TY - JOUR A1 - Werner, Katharina A1 - Schwede, Frank A1 - Genieser, Hans-Gottfried A1 - Geiger, Jörg A1 - Butt, Elke T1 - Quantification of cAMP and cGMP analogs in intact cells: pitfalls in enzyme immunoassays for cyclic nucleotides JF - Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology N2 - Immunoassays are routinely used as research tools to measure intracellular cAMP and cGMP concentrations. Ideally, this application requires antibodies with high sensitivity and specificity. The present work evaluates the cross-reactivity of commercially available cyclic nucleotide analogs with two non-radioactive and one radioactive cAMP and cGMP immunoassay. Most of the tested cyclic nucleotide analogs showed low degree competition with the antibodies; however, with Rp-cAMPS, 8-Br-cGMP and 8-pCPT-cGMP, a strong cross-reactivity with the corresponding cAMP and cGMP, respectively, immunoassays was observed. The determined EIA-binding constants enabled the measurement of the intracellular cyclic nucleotide concentrations and revealed a time- and lipophilicity-dependent cell membrane permeability of the compounds in the range of 10–30% of the extracellular applied concentration, thus allowing a more accurate prediction of the intracellular analog levels in a given experiment. KW - Cyclic nucleotides KW - Enzyme immunoassay KW - Lipophilicity KW - Cell permeability Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141828 VL - 384 IS - 2 ER - TY - THES A1 - Sutor, Dominic Christian T1 - Induktion von FGF19 & FXR in humanen HT-29 Zellen unter Verwendung der nukleären Agonisten Vitamin D3, Vitamin A & CDCA T1 - Induction of FGF19 & FXR in human HT-29 cells with nuclear agonists vitamin D3, vitamin A and CDCA N2 - Ziel dieser Arbeit ist es, weitere Einblicke in die Aktivierung von FGF19 und FXR durch diverse nukleäre Agonisten und deren spezifischer Rezeptoren zu gewinnen. Hierbei soll im humanen Zellmodell versucht und mittels DNA-Analyse untersucht werden, welche messbaren molekularbiologischen Auswirkungen eine Behandlung mit unterschiedlichen Substanzen in variierenden Konzentrationen bewirkt. Genauer soll betrachtet werden, ob sich Vitamin A und Vitamin D als Induktoren von FGF19 in menschlichen Darmzelllinien eignen, da dies bereits im Mausmodel demonstriert werden konnte. Dieser initialen Vermutung folgend, sollen auch die möglichen Wechselwirkungen und Synergismen untersucht werden – welche Mechanismen liegen diese zu Grunde und über welche molekularen Signalwege werden dies vermuteten Effekte vermittelt. Hierdurch soll ein besseres Verständnis für die Rezeptor und Agonistenabhängigen Abläufe ermöglicht werden, um mögliche Rückschlüsse auf weitere Funktionen bereits bekannter Vertreter zu erlauben. Aufgrund der bereits oben beschriebenen Tiermodelle und der daraus gewonnenen Einsichten würde sich durch ein noch besseres Verständnis des FGF15/19 und des Farnesoid X Rezeptors in menschlichen Zellen, auf eine zukünftige Anwendung in analytischen und/oder therapeutischen Bereichen hoffen lassen. Diese Arbeit soll sich deshalb den Fragen widmen, ob eine FGF19 Induktion in humanen Darmzellen durch die nukleären Agonisten VD3, 9-cis RA und CDCA, ähnlich dem Mausmodel, möglich ist und welche Faktoren dabei Einflüsse auf die beschriebenen Effekte haben. N2 - This study demonstrates the induction potentials of vitamin A derivate 9-cis retinoic acid (9-cis RA), 1,25 (OH)² vitamin D3 and chenodeoxycholic acid (CDCA) on the gut-derived hormone Fibroblast Growth Factor 19 as well as a key-control element of the bile acid metabolism, the Farnesoid X Receptor. In conclusion, our data provides evidence for an important role of vitamin A as a novel potent regulator of intestinal FGF19 in humans, in contrast to previously discovered mechanisms in the murine model. KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - FGF19 KW - FXR KW - RXR KW - RAR KW - Vitamin A Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141152 ER - TY - JOUR A1 - Williams, Tatjana A1 - Machann, Wolfram A1 - Kühler, Leif A1 - Hamm, Henning A1 - Müller-Höcker, Josef A1 - Zimmer, Michael A1 - Ertl, Georg A1 - Ritter, Oliver A1 - Beer, Meinrad A1 - Schönberger, Jost T1 - Novel desmoplakin mutation: juvenile biventricular cardiomyopathy with left ventricular non-compaction and acantholytic palmoplantar keratoderma JF - Clinical Research in Cardiology N2 - Two sons of a consanguineous marriage developed biventricular cardiomyopathy. One boy died of severe heart failure at the age of 6 years, the other was transplanted because of severe heart failure at the age of 10 years. In addition, focal palmoplantar keratoderma and woolly hair were apparent in both boys. As similar phenotypes have been described in Naxos disease and Carvajal syndrome, respectively, the genes for plakoglobin (JUP) and desmoplakin (DSP) were screened for mutations using direct genomic sequencing. A novel homozygous 2 bp deletion was identified in an alternatively spliced region of DSP. The deletion 5208_5209delAG led to a frameshift downstream of amino acid 1,736 with a premature truncation of the predominant cardiac isoform DSP-1. This novel homozygous truncating mutation in the isoform-1 specific region of the DSP C-terminus caused Carvajal syndrome comprising severe early-onset heart failure with features of non-compaction cardiomyopathy, woolly hair and an acantholytic form of palmoplantar keratoderma in our patient. Congenital hair abnormality and manifestation of the cutaneous phenotype in toddler age can help to identify children at risk for cardiac death. KW - Desmoplakin KW - Juvenile biventricular cardiomyopathy KW - Palmoplantar keratoderma Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141198 VL - 100 IS - 12 ER - TY - JOUR A1 - Orth, Martin F. A1 - Cazes, Alex A1 - Butt, Elke A1 - Grunewald, Thomas G. P. T1 - An update on the LIM and SH3 domain protein 1 (LASP1): a versatile structural, signaling, and biomarker protein JF - Oncotarget N2 - The gene encoding the LIM and SH3 domain protein (LASP1) was cloned two decades ago from a cDNA library of breast cancer metastases. As the first protein of a class comprising one N-terminal LIM and one C-terminal SH3 domain, LASP1 founded a new LIM-protein subfamily of the nebulin group. Since its discovery LASP1 proved to be an extremely versatile protein because of its exceptional structure allowing interaction with various binding partners, its ubiquitous expression in normal tissues, albeit with distinct expression patterns, and its ability to transmit signals from the cytoplasm into the nucleus. As a result, LASP1 plays key roles in cell structure, physiological processes, and cell signaling. Furthermore, LASP1 overexpression contributes to cancer aggressiveness hinting to a potential value of LASP1 as a cancer biomarker. In this review we summarize published data on structure, regulation, function, and expression pattern of LASP1, with a focus on its role in human cancer and as a biomarker protein. In addition, we provide a comprehensive transcriptome analysis of published microarrays (n=2,780) that illustrates the expression profile of LASP1 in normal tissues and its overexpression in a broad range of human cancer entities. KW - LASP1 KW - cancer KW - biomarker KW - microRNA KW - nucleo-cytoplasmic Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144546 VL - 6 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Busch, Albert A1 - Hoffjan, Sabine A1 - Bergmann, Frauke A1 - Hartung, Birgit A1 - Jung, Helena A1 - Hanel, Daniela A1 - Tzschach, Andeas A1 - Kadar, Janos A1 - von Kodolitsch, Yskert A1 - Germer, Christoph-Thomas A1 - Trobisch, Heiner A1 - Strasser, Erwin A1 - Wildenauer, René T1 - Vascular type Ehlers-Danlos syndrome is associated with platelet dysfunction and low vitamin D serum concentration JF - Orphanet Journal of Rare Diseases N2 - Background The vascular type represents a very rare, yet the clinically most fatal entity of Ehlers-Danlos syndrome (EDS). Patients are often admitted due to arterial bleedings and the friable tissue and the altered coagulation contribute to the challenge in treatment strategies. Until now there is little information about clotting characteristics that might influence hemostasis decisively and eventually worsen emergency situations. Results 22 vascular type EDS patients were studied for hemoglobin, platelet volume and count, Quick and activated partial thromboplastin time, fibrinogen, factor XIII, von Willebrand disease, vitamin D and platelet aggregation by modern standard laboratory methods. Results show a high prevalence of over 50 % for platelet aggregation disorders in vascular type EDS patients, especially for collagen and epinephrine induced tests, whereas the plasmatic cascade did not show any alterations. Additionally, more than half of the tested subjects showed low vitamin D serum levels, which might additionally affect vascular wall integrity. Conclusion The presented data underline the importance of detailed laboratory screening methods in vascular type EDS patients in order to allow for targeted application of platelet-interacting substances that might be of decisive benefit in the emergency setting. KW - vascular type KW - vitamin D KW - Ehlers-Danlos syndrome KW - EDS KW - platelet dysfunction Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147757 VL - 11 IS - 111 ER - TY - JOUR A1 - Subramanian, Hariharan A1 - Döring, Frank A1 - Kollert, Sina A1 - Rukoyatkina, Natalia A1 - Sturm, Julia A1 - Gambaryan, Stepan A1 - Stellzig-Eisenhauer, Angelika A1 - Meyer-Marcotty, Philipp A1 - Eigenthaler, Martin A1 - Wischmeyer, Erhard T1 - PTH1R Mutants Found in Patients with Primary Failure of Tooth Eruption Disrupt G-Protein Signaling JF - PLoS One N2 - Aim Primary failure of tooth eruption (PFE) is causally linked to heterozygous mutations of the parathyroid hormone receptor (PTH1R) gene. The mutants described so far lead to exchange of amino acids or truncation of the protein that may result in structural changes of the expressed PTH1R. However, functional effects of these mutations have not been investigated yet. Materials and Methods In HEK293 cells, PTH1R wild type was co-transfected with selected PTH1R mutants identified in patients with PFE. The effects on activation of PTH-regulated intracellular signaling pathways were analyzed by ELISA and Western immunoblotting. Differential effects of wild type and mutated PTH1R on TRESK ion channel regulation were analyzed by electrophysiological recordings in Xenopus laevis oocytes. Results In HEK293 cells, activation of PTH1R wild type increases cAMP and in response activates cAMP-stimulated protein kinase as detected by phosphorylation of the vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP). In contrast, the PTH1R mutants are functionally inactive and mutant PTH1R/Gly452Glu has a dominant negative effect on the signaling of PTH1R wild type. Confocal imaging revealed that wild type PTH1R is expressed on the cell surface, whereas PTH1R/Gly452Glu mutant is mostly retained inside the cell. Furthermore, in contrast to wild type PTH1R which substantially augmented K+ currents of TRESK channels, coupling of mutated PTH1R to TRESK channels was completely abolished. Conclusions PTH1R mutations affect intracellular PTH-regulated signaling in vitro. In patients with primary failure of tooth eruption defective signaling of PTH1R mutations is suggested to occur in dento-alveolar cells and thus may lead to impaired tooth movement. KW - phosphorylation KW - xenopus oocytes KW - calcium signaling KW - intracellular receptors KW - mutation KW - teeth KW - tooth eruption KW - transfection Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147967 VL - 11 IS - 11 ER - TY - THES A1 - Möller, Christian T1 - Mutationen im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase bei Patienten mit familiärer dilatativer Kardiomyopathie T1 - Mutations in the gene of dihydrolipoamide dehydrogenase in patients with familial dilated cardiomyopathy N2 - Die Arbeitsgruppe Zimmer am Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie der Universität Würzburg detektierte im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (DLD) eine bisher nicht bekannte Mutation, die für die Entwicklung einer familiären Form der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) verantwortlich ist. Die DLD spielt als Teil von mitochondrialen Enzymkomplexen eine wichtige Rolle im Energie- und Aminosäurestoffwechsel der Zelle. Mutationen im DLD-Gen führen dabei meist zu neurologischen Syndromen mit Erscheinungsbildern wie mentaler Entwicklungsverzögerung, Krampfanfällen und spastischen Bewegungsstörungen. Fälle von Herzinsuffizienz und frühkindlicher Hypertropher Kardiomyopathie wurden ebenfalls beschrieben. Von den zahlreichen Gendefekten, die als Auslöser für die dilatative Kardiomyopathie bekannt sind, ist bisher noch keiner im Gen der DLD beschrieben worden. Vielmehr sind DCM-Mutationen in Genen zu finden, die für muskelspezifische Proteine kodieren. Dadurch führen sie oft zu einer Beeinflussung der Kraftübertragung im Sarkomer. Die durch die Arbeitsgruppe Zimmer beschriebene DLD-Mutation wurde in einer portugiesischen Großfamilie entdeckt, in welcher das Auftreten der dilatativen Kardiomyopathie über mehrere Generationen hinweg zu verfolgen ist. Ähnliche Fälle außerhalb dieser Familie sind nicht bekannt. Demnach gibt es keine Daten, die die Häufigkeit DCM-assoziierter Mutationen im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase beschreiben. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich damit weitere Zusammenhänge zwischen genetischen Alterationen im DLD-Gen und dem Auftreten einer DCM aufzudecken. In diesem Rahmen wurden DCM-Patienten, die erwiesenermaßen an einer familiären Form dieser Erkrankung leiden, gezielt auf Veränderungen in den Exons des DLD-Gens untersucht. Insgesamt wurden die Exons von 88 Patienten auf das Vorhandensein heterozygoter Mutationen überprüft. Hierfür wurden PCR-Produkte, die die jeweiligen Exons enthielten, mit Hilfe der Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC) untersucht. Diese Methode ermöglicht eine hochsensitive und gleichermaßen äußerst spezifische Detektion heterozygoter Mutationen. Auffällige Ergebnisse wurden anschließend mittels Sequenzierung verifiziert. Insgesamt wurden bei elf Patienten fünf unterschiedliche Mutationen nachgewiesen. Es handelte sich um vier bereits bekannte Einzelnukleotid-Polymorphismen und eine bisher nicht beschriebene Mutation. Dabei lagen vier Mutationen in nicht näher bezeichneten Intron-Bereichen, eine Mutation in einer 3‘ Spleißstelle und eine weitere Mutation in der 3‘ UTR (untranslated region) der mRNA. Somit befanden sich also einige Mutationen an für die Regulation der Genfunktion strategisch wichtigen Positionen. Da es sich dabei um bekannte Polymorphismen handelte, wurde mit Hilfe der Daten des HapMap Projekts überprüft, ob es bereits Hinweise für eine klinische Assoziation gab. Die Daten zeigten, dass bisher keiner der hier detektierten SNPs mit klinischen Erscheinungsbildern in Verbindung gebracht werden konnte. Es gab auch keine Hinweise dafür, dass die erfassten SNPs im Patientenkollektiv häufiger vorkamen als in der Normalbevölkerung. Einer der hier beschriebenen Mutationen war nicht in den verwendeten Datenbanken aufgeführt. Daher kann ein pathologischer Einfluss dieser Mutation zwar nicht ausgeschlossen werden, erscheint aber aufgrund ihrer Lage in einem weit vom Exon entfernten Intron-Bereich nicht offensichtlich. Es ließen sich also für keine der detektierten Mutationen pathogene Eigenschaften nachweisen. In Protein-kodierenden Sequenzbereichen konnten keine Mutationen nachgewiesen werden. Abschließend lässt sich also sagen, dass eine Assoziation zwischen Mutationen im DLD-Gen und dem Auftreten einer familiären DCM im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigt werden konnte. Es ist jedoch möglich, dass DCM-assoziierte Mutationen im DLD-Gen nur äußerst selten auftreten oder aber die durch die Arbeitsgruppe Zimmer detektierte Mutation im DLD-Gen die bisher einzige ist, die mit DCM in Verbindung gebracht werden kann. Um diese Frage zu klären müssen Untersuchungen mit größeren Patientenkollektiven angeschlossen werden. N2 - The working group Zimmer at the Institute of Clinical Biochemistry and Pathobiochemistry at the University of Wuerzburg detected an until now unknown mutation in the gene of dihydrolipoamide dehydrogenase (DLD), which causes a familial dilated cardiomyopathy (DCM). The DLD plays an important role in the metabolism of carbohydrates and amino acids. In most cases mutations in the DLD gene lead to neurological symptoms like mental developmental delay, seizures and spastic movement disorders. Cases of heart failure and an early childhood hypertrophic cardiomyopathy are also known. Among the numerous genetic defects, which are known to be responsible for the development of a dilated cardiomyopathy, there is no one known in the gene of DLD. To a greater degree DCM mutations are found in genes, which encode for muscle-specific proteins. In this way they often lead to an affectation of the force transmission in the sarcomer. The mutation, which was described by the working group Zimmer was found in an portuguese extended familiy. In this family the presence of a dilated cardiomyopathy could be followed up for several generations. Similar cases outside of this family are not known. So there is no data about the frequency of DCM associated mutations in the gene of dihydrolipoamide dehydrogenase. The work in hand dealt with revealing further relationships between genetic variances in the DLD gene and the presence of DCM. In this context the exons of the DLD gene of DCM patients with a familial form of this disease were examined. Overall the DLD exons of 88 patients were investigated looking for heterozygous mutations. For this purpose the Denaturing High-Performance Liquid Chromatography was used. This method allows a highly sensitive and also exceedingly specific detection of heterozygous mutations. Afterwards conspicuous results were verified by sequencing. Altogether five different mutations in eleven patients were found. It was about four already known single nucleotide polymorphisms and one until know not known mutation. Four mutations were located in not further described intronic regions. One was found in a 3' splice site and one in a 3' UTR. In this way some mutations were located in regions which are important for the regulation of gene function. Because it was about known SNPs, it was checked if there is evidence for associations with clinical phenotypes. Therefor the data of the HapMap project was used. The data shows that no one of the detected SNPs is known to be associated with clinical phenotypes. In protein coding sequences no mutation was detected. Conclusively it can be said that within this work an association between mutations in the DLD gene and the presence of a familial DCM could not be confirmed. It is possible that mutations in the DLD gene associated with DCM are very rare or unique in this family. To reason this out, investigations with greater patient populations are necessary. KW - Kongestive Herzmuskelkrankheit KW - Punktmutation KW - Genmutation KW - Genommutation KW - Mutation KW - Dihydrolipoamid-Dehydrogenase KW - Polymorphismus KW - SNP KW - Seque KW - Denaturing high-performance liquid chromatography KW - Sequenzierung KW - Familiäre dilatative Kardiomyopathie KW - Denaturing high-performance liquid chromatography KW - sequencing KW - familial dilated cardiomyopathy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74278 ER - TY - THES A1 - Dettling, Aurelia Katharina [verh.: Filser] T1 - Plakophilin-2-Gen und Troponin-I-Gen als Krankheitskandidatengene für die arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie und die restriktive Kardiomyopathie T1 - Plakophilin-2-Gene and Troponin-I-Gene as disease genes for the arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy and the restrictive cardiomyopathy N2 - Die arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie ARVC ist eine seltene Erkrankung des Herzmuskels. Die ARVC tritt oft familiär gehäuft auf und geht meist mit einer autosomal dominanten Vererbung einher. Durch molekulargenetische Untersuchungen konnten bisher neun Genmutationen identifiziert werden, davon ein Großteil in Bestandteilen der kardialen Desmosomen, am häufigsten im Plakophilin-2-Gen. Das Protein Plakophilin 2 ist Bestandteil kardialer Desmosomen und gehört zur Familie der Armadillo-Proteine. Es wird vermutet, dass Veränderungen im Protein Plakophilin 2 zu Schädigungen der Zell-Zell-Verbindungen führen. Der Verlust der Myocytenadhäsion führt zum Zelltod und regionalen Fibrosierung. Da Mutationen im PKP-2-Gen am häufigsten in den westlichen Ländern für die familiär auftretende ARVC verantwortlich sind, entschieden wir uns für das PKP-2-Gen als Kandidatengen für Familie A, die für ein signifikantes Ergebnis einer Kopplungsanalyse zu klein war. Bei der direkten Sequenzierung der 14 Exons des PKP2-Gens, konnte auf Exon 11 von Patient II-2 ein Einzelnucleotidpolymorphismus SNP identifiziert werden, der sich allerdings auch in gesunder Kontroll-DNA bestätigte und somit als nicht krankheitsrelevant gewertet werden konnte. Die restriktive Kardiomyopathie RCM ist ebenfalls eine sehr seltene Herzmuskelerkrankung. Sie ist durch eine Verminderung der diastolischen Dehnbarkeit der Ventrikel charakterisiert. Die RCM kann im Rahmen systemischer Erkrankungen auftreten oder genetisch bedingt sein. Bisher wurden 6 Mutationen im kardialen Troponin-I-Gen als Ursache identifiziert. Troponin I gehört zusammen mit Troponin C und T zum kardialen Troponinkomplex und ist für die Regulation der Ca2+-abhängigen Kontraktion der kardialen Myocyten verantwortlich. Kommt es zu Veränderungen im Troponin I, wird die physiologische Relaxation des myokardialen Gewebes gestört. Da Mutationen im TNNI3-Gen häufig an der Pathogenese der familiären RCM beteiligt sind, untersuchten wir bei Familie B das TNNI3-Gen durch Direktsequenzierung. Dabei wurden bei der Sequenzierung des Exon 2 des erkrankten Kindes III-1 vier zusätzliche, intronisch gelegene Basen auf einem Strang entdeckt, die zu einer Verschiebung des Leserasters führten. Die Kontrolle der Auffälligkeit durch die Sequenzierung des DNA-Abschnitts bei der ebenfalls erkrankten Mutter II-1, der Tante II-3 und des gesunden Vaters II-2 zeigten, dass die vier zusätzlichen Basen vom gesunden Vater II-2 auf das Kind III-1 vererbt wurden und somit nicht mit der monogen vererbten Krankheit korrelieren. Die Charakterisierung der genetischen Ursachen von familiär bedingten Kardiomyopathien bringt weitere Erkenntnisse der pathophysiologischen Mechanismen der Erkrankungen. Dies ist die Voraussetzung zur Entwicklung und Verbesserung von präventiven, diagnostischen und therapeutischen Maßnahmen. Sollte sich bei Patienten, die an einer idiopathischen Kardiomyopathie erkrankt sind, eine genetische Ursache finden, so ist es für Verwandte empfehlenswert sich ebenfalls einer klinischen und genetischen Untersuchung zu unterziehen, um im Falle eines positiven Ergebnisses rechtzeitig Komplikationen der Erkrankung vermeiden und eine präventive Therapie einleiten zu können. N2 - The arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy ARVC is a uncommon heart muscle disease. It is reported familial with most commonly dominant inheritance. 9 disease-causing mutaions are recognized in genes among desmosomal proteins, most in plakophilin-2-gene.The protein plakophilin-2 is part of the cardial desmosomal structure and member of the armadillo-protein-family. The changes of plakophilin-2 may lead into a damage of the cell-cell-interaction. Cause muations in plakophilin-2-gene are the most common, we decided for plakophili-2-gene for family A. The direct screening of plakophilin-2-gene in family A detected no diease relevant results. The restrictive cardiomyopathy RCM is also a very uncommon heart muscle disease. It is characterized by reduced diastolic relaxation. So far 6 muations are identified in the cardial troponin-I-gene. Troponin I is a part of the cardial troponin-complex and regulates the Ca2+-sensitive heart muscle contraction. Cauuse muations in troponi-I-gene are common in the pathogenesis of RCM, we choosed troponin-I-gene for family B. No RCM linked mutaions were found in the molecular genetic investigatio of family B. KW - Herzmuskelkrankheit KW - Restriktive Herzmuskelkrankheit KW - genetisch bedingte Krankheit KW - Herzmuskelerkrankung KW - Kardiomyopathie KW - Plakophilin-2 KW - Troponin I KW - Krankheitsgen KW - cardiomyopathy KW - haert muscle disease KW - plakophilin 2 KW - troponin I Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74803 ER - TY - THES A1 - Kramer, Daniel T1 - Das Phosphatidylinositol-Transfer-Protein PITPnm2 in humanen Thrombozyten T1 - The phosphatidylinositol-transfer-protein PITPnm2 in human platelets N2 - Die Analyse des Phosphoproteoms in ruhenden und in aktivierten humanen Plättchen führte zur Identifikation des PITPnm2-Proteins. Dieses Protein wird bei einer Stimulation von Thrombozyten mit dem Prostazyklinanalogon Iloprost phosphoryliert. Diese Ergebnisse gaben Anlass zu weiteren Untersuchungen zum Vorkommen und zur Funktion dieses Proteins in Thrombozyten. In der Arbeit wurde gezeigt, dass das PITPnm2-Protein das einzige Protein der PITP-Familie ist, welches in humanen Thrombozyten exprimiert wird. Die membranassoziierten Phosphatidylinositol-Transfer-Proteine PITPnm1 und PITPnm3 sind auf cDNA-Ebene nicht in Thrombozyten nachweisbar. Von den drei zur Zeit der Untersuchung bekannten Splicevarianten des PITPnm2-Proteins konnten zwei Varianten in Thrombozyten mittels RT-PCR identifiziert werden. Diese zwei Varianten unterscheiden sich durch ein unterschiedlich exprimiertes Exon, welches im zentralen Teil des Proteins liegt. Ein weiteres Spliceprodukt, dem die Aminosäuren 50 bis 328 im vorderen Teil des Proteins fehlen, wird nicht in Thrombozyten exprimiert. PITPNM2 (Splicevariante 1) wurde als Fusionsprotein mit einem sogenannten „Flag-Tag“ kloniert und in Eukaryonten exprimiert (pCMV-SC-CF, Stratagene). Mit dem rekombinanten Fusionsprotein wurden gegen PITPnm2 gerichtete Antikörper getestet. Der Vergleich mit Flag-Tag-spezifischen Antikörpern zeigte, dass der PITPnm2-spezifische Antikörper zahlreiche Banden detektiert und für weitere Untersuchungen nicht geeignet ist. Dieser PITPnm2-Klon wird auch in weiterführenden Arbeiten eingesetzt werden, die sich mit der Identifizierung der Interaktionspartner dieses Proteins, der subzellulären Lokalisierung und der Teilnahme des Proteins an spezifischen Zell-Signalwegen beschäftigen werden. N2 - In order to gain a deeper insight into the function of platelets the protein composition of both resting and activated human thrombocytes was characterized by using mass spectrometry. One of the identified proteins is the phosphatidylinositol transfer protein PITPnm2. The treatment of platelets by the platelet inhibitor prostacyclin leads to a phosphorylation of the PITPnm2 protein. These results gave rise to further investigations regarding both the occurrence and the function of this protein in human thrombocytes. The phosphatidylinositol transfer proteins are a protein family including the three proteins PITPnm1, PITPnm2, PITPnm3. RT-PCR analysis demonstrated that only the PITPnm2 protein of the PITP-family is expressed in platelets. At the time of investigation, three different splice products of the PITPnm2 protein are described. Two of these three splice products are expressed in platelets at the RNA level. These two splice variants differ in the expression of a variable spliced exon in the central part of the protein. The third splice variant shows the same sequence as the first, however the amino acids 50-328 at the N-terminus of the protein are missing. Cloning and expression of flag-tagged PITPnm2 (pCMV-SC-CF, Stratagene) allowed testing of PITPnm2-specific antibodies. In comparison with flag-tag specific antibodies, PITPnm2-specific antibodies showed numerous unspecific crossreactions and are not suitable for further experiments. The expression clone of PITPnm2 will be very useful for further investigations regarding both the different interaction partners of the PITPnm2 protein and the involvement of the PITPnm2 protein in different signalling cascades. KW - Thrombozyt KW - Inosite KW - Phosphatidylinositol Transfer Proteine KW - PITPnm2 KW - NIR3 KW - phosphatidylinsoitol transfer protein KW - platelets KW - PITPnm2 KW - NIR3 Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76638 ER - TY - THES A1 - Mihlan, Sabrina [geb. Jasper] T1 - Identifikation von Zonula Occludens 2 (ZO-2) als neuen LASP-1 Interaktionspartner und Aufklärung der LASP-1/ZO-2 Kern-Zytosol Translokation T1 - Identification of zonula occludens 2 (ZO-2) as a new LASP-1binding partner and the elucidation of LASP-1/ZO-2 nucleo-cytoplasmatic shuttling N2 - LASP-1 (LIM und SH3 Domänen Protein) ist ein in Zellen ubiquitär vorkommendes Protein, welches in verschiedenen Tumorgeweben eine pathophysiologische Überexpression aufweist. Das Protein besitzt eine LIM Domäne, zwei Aktinbindungsregionen sowie eine SH3 Domäne und bindet einerseits an dynamischen Aktinstrukturen wie den fokalen Kontakten, Lamellopodien und Membranfortsätzen, kann andererseits aber auch in den Zellkern translokalisieren. Für Aktinstrukturen wirkt LASP-1 als Gerüstprotein und ist wichtig für die Migration und Proliferation der Zellen. Die Funktion von LASP-1 im Zellkern ist noch nicht bekannt, da aber in Tumorzellen eine erhöhte nukleare Akkumulation von LASP-1 beobachtet werden konnte, deren Intensität mit der Tumorgröße sowie dem Langzeitüberleben der Patientinnen korreliert, ist LASP-1, zusätzlich zu seiner Funktion als Strukturprotein, vermutlich auch ein Transkriptionsfaktor oder ein transkriptioneller Kofaktor. Eine Herunterregulation von LASP-1 in verschiedenen Tumorentitäten führt zur Inhibition der Proliferation und Migration. In dieser Arbeit konnte der bisher unbekannte Zellkernimport und -export von LASP-1 aufgeklärt werden. Maßgeblich daran beteiligt ist ein durch Pulldown Experimente neu identifizierter LASP-1 Bindungspartner: das Zonula Occludens 2 Protein (ZO-2). Mittels Immunpräzipitationen und Immunfluoreszenzen wurde diese Interaktion bestätigt. Nach Phosphorylierung von LASP-1 an Ser-146 durch Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) kommt es zu einer partiellen Ablösung des LASP-1/ZO-2 Komplexes aus den fokalen Kontakten hin zu einer vermehrten Kernlokalisation beider Proteine. Dies lässt sich durch Kern/Zytosol Trennungen belegen. Dabei ist die Bindung von LASP-1 an ZO-2 essentiell für die Translokation in den Zellkern, da bei einem ZO-2 Knockdown auch nach PKA Aktivierung LASP-1 zytosolisch lokalisiert bleibt. Wie Mutationsanalysen zeigen, findet die Interaktion zwischen der C-terminalen SH3 Domäne im LASP-1 und der Prolin-reichen SH3-Bindungssequenz im Bereich der Aminosäuren 1103-1121 am C-Terminus im ZO-2 statt. Die Translokation des Komplexes in den Kern erfolgt dabei über das Kernlokalisationssignal im ZO-2, da die LASP-1 Sequenz selbst keine nukleare Importsequenz aufweist. Im Zellkern konnte die direkte Interaktion von LASP-1 und ZO-2 mittels Duolink® Proximity Ligation Assay sichtbar gemacht werden. Der Export der Proteine erfolgt über das Protein CRM1. Eine Inhibition der Kernexportmaschinerie mit Leptomycin B erhöht die Konzentration beider Proteine im Zellkern. Das nukleare Exportsignal (NES) im LASP-1 konnte durch Punktmutationen N-terminal der Leucin-reichen Aminosäuresequenz 70-77 zugeordnet werden (NLRLKQQS). Im letzten Schritt dieses Zyklus erfolgt die Relokalisation von LASP-1 zurück an die Zellmembranstrukturen. Der neu gefundene Signalweg dient wahrscheinlich zur Weiterleitung von externen Stimuli in den Kern und zur Genregulation - mit LASP-1 als Transkriptionsfaktor oder transkriptionellen Kofaktor. N2 - LASP-1 (LIM and SH3 protein) is ubiquitously expressed at basal levels, but was found to be pathophysiologically overexpressed in several cancer entities. LASP-1 exhibits one LIM domain, two actin binding domains and one SH3 domain. On the one hand, LASP-1 is predominantly localized at focal contacts, lamellopodia and membrane ruffles, on the other hand a nuclear localization is observed. LASP-1 works as actin-binding scaffolding protein and is essential for migration and proliferation. Silencing of LASP-1 by RNA- interference in various cancer cell lines results in a strong inhibition of proliferation and migration. However, in tumor cells, an additional striking nuclear localization of the protein was observed, which significantly correlates with tumor size and a poor long term survival of the patients. Therefore, LASP-1 might act additionally as transcription factor or transcriptional co-factor In this work, a novel LASP-1 binding partner, zonula occludens protein 2 (ZO-2), was identified and its role in the signal transduction pathway of LASP-1 nucleo-cytoplasmic shuttling was established. Upon LASP-1 phosphorylation at Ser-146 by activated cAMP-dependent protein kinase A (PKA), LASP-1 binding to Zyxin and F-actin decreases and the protein detaches, in complex with ZO-2, from the plasma membrane and translocates into the nucleus. These results were confirmed by nuclear and cytosolic separation assays. Pull-down assays with mutants revealed that ZO-2 binds with its proline-rich sequence (amino acids 1103-1121) to the SH3 domain in LASP-1. LASP-1 exhibits no nuclear localization signal and requires ZO-2 to shuttle into the nucleus. In situ proximity ligation assay confirmed the direct binding between LASP-1 and ZO-2 and visualized the shuttling. Inhibition of the nuclear export system by Leptomycin B results in an accumulation of both proteins in nuclei. Nuclear export is regulated by the newly identified nuclear export signal in LASP-1 (amino acids 70-77) and mediated by CRM1. Finally LASP-1 relocalizes to focal contacts. This new identified pathway serves presumably as a signal transductor from the focal contacts to the nucleus for gene regulation. KW - Tumorzelle KW - Skleroproteine KW - Transkriptionsfaktor KW - Überexpression KW - Zellkern KW - Kern-Zytosoltranslokation KW - ZO-2 KW - Phosphorylierung KW - LASP-1 KW - nuclear cytosolic translocation KW - ZO-2 KW - phosphorylation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73442 ER -