TY - THES A1 - Willier, Semjon Manuel T1 - Funktionelle Charakterisierung des Proteins Thyroid Receptor Interacting Protein 6 (TRIP6) in Ewing-Sarkomen T1 - Functional characterization of TRIP6 in Ewing's Sarcoma N2 - Das Ewing-Sarkom (EFT) ist nach dem Osteosarkom das zweihäufigste Knochen-assoziierte Malignom im Kindesalter. Das entscheidende Ereignis in der Pathogenese dieser Entität stellt eine chromosomale Translokation dar, welche zur Entstehung eines chimären Transkriptionsfaktors, meist EWS-FLI1, führt. Unsere Absicht war es, die Mechanismen zu verstehen, die letztlich zur Metastasierung von Ewing-Sarkomen mit der damit verbundenen, infausten Prognose führen. Die Mitglieder der Zyxin-Proteinfamilie sind in vielfältige zelluläre Funktionen involviert. Hierbei nehmen sie, teilweise funktionell redundant, Einfluss auf zytoplasmatische und nukleäre Prozesse. Durch Analyse von öffentlich verfügbaren Microarraydaten konnten wir belegen, dass lediglich das Protein TRIP6 (thyroid receptor interacting protein 6) aus der Familie in EFT deutlich überexprimiert ist. Dieses Protein ist, neben seiner Funktion in der Organisation des Zytoskeletts, auch nukleär als Kotranskriptionsfaktor und als Element der Telomerprotektion tätig. Vielfach wurde eine Implikation des multifunktionellen Adaptorproteins in maligne Prozesse dokumentiert. Die Überexpression von TRIP6 in EFT ist jedoch unabhängig von EWS-FLI1. Eine Bindung von EWS-FLI1 an eine putative Bindungsstelle im Promotor von TRIP6 konnte nicht nachgewiesen werden. Die Analyse von Microarrays nach TRIP6-Knockdown in EFT-Zelllinien identifizierte mehrere Gensets, welche mit Proliferation und Invasivität assoziiert sind und die nach TRIP6-Knockdown vermindert exprimiert werden. Die für Malignome pathogenetisch relevanten Zielgene Radixin, CD164 und CRYZ konnten als Zielgene des Kotranskriptionsfaktors TRIP6 durch qRT-PCR und Western Blot bestätigt werden. Durch RNA-Interferenz-mediierte Verminderung der Proteinmenge von TRIP6 in EFT kam es zu einer deutlich reduzierten Klonogenität und Migration der Zellen in vitro. Nach induzierbarem TRIP6-Knockdown konnte eine verminderte Tumorigenität und hepatische Metastasierung von hierfür generierten EFT-Einzelzellklonen in vivo beobachtet werden. Zusammengefasst deuten diese Daten auf eine Rolle von TRIP6 in der Pathogenese der EFT und insbesondere beim Prozess der Metastasierung hin. Somit legen diese Ergebnisse eine weitere Evaluierung von TRIP6 als Biomarker oder molekulare Zielstruktur für therapeutische Ansätze in EFT nahe. N2 - Ewing’s sarcoma (ES) is the second most common bone-associated malignancy in children that is driven by the fusion oncogene EWS/FLI1. Despite the great propensity of ES toward early metastasis, recent evidence showed that EWS/FLI1 expression reduces migration and invasiveness of ES cells. However, we strived for exploring the underlying mechanisms of how ES maintains its basal migratory and invasive properties ultimately contributing to metastasis. We focused on the Zyxin-protein family comprising key players in actin remodeling, migration, and invasion. By interrogation of published microarray data, we observed that of all seven Zyxin-proteins only TRIP6 (thyroid receptor interacting protein 6) is highly overexpressed in ES. Besides its effects on cytoskeletal organization, TRIP6 is a nucleocytoplasmic shuttling protein involved in telomere protection, apoptosis, chemo-resistance, and transcriptional control. Initial experiments indicate that TRIP6 expression is independent of EWS/FLI1. However, RNAi-mediated knockdown of TRIP6 in ES cells significantly reduced clonogenicity and migration, whereas proliferation and adhesion were not reduced. DNA microarrays revealed that TRIP6 knockdown is accompanied by the downreguation of important pro-migratory and pro-invasive genes such as Radixin, CD164, and crystalline zeta.Taken together, these data indicate that TRIP6 might partially account for the EWS/FLI1-autonomous migratory and invasive properties of ES KW - Kind / Onkologie KW - TRIP6 KW - pädiatrische Onkologie KW - Ewing-Sarkom Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119241 ER - TY - JOUR A1 - Williams, Tatjana A1 - Machann, Wolfram A1 - Kühler, Leif A1 - Hamm, Henning A1 - Müller-Höcker, Josef A1 - Zimmer, Michael A1 - Ertl, Georg A1 - Ritter, Oliver A1 - Beer, Meinrad A1 - Schönberger, Jost T1 - Novel desmoplakin mutation: juvenile biventricular cardiomyopathy with left ventricular non-compaction and acantholytic palmoplantar keratoderma JF - Clinical Research in Cardiology N2 - Two sons of a consanguineous marriage developed biventricular cardiomyopathy. One boy died of severe heart failure at the age of 6 years, the other was transplanted because of severe heart failure at the age of 10 years. In addition, focal palmoplantar keratoderma and woolly hair were apparent in both boys. As similar phenotypes have been described in Naxos disease and Carvajal syndrome, respectively, the genes for plakoglobin (JUP) and desmoplakin (DSP) were screened for mutations using direct genomic sequencing. A novel homozygous 2 bp deletion was identified in an alternatively spliced region of DSP. The deletion 5208_5209delAG led to a frameshift downstream of amino acid 1,736 with a premature truncation of the predominant cardiac isoform DSP-1. This novel homozygous truncating mutation in the isoform-1 specific region of the DSP C-terminus caused Carvajal syndrome comprising severe early-onset heart failure with features of non-compaction cardiomyopathy, woolly hair and an acantholytic form of palmoplantar keratoderma in our patient. Congenital hair abnormality and manifestation of the cutaneous phenotype in toddler age can help to identify children at risk for cardiac death. KW - Desmoplakin KW - Juvenile biventricular cardiomyopathy KW - Palmoplantar keratoderma Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141198 VL - 100 IS - 12 ER - TY - JOUR A1 - Wildgruber, Moritz A1 - Aschenbrenner, Teresa A1 - Wendorff, Heiko A1 - Czubba, Maria A1 - Glinzer, Almut A1 - Haller, Bernhard A1 - Schiemann, Matthias A1 - Zimmermann, Alexander A1 - Berger, Hermann A1 - Eckstein, Hans-Henning A1 - Meier, Reinhard A1 - Wohlgemuth, Walter A. A1 - Libby, Peter A1 - Zernecke, Alma T1 - The "Intermediate" CD14\(^{++}\)CD16\(^{+}\) monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans JF - Scientific Reports N2 - Monocytes are key players in atherosclerotic. Human monocytes display a considerable heterogeneity and at least three subsets can be distinguished. While the role of monocyte subset heterogeneity has already been well investigated in coronary artery disease (CAD), the knowledge about monocytes and their heterogeneity in peripheral artery occlusive disease (PAOD) still is limited. Therefore, we aimed to investigate monocyte subset heterogeneity in patients with PAOD. Peripheral blood was obtained from 143 patients suffering from PAOD (Rutherford stage I to VI) and three monocyte subsets were identified by flow cytometry: CD14\(^{++}\)CD16\(^{-}\) classical monocytes, CD14\(^{+}\)CD16\(^{++}\) non-classical monocytes and CD14\(^{++}\)CD16\(^{+}\) intermediate monocytes. Additionally the expression of distinct surface markers (CD106, CD162 and myeloperoxidase MPO) was analyzed. Proportions of CD14\(^{++}\)CD16\(^{+}\) intermediate monocyte levels were significantly increased in advanced stages of PAOD, while classical and non-classical monocytes displayed no such trend. Moreover, CD162 and MPO expression increased significantly in intermediate monocyte subsets in advanced disease stages. Likewise, increased CD162 and MPO expression was noted in CD14\(^{++}\)CD16\(^{-}\) classical monocytes. These data suggest substantial dynamics in monocyte subset distributions and phenotypes in different stages of PAOD, which can either serve as biomarkers or as potential therapeutic targets to decrease the inflammatory burden in advanced stages of atherosclerosis. KW - peripheral artery occlusive disease KW - monocyte subset KW - humans Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-167476 VL - 6 IS - 39483 ER - TY - JOUR A1 - Wiegering, Armin A1 - Riegel, Johannes A1 - Wagner, Johanna A1 - Kunzmann, Volker A1 - Baur, Johannes A1 - Walles, Thorsten A1 - Dietz, Ulrich A1 - Loeb, Stefan A1 - Germer, Christoph-Thomas A1 - Steger, Ulrich A1 - Klein, Ingo T1 - The impact of pulmonary metastasectomy in patients with previously resected colorectal cancer liver metastases JF - PLoS ONE N2 - Background 40–50% of patients with colorectal cancer (CRC) will develop liver metastases (CRLM) during the course of the disease. One third of these patients will additionally develop pulmonary metastases. Methods 137 consecutive patients with CRLM, were analyzed regarding survival data, clinical, histological data and treatment. Results were stratified according to the occurrence of pulmonary metastases and metastases resection. Results 39% of all patients with liver resection due to CRLM developed additional lung metastases. 44% of these patients underwent subsequent pulmonary resection. Patients undergoing pulmonary metastasectomy showed a significantly better five-year survival compared to patients not qualified for curative resection (5-year survival 71.2% vs. 28.0%; p = 0.001). Interestingly, the 5-year survival of these patients was even superior to all patients with CRLM, who did not develop pulmonary metastases (77.5% vs. 63.5%; p = 0.015). Patients, whose pulmonary metastases were not resected, were more likely to redevelop liver metastases (50.0% vs 78.6%; p = 0.034). However, the rate of distant metastases did not differ between both groups (54.5 vs.53.6; p = 0.945). Conclusion The occurrence of colorectal lung metastases after curative liver resection does not impact patient survival if pulmonary metastasectomy is feasible. Those patients clearly benefit from repeated resections of the liver and the lung metastases. KW - hepatic resection KW - surgical resection KW - lung resection KW - curative resection KW - metastasis KW - colorectal cancer KW - cancer treatment KW - surgical oncology Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158036 VL - 12 IS - 3 ER - TY - JOUR A1 - Werner, Rudolf A. A1 - Lapa, Constantin A1 - Bluemel, Christina A1 - Lückerath, Katharina A1 - Schirbel, Andreas A1 - Strate, Alexander A1 - Buck, Andreas K. A1 - Herrmann, Ken T1 - Influence of the amount of co-infused amino acids on post-therapeutic potassium levels in peptide receptor radionuclide therapy N2 - Background Peptide receptor radionuclide therapy (PRRT) is routinely used for advanced or metastasized neuroendocrine tumours (NET). To prevent nephrotoxicity, positively charged amino acids (AA) are co-infused. The aim of this study was to correlate the risk for therapy-related hyperkalaemia with the total amount of AA infused. Methods Twenty-two patients undergoing PRRT with standard activities of 177Lu-DOTATATE/-TOC were monitored during two following treatment cycles with co-infusion of 75 and 50 g of AA (L-arginine and L-lysine), respectively. Mean serum levels of potassium and other parameters (glomerular filtration rate [GFR], creatinine, blood urea nitrogen [BUN], phosphate, chloride, lactate dehydrogenase) prior to, 4 h and 24 h after AA infusion were compared. Results Self-limiting hyperkalaemia (>5.0 mmol/l) resolving after 24 h occurred in 91% (20/22) of patients in both protocols. Potassium levels, BUN, creatinine, GFR, phosphate, chloride and LDH showed a similar range at 4 h after co-infusion of 75 or 50 g of AA, respectively (p > 0.05). Only GFR and creatinine levels at 24 h varied significantly between the two co-infusion protocols (p < 0.05). Conclusions Hyperkalaemia is a frequent side effect of AA infusion in PRRT. Varying the dose of co-infused amino acids did not impact on the incidence and severity of hyperkalaemia. KW - NET KW - PRRT KW - Hyperkalaemia KW - Arginine KW - Lysine Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110617 ER - TY - JOUR A1 - Werner, Katharina A1 - Schwede, Frank A1 - Genieser, Hans-Gottfried A1 - Geiger, Jörg A1 - Butt, Elke T1 - Quantification of cAMP and cGMP analogs in intact cells: pitfalls in enzyme immunoassays for cyclic nucleotides JF - Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology N2 - Immunoassays are routinely used as research tools to measure intracellular cAMP and cGMP concentrations. Ideally, this application requires antibodies with high sensitivity and specificity. The present work evaluates the cross-reactivity of commercially available cyclic nucleotide analogs with two non-radioactive and one radioactive cAMP and cGMP immunoassay. Most of the tested cyclic nucleotide analogs showed low degree competition with the antibodies; however, with Rp-cAMPS, 8-Br-cGMP and 8-pCPT-cGMP, a strong cross-reactivity with the corresponding cAMP and cGMP, respectively, immunoassays was observed. The determined EIA-binding constants enabled the measurement of the intracellular cyclic nucleotide concentrations and revealed a time- and lipophilicity-dependent cell membrane permeability of the compounds in the range of 10–30% of the extracellular applied concentration, thus allowing a more accurate prediction of the intracellular analog levels in a given experiment. KW - Cyclic nucleotides KW - Enzyme immunoassay KW - Lipophilicity KW - Cell permeability Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141828 VL - 384 IS - 2 ER - TY - THES A1 - Wagner, Toni T1 - Activity and Crosstalk of STAT3 and BMP Signalling Pathways in Pluripotency Control of Mouse and Medaka Stem Cells T1 - Aktivität und Verschaltung von STAT3 und BMP Signalwegen in der Pluripotenzkontrolle von Maus und Medaka Stammzellen N2 - - 77/83 allerdings inaktiv in Kulturen und Embryonen von Medaka. Dieser Unterschied wird durch Daten aus humanen ES-Zellkulturen unterstützt. Letztere sind ebenfalls komplett STAT3 unabhängig. Die BMP-Smad Kaskade wiederum ist in Medaka-Stammzellen aktiv, Antidifferenzierungsgene wie id2, die durch BMP direkt kontrolliert werden, sind dementsprechend exprimiert. Diese Daten stimmen wiederum mit dem Maussystem überein, während humane ES-Zellen diesbezüglich bislang nicht untersucht wurden. Die Interaktion zwischen verschiedenen Signalwegen ist ein bisher noch nicht gut verstandenes Gebiet. Die Integration verschiedener Signale ist aber speziell für Stammzellen, die ihr Differenzierungsschicksal von winzigen Abweichungen in der Signalmixtur abhängig machen, von entscheidender Bedeutung. Im zweiten Teil der hier vorgelegten Arbeit konnte eine Interaktion zwischen dem BMP-Rezeptor 1a und STAT3 nachgewiesen werden. Diese Interaktion ist offenbar Teil eines variablen Komplexes. Zum ersten Mal war es auch möglich, funktionale Konsequenzen für STAT3 nach Stimulierung des BMP-Rezeptors 1a zu dokumentieren. Nach Belegung des BMP-Rezeptors 1a mit dem mutierten BMP2-A34D wird STAT3 trotz Aktivierung durch Phosphorylierung an Tyrosin 705 im Zytoplasma von Maus Stammzellen festgehalten. Zusammengenommen konnte hier gezeigt werden, dass eine Interaktion zwischen den bislang als isoliert betrachteten Signalwegen BMP-Smad und STAT3 besteht. Des Weiteren wurde das Medaka-Stammzellkultursystem benutzt, um zu zeigen, dass STAT3 für die Pluripotenz von Stammzellen nur im Maussystem eine Rolle spielt, wohingegen BMPZielgene wie id2 in bislang allen getesteten ES-Zellkultursystemen aktiv sind. KW - Stammzellen KW - Pluripotency KW - ES-Cells KW - STAT3 KW - BMP KW - Medaka Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26495 ER - TY - THES A1 - Vielreicher, Martin Christian T1 - Fluoreszenz-mikroskopische Untersuchung der Inaktivierung der Tyrosinkinase SRC im Integrin alphaIIb-beta3 -Signalweg T1 - Studies on the inactivation process of the tyrosine kinase Src in the integrin alphaIIb-beta3 signaling pathway by fluorescence microscopy N2 - Essentiell für die Blutstillung (Haemostase) ist die Thrombozyten- oder Blutplaettchen-Adhaesion und die Thrombus-Bildung. Beide Vorgaenge werden hauptsaechlich durch den Thrombozyten-Rezeptor Integrin alphaIIb-beta3 vermittelt. Nach Bindung des Liganden Fibrinogen aendert sich die Rezeptor-Konformation, Integrine assoziieren und ein intrazellulaeres Signalnetzwerk wird aktiviert, welches die Organisation des Aktin-Zytoskeletts steuert. Diese Zytoskelett-Reorganisationen sind Grundlage für zellulaere Adhaesions- und Aggregations-Prozesse. Die Signalvermittlung vom Integrin zum Zytoskelett wird durch die Protein-Tyrosinkinase Src eingeleitet, deren Aktivitaetszustand den Signalweg reguliert. Bei der Src-Aktivierung wird Tyrosin 418 durch Autokatalyse phosphoryliert. Die Kinase muss jedoch wieder inaktiviert werden. Dies übernimmt in Plaettchen ausschliesslich die Tyrosinkinase Csk (C-terminale Src Kinase) durch Phosphorylierung von Tyrosin 529 im C-terminalen Ende des Proteins. Die Csk-vermittelte Inaktivierung von Src stellt den entscheidenden Kontrollschritt des alphaIIb-beta3-vermittelten Signalwegs dar. Obwohl bekannt ist, dass die Src-Aktivierung bei der Zelladhaesion an den Zellraendern der Lamellipodien geschieht und man den Mechanismus und die Kinetik der Src-Csk Interaktion genauer versteht, ist bislang immer noch unbekannt, wo und wie Src inaktiviert wird bzw. welche Rolle der Src-Inaktivierung genau zukommt. FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) ist ein physikalischer Effekt, mit dem Interaktionen beliebiger fluoreszenzmarkierter Proteine mikroskopisch detektiert werden koennen. Diese Technik wurde genutzt, um die Src-Csk-Interaktion waehrend der alphaIIb-beta3-vermittelten Fibrinogen-Adhaesion in einer etablierten Thrombozyten-Modellzelllinie (A5-CHO) direkt visualisierbar zu machen. Es zeigten sich starke Src-Csk Interaktionen (FRET-Signale) an den Zellraendern aktiver Lamellipodien und zusaetzlich in Fokalkontakten, wo beide Proteine mit Vinculin, einem Fokalkontakte-Marker, co-lokalisierten. Die Proteininteraktionen folgten einem hochdynamischen Ablauf. Nach der Akkumulation der Src-Csk Komplexe an den Zellraendern wanderten sie in Abstaenden von 2-3 Minuten nach innen, fragmentierten und bildeten schliesslich stabile Fokal-Adhaesionen. FRET-Signale an den Zellraendern fanden sich vor allem in ruhenden Lamellipodien bzw., waehrend des Lamellipodien-Rückzugs, in wachsenden Lamellipodien traten die FRET-Signale dort dagegen nicht auf. In unabhaengigen biochemischen Tests im Zeitfenster der FRET-Beobachtungen wurde ein spezifischer Anstieg der Src-Tyr529-Phosphorylierung (Inaktivierung) und eine parallele Abnahme der Src-Tyr418-Phosphorylierung (Aktivierung) gemessen. Weiterführende Ergebnisse lieferten Versuche mit Src- und Csk-Mutanten. Die Co-Expression von Wildtyp-Src mit Kinase-inaktivem CskK222R hatte weder einen Effekt auf die Adhaesion und Ausbreitung der Zellen noch auf die Praesenz von FRET, es aenderte sich jedoch drastisch die zellulaere Verteilung der FRET-Signale sowie das Wachstum und die Form der Lamellipodien. Die Co-Expression von Wildtyp-Csk mit konstitutiv aktivem SrcY529F verursachte dagegen eine stark verringerte Adhaesionsfaehigkeit und Hemmung der Lamellipodien-Bildung. Die Fokal-Adhaesionspunkte in diesen Zellen waren sehr schwach und ueberdimensioniert und lagen ungeordnet verteilt in der Adhaesionsebene. Zusaetzlich verursachte SrcY529F eine starke Ueberaktivierung des Zytoskeletts und das fast vollstaendige Verschwinden der FRET-Signale. Die ermittelten Daten zeigen, dass die enge Kontrolle der Src-Aktivitaet durch Csk eine bedeutende Rolle für die funktionelle Zell-Adhaesion and -Ausbreitung spielt. Co-Immunpraezipitations-Resultate und Messungen der Menge an markiertem Protein in Zellen, in welchen FRET detektierbar war, untermauern zusaetzlich unsere These, zum ersten Mal die Src-Regulation durch Csk in lebenden Zellen direkt beobachtbar gemacht zu haben. Dieser neue FRET-Ansatz kann auch als Reporter-System für Prozesse der Src-Inaktivierung in anderen Signalwegen und Zellen angewendet werden. Das Messprinzip kann weiterhin auf das Studium der Inaktivierung weiterer Mitglieder der Familie der Src-Kinasen (in verschiedensten Signalwegen) erweitert werden. N2 - Platelet adhesion and thrombus formation required for functional hemostasis depends on integrin receptor mediated “outside-in” signaling to the cytoskeleton. Integrin alphaIIb-beta3 is the major integrin on the platelet surface and acts as a specific receptor for the plasma protein fibrinogen. Fibrinogen binding causes clustering of integrins within the plasma membrane activating the protein tyrosine kinase Src (signal initiation) by phosphorylation of tyrosine 418. Src, however, is negatively regulated by another tyrosine kinase, Csk (C-terminal Src kinase), which phosphorylates tyrosine 529. Although, in adhering cells, it is believed that Src is getting activated at lamellipodia leading edges, neither the cellular location nor the dynamics and exact role of Src inactivation is known to date. Here, we studied Src inactivation during alphaIIb-beta3-dependent adhesion to fibrinogen in the established platelet model cell line A5-CHO. Using a live cell FRET (fluorescence resonance energy transfer) microscopy technique with CFP and YFP label molecules (cyan and yellow fluorescent protein), we were able to image highly dynamic Src-Csk interactions at the leading edges of active lamellipodia. Every 2-3 minutes, signals detecting Src-Csk interactions (complexes) appeared at the cell periphery before they begin to move inward in the cell and reorganize while lamellipodia start to protrude (grow). FRET signals were also found in small accumulations at the fringe and also further to the centre of the adhesion plane (focal complexes and adhesions). Src and Csk co-localize with vinculin (a focal adhesion marker) within these regions. During the runtime of FRET observation a specific increase in Src-Tyr529 phosphorylation with a parallel decrease in Src-Tyr418 phosphorylation was observed supporting the idea that Src inactivation occurs within the cells. The role of Src-Csk interaction was studied in further detail using Src and Csk mutants. The data revealed that co-expression of inactive CskK222R did not alter the presence of FRET signals, but fundamentally changed its distribution within the cell. Furthermore it caused lamellipodia shape changes and a tendency of constant lamellipodia protrusion. Co-expression of constitutively active SrcY529F in turn caused a severe adhesion and spreading dysfunction. Adherent cells showed very weak, disorganized and oversized focal adhesions, a hyper-activated cytoskeleton (visible in fast-changing membrane blebs) and absence of FRET signals. Results from immunoprecipitation analyses and protein level determination within cells, in which FRET was detectable, further supported that we were able, for the first time, to directly visualize Src (and integrin) regulation by Csk control in live cells. The results show that Src control by Csk is ultimately required for lamellipodia and focal adhesion function and thus for cell anchorage and spreading. The novel FRET-approach reported here can be readily applied to other integrin and signaling pathways including the study of closely related Src family kinases (SFKs). Results may also contribute to a better understanding of the processes of tumor formation. KW - Antigen CD41 KW - Src-Proteine KW - C-terminal-Src-Kinase KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Thrombozyt KW - CHO-Zelle KW - Lamellipodium KW - Zellskelett KW - Zelladhäsion KW - Integrin alphaIIb-beta3 KW - integrin alphaIIb-beta3 KW - src kinase KW - csk KW - FRET KW - platelet KW - cell adhesion KW - CHO cell KW - lamellipodium KW - actin cytoskeleton Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26743 ER - TY - JOUR A1 - Vaman V. S., Anjana A1 - Poppe, Heiko A1 - Houben, Roland A1 - Grunewald, Thomas G. P. A1 - Goebeler, Matthias A1 - Butt, Elke T1 - LASP1, a Newly Identified Melanocytic Protein with a Possible Role in Melanin Release, but Not in Melanoma Progression JF - PLoS One N2 - The LIM and SH3 protein 1 (LASP1) is a focal adhesion protein. Its expression is increased in many malignant tumors. However, little is known about the physiological role of the protein. In the present study, we investigated the expression and function of LASP1 in normal skin, melanocytic nevi and malignant melanoma. In normal skin, a distinct LASP1 expression is visible only in the basal epidermal layer while in nevi LASP1 protein is detected in all melanocytes. Melanoma exhibit no increase in LASP1 mRNA compared to normal skin. In melanocytes, the protein is bound to dynamin and mainly localized at late melanosomes along the edges and at the tips of the cell. Knockdown of LASP1 results in increased melanin concentration in the cells. Collectively, we identified LASP1 as a hitherto unknown protein in melanocytes and as novel partner of dynamin in the physiological process of membrane constriction and melanosome vesicle release. KW - cell membranes KW - vesicles KW - melanoma cells KW - melanomas KW - melanocytes KW - membrane proteins KW - melanin KW - cell staining Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125994 VL - 10 IS - 6 ER - TY - THES A1 - Untucht, Robert T1 - Design und Klonierung eines Targeting Vektors zur Generierung von Plasmakallikrein-defizienten Mäusen T1 - Designing and cloning of a targeting vector for generating plasma kallikrein deficient mice N2 - Gegenstand dieser Arbeit ist die Erstellung eines sogenannten "Targeting Vektors" zur gezielten Ausschaltung des Gens für Plasmakallikrein in der Maus, als Vorbereitung zur Schaffung einer Plasmakallikrein-defizienten Mauslinie. Plasmakallikrein ist eine im Blut zirkulierende Serinprotease, die Funktionen in Hämostase, Thrombusbildung und Fibrinolyse hat sowie sowohl direkt als auch indirekt mittels Bradykinin an Entzündungsvorgängen beteiligt ist. Zwei 5836 und 3834 bp lange Abschnitte aus dem murinen Plasmakallikrein-Gen wurden durch PCR isoliert und in ein Plasmid kloniert, das neben Resistenzgenen gegen Ampicillin und Neomycin auch das β-Galaktosidase-Gen zum Nachweis einer erfolgreichen Transfektion enthält. Der so entstandene "Targeting Vektor" hat eine Gesamtgröße von 18072 bp, die Basensequenz wurde durch Sequenzierung verifiziert. Der Vektor soll im Plasmakallikrein-Gen einen Teil der Exons 2 und 3 und damit einen Großteil des Signalpeptids und der ersten Proteindomäne funktionsunfähig machen. An den mit dieser Methode erstellten Knockout-Mäusen können die Funktionen von Plasmakallikrein genauer untersucht werden. N2 - This thesis describes the cloning of a targeting vector in the gene targeting strategy for a murine plasma kallikrein (PK) knock-out. PK is a serine protease found in blood which has functions in hemostasis, thrombus formation, fibrinolysis and – both directly and indirectly via bradykinin – inflammation. Two fragments of the murine PK gene with respective lengths of 5836 and 3834 bp were isolated by PCR and cloned into a plasmid containing resistance genes against both ampicillin and neomycin and the β-galactosidase gene for the detection of transfected cells. The targeting vector has a total size of 18072 bp and was verified by sequencing. The vector should destroy parts of the exons 2 and 3 in the gene for PK and thus the greater part of the signal peptide and the first protein domain. With the knock-out mice created by this means the function of PK can be investigated more thoroughly. KW - Kallikreine KW - Maus KW - Plasmakallikrein KW - knockout KW - plasma kallikrein KW - knockout KW - knock-out KW - mouse KW - gene targeting Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78124 ER - TY - THES A1 - Tränka, Christopher T1 - Untersuchungen zur Expression und Funktion des „LIM and SH3 Domain Proteins“ (LASP-1) in Medulloblastomen T1 - Investigation of the expression and function of the "LIM and SH3 Domain Protein" LASP-1 in Medulloblastoma N2 - Medulloblastome (MB) gehören zu den häufigsten Tumorerkrankungen des Kindes- und Jugendalters, in der Gruppe der intrakraniell und intraspinal gelegenen Tumoren stellen sie gar die häufigste Entität in dieser Altersgruppe dar. Die Einteilung der nach WHO Grad IV klassifizierten Medulloblastome erfolgt derzeit hauptsächlich in vier Subgruppen entsprechend der jeweils vorherrschenden molekulargenetischen Veränderungen. Aberrationen der Chromosomen 7 und 17 sind dabei die häufigsten molekulargenetischen Veränderungen der als Hochrisiko-MB eingestuften Tumoren der Gruppe 3 und 4. Das LIM- und SH3-Domänen-Protein „LASP-1“ ist auf Chromosom 17 in der Region q11 – q21.3 codiert und wird im humanen Organismus ubiquitär exprimiert. LASP-1 wurde in vergleichenden mRNA-Analysen als eines der am stärksten hochregulierten Transkripte in MB mit Chromosom 17q – Zugewinn identifiziert. Als ein Aktin – bindendes Gerüstprotein spielt LASP-1 eine wichtige Rolle in der Zytoskelettorganisation humaner Zellen. Die pathophysiologische Bedeutung einer LASP-1-Überexpression wurde bereits unter anderem in Brustkrebs- und Ovarialkrebszellen demonstriert, in denen ein LASP-1-silencing die Migration und Proliferation der Zellen hemmte. Die Ergebnisse dieser Dissertation unterstreichen bisherige Annahmen, dass eine LASP-1-Überexpression eine wichtige Rolle in der Tumorigenese und Metastasenbildung humaner Tumoren spielt. Mittels Immunfluoreszenz konnte die Ko-Lokalisation von LASP-1 und F-Aktin in MB bestätigt werden. Aufgefallen ist dabei eine besonders starke Akkumulation der phosphorylierten Variante von LASP-1 in MB-Zellkernen. Funktionelle Untersuchungen zu LASP-1 in MB erbrachten zudem folgende Ergebnisse: ein LASP-1 silencing mittels small-interfering-RNA (siRNA) führte zu einer signifikant verringerten Proliferations- und Migrationsfähigkeit der untersuchten Tumorzellen. Die Adhäsionsfähigkeit der MB-Zellen konnte durch ein LASP-1-silencing hingegen signifikant gesteigert werden – ein erstmaliger direkter Nachweis des möglichen Einflusses von LASP-1 auf die Adhäsionsfähigkeit humaner Tumorzellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen bisherige Erkenntnisse zur Funktion von LASP-1 in humanen Tumorzellen und übertragen diese auf das humane Medulloblastom. Parallel zu dieser Dissertation durchgeführte immunhistochemische Untersuchungen (DKFZ, Heidelberg) stellten eine signifikante Korrelation einer hohen LASP-1-Expression in humanen MB und einem Zugewinn auf Chromosom 17q, einer fortgeschrittenen Metastasierung sowie schlechterem progressfreien und schlechterem Gesamtüberleben her. Nicht zuletzt im Kontext individualisierter Therapieansätze, basierend auf jeweiligen molekulargenetischen Veränderungen der Tumoren, könnte LASP-1 somit als ein prognostischer Marker in humanen Medulloblastomen dienen und zum Beispiel eine Therapie-(De)Eskalation stützen. N2 - Medulloblastoma is the most common malignant pediatric brain tumor. This WHO grade IV tumor is currently classified into four subgroups, based on the predominant molecular and cytogenetic changes in each tumor. Aberrations of the chromosomes 7 and 17 are most common in high-risk Medulloblastoma (group 3 and group 4 Medulloblastoma). The LIM- and SH3-domain protein "LASP-1" is ubiquitiously expressed in human tissue, but has been shown to be upregulated in several human cancers. Further, it has been identified as one of the most upregulated transcripts in Medulloblastoma harboring a 17q gain. This analysis identifies LASP-1 as an important regulator of cell migration, proliferation and cell adhesion in Medulloblastoma. Upon siRNA LASP-1-silencing in Medulloblastoma celllines, cell migration and proliferation were significantly inhibited, whereas cell adhesion was significantly increased. KW - Medulloblastom KW - LASP-1 KW - Medulloblastoma Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133207 N1 - Aus datenschutzrechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. Eine inhaltlich identische neue Version ist erhältlich unter: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-139539 ER - TY - THES A1 - Tränka, Christopher T1 - Untersuchungen zur Expression und Funktion des „LIM and SH3 Domain Proteins“ (LASP-1) in Medulloblastomen T1 - Investigation of the expression and function of the "LIM and SH3 Domain Protein" LASP-1 in Medulloblastoma N2 - Medulloblastome (MB) gehören zu den häufigsten Tumorerkrankungen des Kindes- und Jugendalters, in der Gruppe der intrakraniell und intraspinal gelegenen Tumoren stellen sie gar die häufigste Entität in dieser Altersgruppe dar. Die Einteilung der nach WHO Grad IV klassifizierten Medulloblastome erfolgt derzeit hauptsächlich in vier Subgruppen entsprechend der jeweils vorherrschenden molekulargenetischen Veränderungen. Aberrationen der Chromosomen 7 und 17 sind dabei die häufigsten molekulargenetischen Veränderungen der als Hochrisiko-MB eingestuften Tumoren der Gruppe 3 und 4. Das LIM- und SH3-Domänen-Protein „LASP-1“ ist auf Chromosom 17 in der Region q11 – q21.3 codiert und wird im humanen Organismus ubiquitär exprimiert. LASP-1 wurde in vergleichenden mRNA-Analysen als eines der am stärksten hochregulierten Transkripte in MB mit Chromosom 17q – Zugewinn identifiziert. Als ein Aktin – bindendes Gerüstprotein spielt LASP-1 eine wichtige Rolle in der Zytoskelettorganisation humaner Zellen. Die pathophysiologische Bedeutung einer LASP-1-Überexpression wurde bereits unter anderem in Brustkrebs- und Ovarialkrebszellen demonstriert, in denen ein LASP-1-silencing die Migration und Proliferation der Zellen hemmte. Die Ergebnisse dieser Dissertation unterstreichen bisherige Annahmen, dass eine LASP-1-Überexpression eine wichtige Rolle in der Tumorigenese und Metastasenbildung humaner Tumoren spielt. Mittels Immunfluoreszenz konnte die Ko-Lokalisation von LASP-1 und F-Aktin in MB bestätigt werden. Aufgefallen ist dabei eine besonders starke Akkumulation der phosphorylierten Variante von LASP-1 in MB-Zellkernen. Funktionelle Untersuchungen zu LASP-1 in MB erbrachten zudem folgende Ergebnisse: ein LASP-1 silencing mittels small-interfering-RNA (siRNA) führte zu einer signifikant verringerten Proliferations- und Migrationsfähigkeit der untersuchten Tumorzellen. Die Adhäsionsfähigkeit der MB-Zellen konnte durch ein LASP-1-silencing hingegen signifikant gesteigert werden – ein erstmaliger direkter Nachweis des möglichen Einflusses von LASP-1 auf die Adhäsionsfähigkeit humaner Tumorzellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen bisherige Erkenntnisse zur Funktion von LASP-1 in humanen Tumorzellen und übertragen diese auf das humane Medulloblastom. Parallel zu dieser Dissertation durchgeführte immunhistochemische Untersuchungen (DKFZ, Heidelberg) stellten eine signifikante Korrelation einer hohen LASP-1-Expression in humanen MB und einem Zugewinn auf Chromosom 17q, einer fortgeschrittenen Metastasierung sowie schlechterem progressfreien und schlechterem Gesamtüberleben her. Nicht zuletzt im Kontext individualisierter Therapieansätze, basierend auf jeweiligen molekulargenetischen Veränderungen der Tumoren, könnte LASP-1 somit als ein prognostischer Marker in humanen Medulloblastomen dienen und zum Beispiel eine Therapie-(De)Eskalation stützen. N2 - Medulloblastoma is the most common malignant pediatric brain tumor. This WHO grade IV tumor is currently classified into four subgroups, based on the predominant molecular and cytogenetic changes in each tumor. Aberrations of the chromosomes 7 and 17 are most common in high-risk Medulloblastoma (group 3 and group 4 Medulloblastoma). The LIM- and SH3-domain protein "LASP-1" is ubiquitiously expressed in human tissue, but has been shown to be upregulated in several human cancers. Further, it has been identified as one of the most upregulated transcripts in Medulloblastoma harboring a 17q gain. This analysis identifies LASP-1 as an important regulator of cell migration, proliferation and cell adhesion in Medulloblastoma. Upon siRNA LASP-1-silencing in Medulloblastoma celllines, cell migration and proliferation were significantly inhibited, whereas cell adhesion was significantly increased. KW - Medulloblastom KW - Medulloblastoma KW - LASP-1 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139539 N1 - Dieses Dokument wurde aus Datenschutzgründen - ohne inhaltliche Änderungen - erneut veröffentlicht. Die ursprüngliche Veröffentlichung war am 13.05.2016 ER - TY - JOUR A1 - Trifault, Barbara A1 - Mamontova, Victoria A1 - Cossa, Giacomo A1 - Ganskih, Sabina A1 - Wei, Yuanjie A1 - Hofstetter, Julia A1 - Bhandare, Pranjali A1 - Baluapuri, Apoorva A1 - Nieto, Blanca A1 - Solvie, Daniel A1 - Ade, Carsten P. A1 - Gallant, Peter A1 - Wolf, Elmar A1 - Larsen, Dorthe H. A1 - Munschauer, Mathias A1 - Burger, Kaspar T1 - Nucleolar detention of NONO shields DNA double-strand breaks from aberrant transcripts JF - Nucleic Acids Research N2 - RNA-binding proteins emerge as effectors of the DNA damage response (DDR). The multifunctional non-POU domain-containing octamer-binding protein NONO/p54\(^{nrb}\) marks nuclear paraspeckles in unperturbed cells, but also undergoes re-localization to the nucleolus upon induction of DNA double-strand breaks (DSBs). However, NONO nucleolar re-localization is poorly understood. Here we show that the topoisomerase II inhibitor etoposide stimulates the production of RNA polymerase II-dependent, DNA damage-inducible antisense intergenic non-coding RNA (asincRNA) in human cancer cells. Such transcripts originate from distinct nucleolar intergenic spacer regions and form DNA–RNA hybrids to tether NONO to the nucleolus in an RNA recognition motif 1 domain-dependent manner. NONO occupancy at protein-coding gene promoters is reduced by etoposide, which attenuates pre-mRNA synthesis, enhances NONO binding to pre-mRNA transcripts and is accompanied by nucleolar detention of a subset of such transcripts. The depletion or mutation of NONO interferes with detention and prolongs DSB signalling. Together, we describe a nucleolar DDR pathway that shields NONO and aberrant transcripts from DSBs to promote DNA repair. KW - genome integrity KW - repair and replication KW - NONO KW - DNA double-strand breaks KW - aberrant transcripts Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350208 VL - 52 IS - 6 ER - TY - THES A1 - Tjahyadi, Budy T1 - Etablierung und Anwendung eines Proteinphosphorylierungs-Assays zur Quantifizierung der Wirkung von Endothelfaktoren auf Thrombozyten T1 - A protein phosphorylation-based assay for Quantification of endothelfactors in human Thrombocytes N2 - Anhand der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente lässt sich feststellen, dass der VASP-POD-Assay eine sensitive Methode zur Erfassung der Aktivität humaner Thrombozyten ist. Mithilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion kann der hemmende Effekt zahlreicher Vasodilatoren auf Thrombozytenaktivität quantitativ in-vitro erfasst werden. VASP, das Zielantigen dieser Reaktion, spielt eine Schlüsselrolle. Der Phospho¬rylierungszustand dieses Proteins beeinflusst die Thrombozytenaktivierung bzw. Hemmung der Thrombozytenaktivität. Die Phosphorylierung von VASP wiederum bedingt sowohl eine intrazelluläre NO/cGMP- als auch PGI2/cAMP-Signalkaskade. Die cAMP bzw. cGMP abhängigen Signalkaskaden können durch VASP-Phorylierung an Serin 157 und Serin 239 quantifiziert werden. Die Verwendung von mit Meerretich¬peroxidase konjugierten Antikörpern erlaubt eine quantitative Messung von Phospho-VASP Anteil am Gesamt-VASP. Diese markiert den phosphorylierten Serinrest des VASP. Ebengenanntes Verhältnis von Phospho-VASP zum Gesamt-VASP korreliert wiederum mit Hemmung der Thrombozytenaggregation. Die thrombozyten¬aggregationshemmende Wirkung von vasodilatierenden Substanzen – wie z.B. NO und PGI2 – kann durch die Messung der VASP-Phosphorylierung mithilfe VASP-POD-Assay quantifiziert werden. Diese Substanzen entfalten ihre Wirkung durch intrazelluläre Erhöhung von zyklischen Nukleotiden (cAMP und cGMP). Die thrombozytäre VASP-Phosphorylierung unter Wirkung von NO bzw. PGI2. wurden in-vitro in unterschiedlichen Bedingungen – sowohl in gewaschenen Thrombozyten als auch in Vollblut – ermittelt. Somit ist P-VASP als biochemischer Marker für das Monitoring der NO/cGMP- bzw. PGI2/cAMP-Signalkaskade in humanen Thrombozyten geeignet. Eine Interaktion zwischen Thrombozyten und Endothelzellen kann außerdem mithilfe von VASP-POD-Assay ermittelt werden. In einem vereinfachten Modell des humanen, geschlossenen Kreislaufsystems wurden gewaschene Thrombozyten und Endothelzellen mit verschiedenen Substanzen, die endotheliale NO-Synthese stimulieren und somit die NO-Bioverfügbarkeit erhöhen, inkubiert. Die Erhöhung der extrazellulären NO-Bioverfügbarkeit korreliert mit dem intrazellulären Anstieg des P-VASP Anteils am Gesamt-VASP in Thrombozyten. Durch die Messung der intrathrombozytären VASP-Phosphorylierung in VASP-POD-Assay kann man indirekt Rückschlüsse auf die Wirkung dieser Substanzen auf die Thrombozytenaktivität und die Interaktion zwischen humanen Thrombozyten und Endothelzellen ziehen. Zur Verifizierung der Empfindlichkeit dieser Analysenmethode wurde der VASP-Phosphorylierungsgrad von Thrombozyten gesunder Probanden mit der an Diabetes Mellitus erkrankten Probanden verglichen. Die gesteigerte Thrombozytenaktivität von erkrankten Probanden kann unter Verwendung dieses Verfahrens (VASP-POD-Assay) diagnostiziert und quantifiziert werden. VASP-Assay ermöglicht eine schnelle, leichte und reproduzierbare Quantifizierung der Interaktion zwischen Thrombozyten und Endothelzellen. Somit wird das gesetzte Ziel der Entwicklung dieser Messmethode erreicht, nämlich die Früherkennung gestörter Interaktion zwischen humanen Thrombozyten und Endothel¬zellen und folglich die pathologische Veränderung des Funktionszustandes humaner Thrombozyten bei Diabetes Mellitus in Frühstadium. Unter Berücksichtigung des thrombozytenaggregationshemmenden Effekts des P-VASP kann die Stimulation zur Phosphorylierung von VASP einerseits als protektive Maßnahme und andererseits als möglicher Angriffspunkt der zukünftigen Medikation betrachtet werden. N2 - Cyclic nucleotide plays a big role in thrombocyte regulation. Techniques for screening and monitoring of cyclic nucleotide have to be established. Here we develope an assay based on VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) - phosphorylation for the monitoring of intracellular cyclic nucleotide levels. Two phosphorylation sites are specifically phosphorylated by these kinases (Serin 239 and Serin 157). KW - VASP KW - VASP Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54155 ER - TY - THES A1 - Thumati, Naresh Reddy T1 - Characterization of new protein kinases of the EVH1 domain containing protein VASP and identification of binding partners for a new EVH1 domain of the Spred2 protein : A case study on protein interactions of EVH1 domain containing proteins N2 - Protein interactions as mediated by catalytic or non-catalytic protein domains contribute to cellular signal transduction processes by covalent protein modification of or non-covalent binding to interaction partners. Ena/VASP homology 1 (EVH1) domains are found in different signal transduction proteins as N-terminal non-catalytic adaptor modules of ~ 115 amino acids sharing a common fold. By targeting their host proteins to subcellular sites of action they are involved in several signalling cascades which include protein phosphorylation and cytoskeletal reorganisation. In this study, protein interactions of the two EVH1 domain containing proteins VASP and Spred2 were studied according to their involvement in different and non-overlapping signal transduction pathways of the cell. EVH1 domains were first described in the Ena/VASP protein family with the Vasodilator-stimulated phosphoprotein VASP being its founding member. As a cytoskeleton-associated protein VASP not only interacts with different proteins of the actin network but it is also a substrate for cAMP- and cGMP-dependent protein kinases. However the full complement of protein kinases targeting VASP as their substrate is still unknown. Here we used mouse cardiac fibroblast (MCFB) cells in order to study the phosphorylation status of VASP and identify new candidate protein kinases involved after serum stimulation of these cells. Using phosphosite-specific antibodies we found that serum stimulation induces a phosphorylation of VASP at Ser-157 in a time-dependent manner reaching its maximum after 90 min of stimulation. We developed an interaction graph model of possible candidate protein kinases involved. Using a pharmacological perturbation analysis with different combinations of specific protein kinase inhibitors and activators we excluded any contribution of cGMP-dependent protein kinase and Rho kinases to this process and identified a combined action of classical isoforms of PKCs and PKA in serum-stimulated VASP phosphorylation at Ser-157 positioning PKC upstream of PKA in this signalling pathway. We hypothesise that PKC receives an external stimulatory signal upon serum stimulation of MCFB cells which is passed either directly or indirectly to PKA which finally phosphorylates VASP at Ser-157. A new EVH1 domain has been described recently in the Spred proteins (Sprouty related proteins containing an EVH1 domain) which are inhibitors of the Ras/Raf/MAP kinase pathway. Our laboratory has been involved in the elucidation of the atomic structure of the human Spred2 EVH1 domain by protein NMR spectroscopy (PDB 2JP2; 2007). A positively charged binding interface of this EVH1 domain suggests an interaction with negatively charged ligands; however no interaction partners of this domain have been described so far. In the second part of this study, we used different genetic and biochemical screening methods to search for ligands of the Spred2 EVH1 domain. A bacterial two-hybrid system was established using a physically well characterized interaction of the VASP EVH1 domain with a panel of its ActA binding peptides as positive controls to screen a human brain cDNA expression library at different stringencies for candidate Spred2 EVH1 interaction partners. However none of the clones isolated could be genetically and physically validated to support Spred2 EVH1 specific interactions. An in-vitro screening of a 9-mer phage display peptide library using purified GST-Spred2 EVH1 fusion protein was performed together with a Fyn-SH3 fusion protein as a positive control. In contrast to the Fyn-SH3 domain the majority of phages isolated with the Spred2 EVH1 domain either carried no inserts or inserts with stop codons suggesting a highly non-specific interaction of the phage coat protein with the latter domain but neither the Fyn-SH3 domain nor the GST moiety. Isolation of a 13-mer proline-rich sequence was particularly surprising in this context. In order to address possible interactions of the Spred2 EVH1 domain with non-peptidergic ligands protein-lipid interaction assays were performed. Quantitative binding studies to purified Spred2 EVH1 using a liposome sedimentation assay however excluded any interaction of candidate phospholipids of the phosphatidyl inositol phosphate class with the Spred2 EVH1 domain. A natively folded and thus binding-competent conformation of the purified proteins used was assessed independently by 1H protein NMR spectroscopy. In summary the cumulative evidence of our genetic and biochemical screening experiments suggests that the still elusive Spred2 EVH1 ligand(s) may be formed of hydrophobic peptide epitopes larger than nine amino acids in size and carrying negative charge(s). A phosphorylation of Spred2 EVH1 binding epitopes by a post-translational modification should be seriously considered in future experiments. N2 - Proteininteraktionen, wie sie durch katalytisch oder nicht-katalytisch wirksame Proteindomänen vermittelt werden können, spielen eine wesentliche Rolle in zellulären Signaltransduktionsprozessen durch die kovalente Modifikation oder nicht-kovalente Bindung von Interaktionspartnern. Ena/VASP Homologie 1 (EVH1) Domänen finden sich als N-terminale, nicht-katalytische, etwa 115 Aminosäuren große und konserviert gefaltete Adaptormodule in vielen verschiedenen Signaltransduktionsproteinen. Indem sie ihre jeweiligen Wirtsproteine an deren subzellulärem Wirkort verankern helfen, sind sie an vielen verschiedenen Signalkaskaden wie z.B. Proteinphosphorylierungen oder Umbauprozessen des Zytoskeletts beteiligt. In dieser Arbeiten wurden Proteininteraktionen der beiden EVH1 domänen-haltigen Proteine VASP and Spred2 untersucht, die in nicht überlappenden Signaltransduktionswegen der Zelle vorkommen. EVH1 Domänen wurden zuerst innerhalb der Ena/VASP-Proteinfamilie beschrieben, deren Gründungsmitglied das Vasodilator-stimulierte Phosphoprotein VASP ist. Als zytoskelett-assoziiertes Protein wechselwirkt VASP nicht nur mit verschiedenen Aktin-bindenden Proteinen, sondern ist auch ein Substrat der cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen. Der vollständige Satz jener Proteinkinasen, die VASP als eines ihrer Substrate aufweisen, ist immer noch unbekannt. Hier haben wir kardiale Mausfibroblasten (MCFB) Zellen verwendet, um nach Serum-Stimulation dieser Zellen den Phosphorylierungsstatus von VASP zu bestimmen und daran beteiligte, neue Kandidaten-Proteinkinasen zu identifizieren. Mit Hilfe von Phosphorylierungsstellen-spezifischen Antikörpern konnten wir zeigen, dass eine Serum-Stimulation eine zeitabhängige Phosphorylierung von VASP an Serin 157 induziert, die ein Maximum 90 min nach Stimulation erreicht. Wir entwickelten ein Interaktionsgraphen-Modell möglicher Kandidaten-Proteinkinasen, die an diesem Prozess beteiligt sein könnten. Mit Hilfe pharmakologischer Perturbationsexperimente auf der Grundlage spezifischer Proteinkinase-Inhibitoren und Aktivatoren konnten wir einerseits eine Beteiligung der löslichen cGMP-abhängigen Proteinkinase und von Rho-Kinasen an diesem Prozess ausschliessen und anderseits die gemeinsame Beteiligung der klassischen Proteinkinase C Isoform(en) und der cAMP-abhängigen Proteinkinase nachweisen. In diesem Signalweg liegt dabei die Proteinkinase C stromaufwärts vor letzterer. Nach unserer Interpretation der Daten wird die PKC nach Serum-Stimulation der MCFB-Zellen aktiviert und aktiviert ihrerseits direkt oder indirekt die cAMP-abhängige Proteinkinase, die schliesslich VASP als proximales Substrat am Serin 157 phosphoryliert. Eine neue EVH1 Domäne wurde kürzlich in den Spred Proteinen (Sprouty related proteins containing an EVH1 domain) beschrieben, die neue Inhibitoren im Ras/Raf/MAP-Kinase-Signalweg darstellen. Unser Labor war an der NMR-gestützten Aufklärung der atomaren Struktur der Spred2 EVH1 Domäne beteiligt (PDB 2JP2; 2007). Die positiv geladene Bindungsfurche dieser EVH1 Domäne legt eine Interaktion mit anionischen Liganden nahe. Interaktionspartner für diese Domäne sind bisher jedoch nicht beschrieben worden. Im zweiten Teil dieser Arbeit verwendeten wir verschiedene genetische und biochemische Suchverfahren zur Identifizierung möglicher Spred2 EVH1 Liganden. Ein bakterielles Two-Hybrid-System mit der Spred2 EVH1 Domäne als Köderprotein wurde dazu etabliert unter Verwendung der physikalisch gut charakterisierten Wechselwirkung der VASP EVH1 Domäne mit ihren ActA Bindungspeptiden als eines positiven Kontroll-Interaktionspaars und zum verschieden stringenten Durchmustern einer humanen cDNA Expressionsgenbank aus Gehirn eingesetzt. Keiner der isolierten Klone ließ sich jedoch genetisch oder nach Sequenzierung in Hinblick auf eine Spred2 EVH1 spezifische Wechselwirkung validieren. Mittels gereinigtem GST-Spred2 EVH1 Protein wurde daher eine 9-mer Peptid-Genbank im Phage-Display-Verfahren durchgemustert unter Verwendung eines Fyn-SH3 Fusionsproteins als positiver Kontrolle. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit letzterer trugen die mit der Spred2 EVH1 Domäne isolierten Phagen überwiegend keine Inserts oder solche mit Stop-Codons, was eine unspezifische Wechselwirkung mit den Phagen-Hüllenproteinen dieser Domäne nicht jedoch der Fyn-SH3 Domäne oder des GST-Partners nahelegt. Die Isolierung einer 13-mer großen prolin-reichen Bindesequenz war in diesem Zusammenhang besonders überraschend. Um eine mögliche Wechselwirkung von Spred2 EVH1 mit nicht-peptidergen Liganden zu untersuchen, wurden Protein-Phospholipid-Interaktionsassays durchgeführt. Mittels quantitativer Bindungsstudien unter Verwendung der isolierten Domäne konnte eine Interaktion mit Kandidaten-Phospholipiden aus der Klasse der Phosphatidylinositolphosphate in einem Liposomen-Sedimentationsassay ausgeschlossen werden. Eine native Faltung und damit prinzipiell bindungskompetente Konformation(en) der gereinigten Proteine konnten mittels 1H Protein-NMR-Spektroskopie sichergestellt werden. Zusammengenommen lassen unsere Experimente vermuten, dass es sich bei den noch immer nicht dingfest gemachten Spred2 EVH1 Liganden um hydrophobe, negative geladene, mehr als neun Aminosäuren umfassende Peptidepitope handeln könnte. Bei deren Identifizierung in zukünftigen Experimenten sollte mit ihrer Phosphorylierung durch post-translationale Modifikationen gerechnet werden. KW - VASP KW - Spred KW - EVH1 domains KW - Protein interactions KW - VASP KW - Spred KW - EVH1 domains KW - Protein interactions KW - VASP KW - Spred KW - EVH1 domains KW - Protein interactions Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26617 ER - TY - THES A1 - Teichmann, Lino Lars T1 - Stromabwärts der cGMP-abhängigen Proteinkinase in Thrombozyten - Physiologische und diagnostische Relevanz von VASP und Identifikation neuer Substrate T1 - Downstream of the cGMP-dependent protein kinase in platelets – physiological and diagnostic relevance of VASP and identification of new substrates N2 - Clopidogrel hat sich als potentes Medikament zur Verhinderung kardiovaskulärer Ereignisse sowohl bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom ohne ST-Hebung (non-STE-ACS) als auch bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt mit ST-Hebung (STEMI) erwiesen (CURE- und COMMIT-Studie). Insbesondere der Nutzen einer Vorbehandlung mit Clopidogrel bei perkutaner Koronarintervention ist bei Patienten mit non-STE-ACS und STEMI gut belegt (PCI-CURE- und PCI-CLARITY-Studie). Ein beträchtlicher Anteil der Patienten zeigt allerdings kein adäquates Ansprechverhalten auf Clopidogrel. Wir etablierten deswegen zusätzlich zu einem bereits bestehenden FACS-Assay, der den Effekt von Clopidogrel anhand der Phosphorylierung des Proteins VASP quantitativ bestimmt, einen neuartigen auf dem gleichen Prinzip beruhenden enzyme-immuno assay (EIA). In einer Doppelblindstudie mit gesunden Probanden spiegelten im systematischen Vergleich von VASP-EIA, VASP-FACS und anderer verbreiteter Verfahren (Aggregation, p-Selektin Expresssion, PFA100) sowohl die VASP-Assays als auch die Aggregation die Plättchen-Inhibition deutlich wider. Demgegenüber waren weder die p-Selektin Expression noch der PFA100 ein Indikator für den Clopidogrel-Effekt. Die VASP-Assays zeichneten sich im Vergleich zur Aggregation durch bessere Quantifizierbarkeit und eine enge Abhängigkeit von der Zielstruktur des Clopidogrels, dem P2Y12-Rezeptor, aus. So hatte eine Medikation mit Acetylsalicylsäure keinen Einfluss auf die VASP-Assays, verminderte allerdings die Aggregation. Weiterhin konnten wir im Rahmen der Probandenstudie durch Verwendung PAR- (protease activated receptor) spezifischer Peptide (SFFLRN, AYPGKF) und dem stabilen Thromboxan A2 Analog U46619 in ex-vivo Versuchen nachweisen, dass die antithrombozytären Eigenschaften des Clopidogrels zum Teil auf der indirekten Hemmung der Thrombin- und Thromboxan-induzierten Plättchenaktivierung beruhen. Diese Ergebnisse betonen die zentrale Bedeutung Galpha(i)-vermittelter Signalwege in Thrombozyten. Im zweiten Teil dieser Arbeit strebten wir an, neue Substrate der cGMP-abhängigen Proteinkinase zu identifizieren und das bekannte Substrat VASP weiter zu charakterisieren. Die Plättchenadhäsion und -aktivierung an der Zellwand sind initiale Ereignisse der arteriellen Thrombose. Prostacyclin und NO erhöhen die intrazelluläre Konzentration zyklischer Nukleotide (cAMP, cGMP). Dies führt zu einer umfassenden Inhibition der Thrombozyten, hauptsächlich durch Aktivierung der cAMP- bzw. cGMP-abhängige Proteinkinase (cAK, cGK). Es liegt bisher kein schlüssiges Bild davon vor, wie die Substrate der cAK und cGK die Plättcheninhibition regulieren. Wir identifizierten zunächst das adenylylcyclase-associated protein (CAP1) anhand der Analyse des humanen Plättchen-Phosphoproteoms als neues Substrat der cGK, das innerhalb von Sekunden nach SNP-Stimulation phosphoryliert wird. Die Separation des Phosphoproteoms erfolgte durch 2D-Gelelektrophorese. Wildtyp-CAP1 und Mutanten, bei denen an putativen Phosphorylierungsstellen Serin bzw. Threonin durch Alanin ausgetauscht wurde, wurden anschließend in PtK2-Zellen exprimiert. Bisher konnte die Ko-Transfektion von PtK2-Zellen mit CAP1 und cGK eine Phosphorylierung von CAP1 durch die cGK nicht bestätigen. Weitere Anstrengungen werden nötig sein, CAP1 als cGK-Substrat zu etablieren. Flusskammerversuche zeigten, dass die Hemmung der Thrombusformation durch SNP bei VASP-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (WT) ineffektiv ist und belegen, dass die Inhibition der Agonisten-induzierten Thrombusformation durch den NO/cGMP-Signalweg in VASP-defizienten Plättchen gestört ist. VASP hatte in unseren Experimenten keinen signifikanten Einfluss auf die GPIIbIIIa-Aktivierung (gemessen mit dem monoklonalen Antikörper JON/A), die Serotonin-Sekretion (delta-Granula) und die p-Selektin-Expression (alpha-Granula). Die Ergebnisse legen nahe, dass die VASP-Deletion zu subtilen Störungen von Thrombozytenfunktionen führt, die erst in Experimenten deutlich zu Tage treten, die ihr Zusammenspiel abbilden. N2 - Dual-antiplatelet therapy with aspirin and clopidogrel has become the standard therapy to prevent cardiovascular complications of acute coronary syndrome and percutaneous coronary intervention. Increasing experience, however, indicates that a significant proportion of patients do not respond adequately to clopidogrel. We performed a double blinded clinical study with healthy volunteers receiving clopidogrel or placebo to compare various assays of platelet responsiveness, including two methods (a newly established enzyme immunoassay and a FACS assay) based on VASP phosphorylation, for monitoring clopidogrel action. In the clopidogrel group ADP-induced platelet aggregation and the ADP-induced decrease in iloprost-stimulated VASP phosphorylation was attenuated significantly as compared to the placebo group. P-selectin and PFA100 measurements failed to clearly distinguish between the placebo and clopidogrel group of this study. The VASP assays directly measure the function of the clopidogrel target, the P2Y12 receptor, and are selective for clopidogrel effects. Hence the VASP assays are, in contrast to platelet aggregation, not affected by aspirin. In the framework of the study we could additionally demonstrate that the antithrombocytic properties of clopidogrel are partly due to the indirect inhibition of the thrombin and thromboxane induced platelet activation. These results underline the importance of Galpha(i) mediated signalling pathways in platelets. Prostacyclin and NO increase the intracellular concentrations of cyclic nucleotides (cGMP, cAMP). This process results in platelet inhibition mainly by activation of the cGMP- and cAMP-dependent proteinkinase (cGK Ibeta, cAK). How these kinases regulate platelet inhibition is an active field of research. In the second part of the work we therefore sought to identify new substrates of the cGMP-dependent proteinkinase and to further characterize its well established substrate VASP. We initially identified the adenylylcyclase-associated protein (CAP1) as a new substrate of the cGK Ibeta analyzing the human platelet phosphoproteom by two-dimensional gel electrophoresis. To evaluate the role of CAP1 as an in vivo substrate of cGK Ibeta (and cAK) PtK-2 cells were transfected with wildtype CAP1 or the mutants S125A and T375A and cGK Ibeta simultaneously or with either protein alone. Phosphorylation of CAP1 by cGK I beta could not be confirmed as yet and further efforts will be necessary to answer the question whether CAP1 really is a cGK Ibeta substrate. Flowchamber experiments revealed that the inhibition of thrombus formation in whole blood of VASP deficient mice (when compared to wild type) was impaired with the NO donor sodium nitroprusside. Thus VASP plays a major role in the inhibitory NO/cGMP signalling pathway in platelets. KW - Blutstillung KW - Thrombozyt KW - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein KW - Clopidogrel KW - Haemostasis KW - platelets KW - Vasodilator-stimulated phosphoprotein KW - Clopidogrel Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25843 ER - TY - THES A1 - Sutor, Dominic Christian T1 - Induktion von FGF19 & FXR in humanen HT-29 Zellen unter Verwendung der nukleären Agonisten Vitamin D3, Vitamin A & CDCA T1 - Induction of FGF19 & FXR in human HT-29 cells with nuclear agonists vitamin D3, vitamin A and CDCA N2 - Ziel dieser Arbeit ist es, weitere Einblicke in die Aktivierung von FGF19 und FXR durch diverse nukleäre Agonisten und deren spezifischer Rezeptoren zu gewinnen. Hierbei soll im humanen Zellmodell versucht und mittels DNA-Analyse untersucht werden, welche messbaren molekularbiologischen Auswirkungen eine Behandlung mit unterschiedlichen Substanzen in variierenden Konzentrationen bewirkt. Genauer soll betrachtet werden, ob sich Vitamin A und Vitamin D als Induktoren von FGF19 in menschlichen Darmzelllinien eignen, da dies bereits im Mausmodel demonstriert werden konnte. Dieser initialen Vermutung folgend, sollen auch die möglichen Wechselwirkungen und Synergismen untersucht werden – welche Mechanismen liegen diese zu Grunde und über welche molekularen Signalwege werden dies vermuteten Effekte vermittelt. Hierdurch soll ein besseres Verständnis für die Rezeptor und Agonistenabhängigen Abläufe ermöglicht werden, um mögliche Rückschlüsse auf weitere Funktionen bereits bekannter Vertreter zu erlauben. Aufgrund der bereits oben beschriebenen Tiermodelle und der daraus gewonnenen Einsichten würde sich durch ein noch besseres Verständnis des FGF15/19 und des Farnesoid X Rezeptors in menschlichen Zellen, auf eine zukünftige Anwendung in analytischen und/oder therapeutischen Bereichen hoffen lassen. Diese Arbeit soll sich deshalb den Fragen widmen, ob eine FGF19 Induktion in humanen Darmzellen durch die nukleären Agonisten VD3, 9-cis RA und CDCA, ähnlich dem Mausmodel, möglich ist und welche Faktoren dabei Einflüsse auf die beschriebenen Effekte haben. N2 - This study demonstrates the induction potentials of vitamin A derivate 9-cis retinoic acid (9-cis RA), 1,25 (OH)² vitamin D3 and chenodeoxycholic acid (CDCA) on the gut-derived hormone Fibroblast Growth Factor 19 as well as a key-control element of the bile acid metabolism, the Farnesoid X Receptor. In conclusion, our data provides evidence for an important role of vitamin A as a novel potent regulator of intestinal FGF19 in humans, in contrast to previously discovered mechanisms in the murine model. KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - FGF19 KW - FXR KW - RXR KW - RAR KW - Vitamin A Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141152 ER - TY - JOUR A1 - Subramanian, Hariharan A1 - Döring, Frank A1 - Kollert, Sina A1 - Rukoyatkina, Natalia A1 - Sturm, Julia A1 - Gambaryan, Stepan A1 - Stellzig-Eisenhauer, Angelika A1 - Meyer-Marcotty, Philipp A1 - Eigenthaler, Martin A1 - Wischmeyer, Erhard T1 - PTH1R Mutants Found in Patients with Primary Failure of Tooth Eruption Disrupt G-Protein Signaling JF - PLoS One N2 - Aim Primary failure of tooth eruption (PFE) is causally linked to heterozygous mutations of the parathyroid hormone receptor (PTH1R) gene. The mutants described so far lead to exchange of amino acids or truncation of the protein that may result in structural changes of the expressed PTH1R. However, functional effects of these mutations have not been investigated yet. Materials and Methods In HEK293 cells, PTH1R wild type was co-transfected with selected PTH1R mutants identified in patients with PFE. The effects on activation of PTH-regulated intracellular signaling pathways were analyzed by ELISA and Western immunoblotting. Differential effects of wild type and mutated PTH1R on TRESK ion channel regulation were analyzed by electrophysiological recordings in Xenopus laevis oocytes. Results In HEK293 cells, activation of PTH1R wild type increases cAMP and in response activates cAMP-stimulated protein kinase as detected by phosphorylation of the vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP). In contrast, the PTH1R mutants are functionally inactive and mutant PTH1R/Gly452Glu has a dominant negative effect on the signaling of PTH1R wild type. Confocal imaging revealed that wild type PTH1R is expressed on the cell surface, whereas PTH1R/Gly452Glu mutant is mostly retained inside the cell. Furthermore, in contrast to wild type PTH1R which substantially augmented K+ currents of TRESK channels, coupling of mutated PTH1R to TRESK channels was completely abolished. Conclusions PTH1R mutations affect intracellular PTH-regulated signaling in vitro. In patients with primary failure of tooth eruption defective signaling of PTH1R mutations is suggested to occur in dento-alveolar cells and thus may lead to impaired tooth movement. KW - phosphorylation KW - xenopus oocytes KW - calcium signaling KW - intracellular receptors KW - mutation KW - teeth KW - tooth eruption KW - transfection Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147967 VL - 11 IS - 11 ER - TY - JOUR A1 - Stölting, Miriam A1 - Wiesner, Christiane A1 - van Vliet, Vanessa A1 - Butt, Elke A1 - Pavenstädt, Hermann A1 - Linder, Stefan A1 - Kremerskothen, Joachim T1 - Lasp-1 Regulates Podosome Function JF - PLoS One N2 - Eukaryotic cells form a variety of adhesive structures to connect with their environment and to regulate cell motility. In contrast to classical focal adhesions, podosomes, highly dynamic structures of different cell types, are actively engaged in matrix remodelling and degradation. Podosomes are composed of an actin-rich core region surrounded by a ring-like structure containing signalling molecules, motor proteins as well as cytoskeleton-associated proteins. Lasp-1 is a ubiquitously expressed, actin-binding protein that is known to regulate cytoskeleton architecture and cell migration. This multidomain protein is predominantely present at focal adhesions, however, a second pool of Lasp-1 molecules is also found at lamellipodia and vesicle-like microdomains in the cytosol. In this report, we show that Lasp-1 is a novel component and regulator of podosomes. Immunofluorescence studies reveal a localization of Lasp-1 in the podosome ring structure, where it colocalizes with zyxin and vinculin. Life cell imaging experiments demonstrate that Lasp-1 is recruited in early steps of podosome assembly. A siRNA-mediated Lasp-1 knockdown in human macrophages affects podosome dynamics as well as their matrix degradation capacity. In summary, our data indicate that Lasp-1 is a novel component of podosomes and is involved in the regulation of podosomal function. KW - discrete KW - smooth muscle cells KW - microdomains KW - actin cytoskeleton KW - endothelial cells KW - epithelial cells KW - cancer cells KW - phosphorylation KW - invadopodia KW - dependent protein-kinase KW - camp signaling pathway Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134315 VL - 7 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Schütze, Friedrich A1 - Röhring, Florian A1 - Vorlová, Sandra A1 - Gätzner, Sabine A1 - Kuhn, Anja A1 - Ergün, Süleyman A1 - Henke, Erik T1 - Inhibition of lysyl oxidases improves drug diffusion and increases efficacy of cytotoxic treatment in 3D tumor models JF - Scientific Reports N2 - Tumors are characterized by a rigid, highly cross-linked extracellular matrix (ECM), which impedes homogeneous drug distribution and potentially protects malignant cells from exposure to therapeutics. Lysyl oxidases are major contributors to tissue stiffness and the elevated expression of these enzymes observed in most cancers might influence drug distribution and efficacy. We examined the effect of lysyl oxidases on drug distribution and efficacy in 3D in vitro assay systems. In our experiments elevated lysyl oxidase activity was responsible for reduced drug diffusion under hypoxic conditions and consequently impaired cytotoxicity of various chemotherapeutics. This effect was only observed in 3D settings but not in 2D-cell culture, confirming that lysyl oxidases affect drug efficacy by modification of the ECM and do not confer a direct desensitizing effect. Both drug diffusion and efficacy were strongly enhanced by inhibition of lysyl oxidases. The results from the in vitro experiments correlated with tumor drug distribution in vivo, and predicted response to therapeutics in murine tumor models. Our results demonstrate that lysyl oxidase activity modulates the physical barrier function of ECM for small molecule drugs influencing their therapeutic efficacy. Targeting this process has the potential to significantly enhance therapeutic efficacy in the treatment of malignant diseases. KW - human osteosarcoma xenografts KW - factor binding profiles KW - open-access database KW - vascular normalization KW - solid tumors KW - transcapillary pressure gradient KW - hypoxia inducible factor 1 KW - breast cancer cells KW - beta-aminopropionitrile KW - pancreatic cancer Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145109 VL - 5 IS - 17576 ER -