TY - THES A1 - Dennstädt, Fabio Stefan T1 - Modulation CD4+ humaner Treg- und Tconv-Zellen durch Inhibition der sauren Sphingomyelinase in vitro T1 - Modulation of CD4+ human Treg and Tconv cells by inhibition of the acid sphingomyelinase in vitro N2 - Die saure Sphingomyelinase (ASM) stellt durch die Umwandlung von Sphingomyelin in Ceramid und Phosphorylcholin ein zentrales, fein reguliertes Enzym im Sphingolipidmetabolismus dar. Dadurch nimmt es Einfluss auf verschiedene zelluläre Mechanismen wie Signalvermittlung, Endo- und Exozytose und Zellaktivierung. Dementsprechend weitreichend ist auch die Bedeutung der ASM bei verschiedenen Krankheiten wie Arteriosklerose, Depression oder Neoplasien. Auch auf das Immunsystem, insbesondere auf die Signalvermittlung durch T-Zellen innerhalb des adaptiven Immunsystems, nimmt die saure Sphingomyelinase Einfluss. Aufbauend auf früheren Forschungsarbeiten zur pharmakologischen und genetischen Hemmung der ASM im Mausmodell untersuchten wir, welche Auswirkungen die Hemmung dieses Enzyms in humanen Zellkulturen auf die Population regulatorischer und konventioneller T-Zellen haben. Hierzu verwendeten wir die beiden selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Sertralin und Citalopram; zwei antidepressiv wirksame Medikamente, die durch eine Verdrängung der ASM von der lysosomalen Membran eine hemmende Wirkung ausüben. Wir konnten zeigen, dass diese beiden Substanzen sowohl in Maus-T-Zellen, als auch in humanen T-Zellen, in der Lage sind, die Aktivität der sauren Sphingomyelinase zu inhibieren. Durch Kultivierung von Immunzellen der Maus zusammen mit den Inhibitoren konnte darüber hinaus eine Erhöhung der Treg-Zellfrequenz erreicht werden. Verschiedene Zellkulturexperimente mit humanen PBMCs zeigten weiterhin, dass unter gewissen Umständen so auch eine Vermehrung regulatorischer T-Zellen im Menschen möglich ist, und dass dies mutmaßlich durch Einbindung der ASM im CD3/CD28-Signalweg bedingt ist. In mit AntiCD3-Antikörper stimulierten experimentellen Ansätzen kam es jedoch nur bei einzelnen Individuen, die als Responder identifiziert werden konnten, zu einer Treg-Zellvermehrung. Umgekehrt kam es durch externe Zugabe von C6-Ceramid zu einer Verringerung des Anteils an regulatorischen T-Zellen. Des Weiteren wurden verschiedene Veränderungen im Expressionsverhalten von Treg- und Tconv-Zellen bezüglich CD25, CD69 und CTLA-4 in Anwesenheit der ASMInhibitoren beobachtet. Weiterhin bestätigte sich, dass die pharmakologische Hemmung der sauren Sphingomyelinase auch Auswirkungen auf die Effektorfunktion von T-Zellen hat. Während die Proliferation der Zellen weitgehend unbeeinträchtigt blieb, kam es zu einer verringerten Sekretion der Zytokine IFN-gamma, TNF, IL-5 und IL-10. In ihrer Gesamtheit sprechen diese Ergebnisse dafür, dass Inhibitoren der sauren Sphingomyelinase begünstigend auf Krankheitsgeschehen mit überschießender oder dysregulierter Aktivität des Immunsystems einwirken könnten. Immunmodulatorischen Wirkungen durch Inhibition der ASM erklären möglicherweise auch Einflüsse auf das Immunsystem, die für verschiedene Antidepressiva beschrieben wurden. Insgesamt ist die Bedeutung der sauren Sphingomyelinase innerhalb der Regulation des adaptiven Immunsystems jedoch noch ein weitgehend ungeklärtes Thema mit vielen offenen Fragen. Daher ist auch in Zukunft weitere klinische und experimentelle Forschung erforderlich, um zu klären, welchen Einfluss dieses Enzyms auf Immunzellen hat und wie sich dieser auch klinisch anwenden lässt. N2 - By catalyzing the transformation of sphingomyeline into ceramide and phosphocholine, the acid sphingomyelinase (ASM) plays a central role in the metabolism of sphingolipids and is tightly regulated. Therefore it takes essential influence upon different cellular mechanisms like signal transduction, endo-/exocytosis and cell activation. Accordingly complex is the importance of the ASM in different diseases like atherosclerosis, depression or neoplastic diseases. The acid sphingomyelinase also greatly influences the signal mediation of T cells within the adaptive immune system. Based on previous research about the pharmacological and genetic inhibition of the ASM in mice we investigated, which impact an inhibition of this enzyme in human cell cultures may have on the populations of regulatory and conventional T cells. Therefore we mostly used the two selective serotonin reuptake inhibitors sertraline and citalopram. These two antidepressive drugs detach the ASM from the lysosomal membrane and thereby inhibit the enzyme. Here we show, that these two substances efficiently inhibit the ASM mice T cells as well as human T cells. Cultivating immune cells of mice together with the inhibitors led to an essential increase in the frequency of regulatory T cells. Various cell culture experiments with human PBMCs showed that under certain circumstances an increase in regulatory T cells is also possible in the human, most likely due to the involvement of the ASM in the CD3/CD28 signal pathway. Experimental approaches using � CD3-antibodies showed an increase in Treg cells in a fraction of the tested individuals. External addition of C6-ceramide led to a decrease in the frequency of regulatory T cells. In addition to that, we were able to observe diverse effects regarding the expression of CD25, CD69 and CTLA-4 in Treg and Tconv cells in the presence of the ASM-inhibitors. We were also able to confirm that the pharmacological inhibition of the acid sphingomyelinase has an impact on the effector functions of T cells. While there was no effect on cell proliferation, we observed a decreased secretion of the cytokines IFN-gamma, TNF, IL-5 and IL-10. Alltogether these results indicate that inhibitors of the acid sphingomyelinase might have positive effects in pathologies of overshooting or dysregulated activity of the immune system. Immunomodulatory effects after inhibition of the ASM might also explain observations of an influence of antidepressants on the immune system that have been described in the literature. Overall the importance of the acid sphingomyelinase within the regulation of the adaptive immune system is a new field of research with many open questions. Therefore further clinical and experimental research is needed to clarify, which impact this enzyme has on immune cells and how this impact might be used therapeutically. KW - T-Lymphozyt KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Serotonin-Reuptake-Hemmer KW - Sphingolipide KW - Sphingomyelinphosphodiesterase KW - Saure Sphingomyelinase KW - ASM-Inhibition KW - Regulatorische T-Zellen KW - Serotonin-Wiederaufnahmehemmer KW - Sphingolipidstoffwechsel KW - Ceramid KW - Sphingomyelin KW - Sertralin KW - Citalopram Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205420 ER - TY - THES A1 - Fichtner, Alina Suzann T1 - Alpaca, armadillo and cotton rat as new animal models for nonconventional T cells: Identification of cell populations and analysis of antigen receptors and ligands T1 - Alpaka, Gürteltier und Baumwollratte als neue Tiermodelle für nichtkonventionelle T-Zellen: Identifikation von Zellpopulationen und Analyse von Antigenrezeptoren und Liganden N2 - In this thesis, three species were investigated for the conservation of two non-conventional T cell systems, the CD1d/ iNKT cell system and the BTN3/ Vγ9Vδ2 T cell system. Non-conventional T cells are αβ or γδ T cells that do not fit into the classical mode of antigen recognition and adaptive responses. These T cells recognize antigens different from classical peptide antigens and are not restricted to the polymorphic MHC molecules but rather to non-polymorphic antigen-presenting molecules. The iNKT cell subset is restricted by the lipid antigen-presenting molecule CD1d and carries out immunomodulatory functions by rapid cytokine secretion. The molecular basis of this system, the semi-invariant iNKT TCR chains and CD1d were proven to be expressed and compared to homologs in human and rodents. Cotton rats possess multiple members of the AV14 and BV8 family and only one isoform of CD1d which is comparable to findings in the rat. Moreover, the reactivity of primary cells to glycolipid antigens could be shown, and an iNKT cell-like population was detected in primary cells using newly developed cotton rat CD1d oligomers. These were also applied to test the capacity of CD1d to present typical glycolipid antigens to iNKT TCR transductants. In addition, expression of cotton rat iNKT TCR α and β chains in TCR-negative cell lines was used to show successful pairing and detection of glycolipids in the context of CD1d. In summary, the conservation of a functional CD1d/iNKT cell system in the cotton rat could be shown, and tools were developed to study this cell subset in the course of infectious diseases. The Vγ9Vδ2 T cell subset is the major γδ T cell subset in human peripheral blood and has the unique ability to contribute to immune surveillance by detecting pyrophosphorylated metabolites of isoprenoid synthesis that indicate cell stress, transformation or infection. Up to this date, phosphoantigen-reactive γδ T cells have only been shown in primate species. However, evidence for the existence and functional conservation of the genes implied in the BTN3/Vγ9Vδ2 T cell system was found in several placental mammal species, and two candidate species were chosen for further investigation. The nine-banded armadillo, a valuable model for leprosy research, was shown to possess homologous genes to TRGV9, TRDV2 and BTN3. In this study, the expression of productive rearrangements of TRDV2 gene segments could be shown in peripheral blood samples, but no evidence was found for the expression of a functional TRGV9 rearrangement or BTN3 molecules. Moreover, determinants of phosphoantigen-reactive Vγ9Vδ2 T cells and functional BTN3 molecules were found to still be prevalent in armadillo genes. This makes the armadillo an interesting model to study the structural determinants that allow phosphoantigen recognition by a functional Vγ9Vδ2 T cell subset although this species is merely a witness for a functional system in a placental mammal ancestor. In contrast, alpacas were shown to express functional Vγ9Vδ2 T cells which conserved many features of the human counterpart. Expression of Vγ9Vδ2 pairings could be shown by single-cell PCR and functional phosphoantigenreactive pairings were observed. This phosphoantigen reactivity was also shown in PBMC cultures with a newly developed antibody specific for alpaca Vδ2Jδ4 chains. Moreover, a more detailed study of the alpaca TCR repertoire showed similarities to “γδ high” species like camelids and cattle which possess an extended family of TRDV genes. The γ and δ loci of alpaca TCR genes were drafted based on genomic information and cDNA studies and provide an overview for more detailed studies. Conservation of phosphoantigen recognition by the single BTN3 molecule of alpacas was shown in 293T knock out cell lines, and BTN3 detection on PBMCs was investigated with a newly developed alpaca BTN3-specific antibody. These findings prove the existence of a functional BTN3-dependent phosphoantigen-reactive Vγ9Vδ2 T cell subset and provide a basis for the future study of this cell system in a non-primate species. Moreover, as the first non-primate candidate species with the BTN3/Vγ9Vδ2 T cell system the alpaca is an important outgroup for research in this field. The use of a single BTN3 variant in contrast to three human isoforms that work together renders the alpaca a unique and to this date indispensable model for Vγ9Vδ2 T cells. In conclusion, this study provides an overview of the applicability of new animal models in the study of the non-conventional T cell subsets iNKT cells and Vγ9Vδ2 T cells and leads the way for a better understanding of structural and functional relationships. N2 - In dieser Arbeit wurden drei Spezies hinsichtlich ihrer Konservierung von unkonventionellen T-Zellen und ihren Interaktionspartnern, dem CD1d/iNKT-Zellsystem und dem BTN3/Vγ9Vδ2 T-Zellsystem, untersucht. Nicht-konventionelle T-Zellen sind αβ oder γδ T-Zellen, die nicht in das klassische Schema der adaptiven Immunantwort und Peptidantigenerkennung via MHC passen. Diese speziellen T-Zellen erkennen andere Antigene und unterliegen nicht der MHC-Restriktion, sondern interagieren mit meist nicht-polymorphen antigenpräsentierenden Molekülen. iNKT-Zellen erkennen Lipide, die von CD1d präsentiert werden, und führen immunmodulatorische Funktionen durch schnelle Zytokinproduktion aus. Charakteristisch ist die Expression einer semi-invarianten TCR α-Kette mit einer AV14/AJ18-Umlagerung in Mäusen und Ratten und der homologen Umlagerung AV24/AJ18 im Menschen. Diese α-Kette liegt gepaart mit bestimmten β-Ketten vor, die Diversität in der CDR3 Region aufweisen. Die Erforschung von iNKT-Zellen in der Baumwollratte, einem Modellorganismus für Infektionen mit humanen Viren, war bislang durch das Fehlen von genomischen Daten und Methoden eingeschränkt. Daher wurde die Konservierung von iNKT-Zellen und ihrem antigenpräsentierenden Molekül CD1d in der Baumwollratte untersucht. Die Expression der molekularen Bestandteile dieses Systems, die iNKT α-Kette, typische β-Ketten und CD1d, konnte bestätigt werden und mit den homologen Molekülen in Menschen und Nagern verglichen werden. Baumwollratten besitzen, vergleichbar mit Ratten, mehrere Mitglieder der AV14- und BV8-Familie und nur eine CD1d Variante. Zudem konnte die Reaktivität von primären Baumwollrattenzellen gegenüber typischen iNKT-Zell-Antigenen gezeigt werden und iNKT-Zellpopulationen in primären Zellen wurden mithilfe von CD1d-Multimeren gefärbt. Diese wurden auch zum Test der Funktionalität von CD1d herangezogen. Zusätzlich wurden iNKT TCR-Ketten in TCR-negativen Zelllinien exprimiert und so Paarung und Glykolipiderkennung gezeigt. Zusammenfassend konnte die Konservierung des CD1d/iNKT-Zellsystems in der Baumwollratte bewiesen werden Methoden entwickelt werden, die eine Erforschung der Bedeutung von iNKT-Zellen in Virusinfektionen in diesem Modellorganismus ermöglichen. Vγ9Vδ2 T-Zellen sind die Hauptpopulation von γδ T-Zellen im Blut des Menschen und haben die einzigartige Fähigkeit Metabolite des Isoprenoidstoffwechsels zu erkennen und dadurch zur Immunüberwachung beizutragen. Diese Moleküle sind ein Indiz für Zellstress, Transformation oder Infektionen. Bis jetzt wurden funktionelle Vγ9Vδ2 T-Zellen nur in Vertretern der Primaten gezeigt, die Gene dieses Systems sind allerdings in mehreren höheren Säugetieren konserviert. Zwei Kandidaten für ein funktionelles BTN3/Vγ9Vδ2 T-Zellsystem wurden in dieser Arbeit näher betrachtet. Das Neunbinden-Gürteltier ist ein Modellorganismus der Lepraforschung und die Konservierung von TRGV9, TRDV2 und BTN3 Homologen wurde in dieser Spezies gezeigt. Die Expression von produktiven TRDV2-Umlagerungen konnte im Blut dieser Tiere nachgewiesen werden, es wurde jedoch kein Hinweis auf die Expression von γ-Ketten mit TRGV9 Gensegmenten oder BTN3 Transkripten gefunden. Zusätzlich konnten charakteristische Merkmale von Phosphoantigen-reaktiven menschlichen Vγ9Vδ2 T-Zellen und BTN3 gefunden werden, die immer noch im Gürteltier angelegt sind. Dadurch bietet sich das Neunbinden-Gürteltier als Modell für die Erforschung von strukturellen Faktoren an, die Phosphoantigen-Erkennung durch funktionelle Vγ9Vδ2 T Zellen ermöglichen. Generell ist dieser Modellorganismus aber eher ein Zeuge für ein funktionelles BTN3/VγVδ2 T-Zellsystem in einem gemeinsamen Vorfahren. Im Gegensatz dazu wurden in Alpakas funktionelle Vγ9Vδ2 T-Zellen nachgewiesen, die viele Charakteristiken menschlicher phosphoantigen-reaktiver Vγ9Vδ2 T-Zellen, z.B. TRGJP Verwendung und CDR3 Längenrestriktion, aufweisen. Die Expression von Vγ9Vδ2 Paarungen im Alpaka konnte durch Einzelzell-PCR gezeigt werden und einige Paarungen waren in der Lage Phosphoantigene zu erkennen. Diese Reaktivität wurde, mithilfe von neu entwickelten Vδ2Jδ4-spezifischen Antikörpern, auch in PBMC Kulturen nachgewiesen. Weiterhin wurden Ähnlichkeiten des Alpakas mit „γδ high“ Spezies, z. B. Kamele und Rinder, durch eine erweiterte Untersuchung des TCR-Repertoires aufgezeigt. Schematische Darstellungen der TCR-γ und -δ Loci wurden basierend auf genomischen Daten und cDNA Analysen angefertigt und ermöglichen eine Übersicht für genauere Untersuchungen. Die Konservierung der Phosphoantigen-Bindung zu Alpaka BTN3 konnte durch Gen Knock-out Zelllinien bestätigt werden und die BTN3 Expression wurde mit neuen Alpaka BTN3-spezifischen Antikörpern untersucht. Diese Ergebnisse beweisen die Existenz einer BTN3-abhängigen Phosphoantigen-reaktiven Vγ9Vδ2 T-Zellpopulation im Alpaka und liefern eine Basis für zukünftige Studien dieses Systems. Weiterhin ist das Alpaka als erste nicht-Primaten Spezies eine wichtige Außengruppe für die Forschung in diesem Feld und ein bis jetzt einzigartiges und unersetzliches Modell für die Verwendung nur einer BTN3 Isoform in einem funktionellen BTN3/Vγ9Vδ2 T-Zellsystem. Abschließend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit eine Übersicht der Eignung von neuen Tiermodellen für die Untersuchung zweier nicht-konventioneller T-Zellpopulationen, der iNKT und Vγ9Vδ2 T-Zellen, geschaffen wurde. Dies ermöglicht weitere Untersuchungen zum besseren Verständnis von strukturellen und funktionellen Interaktionen. KW - T-Lymphozyt KW - Immunologie KW - Immunmodulation KW - Evolution KW - Non-conventional T cell KW - Vgamma9Vdelta2 T cell KW - Butyrophilin KW - Phosphoantigen KW - iNKT cell KW - CD1d KW - Glycolipid KW - T cell activation KW - Antigen recognition Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169108 ER - TY - THES A1 - Monjezi, Razieh T1 - Engineering of chimeric antigen receptor T cells with enhanced therapeutic index in cancer immunotherapy using non-viral gene transfer and genome editing T1 - Entwicklung chimärer Antigenrezeptor T-Zellen mit verbessertem Therapeutischen Index in der Krebsimmuntherapie durch die Verwendung von nicht-viralen Gentransfer und Genomeditierung N2 - The advances in genetic engineering have enabled us to confer T cells new desired functions or delete their specific undesired endogenous properties for improving their antitumor function. Due to their efficient gene delivery, viral vectors have been successfully used in T-cell engineering to provide gene transfer medicinal products for the treatment of human disease. One example is adoptive cell therapy with T cells that were genetically modified with gamma-retroviral and lentiviral (LV) delivery vectors to express a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) for cancer treatment. This therapeutic approach has shown remarkable results against B-cell malignancies in pilot clinical trials. Consequently, there is a strong desire to make CAR T cell therapy scalable and globally available to patients. However, there are persistent concerns and limitations with the use of viral vectors for CAR T cell generation with regard to safety, cost and scale of vector production. In order to address these concerns, we aimed to improve non-viral gene transfer and genome editing tools as an effective, safe and broadly applicable alternative to viral delivery methods for T-cell engineering. In the first part of the study, we engineered CAR T cells through non-viral Sleeping Beauty (SB) transposition of CAR genes from minimalistic DNA vectors called minicircles rather than conventional SB plasmids. This novel approach dramatically increased stable gene transfer rate and cell viability and resulted in higher yield of CAR+ T cells without the need of long ex vivo expansion to generate therapeutic doses of CAR+ T cells. Importantly, CD19-CAR T cells modified by MC-based SB transposition were equally effective as LV transduced CD19-CAR T cells in vitro and in a murine xenograft model (NSG/Raji-ffLuc), where a single administration of CD8+ and CD4+ CAR T cells led to complete eradication of lymphoma and memory formation of CAR T cells after lymphoma clearance. To characterize the biosafety profile of the CAR T cell products, we did the most comprehensive genomic insertion site analysis performed so far in T cells modified with SB. The data showed a close-to-random integration profile of the SB transposon with a higher number of insertions in genomic safe harbors compared to LV integrants. We developed a droplet digital PCR assay that enables rapid determination of CAR copy numbers for clinical applications. In the second part of the study, we ablated expression of PD-1, a checkpoint and negative regulator of T cell function to improve the therapeutic index of CAR T cells. This was accomplished using non-viral CRISPR/Cas9 via pre-assemble Cas9 protein and in vitro-transcribed sgRNA (Cas9 RNP). Finally, we combined our developed Cas9 RNP tool with CAR transposition from MC vectors into a single-step protocol and successfully generated PD-1 knockout CAR+ T cells. Based on the promising results achieved from antibody-mediated PD-1 blockade in the treatment of hematological and solid tumors, we are confident that PD-1 knockout CAR T cells enhance the potency of CAR T cell therapies for treatment of cancers without the side effects of antibody-based therapies. In conclusion, we provide a novel platform for virus-free genetic engineering of CAR T cells that can be broadly applied in T-cell cancer therapy. The high level of gene transfer rate and efficient genome editing, superior safety profile as well as ease-of-handling and production of non-viral MC vectors and Cas9 RNP position our developed non-viral strategies to become preferred approaches in advanced cellular and gene-therapy. N2 - Die Fortschritte des genetischen Engineerings erlauben uns, T-Zellen neue, erwünschte Funktionen zu verleihen oder ihnen bestimmte, unerwünschte endogenen Eigenschaften zu nehmen, um ihre Antitumorfunktion zu verbessern. Aufgrund ihrer Effizienz im Gentransport, werden virale Vektoren für das TZellengineering verwendet, um gentransferierte, medizinische Produkte zur Behandlung humaner Krankheiten herzustellen. Ein Beispiel hierfür ist die adoptive Zelltherapie mit T-Zellen, die mit gamma-retroviralen und lentiviralen (LV) Vektoren genetisch modifiziert wurden, so dass sie einen CD19-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren. In klinischen Pilotstudien zu B-Zellerkrankungen zeigte dieser therapeutische Ansatz bereits beachtliche Erfolge. Hieraus resultiert das Bestreben, die CAR-T-Zelltherapie für Patienten skalierbar und weltweit zugänglich zu machen. Aufgrund gesundheitlicher Risiken, finanzieller Kosten und dem Umfang der Vektorenproduktion bestehen jedoch anhaltende Bedenken und Grenzen bezüglich der Verwendung viraler Vektoren für die Herstellung von CAR-T-Zellen. Um diese Problematiken zu umgehen, beabsichtigten wir, den nicht-viralen Gentransfer sowie genomverändernde Techniken soweit zu verbessern, dass sie als eine effiziente, sichere und umfassend einsetzbare Alternative zum virusbasierten T-Zellengineering verwendet werden können. Im ersten Teil dieser Arbeit stellten wir durch die Sleeping Beauty (SB) Transposition von CAR-Genen auf minimalistischen DNA Vektoren (sogenannten Minicircles) CART-Zellen her. Die Minicircles wurden anstelle von konventionellen SB Plasmiden verwendet. Mithilfe dieser neuen Vorgehensweise wurden die Rate des stabilen Gentransfers sowie das Überleben der Zellen drastisch erhöht und führte zu einer gesteigerten Rate an CAR+ T-Zellen, ohne dass eine langwierige ex vivo Expansion zur Herstellung therapeutisch relevanter CAR-T-Zelldosen nötig wurde. CD19-CART-Zellen, die mit MC-basierter SB-Transposition modifiziert wurden, zeigten in vitro und in einem murinen Xenograftmodell (NSG/Raji-ffLuc) eine vergleichbar hohe Effizienz, wie LV-transduzierte CD19-CAR-T-Zellen. Hierbei genügte eine einzige Verabreichung von CD4+ und CD8+ CAR-T-Zellen für eine komplette Eliminierung des Lymphoms und der anschließenden Gedächtnisbildung von CAR-T-Zellen. Um die Biosicherheit der CAR-T-Zellprodukte zu charakterisieren, führten wir die bislang umfassendste vergleichende Analyse von Genominsertionsstellen nach SB-basierter Modifikation von T-Zellen durch. Im Vergleich zur LV Integration zeigten diese Daten ein beinahe zufälliges Integrationsmuster des SB Transposons mit höheren Integrationsraten in genomisch „sicheren Häfen“. Wir entwickelten eine Analyse basierend auf digitaler Tröpfchen-PCR, um eine rasche Ermittlung der Anzahl an CAR-Genkopien in klinischen Anwendungen zu ermöglichen. Im zweiten Teil der Arbeit verminderten wir die Expression von PD-1, einer Prüfstelle und negativen Regulator der T-Zellfunktion, um den therapeutischen Index der CART- Zellen zu verbessern. Dies wurde durch die Verwendung eines nicht-viralen CRISPR/Cas9, durch das Zusammensetzen von Cas9 Protein und in vitrotranskribierter sgRNA (Cas9 RNP), erzielt. Schließlich verwendeten wir unsere entwickelte Cas9 RNP-Technik in Kombination mit CAR-Transposition von MCVektoren, um PD-1-knock out, CAR-positive T-Zellen herzustellen. Da die antikörperbasierte PD-1-Blockade in der Behandlung hämatologischer und solider Tumore vielversprechende Ergebnisse zeigt, sind wir zuversichtlich, dass PD-1-knock out CAR-T-Zellen die Effizienz von CAR-T-Zelltherapien verschiedener Krebsarten verbessern können und dabei die Nebenwirkungen der antikörperbasierten Therapien umgehen. Wir zeigen in der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten mit virusfreien, gentechnischen Methoden CAR-T-Zellen herzustellen, die in der T-Zellkrebstherapie umfassend Anwendung finden können. Das hohe Level der Gentransferraten und der effizienten Genomeditierung, ein zu bevorzugendes Sicherheitsprofil sowie die einfache Handhabung und Produktion nichtviraler MC-Vektoren und Cas9 RNP machen es möglich, dass unser neuentwickelter, nichtviraler Ansatz zu einer bevorzugten Herangehensweise in der künftigen Zell- und Gentherapie werden kann. KW - Krebs KW - Cancer immunotherapy KW - Immuntherapie KW - T-Lymphozyt KW - Chimeric antigen receptor KW - T-cell therapy KW - T-cell engineering KW - Sleeping Beauty transposon KW - Non-viral genome engineering KW - Genome editing KW - CRISPR/Cas9 KW - Krebsimmuntherapie KW - nicht-viraler Gentransfer KW - Genomeditierung KW - Entwicklung chimärer Antigenrezeptor T-Zellen Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152521 ER - TY - THES A1 - Riaño, Rubén Felipe T1 - BTN3A1 in the immune response of Vγ9Vδ2 T cells T1 - BTN3A1 in der Immunantwort der Vγ9Vδ2 T Zellen N2 - Human Vγ9Vδ2 T cells are the main γδ T cell subset in the circulation, accounting for up to 5% of the total peripheral blood lymphocyte population. They have been suggested to be important in response to tumors and infections. Their immune mechanisms encompass cell killing via cytotoxicity and secretion of pro-inflammatory cytokines such as IFNγ and tumor necrosis factor (TNF). The main stimulators of Vγ9Vδ2 T cells are isopentenyl pyrophosphate (IPP) and (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), denominated phosphoantigens (PAg). A major advance in the understanding of PAg detection and Vγ9Vδ2 T cell activation has been the identification of the butyrophlin 3A (BTN3A) proteins as key mediators in these processes. In humans, three isoforms constitute the BTN3A family: BTN3A1, BTN3A2, and BTN3A3; and their genes are localized on the short arm of chromosome 6. The role of BTN3A1 has been highlighted by BTN3A-specific monoclonal antibody 20.1 (mAb 20.1), which has an agonist effect and causes proliferation, expansion, and activation of primary human Vγ9Vδ2 T cells. On the other hand, BTN3A-specific monoclonal antibody 103.2 (mAb 103.2) is antagonistic, inhibiting the Vγ9Vδ2 T cell response. The actual mechanism underlying both PAg- and mAb 20.1-mediated activation is not completely elucidated, but the importance of BTN3A1 is clear. The main objective of this dissertation was to characterize the role of BTN3A1 in the PAg-dependent and PAg-independent Vγ9Vδ2 T cell activation and to evaluate its contribution in the response to influeza A virus infected cells. This research work demonstrated, by using Vγ9Vδ2 TCR MOP-transduced murine cells (reporter cells), that human chromosome 6 (Chr6) is mandatory for PAg-induced stimulation, but not for stimulation with mAb 20.1. The reporter cells responded to mAb 20.1 in cultures with BTN3A1-transduced Chinese hamster ovary cells (CHO BTN3A1) as antigen presenting cells. Nevertheless, for PAg-dependent activation the presence of Chr6 in CHO BTN3A1 was mandatory. Although reporter cells expressing clonotypically different Vγ9Vδ2 TCRs showed similar PAg response, they clearly differed in the mAb 20.1 response. The reporter cell line transduced with Vγ9Vδ2 TCR D1C55 demonstrated essentially no response to mAb 20.1 compared to Vγ9Vδ2 TCR MOP cells. These findings were further supported by experiments performed with human PBMCs-derived Vγ9Vδ2 T cell clones. The results indicate heterogeneity in the PAg- and 20.1-dependent responses, in terms of CD25 and CD69 expression, among three different Vγ9Vδ2 T cells clones. Co-cultures of reporter cells with Raji RT1BI and PAg plus mAb 20.1 or single chain antibody 20.1 (sc 20.1) revealed no additive or synergistic activating effects. In contrast, mAb 20.1 or sc 20.1 inhibited the PAg-mediated activation of the reporter cells. The comparison of the relative contribution of the isoforms BTN3A2 and BTN3A3, in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, was undertaken by overexpression of these isoforms in CHO cells. The results showed that BTN3A2 contributes to both PAg- and mAb-induced Vγ9Vδ2 T cell activation. On the contrary, BTN3A3 does not support PAg-mediated γδ T cell response. Additionally, mutations in the proposed PAg- and mAb 20.1-binding sites of the extracellular BTN3A1 domain were generated by means of site-directed mutagenesis. These mutations revoked the mAb 20.1-induced Vγ9Vδ2 T cell activation, but not that induced by PAg. Finally, co-cultures of Vγ9Vδ2 TCR MOP-transduced murine reporter cells with influenza A/PR/8/34-infected cells, or infection of PBMCs with this virus strain indicated that BTN3A1 might be dispensable for the Vγ9Vδ2 T cell response against influenza A. The data of this research work points out that: i) in addition to BTN3A1, other Chr6-encoded genes are necessary for Vγ9Vδ2 T cell activation with PAg; ii) clonotypical (CDR3) differences influence the PAg- and mAb 20.1-mediated Vγ9Vδ2 T cell activation; iii) the PAg- and mAb 20.1-induced responses are not synergistic and interfere with each other; iv) BTN3A2 and BTN3A3 isoforms differ in the ability to support PAg- or mAb 20.1-dependent Vγ9Vδ2 T cell activation; v) the importance of the intracellular B30.2 domain of BTN3A1, in the Vγ9Vδ2 T cell activation, might be higher than that of the extracellular domain; and vi) in spite of the importance of BTN3A1 in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, it is possible that many molecules with redundant functions are involved in the elimination of influenza virus infection by these cells. In summary, it is possible to hypothesize a model in which BTN3A1 detects prenyl pyrophosphates in the cytoplasm via its B30.2 domain and in association with another protein(s). The binding of PAg to this domain induces a multimerization of BTN3A1 or a conformational change of its extracellular domain (mimicked by mAb 20.1). These modifications might be recognized by the Vγ9Vδ2 TCR or by an associated T cell protein. In the case that the TCR directly recognizes BTN3A1, the intensity of the response will depend on the Vγ9Vδ2 TCR clonotype. Future research will allow to gain a better understanding of BTN3A1, its interaction with other proteins, its actual role in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, and its importance in specific models of cancer or infection. This knowledge will be necessary to transform these cells into effective tools in the clinic. N2 - Im Menschen stellen Vγ9Vδ2 T Zellen die größte Subpopulation an γδ T Zellen im Blut dar und machen bis zu 5% der Gesamtpopulation peripherer Blutlymphozyten aus. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung von Tumoren und Infektionen. Ihre Immunantwort umfasst cytotoxische Aktivität sowie Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie IFNγ und dem Tumor Necrosis Faktor (TNF). Vγ9Vδ2 T Zellen werden am stärksten durch Isopentenylpyrophosphat (IPP) und (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphat (HMBPP) stimuliert, welche als Phosphoantigene (PAg) bezeichnet werden. Ein großer Schritt für das Verständnis der Phosphoantigenerkennung und Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung war die Identifzierung der Schlüsselrolle, die Butyrophilin 3A (BTN3A) Proteinen in diesen Prozessen zukommt. Im Menschen existieren drei Isoformen von BTN3A (BTN3A1, BTN3A2 und BTN3A3), deren Gene auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 lokalisiert sind. Die Rolle von BTN3A1 wurde durch den BTN3A spezifischen monoklonalen Antikörper 20.1 (mAk 20.1) besonders hervorgehoben, der eine agonistische Wirkung besitzt und Proliferation, Expansion, sowie Aktivierung primärer humaner Vγ9Vδ2 T Zellen hervorruft. Zudem existiert ein antagonistischer BTN3A spezifischer monoklonale Antikörper 103.2 (mAk 103.2), welcher Vγ9Vδ2 T Zellantworten inhibiert. Die der PAg- und mAk 20.1 vermittelten Aktivierung zugrunde liegenden Mechanismen wurden noch nicht vollständig aufgeklärt, die bedeutende Rolle von BTN3A1 in diesem Prozess ist jedoch eindeutig. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle von BTN3A1 in der PAg abhängigen sowie unabhängigen Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung zu charakterisieren und ihren Beitrag zu der Immunantwort gegen mit Influenza A Virus infizierte Zellen zu ermitteln. Durch die Nutzung Vγ9Vδ2 TCR MOP transduzierter muriner Zellen als Reporterzellen konnte gezeigt werden, dass das humane Chromosom 6 (Chr6) zwar für die PAg abhängige Stimulation, nicht jedoch für die Aktivierung durch mAk 20.1 zwingend notwendig ist. In Kultur mit BTN3A1 transduzierten “chinese hamster ovary” (CHO) Zellen antworteten die Reporterzellen auf mAk 20.1. Für eine PAg abhängige Aktivierung war jedoch zusätzlich die Anwesenheit des humanen Chr6 in CHO BTN3A1 Zellen Voraussetzung. Obwohl Reporterzellen, die Vγ9Vδ2 TCRs verschiedener Klonotypen exprimierten, ähnliche PAg Antworten zeigten, unterschieden sie sich in der mAk 20.1 Antwort klar. Die mit Vγ9Vδ2 TCR D1C55 transduzierten Reporterzellen zeigten im Vergleich zu Vγ9Vδ2 TCR MOP Zellen nahezu keine mAk 20.1 abhängige Antwort. Diese Befunde wurden auch durch Experimente gestützt, die mit humanen, aus PBMCs gewonnenen Vγ9Vδ2 T Zellklonen durchgeführt wurden. Deren Resultate weisen, bezüglich der CD25 und CD69 Expression, auf eine heterogene PAg- und 20.1 abhängige Antwort der drei unterschiedlichen Vγ9Vδ2 T Zellklone hin. Kokulturen von Reporterzellen mit Raji RT1BI und PAg plus mAk 20.1 oder dem Einzelkettenantikörper 20.1 (sc 20.1) zeigten keine additive oder synergistische aktivierende Wirkung, vielmehr wurde die PAg vermittelte Aktivierung der Reporterzellen durch mAk 20.1 oder sc 20.1 inhibiert. Mittels Überexpression der beiden Isoformen BTN3A2 und BTN3A3 in CHO Zellen, wurde deren jeweiliger Beitrag zur Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass BTN3A2 sowohl zu PAg als auch mAk induzierten Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung beiträgt. BTN3A3 hingegen unterstützt die PAg vermittelte γδ T Zellaktivierung nicht. Weiterhin wurden, mittels gerichteter Mutagenese, in den vorgeschlagenen PAg- und mAk 20.1 Bindungsstellen der extrazellulären BTN3A1 Domäne Mutationen generiert. Diese verhinderten die mAk 20.1-, jedoch nicht die PAg vermittelte Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung. Zuletzt zeigten Kokulturen von Vγ9Vδ2 TCR MOP transduzierten murinen Reporterzellen und Influenza A/PR/8/34 infizierten Zellen, sowie eine Infektion von PBMCs mit diesem Virusstamm, dass BTN3A1 für die Vγ9Vδ2 T Zellantwort gegen Influenza A entbehrlich sein könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass i) zusätzlich zu BTN3A1, andere auf Chr6 befindliche Gene für die PAg abhängige Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen nötig sind; ii) klonotypische (CDR3) Unterschiede die PAg und mAk 20.1 vermittelte Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung beeinflussen; iii) die PAg- and mAk 20.1 induzierten Antworten sich nicht verstärken, sondern beeinträchtigen; iv) sich die Isoformen BTN3A2 und BTN3A3 in der Fähigkeit, die PAg- oder mAk 20.1 abhängige Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung zu unterstützen, unterscheiden; v) die intrazelluläre B30.2 Domäne von BTN3A1 eine größere Bedeutung für die Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung haben könnte als die extrazelluläre; und dass vi) trotz der Bedeutung von BTN3A1 für die Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen, die Möglichkeit besteht, dass viele Moleküle mit redundanter Funktion bei der Eliminierung von Influenza Viren durch diese Zellen eine Rolle spielen. Zusammenfassend lässt sich als Hypothese ein mögliches Modell aufstellen, in dem BTN3A1 in Assoziation mit einem oder mehreren zusätzlichen Proteinen zytoplasmatische Prenylpyrophosphate mittels der B30.2 Domäne detektiert. Die Bindung der PAg an diese Domäne würde dann eine Multimerisierung von BTN3A1 oder eine Konformationsänderung der extrazellulären Domäne (wie auch durch mAk 20.1 herbeigeführt) induzieren. Diese Modifizierungen könnten vom Vγ9Vδ2 TCR oder von einem assoziierten T Zellprotein erkannt werden. Für den Fall einer direkten Erkennung von BTN3A1 durch den TCR würde der Grad der T Zellantwort vom Vγ9Vδ2 TCR Klonotyp abhängen. Zukünftige Forschung wird ein besseres Verständnis von BTN3A1, dessen Proteininteraktionen, dessen Rolle in der Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung, und dessen Bedeutung in spezifischen Krebs- oder Infektionsmodellen ermöglichen. Wissen, das benötigt wird, um diese Zellen effizient in klinischen Therapien einzusetzen. KW - gamma delta T cells KW - Vgamma9Vdelta2 T cells KW - phosphoantigen KW - HMBPP KW - IPP KW - butyrophilin 3A KW - human chromosome 6 KW - monoclonal antibody 20.1 KW - monoclonal antibody 103.2 KW - influenza A virus KW - T cell activation KW - T-Lymphozyt KW - Immunmodulation KW - In vitro Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142084 ER - TY - THES A1 - Bergfeld, Arne T1 - Das pH-regulierte Protein 1 (Pra1) von \(Candida\) \(albicans\) moduliert CD4\(^+\) T-Zell-Antworten der Maus in vitro durch direkte Bindung an die T-Zell-Oberfläche T1 - The pH-regulated protein 1 (Pra1) of \(Candida\) \(albicans\) modulates mouse CD4\(^+\) T cell responses in vitro by directly binding to the T cell surface N2 - Infektionen durch C. albicans auf den Schleimhäuten sind eine häufige Erkrankung bei Patienten mit einer Schwächung der T-Zellimmunität. Blutstrominfektionen mit der Hefe C. albicans (Candidämie) stellen, vor allem bei Patienten auf Intensivstationen, eine nach wie vor bedrohliche Komplikation mit hoher Letalität dar. Das pH-regulierte Antigen 1 (Pra1) ist ein Protein, das von C. albicans produziert wird, auf der Oberfläche des Pilzes gebunden vorkommt und auch vom Pilz in den Überstand sezerniert wird. Im humanen System bindet das Protein an T-Zellen an das Oberflächenprotein CD46. Es ist des Weiteren bekannt, dass das Pra1 an bestimmte Immunzellen der Maus (Monozyten und Phagozyten) binden kann. Eine Bindung an T-Zellen der Maus ist bisher nicht beschrieben. Eine genaue Charakterisierung der Interaktion von Pra1 mit Immunzellen der Maus ist interessant, da die Maus als biologischer Modellorganismus zur Erforschung der Infektion mit C. albicans dient. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Pra1 (rPra1) auch an Maus-CD4+ T-Zellen binden kann. Es wurden Einflussfaktoren auf die gefundene Bindung von Pra1 an CD4+ T- Zellen gesucht. Als ein Einflussfaktor wurde Zink identifiziert. Pra1 kann an freies Zink binden und durch Zugabe von ZnCl2 während der Inkubation von Pra1 mit T-Zellen kann das Signal von gebundenem Pra1 an CD4+ T-Zellen erhöht werden. Aspf2, ein Protein aus Aspergillus fumigatus mit großer Homologie zu Pra1, kann nicht an diese Zellen binden. Im in-vivo-Experiment mit Tieren, die mit C. albicans infiziert wurden, konnte kein wildtypisches sezerniertes Pra1 gebunden an T-Zellen nachgewiesen werden. Zellkulturüberstände von C. albicans zeigten nach Inkubation in vitro mit T-Zellen ein Signal für gebundenes Pra1 an CD4+ T-Zellen. Die Bindungskinetik von Pra1 an T-Zellen zeigte eine über die Zeit der Inkubation konstante Zunahme des Signals von zellgebundenem rPra1 an CD4+ T-Zellen. In der off-Kinetik fand sich eine Abnahme des Signals über die Zeit bis an die Grenze der Nachweisbarkeit. Der Bindungspartner von Pra1 auf T-Zellen konnte nicht identifiziert werden. Die strukturell und funktionell verwandten Oberflächenproteine Crry, CD59a und CD55 wurden auf Bindungsfähigkeit an T-Zellen in entsprechenden Knockout- Mäusen getestet, konnten jedoch als Rezeptor für Pra1 ausgeschlossen werden. Durch die Bindung von sezerniertem Pra1 an neutrophile Granulozyten wird die Fähigkeit dieser Zellen zur Phagozytose eingeschränkt. Die Bindung von Pra1 an CD4+ T-Zellen führt zur Kostimulation der T-Zellen, also zur verstärkten Zellaktivierung und Proliferation. Durch die Zugabe von 10 μM Zinkchlorid wird die kostimulatorische Aktivität von Pra1 verstärkt. Während der Zellaktivierung von Effektor-Memory-CD4+ T-Zellen reduziert rPra1 die Sekretion von IFN-γ. Diese Reduktion von IFN-γ-produzierenden Zellen entsteht nicht durch einen Einfluss von Pra1 während der Zellaktivierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen und auch nicht durch die Auslösung von Apoptose in IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen. Die Bindung von Pra1 an CD4+- T-Zellen, die über den T-Zell-Rezeptor aktiviert werden, reduziert in vitro die Sekretion des Zytokins. Zusätzlich werden weitere Zytokine in ihrer sezernierten Menge reduziert wie IL-2 und TNF-α. N2 - Infections caused by C. albicans on mucosal surfaces are a common disease in patients suffering from suppression of the T cell immune defense. Blood stream infections by the yeast C. albicans (candedemia) represent still a severe complication in patients in intensive care units with high rates of lethality. The pH-regulated antigen 1 (Pra1) is a protein produced by C. albicans which is present on the surface of the fungi and is secreted into the supernatant of fungal cultures as well. Pra1 can bind to human T cells via the surface protein CD46. It is known, that this protein can also bind to certain immune cells of mice (monocytes and phagocytes). Binding to T cells of mice is not yet known. A characterization of the interaction of Pra1 with immune cells of mice would be valuable, because mice act as a biological model system for the investigation of infections with C. albicans. In this paper, it could be shown that recombinant Pra1 (rPra1) can bind to mouse CD4+ T cells as well. After the finding that rPra1 can bind to CD4+ T cells, different parameters determining this binding have been studied. Zinc was found to be one influencing factor on the binding. Pra1 can bind free zinc ions and by the addition of ZnCl2 while incubating T cells with Pra1 the signal of bound Pra1 to CD4+ T cells could be increased. Aspf2, a protein from Aspergillus fumigatus with high homology to Pra1, was not able to bind to these cells. In in-vivo-experiments with animals infected with C. albicans, no wild-typic secreted Pra1 was found bound to T cells. Supernatant from C. albicans cultures produced, after incubation in vitro, a signal for cell-bound Pra1 on CD4+ T cells. Kinetics of the binding of rPra1 to T cells showed a constant increase of signal over the time of incubation. The off-kinetics revealed a decrease of cell-bound rPra1 over time to the edge of detectability. The receptor of Pra1 on T cells has not been identified yet. The structurally and functionally comparable surface proteins Crry, CD59a and CD55 were tested in knockout mice for each of these proteins and could be excluded as possible receptors. After binding of secreted Pra1 to neutrophilic granulocytes these cells experience a decreased capacity to phagocytose pathogens. The binding of Pra1 to CD4+ T cells leads to a costimulation of T cells, which results in increased cell activation and proliferation. This costimulatory capacity of Pra1 can be augmented by adding 10 μM zinc chloride. During activation of naïve CD4+ T cells Pra1 reduces the secretion of IFN-γ. The reduction of IFN-γ-producing cells is not due to an influence of Pra1 during cell activation of naive CD4+ T cells to Th1 cells and is also not due to induction of apoptosis in IFN-γ-producing Th1 cells. The binding of Pra1 to ex-vivo isolated CD4+ T cells reduces the in vitro secretion of IFN-γ after stimulating these cells via their T cell receptor. Additionally, the secretion of IL-2 and TNF-α was reduced. KW - Candida albicans KW - T-Lymphozyt KW - Interferon KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Interleukin 2 KW - C. albicans KW - CD4+ KW - T-Zelle KW - IFN-g KW - Pra1 Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169716 ER - TY - THES A1 - Pletinckx, Katrien T1 - Dendritic cell maturation and instruction of CD4+ T cell tolerance in vitro T1 - Reifung der dendritischen Zelle und Instruktion der CD4+ T Zell Toleranz in vitro N2 - Effective T cell immunity was believed to occur by mature DC, whereas tolerogenicity was attributed strictly to immature DC phenotypes. However, intermediate DC maturation stages were identified conditioned by inflammatory mediators like TNF. Furthermore, the T cell tolerance mechanisms are dependent on distinct modes and intensities of co-stimulation. Therefore, in this study it was addressed how distinct DC maturation signatures instruct CD4+ T cell tolerance mechanisms. DC acquire antigens from apoptotic cells for self-peptide-MHC presentation and functionally adapt presumed tolerogenic DC phenotypes. Here, immature murine bone-marrow derived DC representing both inflammatory and conventional DC subsets adapted a maturationresistant DC signature upon apoptotic cell recognition but no additional tolerogenic features. Immature DC instruct CD4+ FoxP3+ regulatory T cells in a TGF-β prone micro-environment or generate anergic CD4+ T cells hampered in the TCR-induced proliferation and IL-2 secretion. Secondary stimulation of such anergic CD4+ T cells by immature DC increased primarily IL-10 production and conferred regulatory function. These IL-10+ regulatory T cells expressed high levels of CTLA-4, which is potently induced by immature DC in particular. Data in this work showed that anergic T cells can be re-programmed to become IL-10+ regulatory T cells upon ligation of CTLA-4 and CD28 signalling cascades by B7 costimulatory ligands on immature DC. In contrast, semi-mature DC phenotypes conditioned by the inflammatory mediator TNF prevented autoimmune disorders by induction of IL-10+ Th2 responses as demonstrated previously. Here, it was shown that TNF as an endogenous maturation stimulus and pathogenic Trypanosoma brucei variant-specific surface glycoproteins (VSG) induced highly similar DC gene expression signatures which instructed default effector Th2 responses. Repetitive administration of the differentially conditioned semi-mature DC effectively skewed T cell immunity to IL-10+ Th2 cells, mediating immune deviation and suppression. Collectively, the data presented in this work provide novel insights how immature and partially mature DC phenotypes generate T cell tolerance mechanisms in vitro, which has important implications for the design of effective DC-targeted vaccines. Unravelling the DC maturation signatures is central to the long-standing quest to break tolerance mimicked by malignant tumours or re-establish immune homeostasis in allergic or autoimmune disorders. N2 - Reife DC sind potente Induktoren von T Zell Immunität, wogegen unreife DC Stadien zur Induktion von Immuntoleranz befähigt sind. Zudem sind intermediäre semireife DC Entwicklungsstadien identifiziert worden, wie sie nach Behandlung mit inflammatorischen TNF entstehen. Die bekannten T Zell Toleranzmechanismen sind wiederum abhängig von unterschiedlicher Art und Intensität von Kostimulation. Hier wurde deshalb untersucht wie verschiedene DC Reifungsstadien CD4+ T Zelltoleranz induzieren können. DC nehmen apoptotisches Zellmaterial auf, was als Antigenquelle zur Präsentation von MHC/Selbstpeptid-Komplexen genutzt wird und tolerogene Funktionen in DC hervorrufen kann. Unsere Ergebnisse zeigten dass aus Knochenmark generierte DC der Maus, die sowohl inflammatorische als auch klassische DC Subtypen darstellen, nach Erkennung apoptotischen Zellmaterials reifungsresistent wurden, jedoch unverändert unreif und keine neuen tolerogenen Funktionen erwarben. Unreife DC induzierten in Gegenwart von TGF-β CD4+ FoxP3+ regulatorische T Zellen und in dessen Abwesenheit anergische CD4+ T Zellen. Wiederholte Stimulation anergischer CD4+ T Zellen durch unreife DC, induzierte deren IL-10 Produktion und regulatorische Eigenschaften. Diese IL-10+ regulatorischen T Zellen zeigten keine FoxP3 Expression, jedoch verstärkt CTLA-4, insbesondere nach Interaktion mit unreifen DC. Zusammen zeigten die hier erhaltenen Daten, dass das Reprogrammieren anergischer T Zellen zu IL-10+ regulatorischen T Zellen über CTLA-4 als auch über CD28 Signalkaskaden durch deren B7 Liganden auf der Zelloberfläche unreifer DC gesteuert wird. Frühere Arbeiten zeigten, dass repetitive Injektion semireifer DC, Autoimmunerkrankungen vorbeugen konnten durch die Induktion IL-10+ Th2 Antworten. Hier konnte gezeigt werden dass TNF als endogener Reifungsstimulus sowie pathogene T. brucei Varianten-spezifische Glykoproteine (VSG) sehr ähnliche semireife DC Reifungsqualitäten hervorrufen. Die entsprechend generierten Th2 Effektor Zellen unterschieden sich lediglich geringfügig in deren Zytokinproduktion. Repetitive Injektionen dieser semireifen DC induzierten ebenfalls IL-10+ Th2 Differenzierung und effektive Immundeviation in vivo. Insgesamt hat die vorliegende Arbeit wichtige Erkenntnisse ergeben, wie unreife und semireife DC die Generierung unterschiedlicher T Zell Toleranzmechanismen in vitro unterstützen. Diese Erkenntnisse sind ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung effektiver DC-basierter Immunvakzinen. Die Definition der verschiedenen DC Reifungsstadien ist von großer Bedeutung bei der Optimierung von Behandlungsverfahren gegen infektiöse Erreger, Krebs oder Autoimmunerkrankungen. KW - Dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Immuntoleranz KW - Toleranz KW - Dendritic cell KW - tolerance Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67375 ER - TY - THES A1 - Väth, Martin T1 - Regulation der peripheren immunologischen Toleranz durch die Transkriptionsfaktoren ICER, NFAT und Foxp3 T1 - Regulation of Peripheral Immunological Tolerance by the Transcription Factors ICER, NFAT, and Foxp3 N2 - Die Unterscheidung zwischen körpereigenen und körperfremden Strukturen ist eine grundlegende Herausforderung der spezifischen Immunantwort. Pathologische Veränderungen dieser Abgrenzung können zu schwerwiegenden Autoimmunerkrankungen wie beispielsweise Diabetes Mellitus, Rheumatischer Arthritis oder Multipler Sklerose führen. Um unerwünschte (Auto-) Immunreaktionen zu verhindern, existieren verschiedene Formen von peripheren Toleranzmechanismen, die durch viele Transkriptionsfaktoren wie z. B. ICER (inducible cAMP early repressor), NFAT (nuclear factor of activated T cells) und Foxp3 (forkhead box protein p3) kontrolliert werden. Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) sind spezialisierte immun-suppressive Lymphozyten, welche die Aktivierung anderer Immunzellen unterdrücken können. Einer der möglichen Mechanismen ist der Transfer zyklischen Adenosin-Monophosphats (cAMP) von Tregs in konventionelle T- und B-Lymphozyten. Die erhöhte intrazelluläre Konzentration an cAMP führt in Effektorzellen zur Induktion und Kerntranslokation von ICER. Der transkriptionelle Repressor ICER supprimiert die Expression vieler NFAT-regulierter Gene und hemmt darüber hinaus die Induktion der NFATc1/αA-Isoform selbst. Diese Isoform wird speziell in pro-inflammatorischen Effektorzellen hochreguliert und ist maßgeblich an deren spezifischem transkriptionellen Programm beteiligt. Foxp3 ist ein zentraler Faktor für die Bildung und Funktion sowohl Thymus-generierter nTregs als auch peripher (TGFβ-) induzierter iTregs. Die Kontrolle des Foxp3-Gens wird in iTregs – überraschenderweise aber nicht in nTregs – durch NFAT-Faktoren reguliert. Allerdings hemmt Foxp3 durch eine negative Rückkopplung wiederum die Induktion und Aktivität von NFATc1/αA. Dies stellt somit ein weiteres Regulativ dar, wobei Foxp3 nicht nur die Plastizität, sondern auch die Funktion von immun-suppressiven T-Zellen steuert. Zusätzlich regulieren die verschiedenen NFAT-Faktoren auch die Antigen präsentierenden dendritischen Zellen (DCs). Während NFATc1 und NFATc2 die Differenzierung und Proliferation von DCs beeinflussen, reguliert NFATc3 deren Zytokinexpression und steuert indirekt auch die nachfolgende T-Zell-Immunantwort. Die Kontrolle der Genregulation in Immunzellen durch die Transkriptionsfaktoren ICER, NFAT und Foxp3 erfüllt somit spezifische Funktionen der Immunität, reguliert aber gleichzeitig wichtige Aspekte der peripheren Toleranz, um schädliche (Auto-) Immunreaktionen zu verhindern. N2 - Discrimination between self and nonself is a major challenge during a specific immune reaction. Pathological alterations of this fine boundary can cause severe autoimmune diseases, such as Diabetes Mellitus, Rheumatoid Arthritis or Multiple Sclerosis. In order to prevent unwanted (auto-) immune reactions, several mechanisms of peripheral tolerance exist. Transcription factors, including ICER (inducible cAMP early repressor), NFAT (nuclear factor of activated T cells), and Foxp3 (forkhead box protein p3), are critical components thereby. Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) are specialized immune-suppressive lymphocytes and inhibit the activation of conventional immune cells. One mechanism of Treg-mediated suppression is the transfer of cyclic adenosine-monophosphat (cAMP) from Treg cells into conventional T- and B-lymphocytes. Elevated concentrations of cAMP induce the transcription and subsequent nuclear translocation of ICER. The transcriptional repressor ICER arrests expression of NFAT-regulated genes and even the induction of the short NFATc1/αA-isoform. Upregulation of NFATc1/αA is a hallmark of activated effector cells, controlling their transcriptional program. Foxp3 is essential for the development and function of thymus-derived nTregs as well as peripheral (TGFβ-) induced iTregs. The Foxp3-gene is regulated in iTregs – but surprisingly not in nTregs – by NFAT-factors. Likewise, Foxp3 represses NFATc1/αA in a negative feedback loop and, thereby, controls both plasticity and function of immune-suppressive Treg cells. In addition, NFAT-proteins also affect antigen-presenting dendritic cells (DCs). While NFATc1 and NFATc2 influence differentiation and proliferation of DCs, NFATc3 is important for cytokine secretion and the subsequent T cell response. Taken together, these results show that the transcription factors ICER, NFAT, and Foxp3 exert specific functions in controlling both immunity and tolerance, the opposing „faces“ of the immune system. The appropriate transcriptional regulation of this ambivalent situation is a requisite to achieve optimal immune responses and, coincidentally, to prevent deleterious (auto-) immune reactions. KW - Immunologie KW - Toleranz KW - Dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Transkription KW - Nuclear Factor of Activated T cells (NFAT) KW - Tolerance KW - Immunology KW - Dendritic cells Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67527 ER - TY - THES A1 - Gassert, Evelyn T1 - Die Bedeutung von Ceramiden für die Reorganisation des Zytoskeletts in T-Zellen, die Ausbildung einer immunologischen Synapse und die T-Zell-Aktivierung T1 - Impact of ceramide accumulation on T lymphocyte cytoskeletal reorganisation,immune synapse formation and activation N2 - Ceramide sind biologisch aktive Sphingolipide, die verschiedene zelluläre Signalwege regulieren, meist im Zusammenhang mit der Induktion von Apoptose oder der Regulation des Zellzyklus. Darüber hinaus wurde in der Literatur beschrieben, dass Ceramide die Zytoskelettdynamik unterschiedlicher Zelltypen beeinflussen, die Bedeutung von Ceramiden für die Funktion von T-Zellen wurde allerdings bisher wenig untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die exogene Akkumulation von Ceramiden ebenso wie die Generierung von Ceramiden durch bSMase die Adhärenz von T-Zellen an FN bzw. ICAM-1 beeinträchtigt. Des Weiteren konnte eine verminderte T-Zell-Polarisierung auf FN sowie eine reduzierte Chemotaxis und Motilität ceramidmodifizierter T-Zellen in Antwort auf SDF-1 nachgewiesen werden. In Übereinstimmung mit der Unfähigkeit ceramidmodifizierter Zellen morphologisch zu polarisieren wird ferner die Relokalisation von Oberflächenmolekülen und intrazellulärer Proteine durch die Akkumulation von Ceramiden gestört. Überdies konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide mit dem Aktivierungsstatus von Akt und ERM-Proteinen interferieren, da eine verminderte stimulationsabhängige Phosphorylierung von Akt und ERM-Proteinen in ceramidmodifizierten Zellen nachgewiesen wurde. Ein wesentlicher Schritt im Verlauf der T-Zell-Aktivierung ist die Ausbildung einer immunologischen Synapse mit dendritischen Zellen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass, obwohl ceramidreiche Membrandomänen von der Kontaktstelle ausgeschlossen werden, Konjugatfrequenz und Architektur der IS durch die Induktion von Ceramiden nicht beeinflusst werden, da eine normale Verteilung von CD3 und des MTOC beobachtet wurde. Allerdings wird die Funktionalität der Konjugate durch die Induktion von Ceramiden beeinträchtigt. Ceramidmodifizierte Zellen waren nur eingeschränkt in der Lage Orai1 und Stim1 zur Kontaktfläche mit DCs zu translozieren. In Übereinstimmung mit diesen Befunden wurde auch ein verminderter Calcium-Einstrom sowie eine verminderte Proliferation infolge der Akkumulation von Ceramiden detektiert. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide wesentliche Prozesse im Verlauf der T-Zell-Aktivierung beeinflussen, so dass die pathogeninduzierte Generierung von Ceramiden einen möglichen Mechanismus darstellt, die Funktion von T-Zellen zu beeinträchtigen. N2 - Ceramides are sphingolipids regulating various signalling pathways mainly associated with the induction of apoptosis and cell cycle arrest. Besides their established role in these processes several lines of evidence suggest that ceramides also regulate cytoskeletal dynamics in non-hematopoietic cells, but their role in T lymphocyte function has not yet been addressed. In this study we show that accumulation of membrane ceramides affects several processes required for accurate T cell function. Treatment of T cells with bSMase or exogenously added ceramides interfered with T cell adhesion to FN and ICAM-1 as well as T cell polarisation, chemotaxis and motility in response to SDF-1. In line with the impairment to morphologically polarise, relocation of surface receptors as well as intracellular signalling molecules was also impaired upon ceramide treatment of T cells. Moreover, increase in cellular ceramide levels interfered with cellular signalling pathways as revealed by reduced phosphorylation levels of Akt and ERM proteins. T cell activation requires the formation of an IS with DCs. In this study we could show, that ceramides, although excluded from the DC/T cell interface, do not interfere with conjugate frequency or synapse organisation, since a normal distribution of CD3 and the MTOC was observed. Nevertheless, ceramide generation interfered with the translocation of Orai1 and Stim1 to the interface and in line with this observation a reduced calcium-influx in T cells was detected upon bSMase exposure. In addition to the decrease in cytosolic calcium levels ceramides also reduced the ability of T cells to proliferate in response to CD3/CD28 stimulation. Therefore the induction of ceramides by certain pathogens, including MV, might be a possible mechanism to interfere with essential processes required for T cell activation. KW - Ceramide KW - T-Lymphozyt KW - T-Zell-Aktivierung KW - Zytoskelettreorganisation KW - immunologische Synapse KW - Masernvirus KW - ceramide KW - T cell activation KW - cytoskeletal reorganisation KW - immunological synapse KW - measles virus Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65123 ER - TY - THES A1 - Mathes, Denise Sandra T1 - Die Rolle von T-Lymphozyten im myokardialen Reperfusionsschaden T1 - The role of T-cells in myocardial reperfusion injury N2 - Der Myokardinfarkt (MI) gehört nach wie vor zu den führenden Todesursachen weltweit. Eine Minimierung der Infarktgröße, die durch die Dauer der Ischämie bestimmt wird, ist wesentlich für das Überleben und die Lebensqualität des Myokardinfarkt-Patienten. Die Reperfusion stellt aktuell eine zentrale klinische Intervention dar, um den myokardialen Schaden einzugrenzen. Dennoch führt die Reperfusion per se zu zusätzlichem Schaden am Herzen. Somit ist die Erforschung neuer Strategien zur Minimierung des myokardialen Reperfusionsschadens international von Interesse. Die Pathophysiologie des myokardialen Reperfusionsschadens ist vielschichtig und einige Komponenten sind auch heute in ihrer Wirkweise noch nicht vollständig mechanistisch verstanden. Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle von CD4+ T-Zellen und insbesondere deren Subpopulation der regulatorischen T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden und stellt neue, auf T-Zellen abzielende, Therapien in Ergänzung zur myokardialen Reperfusion vor. Zunächst wurde eine Infiltration von T-Zellen in das Myokard nach Ischämie-Reperfusion (I/ R) untersucht. Nach der Ischämie-Reperfusion wurden infiltrierende CD4+ T-Zellen als quantitativ führend und aktiviert identifiziert und erwiesen sich in der Infarktgrößenbestimmung als relevante Mediatoren des Reperfusionsschadens. CD25+Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Treg) stellen eine Subpopulation von CD4+ T-Zellen mit immunsuppressiven Eigenschaften dar, die schnell und niederschwellig aktiviert werden können und kommen somit als zum Reperfusionsschaden beitragend in Frage. Mit Hilfe des DEREG (DEpletion of REGulatory T cells) -Mausmodells wurde gezeigt, dass regulatorische T-Zellen zum myokardialen Reperfusionsschaden beitragen; Treg-depletierte DEREG-Mäuse waren vor dem Reperfusionsschaden geschützt und zeigten kleinere Infarktgrößen als die Kontrolltiere. Zudem wurde mittels Transferexperimenten gezeigt, dass für den Treg-vermittelten Reperfusionsschaden die Anwesenheit von CD25- konventionellen T-Zellen (Tconv) erforderlich ist. Regulatorische T-Zellen stellen also einen in der vorliegenden Arbeit identifizierten potentiellen Angriffspunkt zur Reduktion des myokardialen Reperfusionsschadens dar. Anhand von T-Zell-Rezeptor transgenen OT-II Mäusen und MHC (Major Histocompatibility Complex) Klasse II Knockout (KO) Tieren wurde gezeigt, dass Autoantigenerkennung im myokardialen Reperfusionsschaden eine Rolle spielt. Zur vollen T-Zell-Aktivierung notwendig ist neben dem MHC Klasse II-Signalweg und Kostimulatoren auch das Moleküle CD154 (CD40L). Die Gabe eines inhibitorischen anti-CD154-Antikörpers reduzierte die Infarktgröße in Wildtyp-Tieren sigifikant. Der myokardiale Reperfusionsschaden kann neben Zellen der adaptiven Immunität auch durch Neutrophile Granulozyten, Plättchen oder Inflammation des Endothels verstärkt werden. Knockout Mäuse mit einer Defizienz an CD4+ T-Zellen verfügten über eine verbesserte Mikroperfusion. Mechanistisch war nach 24h Reperfusion die absolute Zellzahl an Neutrophilen Granulozyten im CD4 KO im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen unverändert; in Endothelzellen war die Regulation bestimmter Gene (VEGFα, TIMP-1 und Eng) nach I/ R im CD4 KO jedoch verändert. Zusammengefasst zeigt die vorliegende Arbeit eine zentrale Rolle der Antigen-Erkennung durch den T-Zell-Rezeptor zur Aktivierung von CD4+ T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden. In Anwesenheit von CD4+Foxp3+ T-Zellen ist der Reperfusionsschaden erhöht. Somit können CD4+Foxp3+ T-Zellen potentiell als Ziel für neuartige Therapien des Myokardinfarkts genutzt werden. N2 - Myocardial infarction (MI) is still one of the leading causes of mortality worldwide. Minimizing infarct size, which is determined by duration of ischemia, is of paramount importance for the rescue of myocardial tissue determining myocardial infarct size and prognosis. Currently, reperfusion is a central clinical intervention to curtail myocardial ischemia. However, reperfusion itself is leading to additional damage to the heart. Therefore, investigating new strategies to minimize myocardial reperfusion injury is of international interest. The pathophysiology of myocardial reperfusion injury is complex and some of its components are still mechanistically not completely understood. The present work determines the role of CD4+ T-cells and in particular their subset of regulatory T-cells in myocardial reperfusion injury, providing approaches for new T-cell directed therapies in addition to myocardial reperfusion. Initially, an infiltration of T-cells into the myocardium was investigated after ischemia-reperfusion (I/ R). After ischemia-reperfusion, infiltrating CD4+ T-cells were identified as leading in quantity and activated and turned out to be relevant mediators of reperfusion injury influencing infarct size. CD25+Foxp3+ regulatory T (reg)-cells are a subpopulation of CD4+ T-cells with immunosuppressive features, being activated quickly and at a low threshold, thereby possibly mediating reperfusion injury. With the help of the DEREG (DEpletion of REGulatory T-cells) mouse model, regulatory T-cells were identified as involved in myocardial reperfusion injury; Treg-depleted DEREG mice were protected from reperfusion injury showing smaller infarct sizes than control mice. Additionally, transfer experiments revealed that Treg-mediated reperfusion injury needs the presence of CD25- conventional T-cells (Tconv). That means that Tregs are a potential target identified in the present work to reduce myocardial reperfusion injury. With the help of T-cell receptor transgenic OT-II mice and MHC (major histocompatibility complex) class II knockout (KO) mice, it was shown that recognition of autoantigen plays a role in myocardial reperfusion injury. Next to MHC class II-signaling and costimulators also the molecule CD154 (CD40L) is required for full T-cell activation. An inhibitory anti-CD154 antibody significantly reduced infarct size in wildtype mice. Besides by cells of the adaptive immunity, myocardial reperfusion injury can also be intensified by neutrophils, platelets or inflammation of the endothelium. Knockout mice deficient in CD4+ T-cells revealed a better microperfusion. Mechanistically, after 24h of reperfusion, the absolute cell number of neutrophils was not altered in CD4 KO versus wildtype mice; however, in endothelial cells, the regulation of specific genes (VEGFα, TIMP-1 and Eng) was altered after I/ R. In summary, the present work shows a central role of recognition of antigen by the T-cell receptor for activation of CD4+ T cells in myocardial reperfusion injury. In the presence of CD4+Foxp3+ regulatory T-cells, myocardial reperfusion injury is enhanced. Hence, CD4+Foxp3+ regulatory T-cells might constitute a new potential target for the therapy of myocardial infarction. KW - Reperfusion KW - T-Lymphozyt KW - Foxp3+CD4+ regulatorische T-Zelle Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110802 ER - TY - THES A1 - Wegner, Julia T1 - Restoring tissue-like functionality in circulating CD8 T-cells: mechanistic studies and application in immunomonitoring of cancer patients T1 - Wiederherstellen einer gewebeartigen Funktionalität in humanen CD8 T-Zellen des Blutes: mechanistische Studien und Anwendung beim Immunomonitoring von Krebspatienten N2 - Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are the only source of human lymphoid cells routinely available for immunologic research and for immunomonitoring of T-cell responses to microbial and tumor-associated antigens. However the large majority of human T-cells resides in tissues, especially in lymphatic organs, while only 1 % of the body’s T-cells circulate in the blood stream. Previous work in mice and humans had indicated that CD4 T-cells transiently lose antigen sensitivity when cellular contacts are lost, e.g. by leaving lymphoid organs such as lymph nodes (LNs) and entering the circulation. In this study, these findings were extended to CD8 T-cells. Thus, CD8 T-cell responses of the human tonsil show a significant drop in sensitivity to viral antigens if tissue-exit was simulated by keeping cells in dispersed culture at body temperature for two hours. Conversely, tissue-like functionality in blood-derived CD8 T-cells was restored by applying the simple and robust RESTORE protocol. Indeed, application of the RESTORE protocol, i.e. pre-culturing PBMCs for two days at a high cell density before initiation of antigenic stimulation, demonstrated that CD8 T-cell responses to a broad range of viral and to tumor-associated antigens are greatly underestimated, and sometimes even remain undetected if conventional, unprocessed PBMC cultures are used. The latter finding is particularly striking with regard to the appearance of Wilms tumor 1 (WT1)-specific CD8 T-cell responses in leukemia patients after allogeneic bone marrow transplantation. My studies on the mechanism of the RESTORE protocol show that HD preculture of PBMCs does not involve antigen-or cytokine-driven clonal expansion of T-cells. Moreover, the gain in antigen sensitivity cannot be explained by a decreased activity of regulatory T-cells during the preculture step. The increased antigen sensitivity of CD8 T-cells from HD precultures of PBMCs is associated with tonic T-cell receptor signaling as indicated by enhanced tyrosine phosphorylation of the CD3 ζ chains and the tyrosine kinase Lck, thereby preparing T-cells for full responses. The upregulation of genes involved in aerobic glycolysis in “restored” CD8 memory T-cells relative to fresh cells might be an essential requirement for increased T-cell functionality including the regulation of IFN-γ production. Taken together, the RESTORE protocol, which was initially described for the CD4 T-cell response to the antibody TGN1412 permits a more meaningful monitoring of CD8 T-cell responses to viral infections and tumors. Furthermore, when generating T-cell lines for adoptive T-cell therapy, the RESTORE protocol allows the generation of CD8 T-cell lines with an improved representation of clones responding to low antigen concentrations. N2 - Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs: peripheral blood mononuclear cells) stellen die einzige routinemäßig zugängliche Quelle für humane Lymphozyten dar, welche für die immunologische Forschung und das „Immunomonitoring“ von T-Zellantworten gegen mikrobielle und Tumor-assoziierte Antigene verwendet werden. Jedoch befindet sich der Großteil der T-Zellen des Menschen in Geweben, insbesondere den lymphatischen Organen, wohingegen sich nur 1 % der T-Zellen im Blut aufhalten. Frühere Studien, die sowohl mit murinen als auch mit humanen Zellen durchgeführt wurden, zeigten, dass CD4 T-Zellen ihre Sensitivität gegenüber Antigenen zeitweise verlieren sobald zelluläre Kontakte unterbrochen werden. Dies erfolgt beispielsweise beim Verlassen der T-Zellen von Geweben und dem Eintreten in die Blutzirkulation. In dieser Arbeit wurden diese Beobachtungen auf CD8 T-Zellen ausgeweitet. So weisen humane tonsilläre CD8 T-Zellen eine signifikant niedrigere Sensitivität gegenüber viralen Antigenen auf, wenn diese in Dispersion bei Körpertemperatur für zwei Stunden gehalten werden, um das Verlassen von Geweben und somit den Verlust von zellulären Kontakten zu simulieren. Im Gegenzug konnte eine gewebeähnliche T-Zellfunktionalität bei Blutzellen durch Anwendung des RESTORE Protokolls wiederhergestellt werden. In der Tat zeigte die Anwendung des RESTORE Protokolls, welches eine Vorkultur von PBMCs für zwei Tage bei hoher Zelldichte vor antigenspezifischer T-Zellstimulation einschließt, dass CD8 T-Zellantworten gegen eine Vielzahl viraler und Tumor-assoziierter Antigene deutlich unterschätzt werden, wenn herkömmliche Stimulationsansätze verwendet werden. Teilweise können diese so gemessenen T-Zellantworten bei Verwendung herkömmliche Stimulationsansätze auch gar nicht nachgewiesen werden. Dieser Effekt war bei der Detektion von Wilms Tumor 1 (WT1)-spezifischen CD8 T-Zellantworten bei Leukämiepatienten nach allogener Stammzelltransplantation besonders deutlich zu beobachten. Meine mechanistischen Studien zeigten, dass die Vorkultur von PBMCs bei hoher Zelldichte selbst nicht zu einer Antigen- oder Zytokin-getriebenen T-Zell Expansion führt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der RESTORE Effekt durch den Zugewinn an CD8 T-Zellsensitivität erklärt werden kann und nicht auf eine verringerte CD8 T-Zellsuppression durch regulatorische T-Zellen während der Vorkultur zurückzuführen ist. Die erhöhte Antigensensitivität von vorkultivierten CD8 T-Zellen steht im Zusammenhang mit tonischer T-Zell Signalweiterleitung, welche anhand von erhöhter Tyrosin Phosphorylierung der CD3 ζ Ketten des T-Zell-Rezeptors und der Tyrosinkinase Lck nachgewiesen werden kann. Diese tonischen T-Zellsignale bereiten CD8 T-Zellen darauf vor, bereits auf kleine Mengen Antigen effektiv zu reagieren. Auch die Hochregulierung von Genen, welche der aeroben Glykolyse zuzuordnen sind in vorkultivierten CD8 Gedächtniszellen im Vergleich zu CD8 Gedächtniszellen, welche direkt aus dem Blut isoliert wurden, trägt zu einer erhöhten T-Zellfunktionalität bei, welche die Regulation der IFN-γ Produktion einschließt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anwendung des RESTORE Protokolls, welches ursprünglich zum Nachweis von CD4 T-Zellantworten gegen den Antikörper TGN1412 entwickelt wurde, eine verlässliche Methode zum Nachweis von CD8 T-Zellantworten gegen virale Infektionen und Tumore darstellt. Des Weiteren kann das RESTORE Protokoll zur Generierung von T-Zelllinien in der adoptive T-Zelltherapie eingesetzt werden. Die Anwendung des Protokolls erlaubt das Generieren von Zelllinien, welche auch T-Zellklone beinhalten, die durch Immunantworten auf geringe Antigenkonzentrationen entstanden sind. KW - Antigen CD8 KW - CD8 T cell KW - antigen KW - CD8 T-Zelle KW - RESTORE protocol KW - sensitivity KW - T-Lymphozyt KW - Gewebe Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124177 ER - TY - THES A1 - Gonzalez-Leal, Iris Janet T1 - Roles of cathepsins B and L in the Th1/Th2 polarization by dendritic cells T1 - Die Rolle von Kathepsinen B und L während der Th1/Th2 Polarisierung durch Dendritische Zellen N2 - Leishmaniasis is a neglected tropical disease that can be manifested through different clinical forms, ranging from cutaneous to visceral. The host response against Leishmania spp. is greatly dependent on T cell-mediated immunity, in which T helper 1 responses are associated with macrophage activation and elimination of the parasite, while regulatory T cells and T helper 2 responses are correlated with parasite survival and persistence of infection. Leishmania uses different virulence factors as strategies for evading the immune response of the host. One of them are cathepsin-like cysteine proteases, which are currently under extensive investigation as targets for drug development. Previous studies with inhibitors of cathepsins B and L in vivo revealed an outstanding modulation of the host T helper cell response. However, the mechanisms behind these observations were not further investigated. Given the urgent need for better treatments against leishmaniasis, the aim of this study was to investigate the effects that the lack of cathepsin B and L activity have on the signals that dendritic cells use to instruct T helper cell polarization in response to infection with Leishmania major. The cathepsin inhibitors tested showed low or no cytotoxicity in bone marrow-derived dendritic cells, and dendritic cells and macrophages could be generated from cathepsin B and cathepsin L-deficient mice without apparent alterations in their phenotype in comparison to wild-type controls. Furthermore, lack of cathepsin B and L activity showed no impact in the rate of promastigote processing by dendritic cells. Cathepsin B and cathepsin L-deficient macrophages showed no differences in parasite proliferation and capacity to produce nitric oxide in comparison to wild-type macrophages. In response to the parasite, dendritic cells treated with a cathepsin B inhibitor and dendritic cells from cathepsin B-deficient mice showed higher levels of expression of major histocompatibility complex (MHC) class II molecules than dimethyl sulfoxide (DMSO) or wild-type controls, but it was not accompanied by changes in the expression of costimulatory molecules. Wild-type dendritic cells and macrophages are not able to express the pro-inflammatory cytokine interleukin (IL)-12 in response to promastigotes. However, cells treated with a cathepsin B inhibitor or cells deficient for cathepsin B were able to express IL-12, whilethe expression of other cytokines -including IL-6 and tumor necrosis factor (TNF)-alpha-remained unchanged. These characteristics point towards a more “pro-Th1” profile of dendritic cells in the absence of cathepsin B. This data is the first report on IL-12 regulation depending on cathepsin B. The IL-12 up-regulation observed was already present at the transcriptional level. Furthermore, it was also present in macrophages and dendritic cells in response to LPS, and the latter had a higher capacity to induce T cell helper 1 polarization in vitro than wild-type dendritic cells. The activation of different signaling pathways was analyzed, but the up-regulation of IL-12 could not be attributed to modulation of nuclear factor-kappaB (NFkappaB), p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) and extra-cellular signal-regulated kinase (ERK)1/2 pathways. Thus, the mechanism behind IL-12 regulation by cathepsin B remains to be elucidated, and the impact of these effects is yet to be confirmed in vivo. Altogether it is tempting to speculate that cathepsin B, in addition to its role in processing endocytosed material, is involved in the modulation of the pro-inflammatory cytokine IL-12. N2 - Leishmaniose ist eine hauptsächlich in den Tropen vorkommende Infektionskrankheit, die sich in verschiedenen klinischen Formen, von kutan bis viszeral, manifestieren kann. Die Reaktion des Wirtes gegen Leishmania spp. hängt stark von der T-Zell-vermittelten Immunantwort ab, wobei die Antwort der T1-Helferzellen assoziiert ist mit der Aktivierung von Makrophagen und der Beseitigung des Parasiten, während die regulatorischen T-Zellen und T2-Helferzellen mit dem Überleben der Parasiten und der Fortdauer der Infektion in Verbindung stehen. Leishmania verwendet verschiedene Virulenzfaktoren als Strategie zur Umgehung der Immunantwort des Wirtes. Darunter zählen Cathepsin-ähnliche Cysteinproteasen, die derzeit Gegenstand umfangreicher Untersuchungen sind mit dem Ziel, für die Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden zu können. Frühere Studien mit Inhibitoren von Cathepsin B und L in vivo zeigten eine hervorragende Modulation der Wirt-T-Helferzellantwort. Jedoch wurden die Mechanismen, die diesen Beobachtungen zu Grunde liegen, nicht weiter untersucht. Angesichts der dringenden Notwendigkeit einer besseren Behandlung gegen Leishmaniose war das Ziel dieser Studie die Auswirkungen zu untersuchen, die das Fehlen von Cathepsin B und L-Aktivität auf die Signale hat, welche die dendritischen Zellen verwenden, um die Reaktion der T-Helferzellen auf eine Infektion mit Leishmania major zu beeinflussen. Die getesteten Cathepsin-Inhibitoren zeigten geringe oder keine Cytotoxizität in den aus dem Knochenmark präparierten dendritischen Zellen. Dendritische Zellen und Makrophagen von Cathepsin B- und Cathepsin L-defizienten Mäusen zeigten keine offensichtlichen Veränderungen ihres Phänotyps im Vergleich zu Wildtypkontrollen. Weiterhin zeigte das Fehlen von Cathepsin B- und L-Aktivität keine Auswirkung auf die Prozessierung der Promastigoten durch dendritische Zellen. Auch zeigten Cathepsin Bund Cathepsin L-defiziente Makrophagen keine Unterschiede in der Parasitenproliferation und der Fähigkeit Stickoxid zu produzieren im Vergleich zu Wildtyp-Makrophagen. In Reaktion auf den Parasiten war bei mit einem Cathepsin-B-Inhibitor behandelten dendritischen Zellen und dendritischen Zellen von Cathepsin-B-defizienten Mäusen eine höhere Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen ersichtlich im Vergleich zu DMSO oder Wildtyp-Kontrollen, aber es wurden keine Veränderungen in der Expression von costimulatorischen Molekülen festgestellt. Dendritische Zellen und Makrophagen von Wildtyp-Mäusen sind nicht in der Lage das pro-inflammatorische Zytokin IL-12 als Reaktion auf die Promastigoten zu exprimieren. Jedoch konnten dendritische Zellen, die mit einem Cathepsin-B-Inhibitor behandelt waren oder Cathepsin-B-defiziente Zellen, IL-12 exprimieren, während die Expression von anderen Zytokinen - einschließlich IL-6 und TNF-alpha- unverändert blieb. Diese Eigenschaften weisen in die Richtung einer "pro-Th1"-Antwort der dendritischen Zellen in Abwesenheit von Cathepsin B. Diese Daten sind der erste Bericht über die IL-12-Regulierung in Abhängigkeit von Cathepsin B. Die Hochregulation von IL-12 war bereits auf der Transkriptionsebene zu beobachten. Weiterhin war sie in Makrophagen und dendritischen Zellen auch als Reaktion auf LPS vorhanden. Dendritische Zellen von Cathepsin B-defizienten Mäusen hatten eine höhere Kapazität zur Induktion einer eine T1-Helferzell-Polarisierung in vitro als dendritische Zellen von Wildtyp-Mäusen. Die Aktivierung von verschiedenen Signalwegen wurde untersucht, jedoch konnte die Hochregulierung von IL-12 nicht auf die Modulation von NF_B, p38 MAPK und ERK1/2-Signalwege zurückgeführt werden. Damit ist der für die IL-12-Regulierung durch Cathepsin B verantwortliche Mechanismus noch nicht geklärt; auch die Auswirkungen dieser Effekte in vivo müssen noch bestätigt werden. Insgesamt lässt die vorliegende Studie vermuten, dass Cathepsin B nicht nur an der Prozessierung von endozytiertem Material sondern auch an der Regulierung des pro-inflammatorischen Zytokins IL-12 beteiligt ist. KW - Leishmaniose KW - Dendritische Zelle KW - leishmaniasis KW - dendritic cells KW - th1/th2 polarization KW - T-Lymphozyt KW - Helferzelle KW - Immunologie KW - Infektionsbiologie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114397 ER - TY - THES A1 - Paletta, Daniel Sylvester T1 - Die Variabilität des Ratten iNKT TCR T1 - The Variability Of The Rat iNKT TCR N2 - Typ 1 NKT Zellen oder iNKT Zellen (invariante Natürliche Killer T Zellen) stellen eine Subpopulation der abT Zellen dar, die sich durch mehrere charakteristische Eigenschaften aus- zeichnet. Ihr Hauptmerkmal ist die Expression eines semi-invarianten T Zellrezeptors (TCR), der die Bindung von CD1d:Glycolipid Komplexen ermöglicht, wohingegen ‚klassische‘ T Zellen an Komplexe aus MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) Molekülen und Peptiden binden. Die während der Reifung im Thymus durch Transkriptionsfaktoren festgelegte Voraktivierung der iNKT Zellen ermöglicht das unmittelbare Freisetzen von Cytokinen bei Antigenkontakt, wodurch iNKT Zellen die adaptive Immunantwort stark beeinflussen können: Sie tragen sowohl zur Regulation von Autoimmunerkrankungen als auch der Bekämpfung von Krebs und Infektionen bei. Der iNKT TCR setzt sich aus einer invarianten a-Kette (AV14/AJ18 in der Maus bzw. AV24/AJ18 im Menschen) und einer charakteristischen Auswahl an b-Ketten (vorwiegend BV8S2, BV7 und BV2 in der Maus und BV11 im Menschen) zusammen. Das Cerebrosid a-Galactosylceramid (aGC, KRN7000) stellt eines der potentesten Antigene für iNKT Zellen dar. Die Präsentation dieser Antigenklasse erfolgt durch CD1d Moleküle, die, abgesehen von tiefen hydrophoben Bindungstaschen, strukturell MHC I Molekülen ähneln, jedoch nicht polymorph sind und außerhalb des MHC Locus codiert sind. Die, zwischen Maus und Mensch hochkon- servierte, Interaktion von iNKT TCR und CD1d:aGC Komplex zeichnet sich bei potenten Antigenen durch die eingeschränkte Nutzung der Antigenspezifität bestimmenden Regionen aus: CDR1a, CDR3a und CDR2b. Die den CDR3b definierende V-D-J Umlagerung der b-Kette stellt im iNKT TCR den Bereich der höchsten Variabilität dar, beeinflusst jedoch nur die Bindung schwächerer Antigene. Natürlich auftretende Variabilität innerhalb der a-Kette kann durch Abweichungen von der kanonischen V-J Umlagerung am Beginn des CDR3a entstehen und beeinflusst ebenfalls die Bindung des iNKT TCR. Die iNKT Zellpopulation in F344 Ratten ähnelt in Frequenz und Korezepotorexpression derjenigen des Menschen. Ratten besitzen ein CD1D Gen, welches hoch homolog zu denen der Maus ist und zwei dem BV8S2 Gensegment der Maus homologe BV Segmente (BV8S2 und BV8S4), die in F344 Ratten beide funktionell sind. Eine Besonderheit der Ratte ist jedoch das Auftreten einer AV14 Multigenfamilie von bis zu zehn Gensegmenten. Diese unterscheiden sich neben dem HV4 vor allem in ihren CDR2 Sequenzen und werden anhand dieser Unterschiede in zwei Gruppen (Typ 1 und 2) eingeteilt. Zusätzlich wurde in der iNKT Zellpopulation eine hohe Frequenz an natürlich auftretenden A93G Substitutionen in der TCR↵ Kette beschrieben und es wurde gezeigt, dass, im Gegensatz zur Kreuzreaktivität zwischen iNKT TCR und CD1d von Maus und Mensch, iNKT Zellen der Ratte nicht an Maus CD1d binden. Die Besonderheiten des Ratten iNKT TCR und deren Auswirkungen auf die TCR Expression und Ligandenbindung der Ratten iNKT Zellpopulation wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht. Durch in dieser Arbeit durchgeführte in vitro Mutagenesestudien konnten Position 68 in der vierten Hypervariablen Schleife (HV4↵) und Position 93 zu Be- ginn des CDR3↵ als entscheidende Modulatoren der CD1d Bindung im iNKT TCR von Ratte und Maus identifiziert werden, wobei auch speziesspezifische Unterschiede aufgedeckt werden konnten. Die Spezieskreuzreaktivität des Ratten iNKT TCR selbst hing stark von einer A93G Substitution im TCRa ab. Bei Untersuchungen der b-Kette zeigte sich, dass sowohl BV Segmente als auch CDR3b Region die Ligandenbindung in differenziellem Zusammenspiel beeinflussen, was bei Paarung mit unterschiedlichen AV14 Segmenten verschieden ausgeprägt sein konnte. Weiterhin wurden humane CD1d Dimere generiert und zum ersten Mal die Bindung von Ratten CD1d an humane iNKT TCR gezeigt. Weiterhin wurde in dieser Arbeit das TCR Repertoire von iNKT Zellen der F344 Ratte und deren CD1d Bindungseigenschaften charakterisiert. Hierzu wurde die bereits etablierte Methode der in vitro Expansion von iNKT Zellen aus der Rattenmilz weiterentwickelt, was die Langzeitkultur und -expansion der sortierten iNKT Zellpopulation ermöglichte. Bei Untersuchung der TCR Expression konnte gezeigt werden, dass die Auswahl der im Ratten iNKT TCR genutzten BV Gensegmente ähnlich limitiert ist wie in der Maus. Neben der dominanten Nutzung der BV8S4 und BV8S2 Gensegmente wurden hauptsächlich BV8S1, BV14 und BV7 gefunden. Bei Untersuchungen der CD1d Dimerbindung der iNKT Zellpopulation konnte der Einfluss der na- türlich auftretenden A93G Substitution in der iNKT TCRa Kette bestätigt werden. Außerdem zeigte sich hier ebenfalls der Einfluss des BV Gensegments auf die Ligandenbindung, wobei BV8S4 negative Zellen im Vergleich zu BV8S4 positiven Zellen eine stärkere Ratten CD1d Dimerbindung zeigten. N2 - Type 1 NKT cells, also called iNKT cells (invariant Natural Killer T cells), are a subpopulation of abT cells with characteristic features. Their hallmark is the expression of a semi-invariant T cell receptor (TCR) which binds CD1d:glycolipid complexes. This is in contrast to ‚conventional‘ T cells which bind complexes of MHC (major histocompatibility complex) molecules and peptides. iNKT cells show a transcription factor dependend, preactivated phenotype which is obtained during their development in the thymus. This allows for immediate cytokine release after antigen encounter and enables iNKT cells to strongly influence the adaptive immune re- sponse: They are not only able to help regulating autoimmune diseases, but also contribute to the clearance of cancer and infections. The iNKT TCR is composed of an invariant a-chain (AV14/AJ18 in mice, AV24/AJ18 in humans) and a limited number of � chains (mostly BV8S2, BV7 and BV2 in mice and BV11 in humans). a-galactosyceramide (aGC, KRN7000), a cerebroside, is one of the most potent iNKT cell antigens known so far. iNKT cell antigens are presented by CD1d, a non polymorphic molecule which is encoded outside the MHC locus. CD1d molecules resemble MHC I structurally but possess deep hydrophobic pockets as antigen binding grooves. The iNKT TCR interaction with CD1d:aGC complexes is highly conserved between mice and humans. Its binding mode is characteristic for the restricted CDR (complementarity determining region) usage and relies mostly on CDR1a, CDR3a and CDR2b. The only highly variable region within the iNKT TCR, the CDR3b defining diverse V-D-J rearrangement of the TCRb chain, has been shown to only influence binding to less potent antigens. Natural variability within the TCRa chain is usually only possible due to non canonical AV14/AJ18 rearrangements at the beginning of CDR3a and has been shown to indirectly influence ligand binding. The iNKT cells in F344 rats resemble human iNKT cells in terms of frequency and coreceptor expression profile. Rats have one CD1D gene, highly homologous to those found in mice, and two BV8S2 homologs (BV8S2 and BV8S4 ), which are both functional in F344 rats. Peculiar for the rat is the presence of an AV14 gene family with up to ten members, which have been grouped by their CDR2↵ sequences into Type 1 and 2, and a high frequency of A93G substitutions within the iNKT TCRa chains. Additionally, in contrast to the species cross-reactive interaction of iNKT TCR and CD1d from mice and humans, a lack of mouse CD1d binding by the rat iNKT TCR has been demonstrated. Those characteristic features of the rat iNKT TCR and its influence on TCR expression and ligand binding of rat iNKT cells were investigated in this study. Due to in vitro mutagenesis studies conducted in this thesis, position 68 within the fourth hypervariable loop of the TCRa chain (HV4a) as well as position 93 at the start of CDR3a could be identified as strong modulators of CD1d binding within the iNKT TCR of rat and mouse with specific features for both species. Furthermore, species cross-reactivity of rat iNKT TCR was found to be strongly enhanced due to the naturally occuring A93G substitution within the rat TCRa chain. The analysis of the rat iNKT TCRb chain showed that BV segments as well as the highly diverse CDR3b region influence CD1d binding in a complex interplay, which also differs depending on the paired a-chain. Furthermore, human CD1d dimers were generated and for the first time binding of rat CD1d to human iNKT TCRs could be shown. Additionally, the TCR repertoire of F344 rat iNKT cells and its ligand binding has been characterized in this study. For this purpose, the already established in vitro expansion of rat iNKT cell from splenocytes was further developed, allowing long term culture and expansion of purified iNKT cell populations. Analysis of the TCR expression did reveal a restricted BV segment usage, similar to mouse iNKT cells. Besides the predominant usage of BV8S2 and BV8S4 gene sements, mainly BV8S1 BV14 and BV7 were found. CD1d dimer binding studies confirmed the influence of the A93G substitution on ligand binding properties of the rat iNKT cell population and the influence of different BV segments on CD1d binding could also be seen by comparison of BV8S4 positive and negative iNKT cell subpopulations, where BV8S4 usage led to a lower rat CD1d binding profile. KW - T-Lymphozyt KW - T-Lymphozyten-Rezeptor KW - Ratte KW - invariante NKT Zellen KW - invariant NKT cells KW - CD1d KW - CD1d Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114521 ER - TY - THES A1 - Vögtle, Timo T1 - Studies on receptor signaling and regulation in platelets and T cells from genetically modified mice T1 - Studien zur Signaltransduktion und Regulierung von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen genetisch veränderter Mäuse N2 - Receptors with tyrosine-based signaling motifs control essential functions of hematopoietic cells, including lymphocytes and platelets. Downstream of the platelet receptor glycoprotein (GP) VI and the T cell receptor (TCR) the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) initiates a signaling cascade that involves kinases, adapter and effector proteins and finally leads to cellular activation. This thesis summarizes the results of three studies investigating different aspects of receptor signaling and regulation in platelets and T cells. In the first part, the impact of constitutive Ca2+ influx on TCR signaling and T cell physiology was investigated using a transgenic mouse line with a mutation in the Ca2+ sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1). The elevated cytoplasmic Ca2+ level resulted in an altered phosphorylation pattern of the key enzyme phospholipase (PL) Cγ1 in response to TCR stimulation, but without affecting its enzymatic activity. Withdrawal of extracellular Ca2+ or inhibition of the phosphatase calcineurin restored the normal phosphorylation pattern. In addition, there was a decrease in the release of Th2-type cytokines interleukin 4, 5 and 13 upon stimulation in vitro. The second part of the thesis deals with the role of the adapter protein growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in platelets using a megakaryocyte/platelet-specific knockout mouse line. Loss of Grb2 severely impaired signaling of GPVI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), a related hemITAM receptor. This was attributed to defective stabilization of the linker for activation of T cells (LAT) signalosome and resulted in reduced adhesion, aggregation, Ca2+ mobilization and procoagulant activity downstream of (hem)ITAM-coupled receptors in vitro. In contrast, the signaling pathways of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the integrin αIIbβ3, which do not utilize the LAT signalosome, were unaffected. In vivo, the defective (hem)ITAM signaling caused prolonged bleeding times, however, thrombus formation was only affected under conditions where GPCR signaling was impaired (upon acetylsalicylic acid treatment). These results establish Grb2 as an important adapter protein in the propagation of GPVI- and CLEC-2-induced signals. Finally, the proteolytic regulation of the immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)-bearing receptor CD84 in platelets was investigated. This study demonstrated that in mice CD84 is cleaved by two distinct and independent proteolytic mechanisms upon platelet activation: shedding of the extracellular part, which is exclusively mediated by a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 and cleavage of the intracellular C-terminus by the protease calpain. Finally, the analysis of soluble CD84 levels in the plasma of transgenic mice revealed that shedding of CD84 by ADAM10 occurs constitutively in vivo. N2 - Rezeptoren mit Tyrosin-basierten Signaltransduktionsmotiven sind von fundamentaler Bedeutung für die Funktion hematopoietischer Zellen wie Lymphozyten und Thrombozyten. Unterhalb des Glykoproteins (GP) VI auf Thrombozyten und des T-Zell Rezeptors (TZR) auf T-Zellen initiiert das immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) eine Signalkaskade, die Kinasen, Adapter- und Effektorproteine mit einbezieht und schlussendlich zur Aktivierung der Zelle führt. Die hier vorgelegte Arbeit fasst die Ergebnisse dreier Studien zusammen, die sich mit verschiedenen Aspekten der Signaltransduktion und Regulation von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen befasst. Im ersten Teil wurde der Einfluss eines konstitutiven Ca2+-Einstroms auf die TZR Signalkaskade und T-Zell Funktion untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einer Mutation im Ca2+-Sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) verwendet. Die erhöhte zytoplasmatische Ca2+-Konzentration veränderte das Phosphorylierungsmuster der Phospholipase (PL) Cγ1, ein Schlüsselenzym der Signalkaskade, nach Stimulation des TZRs. Die enzymatische Aktivität der PLCγ1 blieb hierbei jedoch unverändert. In der Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ oder bei Inhibition der Phosphatase Calcineurin war das Phosphorylierungsmuster hingegen wieder normal. Darüber hinaus zeigten die T Zellen nach Stimulation in vitro eine verringerte Produktion von Interleukinen des Th2-Typs (Interleukin-4, 5 und 13). Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Funktion des Adapterproteins growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in Thrombozyten, die unter Zuhilfenahme einer Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Knockout Mauslinie untersucht wurde. Hierbei zeigte es sich, dass der Verlust von Grb2 die Signaltransduktion von GPVI und des verwandten hemITAM-Rezeptors C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) schwer beeinträchtigt. Dies konnte auf eine mangelnde Stabilisierung des linker for activation of T cells (LAT) Signalosoms zurückgeführt werden und resultierte in einer verminderten Adhäsion, Aggregation, Ca2+-Mobilisierung und prokoagulatorischen Aktivität nach Aktivierung (hem)ITAM gekoppelter Rezeptoren in vitro. Im Gegensatz hierzu blieben die Signaltransduktionswege G-protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) und des Integrins αIIbβ3, die das LAT Signalosom nicht nutzen, unbeeinflusst. In in vivo Studien verursachte die beeinträchtigte (hem)ITAM Signaltransduktion eine verlängerte Blutungszeit der Mäuse, während die Entstehung von Thromben nur bei gleichzeitiger Hemmung von GPCR-Signalwegen (durch Acetylsalicylsäuregabe) vermindert war. Diese Ergebnisse etablieren Grb2 als ein wichtiges Adapterprotein in der Signaltransduktionskaskade von GPVI und CLEC-2. Schließlich wurde im dritten Teil dieser Arbeit die proteolytische Regulation des Rezeptors CD84, der ein immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM) enthält, untersucht. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass CD84 in Mausthrombozyten durch zwei verschiedene und unabhängige proteolytische Mechanismen geschnitten wird: Zum einen durch Shedding des extrazellulären Teils, was ausschließlich durch die a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 bewerkstelligt wird, und zum anderen durch das Schneiden des intrazellulären C Terminus durch die Protease Calpain. Des Weiteren zeigte eine Untersuchung von Plasmaproben transgener Mäuse, dass das Shedding von CD84 durch ADAM10 konstitutiv in vivo erfolgt. KW - Thrombozyt KW - T-Lymphozyt KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - Calcium KW - Platelet KW - Thrombose KW - T cell KW - receptor signaling KW - calcium KW - ITAM KW - Hämostase KW - Metalloproteinasen KW - Adapterprotein Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97114 ER - TY - THES A1 - Langenhorst, Daniela T1 - Induktion und Aktivierung regulatorischer T-Zellen durch superagonistische Stimulation des CD28 Moleküls T1 - Induction and activation of regulatory T-cells by superagonistic Stimulation of the CD28 molecule N2 - Regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine ntscheidende Rolle beim Erhalt der Immunhomöostase und bei der Kontrolle überschießender Immunantworten. Sie können anhand ihres Entstehungsortes in im Thymus generierte natürliche Tregs (nTregs) und in der Peripherie generierte induzierte Tregs (iTregs) unterteilt werden. Ihr Phänotyp wie auch ihre Funktion werden zu einem großen Teil durch den transkriptionellen Masterregulator Foxp3 kontrolliert. Das kostimulatorische Molekül CD28 wird von nTregs für die Differenzierung benötigt und von Tregs und konventionellen T-Zellen (Tkons) für ihre Aktivierung. Superagonistische CD28 spezifische monoklonale Antikörper (CD28SA) aktivieren T-Zellen im Gegensatz zu konventionellen anti-CD28 Antikörpern ohne zusätzliche Ligation des T-Zellrezeptors. Die in vivo Applikation des CD28SA bewirkt eine starke Aktivierung der Tregs und eine präferentielle Expansion der Tregs gegenüber Tkons. Dies erklärt die präventive und therapeutische Wirkung der CD28SA Behandlung in verschiedenen Krankheitsmodellen bei Nagern. Die erste Anwendung des humanisierten CD28SA TGN1412 führte in den Testpersonen jedoch zu einem unerwarteten „Cytokine-Release Syndrom“. Daher wurde hier am Mausmodell der Zusammenhang zwischen Treg Aktivierung und systemischer Zytokinausschüttung näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die CD28SA vermittelte Proliferation der T-Zellen abhängig vom CD28 Signal und von parakrinem Interleukin (IL)-2 ist. Durch die in vivo Depletion der Tregs vor der CD28SA Injektion wurde deutlich, dass es auch in Mäusen nach CD28SA Stimulation zu einer systemischen Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine kommt, die jedoch, im Gegensatz zum humanen System, von Tregs effektiv kontrolliert werden kann. Um die usschüttung pro-inflammatorischer Zytokine zu verhindern, wäre eine zusätzliche prophylaktische Behandlung mit Corticosteroiden möglich, da diese auch in hohen Dosen die CD28SA vermittelte Aktivierung und Expansion der Tregs nicht beeinflussen. Neben der Expansion wird durch die Stimulation mit CD28SA auch die Produktion des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 in Tregs induziert und so eine genauere Untersuchung des Ursprungs und des Schicksals IL-10 produzierender Tregs ermöglicht. Diese Tregs exprimieren im Vergleich zu IL-10 negativen Tregs ein höheres Niveau an Molekülen, die mit einer supprimierenden Aktivität verbunden sind. Zudem werden IL-10 Produzenten aufgrund der Veränderung im Expressionsmuster der Migrationsrezeptoren nach der Stimulation von einem lymphknotensuchenden CCR7+CCR5-CCR6- zu einem entzündungssuchenden CCR7-CCR5+CCR6+ Phänotyp verstärkt in Bereiche mit stattfindender Immunantwort rekrutiert. Schließlich sind IL-10 produzierende Tregs von CD28SA stimu2 lierten Mäusen in vitro stärker apoptoseanfällig als die IL-10 negativen Tregs. Die Aktivierung der Tregs scheint somit die terminale Differenzierung zu einem IL-10 produzierenden Effektorphänotyp mit begrenzter Lebensdauer zu induzieren. Dies führt auch zur Beendigung der Immunsuppression. Die Kombination aus schwachem TZR und starkem CD28 Signal, die die CD28SA Stimulation in naiven T-Zellen auslöst, induziert zumindest in vitro abhängig von IL-2 und TGFβ effizient die Expression von Foxp3. Die so generierten iTregs haben, ähnlich wie konventionell in vitro erzeugte iTregs, in Bezug auf die Expression von Oberflächenmolekülen und den Methylierungsstatus bestimmter Regionen des Foxp3 Gens einen Phänotyp, der zwischen dem von Tkons und Tregs liegt. Da auch die supprimierende Aktivität der iTregs geringer ist als die der ex vivo Tregs bedarf es einer weiteren Optimierung des Stimulationsprotokolls, um diese Zellen für therapeutische Zwecke verwenden zu können. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die superagonistische Stimulation des CD28 Moleküls ein vielseitig einsetzbares Instrument ist. Einerseits können durch die CD28SA Stimulation Tregs polyklonal aktiviert und für therapeutische Zwecke mobilisiert werden und andererseits kann die besondere Art der T-Zellstimulation auch dazu genutzt werden, neue Aspekte von nTregs und iTregs zu untersuchen. N2 - Regulatory T-cells (Tregs) are important to maintain immune homeostasis and to control overshooting immune responses. Depending on the place where they are generated Tregs can be divided into thymus-derived natural Tregs (nTregs) and peripheral-derived induced Tregs (iTregs). Their phenotype and function is controlled by the transcriptional masterregulator Foxp3. The costimulatory molecule CD28 is required for nTreg differentiation and for the activation of Tregs and conventional T-cells (Tcons). Superagonistic CD28 specific monoclonal antibodies (CD28SA) activate T-cells without additional T-cell receptor ligation in contrast to conventional anti-CD28 antibodies. In vivo CD28SA treatment induces strong Treg activation and preferential expansion of Tregs over Tcons. This explains the preventive and therapeutic effects of CD28SA in various rodent disease models. In contrast, a first-in-man trail of the human CD28SA TGN1412 resulted in an unexpected cytokine release syndrome. Thus, using the mouse system the relationship between Treg activation and systemic cytokine release was reinvestigated. It could be shown that CD28SA induced T-cell proliferation is dependent on the CD28 signal and on paracrine interleukin (IL)-2. In vivo depletion of Tregs prior CD28SA injection showed that in mice, too, CD28SA stimulation induces a systemic release of pro-inflammatory cytokines, but in contrast to humans, this can be effectively controlled by Tregs. To prevent the pro-inflammatory cytokine release an additional prophylactic treatment with corticosteroids might be feasible since even high doses of corticosteroids have no effect on CD28SA driven Treg activation and expansion. Beside expansion, CD28SA stimulation also induces the production of anti-inflammatory IL-10 in Tregs. This allows for examination of the origin and fate of IL-10 producing Tregs. In comparison to IL-10 negative Tregs, these cells express higher levels of molecules associated with suppressive activity. In addition IL-10 producers are preferentially recruited to sites of ongoing immune responses, as they shift their expression pattern of migration receptors after stimulation from a CCR7+CCR5-CCR6- lymph node-seeking to a CCR7-CCR5+CCR6+ inflammation-seeking phenotype. Finally, IL-10 producing Tregs of CD28SA stimulated mice are more apoptosis-prone in vitro than their IL-10 negative counterparts. Thus, activation of Tregs induces terminal differentiation towards an IL-10 producing effector phenotype with a limited life span. This also terminates the immune suppression. The special combination of weak TCR and strong CD28 signals following CD28SA stimulation of naïve T-cells can, at least in vitro and dependent on IL-2 and TGFβ, efficiently induce Foxp3 expression. The phenotype regarding expression of certain surface molecules and the methylation level of particular regulatory regions of the Foxp3 gene is similar in CD28SA and anti-CD3/ anti-CD28 (+ IL-2/TGFβ) induced iTregs, and shows properties of both Tcons and Tregs. Since the suppressive activity of these iTregs is also lower than that of ex vivo Tregs, further improvement of the stimulation protocol is needed before these cells could be used for therapeutic purposes. In conclusion, this study shows that superagonistic stimulation of CD28 molecules is a versatile tool. On the one hand CD28SA stimulation polyclonally activates Tregs and can be used as a therapeutic, on the other hand the special way of T-cell stimulation can also be utilized to investigate new aspects of nTregs and iTregs. KW - Antigen CD28 KW - regulatorische T-Zellen KW - CD28 Molekül KW - T-Zellaktivierung KW - CD28 Superagonist KW - T-Lymphozyt KW - Immunreaktion KW - Immunologie Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96700 ER - TY - THES A1 - Karunakaran, Mohindar Murugesh T1 - Evolution of Vγ9Vδ2 T-cells T1 - Die Evolution der Vγ9Vδ2 T-Zellen N2 - Human Vγ9Vδ2 T cells are the major subset of blood γδ T cells and account for 1-5% of blood T cells. Pyrophosphorylated metabolites of isoprenoid biosynthesis are recognized by human Vγ9Vδ2 T cells and are called as phosphoantigens (PAg). Isopentenyl pyrophosphate (IPP) and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP) are among the few well studied PAg. IPP is found in all organisms while HMBPP is a precursor of IPP found only in eubacteria, plants and apicomplexaen parasite. Interestingly, the PAg reactive Vγ9Vδ2 T cells are so far identified only in human and higher primates but not in rodents. Hence, Vγ9Vδ2 T cells are believed to be restricted to primates. With regard to PAg recognition, a Vγ9JP recombined TCRγ chain and certain CDR3 motifs of the TCR chain are mandatory. The BTN3A1 molecule is essential for a response to PAg. BTN3 is a trans-membrane protein belonging to butyrophilin family of proteins. Though BTN3A1 was found to be essential for PAg presentation, the exact molecular basis of PAg presentation still remains unclear. This thesis presents new data on the evolution of Vγ9Vδ2 TCR and its ligands (BTN3) as well as the genetic basis of PAg presentation to Vγ9Vδ2 TCR. The comprehensive analysis of genomic database sequences at NCBI and other public domain databases revealed for the first time that Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes emerged and co-evolved along with the placental mammals. Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes are scattered across mammalian species and not restricted to primates. But interestingly, all three genes are highly conserved between phylogenetically distinct species. Moreover, the distribution pattern of Vγ9, Vδ2 TCR genes and BTN3 genes suggests a functional association between these genes representing the TCR - ligand relationship. Alpaca (Vicugna pacos), a member of the camelid family, is one among the 6 candidate non-primate species which were found to possess functional Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes. From peripheral lymphocytes of alpaca, Vγ9 chain transcripts with a characteristic JP rearrangement and transcripts of Vδ2 chains with a CDR3 typical for PAg-reactive TCR were identified. The transduction of αβ TCR negative mouse thymoma BW cells with alpaca Vγ9 and Vδ2 TCR chains resulted in surface expression of the TCR complex as it was deduced from detection of cell surface expression of mouse CD3. Cross-linking of alpaca Vγ9Vδ2 TCR transductants with anti-CD3ε led to IL-2 production which confirmed that alpaca Vγ9 and Vδ2 TCR chains pair to form a functional TCR. Besides the conservation of human like Vγ9 and Vδ2 TCR chains, alpaca has conserved an orthologue for human BTN33A1 as well. Interestingly, the predicted PAg binding sites of human BTN3A1 was 100% conserved in deduced amino acid sequence of alpaca BTN3A1. All together alpaca is a promising candidate for further studies as it might have preserved Vγ9Vδ2 T cells to function in surveillance of stress and infections. This thesis also provides the sequence of Vγ9Vδ2 TCR of African green monkey (Chlorocebus aethiops), which was previously unknown. Moreover, our data indicates the lack of any species specific barrier which could hinder the PAg presentation by African monkey derived COS cells to human Vγ9Vδ2 TCR and vice versa of human cells to African green monkey Vγ9Vδ2 TCR which was in contradiction to previously reported findings. Apart from the above, the thesis also presents new data on the genetic basis of PAg presentation to Vγ9Vδ2 T cells, which revealed that human chromosome 6 is sufficient for the presentation of exogenous and endogenous PAg. By employing human/mouse somatic hybrids, we identified the role of human chromosome 6 in PAg presentation and in addition, we observed the lack of capacity of human chromosome 6 positive hybrids to activate Vγ9Vδ2 TCR transductants in the presence of the alkylamine sec-butylamine (SBA). Investigation of Chinese hamster ovary (CHO) cells containing the human chromosome 6 also yielded similar results. This suggests that aminobisphosphonates (zoledronate) and alkylamines employ different mechanisms for activation of Vγ9Vδ2 T cells although both have been described to act by inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase activity which is known to increase intracellular levels of the IPP. In conclusion, this thesis suggests that Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes controlling Vγ9Vδ2 TCR- ligand relationship emerged and co-evolved along with placental mammals; and also identified candidate non-primate species which could possess Vγ9Vδ2 T cells. Furthermore, it suggests alpaca as a promising non-primate species to investigate the physiological function of Vγ9Vδ2 T cells. With respect to PAg antigen presentation it was shown that chromosome 6 is essential and sufficient for exogenous and endogenous PAg presentation. Moreover, the alkylamine SBA and aminobisphosphonate zoledronate may engage different cellular mechanism to exert inhibition over IPP consumption. The thesis raises interesting questions which need to be addressed in future: 1) What are the environmental and evolutionary factors involved in preservation of Vγ9Vδ2 T cells only by few species? 2) What could be the functional nature and antigen recognition properties of such a conserved T cell subset? 3) What is the genetic and molecular basis of the differential capacity of human chromosome 6 bearing rodent-human hybridoma cells in activating Vγ9Vδ2 T cells in presence of SBA and aminobisphosphonates? N2 - Vγ9Vδ2 T Zellen stellen im Menschen die größte Population an γδ T Zellen im Blut dar. Ihr Anteil an den Blut-T Zellen beträgt 1-5%. Humane Vγ9Vδ2 T Zellen erkennen als Phosphoantigene (PAg) bezeichnete pyrophosphorylierte Metabolite der Isoprenoidbiosynthese wobei Isopentenylpyrophosphat (IPP) und (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphat (HMBPP) zu den wenigen gut erforschten PAg gehören. IPP ist in allen Organismen zu finden während HMBPP ein IPP Vorläufer ist, der nur in Eubakterien, Pflanzen und Apikomplexa vorkommt. Interessanterweise wurden PAg-reaktive Vγ9Vδ2 T Zellen bisher nur im Menschen und höheren Primaten gefunden, aber nicht in Nagern. Daher wurde angenommen, dass Vγ9Vδ2 T Zellen eine exklusiv in Primaten vorkommende Population darstellt. Hinsichtlich der PAg-Bindung sind TCR  Ketten mit einer Rekombination von Vγ9 und JP zwingend notwendig und bestimmte CDR3 Motive der V2 TCR Kette, wobei die Erkennung der PAg von der Präsenz des BTN3A1 Moleküls abhängt. BTN3 ist ein Transmembranprotein und gehört zur Butyrophilinfamilie. Obwohl gezeigt wurde, das BTN3A für die PAg-Präsentierung unerlässlich ist, ist deren molekularer Mechanismus noch immer unklar. Die vorgelegte Arbeit beinhaltet sowohl neue Daten über die Evolution des Vγ9Vδ2 TCR und dessen Liganden (BTN3), als auch über die genetischen Grundlagen der PAg-Präsentierung. Eine umfassende Analyse genomischer Datenbanksequenzen des NCBI sowie anderer öffentlicher Datenbanken zeigte erstmals, dass Vγ9, Vδ2 und BTN3 Gene zusammen mit den höheren Säugetieren (Placentalia) entstanden und sich gemeinsam weiter entwickelten. Vγ9, Vδ2 und BTN3 Gene existieren über die gesamten Placentalia verteilt und nicht allein in Primaten. Erstaunlicherweise sind alle drei Gene auch zwischen phylogenetisch unterschiedlichen Spezies hoch konserviert und das Verteilungsmuster von Vγ9, Vδ2 und BTN3 Genen lässt auf eine funktionale Verbindung dieser Gene schliessen, wie sie die TCR/Ligand Interaktion darstellt. Weitergehende Analysen resultierten in der Identifizierung von sechs möglichen Kandidatenspezies, die nicht zu den Primaten gehören und funktionelle Vγ9, Vδ2 und BTN3 Gene besitzen. Hierzu gehört auch das Alpaka (Vicugna pacos), ein Mitglied der Famile der Kamele. Aus periphären Alpakalymphozyten wurden TCR-γ-Kettentranskripte mit charakteristischem Vγ9JP Rearrangement sowie TCR-δ-Kettentranskripte mit für PAg-reaktive Zellen typischen CDR3 amplifiziert. Die Transduktion der Alpaka-Vγ9 und Vδ2 Ketten in die TCR-negativen Maus T-Zell Hybridomlinie BW resultierte in einer Oberflächenexpression des TCR Komplex wie aus der Zelloberflächenexpression von Maus CD3 geschlossen werde konnte. Die Aktivierung dieses TCR Komplexes mittels anti-CD3ε Antikörpern führte zur Produktion von IL-2 durch die TCR-Transduktante, was die funktionelle Paarung der Alpaka Vγ9 und Vδ2 TCR-Ketten bestätigte. Neben den Vγ9 und Vδ2 TCR-Kettengenen existiert im Alpakagenom ebenso ein konserviertes Ortholog des humanen BTN3. Interessanterweise sind die mutmaßlichen PAg-Bindungsstellen des humanen BTN3A1 in dessen abgeleiteter Aminosäuresequenz zu 100% konserviert. Diese Daten machen das Alpaka zu einen vielversprechenden Kandidaten für weitere Untersuchungen, da hier möglicherweise die Population der Vγ9Vδ2 Zellen in ihrer Funktion zur Überwachung von Stress und Infektionen erhalten geblieben ist. Ebenso liefert diese Arbeit die Sequenz des Vγ9Vδ2 TCR der Grünen Meerkatze (Chlorocebus aethiops), welche zuvor nicht bekannt war. Darüber hinaus wurde keine Speziesspezifität in der Präsentierung von PAg durch COS Zellen der Grünen Meerkatze für den humanen Vγ9Vδ2 TCR oder umgekehrt der Präsentierung von PAg durch Meerkatzenzellen für humane Vγ9Vδ2 TCRs gefunden, was im im Widerspruch zu bisher veröffentlichten Ergebnissen steht. Zudem liefert diese Arbeit auch neue Ergebnisse zur genetischen Grundlage der PAg- Präsentierung für die Vγ9Vδ2 T Zellen. Hier zeigte sich, dass das humane Chromosom 6 für die Präsentierung exogener sowie endogener PAg ausreicht. Durch die Generierung somatischer Mensch/Maus Hybride konnten wir die Rolle des humanen Chromosom 6 in der Phosphoantigenpräsentierung ermitteln und zudem beobachten, dass Chromosom 6 positive Hybride nicht in der Lage waren, Vγ9Vδ2 TCR Transduktanten in Anwesenheit des Alkylamins sec-Butylamin (SBA) zu aktivieren. Desweiteren brachten Versuche mit Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), die das humane Chromosom 6 enthielten, ähnliche Ergebnisse. Dies legt nahe, dass Aminobisphosphonate (Zoledronat) und Alkylamine unterschiedliche Mechanismen der Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen nutzen obwohl für beide beschrieben ist, dass sie durch Inhibition der Farnesylpyrophosphatsynthase wirken, die wiederum zum Anstieg des intrazellulären IPP-Spiegels führt. Zusammengefasst legt diese Arbeit die Co-Evolution der die Vγ9Vδ2 TCR/Ligand Interaktion kontrollierenden Vγ9, Vδ2 und BTN3 Gene in Placentalia nahe und identifiziert nicht den Primaten zugehörige Spezies als Kandidaten, die Vγ9Vδ2T Zellen besitzen könnten, von denen das Alpaka als vielversprechend für die Untersuchung der physiologischen Rolle von Vγ9Vδ2 T Zellen vorgeschlagen wird. Hinsichtlich der PAg-Präsentierung bestätigen die vorliegenden Ergebnisse, dass das humane Chromosom 6 zugleich nötig und ausreichend ist, endogene sowie exogene PAg zu präsentieren. Zudem könnten das Alkylamin SBA und Aminobiosphonat Zoledronat verschiedene Mechanismen zur Inhibierung des IPP Verbrauchs nutzen. Diese Ergebnisse werfen einige Fragen auf, die es in Zukunft zu beantworten gilt: 1) Was sind die Umwelt- und Evolutionsfaktoren, die dazu geführt haben, dass Vγ9Vδ2 T Zellen nur in wenigen Spezies erhalten blieben? 2) Was könnte die funktionale Natur und die Antigenbindungseigenschaften einer solchen konservierten T Zell Population sein? 3) Was ist die genetische und molekulare Grundlage für die unterschiedliche Fähigkeit von das humane Chromosom 6 tragenden Mensch-Nager Hybridomazellen, Vγ9Vδ2 T Zellen in Anwesenheit von SBA und Aminobisphosphonaten zu aktivieren? KW - Evolution KW - γδ T cells KW - Vγ9Vδ2 T cells KW - Alpaca KW - Chromosome 6 KW - BTN3A1 and Phospho-antigen presentation KW - T-Lymphozyt KW - Chromosom 6 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99871 ER - TY - THES A1 - Weirather, Johannes T1 - Role of CD4+ T lymphocytes in cardiac wound healing and remodeling after experimental myocardial infarction in mice T1 - Die Bedeutung von CD4+ T-Lymphozyten für die kardiale Wundheilung und Remodeling nach experimentellem Herzinfarkt im Mausmodell N2 - Cardiac healing after myocardial infarction (MI) represents the cardinal prerequisite for proper replacement of the irreversibly injured myocardium. In contrast to innate immunity, the functional role of adaptive immunity in postinfarction healing has not been systematically addressed. The present study focused on the influence of CD4+ T lymphocytes on wound healing and cardiac remodeling after experimental myocardial infarction in mice. Both conventional and Foxp3+ regulatory CD4+ T cells (Treg cells) became activated in heart draining lymph nodes after MI and accumulated in the infarcted myocardium. T cell activation was strictly antigen-dependant as T cell receptor-transgenic OT-II mice in which CD4+ T cells exhibit a highly limited T cell receptor repertoire did not expand in heart-draining lymph nodes post-MI. Both OT-II and major histocompatibility complex class II-deficient mice lacking a CD4+ T cell compartment showed a fatal clinical postinfarction outcome characterized by disturbed scar tissue construction that resulted in impaired survival due to a prevalence of left-ventricular ruptures. To assess the contribution of anti-inflammatory Treg cells on wound healing after MI, the Treg cell compartment was depleted using DEREG mice that specifically express the human diphtheria toxin receptor in Foxp3-positive cells, resulting in Treg cell ablation after diphtheria toxin administration. In a parallel line of experiments, a second model of anti-CD25 antibody-mediated Treg cell immuno-depletion was used. Treg cell ablation prior to MI resulted in adverse postinfarction left-ventricular dilatation associated with cardiac deterioration. Mechanistically, Treg cell depletion resulted in an increased recruitment of pro-inflammatory neutrophils and Ly-6Chigh monocytes into the healing myocardium. Furthermore, Treg cell-ablated mice exhibited an adverse activation of conventional non-regulatory CD4+ and CD8+ T cells that showed a reinforced infiltration into the infarct zone. Increased synthesis of TNFα and IFNγ by conventional CD4+ and CD8+ T cells in hearts of Treg cell-depleted mice provoked an M1-like macrophage polarization characterized by heightened expression of healing-compromising induced NO synthase, in line with a reduced synthesis of healing-promoting transglutaminase factor XIII (FXIII), osteopontin (OPN) and transforming growth factor beta 1 (TGFβ1). Therapeutic Treg cell activation by a superagonistic anti-CD28 monoclonal antibody stimulated Treg cell accumulation in the infarct zone and led to an increased expression of mediators inducing an M2-like macrophage polarization state, i.e. interleukin-10, interleukin-13 and TGFβ1. M2-like macrophage differentiation in the healing infarct was associated with heightened expression of scar-forming procollagens as well as scar-stabilizing FXIII and OPN, resulting in improved survival due to a reduced incidence of left-ventricular ruptures. Therapeutic Treg cell activation and the induction of a beneficial M2-like macrophage polarization was further achieved by employing a treatment modality of high clinical potential, i.e. by therapeutic administration of IL-2/ anti-IL-2 monoclonal antibody complexes. The findings of the present study suggest that therapeutic Treg cell activation and the resulting improvement of healing may represent a suitable strategy to attenuate adverse infarct expansion, left-ventricular remodeling, or infarct ruptures in patients with MI. N2 - Die kardiale Wundheilung nach einem Herzinfarkt ist unabdingbare Voraussetzung um das unwideruflich beschädigte Myokard zu ersetzen. Im Gegensatz zur Rolle der angeborenen Immunität ist zur Bedeutung der adaptiven Immunität für die kardiale Wundheilung nur wenig bekannt. Im Fokus der Studie stand deshalb die Rolle von CD4+ T-Zellen bei der Wundheilung und kardialem Remodeling nach einem experimentellen Herzinfarkt im Mausmodell. Sowohl konventionelle, als auch Foxp3-positive regulatorische CD4+ T Zellen (Treg-Zellen) wurden im Lymphknoten infarzierter Tiere aktiviert und akkumulierten im Infarktareal. Die Aktivierung von CD4+ T Zellen nach MI setzte die Erkennung von Selbstantigenen voraus, da OT-II Tiere, die ein stark eingeschränktes T-Zell-Rezeptor-Repertoire aufweisen, keine T-Zell-Aktivierung zeigten. Sowohl OT-II Tiere, als auch Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Knock-out Mäuse, die kein CD4+ T-Zell Kompartment aufweisen, zeigten einen fatalen klinischen Phänotyp, welcher durch eine gestörte Narbenbildung und damit verbunden einem verstärkten Auftreten linksventrikulärer Rupturen verbunden war. Um den Einfluss anti-inflammatorischer Treg-Zellen auf die kardiale Wundheilung nach Herzinfarkt zu untersuchen, wurde das Treg-Zell Kompartment vor MI Induktion depletiert. Hierzu wurden DEREG Mäuse verwendet, in denen Foxp3-positive Zellen den humanen Diphtherietoxin-Rezeptor exprimieren, sodass nach nach Diphtierietoxin-Applikation die Treg-Zellen spezifisch depletiert werden. In einer dazu parallel verlaufenden Versuchsreihe wurden die Treg-Zellen mittels anti-CD25 monoklonaler Antikörper depletiert. Die Depletion des Treg-Zell Kompartments 2 Tage vor MI Induktion bewirkte ein verschlechtertes links-ventrikuläres Remodeling und damit einhergehend eine signifikante Verschlechterung der Herzfunktion. Mechanistisch führte die Treg-Zell Depletion zu einer verstärkten Rekrutierung pro-inflammatorischer Ly-6Chigh Monozyten und neutrophilen Granulozyten ins Infarktareal. Die Depletion von Treg-Zellen war weiterhin mit einer adversen Aktivierung konventioneller CD4+ und CD8+ T-Zellen assoziiert, die eine verstärkte Infiltration ins infarzierte Myokard zeigten. Die erhöhte Synthese von TNFα und IFNγ in konventionellen T-Zellen führte zu einer M1-Makrophagen Polarisierung, welche durch eine verstärkte Expression der induzierbaren NO Synthase charakterisiert war. Weiterhin exprimierten diese M1 Makrophagen signifikant weniger der für eine geordnete Heilung essentiellen Faktoren Osteopontin, Transglutaminase Faktor XIII und transforming growth factor beta 1 (TGFβ1). Im Gegensatz zu den Depletionsversuchen führte die therapeutische Aktivierung der Treg-Zellen durch einen superagonistischen anti-CD28 monoklonalen Antikörper zu einer verstärkten Rekrutierung von Treg-Zellen ins Infarktareal und bewirkte eine erhöhte Synthese von Interleukin (IL)-10, IL-13 sowie TGFβ1. Die damit einhergehende M2 Makrophagenpolarisierung im Infarktareal war mit einer verstärkten Narbenbildung sowie der Synthese von Osteopontin und Transglutaminase Faktor XIII verbunden, welche sich stabilisierend auf die Narbenbildung auswirken. Folgerichtig zeigten die behandelten Tiere ein verbessertes Überleben aufgrund einer signifikant verringerten Inzidenz linksventrikulärer Rupturen. Alternativ zum superagonistischen anti-CD28 monoklonalen Antikörper wurde ein weiterer klinisch relevanter Ansatz zur therapeutischen Aktivierung von Treg-Zellen verfolgt. Durch die Applikation von IL-2/ anti-IL-2 Antikörper-Komplexen konnte ebenfalls eine M2 Makrophagenpolarisierung hervorgerufen werden, die mit einer verstärkten Narbenbildung einherging. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie deuten darauf hin, dass eine therapeutische Aktivierung von Treg-Zellen bei Infarktpatienten und die dadurch hervorgerufene Verbesserung der Wundheilung potentiell einen geeigneten Ansatz darstellt, durch welchen adverses linksventrikuläres Remodeling sowie Infarktrupturen verhindert werden können. KW - Antigen CD4 KW - T-Lymphozyt KW - Herzinfarkt KW - Wundheilung KW - wound healing KW - Foxp3+CD4+ regulatory T cell KW - myocardial infarction KW - macrophage KW - Maus KW - Myokardinfarkt KW - T-Zelle KW - Makrophagen KW - Heilung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107225 ER - TY - THES A1 - Hummel, Jonas Florian T1 - Hüllproteine endogener Retroviren interferieren mit der allostimulatorischen Aktivität dendritischer Zellen T1 - Human endogenous retrovirus envelope proteins target dendritic cells to modulate T-cell activation N2 - Das humane Genom besteht zu ungefähr 8 % aus humanen endogenen Retroviren (HERVs), jedoch sind viele aufgrund von Mutationen oder Deletionen nicht mehr funktionell. Trotzdem wurden funktionelle HERV-Proteine gefunden, welche offene Leserahmen (ORFs) besitzen und für funktionelle Hüll-Glykoproteine wie z.B. Syncytin-1, Syncytin-2 und HML-2 kodieren. Diese HERV-Hüllproteine beinhalten eine suppressive Domäne (SU) und induzieren möglicherweise eine Immunsuppression diverser Immunzellen während einer gesunden Schwangerschaft. In dieser Arbeit wurden spezifisch die modulatorischen Eigenschaften verschiedener HERVHüllproteine (Syncytin-1, -2 und HML-2) auf Immunzellen untersucht. Wir konnten zeigen, dass die HERV-Bindungsrezeptoren ASCT-1, -2 und MFSD2A auf der Oberfläche von T-Zellen und DCs exprimiert werden. Für funktionelle Experimente wurden HERV-Hüllproteine transgen in CHO-Zellen exprimiert, die als Effektorzellen in Ko-Kultur- Systemen verwendet wurden. Es konnte keine Hemmung der PMA/Ionomycin-stimulierten T-Zell-Proliferation durch die Effektorzellen gefunden werden. Darüber hinaus beeinträchtigten die Effektorzellen nicht die Expression von Reifungsmarkern auf DCs nach LPS-Aktivierung, induzierten jedoch die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine IL- 12 und TNF-α. Dagegen inhibierten die konstitutiv HERV-Hüllprotein-exprimierenden Chorionkarzinom-Zelllinien BeWo und JEG die PMA/Ionomycin-stimulierte T-Zell- Proliferation sehr effektiv. Die Chorionkarzinom-Zelllinien hatten ebenfalls keinen Einfluss auf die phänotypische LPS-DC-Reifung, modulierten aber die LPS-DC-Zytokin-Antwort sehr effektiv zu einem suppressiven Profil durch eine Inhibition der pro-inflammatorischen Zytokine IL-12 und TNF-α sowie einen Anstieg von anti-inflammatorischem IL-10. BeWound JEG-Zellen, aber auch HERV-Hüllprotein-exprimierende Effektorzellen verändern die durch LPS-DC-stimulierte allogene T-Zell-Proliferation. Dies war mit einer verringerten Bildung von DC/T-Zell-Konjugaten sowie mit einer Hemmung der IFN-γ-Sekretion und der Ca2+-Mobilisation dieser T-Zellen assoziiert. Des Weiteren wurden eine reduzierte p-Tyrosin- Akkumulation und kein Ausschluss des F-Aktin-Signals in der immunologischen Synapse, der Kontaktstelle dieser DC/T-Zell-Konjugate, gefunden. Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse vermuten, dass HERV-Hüllproteine die T-Zell- Proliferation nicht direkt beeinflussen, sich aber modulierend auf DCs auswirken und dadurch mit deren allogene T-Zell-Proliferation interferieren. N2 - Human endogenous retroviruses (HERVs) comprise about 8 % of the human genome but many are not functional due to mutations or deletions. However, some HERVs have been reported to harbor open reading frames (ORFs) and are coding for functional envelope (env) glycoproteins (Syncytin-1, Syncytin-2 and HML-2). These HERV env glycoproteins have suppressive domains (SU) and may modulate immune cells especially in the placenta where they are highly expressed. In this work, we investigated the ability of different HERV envs (Syncytin-1, -2 and HML-2) to modulate immune cell function. We showed that HERV binding receptors ASCT-1, -2 and MFSD2A are expressed by T-cells and DCs. For functional analysis, HERV envs were transiently expressed in CHO-cells which were then used as effector cells for co-culture assays. We demonstrated that HERV env expressing CHO effector cells did not significantly inhibit PMA/Ionomycin stimulated T-cell proliferation, and did not prevent phenotypic maturation of DCs in response to LPS. However, they did strongly augment the release of the pro-inflammatory cytokines IL-12 and TNF-α from LPS-DCs. In contrast, BeWo and JEG choriocarcinoma cell-lines constitutively expressing HERV env proteins reduced the T-cell proliferation very effectively. These celllines did not prevent phenotypic maturation of LPS-DCs, but shifted their cytokine response towards an immune suppressive profile by inhibiting the pro-inflammatory cytokines IL-12 and TNF-α and enhancing the release of the anti-inflammatory cytokine IL-10. The choriocarcinoma cell-lines and CHO effector cells inhibited the LPS-DC induced allogenic Tcell- proliferation. This was associated with a loss of DC/T-cell conjugate frequency as well as with an impairment of IFN-γ release and Ca2+ mobilization in T-cells. In addition, we observed an aberrant pattern of p-tyrosine and F-actin signal in the interface of these DC/Tcell conjugates. Altogether, these findings suggest that HERV proteins do not target T-cell activation directly, but modulate the DCs' ability to promote T-cell expansion. KW - Syncytin KW - dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - HERV KW - immunologische Synapse KW - DC/T-Zell-Konjugate KW - T-Zelle Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118964 ER - TY - THES A1 - Matuschek, Anja T1 - Characterization of tolerogenic rat bone marrow-derived dendritic cells and regulatory T cells T1 - Charakterisierung tolerogener dendritischer Knochenmarkszellen und regulatorischer T-Lymphozyten aus der Ratte N2 - Tolerogene Dendritische Zellen (DZ) und regulatorische T-Lymphozyten (Treg) verfügen über die Fähigkeit, destruktive Immunantworten zu verhindern. Die Hoffnung besteht, solche Zellen in naher Zukunft für therapeutische Zwecke einzusetzen, um z. B. Immunantworten nach Transplantation, aber auch bei Autoimmunität und Allergie antigenspezifisch zu supprimieren. Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Generierung solcher Zellen aufwendig und noch nicht für die klinische Routine geeignet. Zudem sind die Mechanismen noch wenig verstanden, wie diese Zellen eine gewünschte Immunhemmung in vivo auszulösen und wie der möglichen Gefahr einer zu starken Immunhemmung zu begegnen ist. Das Kleinnagermodell Ratte ist für die biomedizinische Forschung noch immer von großer Bedeutung, umso überraschender ist es, dass insbesondere tolerogene DZ und Treg in diesem Modell bisher nur unzureichend untersucht wurden. Das Ziel der Arbeit war deshalb, diese Immunzellen umfassend zu charakterisieren und ihre Funktion auf das Immunsystem zu untersuchen. Tolerogene DZ wurden mit GM-CSF und IL-4 aus Knochenmarkvorläuferzellen generiert (= IL-4 DC). Der Anteil an natürlich vorkommenden Treg mit einem Phänotyp CD4posCD25posFoxp3pos umfasst ca. 5-8% der peripheren naiven CD4pos TLymphozyten. Die Charakterisierung der IL-4 DC zeigte im Vergleich zu reifen DZ der Milz eine bis zu 26-fach geringere Expression von Oberflächenmolekülen wie MHC-Klasse II Molekül, CD80, CD86, ICAM-1 und CD25. Diese geringe Expression änderte sich auch nicht, wenn die Zellen verschiedensten Reifungssignalen wie das Replattieren,LPS, TNF-α und CD40L ausgesetzt wurden. IL-4 DC verfügen somit über einen robusten und gegenüber Reifungssignalen überaus resistenten Phänotyp. IL-4 DC nehmen Antigene durch Endozytose auf und sind unfähig, sowohl naive TLymphozyten zu aktivieren, als auch antigenspezifische T-Lymphozyten zu restimulieren. Zudem sind sie in der Lage, die Aktivierung naiver T-Lymphozyten und die Restimulierung antigenspezifischer T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ zu bzw. zu verzögern. Dabei verringerte sich die Proliferation der TLymphozyten um bis zu 95%. Diese Beeinflussung der Proliferation ist nach Zugabe der IL-4 DC bereits innerhalb von 24 Stunden zu messen. Die verringerte Aktivierung geht zu dem mit einer verringerten Zytokinausschüttung (IL-2 um 49% und IFN-γ um 92%) einher. Die inhibitorischen Eigenschaften der IL-4 DC scheinen aber nicht ausschließlich auf der verringerten Expression kostimulatorischer Moleküle zu beruhen. Der Nachweis der beiden inhibitorischen Oberflächenmoleküle PD-L1 und PD-L2 auf IL-4 DC lässt ebenfalls eine Bedeutung dieser Moleküle bei der Vermittlung inhibierender Signale vermuten. Auch die suppressive Wirkung löslicher Faktoren wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt. Überstände einer 24-stündigen Kultur mit einer Million IL-4 DC hemmten die Aktivierung naiver T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ um etwa 90%. Für diese Immunhemmung scheint das in diesen Überständen nachgewiesene Zytokin TGF-β (bis 300 pg/ml) verantwortlich zu sein. Im Vergleich dazu wiesen Überstände reifer Milz-DZ, die nicht die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmten, eine TGF-β Konzentrationen von bis 100 pg/ml auf. Im Gegensatz dazu scheint zelltoxisches Stickstoffmonoxid nur eine geringe Rolle bei der Inhibierung der T-Zellproliferation zu spielen. Die Zugabe des NO Synthase-Inhibitors NMMA verringerte zwar den Anteil an NO um ca. 50%, doch führte dies nicht zu einer Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten. IL-4 DC sind zwar nicht in der Lage, T-Lymphozyten zur Proliferation zu bringen, doch bedeutet dies nicht, dass keinerlei Veränderungen auf molekularer Ebene festzustellen wären. So sind T-Lymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC nicht in der Lage, in Gegenwart von reifen Milz-DZ zu proliferieren. Dieser anergische Zustand wurde nach Zugabe von IL-2 aufgehoben. Zudem können diese TLymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC die Aktivierung naïver TLymphozyten hemmen. Naïve und aktivierte T-Lymphozyten können dies nicht. Diese Beobachtung, die auf eine Induktion von Treg schließen lässt, wurde genauer untersucht. In der Tat zeigten durchflusszytometrische Analysen eine 1,6-fach verstärkte Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten aus natürlich vorkommenden Treg in Gegenwart von IL-4 DC. Dabei erfolgte die Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten unabhängig vom Reifegrad der DZ. So waren auch reife Milz-DZ dazu in der Lage, die Zahl der natürlich vorkommenden Treg zu erhöhen. Doch wiesen diese mit Milz-DZ inkubierten Treg einen verminderten inhibitorischen Effekt auf. Im Gegensatz dazu waren die mit IL-4 DC inkubierten Treg in der Lage die Aktivierung naiver T-Lymphozyten zu hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich das regulatorische Potential von DZ nicht ausschließlich vom Phänotyp bzw. ihrem Reifegrad ableiten lässt, sondern dass hierzu auch ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen sind. Die Induktion von Treg mit suppressiven Eigenschaften durch in vitro generierte tolerogene IL-4 DC könnte ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz darstellen. Vor einer klinischen Umsetzung sind aber noch weitergehende Untersuchungen notwendig, um das Zusammenspiel zwischen tolerogenen DZ und Treg zu verstehen, aber auch um die Auswirkungen eines Transfers großer Mengen regulatorischer Zellen auf das Immunsystem des Empfängers zu untersuchen. N2 - Tolerogenic dendritic cells (DC) and regulatory T (Treg) cells are able to prevent destructive immune responses. There is reason to hope that it may soon be possible to use DC and Treg cells to suppress immune responses antigen-specific, not only after transplantation, but also in the case of autoimmunity and allergy. At the moment, the generation of such cell types is very time-consuming and not suitable for clinical routine. In addition, it is not yet fully understood how these cells elicit a desired protective immune response in vivo and how the risks of an excessive immune suppression can be managed. The rat is one of the most important animal models in biomedical research. It is therefore surprising that tolerogenic DC and Treg cells in particular have not been more thoroughly investigated in this model. Thus, the aim of the present study was to systematically characterize these immune cells and investigate their impact on the immune system. Tolerogenic DC were generated from bone marrow precursors cultured with GM-CSF and IL-4 (= IL-4 DC). The proportion of naturally occurring Treg cells with a CD4posCD25posFoxp3pos phenotype comprises approximately 5-8% of the peripheral CD4pos T cells. The characterization of IL-4 DC revealed an up to 26-fold reduced expression of surface molecules such as MHC class II molecules, CD80, CD86, ICAM-1 and CD25 in comparison to mature splenic DC (S-DC). This low expression did not change when the cells where stimulated with different maturation-inducing signals such as replating, LPS, TNF- α and CD40L. Thus, these cells possess a robust phenotype resistant to maturation-inducing stimuli. IL-4 DC take up antigen via endocytosis and are not able to activate naïve T cells or to restimulate antigen-specific T cells. Furthermore, they are able to inhibit and prolongate mature S-DC induced T cell proliferation as well as mature S-DC induced restimulation of antigen-specific T cells, respectively. Thereby, the T cell proliferation was reduced up to 95%. This strong inhibitory effect was mediated within 24 hours in association with a reduced cytokine production (IL-2 about 49% and IFN-γ about 92%). The inhibitory properties of IL-4 DC don´t seem to be caused exclusively by the reduced expression of co-stimulatory molecules. In this study, the detection of the inhibitory molecules PD-L1 and PD-L2 on IL-4 DC suggests they have an impact on mediating inhibitory signals to the T cells. In addition, a suppressive effect of soluble factors was shown. The supernatant of one million IL-4 DC, collected after a 24 hour culture, suppressed mature S-DC induced proliferation of naïve T cells by about 90%. TGF-β, which was detected in the supernatant (up to 300 pg/ml), appears to be the causing soluble factor for this immune inhibition. By contrast, the supernatants of mature S-DC, which did not inhibit the activation of T cells, showed a TGF-β concentration of only about 100 pg/ml. The cytotoxic nitric oxide does not contribute to the IL-4 DC-mediated inhibition of T cell proliferation. The NO synthase inhibitor NMMA reduced the amount of NO by about 50%, but the decreased NO levels did not influence T cell proliferation. Indeed, IL-4 DC are not able to induce T cell proliferation, but this doesn´t mean that there is no change on the molecular level. For instance, T cells co-cultured with IL-4 DC during a first culture are not able to proliferate in the presence of mature S-DC during a second culture. This anergic-like state, however, could be abolished by adding exogenous IL-2. In addition, T cells co-cultured with IL-4 DC are able to inhibit the activation of naïve T cells. Naïve and activated T cells were not able to inhibit the mature S-DC induced T cell proliferation. This observation suggests the induction of Treg cells and was investigated in more detail. Indeed, flow cytometric analysis showed a 1.6-fold expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells from naturally occurring Treg cells in the presence of IL-4 DC. Thereby, the expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells occurs independently of the maturation state of DC. Both immature IL-4 DC as well as mature S-DC were able to expand the percentage of naturally occurring Treg cells. However, Treg cells pre-incubated with mature S-DC demonstrated a diminished inhibitory effect compared to Treg cells pre-incubated with IL-4 DC. Treg cells pre-incubated with IL-4 DC were able to inhibit the activation of naïve T cells. In this study it was shown that the regulatory potential of DC cannot be deduced solely by their phenotype or maturation state. Other factors, such as functional properties, need to taken into consideration, too. The induction of Treg cells with suppressive properties induced by in vitro generated tolerogenic IL-4 DC might provide an important mechanism for the maintenance of peripheral tolerance. However, for clinical application further investigation is necessary, not only to understand the interactions between tolerogenic DC and Treg cells, but also to investigate the impact of the transfer of a larger quantity of regulatory cells on the immune system of the recipient. KW - Dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Immuntoleranz KW - Allogene Zelle KW - Transforming Growth Factor beta KW - tolerogen KW - Dendritische Zelle KW - regulatorische T-Zellen KW - allogen KW - TGF-ß KW - tolerogenic KW - dendritic cell KW - regulatory T cells KW - allogenic KW - TGF-ß Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51708 ER - TY - THES A1 - Nerreter, Thomas T1 - Untersuchungen über den Einfluss des Tyrosinkinaseinhibitors Dasatinib auf die Funktion von T-Zellen und aus Monozyten generierten Dendritischen Zellen T1 - Studies on the effect of the tyrosine-kinase inhibitor dasatinib on function of T cells and monocyte-derived dendritc cells N2 - Kinasen der SRC-Familie (SFKs) sind sowohl in Wachstum und Metastasierung von Tumor- und Leukämiezellen als auch an prominenter Stelle in vielgestaltige Signalwege aller Immunzellen involviert. Eine Hemmung von SFKs ist damit ein vielversprechendes Mittel zur Therapie maligner Erkrankungen, kann aber darüber hinaus auch sehr effektiv zur Immunmodulation genutzt werden. Für den zur Therapie von CML und AML zugelassenen Tyrosinkinaseinhibitor (TKI) Dasatinib (Handelsname Sprycel®), für den unter anderem SFKs die Hauptziele darstellen, wurden, neben der antitumoralen Wirkung, sowohl immunsuppressive als auch immunstimulierende Effekte beschrieben. Aus diesem Grund könnte Dasatinib ein für die Modulation von Immunantworten sehr interessantes Hilfsmittel darstellen. In der vorliegenden Arbeit werden die hemmenden und fördernden Einflüsse von Dasatinib auf zwei Typen von Immunzellen genauer untersucht, um so die Auswirkungen einer Dasatinib-Behandlung auf Zellen des Immunsystems besser zu verstehen und sich das immunmodulatorische Potenzial von Dasatinib besser nutzbar machen zu können. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung möglicher kombinatorischer Effekte zwischen Dasatinib und dem Glucocorticoid Dexamethason auf verschiedene Subsets von T-Zellen vor dem Hintergrund eines potentiellen Einsatzes der Kombination bei der allogenen Hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) zur Separation von Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekten und der Graft-versus-host Disease (GvHD). Während keine kombinatorischen Effekte bei der Aktivierung von T-Zellen auftraten, ergaben sich bei der Untersuchung des Einflusses auf die Proliferation besonders in CD8+ T-Zellen additive Effekte durch die Kombination. Die Proliferation naiver T-Zell-Subsets wurde bereits durch die beiden Einzelsubstanzen alleine stark gehemmt. Dagegen waren Memory T-Zell-Subsets deutlich unempfindlicher, allerdings konnte durch eine Kombination von Dexamethason und Dasatinib auch die Proliferation dieser Memory Subsets effektiv gehemmt werden. Hierbei zeigten sich bei CD8+ Memory Subsets die deutlichsten synergistischen Effekte. Da eine Kombination in stärkerem Maße auch CD8+ gegenüber CD4+ Memory Subsets hemmt und diese Subsets unterschiedliche Rollen in der Induktion von GvL-Effekten und der Auslösung einer GvHD zu spielen scheinen, ist eine Steigerung der GvL-Effektivität durch die Medikamenten-Kombination bei gleichzeitiger Minimierung eines GvHD-Risikos in Zusammenhang mit anderen publizierten Ergebnissen durchaus denkbar. Weil eine starke Hemmung von virus-spezifischen T-Zellen nur bei sehr hohen Konzentrationen auftrat, ist zudem das Risiko einer Virus-Reaktivierung, die ein großes Problem bei einer HSCT darstellt, eher als gering einzuschätzen. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von Dasatinib auf aus Monozyten generierte Dendritische Zellen (moDCs) mit einem Fokus auf der Beeinflussung ihrer Migration. Während eine Behandlung mit Dasatinib nur sehr geringe Auswirkungen auf die Ausreifung der moDCs und die Expression von kostimulatorischen Molekülen hatte, führte eine Dasatinib-Behandlung zu einer Zeit- und Dosis-abhängigen Verringerung der Zytokinsekretion (IL-10 und IL-12). Im Gegensatz dazu hatte Dasatinib keinen Einfluss auf die phagozytotische Aktivität der moDCs und auf ihre Fähigkeit, Virus-spezifische T-Zell-Antworten auszulösen. Dasatinib zeigte dagegen einen deutlich steigernden Einfluss auf die Migration von moDCs gegen einen CCL19-Gradienten im Transwell-Assay, ohne die Expression des CCL19-Rezeptors CCR7 zu beeinflussen. Da ähnliche Migrations-steigernde Effekte auch bei einer Behandlung mit dem spezifischen SFK-Inhibitor SKI-1 auftraten, eine Behandlung mit Nilotinib, einem TKI der nicht auf SFKs wirkt, im Gegensatz dazu aber zu einer Hemmung der Migration führte, liegt es nahe dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über SFKs vermittelt wird. Dasatinib führte zu einer deutlichen Inhibierung der Phosphorylierung der inhibitorischen Immunrezeptoren Siglec-9 und Siglec-3 (CD33) ohne ihre Expressionslevel zu beeinflussen. Eine mit spezifischen Antikörpern durchgeführte Blockierung dieser Immunrezeptoren, deren ITIM-Domänen mutmaßlich von SFKs phosphoryliert werden, hatte eine deutliche Steigerung der Migration und eine verringerte Phosphorylierung von Siglec-9, Siglec-3 und SHP-2 zur Folge. Letztere ist eine Phosphatase, die nach Bindung an phosphorylierte ITIM-Domänen von Rezeptoren wie den Siglecs verschiedene Zielmoleküle dephosphoryliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über eine Hemmung von SFKs und daraus resultierend auf dem Wegfall eines inhibitorischen Signalwegs erfolgt. Diese Steigerung der Migration könnte in der Tumor-Therapie von großem Nutzen sein, da bei einer Vakzinierung mit autologen DCs, die mit Tumor-assoziierten Antigenen stimuliert wurden, die schlechte Einwanderung in die Lymphknoten eines der Hauptprobleme darstellt. Zur Überwindung dieses Problems könnte Dasatinib ein sehr effektives Hilfsmittel darstellen und die Therapie-Effizienz deutlich verbessern. Da Dasatinib aber auch eine ganze Reihe weiterer, sehr vielfältiger Einflüsse auf alle Arten von Immunzellen ausübt, scheint eine Verwendung spezifischer blockierender α-Siglec-Antikörper auf Grund geringerer Nebenwirkungen im Vergleich zu Dasatinib möglicherweise sogar noch deutlich besser geeignet zu sein, das Migrationsverhaltens Dendritischer Zellen positiv zu beeinflussen. Die Verwendung gegen Siglec-Rezeptoren gerichteter Antikörper als Adjuvantien könnte somit zu einem erfolgreicheren Einsatz der Vakzination mit Dendritischen Zellen in der Tumor-Therapie führen. N2 - SRC-family kinases (SFKs) are involved in growth and metastasis of tumor and leukemic cells as well as in manifold signaling pathways at prominent position in all types of immune cells. Inhibition of SFKs thereby represents a promising tool for the therapy of malignant diseases but can also be used quite effectively for immunomodulation. Besides its antitumoral activity, immune-suppressive as well as immune-stimulatory effects have been described for the tyrosine kinase inhibitor (TKI) dasatinib (trademark Sprycel®) which is approved for the treatment of CML and AML. Therefore the use of dasatinib could be a very interesting method for the modulation of immune responses. The present paper aimes to scrutinize the inhibitory and promoting effects of dasatinib on two types of immune cells to gain a better insight into the consequences of a dasatinib treatment in immune cells and to take advantage of the immunomodulatory potential of dasatinib. The first part of the paper deals with the investigation of potential combinatory effects between dasatinib and the glucocorticoid dexamethasone on various T cell subsets in the context of a potential use of the combination in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to dissect Graft-versus-leukemia (GvL) effects and Graft-versus-host Disease. While no combinatory effects regarding T cell activation occurred, the investigation of the influence on T cell proliferation revealed significant additive effects of the combination especially in CD8+ T cells. The proliferation of naïve T cell subsets was inhibited already by use of the single agents. In contrast, memory T cell subsets proved to be much more insensitive, but their proliferation was effectively hampered by a combination of dasatinib and dexamethasone whereas the most pronounced synergistic effects occurred in CD8+ memory subsets. Since the combination more potently inhibits also CD8+ in comparison to CD4+ Memory subsets and since these subsets seem to fulfill diverging roles in mediation of GvL effects and induction of GvHD, an increase in GvL efficacy by the drug combination while concurrently reducing the risk of a GvHD is conceivable, especially when including other published results. Moreover, as a potent inhibition of virus-specific T cells only occurred at very high concentrations, the risk of viral reactivations, which represent a major problem with HSCT, could be considered as rather marginal. The second part of the paper addresses the influence of dasatinib on monocyte-derived dendritic cells (moDCs) with a special focus on its influence on their migration. While dasatinib treatment exhibited only negligible effects on moDCs’ maturation and expression of costimulatory molecules, dasatinib led to a time- and dose-dependent reduction in cytokine secretion (IL-10 and IL-12). In contrast, dasatinib had no influence on phagocytotic activity of moDCs and on their ability to induce virus-specific T cell responses. Notably Dasatinib had a pronounced beneficial effect on migration of moDCs towards a CCL-19 gradient in a transwell assay without altering the expression of the CCL19 receptor CCR7. Since comparable migration-enhancing effects also occurred in presence of the specific SFK-inhibitor SKI-1 while the use of nilotinib, a TKI not inhibiting SFKs, in contrast led to an inhibition of migration, it can be assumed that dasatinib mediates its migration-enhancing effects via an inhibition of SFKs. Dasatinib treatment led to a dramatic decrease in phosphorylation of the inhibitory immunoreceptors Siglec-9 and Siglec-3 (CD33) without altering their expression levels. The use of specific antibodies for blocking of these immunoreceptors, whose ITIM domains are thought to be phosphorylated by SFKs, led to a powerful increase in migration and diminished phosphorylation of Siglec-9, Siglec-3 and SHP-2. The latter is a phosphatase which dephosphorylates target molecules after binding phosphorylated ITIM domains of receptors like the Siglecs. This paper’s results suggest that dasatinib mediates its migration-enhancing effects via inhibition of SFKs resulting in omission of an inhibitory signaling pathway. This enhancement of migratory capacity could be very useful in anti-tumor therapy as limited migration to the lymph nodes is one of the major problems when vaccinating with autologous dendritic cells that were stimulated with tumor-associated antigens. Dasatinib could be a potent mediator to overcome this problem and could lead to an improvement in the efficacy of therapy. Since dasatinib in addition also affects a broad range of processes in all immune cells, the use of specific α-Siglec blocking antibodies seems to be the more appropriate attempt to positively influence the migratory behavior of dendritic cells due to fewer side effects in comparison to dasatinib. Utilization of antibodies that target siglec receptors as adjuvants could lead to a more successful use of a vaccination with dendritic cells in tumor therapy. KW - Protein-Tyrosin-Kinasen KW - Dexamethason KW - T-Lymphozyt KW - Dendritische Zelle KW - Tyrosinkinaseinhibitor Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99477 ER - TY - THES A1 - Camara, Monika T1 - Die Rolle der CD8+ T Zellen in der Pathogenese der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis in der Lewis Ratte T1 - The role of CD8+ T cells in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats N2 - Multiple Sclerosis (MS) and its corresponding animal model Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) are autoimmune diseases of the central nervous system (CNS). Besides CD4+ T cells specific for myelin-derived antigens CD8+ T cells additionally contribute to the pathogenesis of that disease. However, the role of CD8+ T cells during the induction phase of the disease outside the CNS has not been clarified so far. Thus the contribution of CD8+ T cells to the immunopathogenesis of EAE in the Lewis rat was investigated in this work. For that purpose active EAE was induced in normal Lewis rats and animals that were deficient for CD8+ T cells due to the application of CD8-specific monoclonal antibodies. The CD8-depleted animals showed diminished disease activity in comparison to control rats. Equally, CD8-knockout rats, characterized by the absence of functional CD8+ T cells, developed clearly reduced symptoms of the disease in comparison to wild type littermates. Reduced disease activity of the CD8-deficient animals was accompanied by reduced infiltration of T cells and macrophages into the CNS. In the draining lymph nodes activated gpMBP-specific CD4+ T cells could be detected in the absence of CD8+ T cells, but they produced less amounts of proinflammatory cytokines like interferon-gamma than CD4+ T cells of normal rats. Obviously in the active EAE, myelin-specific CD4+ T cells are not able to differentiate completely into effector cells and invade the CNS upon absence of CD8+ T cells. In contrast fully differentiated encephalitogenic CD4+ effector cells equally potently induced EAE upon transfer into either normal or CD8-deficient rats. Hence, the pathogenic potential of completely differentiated CD4+ effector cells does not depend on the presence of CD8+ T cells. With the help of a rat-IFN-gamma ELISpot interferon-gamma-producing gpMBP-specific CD8+ T cells were detected in animals immunized with gpMBP. To directly detect gpMBP-specific CD8+ T cells, RT1.Al-Ig dimeres were generated and loaded with different gpMBP-derived peptides. Indeed, CD8+ T cells specifically recognizing RT1.Al-Ig dimeres loaded with gpMBP125-133 could be detected in the draining lymph nodes of rats, immunized with gpMBP in CFA. The results of this work allow the conclusion that in the EAE of the Lewis rat interferon--producing CD8+ T cells interact with myelin-specific CD4+ T cells, thus licensing these cells to differentiate into CNS invading effector cells. N2 - Die Multiple Sklerose (MS) und ihr Tiermodell, die Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), sind Autoimmunerkrankungen des Zentralen Nervensystems (ZNS). Neben myelinspezifischen CD4+ T-Zellen tragen auch CD8+ T-Zellen zur Pathogenese dieser Erkrankungen bei. Allerdings ist die Rolle der CD8+ T-Zellen während der Induktionsphase der Erkrankung außerhalb des ZNS noch unklar. In dieser Arbeit wurde daher der Beitrag der CD8+ T-Zellen in der EAE der Lewis-Ratte näher untersucht. Dazu wurde die Krankheitsaktivität der aktiven EAE in normalen Lewis-Ratten mit Tieren verglichen, in denen die CD8+ T-Zellen durch CD8-spezifische monoklonale Antikörper depletiert wurden. Die CD8-depletierten Tiere zeigten dabei eine verminderte Krankheitsaktivität im Vergleich zu den Kontrolltieren. Ebenso entwickelten CD8 knockout Ratten, die durch die Abwesenheit funktionsfähiger CD8+ T-Zellen gekennzeichnet sind, deutlich reduzierte Krankheitssymptome im Vergleich zu wildtypischen Tieren. Die reduzierte Krankheitsaktivität in den CD8-defizienten Tieren war von einer verminderten Infiltration von T-Zellen und Makrophagen in das ZNS begleitet. Zwar konnten aktivierte gpMBP-spezifische CD4+ T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten von CD8-depletierten Ratten detektiert werden, diese produzierten jedoch in deutlich reduziertem Umfang pro-inflammatorische Zytokine wie beispielsweise Interferon-. Offensichtlich können in der aktiven EAE myelinspezifische CD4+ T-Zellen in Abwesenheit von CD8+ T-Zellen nicht vollständig zu Effektorzellen differenzieren und infolgedessen das ZNS nicht infiltrieren. Umgekehrt konnten nach adoptivem Transfer von voll ausdifferenzierten enzephalitogenen CD4+ Effektorzellen sowohl in normalen als auch CD8-defizienten Empfängertieren gleich starke Symptome einer AT-EAE beobachtet werden. Die Entfaltung des pathogenen Potentials voll ausgereifter CD4+ Effektorzellen scheint somit nicht von der Präsenz von CD8+ T-Zellen abzuhängen. Mit Hilfe eines Ratten-IFN- ELISpots gelang erstmals die Detektion Interferon--produzierender gpMBP-spezifischer CD8+ T-Zellen in Tieren, die zuvor mit gpMBP immunisiert wurden. Zum direkten Nachweis von gpMBP-spezifischen CD8+ T-Zellen wurden RT1.Al-Ig Dimere generiert und mit verschiedenen gpMBP-Peptiden beladen. Tatsächlich konnten in den drainierenden Lymphknotenzellen von Ratten, die zuvor mit gpMBP in CFA immunisiert wurden, CD8+ T-Zellen detektiert werden, die gpMBP125-133-beladene RT1.Al-Ig Dimere erkennen. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen insgesamt den Schluss nahe, dass bei der EAE der Lewis-Ratte Interferon--produzierende CD8+ T-Zellen in der Peripherie mit myelinspezifischen CD4+ T-Zellen interagieren und damit deren Differenzierung zu ZNS-infiltrierenden Effektorzellen ermöglichen. KW - Multiple Sklerose KW - CD8+ T cells KW - Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) KW - Multiple Sclerosis KW - CD8+ T-Zellen KW - Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) KW - Multiple Sklerose KW - Encephalomyelitis KW - T-Lymphozyt KW - Ratte KW - EAE Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98497 PB - Journal of Neuroimmunology (2013) ER - TY - THES A1 - Rein, Alice Felicitas T1 - Identifizierung von durch PI3K-Inhibition induzierten Spleißvarianten in T-Zellen mittels Exon Array und die Effekte funktionell relevanter Gene auf T-Zell-Funktionen und Viabilität T1 - Identification of splice variants in response to PI3K inhibition in T cells using an Exon Array approach and effects of functional relevant genes on key T cell functions and viability N2 - Die Interaktion des Masernvirus mit T-Zellen stört die Aktivierung der TCR-Signalkaskade durch die Hemmung der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), die zur Einstellung der T-Zell-Funktionen führt und dadurch nachgeschaltete (downstream) Signalwege sowie den Eintritt in den Zellzyklus, aber auch die Genexpression reguliert. Infolgedessen können die Aktivität spleißregulatorischer Faktoren sowie die Spleißmuster von mRNAs verändert werden, wie zum Beispiel bei der alternativ gespleißten SHIP1-Isoform SIP110, die eine T-Zell-inhibitorische Aktivität zeigt. Um alternativ gespleißte (AS) und differentiell regulierte (RG) Transkripte in T-Zellen infolge von PI3K-Inhibition zu erfassen, wurde ein Human Exon 1.0 ST Array an RNA-Proben von humanen T-Zellen, 24 h stimuliert und stimuliert/ PI3K-inhibiert, durchgeführt. Durch die Anwendung geeigneter bioinformatischer Algorithmen konnten spezifisch in PI3K-inhibierten Zellen angereicherte Transkripte nachgewiesen und in die Kategorien AS (2192 Gene) und RG (619 Gene) eingeteilt werden. Ausgewählte Gene wurde mittels RT-PCR und qPCR validiert, gefolgt von der funktionellen Annotation beider Genlisten. AS Gene konnten verstärkt in ECM-Rezeptor Interaktionen, fokaler Adhäsion, Proliferation, Zytoskelettorganisation und Tumorsignalwegen gefunden werden, während RG Gene eher in der DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Stressantwort vertreten waren. Gene beider Gruppen konnten auf Signalwege bezogen werden, die essentiell für den TCR-Signalweg, die Zytoskelettdynamik und den Zellzykluseintritt waren. Das stützt die Annahme, dass die Außerkraftsetzung der PI3K-Schüsselprozesse der T-Zell-Aktivierung sowohl auf der Ebene der RG als auch der AS Gene wirkt. Über die Ingenuity Pathway Analyse konnten wir unsere Genlisten mit Genen vergleichen, die bereits auf solche Schlüsselprozesse und die Viabilität bezogen werden können. In der Überschneidung wurden z.B. die AS GTP-Austauschfaktoren Vav1 und Vav3 gefunden, die für die Übersetzung extrazellulärer Signale in Zytoskelettdynamik, Proteinphosphatasen und Adapter von Bedeutung sind. Ausgewählte Gene (AS - FBXO6 und LAT2, RG - SLFN5) wurden aus PI3K-arretierten T-Zellen kloniert und deren Effekt auf grundlegende zelluläre Funktionen durch Überexpression in HEK293T-Zellen überprüft. Die Fusionsproteine veränderten weder die Zellviabilität noch die Proliferation dieser Zellen. Über einen auf siRNA basierenden Knockdown wurde überprüft, ob das RG Gene SLFN5 als Suppressor auf die T-Zell-Aktivierung agiert. Der Knockdown in primären T-Zellen zeigte keinen Einfluss auf die Zellviabilität, Proliferation und Polarisation. Jedoch konnte ein signifikanter Effekt auf die T-Zell-Adhärenz auf Fibronektin gezeigt werden, was darauf schließen lässt, dass SLFN5 die T-Zell-Adhärenz negativ reguliert. Des Weiteren wurde die MV-induzierte Regulation selektierter Gene betrachtet und Unterschiede in der Regulation im Vergleich zur direkten PI3K-Inhibition festgestellt. Ein Grund dafür könnte sein, dass das MV eine Inhibition auf vielen Ebenen induziert, anstelle der alleinigen PI3K-Inhibition. Abschließend wurde untersucht, ob ausgewählte Gene an der Regulation in verschiedenen T-Zelllinien beteiligt sind und als Tumorsuppressoren agieren könnten. FBXO6 als Regulator der CHK1-Stabilität wurde in den meisten Zelllinien nicht exprimiert. Die Annahme, dass eine Stress-induzierte defekte Ubiquitinierungsmaschinerie an der Resistenz von Tumorzellen auf Chemotherapeutika beteiligt ist, macht FBXO6 zu einem interessanten Kandidaten als Biomarker für Tumorsensitivität gegenüber Krebsmedikamenten. Diese Annahme bedarf jedoch weiterer Untersuchungen. N2 - The interaction of measles virus (MV) with T cells interferes with the activation of the TCR-signaling by the inhibition of the phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K), leading to the termination of T cell functions and consequently to the regulation of downstream signaling as well as cell cycle entry. PI3K-inhibition also affects the activity of splice regulatory elements and the splicing pattern of mRNAs, as for example the alternatively spliced SHIP1 isoform SIP110 that shows T cell inhibitory activity. To integrate early alternatively spliced (AS) and differentially regulated (RG) transcripts in response to PI3K interference in T cells at a general level, we performed a Human Exon 1.0 ST Array analysis on RNAs isolated from human T cells PI3K-inhibited or not prior to 24h stimulation. Applying suitable bioinformatic algorithms, transcripts detected specifically in PI3K-inhibited cells were assigned to categories defining RG (619 genes) and AS species (2192 genes). A selection of genes was validated by RT-PCR and qPCR followed by functional annotation of both gene lists. AS genes were found to be enriched in ECM-receptor interactions, focal adhesion, proliferation, cytoskeleton organization and tumor signaling, while RG genes were rather related to processes as DNA-replication, DNA-repair and stress response. Some genes that belonged to both groups target pathways essential for TCR-signaling, cytoskeletal dynamics and cell cycle entry, strongly support the notion that PI3K abrogation interferes with key T cell activation processes at the level of differential regulation as well as alternative splicing. Using Ingenuity Pathway Analysis we compared our gene lists to genes already known to specifically relate to key T cell functions and viability. In the overlap we found for example AS GTP-exchange factors Vav1 and Vav3 important for translating extracellular signals into cytoskeletal dynamics, protein phosphatases and adaptors. Selected candidate genes (AS - FBXO6 und LAT2, RG - SLFN5) were cloned from PI3K-arrested T cells into the pEGFP-vector and tested by overexpression in HEK293T for their effect on basic cell functions. These fusion proteins did not affect viability and proliferation of these cells. Using siRNA-based knockdown the potential of the RG gene SLFN5 to act as suppressors of key steps in T cell activation was tested. Its knockdown in primary T cells did not affect cell viability, proliferation and polarization. However, T cell adherence on fibronectin was significantly enhanced indicating that SLFN5 negatively regulates T cell adhesion to the ECM. Additionally we had a look at the MV induced regulation of selected genes and found a difference of the regulation in comparison to direct PI3K-inhibition. A reason for these unexpected results could be that MV induces a multi-level inhibition, rather than PI3K-inhibition only. Finally we wanted to find out, if selected genes were also implicated in the regulation of different T cell lines and therefore could act as tumor suppressors. FBXO6, a regulator of CHK1 stability, for example was not expressed in most investigated cell lines. Assuming that a stress-induced defective ubiquitination complex is involved in the resistance of tumor cells to chemotherapeutic agents FBXO6 might be an interesting candidate as biomarker for tumor sensitivity to cancer medication. If some of these differences in regulation are the result of immortalization, corresponding genes could consequently act as tumor suppressor. This issue has to be subject to further research. KW - Phosphatidylinositolkinase KW - RNS-Spleißen KW - Masern KW - T-Lymphozyt KW - Exon Array KW - SLFN5 KW - FBXO6 KW - LAT2 KW - Funktionelle Annotation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103462 ER - TY - THES A1 - Li, Jian-Qiang T1 - Modulating the expression of enzymes of isoprenoid synthesis: effects on Vgamma9Vdelta2 T cell activation and tumor cell growth T1 - Modulation der Expression von Enzymen der Isoprenoidsynthese: Effekte auf die Vgamma9Vdelta2 T Zellaktivierung und das Tumorzellwachstum N2 - This study focuses on phosphoantigen specific Vg9Vd2 T cells which only exist in human and non-human primates. This population accounts for 1%-5% of peripheral blood T-lymphocytes but their frequency can rise to 50% of total blood T cells upon infection. Vg9Vd2 T cells can be activated by nonpeptide compounds with critical phosphate moieties which are termed as phosphoantigens. These include isopentenyl pyrophosphate (IPP), a key compound of isoprenoid synthesis in all organisms, and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), a direct precursor of IPP in DOXP pathway which only exist in eubacteria, plants, apicomplexaen parasites. Its activity as phosphoantigen is at least 1000 fold higher than that of IPP. However, direct structural evidence of phosphoantigen binding to the TCR is missing so far. Moreover, Vg9Vd2 T cells have potent anti-tumor activity e.g. against the B-cell lymphoma Daudi, whose Vg9Vd2 T cell activating properties have been suggested to result from sensing of abnormal intracellular IPP levels by the Vg9Vd2 TCR or Vg9Vd2 TCR binding to other postulated ligands such as an ectopically expressed F1-ATPase or UL-16 binding protein 4 (ULBP4). Aminobisphosphonates and alkymines were hypothesized to activate Vg9Vd2 T cells indirectly by inhibiting the IPP consuming enzyme farnysyl pyrophosphates synthesis (FPPS) although off target effects of these drugs or a direct interaction with the Vg9Vd2 TCR could not be excluded. This thesis presents new approaches for the mechanistic analysis of Vg9Vd2 T cell activation. By employing retroviral transduction of FPPS specific shRNA, it shows that specific shRNA reduces expression of FPPS and is sufficient to convert hematopoietic and non-hematopoietic tumor cell lines into Vg9Vd2 T cell activators. FPPS knockdown cells activated Vg9Vd2 T cells as measured by increased levels of CD69 and CD107a, kill of FPPS knockdown cells and induction of IFN-γ secretion. The IPP-synthesis-inhibiting drug mevastatin reduced Vg9Vd2 T cell activation by FPPS knockdown cells or aminobisphosphonate treated cells but not activation by the phosphoantigen bromohydrin pyrophosphate (BrHPP). A reduced growth of the FPPS knockdown cells has not been observed which is different to what has been reported for aminobisphosphonate treated cells. Finally, the human B-cell lymphoma RAJI has been transduced with Tetracyclin-inducible FPPS specific shRNA and proven to gain and loose the capacity to activate Vg9Vd2 TCR transductants upon doxycylin provision or removal. Another approach for the analysis of Vg9Vd2 T cell activation is Vg9Vd2 TCR transduced mouse cell lines with specificity for phosphoantigens. In contrast to the previously used Vg9Vd2 TCR transduced Jurkat cells, these cells do not present phosphoantigens, and are therefore specially suited for analysis of phosphoantigen presentation. The response of the new TCR transductants to presumed Vg9Vd2 TCR ligands/activators such as phosphoantigens, aminobisphosphonates or FPPS knockdown cells, depended strongly on the expression of a rat/mouse CD28 molecule by the transductants and its ligation by the (CD80) counter receptor on the ligand-presenting cell. The response is likely to reflect recognition of cognate Vg9Vd2 TCR antigens since mutations in the TCR-δ chain CDR2 and 3 abolished this response but activation by TCR or CD3 specific antibodies. A major difference between TCR transductants and primary gd T cells, was the lacking response of TCR transductants to Daudi or IPP. In addition their sensitivity to other soluble phosphoantigens was about 100 fold weaker than that of primary cells, stimulation of both cell type to CD80 expressing FPPS knock down or aminobisphosphonates was similar. Finally, the transductants have also been used to analyze effects of over-expression or knockdown of enzymes of isoprenoid synthesis such as 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase or HMGR), mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MVD), isopentenyl pyrophosphate isomerase (IDI), geranyl-geranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) but no clear effects have been found. In conclusion, this thesis supports the concept of Vg9Vd2 T cells being sensors of a dysregulated isoprenoid metabolism and established new tools to study ligand recognition and TCR mediated activation of this T cell population. These tools will be most useful to address following questions: 1) How does the dysregulation of isoprenoid metabolism affect tumor growth? 2) What is the correlation between the modulation of IPP levels and the Vg9Vd2 TCR binding or expression of other postulated ligands? 3) Are there any mevalonate pathway enzymes other than FPPS and HMGR, which play an important role in Vg9Vd2 T cells activation? 4) What is/are the putative phosphoantigen-presenting molecule(s)? N2 - Die vorliegende Arbeit widmet sich den phosphoantigenspezifischen Vg9Vd2 T Zellen, die nur im Menschen und nicht-humanen Primaten zu finden ist. Diese Population stellt 1-5% der peripheren Blut T-Zellen aber ihre Frequenz kann bei Infektionen auf bis zu 50% steigen. Vg9Vd2 T Zellen können durch nicht Peptid-Moleküle aktiviert werden, die sich durch eine essentielle Phosphatkomponente auszeichnen. Hierzu gehören das Isopentenyl-pyrophosphat (IPP), ein Schlüsselmolekül der Isoprenoidsynthese aller Organismen, sowie das bezüglich seiner gd T zellaktivierenden Eigenschaften mehr als 1000fach stärkere (E)-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP), dass der direkte Vorläufer des IPP im DOXP Stoffwechselweg ist, der nur bei Eubakterien, Pflanzen und apikomplexen Bakterien zu finden ist. Direkte strukturelle Belege für die Bindung von Phosphoantigenen an den gd TCR stehen jedoch aus. Darüber hinaus besitzen Vg9Vd2 T Zellen eine direkte gegen Tumoren wie das B-Zelllymphom Daudi gerichtete Aktivität, für deren Erklärung ein „Erspüren“ eines abnormal erhöhten intrazellulären IPP Spiegels durch den Vg9Vd2 TCR oder Bindung des Vg9Vd2 TCR an Liganden, wie einer ectopisch exprimierten F1-ATPase oder des UL-16 bindenden Proteins 4 (ULBP4) herangezogen wurde. Die Vg9Vd2 T Zell Aktivierung durch Aminobisphosphonate und Alkylamine wurde hingegen auf die Inhibition des IPP verbrauchenden Enzyms Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS) zurückgeführt, obgleich Wirkungen auf andere Moleküle oder eine direkte Bindung an den TCR nicht ausgeschlossen werden konnten. Die vorgelegte Dissertationsschrift beschreibt neue Ansätze der Analyse der Mechanismen der Vg9Vd2 T Zell Aktivierung. Sie zeigt, dass eine mittels retroviraler Transduktion von shRNA erzielte Reduktion der FPPS Expression ausreicht, um hematopoietische und nicht-hematopoietische Tumorzellen zu Vg9Vd2 T Zellaktivatoren zu machen. Die FPPS knockdown zellvermittelte Aktivierung der Vg9Vd2 T Zellen zeigte sich in erhöhter Expression von CD69, CD107a, Zytotoxizität gegen FPPS knockdown Zellen und Induktion der IFNg Sekretion. Die, die IPP-Synthese inhibierende Substanz Mevastatin, reduzierte die Vg9Vd2 T Zellaktivierung durch FPPS knockdown Zellen oder Aminobisphosphonat behandelte Zellen, aber nicht die Aktivierung durch das Phosphoantigen Bromhydrin Pyrophosphat. Ein vermindertes Wachstum der FPPS knockdown Zellen wurde nicht nachgewiesen was im Gegensatz zur Literatur über Aminobisphosphonat behandelte Zellen steht. Weiterhin wurde ein Tetracyclin-induzierbares FPPS spezifische shRNA kodierendes lentivirales Konstrukt in humane B-Zelllymphom Raji Zellen transduziert, die anschließlich die durch Zugabe bzw. Entfernung von doxycyclin gesteuerte Fähigkeit erhielten, Vg9Vd2 T Zellen zu aktivieren. Ein anderer Ansatz zur Analyse der Vg9Vd2 T-zellvermittelten Aktivierung war die Entwicklung phosphoantigenspezifischer Vg9Vd2 TCR transduzierter Mauszelllinien. Diese Zellen unterscheiden sich von den bisher benutzten humanen Vg9Vd2 TCR transduzierten Jurkat Zellen dadurch, dass sie keine Phosphoantigene präsentieren, und sind daher für Analyse der Phosphoantigenpräsentation besonders geeignet. Die Antwort der neuen TCR Transduktanten auf wahrscheinliche Vg9Vd2 TCR Zellliganden bzw. Vg9Vd2 T-Zellaktivatoren wie Phosphoantigene, Aminobisphosphonate oder FPPS knockdown Zellen hing im hohen Maße von der Expression eines Ratten/Maus CD28 Moleküls auf den Transduktanten und dessen Bindung an den (CD80) Gegenrezeptor auf der antigenpräsentierenden Zelle ab. Höchstwahrscheinlich reflektiert die Antwort auf eine spezifische Antigenerkennung, da Mutationen in den CDR2 und 3 der TCRd Kette die Antwort verschwinden ließen, aber keine Effekte auf die Stimulation durch CD3 oder TCR spezifische Antikörper hatten. Ein gravierender Unterschied der TCR-Transduktanten zu primären gd T Zellen lag auch darin, dass die TCR Transduktanten weder durch Daudi Zellen noch durch IPP stimuliert wurden und ihre Empfindlichkeit gegenüber löslichen Phosphoantigenen ungefähr 1000fach geringer als bei primären Vg9Vd2 T-Zellen war, während sich die Antwort der beiden Zelltypen auf FPPS knockdown oder Aminobisphosphonate-behandelte Zellen ähnelten. Schließlich wurden die Transduktanten verwendet, um Effekte der Überexpression oder des knockdown von Enzymen der Isoprenoidsynthese wie 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reduktase or HMGR), Mevalonat-5-Pyrophosphat decarboxylase (MVD), Isopentenyl Pyrophosphat Isomerase (IDI), Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase (GGPPS) zu analysieren, wobei keine eindeutigen Effekte beobachtet wurden. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die vorgelegte Arbeit die Vorstellung von Vg9Vd2 TCR Zellen als Sensoren eines entgleisten Isoprenoidstoffwechsel unterstützt und neue Werkzeuge zur Analyse der Ligandenerkennung und TCR vermittelten Aktivierung dieser Zellpopulation vorstellt. Diese Werkzeuge sollten bei der Beantwortung folgender Fragen helfen: 1) Wie beeinflusst die Fehlregulation des Isoprenoidstoffwechesle das Tumorwachstum. 2) Welche Korrelation besteht zwischen der Modulation der IPP Spiegel und der Vg9Vd2 TCR vermittelten Aktivierung bzw. der Expression anderer vorgeschlagener Vg9Vd2 Liganden. 3) Gibt es Enzyme außer der FPPS und der HMG-CoA Reduktase, die eine wichtige Rolle bei der Vg9Vd2 T-Zellaktivierung spielen und schließlich 4) Welche(s) Molekül(e) präsentiert bzw. präsentieren Phosphoantigene ? KW - Primaten KW - T-Lymphozyt KW - Tumorwachstum KW - Isoprenoide KW - Synthese KW - Vg9Vd2 T Zellaktivierung KW - Isoprenoidsynthese KW - Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS) KW - Aminobisphosphonat KW - Isopentenyl-pyrophosphat (IPP) KW - Vg9Vd2 T cell KW - Isoprenoid Synthesis KW - Farnesyl Pyrophosphate Synthase KW - Aminobisphosphonate KW - Isopentenyl pyrophosphate (IPP) Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46388 ER - TY - THES A1 - König, Anika T1 - The role of the transcriptional regulators NFATc1 and Blimp-1 in follicular T-cells T1 - Die Rolle der Transkriptionsregulatoren NFATc1 und Blimp-1 in follikulären T-Zellen N2 - The defense against invading pathogens is, amongst other things, mediated via the action of antibodies. Class-switched antibodies and antibodies of high affinity are produced by plasma cells descending from germinal center B (GCB) cells. GCB cells develop in the germinal center (GC), a specialized microstructure found in the B-cell follicle of secondary lymphoid organs. GCB-cell maturation and proliferation are supported by follicular T- helper (Tfh) cells. On the other hand, follicular regulatory T (Tfr) cells control this process in quantity and quality preventing, for instance, the formation of autoantibodies directed against endogenous structures. The development of GCB, Tfh and Tfr cells essentially depends on the migration into the GC, which is mediated via the expression of the chemokine receptor CXCR5. One transcription factor highly expressed in follicular T cells, comprising Tfh and Tfr cells, is NFATc1. Tfr cells additionally express the transcriptional repressor Blimp-1, which is not expressed in Tfh cells. We found that NFATc1 is transactivating Cxcr5 via response elements in the promoter and enhancer in vitro. Blimp-1 binds to the same elements, transactivating Cxcr5 expression in cooperation with NFATc1, whilst mediating Cxcr5- repression on its own. In Tfr cells Blimp-1 suppresses CXCR5 expression in the absence of NFATc1. Blimp-1 itself is necessary to restrict Tfr-cell frequencies and to mediate Tfr- cell function as in mice with Blimp-1-ablated Tregs high frequencies of Tfr cells do not reduce GCB- or Tfh cell frequencies. NFATc1 and Blimp-1 double deficient Tfr cells show additional loss of function, which becomes visible in clearly expanded antibody titers. To evaluate the function of NFATc1 in Tfr cells, we not only deleted it, but also overexpressed a constitutive active form of NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatory T cells (Tregs). The latter is leading to an upregulation of CXCR5 per cell, without changing Tfh or Tfr-cell frequencies. However, the high density of surface CXCR5 enhances the migration of Tfr cells deep into the GC, which results in a tighter control of the antigen- specific humoral immune response. Additionally, caNFATc1/aA increases the expression of genes coding for Tfr effector molecules like Il1rn, Il10, Tigit and Ctla4. Interestingly, this part of the transcriptional change is dependent on the presence of Blimp-1. Furthermore, Blimp-1 regulates the expression of multiple chemokine receptor genes on the background of caNFATc1/aA. In contrast, when caNFATc1/aA is overexpressed in all T cells, the frequencies of Tfh- and GCB cells are dominantly reduced. This effect seems to stem from the conventional T- cell (Tcon) side, most probably originating from increased secretion of interleukin-2 (IL- 2) via the caNFATc1/aA overexpressing Tcons. IL-2 is known to hinder the germinal center reaction (GCR) and it might in its abundance not be neutralizable by Tfr cells. Taken together, NFATc1 and Blimp-1 cooperate to control the migration of Tfr cells into the GC. Tfr cells in the GC depend on NFATc1 and Blimp-1 to perform their proper function. Overexpression of caNFATc1 in Tregs strengthens Tfr function in a Blimp-1-dependent manner, whilst overexpression of caNFATc1 in all T cells dominantly diminishes the GCR. N2 - Die Abwehr von Krankheitserregern durch das Immunsystem wird unter anderem (u.a.) durch die Wirkung von Antikörpern vermittelt. Antikörper, welche einen Klassenwechsel und eine hohe Affinität aufweisen, werden von Plasmazellen gebildet, welche sich von Keimzentrums-B (GCB) -Zellen ableiten. GCB-Zellen evolvieren innerhalb des Keimzentrums (GC), einer Mikrostruktur, welche sich innerhalb des B-Zellfollikels sekundärer lymphoider Organe bildet. Die GCB-Zell-Reifung und -Proliferation wird durch follikuläre T-Helfer (Tfh) -Zellen unterstützt und durch follikuläre regulatorische T (Tfr) -Zellen kontrolliert, wodurch u.a. die Bildung von Autoantikörpern, welche körpereigene Strukturen angreifen, unterbunden wird. Die Entwicklung von GCB-, Tfh- und Tfr-Zellen ist in entscheidender Weise abhängig von der Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 und der damit verbundenen Migration in das GC. NFATc1 ist ein Transkriptionsfaktor, welcher in follikulären T-Zellen, bestehend aus Tfh- und Tfr-Zellen, stark exprimiert wird. Im Gegensatz zu Tfh-Zellen exprimieren Tfr-Zellen zusätzlich den Transkriptionsrepressor Blimp-1. Wir haben herausgefunden, dass NFATc1 die Expression von Cxcr5 über die Bindung an Elemente innerhalb des Cxcr5-Promotors und -Enhancers in vitro transakiviert. Blimp-1 bindet an selbige Elemente und transaktiviert in Kooperation mit NFATc1 die Cxcr5-Expression, während es die Cxcr5- Expression alleine hemmt. In Tfr-Zellen supprimiert Blimp-1 die CXCR5-Expression in Abwesenheit von NFATc1. Blimp-1 beschränkt darüber hinaus das Vorkommen von Tfr-Zellen und spielt eine Rolle in der Effektorfunktion von Tfr-Zellen. Dies wird deutlich da das verstärkte Tfr-Zell-Vorkommen in Mäusen mit Blimp-1 defizienten Tregs nicht zu einer Reduktion der GCB-oder Tfh-Zellen führt. Der Verlust der Effektorfunktion akkumuliert in NFATc1 und Blimp-1 doppel-defizienten Tfr-Zellen, was sich in einem deutlichen Anstieg der Antikörpertiter im Serum immunisierter Tiere zeigt. Zur Überprüfung der Funktion von NFATc1 in Tfr-Zellen untersuchten wir sowohl dessen Deletion, als auch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form von NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatorischen T-Zellen (Tregs). Letztere steigert die CXCR5- Expression pro Zelle ohne das Vorkommen von Tfh- oder Tfr-Zellen zu verändern. Jedoch führte die erhöhte Oberflächenexpression von CXCR5 zu einer verstärkten Migration der Tfr-Zellen in das GC, was in einer verstärkten Kontrolle der antigenspezifischen Antikörpertiter resultierte. Darüber hinaus erhöht caNFATc1/aA in Abhängigkeit von Blimp-1, die Expression der Gene Il1rn, Il10, Tigit und Ctla4, welche mit der Effektorfunktion von Tfr-Zellen assoziiert werden. Blimp-1 wirkt auf dem Hintergrund der Überexpression von NFATc1 vor allem regulierend auf die Expression von Chemokinrezeptorgenen. Im Gegensatz zur Überexpression von caNFATc1/aA in Tregs allein, führt selbige Veränderung in allen T-Zellen zu einer deutlichen Reduktion des Vorkommens von Tfh- und GCB-Zellen nach Immunisierung. Dieser Effekt scheint durch konventionelle T-Zellen (Tcons) vermittelt zu sein und entsteht vermutlich durch eine erhöhte Sekretion von Interleukin-2 (IL-2) durch die caNFATc1/aA überexprimierenden Tcons. Dieses IL-2 scheint in seiner Menge nicht durch die vorliegenden Tfr-Zellen neutralisierbar zu sein und die Keimzentrumsreaktion (GCR) zu hemmen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass NFATc1 und Blimp-1 kooperieren, um die Migration von Tfr-Zellen in das GC zu kontrollieren. Tfr-Zellen im GC sind in der Erfüllung ihrer ordnungsgemäßen Funktion abhängig von NFATc1 und Blimp-1. Die Überexpression von caNFATc1 in Tregs stärkt die Funktion von Tfr-Zellen in einer Blimp-1-abhängigen Weise, während die Überexpression von caNFATc1 in allen T-Zellen die GCR extrem minimiert. KW - Signaltransduktion KW - NFATc1 KW - follikuläre regulatorische T-Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Blimp-1 KW - CXCR5 KW - germinal center KW - follicular regulatory T cell KW - Keimzentrumsreaktion KW - Zellmigration KW - Immunisierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209727 ER - TY - THES A1 - Gulde, Tobias Simon T1 - Die molekulare Grundlage für die höhere Sensitivität regulatorischer CD4\(^+\) T-Zellen im Vergleich zu konventionellen CD4\(^+\) T-Zellen gegenüber der Stimulation mit CD28 Superagonisten T1 - The molecular basis for the higher sensitivity of regulatory CD4\(^+\) T cells as compared to conventional CD4\(^+\) T cells to CD28 superagonistic stimulation N2 - In Ratten und Mäusen aktiviert der superagonistische anti-CD28 monoklonale Antikörper (CD28SA) vorzugsweise regulatorische T-Zellen. In niedriger Dosierung führt CD28SA zu einer fast ausschließlichen Aktivierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs). Diese Beobachtung konnte inzwischen auch für menschliche Zellen in Zellkultur bestätigt werden. In gesunden und freiwilligen Testpersonen deutet die Zytokin-Antwort nach Applikationen von niedrigen CD28SA-Dosen darauf hin, dass sich diese Beobachtung auch in-vivo bewahrheitet. Eine Gabe von CD28SA in niedriger Dosierung, die zu einer exklusiven Aktivierung von regulatorischen T-Zellen führt, könnte somit in der Behandlung von Autoimmunkrankheiten oder von entzündlichen Erkrankungen eingesetzt werden. Eine mechanistische Erklärung für dieses Phänomen blieb lange Zeit unklar. Die CD28SA-vermittelte T-Zell-Aktivierung ist abhängig von der Verstärkung von basalen tonischen Signalen, die T-Zellen über ihren T-Zell-Rezeptor erhalten. Diese Tatsache führte zu der Hypothese, dass die schwachen, tonischen Signale, die konventionelle CD4+ T-Zellen in Abwesenheit ihrer spezifischen Antigene über den T-Zell-Rezeptor erhalten, ein stärkeres CD28 Signal für ihre Aktivierung benötigen als die selbstreaktiven regulatorischen T-Zellen, die ein stärkeres Selbstpeptid-TCR Signal erhalten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Blockade von MHC-Klasse-II-Molekülen in Mäusen, in-vitro und in-vivo, den Vorteil der regulatorischen T-Zellen gegenüber den konventionellen T-Zellen bezüglich der Antwort auf niedrige CD28SA Dosierungen, aufhebt. N2 - In rats and mice, CD28 superagonistic mAb (CD28SA) preferentially activate regulatory T-cells, resulting in near exclusive Treg activation at low CD28SA doses. This observation has recently also been extended to cell culture studies in humans, and the cytokine response of healthy volunteers to low-dose CD28SA application suggests that it also holds true in vivo, and thus can be utilized for the treatment of autoimmune and inflammatory diseases. A mechanistic explanation for this phenomenon, however, remained uncertain for a long time. Given that CD28SA-mediated T-cell activation depends on the amplification of basal tonic TCR signals, the hypothesis was tested that the weak tonic TCR signals received by conventional CD4 T-cells in absence of their cognate antigen require more CD28 signalling input than the stronger TCR signals perceived by self-reactive regulatory T-cells. The experiments of this thesis provide strong evidence that in mice, blockade of MHC class II in vitro or in vivo abrogates the advantage of Treg over Tconv in the response to low CD28SA doses. KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Antigen CD28 KW - Immunologie KW - T-Lymphozyt KW - regulatorische T Zellen KW - CD28 Superagonisten KW - konventionelle CD4 T Zellen KW - T Zellen KW - regulatory t cells KW - cd28 superagonists KW - CD4 positiv T cells KW - t cells Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-283962 ER - TY - THES A1 - Uehlein, Sabrina T1 - Expression und Funktion von CD28 im Schwein T1 - Expression and function of CD28 in pigs N2 - Trotz zahlreicher Fortschritte im Verständnis der Funktionsweise des kostimulatorischen Rezeptors CD28 in Mensch, Maus, Ratte und Makake ist nach wie vor wenig hierüber in Bezug auf das Tiermodell Schwein bekannt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Expression von CD28 in Schweine-T-Zellen sowie die Regulierbarkeit der T-Zellaktivierung durch anti-pCD28 mAb. Die Ergebnisse zeigen, dass hierbei vor allem CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert betrachtet werden müssen. Grundsätzlich unterscheiden sich die beiden T-Zellpopulationen in der CD28 mRNA Expression, im Expressionsverhältnis zwischen CD28 mRNA und Protein, sowie im proliferativen Ansprechen auf anti-pCD28mAb. So reagierten CD4+ im Vergleich zu CD8+ T-Zellen auf die kostimulatorische Inkubation mit anti-pCD28 mAb des Klons 3D11 sensibler. In direkt stimulatorischen Ansätzen zeigte sich, dass CD4+ und CD8+ T-Zellen durch unterschiedliche anti-pCD28 mAb differentiell angesprochen werden können. Eine superagonistische Funktion konnte für CD4+ T-Zell aktivierende anti-pCD28 mAb in den bisherigen Versuchen noch nicht beobachtet werden. Letzteres ist hierbei vor allem für den Transfer von vielversprechenden Therapiestrategien vom Kleintier- zum Großtiermodell auf dem Weg zur Entwicklung neuer Therapieoptionen für Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen mit starker proinflammatorischer Aktivität und dem Myokardinfarkt von Bedeutung. N2 - Even though tremendous progress has been made in clarifying the function of the costimulatory receptor CD28 in human, mouse, rat, and macaques, concerning pigs, an important large animal model, only little is still known about CD28 expression and function. Therefore, our work aimed at investigating the function and expression of CD28 in porcine T cells as well as the applicability of anti-pCD28 mAb as a tool to regulate T cell activation, specifically. Our results indicate that the two major T cell groups, CD4+ and CD8+, have to be considered separately. These cell populations differ in their level of pCD28 mRNA expression, their ratio of CD28 mRNA and protein expression as well as their proliferative responsiveness towards anti-pCD28 mAb. In costimulatory assays, CD4+ compared to CD8+ T cells showed higher sensitivity toward low concentrations of the anti-pCD28 mAb 3D11. Additionally, in direct stimulatory assays, CD4+ and CD8+ T cells can be specifically targeted by different anti-pCD28 mAb. With these assays, a superagonistic anti-pCD28 mAb could not been detected so far. With anti-pCD28 superagonist, promising therapeutic strategies developed in rodents could be tested in pigs as a large animal model, representing the next step on the way towards new therapeutic options for autoim-mune diseases, diseases with strong proinflammatory activity and myocardial infarction. KW - Antigen CD28 KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Monoklonaler Antikörper KW - T-Lymphozyt KW - Antigen CD3 KW - Kostimulation KW - CD4 T-Zellen KW - CD8 T-Zellen KW - Dynabeads KW - superagonistische Funktion Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-245512 ER - TY - THES A1 - Jarick [née Ottmüller], Katja Julika T1 - Migration of allogenic T cells in intestinal lymphoid structures during acute Graft-versus-Host Disease T1 - Migration allogener T-Zellen in intestinalen lymphoiden Strukturen während der akuten Graft-versus-Host Reaktion N2 - T cell infiltration into the intestine occurs after priming and activation in the mesenteric lymph nodes and Peyer’s patches and subsequent trafficking via the blood circulation. We hypothesized that additionally to the vascular trafficking route, a fraction of T cells in the Peyer’s patches directly migrate into the adjacent lamina propria of the small intestine. To test this hypothesis, we employed a mouse model of acute Graft-versus-Host Disease to study the direct T cell migration from the Peyer’s patches to the adjacent lamina propria. First, we analyzed the border of Peyer’s patches on histological sections and found that the Peyer’s patch is not enclosed by a capsule or basement membrane. Thus, the tissue architecture allows for direct access to the surrounding tissue. With whole-mount light sheet fluorescence microscopy we quantified a three-dimensional gradient of T cells around Peyer’s patches on day 2.5 and day 3 after transplantation. This gradient evened out at day 4 and day 6 when high numbers of T cells started to evenly infiltrate the intestine from the blood circulation. We confirmed that gradient-forming T cells around Peyer’s patches resided within the tissue parenchyma of the lamina propria and not inside lymphatic vessels. To positively prove that the recently activated donor T cells around Peyer’s patches have egressed directly from that patch, we established a protocol for intravital photoconversion of T cells inside Peyer’s patches. 12 h after photoconversion inside a single Peyer’s patch, photoconverted T cells resided only around this particular Peyer’s patch and not elsewhere in the small intestine. This indicated that the T cells did not infiltrate via the blood but migrated to the adjacent lamina propria of the small intestine. Dynamic intravital two-photon microscopy revealed that these T cells next to the Peyer’s patch migrated in a random pattern. This suggested that these cells did not follow a positive chemoattractive gradient once they had reached the lamina propria. Laser-capture microdissection combined with RNA sequencing of the mucosa near the Peyer’s patch identified a wide range of migration-promoting factors. These included chemokines, co-stimulatory receptors and migration-associated intracellular molecules, which are candidates to promote this direct migration from Peyer’s patches. Altogether, we demonstrate for the first time that additionally to the vascular trafficking route, a fraction of T cells migrates directly from the Peyer’s patch to the surrounding mucosa. This mechanism implies so far unrecognized regional specification of Peyer’s-patch-primed T cells. Our findings may impact treatment strategies to avoid intestinal inflammation or foster immunity after oral vaccination. N2 - T-Zell Infiltration in den Darm erfolgt nach Primen und Aktivierung in den mesenterialen Lymphknoten und Peyerschen Plaques durch Rezirkulation über die Blutbahn. Wir stellten die Hypothese auf, dass zusätzlich zur vaskulären Route ein Teil der T-Zellen im Peyerschen Plaque direkt in die angrenzende Lamina propria des Dünndarms wandert. Um diese Hypothese zu testen, setzten wir ein Mausmodell für eine akute Graft-versus-Host Reaktion ein, um die direkte Migration von T Zellen aus den Peyerschen Plaques in die angrenzende Lamina propria zu untersuchen. Zuerst analysierten wir die Randzonen um die Peyerschen Plaques mit histologischen Schnitten und konnten bestätigen, dass der Peyersche Plaque von keiner Kapsel oder Basalmembran umschlossen ist, sodass die Gewebearchitektur den direkten Zugang des umliegenden Gewebes zulässt. Mithilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie von Dünndarm-Komplettpräparaten quantifizierten wir einen dreidimensionalen T-Zell Gradienten um Peyersche Plaques an den Tagen 2,5 und 3 nach allogener Stammzelltransplantation. Dieser Gradient verschwand zwischen an Tag 4 und Tag 6, als eine hohe Anzahl an T-Zellen begann, den Darm gleichmäßig über die Blutbahn zu infiltrieren. Wir bestätigten, dass die Gradienten-bildenden T-Zellen im Gewebe der Lamina propria und nicht in lymphatischen Gefäßen saßen, um zirkulierende Zellen von der Gradientenbildung auszuschließen. Um direkt zu beweisen, dass die T-Zellen um dem Peyerschen Plaque unmittelbar aus diesem Plaque ausgewandert sind, haben wir ein Protokoll für intravitale Photokonversion von T-Zellen im Peyerschen Plaque etabliert. 12 h nach der Photokonversion in einem einzelnen Peyerschen Plaque befanden sich die T-Zellen nur um diesen bestimmten Plaque herum. Dies zeigt, dass die T-Zellen das Gewebe nicht über die Blutbahn infiltrierten, sondern direkt in die angrenzende Lamina propria des Dünndarms gewandert waren. Dynamische intravitale Zweiphotonenmikrokopie offenbarte, dass diese T-Zellen um den Peyerschen Plaque nach zufälligem Schema wanderten. Dies legte nahe, dass diese T-Zellen keinem positiven Chemokingradienten folgten, sobald sie die Lamina propria erreicht hatten. Laser-Mikrodissektion kombiniert mit RNA-Sequenzierung der Mukosa nahe des Peyerschen Plaques identifizierte eine große Auswahl an migrationsfördernden Faktoren. Hierunter waren Chemokine, kostimulatorische Rezeptoren und intrazelluläre migrationsassoziierte Moleküle, welche Kandidaten sind, diese direkte Migration aus den Peyerschen Plaques zu fördern. In dieser Arbeit zeigen wir erstmalig, dass zusätzlich zur vaskulären Route ein Teil der T Zellen direkt vom Peyerschen Plaque in die umliegende Mukosa wandert. Dieser Mechanismus impliziert bislang unerkannte regionale Spezialisierung von T Zellen, welche in Peyerschen Plaques aktiviert wurden. Diese neuen Befunde können zukünftige Behandlungsstrategien gegen intestinale Entzündungserkrankungen oder für Immunreaktionen nach oraler Impfung beeinflussen. KW - T-Lymphozyt KW - Graft-versus-host-disease KW - Darm KW - Zellmigration KW - Peyer's patch Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178758 ER - TY - THES A1 - Scheller, Lukas T1 - Migrationsfördernde Faktoren im intestinalen T-Zell-Homing während der akuten Graft-versus-Host Erkrankung T1 - Migration-promoting factors in the intestinal T-cell homing during acute graft-versus-host disease N2 - Die akute Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD), insbesondere die Darm GvHD, stellt weiterhin eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität nach allogener SZT dar. Aktivierte, alloreaktive Spender T-Zellen infiltrieren dabei über die Blutbahn die intestinale Lamina Propria. Erst kürzlich konnten wir zeigen, dass neben der vaskulären Migration ein Teil der Spender T-Zellen auch direkt aus den PP in die angrenzende Lamina Propria migrieren. Um Faktoren, die diese direkte Migration fördern, zu untersuchen und die direkt migrierenden T-Zellen genauer zu charakterisieren, verwendeten wir ein MHC-inkompatibles Mausmodell zur Induktion einer akuten GvHD. Durch RNA Sequenzierung und Massenspektrometrie lasermikrodissezierter Darmschleimhautproben konnte eine starke Expression der Chemokine CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4 und CCL5 während der akuten intestinalen GvHD aufgezeigt werden. Neben CCL4 und XCL1 wiesen verschiedene Faktoren der T-Zellaktivierung, wie CD3ζ, LAT, Lck und ZAP70, sowie Faktoren der zytoskelettalen Reorganisation, wie Dock2, Coro1α und Parvin-γ, eine vermehrte Expression insbesondere nahe der PP auf. Die Expression der migrationsfördernden Faktoren Coro1α und Parvin-γ in Spender T-Zellen nahe der PP konnte anschließend mittels histologischen Immunfluoreszenzfärbungen bestätigt werden. Durchflusszytometrische Analysen konnten weiterhin eine vermehrte Expression von CCR5, CCR9 und Intgerin α4β7 auf den vornehmlich Tbet+ Spender T-Zellen nahe der PP nachweisen. Funktionelle in vitro Migrationsversuche zeigten abschließend, dass in vivo aktivierte Spender T-Zellen eine gerichtete Migration in Richtung auf CXCL11 und zu späterem Zeitpunkt auch auf CCL4 vollziehen können. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die Bedeutung zahlreicher Chemokine für das sequenzielle T-Zell-Homing während der akuten intestinalen GvHD. Neben der insbesondere durch Faktoren der zytosekeletalen Reorganisation vermittelten amoeboiden Migration kann auch eine mesenchymale Fortbewegung über Faktoren wie CCR5, CCR9 und Integrin α4β7 die direkte Migration der T-Zellen fördern. Den direkt migrierenden vornehmlich TH1 polarisierten Zellen folgen weitere, CD27 und Integrin αLβ2 exprimierende, zytotoxische T-Zellen aus der Blutbahn. Die direkt migrierenden Zellen könnten als Initiator und Potentiator der intestinalen T-Zell Infiltration wirken und müssen für zukünftige therapeutische Strategien nicht nur der Darm GvHD, sondern der intestinalen Inflammation im Allgemeinen mitberücksichtigt werden. N2 - Acute graft-verus-host disease (GvHD), especially intestinal GvHD, remains one of the main causes of mortality and morbidity after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. In this process activated alloreactive donor T cells infiltrate the intestinal lamina propria via the bloodstream. Our group could recently show that besides the vascular migration route some donor T cells migrate directly from the Peyer’s patches into the adjacent lamina propria. To investigate factors that could promote such a direct migration, and to characterize these direct migrating T cells we applied a major mismatch mouse model to induce acute GvHD. Using RNA sequencing and mass spectrometry of lasermicrodissected lamina propria samples, we detected a strong upregulation of the chemokines CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4 and CCL5 during acute intestinal GvHD. Alongside CCL4 and XCL1, several factors of T cell activation, such as CD3ζ, LAT, Lck und ZAP70, as well as factors of cytoskeletal reorganization, such as Dock2, Coro1α und Parvin-γ, showed higher expression near the Peyer’s patches. Subsequently, we validated the expression of Coro1α and Parvin-γ on donor T cells near the Peyer’s patches with histological immunofluorescence stainings. Flow cytometry analysis further revealed high expression of CCR5, CCR9 and Intgerin α4β7 on the predominantly Tbet+ donor T cells near the Peyer’s patches. Conclusively, in vitro migration assays showed that in vivo activated donor T cells can directly migrate towards CXCL11 and subsequently also towards CCL4. The present study shows the relevance of several chemokines for the sequential T-cell homing during acute intestinal GvHD. Besides the amoeboid migration mode, which is particularly driven by cytoskeletal reorganization, a mesenchymal movement using factors, such as CCR5, CCR9 and Integrin α4β7, can promote the direct migration of donor T cells. The directly migrating cells, which are predominantly of a TH1 phenotype, are followed by cytotoxic T cells, expressing CD27 and Integrin αLβ2 (LFA-1), from the systemic circulation. Thus, these directly migrating cells may act like an initiator and potentiator for the intestinal T cell infiltration and must be considered for new therapeutic strategies not only of GvHD but of intestinal inflammation in general KW - T-Lymphozyt KW - Graft-versus-host-disease KW - Zellmigration KW - Peyersche Plaques KW - T-Zellmigration KW - Transplantat-Wirt-Reaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-292909 ER - TY - THES A1 - Cruz de Casas, Paulina T1 - Sphingolipids as modulators of T cell function T1 - Sphingolipide als Modulatoren der T-Zell-Funktion N2 - The immune system is responsible for the preservation of homeostasis whenever a given organism is exposed to distinct kinds of perturbations. Given the complexity of certain organisms like mammals, and the diverse types of challenges that they encounter (e.g. infection or disease), the immune system evolved to harbor a great variety of distinct immune cell populations with specialized functions. For instance, the family of T cells is sub-divided into conventional (Tconv) and unconventional T cells (UTCs). Tconv form part of the adaptive arm of the immune system and are comprised of αβ CD4+ or CD8+ cells that differentiate from naïve to effector and memory populations upon activation and are essential during infection and cancer. Furthermore, UTCs, which include γδ T cells, NKT and MAIT, are involved in innate and adaptive immune responses, due to their dual mode of activation, through cytokines (innate-like) or TCR (adaptive), and function. Despite our understanding of the basic functions of T cells in several contexts, a great number of open questions related to their basic biology remain. For instance, the mechanism behind the differentiation of naïve CD4+ and CD8+ T cells into effector and memory populations is not fully understood. Moreover, the exact function and relevance of distinct UTC subpopulations in a physiological context have not been fully clarified. Here, we investigated the factors mediating naïve CD8+ T cell differentiation into effector and memory cells. By using flow cytometry, mass spectrometry, enzymatic assays, and transgenic mouse models, we found that the membrane bound enzyme sphingomyelin-phosphodiesterase acid-like 3b (Smpdl3b) is crucial for the maintenance of memory CD8+ T cells. Our data show that the absence of Smpdl3b leads to diminished CD8+ T cell memory, and a loss of stem-like memory populations due to an aggravated contraction. Our scRNA-seq data suggest that Smpdl3b could be involved in clathrinmediated endocytosis through modulation of Huntingtin interacting protein 1 (Hip1) levels, likely regulating TCR-independent signaling events. Furthermore, in this study we explored the role of UTCs in lymph node-specific immune responses. By using transgenic mouse models for photolabeling, lymph node transplantation models, infection models and flow cytometry, we demonstrate that S1P regulates the migration of tissue-derived UTC from tissues to draining lymph nodes, resulting in heterogeneous immune responses mounted by lymph nodes draining different tissues. Moreover, our unbiased scRNAseq and single lineage-deficient mouse models analysis revealed that all UTC lineages (γδ T cells, NKT and MAIT) are organized in functional units, based on transcriptional homogeneity, shared microanatomical location and migratory behavior, and numerical and functional redundancy. Taken together, our studies describe additional cell intrinsic (Smpdl3b) and extrinsic (S1Pmediated migration) functions of sphingolipid metabolism modulating T cell biology. We propose the S1P/S1PR1/5 signaling axis as the potential survival pathway for Smpdl3b+ memory CD8+ T cells and UTCs, mainly in lymph nodes. Possibly, Smpdl3b regulates S1P/S1PR signaling by balancing ligandreceptor endocytosis, while UTCs migrate to lymph nodes during homeostasis to be exposed to specific levels of S1P that assure their maintenance. Our results are clinically relevant, since several drugs modulating the S1P/S1PR signaling axis or the levels of Smpdl3b are currently used to treat human diseases, such as multiple sclerosis and B cell-mediated diseases. We hope that our discoveries will inspire future studies focusing on sphingolipid metabolism in immune cell biology. N2 - Das Immunsystem ist für die Aufrechterhaltung der Homöostase verantwortlich, wenn ein bestimmter Organismus verschiedenen Arten von Störungen ausgesetzt ist. In Anbetracht der Komplexität bestimmter Organismen wie Säugetiere und der verschiedenen Arten von Störungen, denen sie ausgesetzt sein können (z. B. Infektionen oder Krankheiten), hat sich das Immunsystem so entwickelt, dass es eine große Vielfalt verschiedener Immunzellpopulationen mit spezialisierten Funktionen beherbergt. So wird beispielsweise die Familie der T-Zellen in konventionelle (Tconv) und unkonventionelle T-Zellen (UTC) unterteilt. Tconv sind Teil des adaptiven Arms des Immunsystems und bestehen aus αβ-CD4+- oder CD8+-Zellen, die sich bei der Aktivierung von naiven zu Effektor- und Gedächtnispopulationen differenzieren und bei Infektionen und Krebs eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus sind UTCs, zu denen γδ-T-Zellen, NKT und MAIT gehören, aufgrund ihrer dualen Aktivierungsweise durch Zytokine (angeboren) oder TCR (adaptiv) und ihrer Funktion an angeborenen und adaptiven Immunantworten beteiligt. Trotz unseres Verständnisses der grundlegenden Funktionen von T-Zellen in verschiedenen Zusammenhängen gibt es nach wie vor eine große Anzahl offener Fragen im Zusammenhang mit ihrer grundlegenden Biologie. So ist beispielsweise der Mechanismus der Differenzierung naiver CD4+ und CD8+ T-Zellen in Effektor- und Gedächtnispopulationen noch nicht ausreichend verstanden. Auch die genaue Funktion und Bedeutung der verschiedenen UTCSubpopulationen im physiologischen Kontext sind noch nicht vollständig geklärt. Wir haben die Faktoren untersucht, die die Differenzierung naiver CD8+ T-Zellen in Effektorund Gedächtniszellen vermitteln. Mithilfe von Durchflusszytometrie, Massenspektrometrie, enzymatischen Assays und transgenen Mausmodellen konnten wir feststellen, dass das membrangebundene Enzym Sphingomyelin-Phosphodiesterase acid-like 3b (Smpdl3b) für die Aufrechterhaltung der CD8+ T-Zell-Gedächtnisfunktion entscheidend ist. Unsere Daten zeigen, dass das Fehlen von Smpdl3b zu einer verminderten Anzahl and CD8+ T Gedächtniszellen durch eine verstärke Kontraktion sowie einem Verlust von stammzellartigen Gedächtnispopulationen führt. Unsere scRNAseq- Daten deuten jedoch darauf hin, dass Smpdl3b an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligt sein könnte, indem es die Spiegel des Huntingtin interacting protein 1 (Hip1) moduliert und wahrscheinlich TCR-unabhängige Signalereignisse reguliert. Darüber hinaus untersuchten wir in dieser Studie die Rolle von UTCs bei lymphknotenspezifischen Immunantworten. Mit Hilfe von transgenen Mausmodellen für Photolabeling, Lymphknotentransplantationsmodellen, Infektionsmodellen und Durchflusszytometrie konnten wir zeigen, dass S1P die Migration von UTCs aus dem Gewebe in die drainierenden Lymphknoten reguliert, was zu heterogenen Immunantworten in den Lymphknoten führt, die verschiedene Gewebe drainieren. Ausserdem ergab unsere Analyse von scRNA-seq-Daten, sowie Mausmodelle mit einer genetischen Defizienz einzelner UTC-Linien (γδ-T-Zellen, NKT und MAIT), dass diese zusammen in funktionellen Einheiten organisiert sind, die auf transkriptioneller Homogenität, gemeinsamer mikroanatomischer Lage und Migrationsverhalten sowie numerischer und funktioneller Redundanz basieren. Zusammengenommen beschreiben unsere Studien zusätzliche zellinterne (Smpdl3b) und - externe (S1P-vermittelte Migration) Funktionen des Sphingolipid-Stoffwechsels, welche die T-Zell- Biologie modulieren. Wir schlagen die S1P/S1PR1/5-Signalachse als potenziellen Überlebensweg für Smpdl3b+ Gedächtnis-CD8+-T-Zellen und UTCs ausschließlich in Lymphknoten vor. Möglicherweise reguliert Smpdl3b die S1P/S1PR-Signalübertragung, indem es die Endozytose des Liganden-Rezeptors reguliert. Dadurch könnte deren Exposition zu bestimmten S1P-Mengen in der Homöostase im Lymphknoten reguliert werden, die wiederum das Überleben der UTC steuern. Unsere Ergebnisse sind klinisch relevant, da mehrere Medikamente, die die S1P/S1PR-Signalachse oder die Smpdl3b- Konzentration modulieren, derzeit zur Behandlung menschlicher Krankheiten eingesetzt werden, z. B. bei Multipler Sklerose und B-Zell-vermittelten Krankheiten. Wir hoffen, dass unsere Entdeckungen zukünftige Studien anregen werden, die sich auf den Sphingolipid-Stoffwechsel in der Immunzellbiologie konzentrieren. KW - T-Lymphozyt KW - Infektion KW - Lymphknoten KW - Cytokine KW - Sphingolipide KW - CD8+ T cell differentiation KW - Unconventional T cells KW - Sphingolipid biology KW - Immunology Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-359698 ER - TY - THES A1 - Peña Mosca, María Josefina T1 - Local regulation of T-cell immunity in the intestinal mucosa T1 - Lokale Regulation der T-Zell-Immunität in der Darmschleimhaut N2 - After priming in Peyer's patches (PPs) and mesenteric lymph nodes (mLN) T- cells infiltrate the intestine through lymphatic draining and homing through the bloodstream. However, we found that in mouse models of acute graft-versus-host disease (GvHD), a subset of alloreactive T-cells directly migrates from PPs to the adjacent intestinal lamina propria (LP), bypassing the normal lymphatic drainage and vascular trafficking routes. Notably, this direct migration occurred in irradiated and unirradiated GvHD models, indicating that irradiation is not a prerequisite for this observed behavior. Next, we established a method termed serial intravascular staining (SIVS) in mouse models to systematically investigate the trafficking and migration of donor T- cells in the early stages of acute GvHD initiation. We found that the direct migration of T-cells from PPs to LP resulted in faster recruitment of cells after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). These directly migrating T-cells were found to be in an activated and proliferative state, exhibiting a TH1/TH17-like phenotype and producing cytokines such as IFN-γ and TNF-α. Furthermore, we observed that the directly migrating alloreactive T-cells expressed specific integrins (α4+, αE+) and chemokine receptors (CxCR3+, CCR5+, and CCR9+). Surprisingly, blocking these integrins and chemokine-coupled receptors did not hinder the direct migration of T- cells from PPs to LP, suggesting the involvement of alternative mechanisms. Previous experiments ruled out the involvement of S1PR1 and topographical features of macrophages, leading us to hypothesize that mediators of cytoskeleton reorganization, such as Coro1a, Dock2, or Cdc42, may play a role in this unique migration process. Additionally, we observed that directly migrating T-cells created a local inflammatory microenvironment, which attracts circulating T-cells. Histological analysis confirmed that alloreactive PPs-derived T-cells and bloodborne T-cells colocalized. We employed two experimental approaches, including either photoconversion of T-cells in PPs or direct transfer of activated T-cells into the vasculature, to demonstrate this colocalization. We hypothesize that cytokines released by migrating T-cells, such as IFN-γ and TNF-α, may play a role in recruiting T-cells from the vasculature, as inhibiting chemokine-coupled receptors did not impair recruitment. N2 - Nach der Priming-Phase in den Peyer-Plaques (PPs) und mesenterialen Lymphknoten (mLN) migrieren T-Zellen über die lymphatische Drainage und den Blutkreislauf die Darmschleimhaut. Allerdings haben wir festgestellt, dass in Mausmodellen der akuten Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD) eine Untergruppe alloreaktiver T-Zellen direkt von den Peyer-Plaques in das benachbarte intestinale Lamina propria (LP) migriert, ohne lymphatische Drainage- oder vaskuläre Transportwege zu nutzen. Bemerkenswert ist, dass diese direkte Migration sowohl in bestrahlten als auch in nicht bestrahlten GvHD-Modellen auftrat, was darauf hindeutet, dass Gewebeschaden durch ionisierende Strahlung keine Voraussetzung für dieses beobachtete T-Zell-Migrationsverhalten ist. Anschließend haben wir die Methode der "serielle intravaskulären Zellmarkierung" (SIVS) für Mausmodelle etabliert, um systematisch das Migrationsverhalten von alloreaktiven Spender-T-Zellen in den frühen Stadien der akuten GvHD-Initiierung zu untersuchen. Wir beobachteten, dass die direkte Migration von T-Zellen von PPs zu LP zu einer schnelleren Rekrutierung von Zellen nach allogener hämatopoetischer Zelltransplantation (allo-HCT) führte. Diese direkt migrierenden T-Zellen befanden sich in einem aktivierten und proliferativen Zustand, wiesen einen TH1-/TH17- ähnlichen Phänotyp auf und produzierten Zytokine wie IFN- γ und TNF-α. Darüber hinaus beobachteten wir, dass die direkt migrierenden alloreaktiven T-Zellen spezifische Integrine (α4+, αE+) und Chemokinrezeptoren (CxCR3+, CCR5+ und CCR9+) exprimierten. Überraschenderweise verhinderte die Blockierung dieser Integrine und Chemokinrezeptoren nicht die direkte Migration von T-Zellen aus PPs in LP, was auf die Beteiligung alternativer T- Zellmigrationsmechanismen schließen lässt. Vorangegangene Experimente schlossen die Beteiligung von S1PR1 und topografischer Merkmale gewebeständiger Makrophagen aus, was uns zu der Hypothese führte, dass Mediatoren der Zytoskelett- Reorganisation wie Coro1a, Dock2 oder Cdc42 eine Rolle in diesem einzigartigen Migrationsprozess spielen könnten. Zusätzlich beobachteten wir, dass direkt migrierende T-Zellen in der Darmschleimhaut ein lokales entzündliches Mikromilieu schaffen, welches zirkulierende T-Zellen anzieht. Die histologische Analyse bestätigte die Kolokalisation von direkt aus PP stammenden T-Zellen und T Zellen, welche über die Blutbahn in die Darmmukosa einwanderten. Um die direkte T-Zellmigration eindeutig zu bestätigen, wählten wir zwei experimentelle Ansätze: Die Photokonversion von T-Zellen in PPs während der Priming-Phase sowie den direkten Transfer aktivierter T-Zellen in das Gefäßsystem, um eine T-Zellkolokalisierung nachzuweisen. Aufbauend auf den Ergebnissen vermuten wir, dass Zytokine, die von migrierenden T-Zellen freigesetzt werden, wie zum Beispiel IFN-γ und TNF-α, möglicherweise eine Rolle bei der Rekrutierung von T-Zellen aus dem Gefäßsystem spielen, da die Hemmung von G- Protein-gekoppelter Rezeptoren (und somit aller Chemokinrezeptoren) die T-Zell- Rekrutierung nicht beeinträchtigte. KW - T-Lymphozyt KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Zellmigration KW - Darm KW - Peyer's patch KW - Graft versus Host disease KW - T-cell KW - Cell migration KW - Small intestine KW - Bone marrow transplantation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-352665 ER - TY - THES A1 - Rombach [geb. Grosso], Franziska T1 - Der Interaktionsrezeptor des Masernvirus auf hämatopoetischen Zellen T1 - The Measles Virus´ Interaction Receptor on Hematopoietic Cells N2 - Das Masernvirus (MV) kann in Erkrankten eine schwere, langanhaltende Immunsuppression verursachen, wodurch Infektionen mit opportunistischen Pathogenen begünstigt werden. Diese basiert auf einer Paralyse der hämatopoetischen Zellen, welche das Virus durch Kontakt eines viralen Glykoproteinkomplexes zu einem unbekannten RezeptorX auf der Zell- Oberfläche induzieren kann. Kerncharakterisitika hiervon sind unter anderem die Herabregulation der Akt-Kinase-Phosphorylierung, die Inhibition der zellulären Proliferation und die Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase 2 (NSM2). In einem kinetischen Phosphoproteom konnten zwei potentielle Interaktionsrezeptoren des MV identifiziert werden: CD43 und P2X3. Das hochglykosylierte Oberflächenmolekül CD43 ist auf hämatopoetischen Zellen ubiquitär exprimiert und reguliert in T-Zellen deren Überleben, Proliferation, Aktivierung, Migration und Adhäsion. P2X3 wird in hämatopoetischen Zellen nur in geringem Maße exprimiert. Seine funktionelle Bedeutung ist in diesem Kompartiment nicht bekannt. Beide Kandidaten wurden mittels CRISPR/Cas9 Verfahren einzeln oder kombiniert aus Jurkat-T-Zellen ablatiert, welche nachfolgend nach MV-Kontakt hinsichtlich der oben erwähnten MV-modulierten Parameter getestet wurden. Zusätzlich wurden iso- und allosterische P2X3-Inhibitoren an primären und Jurkat-T-Zellen verwendet, um dessen Rolle in Ca2+-Mobilisierung und Proliferation nach T-Zell-Rezeptor Co-Stimulation zu analysieren. Die genetische Depletion beider Rezeptor-Kandidaten verringerte die Effekte des MV auf alle getesteten Parameter signifikant, was darauf hindeutet, dass beide Proteine entscheidend an der T-Zell-Suppression beteiligt sind. Während die isosterische Inhibition von P2X3 keinen Effekt hatte, wurde die Proliferation primärer T-Zellen durch dessen allosterische Inhibition vor Co-Stimulation fast verdoppelt und die Effizienz der Ca2+-Mobilisierung in Jurkat- und primären T-Zellen signifikant erhöht. In P2X3-depletierten Jurkat-Zellen hingegen war die Ca2+-Mobilisierung nach Stimulation signifikant geringer als in WT-Zellen. In dieser Arbeit konnten zwei wichtige Mediatoren der MV induzierten T-Zell-Suppression identifiziert werden. Vor allem P2X3, dessen Expression, Regulation und funktionelle Bedeutung im hämatopoetischen Kompartiment noch nicht erforscht wurde, könnte ein vielversprechender Kandidat für eine antivirale Therapie darstellen, da ein klinisch getesteter P2X3-Inhibitor bereits verfügbar ist. N2 - Measles virus (MV) infection induces a severe and long-lasting immunosuppression in patients resulting in infections through opportunistic pathogens. T cell paralysis is a major contributor to MV induced immunosuppression. This can be achieved through contact of a viral glycoprotein complex with an uncharacterized receptor X on the surface of hematopoietic cells. Contact-mediated downregulation of Akt-kinase phosphorylation, inhibition of proliferation and activation the neutral spingomyelinase 2 (NSM2) are key characteristics of T cell inhibition in vitro. Using a kinetic phosphoproteomic approach, two potential interaction receptor candidates were identified: CD43 and P2X3 receptor. The highly glycosylated surface protein CD43 is ubiquitously expressed on hematopoietic cells and is known to regulate T cell survival, proliferation, activation, migration and adhesion. The expression of P2X3 in this compartment is low and its functional importance unknown. It is widely expressed in neuronal cells where it is a major effector in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Using the CRISPR/Cas9 method both candidates were knocked down singly or combined in Jurkat T cells. Cells were then tested for the MV modulated parameters mentioned above upon MV challenge. In addition to that, iso- and allosteric functional inhibitors for P2X3 were employed on primary and Jurkat T cells to determine its role in calcium influx and proliferation after T cell receptor stimulation. The knockdown of both CD43 and P2X3 significantly decreased MV effects on all analyzed parameters (Akt-kinase phosphorylation, proliferation, NSM2 activation) indicating that both proteins play a major role in MV-induced T cell suppression. While isosteric inhibition of receptor P2X3 had no effect, its allosteric inhibition prior to stimulation increased proliferation of primary T cells almost twofold and significantly increased Ca2+ influx in Jurkat cells and primary T cells. In contrast, genetic depletion of P2X3 significantly reduced calcium influx after stimulation as compared to wildtype cells. In this study two important mediators of MV induced T cell suppression were identified. Amongst those, P2X3 whose expression, regulation and functional importance in the hematopoietic compartment has not been investigated yet, may represent a promising candidate for anti-viral therapy due to the existence of a clinically tested inhibitor. KW - Masernvirus KW - Immunsuppression KW - JURKAT-Zelle KW - T-Zellen KW - Interaktionsrezeptor KW - T-Lymphozyt Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-353394 ER -