TY - THES A1 - Schleider, Elisa T1 - Angiogenese-Modellsysteme zur Funktionsanalyse des humanen CCM3 Proteins T1 - Angiogenesis in vitro modeling of human CCM3 function N2 - Zerebrovaskuläre kavernöse Malformationen (CCM) sind Blutgefäßfehlbildungen, welche hauptsächlich im Gehirn vorkommen. Sie sind gekennzeichnet durch stark dilatierte kapillarähnliche Gefäße mit niedriger Flussrate („slow-flow lesions“). Intervenierendes Gehirnparenchym fehlt ebenso wie Perizyten oder glatte Gefäßmuskelzellen. Die klinischen Symptome reichen von starken Kopfschmerzen über Epilepsie bis hin zum Schlaganfall. Dennoch bleiben viele Kavernomträger aufgrund unvollständiger Penetranz ihr Leben lang asymptomatisch. Die Prävalenz beträgt ca. 0,5% in der Gesamtbevölkerung. Es gibt sowohl sporadische als auch dominant vererbte Krankheitsformen. In den letzten Jahren konnten 3 Gene ursächlich mit der Krankheit in Verbindung gebracht werden. Mutationen in CCM1, CCM2 oder CCM3 führen zu einem nicht unterscheidbaren klinischen Phänotyp. Alle drei Proteine bilden einen ternären Komplex in vitro, was eine Beteiligung an einem gemeinsamen molekularen Signalweg bekräftigt. Während die Proteine CCM1 und CCM2 in den letzten Jahren umfangreich erforscht wurden, ist über das CCM3-Protein bis heute wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CCM3 eine wichtige Rolle in der Angiogenese spielt und diese bei Überexpression in humanen Endothelzellen stark negativ reguliert: die Migration, die Proliferation und die Fähigkeit, kapillarähnliche Strukturen in Matrix-Gelen zu bilden kommt nahezu zum Erliegen. Ein gegenläufiger Effekt nach siRNA induziertem Knock-down von CCM3 war weniger stark ausgeprägt. Einzig die Fähigkeit, gefäßähnliche Strukturen in Matrigelen zu bilden, war erhöht. Um weiterhin Klarheit über die intrazellulären, von CCM3 beeinflussten Signalwege zu schaffen, wurden Tyrosin Kinase Arrays durchgeführt, bei welchen CCM3-überexprimierende HUVEC Lysate mit Kontrolllysaten verglichen wurden. Dabei stellte sich heraus, dass 5 Substrate signifikant erhöht phosphoryliert wurden: der Discoidin Domänen Rezeptor 1 (discoidin domain receptor; DDR1), die duale spezifitätstyrosinphosphorylierungsregulierte Kinase 1A (dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A; DYR1A), die Protoonkogen Tyrosin- Protein Kinase FER (proto-oncogene tyrosine-protein kinase FER; FER), die fynbezogene Kinase (Fyn-related kinase; FRK) und die phosphoinositolabhängige Kinase 1 (Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDPK-1). Im Folgenden bestätigten Western Blot, dass die Überexpression von CCM3 in Endothelzellen die phosphoinositolabhängige Kinase 1 und die nachgeschaltete Serin-Threonin Kinase Akt/PBK aktiviert, welche ein bedeutsames Überlebenssignal der Zelle darstellt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass CCM3 nicht nur antiangiogen, sondern auch antiapoptotisch wirkt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass CCM3 für die Integrität des ruhenden, adulten Endothelbettes wichtig ist. N2 - Cerebral cavernous malformations are slow-flow vascular lesions, mainly located in the brain. They consist of blood-filled dilated capillary-like vessels without brain parenchyma or mural cells. Clinical symptoms include intense headaches, epilepsy and stroke. However, about 40% of lesion carriers live without any symptoms throughout their lives due to incomplete penetrance. The disease prevalence is 0.5% in the population. Sporadic as well as autosomal-dominantly inherited familial forms exist. In recent years, 3 disease-related genes have been identified. Mutations within CCM1, CCM2 or CCM3 lead to indistinguishable clinical phenotypes. All three proteins form a ternary complex in vitro, confirming their participation in one main signaling pathway. While CCM1 and CCM2 have been explored to a great extent over the past years, little is known about CCM3 and its function so far. In this study, we show that CCM3 plays an important role in angiogenesis. Upon overexpression it has strong negative effects in endothelial cells. The ability to migrate, proliferate and to form capillary-like structures in matrix gels is significantly impaired. Knockdown experiments with siRNA against CCM3 did not reveal such distinct effects. Only the ability to form capillary-like structures was elevated. To identify signaling pathways modulated by CCM3, tyrosine kinase arrays were conducted. Lysates from HUVECs overexpressing CCM3 were compared with control lysates. Five substrates revealed significantly increased phosphorylation: the discoidin domain receptor 1 (DDR1), the dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A (DYR1A), the proto-oncogene tyrosine-protein kinase FER (FER), the fyn-related kinase (FRK) and the Phosphoinositidedependent kinase 1 (PDPK-1). The candidate 3-Phosphoinositide-dependent protein kinase- 1 is an important upstream activator of the serine-threonine kinase Akt/PKB. Subsequent experiments confirmed and demonstrated that p-PDPK-1 and p-Akt are activated in lysates overexpressing CCM3. In agreement with the fact that Akt is important for cell survival, we could finally show that CCM3 is both antiangiogenic and antiapoptotic. Our data suggest that CCM3 plays a role in maintaining quiescence of adult vascular endothelial cells. KW - Blutgefäß KW - Missbildung KW - Gehirn KW - Genanalyse KW - Endothelzelle KW - Angiogenese KW - CCM3 KW - Endothelzellen KW - CCM3 KW - endothelial cells KW - angiogenesis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51504 N1 - Includes articles: - Stahl, S., Gaetzner, S., Voss, K., Brackertz, B., Schleider, E., Sürücü, O., Kunze, E., Netzer, C., Korenke, C., Finckh, U., Habek, M., Poljakovic, Z., Elbracht, M., Rudnik-Schöneborn, S., Bertalanffy, H., Sure, U., Felbor, U. (2007) Novel CCM1, CCM2, and CCM3 mutations in patients with cerebral cavernous malformations: in-frame deletion in CCM2 prevents formation of a CCM1/CCM2/CCM3 protein complex. Hum Mutat, 29, 709-717. - Voss, K., Stahl, S., Reinders, J., Hogan, B.M., Schleider, E., Schulte-Merker, S., Felbor, U. (2009) Functional analysis of human and zebrafish 18 amino acid in-frame deletion pave the way for domain mapping of the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Hum Mutat, 30, 1003-1011. - Schleider, E., Stahl, S., Wüstehube, J., Walter, U., Fischer, A., Felbor, U. (2010) Evidence for anti-angiogenic and pro-survival functions of the cerebral cavernous malformation protein 3. Neurogenetics, submitted ER - TY - THES A1 - Mueller, Felicitas T1 - Analysis of the factor XII-driven contact system activation in vivo T1 - Charakterisierung der Faktor XII-vermittelten Aktivierung des Kontaktsystemsin vivo N2 - Platelets play a central role in thrombosis, hemostasis, and inflammation. Here, we show that activated platelets release inorganic polyphosphate (polyP), a polymer of 60- 100 phosphate residues that directly bound to and activated the plasma protease factor XII. PolyP-driven factor XII-activation triggered release of the inflammatory mediator bradykinin by plasma kallikrein-mediated kininogen processing. PolyP increased vascular permeability and induced fluid extravasation in skin microvessels of mice. Mice deficient in factor XII or bradykinin receptors were resistant to polyP-induced leakage. PolyP initiated clotting of plasma via the contact pathway. Ablation of intrinsic coagulation pathway proteases factor XII and factor XI protected mice from polyPtriggered lethal pulmonary embolism. Targeting polyP with phosphatases interfered with procoagulant activity of activated platelets and blocked platelet-induced thrombosis in mice. Infusion of polyP restored defective plasma clotting of Hermansky- Pudlak Syndrome patients, which lack platelet polyP. The data identify polyP as a new class of mediator having fundamental roles in platelet-driven proinflammatory and procoagulant disorders. N2 - Thrombozyten spielen eine zentrale Rolle bei Thrombose, Hämostase und Entzündungsprozessen. Wir zeigen, dass aktivierte Thrombozyten Polyphosphate (polyP) mit einer Kettenlänge von 60-100 Phosphatuntereinheiten sekretieren. PolyP binden und aktivieren die Serinprotease Faktor XII. PolyP-induzierte Faktor XIIAktivierung führt über Kallikrein zur Freisetzung des Entzündungsmediators Bradykinin aus seinem Vorläufermolekül, dem hochmolekularen Kininogen. In einem Ödem- Modell zeigen wir, dass polyP die Gefäßpermeabilität in der Rückenhaut von Wildtyp- Mäusen erhöhen. Faktor XII- oder Bradykinin B2 Rezeptor-defiziente Tiere waren vor polyP-induzierter Ödembildung geschützt. PolyP aktivieren die intrinsische Blutgerinnungskaskade im Plasma. In einem polyP-vermittelten lethalen Lungenemboliemodell waren Faktor XII- und Faktor XI-defiziente Mäuse im Gegensatz zu Wildtyp Tieren geschützt. Behandlung mit Phosphatase hebt die prokoagulante Aktivität stimulierter Thrombozyten auf und blockiert die Plättchen-induzierte Thrombusbildung in Mäusen. PolyP normalisieren die verlängerte Blutgerinnungszeit von Hermansky-Pudlack Patienten. Die Daten zeigen, dass es sich bei polyP um eine neue Klasse von Mediatoren mit prokoagulanten und proinflammtorischen Eigenschaften handelt. KW - Blutstillung KW - Thrombosis KW - Haemostasis KW - Polyphosphate KW - Blutstillung Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46071 ER - TY - THES A1 - Fröhling, Tobias Marius T1 - Untersuchungen zur Wirkungsweise von Zyklonukleotiden auf die Thrombozytenaktivierung T1 - Investigations on the effectiveness of cyclic nucleotides on platelet activation N2 - In der vorliegenden Arbeit ging es darum, die inhibierende Wirkung von extrazellulär zugefügten GMP-Derivaten auf die Thrombozytenaktivierung nachzuweisen. Anhand verschiedener thrombozytärer Aktivierungsmarker wie ERK, der Expression von P-Selektin und intrazellulärem Kalziumeinstrom zeigte sich eine signifikante Inhibition der Thrombozytenaktivierung durch zyklische GMP-Analoga. Neu ist, dass auch nicht-zyklische GMP-Derivate eindeutig einen hemmenden Effekt aufweisen. Guanosin-Derivate alleine führen dagegen weder zu einer Hemmung noch zu einer vermehrten Stimulation der Plättchenaktivierung. Die Wirkung der GMP-Analoga scheint von der negativen Phosphatgruppe abhängig zu sein. Der frühe Zeitpunkt der Inhibition und die Tatsache, dass auch Hemmer der PKG einen inhibierenden Effekt auf die Thrombozytenaktierung aufweisen, führen zu der Hypothese, dass es sich um PGK-unabhängige Effekte handelt. Der Thrombinrezeptor als Wirkort der GMP-Analoga konnte in Biacore-Messungen ausgeschlossen werden. Es gilt nun, speziell den Thromboxanrezeptor auf mögliche Interaktionen mit GMP-Derivaten hin zu untersuchen. N2 - Platelets play a key role in hemostasis through their ability to rapidly adhere to activated or injured endothelium, subendothelial matrix proteins and other activated platelets. A strong equilibrium between activating and inhibiting processes is essential for normal platelet and vascular function, impairment of this equilibrium being associated with either thrombophilic or bleeding disorders. Cyclic guanosine monophosphate is a crucial and synergistic intracellular messenger that mediates the effects of platelet inhibitors such as nitric oxide (NO) and prostacyclin (PG-I2). This work investigated the effects of extracellular-cyclic-nucleotides on platelet-activation. Different platelet-activation markers like ERK, P-Selectin and intracellular Calcium were tested to be effected by extracellular added cyclic nucleotides. We could show, that cyclic nucleotide derivatives have the power to inhibit platelet activation (stimulated by Thrombin or TRAP6). New is a similar effect with non-cyclic nucleotides like 8-pCPT-5´-GMP and 8-Br-5´-GMP. Guanosine derivatives alone have no effect on platelet activation, so we conclude that the effect might depend on the negative phosphate group of GMP. Furthermore we think that it might be a PGK-independet mechanism because of an early effect even after 15-30 seconds. We could exclude the thrombin receptor as direct interactor by Biacore measurement and suppose that there is some interaction between the guanosine monophosphates and the thromboxane-receptor on the platelet surface. KW - Cyclonucleotide KW - Nucleotide KW - Thrombozyt KW - Aktivierung KW - Cyclo-GMP-Derivate KW - Thrombin KW - Plättchenaktivierung KW - Plättchenhemmung KW - Platets Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53473 ER -