic ecozone. Their habitats range from relatively cluttered environments in the Mediterranean area to almost landmark free deserts. Due to their sophisticated navigational toolkit, mainly based on the sky-compass, they were studied extensively for the last 4 decades and are an exceptional model organism for navigation. Cataglyphis ants exhibit a temporal polyethism: interior workers stay inside the dark nest and serve as repletes for the first ∼2 weeks of their adult life (interior I). They then switch to nursing and nest maintenance (interior II) until they transition to become day-active outdoor foragers after ∼4 weeks. The latter switch in tasks involves a transition phase of ∼2-3 days during which the ants perform learning and orientation walks. Only after this last phase do the ants start to scavenge for food as foragers. In this present thesis I address two main questions using Cataglyphis desert ants as a model organism: 1. What are the underlying mechanisms of temporal polyethism? 2. What is the neuronal basis of sky-compass based navigation in Cataglyphis ants? Neuropeptides are important regulators of insect physiology and behavior and as such are promising candidates regarding the regulation of temporal polyethism in Cataglyphis ants. Neuropeptides are processed from large precursor proteins and undergo substantial post-translational modifications. Therefore, it is crucial to biochemically identify annotated peptides. As hardly any peptide data are available for ants and no relevant genomic data has been recorded for Cataglyphis, I started out to identify the neuropeptidome of adult Camponotus floridanus (Formicinae) workers (manuscript 1). This resulted in the first neuropeptidome described in an ant species – 39 neuropeptides out of 18 peptide families. Employing a targeted approach, I identified allatostatin A (AstA), allatotropin (AT), short neuropeptide F (sNPF) and tachykinin (TK) using mass spectrometry and immunohistology to investigate the distribution of AstA, AT and TK in the brain (manuscript 2). All three peptides are localized in the central complex, a brain center for sensory integration and high-order control of locomotion behavior. In addition, AstA and TK were also found in visual and olfactory input regions and in the mushroom bodies, the centers for learning and memory formation. Comparing the TK immunostaining in the brain of 1, 7 and 14 days old dark kept animals revealed that the distribution in the central complex changes, most prominently in the 14 day old group. In the Drosophila central complex TK modulates locomotor activity levels. I therefore hypothesize that TK is involved in the internal regulation of the interior I–interior II transition which occurs after ∼2 weeks of age. I designed a behavioral setup to test the effect of neuropeptides on the two traits: ’locomotor activity level’ and ’phototaxis’ (manuscript 3). The test showed that interior I ants are less active than interior II ants, which again are less active than foragers. Furthermore, interior ants are negatively phototactic compared to a higher frequency of positive phototaxis in foragers. Testing the influence of AstA and AT on the ants’ behavior revealed a stage-specific effect: while interior I behavior is not obviously influenced, foragers become positively phototactic and more active after AT injection and less active after AstA injection. I further tested the effect of light exposure on the two behavioral traits of interior workers and show that it rises locomotor activity and results in decreased negative phototaxis in interior ants. However, both interior stages are still more negatively phototactic than foragers and only the activity level of interior II ants is raised to the forager level. These results support the hypothesis that neuropeptides and light influence behavior in a stage-specific manner. The second objective of this thesis was to investigate the neuronal basis of skycompass navigation in Cataglyphis (manuscript 4). Anatomical localization of the sky-compass pathway revealed that its general organization is highly similar to other insect species. I further focused on giant synapses in the lateral complex, the last relay station before sky-compass information enters the central complex. A comparison of their numbers between newly eclosed ants and foragers discloses a rise in synapse numbers from indoor worker to forager, suggesting task-related synaptic plasticity in the sky-compass pathway. Subsequently I compared synapse numbers in light preexposed ants and in dark-kept, aged ants. This experiment showed that light as opposed to age is necessary and sufficient to trigger this rise in synapse number. The number of newly formed synapses further depends on the spectral properties of the light to which the ants were exposed to. Taken together, I described neuropeptides in C. floridanus and C. fortis, and provided first evidence that they influence temporal polyethism in Cataglyphis ants. I further showed that the extent to which neuropeptides and light can influence behavior depends on the animals’ state, suggesting that the system is only responsive under certain circumstances. These results provided first insight into the neuronal regulation of temporal polyethism in Cataglyphis. Furthermore, I characterized the neuronal substrate for sky-compass navigation for the first time in Cataglyphis. The high level of structural synaptic plasticity in this pathway linked to the interior–forager transition might be particularly relevant for the initial calibration of the ants’ compass system. N2 - Wüstenameisen der Gattung Cataglyphis sind weit verbreitet in ariden Gebieten der paläarktischen Ökozone. Die von ihnen bewohnten Habitate reichen von landmarkenreichen Arealen im Mittelmeerraum, zu beinahe landmarkenfreien Wüstengebieten. Aufgrund ihres hochentwickelten Navigationssystems, welches größtenteils auf dem Himmelskompass basiert, wurden sie in den letzten 4 Jahrzehnten extensiv studiert und sind ein einzigartiges Modellsystem für Navigation. Cataglyphis weisen einen alterskorrelierten Polyethismus auf: Innendienstler dienen als Speichertiere für die ersten ∼2 Wochen ihres adulten Lebens (Interior I). Sie gehen daraufhin zu Brutpflege und Nestbau (Interior II) über bis sie nach ∼4 Wochen zu tagaktiver Furagiertätitkeit außerhalb ihres Nestes wechseln. Dieser letzte Übergang dauert ∼2-3 Tage und wird von den Ameisen genutzt, um Lernund Orientierungsläufe durchzuführen. In der vorliegenden Arbeit befasse ich mich vor allem mit zwei Fragen, die ich mit Hilfe von Cataglyphis als Modellorganismus beantworten möchte: 1. Welches sind die zugrunde liegenden Mechanismen des Alterspolyethismus? 2. Was ist die neuronale Grundlage von Navigation, die auf dem Himmelskompass basiert? Neuropeptide sind bedeutende Regulatoren der Physiologie und des Verhaltens von Insekten und als solche vielversprechende Kandidaten im Hinblick auf die Regulation des Alterspolyethismus in Cataglyphis Ameisen. Neuropeptide werden aus größeren Vorläuferproteinen herausgeschnitten und posttranslational stark modifiziert. Daher ist es wichtig, annotierte Peptide auch biochemisch zu identifizieren. Da für Ameisen kaum Peptiddaten zur Verfügung stehen und es zudem keine relevanten genomischen Daten für Cataglyphis gibt, identifizierte ich zunächst das Neuropeptidom adulter Camponotus floridanus (Formicinae) Arbeiterinnen (Manuskript 1). Daraus resultierte das erste Neuropeptidom, das für eine Ameisenart beschrieben wird—39 Neuropeptide aus 18 Peptidfamilien. In einer weiteren Studie identifizierte ich gezielt die Neuropeptidfamilien Allatostatin A (AstA), Allatotropin (AT), das kurze Neuropeptid F (sNPF) und Tachykinin (TK) mittels Massenspektroskopie und untersuchte die Verteilung von AstA, AT und TK im Gehirn mit Hilfe der Immunhistologie (Manuskript 2). Alle drei Peptide sind im Zentralkomplex lokalisiert, dem Gehirnzentrum welches sensorische Eingänge integriert und in einer übergeordneten Rolle Lokomotorverhalten steuert. AstA und TK sind zudem in den visuellen und olfaktorischen Eingangsregionen, sowie den Pilzkörpern, den Zentren für Lernen und Gedächtnisbildung, zu finden. Ein Vergleich der TK-Immunfärbung im Gehirn von 1, 7 und 14 Tage alten im Dunkeln gehaltenen Tieren zeigt, dass sich die Verteilung im Zentralkomplex verändert— dies ist besonders prominent in der 14 Tage alten Gruppe. In Drosophila moduliert TK im Zentralkomplex Lokomotoraktivität. Basierend darauf stelle ich die Hypothese auf, dass TK in der internen Regulierung des Übergangs von Interior I zu Interior II involviert ist, welchen die Tiere im Alter von ∼2 Wochen durchlaufen. Für eine dritte Studie konstruierte ich ein Verhaltenssetup um den Einfluss von Neuropeptiden und Licht auf die beiden Verhaltensmerkmale ’Lokomotoraktivität’ und ’Phototaxis’ zu testen (Manuskript 3). Der Test zeigte, dass Interior I Ameisen weniger aktiv sind als Interior II Ameisen, welche wiederum weniger aktiv sind als Furageure. Zudem sind Interior Ameisen negativ phototaktisch, verglichen mit einer häufiger zu beobachtenden positiven Phototaxis bei Furageuren. Im Test zeigte sich auch, dass der Einfluss von AstA und AT stadiumsspezifisch ist: während das Verhalten von Interior I Tieren nicht offensichtlich beeinflusst wird, werden Furageure durch die Injektion von AT positiv phototaktisch, sowie aktiver und AstA-Injektion führt zu geminderter Lokomotoraktivität. Darüber hinaus testete ich den Lichteinfluss auf beide Verhaltensmerkmale in den Innendienststadien und zeige, dass er Lokomotoraktivität steigert und in einer geminderten negativen Phototaxis resultiert. Beide Innendienststadien sind jedoch weiterhin negativer phototaktisch als Furageure und nur die Lokomotoraktivtät von Interior II Ameisen wird auf das Niveau von Furageuren angehoben. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass Neuropeptide und Licht stadiumsspezifisch Verhalten beeinflussen. Der zweite Aspekt dieser Thesis war es, die neuronale Grundlage der Himmelskompassnavigation in Cataglyphis aufzuklären (Manuskript 4). Die neuroanatomische Lokalisation der Himmelskompasssehbahn zeigt, dass die allgemeine Organisation dieser neuronalen Bahn der bei bisher untersuchten anderen Insekten stark ähnelt. Ich habe mich daraufhin auf Riesensynapsen im lateralen Komplex konzentriert, der letzten Verschaltungsstation ehe die Himmelskompassinformation in den Zentralkomplex übertragen wird. Ein Vergleich zwischen der Synapsenzahl in frisch geschlüpfte Ameisen und erfahrenen Furageueren zeigte einen Anstieg der Synapsenzahl von Innendienst zu Furaguer, was aufgabenabhängige synaptische Plastizität in der Himmelskompasssehbahn suggeriert. In einem weiteren Versuch verglich ich die Riesensynapsenzahlen lichtexponierter Tiere und dunkel gehaltener, gealteter Tiere. Dieses Experiment zeigte, dass der Zuwachs an Riesensynapsen durch den Lichteinfluss ausgelöst wird und keinen altersabhängigen Prozess darstellt. Zudem verändert sich die Anzahl der neu gebildeten Riesensynapsen in Abhängigkeit von den spektralen Eigenschaften des Lichts, dem die Ameisen ausgesetzt sind. Zusammengefasst beschrieb ich in dieser Thesis Neuropeptide in C. floridanus und Cataglyphis und lieferte erste Evidenz, dass diese den Alterspolyethismus in Cataglyphis beeinflussen. Zudem zeigte ich, dass das Ausmaß in dem Neuropeptide und Lichtexposition Verhalten beeinflussen können, stadiumsspezifisch ist. Dies suggeriert, dass das System nur unter bestimmten Bedingungen auf externe Einflüsse reagiert. Diese Ergebnisse lieferten erste wichtige Einblicke in die neuronale Grundlage von Alterspolyethismus in Cataglyphis. Zudem charakterisierte ich erstmals das neuronale Substrat der Himmelskompassnavigation in Cataglyphis. Das hohe Maß an synaptischer Plastizität in dieser Sehbahn beim Übergang von Innenzu Außendienst, könnte besondere Relevanz für die initiale Kalibrierung des Kompasssystems haben. KW - Cataglyphis KW - Neuroethologie KW - Neuropeptide KW - Neuronale Plastizität KW - Soziale Insekten KW - Verhaltensplastizität KW - Himmelskompass KW - Riesensynapsen KW - Neuropeptidom KW - Neuromodulation KW - Arbeitsteilung Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142049 ER - TY - THES A1 - Haertle, Larissa T1 - Gestationsdiabetes und fetale Programmierung: Epigenetische Untersuchungen mit verschiedenen Next Generation Sequencing Techniken T1 - Gestational Diabetes Mellitus and fetal programming: Epigenetic investigations with different Next Generation Sequencing Techniques N2 - Eine intrauterine Gestationsdiabetes (GDM) Exposition induziert in den betroffenen Nachkommen eine lebenslang erhöhte Prädisposition für metabolische und komplexe Erkrankungen. Die Krankheitssuszeptibilität wird dabei durch epigenetische Veränderungen vermittelt, die sich über die Regulation der Genaktivität auch auf das Expressionsniveau und den Phänotypen auswirken. Um neue Gene zu finden, die eine Rolle in der fetalen Programmierung spielen, wurden in dieser Arbeit genomweite Methylierungsmuster von Nabelschnurbluten (FCBs) aus GDM-Schwangerschaften und Kontrollen miteinander verglichen. Mit Illumina Infinium HumanMethylation 450K Arrays konnten signifikante Gruppenunterschiede für insgesamt 65 CpG-Stellen (52 davon genassoziiert) festgestellt werden, die multiplem Testen standhielten. Mittels Pyrosequenzierung wurden vier dieser Kandidaten-Loci (ATP5A1, MFAP4, PRKCH, SLC17A4), sowie ein Gen aus der Literatur (HIF3A) genauer untersucht und die Effekte erfolgreich validiert. Für das zugrundeliegende multivariate Regressionsmodell wurden die potenziellen Störfaktoren Gestationsalter, kindliches Geschlecht und mütterlicher BMI berücksichtigt. Der GDM-Effekt zeigte sich stärker in der insulinbehandelten Subgruppe (I-GDM) als in der diätisch behandelten (D GDM) und scheint insgesamt multifaktoriell bedingt zu sein, da viele Gene betroffen waren, jedoch alle mit einer vergleichsweise niedrigen Effekt-Größe. Zusätzlich konnten für den MEG3 Promotor, MEST und PEG3, drei von vier geprägten Genen, die mittels Deep Bisulfite Sequencings (DBS) analysiert wurden, ebenfalls signifikante Methylierungs-unterschiede zwischen der GDM- und Kontroll-Gruppe detektiert werden. Die identifizierten Gene stellen labile Zielregionen für die GDM-induzierte intrauterine Programmierung dar und können zukünftig nützliche Biomarker für Krankheitsdiagnosen und Prognosen sein. Mittels DBS können darüber hinaus Einzelmolekül-Analysen durchgeführt werden, für die in differentiell methylierten Regionen (DMRs) anhand eines informativen SNPs die parentale Allel-Herkunft bestimmt und bei der Berechnung von Epimutationsraten einbezogen werden kann. Epimutationen wurde als solche gewertet, wenn sie ein > 50 % abnormal (de)methyliertes Methylierungsprofil aufwiesen. Die DBS-Daten wurden mit zwei verschiedenen Sequenzierplattformen generiert (Roche GS Junior und Illumina MiSeq). Für Zweitere wurde ein eigenes, unabhängiges Library-Präparations-Protokoll entwickelt. In Nabelschnurblut, adultem Blut und Viszeralfett wurden für die paternal exprimierte MEST Promotor DMR und die maternal exprimierte MEG3 intergenic (IG) DMR hohe Epimutationsraten für das jeweils unmethylierte Allel detektiert. Die geprägten (methylierten) Allele wiesen dagegen nur niedrige Epimutationsraten auf. Da MEST und MEG3 invers geprägte Gene sind, war die Hypermethylierung des nicht geprägten Allels (HNA) demnach unabhängig von der parentalen Allel-Herkunft. Die HNA scheint außerdem erst nach der Fertilisation aufzutreten, da in Spermien nur sehr wenige Epimutationen gefunden wurden. Für die sekundäre MEG3 Promotor DMR (deren Prägung von der primären MEG3 IG-DMR reguliert wird) wurde ein deutlich schwächerer, wenngleich signifikanter HNA-Effekt im FCB gemessen, für die paternal exprimierte PEG3 Promotor DMR konnte dagegen kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden parentalen Epimutationsraten festgestellt werden. Der HNA-Effekt für die MEST DMR, MEG3 IG-DMR und MEG3 Promotor DMR war weder mit GDM noch mit Adipositas assoziiert und zeigte allgemein eine große interindividuelle Varianz. Die Aufrechterhaltung differenzieller Methylierungsmuster in Imprinting Kontrollregionen (ICRs) scheint in manchen Entwicklungs-Zeitspannen von großer Bedeutung und damit streng kontrolliert zu sein, später jedoch redundant zu werden, was sich in der Anreicherung von stochastischen sowie umweltinduzierten Fehlern auf dem nicht geprägten Allel äußern kann. HNA-suszeptible geprägte Gene ähneln in mancherlei Hinsicht metastabilen Epiallelen. Diese Studie zeigt, dass sowohl stochastische Faktoren als auch Umweltstimuli während der frühen embryonalen Entwicklung u.a. über HNA-Effekte geprägte Gen-Netzwerke programmieren, die in Wachstumsprozesse involviert sind. Um tiefere Einblicke in allelspezifische Prägungsprofile zu erhalten, wären umfangreiche DBS HNA-Längsschnittstudien aller 50-100 human geprägten Gene in unterschiedlichen Gewebetypen und Differenzierungsstadien wünschenswert.   N2 - Intrauterine exposure to gestational diabetes mellitus (GDM) induces lifelong increased predisposition for metabolic and complex diseases in the exposed progeny. The elevated disease susceptibility is transmitted via epigenetic alterations that influence gene expression levels and phenotypes through regulation of gene activity. Genome-wide methylation profiles of fetal cord bloods (FCBs) were investigated in GDM and control pregnancies in order to identify new genes susceptible to fetal programming. After multiple testing correction, we found 65 significantly differentially methylated CpG sites between GDM and control groups (52 of which were gene associated) within the Illumina Infinium HumanMethylation 450K array data. Using pyrosequencing, we successfully confirmed the observed results in four of these candidate loci (ATP5A1, MFAP4, PRKCH, SLC17A4) and one gene from the literature (HIF3A). A multivariate regression model was adjusted for the confounding factors gestational age, fetal sex and maternal BMI. The GDM effect was stronger within the insulin treated subgroup (I-GDM) compared to the dietary subgroup (D GDM), suggesting that GDM is a multifactorial disease evidenced by changes of small effect size in multiple genes. Significant mean methylation differences were detected between the GDM group and controls in three out of four imprinted genes (MEG3 promoter, MEST and PEG3) that were analyzed with Deep Bisulfite Sequencing (DBS). The identified genes represent labile target regions for GDM-induced intrauterine programming and could represent future biomarkers for disease diagnosis and prognosis. Furthermore, DBS enables sequencing at a single allele resolution and the calculation of allele specific epimutation rates by differentiating the parental origin of alleles via an informative SNP within differentially methylated regions (DMRs). Epimutations were characterized as alleles showing > 50 % aberrantly (de)methylated CpG sites. DBS data were generated using two different sequencing platforms (Roche GS Junior and Illumina MiSeq). An independent library preparation protocol was established for Illumina MiSeq sequencing. The paternally expressed MEST promoter DMR and the maternally expressed MEG3 intergenic (IG) DMR showed high epimutation rates for the unmethylated alleles in FCB, as well as adult blood and visceral adipose tissue. On the contrary, only minor epimutation rates were displayed by the imprinted (methylated) alleles. Thus, hypermethylation of the non-imprinted allele (HNA) was independent of parental origin, as MEST and MEG3 are opposingly imprinted genes. Very low epimutation rates in sperm indicate that the HNA effect arises after fertilization. A weak but significant HNA was also found for the secondary MEG3 promoter DMR (which is known to be regulated by the MEG3 IG-DMR). The paternally expressed PEG3 promoter DMR showed no HNA and no difference in parental epimutation rates. The observed HNA effect (for the MEST DMR, the MEG3 IG-DMR and the MEG3 promoter DMR) was neither associated with GDM nor obesity and exhibited a large interindividual variance. Maintenance of differential methylation profiles in imprinting control regions (ICRs) seems to be of great importance during some developmental periods and is therefore strictly controlled in germ cells. Later on, it might become redundant manifested in the accumulation of stochastic as well as environmentally-induced errors on the non-imprinted allele. There is evidence that HNA-susceptible imprinted genes resemble metastable epialleles in many aspects. Therefore, we suggest that stochastic as well as environmental stimuli program imprinted gene networks that are important for growth related processes during early development using HNA. Further longitudinal studies of all 50 – 100 imprinted genes would benefit in a deeper insight in allele-specific imprinting patterns of various human tissues. KW - Schwangerschaftsdiabetes KW - Genetisches Imprinting KW - Epigenetik KW - Next Generation Sequencing (NGS) KW - Fetale Programmierung Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156465 ER - TY - THES A1 - Brendtke, Rico T1 - Entwicklungsaspekte eines Medizinproduktes zur Prävention und Überwachung von Hydrierungszuständen T1 - Development aspects of a microwave based hydration monitoring system N2 - Der demografische Wandel und das Populationswachstum stellen eine globale Herausforderung für die Gesundheitssysteme dar. Eine vielversprechende Lösungsstrategie liegt in der digitalen Überwachung, Prävention und Therapie akuter und chronischer Erkrankungen durch die Nutzung von innovativen Technologien aus dem Bereich der personalisierten Medizin. Die Digitalisierung in der Überwachung von Vitalparametern mittels Sensorik besitzt großes Potential für die längere Gesunderhaltung der Patienten und somit die Entlastung der Gesundheitssyteme im Ganzen. Da Wassermangel für eine Vielfalt von Krankheiten einen Katalysator darstellt, ist die Hydratation ein wichtiger aber bislang nur invasiv zugänglicher Vitalparameter. Zur Etablierung nicht invasiver Messungen des Wasserhaushaltes am Menschen wurde im Rahmen dieser Arbeit die Eignung der Mikrowellentechnologie untersucht. Dehydratation resultiert in der Veränderung des Osmolythaushaltes und beeinflusst biochemische Prozesse, was zur Entstehung von Morbidität führen kann. Im Rahmen der Arbeit werden Teilbereiche der Entwicklung eines Medizinproduktes abgebildet. Zu diesem Zweck wird die Machbarkeit der mikrowellenbasierten Analyse des Wasserhaushaltes in einer technischen Machbarkeitsstudie untersucht, um im zweiten Prozessschritt einen technischen Demonstrator in vitro und in vivo am Probanden erproben zu können. Hochfrequente elektromagnetische Wellen interagieren mit Molekülen, speziell Wasser. Enthält eine Probe freie Wassermoleküle, kann dies im reflektierten Signal detektiert werden. Zur Überprüfung des Sensorsystems in vitro dienen humane 3D-Vollhautmodelle mit spezifischer Hydratation und Gewebedichte der Matrixkomponenten als standardisiertes Modell zur Untersuchung definierter Exsikkoseszenarien und des Einflusses verschiedener Modellkomplexitäten. Die Eignungsüberprüfung des Systems mit einem technischen Demonstrator des künftigen Medizinproduktes belegt die Anwendbarkeit des Messsystems zur Erfassung des relativen Wassergehaltes. Die Technologie zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität bei der Destinktion von Proben mittels Frequenz- und Signalreflektionsdifferenzen aus. Neben den In-vitro-Testungen wird das entwickelte Sensorsystem aus regulatorischer Sicht zur klinischen Leistungsüberprüfung vorbereitet und im Rahmen eines bewilligten Ethikvotums in vivo erprobt. Die Ergebnisse belegen die Machbarkeit der nichtinvasiven Erfassung des Wasserhaushaltes durch mikrowellenbasierte Messungen. Die Technologie birgt das Potential, in ein körpernahes Sensorsystem integriert zu werden, welches als Medizinprodukt zur persönlichen Gesundheitsüberwachung zugelassen werden kann. N2 - The demographic change and the growth of mankind are challenging worldwide, especially for healthcare systems. One possible solution to keep humans healthier at all ages coeval fighting disease-related consequences is given by modern technologies for personalized disease treat-ment and digital health monitoring. The digitalization of the health care through new technological advance in personalized disease treatment and health monitoring using sensor-based technologies helps people to recover from illness or stay healthy, to monitor the health state of patients in need and to assist caregivers during their daily routine. This thesis aims to analyze microwave measurements as a technology to monitor the hydration status as a particularly important vital parameter, which can be catalyst for diverse secondary disorders. Wireless body area networks (WBANs) are used for individually tailored therapy of disease and preventive monitoring of health parameters. There are some already existing technologies but there is not yet a way to monitor non-invasively the entire health state and especially hydration as a particularly critical vital parameter. WBANs may help to pave the way for personalized med-icine, improve acute and preventive healthcare and support individual physical fitness. Tissue dehydration results in impaired biochemical processes, and can finally cause severe mor-bidity. The aim of this study was to demonstrate the feasibility of microwave measurements for the non-invasive analysis of the hydration status in vitro and in vivo and to develop a prototype of a medical device for this measurment. Moreover, accompanying regulatory aspects are con-sidered as a basis for an approval of the sensor technology as medical device. Electromagnetic waves at high frequencies interact with molecules, especially water. Thus, free water molecules can be detected via the reflected microwave signal. To develop the sensor system, human three-dimensional skin equivalents were instituted as a standardized test platform mimicking repro-ducible exsiccosis scenarios. Therefore, skin equivalents with a specific hydration and density of matrix components were generated and microwave measurements were performed. Hydration-specific spectra allowed deriving the hydration state of the skin models. A further advantage of the skin equivalents was the characterization of the impact of distinct skin components on the measured signals to investigate mechanisms of signal generation. Together with these in vitro results, the technology is investigated in vivo within initial testing scenarios on test subjects. The results demonstrate the feasibility of non-invasive microwave-based hydration measurements and thus the technologies potential to be integrated in a wearable medical device for personal digital health monitoring. KW - Medizinprodukt KW - Hautmodell KW - Mikrowellen Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157181 ER - TY - THES A1 - Balasubramanian, Srikkanth T1 - Novel anti-infectives against pathogenic bacteria T1 - Neue Anti-infectiva gegen pathogene Bakterien N2 - Marine sponge-associated actinomycetes are reservoirs of diverse natural products with novel biological activities. Their antibiotic potential has been well explored against a range of Gram positive and negative bacteria. However, not much is known about their anti-infective or anti-virulence potential against human pathogens. This Ph.D. project aimed to investigate the anti-infective (anti-Shiga toxin and anti-biofilm) potential of sponge-derived actinobacteria through identification and isolation of their bioactive metabolites produced and characterizing their mechanism of action by transcriptomics. This thesis is divided into three studies with the overall objective of exploring the anti-infective efficacy of actinomycetes-derived extracts and compound(s) that could possibly be used as future therapeutics. The first study deals with investigation on the anti-Shiga toxin effects of sponge-associated actinomycetes. Diarrheal infections pose a huge burden in several developing and developed countries. Diarrheal outbreaks caused by Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) could lead to life-threatening complications like gastroenteritis and haemolytic uremic syndrome (HUS) if left untreated. Shiga toxin (Stx) produced by EHEC is a major virulence factor that negatively affects the human cells, leading them to death via apoptosis. Antibiotics are not prescribed against EHEC infections since they may enhance the risk of development of HUS by inducing the production and release of Stx from disintegrating bacteria and thereby, worsening the complications. Therefore, an effective drug that blocks the Stx production without affecting the growth needs to be urgently developed. In this study, the inhibitory effects of 194 extracts and several compounds originating from a collection of marine sponge-derived actinomycetes were evaluated against the Stx production in EHEC strain EDL933 with the aid of Ridascreen® Verotoxin ELISA assay kit. It was found that treatment with the extracts did not lead to significant reduction in Stx production. However, strepthonium A isolated from the culture of Streptomyces sp. SBT345 (previously cultivated from the Mediterranean sponge Agelas oroides) reduced the Stx production (at 80 μM concentration) in EHEC strain EDL933 without affecting the bacterial growth. The structure of strepthonium A was resolved by spectroscopic analyses including 1D and 2D-NMR, as well as ESI-HRMS and ESI-HRMS2 experiments. This demonstrated the possible application of strepthonium A in restraining EHEC infections. VI In the second study, the effect of marine sponge-associated actinomycetes on biofilm formation of staphylococci was assessed. Medical devices such as contact lenses, metallic implants, catheters, pacemakers etc. are ideal ecological niches for formation of bacterial biofilms, which thereby lead to device-related infections. Bacteria in biofilms are multiple fold more tolerant to the host immune responses and conventional antibiotics, and hence are hard-to-treat. Here, the anti-biofilm potential of an organic extract derived from liquid fermentation of Streptomyces sp. SBT343 (previously cultivated from the Mediterranean sponge Petrosia ficiformis) was reported. Results obtained in vitro demonstrated its anti-biofilm (against staphylococci) and non-toxic nature (against mouse macrophage (J774.1), fibroblast (NIH/3T3) and human corneal epithelial cell lines). Interestingly, SBT343 extract could inhibit staphylococcal biofilm formation on polystyrene, glass and contact lens surfaces without affecting the bacterial growth. High Resolution Fourier Transform Mass Spectrometry (HR-MS) analysis indicated the complexity and the chemical diversity of components present in the extract. Preliminary physio-chemical characterization unmasked the heat stable and non-proteinaceous nature of the active component(s) in the extract. Finally, fractionation experiments revealed that the biological activity was due to synergistic effects of multiple components present in the extract. In the third study, anti-biofilm screening of 50 organic extracts generated from solid and liquid fermentation of 25 different previously characterized sponge-derived actinomycetes was carried out. This led to identification of the anti-biofilm organic extract derived from the solid culture of Streptomyces sp. SBT348 (previously cultivated from the Mediterranean sponge Petrosia ficiformis). Bioassay-guided fractionation was employed to identify the active fraction Fr 7 in the SBT348 crude extract. Further purification with semi-preparative HPLC led to isolation of the bioactive SKC1, SKC2, SKC3, SKC4 and SKC5 sub-fractions. The most active sub-fraction SKC3 was found to be a pure compound having BIC90 and MIC values of 3.95 μg/ml and 31.25 μg/ml against S. epidermidis RP62A. SKC3 had no apparent toxicity in vitro on cell lines and in vivo on the greater wax moth Galleria melonella larvae. SKC3 was stable to heat and enzymatic treatments indicating its non-proteinaceous nature. HR-MS analysis revealed the mass of SKC3 to be 1258.3 Da. Structure elucidation of SKC3 with the aid of 1D and 2D-NMR data is currently under investigation. Further, to obtain insights into the mode of action of SKC3 on S. epidermidis RP62A, RNA sequencing was done. Transcriptome data revealed that SKC3 was recognized by RP62A at 20 min and SKC3 negatively interfered with the central metabolism of staphylococci at 3 h. Taken VII together, these findings suggest that SKC3 could be a lead structure for development of new anti-staphylococcal drugs. Overall, the results obtained from this work underscore the anti-infective attributes of actinomycetes consortia associated with marine sponges, and their applications in natural product drug discovery programs. N2 - Meeresschwamm-assoziierte Actinomyceten stellen ein Reservoir für verschiedene natürliche Produkte mit neuartigen biologischen Aktivitäten dar. Ihr antibiotisches Potenzial gegenüber einer Reihe von Gram-negativen und -positiven Bakterien ist bereits intensiv erforscht worden. Wenig ist allerdings über ihre antiinfektive und antivirulente Wirksamkeit gegenüber menschlichen Pathogenen bekannt. Ziel dieser Doktorarbeit war es, die antiinfektiven Fähigkeiten (anti-Shiga-Toxin und anti-Biofilm) der aus Schwämmen isolierten Actinobakterien zu untersuchen. Hierfür wurden bioaktive Metabolite der Actinobakterien identifiziert und isoliert und abschließend wurde ihr Wirkmechanismus mit Hilfe einer Transkriptomanalyse charakterisiert. Diese Arbeit ist in drei Studien gegliedert, welche alle zum Ziel hatten die antiinfektive Wirksamkeit von aus Actinomyceten gewonnenen Extrakten und Komponente(n), welche möglicherweise als zukünftige Therapeutika dienen könnten, zu untersuchen. Die erste Studie befasst sich mit den anti-Shiga-Toxin Effekten der Meeresschwamm- assoziierten Actinomyceten. Durchfallinfektionen stellen in vielen Entwicklungsländern aber auch in Industrieländern eine große Gefahr dar. Durchfallerkrankungen die durch enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) hervorgerufen werden, können sich zu lebensbedrohlichen Komplikationen wie Gastroenteritis oder dem hämolytisch urenischen Syndrom (HUS) weiterentwickeln. Das von den EHEC Stämmen produzierte Shiga-Toxin (Stx) stellt hierbei den Haupt Virulenz Faktor dar, welcher die eukaryotische Proteinsynthese menschlicher Zellen negativ beeinflusst, was wiederum den Zelltod durch Apoptose zur Folge hat. Die Behandlung der EHEC-Patienten mit Antibiotika wird nicht empfohlen, da dies zu einem Anstieg von freigesetztem Stx der zersetzen Bakterien führen könnte, wodurch das Risiko für die Entwicklung des HUS ansteigt. Aus diesem Grund werden effektive Medikamente dringen benötigt, welche die Stx Produktion blockieren ohne das Wachstum der Bakterien zu beeinflussen. In dieser Studie wurden 194 Extrakte und einige isolierte Komponenten von aus Schwämmen gewonnenen Actinomyceten auf ihren negativen Einfluss auf die Stx Produktion des EHEC Stammes EDL933 mit der Hilfe des Ridascreen® Verotoxin ELISA Kits untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe der Extrakte keinen signifikanten Einfluss auf die Stx Produktion hatte. Strepthonium A auf der anderen Seite, welches aus Streptomyces sp. SBT345 isoliert wurde (vom mediterranen Schwamm Agelas oroides) konnte die Stx Produktion von EDL933 bei einer Konzentration von 80 µM reduzieren ohne das Wachstum des EHEC Stammes zu beeinflussen. Die Struktur von Strepthonium A wurde mittels spektroskopischer Analyse (1D- und 2D-NMR), sowie mittels ESI-HRMS und ESI-HRMS2 Experimenten entschlüsselt. Basierend auf diesen Ergebnissen könnte Strepthonium A eine mögliche Alternative oder Zusatz in der Behandlung einer EHEC Infektion darstellen. In der zweiten Studie wurde der Einfluss der Meeresschwamm-assoziierten Actinomyceten auf die Biofilmbildung von Staphylokokken bewertet. Medizinische Produkte wie Kontakt Linsen, metallische Implantate, Katheter, Herzschrittmacher, usw. stellen optimale ökologische Nischen für die Ausbildung von bakteriellen Biofilmen dar, wodurch Infektionen im Menschen hervorgerufen werden können. Bakterien in einem Biofilm sind deutlich toleranter gegenüber der Immunantwort ihres Wirtes sowie gegenüber konventionellen Antibiotika und sind daher schwer zu bekämpfen. In dieser Studie wurde das anti-Biofilm Potential eines organischen Extrakts der flüssigen Fermentation von Streptomyces sp. SBT343 (vom mediterranen Schwamm Petrosia ficiformis) ermittelt. In vitro Ergebnisse zeigten, dass das organische Extrakt anti-Biofilm (gegenüber Staphylococci) Fähigkeiten besitzt und nicht toxisch für Maus Makrophagen (J774.1), Fibroblasten (NIH/3T3) und humane korneale Epithelzellen ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass das SBT343 Extrakt die Ausbildung eines Biofilms von Staphylokokken auf den Oberflächen von Polystyrol, Glass und Kontaktlinsen unterbinden konnte ohne das bakterielle Wachstum zu beeinflussen. Die hochauflösende Fouriertransformation-Massenspektrometrie (HR-MS) Analyse konnte die Komplexität sowie die chemische Vielfalt an Komponenten im Extrakt aufzeigen. Eine vorläufige, physio-chemische Charakterisierung deutet darauf hin, dass die aktive Komponente im Extrakt hitzestabil und nicht proteinartiger Natur ist. Abschließend konnte durch Fraktionierungsexperimente gezeigt werden, dass die biologische Aktivität auf synergistischen Effekten mehrerer Komponenten im Extrakt beruht. In einer dritten Studie wurden 50 organische Extrakte, welche aus fester und flüssiger Fermentierung von 25 verschiedenen aus Meeresschwämmen isolierten Actinomyceten gewonnen wurden, auf anti-Biofilm-Aktivität untersucht. Hierbei wurde die anti-Biofilm Aktivität des organischen Extrakts der Festkultur von Streptomyces sp. SBT348 (vom mediterranen Schwamm Petrosia ficiformis) identifiziert. Eine Bioassay gestützte Fraktionierung führte zu der Identifikation der aktiven Fraktion Fr 7 im SBT348 Extrakt. Durch weitere Aufreinigung des Extrakts mit einer semipräparativen HPLC, konnten die bioaktiven Sub-Fraktionen SKC1, SKC2, SKC3, SKC4 und SKC5 isoliert werden. Die Sub- Fraktion SKC3 hatte den stärksten anti-Biofilm Effekt und bestand aus einer reinen Verbindung mit BIC90 und MIC Werten von 3,95 µg/ml und 31,25 µg/ml gegen S. epidermidis RP62A. SKC3 zeigte weder erkennbare Toxizität gegenüber Zelllinien in vitro noch gegenüber den Larven der großen Wachsmotte Galleria melonella in vivo. SKC3 war Hitze- und Enzym-resistent, was auf eine nicht proteinartige Natur hindeutet. Eine HR-MS Analyse ergab, dass die Masse von SKC3 1258,3 Da beträgt. Die Strukturanalyse von SKC3 durch 1D und 2D-NMR ist zurzeit in Bearbeitung. Um weiteres Verständnis über den anti-Biofilm Wirkmechanismus von SKC3 auf S. epidermidis RP62A zu erlangen, wurde eine RNA Sequenzierungsanalyse durchgeführt. Die Transkriptomanalyse zeigte, dass SKC3 von RP62A nach einer 20-minütigen Inkubationszeit erkannt wird und dass SKC3 den zentralen Metabolismus des Staphylokokken Stammes nach 3 h negativ beeinflusst. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass SKC3 als Leitstruktur für die Entwicklung neuer anti- Staphylokokken Medikamente dienen könnte. Zusammenfassend heben die Ergebnisse dieser Arbeit die antiinfektiven Eigenschaften der Meeresschwamm-assoziierte Actinomyceten hervor und bieten eine Möglichkeit für die Nutzung dieser in Wirkstoffentwicklungsprogrammen. KW - Marine sponges KW - Streptomyces KW - Staphylococci KW - Enterohemorrhagic Escherichia coli KW - Biofilm KW - Marine sponge-derived actinomycetes Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163882 ER - TY - THES A1 - Bury, Susanne T1 - Molekularbiologische Untersuchungen der antagonistischen Effekte des probiotischen \(Escherichia\) \(coli\) Stamms Nissle 1917 auf Shiga-Toxin produzierende \(Escherichia\) \(coli\) Stämme T1 - Molecular biological investigations on the antagonistic effects of the probiotic \(Escherichia\) \(coli\) strain Nissle 1917 towards Shiga toxin producing \(Escherichia\) \(coli\) N2 - Shiga toxin produzierende E. coli (STEC) stellen mit einer Infektionsdosis von gerade einmal 100 Bakterien ein großes Risiko für unsere Gesundheit dar. Betroffene Patienten können milde Krankheitssymptome wie wässrigen Durchfall aufweisen, welcher sich allerdings zu blutigem Durchfall oder dem hämolytisch urämischen Syndrom (HUS) weiterentwickeln kann. Die Ursache für das Krankheitsbild ist das zytotoxische Protein Shiga-Toxin (Stx), welches von STEC Stämmen produziert wird, eukaryotischen Zellen angreift und den apoptotischen Zelltod induziert. Es konnte gezeigt werden, dass infizierte Patienten in ihrem Krankheitsverlauf stark variieren, was unter anderem auf die Zusammensetzung ihrer Mikrobiota zurückzuführen sein könnte. Diesbezüglich können zum Beispiel einige Bakterien bereits die Darmbesiedlung von STEC Stämmen unterbinden, wohingegen andere die Toxin Produktion der pathogenen Stämme beeinflussen und wieder andere von den stx tragenden Phagen infiziert werden können und daraufhin selbst zu Toxin produzierenden Stämmen werden. Da die genetischen Informationen für das Toxin auf einem Prophagen im Genom der STEC Stämme kodiert ist, führt eine Antibiotika Behandlung von infizierten Patienten zwar zum Tod der Bakterien, hat allerdings auch einen Wechsel vom lysogenen zum lytischen Phagen Zyklus und damit einen enormen Anstieg an freigesetztem Stx zur Folge. In den letzten Jahrzehnten kam es immer wieder zu Epidemien mit STEC Stämmen, welche auch einige Todesopfer forderten. Die Behandlung von Patienten erfolgt auf Grund von mangelnden Behandlungsmöglichkeiten meist nur symptomatisch, weswegen neue Strategien für die Behandlung einer STEC Infektion dringend benötigt werden. Der probiotische E. coli Stamm Nissle 1917 (EcN) zählt bereits seit mehr als 100 Jahren als Medikament für Behandlungen von Darmentzündungen. In vitro und in vivo Studien mit dem probiotischen Stamm und STEC Stämmen konnten zeigen, dass EcN die Produktion von Stx unterdrückt und gleichzeitig die STEC Zellzahl reduziert. Diese Ergebnisse waren der Anlass für diese Studie in der die Auswirkungen von EcN auf STEC Stämme genauer untersucht wurden, um eine mögliche Behandlung von STEC Infektionen mit dem Probiotikum zu gewährleisten. Eines der Hauptziele dieser Studie war es, herauszufinden, ob EcN von stx-Phagen infiziert werden kann und damit selbst zu einem Toxin Produzenten wird. In diesem Falle wäre eine Behandlung mit dem E. coli Stamm ausgeschlossen, da es den Krankheitsverlauf verschlimmern könnte. Verschiedene experimentelle Ansätze in denen versucht wurde den YaeT stx-Phagen Rezeptor tragenden Stamm zu infizieren schlugen fehl. Weder mittels PCR Analysen, Phagen Plaque Assays oder der Phagen Anreicherung konnte eine Lyse oder eine Prophagen Integration nachgewiesen werden. Transkriptom Analysen konnten zeigen, dass Gene eines lambdoiden Prophagen in EcN in Anwesenheit von stx-Phagen stark reguliert sind. Auch andere E. coli Stämme, welche sich ebenfalls durch eine Resistenz gegenüber einer stx-Phagen Infektion auswiesen, wurden positiv auf lambdoide Prophagen untersucht. Einzig dem stx-Phagen sensitiven K-12 Stamm MG1655 fehlt ein kompletter lambdoider Prophage, weswegen die Vermutung nahe liegt, dass ein intakter lambdoider Prophage vor der Superinfektion mit stx-Phagen schützten kann. In weiteren Experimenten wurde der Einfluss der Mikrozin-negativen EcN Mutante SK22D auf STEC Stämme untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass SK22D nicht nur die Produktion des zytotoxischen Proteins unterdrückt, sondern auch mit der Produktion der stx-Phagen von allen getesteten STEC Stämmen interferiert (O157:H7, O26:H11, O145:H25, O103:H2, O111:H- und zwei O104:H4 Isolate vom STEC Ausbruch in Deutschland im Jahr 2011). Transwell Studien konnten zeigen, dass der Faktor, welcher die Transkription des Prophagen unterdrückt, von SK22D sekretiert wird. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die Präsenz von SK22D den lysogenen Zustand des Prophagen stützt und somit den lytischen Zyklus unterdrückt. Da stx-Phagen eine große Gefahr darstellen andere E. coli Stämme zu infizieren, haben wir uns in weiteren Studien dem Einfluss von EcN auf isolierte Phagen gewidmet. Die Kultivierungsexperimente von EcN mit Phagen zeigten, dass der probiotische Stamm in der Lage war die stx-Phagen in ihrer Effizienz der Lyse des K 12 Stammes MG1655 von~ 1e7 pfus/ml auf 0 pfus/ml nach einer 44 stündigen Inkubation zu inaktivieren. Diese Inaktivierung konnte auf die Aktivität eines hitzestabilen Proteins, welches in der stationären Wachstumsphase synthetisiert wird, zurückgeführt werden. Studien welche einen Anstieg der Biofilmmasse zur Folge hatten zeigten eine gesteigerte Effizienz in der Phagen Inaktivierung, weswegen Komponenten des Biofilms möglicherweise die Phagen Inaktivierung herbeiführen. Neben dem direkten Einfluss auf die Phagen wurde auch ein Schutzeffekt von SK22D gegenüber dem stx-Phagen empfänglichen K 12 Stämmen untersucht. Lysogene K 12 Stämme zeichneten sich durch eine enorme Stx und stx-Phagen Produktion aus. Die Präsenz von SK22D konnte den K 12 vermittelten Anstieg der pathogenen Faktoren unterbinden. Transwell Ergebnisse und Kinetik Studien lassen vermuten, dass SK22D eher die Phagen Infektion von K-12 Stämmen unterbindet als die Lyse von lysogenen K-12 Stämmen zu stören. Eine mögliche Erklärung für den Schutz der K-12 Stämme vor einer stx-Phagen Infektion könnte darin liegen, dass die K-12 Stämme innerhalb der SK22D Kultur wachsen und dadurch von den infektiösen Phagen abgeschirmt werden. Zusammenfassend konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass der probiotische Stamm EcN sowohl die Lyse von STEC Stämmen unterdrückt als auch die infektiösen stx-Phagen inaktiviert und sensitive E. coli Stämme vor der Phagen Infektion schützen kann. Diese Ergebnisse sollten als Grundlage für in vivo Studien herangezogen werden, um eine mögliche Behandlung von STEC infizierten Patienten mit dem Probiotikum zu gewährleisten. N2 - Shiga toxin producing E. coli strains (STEC) are a great concern to human health. Upon an infection with as few as 100 bacteria, humans can develop disease symptoms ranging from watery to bloody diarrhea or even develop the hemolytic uremic syndrome (HUS). The major factor contributing to the disease symptoms is Shiga toxin (Stx) which can bind to the eukaryotic cells in the intestine of the human and induce cell death via apoptosis. Based, among other things, on the microbiota composition, the impact of STEC can vary. Some bacteria of the microbiota can interfere with the colonization of STEC strains in the first place. Others cannot impair the colonization but interfere with the toxin production and there are still others which are even infected by stx encoding phages, being released from STEC strains. Those previously harmless bacteria subsequently contribute to the toxin increase and worsen the disease progression. Since the genetic information of Stx is encoded on a prophage, antibiotic treatment of patients can lead to an increased toxin and stx-phage release and is therefore not recommended. Several STEC epidemics in different countries, which even resulted in the death of some patients, demonstrated that there is an urgent need for alternative treatment strategies. The E. coli strain Nissle 1917 (EcN) has been used as a probiotic to treat gastrointestinal infections for more than 100 years. It harbors several fitness factors which contribute to the establishment of an intact intestinal barrier in the human gut. Moreover, studies with EcN unraveled that the probiotic E. coli can interfere with the colonization of STEC strains and their toxin production. This study aimed to investigate if EcN could be a possible alternative or supplementary treatment strategy for STEC infected patients, or a preventive treatment for the patient’s close contact persons. Therefore, EcN was firstly investigated for a possible stx-prophage integration into its’s genome which would eliminate it from being a potential treatment due to the possibility of disease worsening. Despite the presence of the stx-phage surface receptor YaeT, EcN demonstrated a complete resistance towards the lysis and the lysogeny by stx-phages, which was proven by PCR, phage-plaque assays and phage enrichment approaches. Transcriptome data could unravel that a lambdoid prophage in the genome of EcN is involved in the resistance towards the phage infection. Other commensal E. coli tested presented a stx-phage resistance as well and in silico analysis revealed that all of them harbor a complete lambdoid prophage besides the stx-phage susceptible K-12 strain MG1655. We assume that the resistance of EcN towards a stx-phage infection is connected to the presence of an intact lambdoid prophage which interferes with superinfection. Further experiments regarding the impact of the microcin negative EcN mutant SK22D towards STEC strains depicted that SK22D did not only interfere with the toxin production but also negatively regulated the transcription of the entire stx-prophage in coculture with all STEC strains tested (O157:H7, O26:H11, O145:H25, O103:H2, O111:H- and two O104:H4 isolates from the 2011 outbreak in Germany). This influence on the pathogenic factor production was evinced to be cell contact independent as SK22D could even interfere with the pathogenic factor production when being separated from the STEC strain EDL933 by a Transwell membrane with the pore size of 0.4 µm. From this data we concluded, that factor(s) released by SK22D interfere with the lysis of STEC strains by stabilizing the lysogenic state. Another positive aspect of EcN towards the pathogenicity of STEC strains was encountered when EcN was incubated with isolated stx-phages. The probiotic strain could reduce the infectivity of the phages towards a MG1655 lysis from ~ 1e7 pfus/ml to 0 after 44 h of incubation. Various approaches to determine the characteristics of the factor(s) of EcN which are involved in the phage inactivation depicted it to be a heat resistant stationary phase protein on the surface of EcN, which could be a component of its biofilm. Regarding the protective role of EcN we could further evince that SK22D was capable of interfering with the lysogenic K 12 mediated increase of Stx and stx phages. Lysogenic K-12 strains were characterized by a huge increase of Stx and stx-phage production. The presence of SK22D anyhow, could interfere with this K-12 mediated pathogenic factor increase. Transwell and stx phage infection kinetics led to the proposal that SK22D interfered with the stx-phage infection of K-12 strains in the first place rather than disturbing the lysis of lysogenic K 12. The protection from the phage infection could be due to the growth of K 12 strains within the SK22D culture, whereby the phage susceptible strains are masked from phage detection. Summarizing, this work could underline the beneficial attributes of EcN towards the STEC pathogenicity in vitro. These results should be considered as pioneers for future in vivo studies to enable EcN medication as a supportive STEC infection treatment strategy. KW - EHEC KW - Probiotikum KW - Bakteriophagen KW - E. coli Nissle 1917 KW - EHEC KW - Probiotikum KW - stx-Phagen KW - Lambdoide Prophagen KW - probiotica KW - stx-phages KW - lambdoid prophage Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163401 ER - TY - THES A1 - Oerter, Sabrina T1 - Expression von Natrium/Glukose-Cotransportern im menschlichen Gehirn bei Todesfällen durch Schädel-Hirn-Trauma und Todesfällen durch Ersticken T1 - Expression of sodium/glucose cotransporter in the human brain following death by traumatic brain inury and suffocation N2 - Glukosetransporter spielen eine wichtige Rolle in der Versorgung des Gehirns mit Nährstoffen und somit für den Erhalt der physiologischen Zellintegrität. Glukose wird über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) mittels spezifischen transmembranen Transportproteinen der SLC-Genfamilie (GLUT, SGLT) befördert. Dabei scheint während physiologischen Bedingungen hauptsächlich der Glukosetransporter GLUT1 (SLC2A1) für die Energieversorgung des Gehirns zuständig zu sein. Die Erforschung der SGLT-Expression ist in den letzten Jahren ein wichtiger Ansatzpunkt für neue Behandlungsstrategien vieler Erkrankungen, wie Diabetes Mellitus, maligne Neoplasien oder eines Herzinfarkts, geworden. Jedoch ist über deren Expression und Funktion im menschlichen Gehirn nur wenig bekannt. Besonders die Lokalisation entlang der BHS bleibt fraglich. Ein Großteil bisheriger Forschungsarbeiten beschäftigt sich hauptsächlich mit der Expressionsanalyse des Transporters SGLT1 im tierischen Gehirn in vivo (Poppe et al. 1997; Balen et al. 2008; Yu et al. 2013). Es konnte aufgezeigt werden, dass SGLT1 mRNA exklusiv in Neuronen und nicht an der BHS exprimiert wird. Dies wird durch in vitro Analysen einer humanen Hirnendothelzelllinie bestätigt. Demnach kann kein SGLT1 unter physiologischen Bedingungen nachgewiesen werden (Sajja et al. 2014). Im menschlichen Hirngewebe besitzen SGLTs somit keine zentrale Funktion für den Glukosetransport an der BHS. Im Gegensatz dazu konnte eine Expression von SGLT sowohl in vivo als auch in vitro während hypoglykämischen Bedingungen belegt werden (Vemula et al. 2009; Sajja et al. 2014). Die Expression der SGLT-Transporter während einer ischämischen Hypoglykämie führt zu der Annahme, dass diese Transporter für die Aufrechterhaltung der Energieversorgung des geschädigten Hirngewebes notwendig sind. Um die physiologischen Mechanismen nach einem Glukosemangel zu untersuchen, wurden SHT-Modelle etabliert (Salvador et al. 2013). In einem experimentellen Modell des Schädel-Hirn-Traumas im Rahmen eines DFG-gefördertes Projekts ist ein Expressionsverlauf von Glukosetransportern im Maushirn und in Hirnendothelzellen erarbeitet worden (Wais 2012; Salvador et al. 2015). Somit könnten SGLTs als Ansatzpunkt für den Nachweis der Überlebenszeit nach einem SHT fungieren. Die vorliegende Arbeit fokussiert sich auf die Expression der Natrium-abhängigen Glukosetransporter SGLT1 und SGLT2 im menschlichen Gehirn. Hierbei liegt das Hauptaugenmerk auf der Lokalisation dieser Transporter an der menschlichen BHS von post mortalem Hirngewebe. Weiterhin wird untersucht ob die Expressionsstärke von SGLT1 und SGLT2 eine Aussage über die Überlebenszeit von Verstorbenen nach einer traumatisch bedingten Hirnveränderung zulässt. Die Lokalisation von SGLT1 und SGLT2 an der menschlichen BHS konnte durch die Etablierung eines Protokolls zur Isolation von Hirnkapillaren erfolgen. Vorab wurden alle verwendeten Antikörper auf ihre Spezifität mittels siRNA Transfektion und Blockierung der Immunfluoreszenzsignale mittels immunisierten Peptids getestet. Somit ist die Spezifität der detektierten SGLT1- und SGLT2-Expression in menschlichen Hirnkapillaren gewährleistet. Anschließend wird untersucht, in welchen zeitlichem Verlauf nach einer traumatisch bedingten Hirnveränderung die verschiedenen Formen der Glukosetransporter exprimiert werden und ob ggf. der Umfang und die Verteilung von SGLT1, SGLT2 und GLUT1 sowie das Verhältnis zueinander Auskünfte über eine vitale bzw. postmortale Entstehung eines Traumas bzw. dessen Überlebenszeit zulässt. Hierfür wird ein Expressionsschema der Glukosetransporter generiert, abhängig von Todeszeitpunkt und Todesursache. Es konnte festgestellt werden, dass GLUT1 nicht als Target für die Ermittlung der Überlebenszeit nach einem Trauma geeignet ist. Dahingegen zeigen SGLT1 und SGLT2 eine signifikante Änderung der Expressionsstärke im contusionalen Gewebe in Abhängigkeit von der Überlebenszeit. Obwohl diese vorläufigen Daten einen neuen Ansatzpunkt für die forensische Fragestellung aufzeigen, müssen weitere Experimente mit einem erhöhten Umfang der Probenanzahl und kürzere Zeitspannen der Überlebenszeiträume durchgeführt werden. N2 - The transport of glucose across the endothelial cells of the human blood-brain barrier (hBBB) plays a major role for energy supply of the brain and therefor for neuronal integrity. Glucose enters the brain cells through specific transmembrane transporter proteins of the SLC-gene family (GLUT, SGLT). Under physiological conditions glucose uptake across the BBB seems to be mediated primarily by facilitated diffusion through glucose transporter 1 (GLUT1). Although SGLTs are a known drug target for diabetes and furthermore play a role in other disease like cancer and cardiac ischemia, active glucose transport by SGLTs is hardly observed and very little is known about their expression or activity in human brain. Especially the function along the BBB remains uncertain. Up to now, expression analysis focused on SGLT1 and has been confirmed in vivo by analyzing brain tissue of animals (Poppe et al. 1997; Balen et al. 2008; Yu et al. 2013). Here detection mainly occurs in neurons, no SGLT1 mRNA in capillaries of the BBB could be found. Similarly in vitro experiments with a human brain microvascular endothelial cell line reveals no expression of SGLT1 under physiological conditions (Sajja et al. 2014). In human brain, SGLT1 is hardly expressed and so far could not be found along the BBB. In contrast to these findings, expression of SGLT1 could be detected in vivo as well as in vitro under hypoglycemic conditions (Vemula et al. 2009; Sajja et al. 2014). The occurrence of these transporters during ischemic hypoglycemia could lead to the conclusion that the secondary active glucose transport by SGLTs is necessary for additional glucose supply in injured brain. To investigate if SGLTs are required for the reconstruction of energy supply after glucose deficiency, traumatic brain injury (TBI) models were established to study secondary physiological mechanisms along the BBB (Salvador et al. 2013). In an experimental CCI (controlled cortical impact) mouse model within a DFG-funded project, an expression pattern of glucose transporters in the mouse brain and in brain endothelial cells has been developed (Wais 2012; Salvador et al. 2015). Thus it could lead as a Target for evidence of the time of survival after TBI. This study focuses on the sodium-dependent glucose transporters SGLT1 and SGLT2 expression in human brain. The main topic is to localize the sodium-dependent glucose transporters along the human BBB of post mortem brain tissue and to examine whether SGLT expression allow a conclusion to be drawn about the survival time of a patient after TBI. First of all the localization of SGLT1 and SGLT2 at the human BBB could be shown by establishment a capillary isolation protocol of human post mortem brain tissue. Therefore the antibody specificity was tested by a siRNA transfection protocol and blocking the immunofluorescence signal with an immunized peptide. Thus, specific SGLT1 and SGLT2 expression at the endothelial lining of the capillary lumen could be demonstrated. After attaching the value of SGLTs at the human BBB, the relationship of the glucose transporter expression in TBI tissue according to the survival time of the patient is presented. Hereby it should be clarified whether the expression and distribution of the transporters GLUT1, SGLT1 and SGLT2 as well as the relation to each other provide information on a vital or post mortal development of a trauma or its survival time. It could determine that GLUT1 is not suitable as a target for the representation of survival time after TBI. However, SGLT1 and SGLT2 show a significant change in the expression profile of traumatic brain regions. Here an increase according to the survival time after trauma can be shown. Although these preliminary data suggest a novel target for forensic questions, more experiments with an increased scope of survival time frames should be carried out. KW - Sodium-Glucose Transporter 2 KW - Glucosetransportproteine KW - Natrium/Glukose Cotransporter KW - SGLT KW - Schädel-Hirn-Trauma KW - sodium-dependend glucose transporter KW - traumatic brain injury KW - Rechtsmedizin Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164093 ER - TY - THES A1 - Knies, Kerstin T1 - Neue Fanconi-Anämie-Gene als Wächter des Genoms T1 - New Fanconi anemia genes as guardians of the genome N2 - Fanconi Anämie (FA) gehört zu den seltenen Chromsomeninstabilitäts-Syndromen. Ursächlich für die Erkrankung sind biallelische Mutationen mit autosomal rezessiver Vererbung in einem der bisher bekannten 21 Genen (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U und –V). Eine Ausnahme stellen FANCB und FANCS dar, die X-chromosomal rezessiv bzw. mit einem dominant negativen Effekt vererbt werden. Die Genprodukte sind als Teil des FA/BRCA-DNA-Reparatur Netzwerks bei der Beseitigung von DNA-Interstrang-Quervernetzungen (ICL) involviert. ICLs führen zu einer Stagnation der Replikationsgabel und blockieren somit wichtige zelluläre Prozesse wie Replikation und Transkription, sodass eine Aufrechterhaltung der Genomstabilität nicht mehr gewährleistet ist. FA ist gekennzeichnet durch angeborene Fehlbildungen, fortschreitendes Knochenmarkversagen und eine erhöhte Prädisposition gegenüber Krebserkrankungen. Die Diagnose basiert auf phänotypischen Auffälligkeiten und wird auf zellulärer Ebene durch die Hypersensititvät gegenüber DNA-quervernetzenden Substanzen wie Mitomycin C (MMC) bestätigt. Da nicht jeder Patient einer bisher bekannten Komplementationsgruppe zugeordnet werden kann und herkömmliche molekulare Diagnostikverfahren mit der steigenden Anzahl an FA-Genen mühsam, zeitaufwändig und teuer geworden sind, war es nötig, neue molekulare Verfahren wie Whole Exome Sequencing (WES) zu etablieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Potential dieser Methode im Bezug auf die FA-Genotypisierung erforscht. Bei der Suche nach einer optimalen Anwendung des WES, untersuchten wir verschiedene Anreicherungs- und Sequenziertechniken. Dennoch führen Fehler in den Datenbanken sowie Pseudogene zu falschen Dateninterpretationen und –darstellungen und stellen somit eine Herausforderung dar. Trotzdem zeigen unserer Daten, dass WES eine wertvolle Methode in der Molekulardiagnostik von FA ist. Dies bestätigte sich durch die Zuordnung mehrerer, vorher unklassifizierter FA-Patienten zu den bekannten Komplementationsgruppen und der Ergänzung eines siebten Patienten zum Subtyp FA-P, im Rahmen von zwei Next Generation Sequencing (NGS) Publikationen. Außerdem wurden mit Hilfe von WES zwei neue FA-Gene (FANCQ und FANCW) im Rahmen dieser Arbeit gefunden, wobei XPF (FANCQ) das erste Gen überhaupt war, welches anhand von NGS detektiert wurde. ERCC4/XPF ist eine strukturspezifische Endonuklease, die durch ein Gen kodiert wird, welches bereits vorher mit den Krankheiten Xeroderma Pigmentosum (XP) und dem segmentalen XFE progeroid Syndrom in Verbindung gebracht wurde. Unsere Daten zeigen, dass abhängig von der Mutation in XPF, Patienten eine der drei unterschiedlichen Funktionsstörungen aufweisen. Dies hebt die multifunktionale Stellung der XPF Endonuklease im Rahmen der Genomstabilität und von humanen Erkrankungen hervor. Das zweite Gen, das während dieser Arbeit entdeckt wurde, ist die WD40-Domäne tragende E3 Ubiquitin Ligase RFWD3, die kürzlich mit DNA Reparatur und insbesondere HR verknüpft wurde. Wir konnten zeigen, dass eine RFWD3 Mutation in der WD40-Domäne bei einem FA-Patienten mit der genetischen Erkrankung Fanconi Anämie assoziiert ist. Die HR ist in RFWD3 (FANCW) mutierten Zellen gestört, was auf einer verminderten Relokalisation von mutiertem RFWD3 an das Chromatin und einer defekten Interaktion mit RPA beruht. Des Weiteren weisen Rfwd3 defiziente Mäuse typische Merkmale anderer FA-Mausmodelle auf, wie verminderte Fertilität, ovarielle und testikuläre Atrophie sowie eine reduzierte Lebenserwartung. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass neue molekulare Ansätze wie NGS ein wertvolles Hilfsmittel in der FA-Diagnostik sind um bisher unklassifizierte Patienten einer Komplementationsgruppe zuordnen zu können. Zudem konnten mit Hilfe dieser Technik zwei neue Gene identifiziert werden. Deren Charakterisierung trägt zu einer Vervollständigung und weiteren Aufklärung des FA/BRCA-DNA-Reparatur-Netzwerks bei. N2 - Fanconi anemia (FA) is a rare genomic instability syndrome. Biallelic mutations are disease causing in any one of at least 21 genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U and -V). All are inherited in an autosomal recessive way, except FANCB and FANCS, which are inherited in a X-chromosomal recessive and a dominant negative way, respectively. The gene products are involved in the FA/BRCA DNA damage response pathway to remove interstrand-crosslinks (ICL). ICLs cause stalled replication forks and hence block crucial cellular processes like replication and transcription resulting in decreased maintenance of genome stability. FA is characterized by congenital malformations, progressive bone marrow failure (BMF), and susceptibility to malignancies. Patients are diagnosed based upon phenotypical manifestations and the diagnosis of FA is confirmed by the hypersensitivity of cells to DNA interstrand crosslinking agents such as Mitomycin C (MMC). Since not every patient can be assigned to a complementation group and customary molecular diagnostics has become increasingly cumbersome, time-consuming and expensive the more FA genes have been identified new molecular approaches like Whole Exome Sequencing (WES) has been established. The potential of this method for FA genotyping has been investigated in the context of this thesis. By exploring different enrichment and sequencing techniques, we were able to identify the pathogenic mutations in each case using WES. However, database errors and pseudogenes pose challenges to interpret data correctly. Nevertheless our results show that WES is a valuable tool for molecular diagnosis of FA, since we were able to assign several previously unclassified FA patients to known complementation groups in the framework of two Next Generation Sequencing (NGS) studies. In addition WES revealed two new FA-genes, XPF and RFWD3. Extraordinarily, XPF (FANCQ) is the first gene to be detected with NGS. ERCC4/XPF is a structure specific nuclease - encoding a gene previously connected to xeroderma pigmentosum (XP) and segmental XFE progeroid syndrome. Depending on the type of ERCC4 mutation individuals present with one of the three clinically distinct disorders highlighting the multifunctional nature of the XPF endonuclease in genome stability and human disease. The second gene identified within this thesis is the WD40-containing E3 ubiquitin ligase RFWD3, which has been recently linked to the repair of DNA damage by Homologous Recombination (HR). Here, we show that an RFWD3 mutation within the WD40 domain of a patient with typical FA malformations is connected to the genetic disease Fanconi anemia (FA). Disordered HR is the result of depleted relocation of mutant RFWD3 to chromatin and defective physical interaction with RPA. In addition, Rfwd3 knockout mice show ovarian and testicular atrophy, a reduced life span and pups with sub-Mendelian birth ratios indicating embryonal-lethality. These features resemble other FA mouse models. In summary, this work showed that new molecular approaches like WES are valuable tools for FA diagnosis. Additionally, this method is a useful medium to assign FA patients to so far unknown complementation groups. Two novel genes have been identified and contribute to further completion of the FA/BRCA DNA repair network in the context of genome stability. KW - DNA Reparatur KW - Fanconi Anämie KW - Neue Fanconi Anämie Gene Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150669 ER -