TY - THES A1 - Hubertus, Katharina T1 - Regulation des cAMP Spiegel und der Signaltransduktion in humanen Thrombozyten durch Prostanoid-Rezeptoren T1 - Regulation of cAMP level and signaltransduction in human platelets by prostanoid-receptors N2 - Prostanoide wirken über Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten. In dieser Arbeit wurde die Existenz und Funktionsweise der Prostanoid-Rezeptoren anhand synthetischer Agonisten und Antagonisten in humanen Thrombozyten nachgewiesen. Weiter wurde untersucht, über welche Prostanoid-Rezeptoren die Signaltransduktion der natürlichen Agonisten wie PGE2, PGE1 und PGA1 vermittelt wird, sowie das Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten gezeigt. Das Vorhandensein der Prostaglandin E2 Synthase 3 wurde nachgewiesen sowie erste Anhaltspunkte für die Existenz eines Komplexes aus Prostaglandin E2 Synthase 3, Hitzeschockprotein-90 sowie Casein Kinase 2 gezeigt. N2 - Prostanoids act to platelet activation or inhibition via prostanoid-receptors. In this work, the existence and function of prostanoid receptors in human platelets was shown by using sythetic agonists and antagonists. Further, the prostanoid receptors taking part at the signaltransduction induced by endogen prostanoids like PGE2, PGE1 and PGA1 were examinated. The interactions of the prostanoid receptors in platelet activation and inhibition were shown. The existence of prostaglandin E2 synthase 3 in human platelets was shown and first evidence for a complexe of prostaglandin E2 synthase 3, heat shock protein 90 and casein kinase 2 was given. KW - Prostaglandine KW - Rezeptor KW - Cyclo-AMP KW - Prostanoid-Rezeptor KW - cAMP KW - Prostanoide KW - Thrombozyt KW - prostanoid receptor KW - platelets KW - cAMP KW - prostanoids Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71996 ER - TY - JOUR A1 - Beyrich, Claudia A1 - Löffler, Jürgen A1 - Kobsar, Anna A1 - Speer, Christian P. A1 - Kneitz, Susanne A1 - Eigenthaler, Martin T1 - Infection of Human Coronary Artery Endothelial Cells by Group B Streptococcus Contributes to Dysregulation of Apoptosis, Hemostasis, and Innate Immune Responses [Research Article] N2 - Early onset sepsis due to group B streptococcus leads to neonatal morbidity, increased mortality, and long-term neurological deficencies. Interaction between septicemic GBS and confluent monolayers of human coronary artery endothelial cells (HCAECs) was analyzed by genome wide expression profiling. In total, 124 genes were differentially expressed (89 upregulated, 35 downregulated) based on a more than 3-fold difference to control HCAEC. Regulated genes are involved in apoptosis, hemostasis, oxidative stress response, infection, and inflammation. Regulation of selected genes and proteins identified in the gene array analysis was confirmed by Real-time RT-PCR assay (granulocy te chemotactic protein 2), ELISA (urokinase, cyclooxygenase 2, granulocyte chemotactic protein 1), and western blotting (Heme oxygenase1, BCL2 interacting protein) at various time points between 4 and 24 hours. These results indicate that GBS infection might influence signalling pathways leading to impaired function of the innate immune system and hemorrhagic and inflammatory complications during GBS sepsis. KW - Medizin Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68834 ER - TY - THES A1 - Plaß, Armin T1 - Molekulargenetische Diagnostik des Von-Willebrand-Syndroms basierend auf der Analyse der genomischen DNA und der vWF-cDNA T1 - Molecular genetic diagnostic of von-willebrand-syndrome based on the analysis of genomic DNA and vWF-cDNA N2 - Der vWF ist ein sehr großes Protein, das im Plasma als Multimer vorliegt und an der Blutgerinnung beteiligt ist. Der Größe entsprechend handelt es sich um ein Protein, das zahlreiche Funktionen bei diesem Prozess übernimmt. Genauso vielfältig können sich auch unterschiedliche Defekte des vWF auf die Hämostase auswirken. Die genetische Analyse der zu Grunde liegenden Defekte kann bei der Diagnose der von-Willebrand-Erkrankung aber auch bei der Therapie zusätzliche Informationen liefern. Ziel dieser Arbeit war es, die Mutationen im vWF-Gen zweier Patienten auf cDNA-Ebene nachzuweisen und diese in Zusammenhang mit ihrem klinischen Erscheinungsbild und den Laborparametern zu stellen. Zu diesem Zweck wurde Thrombozyten-RNA der Patienten isoliert, durch RT-PCR in cDNA umgeschrieben und sequenziert. Bei Patient 1, der eine milde Klinik aufweist, fanden sich die nicht-gekoppelten Mutationen p.R760C und p.R854Q, die bereits von Casonato und Mitarbeitern 2007 beschriebenen wurden. Im Gegensatz zu den dort festgestellten quantitativen und funktionellen Veränderungen des vWF resultiert bei unserem Patienten ein rein quantitativer Defekt. Eine de novo Mutation könnte bei Patient 1 Ursache eines somatischen Mosaiks und damit des milden Phänotyps sein. Bei Patientin 2 fand sich ein Basenaustausch von Adenin nach Thymin an der Transkript-Position 3437 (c.3437A>G). Im Gegensatz zu dem von Goodeve et al. 2007 beschriebenen Patienten mit der von-Willebrand-Erkrankung vom Typ 1, der genau diese Mutation zeigte 51, konnte bei unserer Patientin keine weitere Mutation im vWF-Gen festgestellt werden. Diese Mutation alleine führt jedoch auch zu der von-Willebrand-Erkrankung vom Typ 1, die sich in einer Verringerung der vWF-Menge, also einem quantitativen Defekt, äußert. Die Etablierung der RNA-Isolation und cDNA-Synthese aus Plättchen konnte darüber hinaus eingesetzt werden, um spezifische Transkripte in Plättchen nachzuweisen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass für die massenspektrometrisch in Plättchen nachgewiesene Metalloendopeptidase Nardilysin auch das Transkript detektiert werden kann. Durch RT-PCR konnte belegt werden, dass die mRNA der beiden Isoformen NRD1-001 und NRD1-002 in Thrombozyten vorkommt. N2 - Von-Willebrand-factor is a large multimeric protein that is secreted into plasma and involved in primary haemostasis. Consistent with the size of the protein, vWF plays a key role in several functions in the haemostatic process. Genetic defects in the vWF result in numerous phenotypically different bleeding abnormalities. Mutation screening can be useful in diagnosis and therapy of the disease. Aim of this work was the confirmation of vWF-gene mutations in two patients on cDNA level and the classification in relation to phenotypic parameters. RNA was extracted from the patient´s platelets, transcribed reversely by RT-PCR and sequenced. Patient 1 shows only a mild bleeding phenotype. He is a carrier of two heterozygous mutations, p.R760C and p.R854Q, a combination already described by Casonato et al 2007 in a patient suffering of quantitative and qualitative vWF defects. Our patient only shows a qualitative reduction of vWF. One of the mutations found in patient 1 could be due to a de novo mutation, affecting only part of the cells and so resulting in a mild phenotype. In patient 2, the heterozygous mutation c.3437A>G was confirmed. A patient carrying this mutation was described by Goodeve et al 2007. This patient was a carrier of an additional mutation in the vWF-gene which could be excluded in our patient. The single mutation is sufficient to explain vWD type 1, characterized by reduced but structurally normal vWF. The establishment of RNA isolation and cDNA synthesis from platelets could also be used in transcript-profiling of platelets. After identifying Nardilysin, a metalloendopeptidase, in platelets by mass spectrometry tools we could confirm this observation on cDNA level. Two different alternatively spliced isoforms of Nardilysin, NRD1-001 and NRD1-002, could be verified in platelets. KW - Willebrand-Jürgens-Syndrom KW - Molekulargenetik KW - Thrombozyt KW - von-willebrand-syndrom KW - nardilysin KW - r854q KW - r760c KW - y1146c KW - von-willebrand-syndrome KW - nardilysin KW - r854q KW - r760c KW - y1146c Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72822 ER - TY - THES A1 - Klett, Sebastian T1 - Untersuchungen zur Rolle der Proteinkinase B auf die Expression fibroserelevanter Gene T1 - Investigation to the role of Proteinkinase B / AKT on expression of fibrosis related genes N2 - Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen im Alter führende Todesursachen in der westlichen Welt dar. Der Proteinkinase B, auch AKT genannt, kommt am Herzen eine zentrale Rolle bezüglich der Organogenese zu. Ihre Funktion wird in Verbindung mit der Insulinwirkung, dem Einfluss auf den Kohlenhydrat-stoffwechsel sowie die Steuerung von Entwicklung und Differenzierung von Geweben durch Modulation des Zellüberlebens, des Zellwachstum und der Zellteilung diskutiert. Auch das postnatale Herzwachstum in physiologischer sowie pathologischer Ausprägung wird durch den PKB/AKT-Signalweg reguliert. Diez et al.zeigten bei seneszenten Kardiofibroblasten der Ratte in vitro eine reduzierte Expression der PKB/AKT-1. Auch bei Myokard-Biopsaten von jungen und alten Patienten (ohne Myokardpathologie) konnte gezeigt werden, dass die Expressionstärke der AKT-1/PKB mit dem Alter abnahm. Die vorliegende Arbeit sollte die Frage klären ob AKT/PKB zu einer veränderten Expression von extrazellulären Matrix-Proteinen, die sie abbauenden Matrixmetalloproteinasen bzw. deren Inhibitoren führt und damit zu einer Umstrukturierung der Extrazellulären Matrix im Sinne einer Fibrose des Myokards beitragen könnte. Nach adenoviraler Transfektion von Kardiofibroblasten mit einer konstitutiv aktiven bzw. inaktiven PKB/AKT-Mutanten, erfolgte die Analyse der differentiellen Genexpression fibroserelevanter Gene mittels RT-PCR und Agarosegelelektrophorese in drei verschiedenen Zellzuständen. Die Auswertung der gewonnen Daten zeigte, dass von den untersuchten Genen lediglich die Matrix-Metalloproteinasen (MMPs).-2/-9/-13 einer deutlichen Regulation unterworfen sind. Die Darstellung auf Proteinebene gelang für die MMP-9 und MMP-2 letztendlich mittels Zymographie. Bezugnehmend auf die Fragestellung zeigte sich bei der durchgeführten Genexpressionsanalyse fibroserelevanter Gene eine Regulation der MMP-2/-9 und -13 durch die PKB/AKT auf m-RNS-Ebene, mit deutlichem Anstieg der für die MMP-9 und MMP-13 kodierenden m-RNS bei Inaktivierung der PKB/AKT. Auf Proteinebene besteht lediglich bei der MMP-9 eine entsprechende Änderung der Proteinmenge. Die MMP-2-Enzymmenge zeigte sich auf basalem Expressionsniveau als nicht reguliert. Die MMP-13 konnte zymographisch nicht nachgewiesen werden. Bezugnehmend auf die durch Diez et al. gefundene Herabregulation der PKB-Akt in seneszenten Kardiofibroblasten der Ratte könnte die in der Arbeit gezeigte Steigerung der Genexpression der MMP-2/-9 und 13 die Voraussetzung eines zur Fibrose führenden Remodelings der kardialen extrazellulären Matrix im Sinne einer Degradation der EZM darstellen. Nach Schram und Sweeney et al. kann sich ein Remodeling der extrazellulären Matrix des Herzens schwerpunktmäßig sowohl als Veränderungen in der Synthese von matrixbildenden Proteinen als auch in Veränderungen der Expression und Aktivität von MMPs und TIMPs darstellen. Neben der wichtigen Wirkung eines antiapoptotischen Zellschutzes könnte die Serin-Threonin-Kinase PKB/AKT mit an der Entstehung einer myokardialen Fibrose beteiligt sein. Weitere Untersuchungen sind aber nötig, diese Frage eindeutig zu klären. N2 - The protein kinase B (PKB/AKT) play a central role in the organogenesis of the heart. Its function is discussed to be associated with the effects of insulin, the influence on carbohydrate-metabolism, development and differentiation of tissues and modulation of cell-survival, growth and proliferation. The postnatal growth of the heart in physiologically and pathologically manner is modulated by the action of PKB. Diez et al. showed an in-vitro reduction of PKB expression in senescent cardiac fibroblasts of the rat. A reduced expression of PKB was also found in myocardial samples of older patients in comparison to younger ones. The aim of the work was to investigate the influence of PKB/AKT on the expression of fibrosis related genes. After adenoviral transfection of fibroblasts with constitutive active and inactive mutants of PKB/AKT the analysis of gene expression was done by PCR and agarose-gel-electrophoresis. The results showed that the Matrix-Metallo-Proteinases (MMPs) -2/-9 and -13 are regulated by the action of PKB, with apparent upregulation of MMP-9 and MMP-13 following an inactivation of PKB/AKT on messenger-RNA-level. Changes on protein-level were detected by zymography. Only in case of MMP-9 we could see an analogous change. MMP-13 could not be detected. The amount of MMP-2-enzyme was not regulated on a basal expression level. The downregulation of PKB/AKT in senescent cardiac fibroblasts found by Diez et al. could lead to an upregulation of MMP-2/-9 and -13. This could be the requirement for a remodeling of the extracellular matrix of the myocardium leading to cardiac fibrosis in sense of degradation. Therefore the PKB/AKT could be involved in the development of a myocardial fibrosis. KW - Proteinkinase B KW - Fibrose KW - Chronische Herzinsuffizienz KW - Herzinsuffizienz KW - Extrazelluläre Matrix KW - Matrixmetalloproteinase KW - MMP KW - PKB KW - heart KW - fibrosis KW - Proteinkinase B KW - PKB Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-50178 ER - TY - THES A1 - Schleider, Elisa T1 - Angiogenese-Modellsysteme zur Funktionsanalyse des humanen CCM3 Proteins T1 - Angiogenesis in vitro modeling of human CCM3 function N2 - Zerebrovaskuläre kavernöse Malformationen (CCM) sind Blutgefäßfehlbildungen, welche hauptsächlich im Gehirn vorkommen. Sie sind gekennzeichnet durch stark dilatierte kapillarähnliche Gefäße mit niedriger Flussrate („slow-flow lesions“). Intervenierendes Gehirnparenchym fehlt ebenso wie Perizyten oder glatte Gefäßmuskelzellen. Die klinischen Symptome reichen von starken Kopfschmerzen über Epilepsie bis hin zum Schlaganfall. Dennoch bleiben viele Kavernomträger aufgrund unvollständiger Penetranz ihr Leben lang asymptomatisch. Die Prävalenz beträgt ca. 0,5% in der Gesamtbevölkerung. Es gibt sowohl sporadische als auch dominant vererbte Krankheitsformen. In den letzten Jahren konnten 3 Gene ursächlich mit der Krankheit in Verbindung gebracht werden. Mutationen in CCM1, CCM2 oder CCM3 führen zu einem nicht unterscheidbaren klinischen Phänotyp. Alle drei Proteine bilden einen ternären Komplex in vitro, was eine Beteiligung an einem gemeinsamen molekularen Signalweg bekräftigt. Während die Proteine CCM1 und CCM2 in den letzten Jahren umfangreich erforscht wurden, ist über das CCM3-Protein bis heute wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CCM3 eine wichtige Rolle in der Angiogenese spielt und diese bei Überexpression in humanen Endothelzellen stark negativ reguliert: die Migration, die Proliferation und die Fähigkeit, kapillarähnliche Strukturen in Matrix-Gelen zu bilden kommt nahezu zum Erliegen. Ein gegenläufiger Effekt nach siRNA induziertem Knock-down von CCM3 war weniger stark ausgeprägt. Einzig die Fähigkeit, gefäßähnliche Strukturen in Matrigelen zu bilden, war erhöht. Um weiterhin Klarheit über die intrazellulären, von CCM3 beeinflussten Signalwege zu schaffen, wurden Tyrosin Kinase Arrays durchgeführt, bei welchen CCM3-überexprimierende HUVEC Lysate mit Kontrolllysaten verglichen wurden. Dabei stellte sich heraus, dass 5 Substrate signifikant erhöht phosphoryliert wurden: der Discoidin Domänen Rezeptor 1 (discoidin domain receptor; DDR1), die duale spezifitätstyrosinphosphorylierungsregulierte Kinase 1A (dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A; DYR1A), die Protoonkogen Tyrosin- Protein Kinase FER (proto-oncogene tyrosine-protein kinase FER; FER), die fynbezogene Kinase (Fyn-related kinase; FRK) und die phosphoinositolabhängige Kinase 1 (Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDPK-1). Im Folgenden bestätigten Western Blot, dass die Überexpression von CCM3 in Endothelzellen die phosphoinositolabhängige Kinase 1 und die nachgeschaltete Serin-Threonin Kinase Akt/PBK aktiviert, welche ein bedeutsames Überlebenssignal der Zelle darstellt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass CCM3 nicht nur antiangiogen, sondern auch antiapoptotisch wirkt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass CCM3 für die Integrität des ruhenden, adulten Endothelbettes wichtig ist. N2 - Cerebral cavernous malformations are slow-flow vascular lesions, mainly located in the brain. They consist of blood-filled dilated capillary-like vessels without brain parenchyma or mural cells. Clinical symptoms include intense headaches, epilepsy and stroke. However, about 40% of lesion carriers live without any symptoms throughout their lives due to incomplete penetrance. The disease prevalence is 0.5% in the population. Sporadic as well as autosomal-dominantly inherited familial forms exist. In recent years, 3 disease-related genes have been identified. Mutations within CCM1, CCM2 or CCM3 lead to indistinguishable clinical phenotypes. All three proteins form a ternary complex in vitro, confirming their participation in one main signaling pathway. While CCM1 and CCM2 have been explored to a great extent over the past years, little is known about CCM3 and its function so far. In this study, we show that CCM3 plays an important role in angiogenesis. Upon overexpression it has strong negative effects in endothelial cells. The ability to migrate, proliferate and to form capillary-like structures in matrix gels is significantly impaired. Knockdown experiments with siRNA against CCM3 did not reveal such distinct effects. Only the ability to form capillary-like structures was elevated. To identify signaling pathways modulated by CCM3, tyrosine kinase arrays were conducted. Lysates from HUVECs overexpressing CCM3 were compared with control lysates. Five substrates revealed significantly increased phosphorylation: the discoidin domain receptor 1 (DDR1), the dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A (DYR1A), the proto-oncogene tyrosine-protein kinase FER (FER), the fyn-related kinase (FRK) and the Phosphoinositidedependent kinase 1 (PDPK-1). The candidate 3-Phosphoinositide-dependent protein kinase- 1 is an important upstream activator of the serine-threonine kinase Akt/PKB. Subsequent experiments confirmed and demonstrated that p-PDPK-1 and p-Akt are activated in lysates overexpressing CCM3. In agreement with the fact that Akt is important for cell survival, we could finally show that CCM3 is both antiangiogenic and antiapoptotic. Our data suggest that CCM3 plays a role in maintaining quiescence of adult vascular endothelial cells. KW - Blutgefäß KW - Missbildung KW - Gehirn KW - Genanalyse KW - Endothelzelle KW - Angiogenese KW - CCM3 KW - Endothelzellen KW - CCM3 KW - endothelial cells KW - angiogenesis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51504 N1 - Includes articles: - Stahl, S., Gaetzner, S., Voss, K., Brackertz, B., Schleider, E., Sürücü, O., Kunze, E., Netzer, C., Korenke, C., Finckh, U., Habek, M., Poljakovic, Z., Elbracht, M., Rudnik-Schöneborn, S., Bertalanffy, H., Sure, U., Felbor, U. (2007) Novel CCM1, CCM2, and CCM3 mutations in patients with cerebral cavernous malformations: in-frame deletion in CCM2 prevents formation of a CCM1/CCM2/CCM3 protein complex. Hum Mutat, 29, 709-717. - Voss, K., Stahl, S., Reinders, J., Hogan, B.M., Schleider, E., Schulte-Merker, S., Felbor, U. (2009) Functional analysis of human and zebrafish 18 amino acid in-frame deletion pave the way for domain mapping of the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Hum Mutat, 30, 1003-1011. - Schleider, E., Stahl, S., Wüstehube, J., Walter, U., Fischer, A., Felbor, U. (2010) Evidence for anti-angiogenic and pro-survival functions of the cerebral cavernous malformation protein 3. Neurogenetics, submitted ER - TY - THES A1 - Fröhling, Tobias Marius T1 - Untersuchungen zur Wirkungsweise von Zyklonukleotiden auf die Thrombozytenaktivierung T1 - Investigations on the effectiveness of cyclic nucleotides on platelet activation N2 - In der vorliegenden Arbeit ging es darum, die inhibierende Wirkung von extrazellulär zugefügten GMP-Derivaten auf die Thrombozytenaktivierung nachzuweisen. Anhand verschiedener thrombozytärer Aktivierungsmarker wie ERK, der Expression von P-Selektin und intrazellulärem Kalziumeinstrom zeigte sich eine signifikante Inhibition der Thrombozytenaktivierung durch zyklische GMP-Analoga. Neu ist, dass auch nicht-zyklische GMP-Derivate eindeutig einen hemmenden Effekt aufweisen. Guanosin-Derivate alleine führen dagegen weder zu einer Hemmung noch zu einer vermehrten Stimulation der Plättchenaktivierung. Die Wirkung der GMP-Analoga scheint von der negativen Phosphatgruppe abhängig zu sein. Der frühe Zeitpunkt der Inhibition und die Tatsache, dass auch Hemmer der PKG einen inhibierenden Effekt auf die Thrombozytenaktierung aufweisen, führen zu der Hypothese, dass es sich um PGK-unabhängige Effekte handelt. Der Thrombinrezeptor als Wirkort der GMP-Analoga konnte in Biacore-Messungen ausgeschlossen werden. Es gilt nun, speziell den Thromboxanrezeptor auf mögliche Interaktionen mit GMP-Derivaten hin zu untersuchen. N2 - Platelets play a key role in hemostasis through their ability to rapidly adhere to activated or injured endothelium, subendothelial matrix proteins and other activated platelets. A strong equilibrium between activating and inhibiting processes is essential for normal platelet and vascular function, impairment of this equilibrium being associated with either thrombophilic or bleeding disorders. Cyclic guanosine monophosphate is a crucial and synergistic intracellular messenger that mediates the effects of platelet inhibitors such as nitric oxide (NO) and prostacyclin (PG-I2). This work investigated the effects of extracellular-cyclic-nucleotides on platelet-activation. Different platelet-activation markers like ERK, P-Selectin and intracellular Calcium were tested to be effected by extracellular added cyclic nucleotides. We could show, that cyclic nucleotide derivatives have the power to inhibit platelet activation (stimulated by Thrombin or TRAP6). New is a similar effect with non-cyclic nucleotides like 8-pCPT-5´-GMP and 8-Br-5´-GMP. Guanosine derivatives alone have no effect on platelet activation, so we conclude that the effect might depend on the negative phosphate group of GMP. Furthermore we think that it might be a PGK-independet mechanism because of an early effect even after 15-30 seconds. We could exclude the thrombin receptor as direct interactor by Biacore measurement and suppose that there is some interaction between the guanosine monophosphates and the thromboxane-receptor on the platelet surface. KW - Cyclonucleotide KW - Nucleotide KW - Thrombozyt KW - Aktivierung KW - Cyclo-GMP-Derivate KW - Thrombin KW - Plättchenaktivierung KW - Plättchenhemmung KW - Platets Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53473 ER - TY - THES A1 - Frietsch, Jochen T1 - Genetische Untersuchungen zur Amplifikation des Gens lasp-1 sowie statistische Auswertung der Auswirkungen der Proteinlokalisation auf das Langzeitüberleben T1 - Genetic analysis of lasp-1 gene Amplification and statistic analysis of the impact of LASP-1s localization on long-term survival N2 - Brustkrebs ist gegenwärtig die häufigste bösartige Erkrankung der Frau weltweit und verantwortlich für 15 % der Krebs¬todes-ursachen in der westlichen Welt. Maligne Erkrankungen in metastasierten Stadien gelten generell als unheilbar mit einem medianen Überleben von wenigen Jahren. Das LIM und SH3 Domänen Protein (LASP-1) ist ein spezielles fokales Ad¬hä¬sions-protein, das an den Vorgängen der Zellproliferation und -migration beteiligt ist. Der Knockdown von LASP-1 in metastatischen Brust- und Eier¬stock¬krebs-zelllinien führt zu einer starken Hemmung der Zellmigration und -proliferation. Um¬ge-kehrt kommt es nach Überexpression des Proteins in nicht neoplastischen Zellen zu einer erhöhten Migration. Bei den von uns untersuchten Patientinnen mit Brust- oder Eierstockkrebs korreliert die Überexpression des Proteins mit fortgeschrittener Tumor-größe und Lymphknoten-Metastasierung. Die genetische Analyse von 63 mikrodissektierten histologischen Brust-krebs-Schnittpräparaten mit anschließender qRT PCR auf LASP-1 ergab (mit nur einer positiven Probe; 1,6 %) allerdings keine Amplifikation des Gens. Es scheint, dass die LASP 1 Proteinüberexpression als aktiver Prozess in der Tumorgenese aufgefasst werden kann und in der Mehrheit der Brustkrebsfälle bevorzugt durch trans¬krip-tionelle Regulation als durch Gen¬amplifi¬ka-tion hervorgerufen wird. LASP-1 ist nicht ausschließlich ein zytosolisch lokalisiertes Protein, sondern in malignen Zellen außerdem im Zellkern nachweisbar. In einer Langzeitstudie (Januar 1985 – Dezember 2007) wurde anhand anti-LASP-1 gefärbter histologischer Schnittpräparate die LASP Expression bestimmt und mit dem Patienten-Überleben korreliert. Patientinnen mit nukleärer LASP-1-Lokalisation zeigen, im Vergleich zu nukleär-LASP-1 negativen Schnitten, ein signifikant (p = 0,0250) reduziertes Langzeitüberleben. Mit diesen Ergebnissen lassen sich zukünftig vielleicht prognostische Aussagen über die Auswirkungen der LASP-1-Expression für den einzelnen Patienten treffen. N2 - Breast cancer currently is the most frequent cancer in women worldwide and accounts for 15 % of cancer deaths in the western world. Metastatic diseases is generally considered as incurable with a median survival time of only a few years. The LIM and SH3 protein 1 (LASP-1) is a specific focal adhesion protein involved in cell proliferation and migration. The knockdown of LASP-1 in metastatic breast cancer and ovarian cancer cell lines results in a strong decrease in cell proliferation and cell migration. Reversely, ectopic over-expression of LASP-1 in non-neoplastic cells leads to an increase in migration. In patients with breast and ovarian cancer addressed in this study, the protein overexpression correlates with increased tumor size and nodal positivity. Quantitative analysis of genomic LASP-1 DNA in micro-dissected histological slices and subsequent qRT-PCR detected a LASP-1 amplification in only 1 out of 64 tissue samples, representing a negligible rate of LASP1 gene amplification. Therefore, LASP-1 overexpression is not due to LASP-1 gene amplification and can be interpreted as an active process in tumorigenesis which is caused through transcriptional regulation rather than gene amplification in the vast majority of human breast cancers. LASP-1 is not exclusively a cytoplasic protein, but has also been found in the nucleus of maligne transformed cells. In the present continuative long-term follow-up (January 1985 – December 2007) patient survival was correlated with LASP-1 expression using paraffin sections stained for LASP-1. Patients with nuclear location of LASP-1 show a significantly decreased long-term survival (p= 0,0250) in contrast to the subgroup of patients without nuclear LASP-1 expression. These results may lead to prognostic statements about the consequences of LASP-1 expression for individual patients. KW - Brustkrebs KW - Überleben KW - Proteine KW - LASP-1 KW - Ki67 KW - PDEF KW - p53 KW - breast cancer Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54262 ER - TY - THES A1 - Schnurr, Axel T1 - Variabilität der Thrombozytenhemmung durch den ADP-Antagonisten Clopidogrel bei Patienten mit koronarer Herzerkrankung T1 - Variability of adp-antagonist clopidogrel induced platelet inhibition in patients with ischaemic heart disease N2 - Zum Nachweis einer interindividuellen Variabilität bei der Therapie mit Clopidogrel wurden in dieser Promotionsarbeit Patienten mit ausreichender Therapiedauer auf eine verbleibende Aktivierbarkeit der Thrombozyten untersucht. Hierfür wurde eine auf Phosphorylierung des Proteins VASP basierender Assay, der mittlerweile auch kommerziell verfügbar ist, eingesetzt. Dieser auf einer durchflusszytometrische Analyse beruhende Test zeigte bei 10 % der untersuchten Patienten eine Restaktivierbarkeit der Thrombozyten trotz ausreichender Thienopyridin-Einnahme. Die statistische Analyse erbrachte den Nachweis von zwei Untergruppen: Eine Untergruppe zeigte trotz Clopidogrel-Therapie eine fast normale Aktivierbarkeit der Thrombozyten („non-responder“), die andere zeigt eine teilweise Thrombozytenfunktionshemmung („low-responder“). In der statistischen Analyse wurde eine deutliche Signifikanz der Ergebnisse mittels Students-t-Test festgestellt. Aus zufällig ausgewählten Proben der „non-responder“ und der adäquat reagierenden Patienten konnte eine Veränderung intrazelluläre Signalwege nicht nachgewiesen werden. Nach Veröffentlichung der Gensequenz für den P2Y12 Rezeptor erfolgte die entsprechende Genanalyse bei diesen Patienten. Es konnten 2 stumme Polymophismen nachgewiesen werden, diese jedoch sowohl in der Gruppe der Responder als auch bei Low-/Non-Respondern. Somit wurde in dieser Promotionsarbeit das mittlerweile von verschiedenen Arbeitsgruppen diskutierte, bei etwa 10 % der Patienten auftretende Therapieversagen von Thienopyridinen bestätigt. Eine Genveränderung oder Änderungen intrazellulärer Signalwege konnte als molekulare Ursache nicht gezeigt werden. N2 - To detect interindividual varabilities during clopidogrel treatment we investigated patients with sufficient treatment duration for remaining activation of platelets. For detection we used an VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) based assay, which is commercially available. This assay works with flow cell detection system (FACS) and showed in 10 % of all investigated patients remaining platelet activatiation even though thienopyridine treatment was sufficint. The statistic analysis showed two sub-groups of remaining platelet acitivity: one consisted of patients with completely regular platelet acitivity (non-responder), the other showed partial remaining acitivity (low-responder). The statistic analysis using a student-t-test proved a solid significance of the results. Randomly chosen probes out of the non-responder sub-group and the regular reacting patients showed no changes in intra-cellular pathways. The in 2000 newly published gene-sequence of the P2Y12 receptor was utilized to look for mutations/variations. Two silent polymorphism were detected in both (low- and non-responder) sub-groups. In this thesis we added to the increasingly published number of articles reporting a 10 % non-responding to thienopyridine treatment. For this variation no gene sequence alternation or change in intracellular pathway singalling were found responsible. KW - Clopidogrel KW - Variabilität KW - Herzkrankheit KW - Thrombozyt KW - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein KW - Therapieresistenz KW - clopidogrel KW - variability KW - ischaemic heart disease KW - platelet KW - vasodilator-stimulated phosphoprotein KW - therapy non-responder Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49677 ER - TY - THES A1 - Hilfer, Oxana T1 - Stabilität plasmatischer Gerinnungsfaktoren in humanen Thrombozytenkonzentraten und Plasma T1 - Stability of the Plasmatic Hemostatic Capacity in Platelet and Plasma Concentrates N2 - Die vorliegende Arbeit untersuchte die Veränderungen der wichtigsten hämostatischen Komponenten der plasmatischen Gerinnung in Thrombozyten- und Plasmakonzentraten während der achttägigen Lagerung bei Raumtemperatur. Es wurden keine signifikanten und klinisch relevanten Veränderungen der plasmatischen hämostatischen Kapazität des Plasmas für Fibrinogen, Gerinnungsfaktor XI, XII und XIII, Protein S und C (quantitative Messung), D-Dimere, von Willebrand-Faktor, Kollagenbindungs-aktivität und Ristocetin-Cofaktor nachgewiesen. Es kam jedoch zu einer zeitabhängigen Veränderung während der Lagerung bei PTT, Quick, Thrombinzeit, Gerinnungsfaktoren II, V, VII, VIII, IX, und X, Antithrombin III, Protein S und C (funktionelle Messung), Prothrombinfragmente F1+F2 und APC-Resistenz. Diese Veränderungen fanden sich zudem insbesondere in den gelagerten Thrombozytenkonzentraten. Die wenigen, in der Literatur verfügbaren Untersuchungen zeigen Ergebnisse, die den unseren vergleichbar sind. Erstmal wurden mit dieser Dissertationsarbeit jedoch umfassend alle diese Parameter in einem Ansatz verglichen. Vorausgesetzt, dass hämostaseologische Faktoren auch unter ungünstigen Lagerungsbedingungen weitgehend ihre hämostatische Kapazität behalten, kann bei Infusionen von Früh- oder Neugeborenen praktische Bedeutung erlangen, da die plasmatische hämostatische Kapazität in Thrombozytenkonzentraten nun in den Gesamtbedarf einbezogen werden kann. Ebenso können vereinfachte Lagerbedingungen (Raumtemperatur versus Tiefkühlung) in Krisensituationen enorme logistische Vorteile mit sich bringen. Weitere, insbesondere klinische Transfusionsstudien müssen nun zeigen, ob die ex vivo gewonnenen Erkenntnisse zur Haltbarkeit hämostatischer Gerinnungsfaktoren sich in den klinisch-praktischen Einsatz übertragen lassen. Mit unseren Versuchen wollten wir auch dazu beitragen, zukünftig möglichst schnelle und praktikable Therapievorschläge für Notfälle bereitzustellen. Eine bedeutende Rolle kann das bei Raumtemperatur gelagerten Plasma in der Transfusionsmedizin, Notfallmedizin, bei Operationen und in Kriseneinsätzen spielen. Es bleiben noch viele Fragen zu diesem Thema offen. Diese Arbeit wird zu weiterer Forschung anregen. N2 - Stability of the Plasmatic Hemostatic Capacity in Platelet and Plasma Concentrates KW - Gerinnungsfaktoren in Thrombozytenkonzentraten KW - Hämostase KW - Thrombozytenkonzentrate KW - Plasmakonzentrate KW - Gerinnungsfaktoren Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106977 ER - TY - THES A1 - Willier, Semjon Manuel T1 - Funktionelle Charakterisierung des Proteins Thyroid Receptor Interacting Protein 6 (TRIP6) in Ewing-Sarkomen T1 - Functional characterization of TRIP6 in Ewing's Sarcoma N2 - Das Ewing-Sarkom (EFT) ist nach dem Osteosarkom das zweihäufigste Knochen-assoziierte Malignom im Kindesalter. Das entscheidende Ereignis in der Pathogenese dieser Entität stellt eine chromosomale Translokation dar, welche zur Entstehung eines chimären Transkriptionsfaktors, meist EWS-FLI1, führt. Unsere Absicht war es, die Mechanismen zu verstehen, die letztlich zur Metastasierung von Ewing-Sarkomen mit der damit verbundenen, infausten Prognose führen. Die Mitglieder der Zyxin-Proteinfamilie sind in vielfältige zelluläre Funktionen involviert. Hierbei nehmen sie, teilweise funktionell redundant, Einfluss auf zytoplasmatische und nukleäre Prozesse. Durch Analyse von öffentlich verfügbaren Microarraydaten konnten wir belegen, dass lediglich das Protein TRIP6 (thyroid receptor interacting protein 6) aus der Familie in EFT deutlich überexprimiert ist. Dieses Protein ist, neben seiner Funktion in der Organisation des Zytoskeletts, auch nukleär als Kotranskriptionsfaktor und als Element der Telomerprotektion tätig. Vielfach wurde eine Implikation des multifunktionellen Adaptorproteins in maligne Prozesse dokumentiert. Die Überexpression von TRIP6 in EFT ist jedoch unabhängig von EWS-FLI1. Eine Bindung von EWS-FLI1 an eine putative Bindungsstelle im Promotor von TRIP6 konnte nicht nachgewiesen werden. Die Analyse von Microarrays nach TRIP6-Knockdown in EFT-Zelllinien identifizierte mehrere Gensets, welche mit Proliferation und Invasivität assoziiert sind und die nach TRIP6-Knockdown vermindert exprimiert werden. Die für Malignome pathogenetisch relevanten Zielgene Radixin, CD164 und CRYZ konnten als Zielgene des Kotranskriptionsfaktors TRIP6 durch qRT-PCR und Western Blot bestätigt werden. Durch RNA-Interferenz-mediierte Verminderung der Proteinmenge von TRIP6 in EFT kam es zu einer deutlich reduzierten Klonogenität und Migration der Zellen in vitro. Nach induzierbarem TRIP6-Knockdown konnte eine verminderte Tumorigenität und hepatische Metastasierung von hierfür generierten EFT-Einzelzellklonen in vivo beobachtet werden. Zusammengefasst deuten diese Daten auf eine Rolle von TRIP6 in der Pathogenese der EFT und insbesondere beim Prozess der Metastasierung hin. Somit legen diese Ergebnisse eine weitere Evaluierung von TRIP6 als Biomarker oder molekulare Zielstruktur für therapeutische Ansätze in EFT nahe. N2 - Ewing’s sarcoma (ES) is the second most common bone-associated malignancy in children that is driven by the fusion oncogene EWS/FLI1. Despite the great propensity of ES toward early metastasis, recent evidence showed that EWS/FLI1 expression reduces migration and invasiveness of ES cells. However, we strived for exploring the underlying mechanisms of how ES maintains its basal migratory and invasive properties ultimately contributing to metastasis. We focused on the Zyxin-protein family comprising key players in actin remodeling, migration, and invasion. By interrogation of published microarray data, we observed that of all seven Zyxin-proteins only TRIP6 (thyroid receptor interacting protein 6) is highly overexpressed in ES. Besides its effects on cytoskeletal organization, TRIP6 is a nucleocytoplasmic shuttling protein involved in telomere protection, apoptosis, chemo-resistance, and transcriptional control. Initial experiments indicate that TRIP6 expression is independent of EWS/FLI1. However, RNAi-mediated knockdown of TRIP6 in ES cells significantly reduced clonogenicity and migration, whereas proliferation and adhesion were not reduced. DNA microarrays revealed that TRIP6 knockdown is accompanied by the downreguation of important pro-migratory and pro-invasive genes such as Radixin, CD164, and crystalline zeta.Taken together, these data indicate that TRIP6 might partially account for the EWS/FLI1-autonomous migratory and invasive properties of ES KW - Kind / Onkologie KW - TRIP6 KW - pädiatrische Onkologie KW - Ewing-Sarkom Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119241 ER - TY - THES A1 - Beissler, Sebastian T1 - Die Funktionen des miRNA 17-92 Clusters in Dendritischen Zellen und deren mögliche Bedeutung für die Atherosklerose T1 - Functions of the miRNA 12-92 cluster in dendritic cells and its possible relevance in atherosclerosis N2 - Atherosklerose ist eine chronisch-entzündliche Gefäßerkrankung. Dabei sind alle entscheidenden Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems involviert. Besonders dendritische Zellen (DCs) expandieren subendothelial während der Progression einer Atherosklerose. Diese können Antigene aufnehmen und daraufhin Zytokine produzieren oder andere Immunzellen aktivieren. MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende Stränge aus Ribonukleinsäure, welche als weitere Ebene der Genregulation wichtige Zellvorgänge beeinflussen können. Diese Arbeit zeigt mögliche Zielproteine des miRNA 17-92 Clusters in dendritischen Zellen auf und schlägt mögliche Modelle vor, wie dadurch Zellvorgänge von DCs in der Atherosklerose reguliert werden könnten. N2 - Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease involving the immune system, with key mechanisms involving dendritic cells. miRNAs are a small, non-coding RNAs that potentially repress translation of mRNA. This dissertation shows possible target proteins and regulation pathways of the miRNA 17-92 cluster in dendritic cells with a potential relevance in atherosclerosis KW - miRNS KW - Arteriosklerose KW - Dendritische Zelle KW - miRNA 17-92 Cluster Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119428 ER - TY - JOUR A1 - Vaman V. S., Anjana A1 - Poppe, Heiko A1 - Houben, Roland A1 - Grunewald, Thomas G. P. A1 - Goebeler, Matthias A1 - Butt, Elke T1 - LASP1, a Newly Identified Melanocytic Protein with a Possible Role in Melanin Release, but Not in Melanoma Progression JF - PLoS One N2 - The LIM and SH3 protein 1 (LASP1) is a focal adhesion protein. Its expression is increased in many malignant tumors. However, little is known about the physiological role of the protein. In the present study, we investigated the expression and function of LASP1 in normal skin, melanocytic nevi and malignant melanoma. In normal skin, a distinct LASP1 expression is visible only in the basal epidermal layer while in nevi LASP1 protein is detected in all melanocytes. Melanoma exhibit no increase in LASP1 mRNA compared to normal skin. In melanocytes, the protein is bound to dynamin and mainly localized at late melanosomes along the edges and at the tips of the cell. Knockdown of LASP1 results in increased melanin concentration in the cells. Collectively, we identified LASP1 as a hitherto unknown protein in melanocytes and as novel partner of dynamin in the physiological process of membrane constriction and melanosome vesicle release. KW - cell membranes KW - vesicles KW - melanoma cells KW - melanomas KW - melanocytes KW - membrane proteins KW - melanin KW - cell staining Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125994 VL - 10 IS - 6 ER - TY - JOUR A1 - Loeffler, Claudia A1 - Loeffler, Jürgen A1 - Kobsar, Anna A1 - Speer, Christian P. A1 - Eigenthaler, Martin T1 - Septic Vs Colonizing Group B Streptococci Differentially Regulate Inflammation and Apoptosis in Human Coronary Artery Endothelial Cells - a Pilot Study JF - Journal of Pediatrics and Neonatal Care N2 - In this pilot study, we exemplify differences between a septic and a colonizing GBS strain during their interaction with Endothelial Cells by evaluating cytokine levels, surface and apoptosis-related molecules. These preliminary results indicate that in vitro infection using an exemplary septic GBS strain results in diminished activation of the innate immune response. KW - streptococci KW - apoptosis KW - inflammation KW - endothelial cells KW - innate immunity KW - early onset sepsis Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125596 VL - 2 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Lapa, Constantin A1 - Werner, Rudolf A. A1 - Bluemel, Christina A1 - Lueckerath, Katharina A1 - Muegge, Dirk O. A1 - Strate, Alexander A1 - Haenscheid, Heribert A1 - Schirbel, Andreas A1 - Allen-Auerbach, Martin S. A1 - Bundschuh, Ralph A. A1 - Buck, Andreas K. A1 - Herrmann, Ken T1 - Prediction of clinically relevant hyperkalemia in patients treated with peptide receptor radionuclide therapy JF - EJNMMI Research N2 - Background Peptide receptor radionuclide therapy (PRRT) is applied in patients with advanced neuroendocrine tumors. Co-infused amino acids (AA) should prevent nephrotoxicity. The aims of this study were to correlate the incidence of AA-induced hyperkalemia (HK) (≥5.0 mmol/l) and to identify predictors of AA-induced severe HK (>6.0). Methods In 38 patients, standard activity of \(^{177}Lu\)-labelled somatostatin analogs was administered. Pre-therapeutic kidney function was assessed by renal scintigraphy and laboratory tests. For kidney protection, AA was co-infused. Biochemical parameters (potassium, glomerular filtration rate, creatinine, blood urea nitrogen (BUN), sodium, phosphate, chloride, and lactate dehydrogenase (LDH)) were obtained prior to 4 and 24 h after the AA infusion. Incidence of HK (≥5.0) was correlated with pre-therapeutic kidney function and serum parameters. Formulas for the prediction of severe hyperkalemia (>6.0) were computed and prospectively validated. Results At 4 h, HK (≥5.0) was present in 94.7% with severe HK (>6.0) in 36.1%. Values normalized after 24 h in 84.2%. Pre-therapeutic kidney function did not correlate with the incidence of severe HK. Increases in K+ were significantly correlated with decreases in phosphate (r = −0.444, p < 0.005) and increases in BUN (r = 0.313, p = 0.056). A baseline BUN of >28 mg/dl had a sensitivity of 84.6% and a specificity of 60.0% (AUC = 0.75) in predicting severe HK of >6.0 (phosphate, AUC = 0.37). Computing of five standard serum parameters (potassium, BUN, sodium, phosphate, LDH) resulted in a sensitivity of 88.9% and a specificity of 79.3% for the prediction of severe HK >6.0 (accuracy = 81.6%). Conclusions A combination of serum parameters predicted prospectively the occurrence of relevant HK with an accuracy of 81.6% underlining its potential utility for identifying ‘high-risk’ patients prone to PRRT. KW - amino acids KW - kidney function KW - hyperkalemia KW - PRRT KW - NET KW - MAG3 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124963 VL - 4 IS - 74 ER - TY - JOUR A1 - Zernecke, Alma T1 - Distinct functions of specialized dendritic cell subsets in atherosclerosis and the road ahead JF - Scientifica N2 - Atherosclerotic vascular disease is modulated by immune mechanisms. Dendritic cells (DCs) and T cells are present within atherosclerotic lesions and function as central players in the initiation and modulation of adaptive immune responses. In previous years, we have studied the functional contribution of distinct DC subsets in disease development, namely, that of CCL17-expressing DCs as well as that of plasmacytoid DCs that play specialized roles in disease development. This review focuses on important findings gathered in these studies and dissects the multifaceted contribution of CCL17-expressing DCs and pDCs to the pathogenesis of atherosclerosis. Furthermore, an outlook on future challenges faced when studying DCs in this detrimental disease are provided, and hurdles that will need to be overcome in order to enable a better understanding of the contribution of DCs to atherogenesis are discussed, a prerequisite for their therapeutic targeting in atherosclerosis. KW - atherosclerotic vascular disease Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120241 VL - 2014 ER - TY - JOUR A1 - Busch, Martin A1 - Westhofen, Thilo C. A1 - Koch, Miriam A1 - Lutz, Manfred B. A1 - Zernecke, Alma T1 - Dendritic Cell Subset Distributions in the Aorta in Healthy and Atherosclerotic Mice JF - PLoS ONE N2 - Dendritic cells (DCs) can be sub-divided into various subsets that play specialized roles in priming of adaptive immune responses. Atherosclerosis is regarded as a chronic inflammatory disease of the vessel wall and DCs can be found in non-inflamed and diseased arteries. We here performed a systematic analyses of DCs subsets during atherogenesis. Our data indicate that distinct DC subsets can be localized in the vessel wall. In C57BL/6 and low density lipoprotein receptor-deficient (Ldlr−/−) mice, CD11c+ MHCII+ DCs could be discriminated into CD103− CD11b+F4/80+, CD11b+F4/80− and CD11b−F4/80− DCs and CD103+ CD11b−F4/80− DCs. Except for CD103− CD11b− F4/80− DCs, these subsets expanded in high fat diet-fed Ldlr−/− mice. Signal-regulatory protein (Sirp)-α was detected on aortic macrophages, CD11b+ DCs, and partially on CD103− CD11b− F4/80− but not on CD103+ DCs. Notably, in FMS-like tyrosine kinase 3-ligand-deficient (Flt3l−/−) mice, a specific loss of CD103+ DCs but also CD103− CD11b+ F4/80− DCs was evidenced. Aortic CD103+ and CD11b+ F4/80− CD103− DCs may thus belong to conventional rather than monocyte-derived DCs, given their dependence on Flt3L-signalling. CD64, postulated to distinguish macrophages from DCs, could not be detected on DC subsets under physiological conditions, but appeared in a fraction of CD103− CD11b+ F4/80− and CD11b+ F4/80+ cells in atherosclerotic Ldlr−/− mice. The emergence of CD64 expression in atherosclerosis may indicate that CD11b+ F4/80− DCs similar to CD11b+ F4/80+ DCs are at least in part derived from immigrated monocytes during atherosclerotic lesion formation. Our data advance our knowledge about the presence of distinct DC subsets and their accumulation characteristics in atherosclerosis, and may help to assist in future studies aiming at specific DC-based therapeutic strategies for the treatment of chronic vascular inflammation. KW - flow cytometry KW - monocytes KW - diet KW - cell staining KW - DAPI staining KW - aorta KW - macrophages Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119907 SN - 1932-6203 VL - 9 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Hailer, Amelie A1 - Grunewald, Thomas G. P. A1 - Orth, Martin A1 - Reiss, Cora A1 - Kneitz, Burkhard A1 - Spahn, Martin A1 - Butt, Elke T1 - Loss of tumor suppressor mir-203 mediates overexpression of LIM and SH3 Protein 1 (LASP1) in high-risk prostate cancer thereby increasing cell proliferation and migration JF - Oncotarget N2 - Several studies have linked overexpression of the LIM and SH3 domain protein 1 (LASP1) to progression of breast, colon, liver, and bladder cancer. However, its expression pattern and role in human prostate cancer (PCa) remained largely undefined. Analysis of published microarray data revealed a significant overexpression of LASP1 in PCa metastases compared to parental primary tumors and normal prostate epithelial cells. Subsequent gene-set enrichment analysis comparing LASP1-high and -low PCa identified an association of LASP1 with genes involved in locomotory behavior and chemokine signaling. These bioinformatic predictions were confirmed in vitro as the inducible short hairpin RNA-mediated LASP1 knockdown impaired migration and proliferation in LNCaP prostate cancer cells. By immunohistochemical staining and semi-quantitative image analysis of whole tissue sections we found an enhanced expression of LASP1 in primary PCa and lymph node metastases over benign prostatic hyperplasia. Strong cytosolic and nuclear LASP1 immunoreactivity correlated with PSA progression. Conversely, qRT-PCR analyses for mir-203, which is a known translational suppressor of LASP1 in matched RNA samples revealed an inverse correlation of LASP1 protein and mir-203 expression. Collectively, our results suggest that loss of mir-203 expression and thus uncontrolled LASP1 overexpression might drive progression of PCa. KW - mir-203 KW - PSA KW - LNCaP KW - LASP1 KW - prostate cancer Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120540 SN - 1949-2553 VL - 5 IS - 12 ER - TY - JOUR A1 - Frietsch, Jochen J. A1 - Kastner, Carolin A1 - Grunewald, Thomas G.P. A1 - Schweigel, Hardy A1 - Nollau, Peter A1 - Ziermann, Janine A1 - Clement, Joachim H. A1 - La Resée, Paul A1 - Hochhaus, Andreas A1 - Butt, Elke T1 - LASP1 is a novel BCR-ABL substrate and a phosphorylation-dependent binding partner of CRKL in chronic myeloid leukemia JF - Oncotarget N2 - Chronic myeloid leukemia (CML) is characterized by a genomic translocation generating a permanently active BCR-ABL oncogene with a complex pattern of atypically tyrosine-phosphorylated proteins that drive the malignant phenotype of CML. Recently, the LIM and SH3 domain protein 1 (LASP1) was identified as a component of a six gene signature that is strongly predictive for disease progression and relapse in CML patients. However, the underlying mechanisms why LASP1 expression correlates with dismal outcome remained unresolved. Here, we identified LASP1 as a novel and overexpressed direct substrate of BCR-ABL in CML. We demonstrate that LASP1 is specifically phosphorylated by BCR-ABL at tyrosine-171 in CML patients, which is abolished by tyrosine kinase inhibitor therapy. Further studies revealed that LASP1 phosphorylation results in an association with CRKL - another specific BCR-ABL substrate and bona fide biomarker for BCR-ABL activity. pLASP1-Y171 binds to non-phosphorylated CRKL at its SH2 domain. Accordingly, the BCR-ABL-mediated pathophysiological hyper-phosphorylation of LASP1 in CML disrupts normal regulation of CRKL and LASP1, which likely has implications on downstream BCR-ABL signaling. Collectively, our results suggest that LASP1 phosphorylation might serve as an additional candidate biomarker for assessment of BCR-ABL activity and provide a first step toward a molecular understanding of LASP1 function in CML. KW - CRKL KW - nilotinib KW - BCR-ABL KW - CML KW - LASP1 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120639 SN - 1949-2553 VL - 5 IS - 14 ER - TY - JOUR A1 - Navdaev, Alexey A1 - Subramanian, Hariharan A1 - Petunin, Alexey A1 - Clemetson, Kenneth J. A1 - Gambaryan, Stepan A1 - Walter, Ulrich T1 - Echicetin Coated Polystyrene Beads: A Novel Tool to Investigate GPIb-Specific Platelet Activation and Aggregation JF - PLoS ONE N2 - von Willebrand factor/ristocetin (vWF/R) induces GPIb-dependent platelet agglutination and activation of αIIbβ3 integrin, which also binds vWF. These conditions make it difficult to investigate GPIb-specific signaling pathways in washed platelets. Here, we investigated the specific mechanisms of GPIb signaling using echicetin-coated polystyrene beads, which specifically activate GPIb. We compared platelet activation induced by echicetin beads to vWF/R. Human platelets were stimulated with polystyrene beads coated with increasing amounts of echicetin and platelet activation by echicetin beads was then investigated to reveal GPIb specific signaling. Echicetin beads induced αIIbβ3-dependent aggregation of washed platelets, while under the same conditions vWF/R treatment led only to αIIbβ3-independent platelet agglutination. The average distance between the echicetin molecules on the polystyrene beads must be less than 7 nm for full platelet activation, while the total amount of echicetin used for activation is not critical. Echicetin beads induced strong phosphorylation of several proteins including p38, ERK and PKB. Synergistic signaling via P2Y12 and thromboxane receptor through secreted ADP and TxA2, respectively, were important for echicetin bead triggered platelet activation. Activation of PKG by the NO/sGC/cGMP pathway inhibited echicetin bead-induced platelet aggregation. Echicetin-coated beads are powerful and reliable tools to study signaling in human platelets activated solely via GPIb and GPIb-triggered pathways. KW - tyrosine KW - ERK signaling cascade KW - integrins KW - phosphorylation KW - polystyrene KW - platelet activation KW - platelet aggregation KW - platelets Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119815 SN - 1932-6203 VL - 9 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Cochain, Clement A1 - Chaudhari, Sweena M. A1 - Koch, Miriam A1 - Wiendl, Heinz A1 - Eckstein, Hans-Henning A1 - Zernecke, Alma T1 - Programmed Cell Death-1 Deficiency Exacerbates T Cell Activation and Atherogenesis despite Expansion of Regulatory T Cells in Atherosclerosis-Prone Mice JF - PLoS ONE N2 - T cell activation represents a double-edged sword in atherogenesis, as it promotes both pro-inflammatory T cell activation and atheroprotective Foxp3(+) regulatory T cell (Treg) responses. Here, we investigated the role of the co-inhibitory receptor programmed cell death-1 (PD-1) in T cell activation and CD4(+) T cell polarization towards pro-atherogenic or atheroprotective responses in mice. Mice deficient for both low density lipoprotein receptor and PD-1 (Ldlr(-/-)Pd1(-/-)) displayed striking increases in systemic CD4(+) and CD8(+) T cell activation after 9 weeks of high fat diet feeding, associated with an expansion of both pro-atherogenic IFNγ-secreting T helper 1 cells and atheroprotective Foxp3+ Tregs. Importantly, PD-1 deficiency did not affect Treg suppressive function in vitro. Notably, PD-1 deficiency exacerbated atherosclerotic lesion growth and entailed a massive infiltration of T cells in atherosclerotic lesions. In addition, aggravated hypercholesterolemia was observed in Ldlr(-/-)Pd1(-/-) mice. In conclusion, we here demonstrate that although disruption of PD-1 signaling enhances both pro- and anti-atherogenic T cell responses in Ldlr(-/-) mice, pro-inflammatory T cell activation prevails and enhances dyslipidemia, vascular inflammation and atherosclerosis. KW - nutritional deficiencies KW - atherosclerosis KW - spleen KW - aorta KW - diet KW - cytotoxic T cells KW - regulatory T cells KW - T cells Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119823 SN - 1932-6203 VL - 9 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Wagner, Toni T1 - Activity and Crosstalk of STAT3 and BMP Signalling Pathways in Pluripotency Control of Mouse and Medaka Stem Cells T1 - Aktivität und Verschaltung von STAT3 und BMP Signalwegen in der Pluripotenzkontrolle von Maus und Medaka Stammzellen N2 - - 77/83 allerdings inaktiv in Kulturen und Embryonen von Medaka. Dieser Unterschied wird durch Daten aus humanen ES-Zellkulturen unterstützt. Letztere sind ebenfalls komplett STAT3 unabhängig. Die BMP-Smad Kaskade wiederum ist in Medaka-Stammzellen aktiv, Antidifferenzierungsgene wie id2, die durch BMP direkt kontrolliert werden, sind dementsprechend exprimiert. Diese Daten stimmen wiederum mit dem Maussystem überein, während humane ES-Zellen diesbezüglich bislang nicht untersucht wurden. Die Interaktion zwischen verschiedenen Signalwegen ist ein bisher noch nicht gut verstandenes Gebiet. Die Integration verschiedener Signale ist aber speziell für Stammzellen, die ihr Differenzierungsschicksal von winzigen Abweichungen in der Signalmixtur abhängig machen, von entscheidender Bedeutung. Im zweiten Teil der hier vorgelegten Arbeit konnte eine Interaktion zwischen dem BMP-Rezeptor 1a und STAT3 nachgewiesen werden. Diese Interaktion ist offenbar Teil eines variablen Komplexes. Zum ersten Mal war es auch möglich, funktionale Konsequenzen für STAT3 nach Stimulierung des BMP-Rezeptors 1a zu dokumentieren. Nach Belegung des BMP-Rezeptors 1a mit dem mutierten BMP2-A34D wird STAT3 trotz Aktivierung durch Phosphorylierung an Tyrosin 705 im Zytoplasma von Maus Stammzellen festgehalten. Zusammengenommen konnte hier gezeigt werden, dass eine Interaktion zwischen den bislang als isoliert betrachteten Signalwegen BMP-Smad und STAT3 besteht. Des Weiteren wurde das Medaka-Stammzellkultursystem benutzt, um zu zeigen, dass STAT3 für die Pluripotenz von Stammzellen nur im Maussystem eine Rolle spielt, wohingegen BMPZielgene wie id2 in bislang allen getesteten ES-Zellkultursystemen aktiv sind. KW - Stammzellen KW - Pluripotency KW - ES-Cells KW - STAT3 KW - BMP KW - Medaka Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26495 ER - TY - THES A1 - Teichmann, Lino Lars T1 - Stromabwärts der cGMP-abhängigen Proteinkinase in Thrombozyten - Physiologische und diagnostische Relevanz von VASP und Identifikation neuer Substrate T1 - Downstream of the cGMP-dependent protein kinase in platelets – physiological and diagnostic relevance of VASP and identification of new substrates N2 - Clopidogrel hat sich als potentes Medikament zur Verhinderung kardiovaskulärer Ereignisse sowohl bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom ohne ST-Hebung (non-STE-ACS) als auch bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt mit ST-Hebung (STEMI) erwiesen (CURE- und COMMIT-Studie). Insbesondere der Nutzen einer Vorbehandlung mit Clopidogrel bei perkutaner Koronarintervention ist bei Patienten mit non-STE-ACS und STEMI gut belegt (PCI-CURE- und PCI-CLARITY-Studie). Ein beträchtlicher Anteil der Patienten zeigt allerdings kein adäquates Ansprechverhalten auf Clopidogrel. Wir etablierten deswegen zusätzlich zu einem bereits bestehenden FACS-Assay, der den Effekt von Clopidogrel anhand der Phosphorylierung des Proteins VASP quantitativ bestimmt, einen neuartigen auf dem gleichen Prinzip beruhenden enzyme-immuno assay (EIA). In einer Doppelblindstudie mit gesunden Probanden spiegelten im systematischen Vergleich von VASP-EIA, VASP-FACS und anderer verbreiteter Verfahren (Aggregation, p-Selektin Expresssion, PFA100) sowohl die VASP-Assays als auch die Aggregation die Plättchen-Inhibition deutlich wider. Demgegenüber waren weder die p-Selektin Expression noch der PFA100 ein Indikator für den Clopidogrel-Effekt. Die VASP-Assays zeichneten sich im Vergleich zur Aggregation durch bessere Quantifizierbarkeit und eine enge Abhängigkeit von der Zielstruktur des Clopidogrels, dem P2Y12-Rezeptor, aus. So hatte eine Medikation mit Acetylsalicylsäure keinen Einfluss auf die VASP-Assays, verminderte allerdings die Aggregation. Weiterhin konnten wir im Rahmen der Probandenstudie durch Verwendung PAR- (protease activated receptor) spezifischer Peptide (SFFLRN, AYPGKF) und dem stabilen Thromboxan A2 Analog U46619 in ex-vivo Versuchen nachweisen, dass die antithrombozytären Eigenschaften des Clopidogrels zum Teil auf der indirekten Hemmung der Thrombin- und Thromboxan-induzierten Plättchenaktivierung beruhen. Diese Ergebnisse betonen die zentrale Bedeutung Galpha(i)-vermittelter Signalwege in Thrombozyten. Im zweiten Teil dieser Arbeit strebten wir an, neue Substrate der cGMP-abhängigen Proteinkinase zu identifizieren und das bekannte Substrat VASP weiter zu charakterisieren. Die Plättchenadhäsion und -aktivierung an der Zellwand sind initiale Ereignisse der arteriellen Thrombose. Prostacyclin und NO erhöhen die intrazelluläre Konzentration zyklischer Nukleotide (cAMP, cGMP). Dies führt zu einer umfassenden Inhibition der Thrombozyten, hauptsächlich durch Aktivierung der cAMP- bzw. cGMP-abhängige Proteinkinase (cAK, cGK). Es liegt bisher kein schlüssiges Bild davon vor, wie die Substrate der cAK und cGK die Plättcheninhibition regulieren. Wir identifizierten zunächst das adenylylcyclase-associated protein (CAP1) anhand der Analyse des humanen Plättchen-Phosphoproteoms als neues Substrat der cGK, das innerhalb von Sekunden nach SNP-Stimulation phosphoryliert wird. Die Separation des Phosphoproteoms erfolgte durch 2D-Gelelektrophorese. Wildtyp-CAP1 und Mutanten, bei denen an putativen Phosphorylierungsstellen Serin bzw. Threonin durch Alanin ausgetauscht wurde, wurden anschließend in PtK2-Zellen exprimiert. Bisher konnte die Ko-Transfektion von PtK2-Zellen mit CAP1 und cGK eine Phosphorylierung von CAP1 durch die cGK nicht bestätigen. Weitere Anstrengungen werden nötig sein, CAP1 als cGK-Substrat zu etablieren. Flusskammerversuche zeigten, dass die Hemmung der Thrombusformation durch SNP bei VASP-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (WT) ineffektiv ist und belegen, dass die Inhibition der Agonisten-induzierten Thrombusformation durch den NO/cGMP-Signalweg in VASP-defizienten Plättchen gestört ist. VASP hatte in unseren Experimenten keinen signifikanten Einfluss auf die GPIIbIIIa-Aktivierung (gemessen mit dem monoklonalen Antikörper JON/A), die Serotonin-Sekretion (delta-Granula) und die p-Selektin-Expression (alpha-Granula). Die Ergebnisse legen nahe, dass die VASP-Deletion zu subtilen Störungen von Thrombozytenfunktionen führt, die erst in Experimenten deutlich zu Tage treten, die ihr Zusammenspiel abbilden. N2 - Dual-antiplatelet therapy with aspirin and clopidogrel has become the standard therapy to prevent cardiovascular complications of acute coronary syndrome and percutaneous coronary intervention. Increasing experience, however, indicates that a significant proportion of patients do not respond adequately to clopidogrel. We performed a double blinded clinical study with healthy volunteers receiving clopidogrel or placebo to compare various assays of platelet responsiveness, including two methods (a newly established enzyme immunoassay and a FACS assay) based on VASP phosphorylation, for monitoring clopidogrel action. In the clopidogrel group ADP-induced platelet aggregation and the ADP-induced decrease in iloprost-stimulated VASP phosphorylation was attenuated significantly as compared to the placebo group. P-selectin and PFA100 measurements failed to clearly distinguish between the placebo and clopidogrel group of this study. The VASP assays directly measure the function of the clopidogrel target, the P2Y12 receptor, and are selective for clopidogrel effects. Hence the VASP assays are, in contrast to platelet aggregation, not affected by aspirin. In the framework of the study we could additionally demonstrate that the antithrombocytic properties of clopidogrel are partly due to the indirect inhibition of the thrombin and thromboxane induced platelet activation. These results underline the importance of Galpha(i) mediated signalling pathways in platelets. Prostacyclin and NO increase the intracellular concentrations of cyclic nucleotides (cGMP, cAMP). This process results in platelet inhibition mainly by activation of the cGMP- and cAMP-dependent proteinkinase (cGK Ibeta, cAK). How these kinases regulate platelet inhibition is an active field of research. In the second part of the work we therefore sought to identify new substrates of the cGMP-dependent proteinkinase and to further characterize its well established substrate VASP. We initially identified the adenylylcyclase-associated protein (CAP1) as a new substrate of the cGK Ibeta analyzing the human platelet phosphoproteom by two-dimensional gel electrophoresis. To evaluate the role of CAP1 as an in vivo substrate of cGK Ibeta (and cAK) PtK-2 cells were transfected with wildtype CAP1 or the mutants S125A and T375A and cGK Ibeta simultaneously or with either protein alone. Phosphorylation of CAP1 by cGK I beta could not be confirmed as yet and further efforts will be necessary to answer the question whether CAP1 really is a cGK Ibeta substrate. Flowchamber experiments revealed that the inhibition of thrombus formation in whole blood of VASP deficient mice (when compared to wild type) was impaired with the NO donor sodium nitroprusside. Thus VASP plays a major role in the inhibitory NO/cGMP signalling pathway in platelets. KW - Blutstillung KW - Thrombozyt KW - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein KW - Clopidogrel KW - Haemostasis KW - platelets KW - Vasodilator-stimulated phosphoprotein KW - Clopidogrel Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25843 ER - TY - THES A1 - Brich, Sonja, geb. Heeg T1 - Regulation der Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer Vorläuferzellen durch zyklische Nukleotide T1 - Cyclic nucleotide regulated proliferation and differentiation vary in human hematopoietic progenitor cells N2 - In dieser Arbeit wurde in humanen CD34-positiven Stammzellen die PK-G, PK-A sowie ihr Substratprotein VASP nachgewiesen. Dabei liegt VASP in unstimulierten Zellen in nicht-phosphorylierter Form vor. Die VASP-Phosphorylierung kann durch die aus anderen Zellsystemen bekannten cAMP- und cGMP- abhängigen Signalkaskaden auch im Zellkultursystem von humanen CD34-positiven Stammzellen reguliert werden. Ein weiterer Teilaspekt war der Einfluss des cGMP-erhöhenden Stickstoffmonoxyd-Donors DEA/NO auf das Proliferations,- und Differenzierungsverhalten humaner CD34-positiver Stammzellen. Hierbei fand sich ein dualer konzentrationsabhängiger Effekt von cGMP: niedrige Konzentrationen zeigten einen hemmenden Einfluss auf die Proliferation undgleichzeitig einen aktivierenden Effekt auf die Differenzierung der hämatopeotischen Zellen zu CD41-positiven Megakaryozyten. Die höhere Konzentration von DEA/NO beinflusst zwar das Zellwachstum positiv, die Differenzierung der CD34-positiven Zellen hingegen wird gehemmt. Eine Zelldifferenzierung von humanen CD34-positiven Stammzellen zu CD15-positiven Granulozyten /Monozyten unter DEA/NO war nicht zu beobachten. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Signalwege, die über zyklische Nukleotide reguliert werden, eine wichtige Rolle in Proliferations- und Differenzierungsvorgängen humaner hämatopoetischer Progenitorzellen spielen. Damit stehen diese Signalwege prinzipiell als Grundlage für neue pharmakologische Therapieoptionen zu Verfügung. N2 - In the present study, the effects of cyclic nucelotide-elevating agents on hematopoietic progenitor cells (HPC) were investigated. HPC contained cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent and cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-dependent protein kinases G and A (PKG and PKA) and also one of their substrate, the vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP). HPCs from healthy persons and patients with tumors were isolated from peripheral blood or leukapheresis materials and analyzed for proliferation and differentiation into megakaryocytic or granulocytic lineages. Stimulation of PKG in HPCs showed a biphasic reaction: low cGMP concentrations inhibited proliferation and stimulated differentiation into megakaryocytes, whereas high concentrations revealed the opposite effect. In contrast, differentiation into granulocytes was inhibited in a concentration-dependent manner. In summary cyclic nucleotide-regulated pathways are clearly involved in HPC differentiation and proliferation. Pharmacological strategies using cyclic nucleotide elevating substances to influence HPC growth and differentiation in the bone marrow might support current strategies in HPC recovery from the peripheral blood. KW - Cyclonucleotide KW - Zelldifferenzierung KW - Proliferation KW - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein KW - cyclic nucleotides KW - differentiation KW - proliferation KW - VASP Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40873 ER - TY - THES A1 - Mueller, Felicitas T1 - Analysis of the factor XII-driven contact system activation in vivo T1 - Charakterisierung der Faktor XII-vermittelten Aktivierung des Kontaktsystemsin vivo N2 - Platelets play a central role in thrombosis, hemostasis, and inflammation. Here, we show that activated platelets release inorganic polyphosphate (polyP), a polymer of 60- 100 phosphate residues that directly bound to and activated the plasma protease factor XII. PolyP-driven factor XII-activation triggered release of the inflammatory mediator bradykinin by plasma kallikrein-mediated kininogen processing. PolyP increased vascular permeability and induced fluid extravasation in skin microvessels of mice. Mice deficient in factor XII or bradykinin receptors were resistant to polyP-induced leakage. PolyP initiated clotting of plasma via the contact pathway. Ablation of intrinsic coagulation pathway proteases factor XII and factor XI protected mice from polyPtriggered lethal pulmonary embolism. Targeting polyP with phosphatases interfered with procoagulant activity of activated platelets and blocked platelet-induced thrombosis in mice. Infusion of polyP restored defective plasma clotting of Hermansky- Pudlak Syndrome patients, which lack platelet polyP. The data identify polyP as a new class of mediator having fundamental roles in platelet-driven proinflammatory and procoagulant disorders. N2 - Thrombozyten spielen eine zentrale Rolle bei Thrombose, Hämostase und Entzündungsprozessen. Wir zeigen, dass aktivierte Thrombozyten Polyphosphate (polyP) mit einer Kettenlänge von 60-100 Phosphatuntereinheiten sekretieren. PolyP binden und aktivieren die Serinprotease Faktor XII. PolyP-induzierte Faktor XIIAktivierung führt über Kallikrein zur Freisetzung des Entzündungsmediators Bradykinin aus seinem Vorläufermolekül, dem hochmolekularen Kininogen. In einem Ödem- Modell zeigen wir, dass polyP die Gefäßpermeabilität in der Rückenhaut von Wildtyp- Mäusen erhöhen. Faktor XII- oder Bradykinin B2 Rezeptor-defiziente Tiere waren vor polyP-induzierter Ödembildung geschützt. PolyP aktivieren die intrinsische Blutgerinnungskaskade im Plasma. In einem polyP-vermittelten lethalen Lungenemboliemodell waren Faktor XII- und Faktor XI-defiziente Mäuse im Gegensatz zu Wildtyp Tieren geschützt. Behandlung mit Phosphatase hebt die prokoagulante Aktivität stimulierter Thrombozyten auf und blockiert die Plättchen-induzierte Thrombusbildung in Mäusen. PolyP normalisieren die verlängerte Blutgerinnungszeit von Hermansky-Pudlack Patienten. Die Daten zeigen, dass es sich bei polyP um eine neue Klasse von Mediatoren mit prokoagulanten und proinflammtorischen Eigenschaften handelt. KW - Blutstillung KW - Thrombosis KW - Haemostasis KW - Polyphosphate KW - Blutstillung Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46071 ER - TY - THES A1 - Endres, Marcel Matthias T1 - LASP1 reguliert die Genexpression und Sekretion von Matrix-Metalloproteasen in Brustkrebszellen T1 - LASP1 regulates the gene expression as well as the secretion of matrix-metalloproteases in breast cancer cells N2 - Migration und Tumorzellinvasion erfordern die vorhergehende Degradation der umliegenden Extrazellulärmartrix (EZM). Dieser Umbauprozess erfolgt primär durch proteolytische Endopeptidasen, sog. Matrix-Metalloproteasen (MMPs). Damit diese ihre funktionelle Aktivität ausüben können, müssen sie zunächst rekrutiert und mit Hilfe podosomaler bzw. invadopodialer Strukturen in die EZM sezerniert werden. Das LIM und SH3 Domänen Protein 1 (LASP1), ein neu in Podosomen von Makrophagen identifiziertes regulatorisches Gerüstprotein, beeinflusst, neben Größe, Anzahl und Beständigkeit von Podosomen, in hohem Maße die Matrixdegradationskapazität der Zelle. Auch in invasiven Brustkrebszellen wurde eine Lokalisation von LASP1 an Invadopodien, den Podosomen-äquivalenten Strukturen, detektiert. Das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die funktionelle Charakterisierung von LASP1 in Invadopodien. Unter Etablierung eines Matrix-Degradations-Assays konnte gezeigt werden, dass eine Herunterregulation von LASP1 auch in der humanen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231, die zuvor schon für Makrophagen gezeigte Matrixdegradation nachhaltig beeinträchtig. Durch Analyse und Verifikation von zugänglichen Mikroarraydaten mittels qRT-PCR und Western Blot konnte ferner belegt werden, dass LASP1 in den Brustkrebszellen die Genexpression und Proteintranslation von MMP1, -3 und -9 positiv moduliert und somit das gesamt-invasive Potential der Zelle steigert. Darüber hinaus deuten Zymogramme und die Analyse des konditionierten Mediums darauf hin, dass LASP1 als Strukturprotein die vesikuläre Sekretion der inaktiven Zymogene (proMMPs) in die EZM fördert. Demzufolge modifiziert LASP1 während der Krebsprogression die zelluläre Mikroumgebung zugunsten einer erhöhten Metastasierungsrate. Die neu identifizierte regulatorische Funktion von LASP1 auf die Transkription sowie Sekretion von Matrix-Metalloproteasen erklärt die in früheren Arbeiten beobachtete Korrelation zwischen einer erhöhten LASP1 Konzentration im Gewebe und dem vermehrten Auftreten von Metastasen, und damit einhergehend, schlechteren Überleben der Patientinnen. N2 - The process of migration and tumor invasion requires the degradation of the surrounding extracellular matrix by proteolytic endopeptidases, called matrix-metalloproteases (MMPs). Therefore, cells form protrusive invadopodia or podosomes that recruit and secret MMPs to degrade the basement membrane. The LIM and SH3 protein 1 (LASP1) was recently identified as a new scaffolding protein in podosomes of macrophages. Knockdown of LASP1 affected size, number and lifetime of the podosomes and moreover, inhibited matrix degradation capacity. The main objective of the presented dissertation was to characterize the function of LASP1 in invadopodia of cancer cells. By establishing a matrix-degradation-assay, we demonstrated that down-regulation of LASP1 impaired matrix-degradation in MDA-MB-231 breast cancer cells, an effect earlier observed in macrophages. By analyzing and verifying accessible microarray data sets we observed regulation of MMPs by LASP1. qRT-PCR and Western Blot experiments confirmed that LASP1 positively modulates gene expression and translation of MMP1, -3 and -9, and thereof enhances cellular invasion. Furthermore, zymography and analysis of the conditioned medium revealed cytosolic LASP1 promotion of MMP vesicle secretion into the extracellular matrix, thus altering the microenvironment during cancer progression. In summary, the newly identified role of LASP1 in regulating matrix degradation by affecting MMP transcription and secretion elucidated the migratory potential observed in former studies that described upregulation of LASP1 in metastatic cancer cells. KW - Brustkrebs KW - Genexpression KW - Sekretion KW - Metalloproteasen KW - LASP1 (LIM und SH3 Protein 1) KW - LASP1 (LIM and SH3 Protein 1) KW - MMP (Matrix-Metalloproteasen) KW - MMP (Matrix-Metalloproteases) KW - Matrix-Metalloproteasen Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136733 ER - TY - THES A1 - Tränka, Christopher T1 - Untersuchungen zur Expression und Funktion des „LIM and SH3 Domain Proteins“ (LASP-1) in Medulloblastomen T1 - Investigation of the expression and function of the "LIM and SH3 Domain Protein" LASP-1 in Medulloblastoma N2 - Medulloblastome (MB) gehören zu den häufigsten Tumorerkrankungen des Kindes- und Jugendalters, in der Gruppe der intrakraniell und intraspinal gelegenen Tumoren stellen sie gar die häufigste Entität in dieser Altersgruppe dar. Die Einteilung der nach WHO Grad IV klassifizierten Medulloblastome erfolgt derzeit hauptsächlich in vier Subgruppen entsprechend der jeweils vorherrschenden molekulargenetischen Veränderungen. Aberrationen der Chromosomen 7 und 17 sind dabei die häufigsten molekulargenetischen Veränderungen der als Hochrisiko-MB eingestuften Tumoren der Gruppe 3 und 4. Das LIM- und SH3-Domänen-Protein „LASP-1“ ist auf Chromosom 17 in der Region q11 – q21.3 codiert und wird im humanen Organismus ubiquitär exprimiert. LASP-1 wurde in vergleichenden mRNA-Analysen als eines der am stärksten hochregulierten Transkripte in MB mit Chromosom 17q – Zugewinn identifiziert. Als ein Aktin – bindendes Gerüstprotein spielt LASP-1 eine wichtige Rolle in der Zytoskelettorganisation humaner Zellen. Die pathophysiologische Bedeutung einer LASP-1-Überexpression wurde bereits unter anderem in Brustkrebs- und Ovarialkrebszellen demonstriert, in denen ein LASP-1-silencing die Migration und Proliferation der Zellen hemmte. Die Ergebnisse dieser Dissertation unterstreichen bisherige Annahmen, dass eine LASP-1-Überexpression eine wichtige Rolle in der Tumorigenese und Metastasenbildung humaner Tumoren spielt. Mittels Immunfluoreszenz konnte die Ko-Lokalisation von LASP-1 und F-Aktin in MB bestätigt werden. Aufgefallen ist dabei eine besonders starke Akkumulation der phosphorylierten Variante von LASP-1 in MB-Zellkernen. Funktionelle Untersuchungen zu LASP-1 in MB erbrachten zudem folgende Ergebnisse: ein LASP-1 silencing mittels small-interfering-RNA (siRNA) führte zu einer signifikant verringerten Proliferations- und Migrationsfähigkeit der untersuchten Tumorzellen. Die Adhäsionsfähigkeit der MB-Zellen konnte durch ein LASP-1-silencing hingegen signifikant gesteigert werden – ein erstmaliger direkter Nachweis des möglichen Einflusses von LASP-1 auf die Adhäsionsfähigkeit humaner Tumorzellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen bisherige Erkenntnisse zur Funktion von LASP-1 in humanen Tumorzellen und übertragen diese auf das humane Medulloblastom. Parallel zu dieser Dissertation durchgeführte immunhistochemische Untersuchungen (DKFZ, Heidelberg) stellten eine signifikante Korrelation einer hohen LASP-1-Expression in humanen MB und einem Zugewinn auf Chromosom 17q, einer fortgeschrittenen Metastasierung sowie schlechterem progressfreien und schlechterem Gesamtüberleben her. Nicht zuletzt im Kontext individualisierter Therapieansätze, basierend auf jeweiligen molekulargenetischen Veränderungen der Tumoren, könnte LASP-1 somit als ein prognostischer Marker in humanen Medulloblastomen dienen und zum Beispiel eine Therapie-(De)Eskalation stützen. N2 - Medulloblastoma is the most common malignant pediatric brain tumor. This WHO grade IV tumor is currently classified into four subgroups, based on the predominant molecular and cytogenetic changes in each tumor. Aberrations of the chromosomes 7 and 17 are most common in high-risk Medulloblastoma (group 3 and group 4 Medulloblastoma). The LIM- and SH3-domain protein "LASP-1" is ubiquitiously expressed in human tissue, but has been shown to be upregulated in several human cancers. Further, it has been identified as one of the most upregulated transcripts in Medulloblastoma harboring a 17q gain. This analysis identifies LASP-1 as an important regulator of cell migration, proliferation and cell adhesion in Medulloblastoma. Upon siRNA LASP-1-silencing in Medulloblastoma celllines, cell migration and proliferation were significantly inhibited, whereas cell adhesion was significantly increased. KW - Medulloblastom KW - Medulloblastoma KW - LASP-1 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139539 N1 - Dieses Dokument wurde aus Datenschutzgründen - ohne inhaltliche Änderungen - erneut veröffentlicht. Die ursprüngliche Veröffentlichung war am 13.05.2016 ER - TY - JOUR A1 - Stölting, Miriam A1 - Wiesner, Christiane A1 - van Vliet, Vanessa A1 - Butt, Elke A1 - Pavenstädt, Hermann A1 - Linder, Stefan A1 - Kremerskothen, Joachim T1 - Lasp-1 Regulates Podosome Function JF - PLoS One N2 - Eukaryotic cells form a variety of adhesive structures to connect with their environment and to regulate cell motility. In contrast to classical focal adhesions, podosomes, highly dynamic structures of different cell types, are actively engaged in matrix remodelling and degradation. Podosomes are composed of an actin-rich core region surrounded by a ring-like structure containing signalling molecules, motor proteins as well as cytoskeleton-associated proteins. Lasp-1 is a ubiquitously expressed, actin-binding protein that is known to regulate cytoskeleton architecture and cell migration. This multidomain protein is predominantely present at focal adhesions, however, a second pool of Lasp-1 molecules is also found at lamellipodia and vesicle-like microdomains in the cytosol. In this report, we show that Lasp-1 is a novel component and regulator of podosomes. Immunofluorescence studies reveal a localization of Lasp-1 in the podosome ring structure, where it colocalizes with zyxin and vinculin. Life cell imaging experiments demonstrate that Lasp-1 is recruited in early steps of podosome assembly. A siRNA-mediated Lasp-1 knockdown in human macrophages affects podosome dynamics as well as their matrix degradation capacity. In summary, our data indicate that Lasp-1 is a novel component of podosomes and is involved in the regulation of podosomal function. KW - discrete KW - smooth muscle cells KW - microdomains KW - actin cytoskeleton KW - endothelial cells KW - epithelial cells KW - cancer cells KW - phosphorylation KW - invadopodia KW - dependent protein-kinase KW - camp signaling pathway Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134315 VL - 7 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Rukoyatkina, N. A1 - Mindukshev, I. A1 - Walter, U. A1 - Gambaryan, S. T1 - Dual role of the p38 \(MAPK/cPLA_2\) pathway in the regulation of platelet apoptosis induced by ABT-737 and strong platelet agonists JF - Cell Death & Disease N2 - p38 Mitogen-activated protein (MAP) kinase is involved in the apoptosis of nucleated cells. Although platelets are anucleated cells, apoptotic proteins have been shown to regulate platelet lifespan. However, the involvement of p38 MAP kinase in platelet apoptosis is not yet clearly defined. Therefore, we investigated the role of p38 MAP kinase in apoptosis induced by a mimetic of BH3-only proteins, ABT-737, and in apoptosis-like events induced by such strong platelet agonists as thrombin in combination with convulxin (Thr/Cvx), both of which result in p38 MAP kinase phosphorylation and activation. A p38 inhibitor (SB202190) inhibited the apoptotic events induced by ABT-737 but did not influence those induced by Thr/Cvx. The inhibitor also reduced the phosphorylation of cytosolic phospholipase \(A_2\) (cPLA2), an established p38 substrate, induced by ABT-737 or Thr/Cvx. ABT-737, but not Thr/Cvx, induced the caspase 3-dependent cleavage and inactivation of cPLA2. Thus, p38 MAPK promotes ABT-737-induced apoptosis by inhibiting the cPLA2/arachidonate pathway. We also show that arachidonic acid (AA) itself and in combination with Thr/Cvx or ABT-737 at low concentrations prevented apoptotic events, whereas at high concentrations it enhanced such events. Our data support the hypothesis that the p38 MAPK-triggered arachidonate pathway serves as a defense mechanism against apoptosis under physiological conditions. KW - cPLA2 KW - platelet KW - apoptosis KW - p38 MAP kinase Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128783 VL - 4 IS - e931 ER - TY - THES A1 - Renné, Thomas T1 - Strukturelle und funktionelle Analyse der Interaktion des Blutgerinnungsfaktors XI mit H-Kininogen T1 - Structural and functional analysis of coagulation factor XI binding to H-kininogen N2 - Im Blutplasma und auf Zelloberflächen bildet H-Kininogen entweder mit dem Blutgerinnungsfaktor XI oder Plasmakallikrein Komplexe. Die beiden Proteasenvorstufen binden über ihre homologen schweren Ketten, die jeweils aus vier Apple Domänen bestehen (F1-F4 bei Faktor XI und P1-P4 bei Kalllikrein), an HK. Die Kalllikrein/Kininogen Interaktion wird über Domäne P2 vermittelt. Im Gegensatz dazu soll FXI über F1 an Kininogen binden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Lokalisation der Kininogen-Bindungsstelle des Faktors XI und ein funktioneller Vergleich der Kalllikrein/Kininogen und Faktor XI/Kininogen Komplexe. Es zeigt sich, dass die relative Bindungsaffinität von HK an rekombinante Faktor XI-Einzeldomänen in der Reihenfolge F2 >> F4 > F1 >> F3 abfällt. Die Bedeutung der F2 Domäne für die Kininogen Bindung wird durch den monoklonale Antikörper αP2 unterstrichen, der die Faktor XI/Kininogen und die Kalllikrein/Kininogen Bindung mit einem apparenten IC50 von 8 nM blockiert und dessen Epitop auf die F2 Domäne kartiert wird. Eine Thrombozyten-spezifische Faktor XI-Splicevariante, der die N-terminale Hälfte der F2 Domäne fehlt, bindet 5-fach schlechter als Faktor XI an Kininogen. Nach Aktivierung wird Kallikrein und ein chimäres Faktor XI-Protein, bei dem F2 durch P2 ersetzt wurde, in P2 gespalten, was zur Verlust der Bindungsaffinität zu Kininogen führt. Im Gegensatz bleibt die Bindung von aktiviertem Faktor XI oder einem chimärem Kalllikrein-Protein, bei dem die P2 Domäne durch F2 ersetzt wurde, nach Aktivierung an Kininogen gebunden. Diese Daten zeigen, dass Faktor XI und Kallikrein über ihre Domänen 2 an Kininogen binden. Trotz homologer Bindungsmotive unterscheiden sich Faktor XI/Kininogen und Kallikrein/Kininogen Komplexe in ihrer Stabilität nach Aktivierung. Die Daten tragen dazu bei, die Regulation der Kallikrein-vermittelten Bradykininbildung bei Entzündungsprozessen und die Faktor XI-getriebene Fibrinbildung besser zu verstehen. N2 - Factor XI (FXI), the zymogen of the blood coagulation protease FXIa, and the structurally homologous protein plasma prekallikrein circulate in plasma in non-covalent complexes with H-kininogen (HK). HK binds to the heavy chains of FXI and of prekallikrein. Each chain contains four apple domains (F1 - F4 for FXI; P1 - P4 for prekallikrein). Previous studies had indicated that the HK binding site on FXI is located in F1, while the major HK binding site on prekallikrein is on P2. To determine the contribution of each FXI apple domain to FXI/HK complex formation, we examined binding of recombinant single apple domain-tPA fusion proteins to HK. The order of affinity from highest to lowest is F2 >> F4 > F1 >> F3. Monoclonal antibodies against F2 are superior to F4 or F1 antibodies as inhibitors of HK binding to FXI. Antibody αP2, raised against prekallikrein, cross-reacts with FXI F2 and inhibits FXI/HK binding with an IC50 of 8 nM. HK binding to a platelet specific FXI variant lacking the N-terminal half of F2 is reduced > 5-fold compared to full-length FXI. A chimeric FXI molecule in which F2 is replaced by P2, is cleaved within P2 during activation by factor XIIa, resulting in greatly reduced HK binding capacity. In contrast, wild-type FXI is not cleaved within F2, and its binding capacity for HK is unaffected by factor XIIa. Our data show that HK binding to FXI involves multiple apple domains, with F2 being most important. The findings demonstrate a similarity in mechanism for FXI and prekallikrein binding to HK. Although the zymogens complex HK via homologous binding motives the stability of FXI/HK and kallikrein/HK complexes is largely diffent following activation. The data may help to understand kallikrein-driven bradykinin formation in inflammation and FXI-mediated fibrin generation in thrombosis. KW - Gerinnungsfaktor XI KW - Blutgerinnung KW - Kallikrein-Kinin-System KW - Domäne KW - Apple Domäne KW - FXI KW - Kinin KW - intrinsische Gerinnungskaskade KW - Apple domain KW - FXI KW - kinin KW - intrinsic coagulation cascade Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25463 ER - TY - THES A1 - Benz, Peter Michael T1 - Cytoskeleton assembly at endothelial cell-cell contacts is regulated by Alpha-II-spectrin/vasp complexes T1 - Das Aktin Zytoskelett an endothelialen Zell-Zell-Kontakten wird durch αII-Spektrin/VASP Komplexe reguliert N2 - Directed cortical actin assembly is the driving force for intercellular adhesion. Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) participates in actin-fiber formation and VASP activity is regulated by phosphorylations. We screened for endothelial cell proteins, which bind to VASP dependent on its phosphorylation status. Differential proteomics identified αII-spectrin as novel VASP-interacting protein. αII-spectrin binds to the triple GP5-motif in VASP via its SH3 domain. cAMP-dependent protein kinase-mediated VASP phosphorylation at Ser157 inhibits αII-spectrin/VASP complex formation. VASP becomes dephosphorylated upon formation of cell-cell contacts and in confluent but not in sparse endothelial cells αII-spectrin colocalizes with non-phosphorylated VASP at cell-cell junctions. Ectopic expression of the αII-spectrin SH3 domain fused to claudin-5 translocates VASP to cell-cell contacts and is sufficient to initiate the formation of cortical actin cytoskeletons. αII-spectrin SH3 domain overexpression stabilizes cell-cell contacts and decreases endothelial permeability. Conversely, permeability of VASP-deficient endothelial cells is elevated. In a skin edema model, microvascular leakage is increased in VASP-deficient over wild-type mice. We propose that αII-spectrin/VASP complexes regulate cortical actin cytoskeleton assembly with implications for formation of endothelial cell-cell contacts and regulation of vascular permeability. N2 - Der zielgerichtete Aufbau eines kortikalen Aktin-Zytoskeletts ist die treibende Kraft für die interzelluläre Adhäsion. Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) ist maßgeblich an der Bildung von Aktin-Fasern beteiligt und die VASP Aktivität wird durch seine Phosphorylierung geregelt. Wir haben in einem systematischen Ansatz nach endothelialen Proteinen gesucht, die an VASP, abhängig von seinem Phosphorylierungszustand, binden. Mit Hilfe differenzieller Massenspektrometrie konnte αII-Spektrin als neuer VASP Interaktionspartner identifiziert werden. Dabei bindet die αII-Spektrin SH3 Domäne an die drei GP5-Motive in VASP. Die Phosphorylierung von VASP durch die cAMP-abhängige Protein Kinase hemmt die αII-Spektrin/VASP Komplexbildung. Bei der Bildung von Zell-Zell Kontakten wird VASP dephosphoryliert und in konfluenten - nicht aber in vereinzelten Endothelzellen - kolokalisieren αII-Spektrin und nicht-phosphoryliertes VASP an Zell-Zell Kontakten. Die ektopische Expression der αII-Spektrin SH3 Domäne als Fusionsprotein mit Claudin-5 führt zu einer Translokation von VASP an Zell-Zell Kontakte und ist hinreichend um die Bildung von kortikalen Aktin-Fasern einzuleiten. Funktionell stabilisiert die Überexpression der αII-Spektrin SH3 Domäne Zell-Zell Kontakte und führt zu einer Abnahme der Endothelzellpermeabilität. Dementsprechend ist die Permeabilität von VASP-defizienten Zellen erhöht. In einem Hautödem-Modell zeigt sich nach Bradykinin-Stimulation eine Erhöhung der mikrovaskuläre Permeabilität von VASP-defizienten Mäusen gegenüber wild-typ Tieren. Unsere Forschungsergebnisse legen nahe, dass αII-Spektrin/VASP Komplexe den Aufbau des kortikalen Aktin-Zytoskeletts regulieren und damit für die Bildung von endothelialen Zell-Zell Kontakten und die Regulation der vaskulären Permeabilität eine Rolle spielen. KW - VASP KW - Spektrin KW - Aktin Zytoskelett KW - Endotheliale Zell-Zell-Kontakte KW - VASP KW - Spectrin KW - Cortical Actin Cytoskeleton KW - Endothelial Cell-Cell Contacts Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23802 ER - TY - THES A1 - Kühler, Leif Heinrich T1 - Identifizierung Genetischer Defekte der Familiären Dilatativen Kardiomyopathie T1 - Genetics of Dilated Cardiomyopathy N2 - Herzinsuffizienz ist eine Krankheit mit wachsender medizinischer und ökonomischer Bedeutung. Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine der Hauptursachen für Herzversagen und führt in den meisten Fällen zu einer Herztransplantation. 20-30 % der DCM-Erkrankungen haben einen genetischen Hintergrund. Durch die Anwendung molekulargenetischer Methoden konnte bereits eine Reihe DCM-verursachender Gene identifiziert werden. Mutationen in Zytoskelettproteinen führten zu der Hypothese, dass eine Beeinträchtigung der Kraftübertragung vom Sarkomer auf be-nachbarte Myozyten eine Ursache für die DCM sein könnte. Zusätzlich scheint auch eine reduzierte Kraftentwicklung, ausgelöst durch Mutationen in den Proteinen des Sarkomers die Entwicklung der DCM zu begünstigen. Darüber hinaus wurden Mutationen in Proteinen gefunden, wie z.B. im Lamin A/C- oder Tafazzin-Gen, deren Rolle in der Pathophysiologie der DCM noch nicht geklärt sind. Um die Komplexität der genetischen Defekte, die eine DCM verursachen, besser zu verste-hen, ist es notwendig weitere krankheitsverursachende Gene zu identifizieren. Im ersten Projekt untersuchten wir eine Familie (DCM-I) mit 16 an DCM erkrankten Familienmit-gliedern. Der Phänotyp folgte einem autosomal-dominanten Erbgang. Nach Ausschluss aller be-kannter DCM-Loci, führten wir eine genomweite genetische Suche mit den Mikrosatellitenmarkern der 10. Version des Weber-Screeningsets durch. Durch die Kopplungsanalyse war es möglich, ge-netische Kopplung für 80 % des Genoms auszuschließen. Mehrere benachbarte Marker auf dem langen Arm von Chromosom 7 zeigten hingegen Kosegregation mit dem Krankheitsstatus. Ein maximaler LOD-Score von 4,20 wurde für die Marker D7S471 und D7S501 erzielt. Die Feinkartie-rung mit zusätzlichen Markern identifizierte eine Kandidatenregion, die von den beiden Markern D7S2545 und D7S2554 begrenzt wird und ein Intervall von 9,73 Mb umschließt. In dem minima-len Intervall sind 32 Gene sowie 6 aufgrund von Sequenzvergleichen vorhergesagte Transkripte kodiert. Keines dieser Gene kodiert für ein Zytoskelett- oder Sarkomerprotein. Durch Sequenzana-lyse konnten wir eine neue DCM-verursachende Mutation (A100G) in Exon 2 des Gens DLD iden-tifizieren, das für das mitochondriale Protein Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (E3) kodiert. Die Mutation veränderte die vorletzte Aminosäure des Signalpeptids, das den Import des Proteins in die Mitochondrien dirigiert. Daher hatten wir die Hypothese, dass möglichweise der Transport oder die Prozessierung des Signalpeptids beeinträchtigt sein könnte. Dazu haben wir das DLD-Signalpeptid mit GFP markiert und die Verteilung des Fusionsproteins in transfizierten humanen Zellen und in isolierten Mitochondrien untersucht. Die Resultate zeigten, dass die Fusionsproteine mit dem mu-tierten Signalpeptid genauso in die Mitochondrien transportiert und prozessiert wurden, wie die Fusionsproteine mit dem Wildtyp-Signalpeptid. Die Enzymaktivität der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase in Lymphozyten mit der Mutation A100G liegt innerhalb der normalen Brandbreite und ist im Vergleich zu der Enzymaktivität in Kontroll-Lymphozyten nicht reduziert. Die Identifikation von DLD, einem Protein des Energiemetabolismus, als neues DCM-verursachendes Gen in Familie DCM-I, kann zu einem besseren Verständnis der komplexen Pa-thophysiologie der dilatativen Kardiomyopathie beitragen. Im zweiten Projekt haben wir eine Familie (DCM-II) untersucht, in der die erkrankten Familien-mitglieder eines oder meherer der folgende Symptome aufwiesen: Reizleitungsstörungen, Schlag-anfall, dilatative Kardiomyopathie, Gliedergürtel-Muskeldystrophie. Dilatative Kardiomyopathie assoziiert mit Reizleitungsstörungen und Skelettmyopathie ist mit Mutationen im Gen für Lamin A und Lamin C (LMNA) korreliert. Zusätzlich wurden Mutationen im LMNA in Zusammenhang mit der Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie, der Gliedergürtel-Muskeldystrophie, Lipodystrophie, dem Charcot-Marie-Tooth-Syndrom und der Hutchinson-Gilford Progerie beschrieben. Da über 90 % der LMNA-Mutationen Missense-Mutationen sind, resultierte daraus die Hypothese, dass die mu-tierten Proteine über einen dominant-negativen Effekt die dreidimensionale Struktur der Lamin-Intermediärfilamente zerstören. Durch Sequenzanalyse der proteinkodierenden Exons des LMNA konnten wir einen Basenpaaraus-tausch von C nach T an Position 700 (C700T) in Exon 4 identifizieren, der mit dem Phänotyp in der Familie segregierte. Die Mutation führte zum Einbau eines vorzeitigen Stop-Codons (PTC) an Position 234 (Q234X) der Aminosäuresequenz. Bei der Sequenzanalyse der Lamintranskripte aus Lymphozyten von erkrankten Individuen konnten wir nur das Wildtyp-Allel detektieren, aber nicht das mutierte Allel, was darauf schließen ließ, dass das mutierte Allel möglicherweise durch einen Kontrollmechanismus (nonsense-mediated mRNA decay, NMD) degradiert wurde. Nach Inhibition des NMD durch Inkubation der Lymphozyten mit Cycloheximid oder Emetin, akkumulierte das mutierte Transkript wieder in der Zelle. Die Quantifizierung der Lamintranskripte durch Amplifi-kation mittels Real-Time-PCR zeigte eine deutliche Reduktion der Menge an Transkripten in Fi-broblasten von erkrankten Familienmitgliedern. Die Western-Blot-Analyse konnte eine reduzierte Expression von Lamin A und Lamin C bestätigen. Die Ergebnisse zeigen, dass das Transkript mit dem PTC durch die NMD-Maschinerie degradiert wird und eine Haploinsuffizienz von Lamin A und Lamin C die DCM in dieser Familie verursacht. N2 - Heart failure is of growing medical and economic importance. Dilated cardiomyopathy (DCM) is a significant cause of heart failure, often leading to cardiac transplantation. 20-30 % of DCM cases are familial. Using genetic strategies mutations in genes encoding various cytoskeletal proteins have been identified. These findings led to the hypothesis, that DCM is a disease caused by an im-pairment of force transduction from the sarcomere to the sarcolemma. Additionally, a reduced pro-duction of force caused by mutations in sarcomeric proteins could lead to DCM. On the other hand mutations in lamin A/C and G4.5 do not exactly fit into this model. To understand the entire com-plexity of genetic defects leading to DCM, it is important to identify further DCM genes. In the first project a four generation pedigree (DCM-I) including 16 affected family members with autosomal dominant inheritance of dilated cardiomyopathy has been investigated. After exclusion of already known DCM loci, a whole genome screen was performed, using the Weber 10.0 screen-ing set. The linkage analysis allowed an exclusion of linkage for 80 % of the human genome whereas several adjacent markers on the long arm of chromosome 7 showed co-segregation be-tween marker alleles and disease. A maximal Lod-score of 4.20 was obtained at D7S471 and D7S501. Fine mapping with additional markers defined a candidate region spanning 9.73 Mb be-tween markers D7S2545 and D7S2554. The minimal candidate region contains 32 known genes and 6 predicted transcripts – non of them coding for a cytoskeletal or sarcomeric protein. Mutation screening identified an A to G transition at nucleotide position 100 (A100G) in exon 2 of the gene DLD that codes for a mitochondrial protein named dihydrolipoamide dehydrogenase. The mutation changed the second last amino acid of the leader peptide which is essential for mitochondrial im-port. We hypothesized that either the transport reaction or the processing might be affected. There-fore we cloned the leader peptide of DLD N-terminal to GFP and examined the localisation of the fusion protein in transfected mamalian cells and in isolated mitochondria. These results showed that the fusion protein with the mutated leader peptid has been transported to the mitochondria in the same way as the fusion protein with the wildtype leader peptide. There were also no differences concerning the cleavage of the leader peptide after import. The enzyme activity of the dihydroli-poamide dehydrogenase in lymphocytes carying the mutation A100G is not reduced compared to the enzyme activity in normal lymphocytes. The identification of DLD as a novel DCM causing gene which is involved in the energy metabo-lism of the cell provides a new and important piece of information, which will help to understand the complex pathophysiology of dilated cardiomyopathy and heart failure. In the second project we investigated a four generation pedigree of a German family with varying degrees of early atrial fibrillation, subsequent stroke, AV-Block, cardiomyopathy and limb girdle muscular dystrophy. Familial dilated cardiomyopathy associated with conduction disturbances and variable degrees of myopathies has been correlated with mutations in the gene coding for the A-type lamins (LMNA). In addition, mutations in LMNA have been shown to cause Emery-Dreifuss-muscular dystrophy, Limb-girdle muscular dystrophy type 1B, partial lipodystrophy type 2, man-dibuloacral dysplasia type A with partial lipodystrophy, Charcot-Marie-Tooth type 2B1 and Hut-chinson-Gilford progeria syndrome. Because more than 90 % of the mutations in LMNA represent missense mutations it has been proposed that the disease causing mechanism would primarily be a dominant negative effect of the mutated “poison polypeptides” that disrupt the three dimensional structure of the filaments. Molecular analysis of the coding sequence of LMNA identified a C to T transition at nucleotide position 700 (C700T) in exon 4 which co-segregates with the phenotype in an autosomal-dominant pattern. The mutation introduces a stop codon at amino acid position 234 (Q234X). RT-PCR of lymphocyte RNA from affected individuals failed to detect the transcript from the mutant allele but not from the wildtype allele indicating that the mutated transcript is subjected to nonsense-mediated decay (NMD). Inhibition of NMD by treatment of patient lymphocytes with both cyclo-heximide and emetine stabilized the message from the mutated allele. Quantification of the lamin transcripts in fibroblasts by using a Real-Time-PCR approach showed a marked decrease of the transcripts in cells from affected family members. In addition, we demonstrated a reduced expres-sion of lamin A and lamin C by Western Blot analysis. These results demonstrate that the transcript carrying the premature stop codon is degraded by non-sense-mediated mRNA decay, and that DCM in this family is caused by haploinsufficiency of lamin A and lamin C. KW - Kongestive Herzmuskelkrankheit KW - Erbkrankheit KW - Molekulargenetik KW - DCM KW - DLD KW - Mitochondriopathie KW - Laminopathie KW - DCM KW - DLD KW - Mitochondriopathy KW - Laminopathy Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22845 ER - TY - THES A1 - Johne, Julia T1 - Pathologische Aktivierung des Gerinnungsfaktors XII - Heparin-Protamin-Komplikationen T1 - Pathological activation of the coagulation factor XII - adverse effects of heparin-protamine N2 - Protamin antagonisiert die antikoagulierende Wirkung von Heparin. Nach intravenöser Protaminapplikation treten als häufige unerwünschte Wirkungen ein systemischer Blutdruckabfall, Herzfrequenzabfall sowie eine Erhöhung des pulmonalarteriellen Widerstandes auf. Die Protamin-assoziierten Nebenwirkungen sind zum Teil lebensbedrohlich. Der ihnen zugrunde liegende Mechanismus wurde in der vorliegenden Arbeit auf Zellkultur- und Gesamttierebene analysiert sowie mögliche Therapieoptionen aufgezeigt. Heparin-Protamin-Komplexe aktivieren auf Endothelzellen den Blutgerinnungsfaktor XII. Aktiver Faktor XII startet über sein Substrat Plasmakallikrein die Freisetzung des Peptidhormons Bradykinin aus hochmolekularem Kininogen. Funktions-inhibierende Antikörper oder pharmakologische Inhibitoren von Plasmakallikrein oder Faktor XII blockierten die Heparin-Protamin induzierte Bradykininbildung auf Zellen. Stickstoffmonoxid-spezifische Fluorophore zeigten, dass Bradykinin-Bindung an Kinin B2 Rezeptoren die endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase aktiviert. B2 Rezeptorantagonisten blockierten die Heparin-Protamin induzierte Stickstoff-monoxidbildung. Die intravenöse Infusion von Protamin in heparinisierte Wildtypmäuse senkte den systemischen Blutdruck und die Herzfrequenz. Im Gegensatz dazu waren Faktor XII und B2 Rezeptor Gen-defiziente Mäuse oder Tiere, die Faktor XII Inhibitoren oder B2 Rezeptorantagonisten infundiert bekamen, vor Heparin-Protamin-Effekten geschützt. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Heparin-Protamin-Komplikationen durch eine Faktor XII-getriebene Bradykininbildung verursacht werden. Eine Blockade der Bradykininbildung oder -wirkung eröffnet eventuell eine Möglichkeit, die Heparin-Protamin-Nebenwirkungen auch beim Patienten zu therapieren. N2 - Protamine is the antidot for anticoagulant effects of heparin. Intravenous application of protamine may cause systemic hypotension, heart rate decrease and increase in pulmonary pressure. Adverse effects associated with protamine are common and potentially life-threatening. This work characterizes the pathomechanism of heparin-protamine-effects in cell culture and in transgenic mice and suggests therapeutic options to block the adverse effects. Heparin-protamine-complexes activate blood coagulation factor XII on endothelial cells. Active factor XII initiates the generation of the vasoactive peptide hormone bradykinin from high molecular weight kininogen by plasmakallikrein action. Antibodies or low molecular weight inhibitors that interfere with factor XII or plasmakallikrein activity blocked heparin-protamine-induced bradykinin effects on cells. Nitric oxide-specific dyes revealed that bradykinin-binding to kinin B2 receptors activates the endothelial nitric oxide synthase. B2 receptor antagonists interfered with heparin/protamine-driven nitric oxide generation. Intravenous application of protamine into heparinized wildtype mice reduced systemic blood pressure and heart rate. Factor XII or B2 receptor deficient mice were protected from heparin-protamine-effects. Consistently, pharmacological targeting of B2 receptors or factor XII inhibited protamine associated cardiovascular effects in heparinized wildtype mice. Together, this work demonstrates that heparin-protamine-adverse effects are due to factor XII activation that culminates in the generation of bradykinin. Inhibition of bradykinin formation or signaling may offer novel strategies to block adverse heparin-protamin-effects in patients. KW - Blutgerinnung KW - Stickstoffmonoxid KW - Gerinnungsfaktor XII KW - Bradykinin KW - Protamin KW - Kontaktphasensystem KW - Endothel KW - Protamine KW - contact activation system KW - endothelium Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30311 ER - TY - THES A1 - Mietner, Silke T1 - Charakterisierung von Organellen und Signalwegen des Thrombozyten T1 - Characterisation of Organells and Signal Transduction Pathways in Thrombocytes N2 - In den letzten Jahren hat sich das gemeinhin gültige Bild von Thrombozyten, in dem die Blutplättchen eine eher passive Rolle als Bestandteil der Koagulations-Kaskade inne hatten, hin zu einem Modell gewandelt, in dem ihnen eine aktive Rolle zugeschrieben wird. Diese ist von besonderer Bedeutung in Hinblick auf die Produktion humoraler Faktoren, die sowohl die Bildung von Blutgerinnseln als auch Entzündungsvorgänge potenzieren. Letzteres ist von besonderer Relevanz bei kardiovaskulären Erkrankungen, wie Myokardinfarkt, Schlaganfall und peripherer arterieller Verschlusskrankheit. Darüber hinaus wurden mittlerweile neue Eigenschaften der Thrombozyten beobachtet, die auf deren Beteiligung bei Krebserkrankungen, Infektionen und Morbus Alzheimer schließen lassen. In der Forschung – und im weitesten Sinne auch in klinischen Anwendungen – werden heute zur näheren Erforschung der Thrombozyten sowohl das Proteom betreffende Analysemethoden, als auch auf PCR basierende Techniken, wie SAGE und qRT-PCR eingesetzt. Für diese Techniken ist die Reinheit der verwendeten Thrombozyten-Präparationen von besonderer Wichtigkeit. Im Rahmen dieser Arbeit, entwickelte ich eine neue, effektive und effiziente Technik zur Aufreinigung humaner Thrombozyten. Ich erzielte hochreine Thrombozyten- Präparationen mit weniger als 1,5 kontaminierenden Leukozyten pro 108 Blutplättchen. Überdies erwiesen sich die aufgereinigten Thrombozyten-Präparationen als frei von kontaminierenden Erythrozyten und Plasma Proteinen. Zudem konnte die Funktionalität der auf der Oberfläche der hochreinen Blutplättchen vorhandenen Membranrezeptoren (z. B. P2Y12 und PGI2 Rezeptoren) mittels FACS Analyse bestätigt werden (Birschmann*, Mietner* et al. 2008). Zwei verschiedene Anwendungen dieser hochreinen Plättchen wurden im Rahmen dieser Arbeit gezeigt. Zum einen wurden sie in einer Studie zur Aufklärung der unterschiedlichen Beschaffenheit der in Thrombozyten vorkommenden Membrantypen verwendet. Hierzu wurden nach Lyse und Dichtegradienten der Plättchen zwei Fraktionen erhalten, welche anschließend sowohl anhand von Western-Blot- als auch durch Lipid-Analysen („Lipidomics“) charakterisiert wurden. Dabei stellte sich heraus, dass es sich bei einer Fraktion um Plasmamembranfragmente handelte und bei der anderen Fraktion um eine Anreicherung von Membranen des kanalikulären Systems. In Verbindung mit Genomics und Proteomics werden diese Techniken der Lipidomics dazu beitragen, die Lipidfunktionen in biologischen Systemen besser zu verstehen. Außerdem können sie einflussreiche Werkzeug für die Aufklärung des Mechanismus von lipid-basierenden Erkrankungen, für die Überwachung biologisch relevanter Lipide und für die pharmakologische Therapiekontrolle sein. Eine weitere Anwendung fanden die hochreinen Plättchen in Interaktions-Studien von Thrombozytenproteinen. In Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für Bioinformatik wurde unter Verwendung von Proteom- und SAGE-Daten ein Protein-Interaktom erstellt. Daraus stellten wir ein Subnetzwerk mit dem IPP-Komplex (ILK-PINCHParvin) als Mittelpunkt dar. Dieser ternäre Komplex fungiert über eine Interaktion mit dem Aktin-Zytoskelett als eine Signalplattform für Integrine. Ausgehend von den einzelnen Proteinen ILK und PINCH ist es im Modell möglich, eine vollständige Signalkaskade zu erstellen, die die Aktin-Polymerisation zur Folge hat. Im Labor konnten wichtige Interaktionen in Thrombozyten mittels Immunopräzipitation und anschließender Western-Blot Analyse erstmals nachgewiesen werden. Das erstellte Thrombozyten-Interaktom kann somit effektiv für ein systematisches „target screening“ genutzt werden. Auf diese Weise wäre es möglich neue Rezeptoren, Proteine oder ganze Signalkaskaden zu identifizieren. Somit legt das Interaktom die Basis für die Generierung von komplexeren Modellen durch das Einbeziehen von neuen Daten. Dies ist auch in Zukunft von besonderer Wichtigkeit, wenn man die entscheidende Bedeutung dieser Interaktionen für die Signaltransduktionswege während der Hämostase in Thrombozyten berücksichtigt. N2 - In recent years the role of platelets has changed from one of passive participation in the coagulation cascade, to one of active production of humoral factors that potentiate both clot formation and inflammation. In addition to platelet functions in cardiovascular disorders like myocardial infarction, stroke and peripheral vascular disease, new functions have been observed which play a role in cancer, infection and Alzheimers disease. For research and also for clinical applications proteomic methods as well as PCR-based techniques such as SAGE and qRT-PCR are mostly used today, especially in high-throughput analysis. For these methods the purity of the platelet sample is of significant importance. KW - Thrombozyten KW - Lipidomics KW - Thrombocytes KW - lipidomics Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31210 ER - TY - JOUR A1 - Rowinska, Zuzanna A1 - Gorressen, Simone A1 - Merx, Marc W. A1 - Koeppel, Thomas A. A1 - Liehn, Elisa A. A1 - Zernecke, Alma T1 - Establishment of a New Murine Elastase-Induced Aneurysm Model Combined with Transplantation JF - PLOS ONE N2 - Introduction: The aim of our study was to develop a reproducible murine model of elastase-induced aneurysm formation combined with aortic transplantation. Methods: Adult male mice (n = 6-9 per group) underwent infrarenal, orthotopic transplantation of the aorta treated with elastase or left untreated. Subsequently, both groups of mice were monitored by ultrasound until 7 weeks after grafting. Results: Mice receiving an elastase-pretreated aorta developed aneurysms and exhibited a significantly increased diastolic vessel diameter compared to control grafted mice at 7 week after surgery (1.11 +/- 0.10 mm vs. 0.75 +/- 0.03 mm; p <= 0.001). Histopathological examination revealed disruption of medial elastin, an increase in collagen content and smooth muscle cells, and neointima formation in aneurysm grafts. Conclusions: We developed a reproducible murine model of elastase-induced aneurysm combined with aortic transplantation. This model may be suitable to investigate aneurysm-specific inflammatory processes and for use in gene-targeted animals. KW - abdominal aortic-aneurysm KW - mouse models KW - prediction KW - dilation KW - rupture Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115774 SN - 1932-6203 VL - 9 IS - 7 ER - TY - JOUR A1 - Werner, Rudolf A. A1 - Lapa, Constantin A1 - Bluemel, Christina A1 - Lückerath, Katharina A1 - Schirbel, Andreas A1 - Strate, Alexander A1 - Buck, Andreas K. A1 - Herrmann, Ken T1 - Influence of the amount of co-infused amino acids on post-therapeutic potassium levels in peptide receptor radionuclide therapy N2 - Background Peptide receptor radionuclide therapy (PRRT) is routinely used for advanced or metastasized neuroendocrine tumours (NET). To prevent nephrotoxicity, positively charged amino acids (AA) are co-infused. The aim of this study was to correlate the risk for therapy-related hyperkalaemia with the total amount of AA infused. Methods Twenty-two patients undergoing PRRT with standard activities of 177Lu-DOTATATE/-TOC were monitored during two following treatment cycles with co-infusion of 75 and 50 g of AA (L-arginine and L-lysine), respectively. Mean serum levels of potassium and other parameters (glomerular filtration rate [GFR], creatinine, blood urea nitrogen [BUN], phosphate, chloride, lactate dehydrogenase) prior to, 4 h and 24 h after AA infusion were compared. Results Self-limiting hyperkalaemia (>5.0 mmol/l) resolving after 24 h occurred in 91% (20/22) of patients in both protocols. Potassium levels, BUN, creatinine, GFR, phosphate, chloride and LDH showed a similar range at 4 h after co-infusion of 75 or 50 g of AA, respectively (p > 0.05). Only GFR and creatinine levels at 24 h varied significantly between the two co-infusion protocols (p < 0.05). Conclusions Hyperkalaemia is a frequent side effect of AA infusion in PRRT. Varying the dose of co-infused amino acids did not impact on the incidence and severity of hyperkalaemia. KW - NET KW - PRRT KW - Hyperkalaemia KW - Arginine KW - Lysine Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110617 ER - TY - THES A1 - Untucht, Robert T1 - Design und Klonierung eines Targeting Vektors zur Generierung von Plasmakallikrein-defizienten Mäusen T1 - Designing and cloning of a targeting vector for generating plasma kallikrein deficient mice N2 - Gegenstand dieser Arbeit ist die Erstellung eines sogenannten "Targeting Vektors" zur gezielten Ausschaltung des Gens für Plasmakallikrein in der Maus, als Vorbereitung zur Schaffung einer Plasmakallikrein-defizienten Mauslinie. Plasmakallikrein ist eine im Blut zirkulierende Serinprotease, die Funktionen in Hämostase, Thrombusbildung und Fibrinolyse hat sowie sowohl direkt als auch indirekt mittels Bradykinin an Entzündungsvorgängen beteiligt ist. Zwei 5836 und 3834 bp lange Abschnitte aus dem murinen Plasmakallikrein-Gen wurden durch PCR isoliert und in ein Plasmid kloniert, das neben Resistenzgenen gegen Ampicillin und Neomycin auch das β-Galaktosidase-Gen zum Nachweis einer erfolgreichen Transfektion enthält. Der so entstandene "Targeting Vektor" hat eine Gesamtgröße von 18072 bp, die Basensequenz wurde durch Sequenzierung verifiziert. Der Vektor soll im Plasmakallikrein-Gen einen Teil der Exons 2 und 3 und damit einen Großteil des Signalpeptids und der ersten Proteindomäne funktionsunfähig machen. An den mit dieser Methode erstellten Knockout-Mäusen können die Funktionen von Plasmakallikrein genauer untersucht werden. N2 - This thesis describes the cloning of a targeting vector in the gene targeting strategy for a murine plasma kallikrein (PK) knock-out. PK is a serine protease found in blood which has functions in hemostasis, thrombus formation, fibrinolysis and – both directly and indirectly via bradykinin – inflammation. Two fragments of the murine PK gene with respective lengths of 5836 and 3834 bp were isolated by PCR and cloned into a plasmid containing resistance genes against both ampicillin and neomycin and the β-galactosidase gene for the detection of transfected cells. The targeting vector has a total size of 18072 bp and was verified by sequencing. The vector should destroy parts of the exons 2 and 3 in the gene for PK and thus the greater part of the signal peptide and the first protein domain. With the knock-out mice created by this means the function of PK can be investigated more thoroughly. KW - Kallikreine KW - Maus KW - Plasmakallikrein KW - knockout KW - plasma kallikrein KW - knockout KW - knock-out KW - mouse KW - gene targeting Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78124 ER - TY - THES A1 - Galler, Annette Bettina T1 - Funktionelle Charakterisierung des Vasodilatator stimulierten Phosphoproteins (VASP) für die Stabilität des Aktin-Zytoskeletts und die Integrin-abhängige Zelladhäsion T1 - Functionel characterization of the vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP) for the stability of the actin-cytoskeleton and integrin-dependent cell adhesion N2 - Das Vasodilatator stimulierte Phosphoprotein (VASP) ist ein Zytoskelett-assoziiertes Protein der Ena (Enabled)/VASP-Proteinfamilie. Seine Funktionen bezüglich Aktin- Polymerisation, Thrombozyten-Aggregation, Wachstumskegel-Führungsprozessen und Motilität sowohl von Zellen als auch von Listerien sind bisher nur unvollständig charakterisiert. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, wie die VASP-F-Aktin Interaktion in vitro durch die Phosphorylierung zweier Aminosäuren von VASP reguliert wird. Transfektions-Experimente mit VASP und RhoA deuten eine mögliche Beteiligung von VASP im Signalweg von RhoA an. Zudem führen Überexpression und Deletion von VASP in Zellen zu demselben Stressfaser-Phänotyp, der unabhängig vom stimulierenden Einfluss von Serum ist. In VASPdefizienten Fibroblasten ist außerdem die Membranrigidität und die Phosphorylierung der leichten Kette des Myosins erhöht, was auf ein stabileres und stärker kontrahiertes Aktin- Zytoskelett in diesen Zellen schließen lässt. Die Regulation und Organisation des Aktin- Zytoskeletts beeinflusst auch die zelluläre Adhäsion, die in VASP-defizienten Zellen verändert ist. VASP-defiziente Zellen adhärieren signifikant stärker an Fibronektinbeschichtete Perlen als Wildtyp-Zellen. Der Widerstand dieser Perlen gegenüber mechanischen Kräften ist in VASP (-/-) Zellen signifikant erhöht. Dieser Unterschied beruht in erster Linie auf dem verstärkten Aktin-Zytoskelett in diesen Zellen und ist unabhängig von Mikrotubuli. Messungen mit rekonstituierten Zelllinien zeigen zudem eine VASPAbhängigkeit dieses Effekts. Der GTPase Rap1 kommt eine wichtige Bedeutung bei der Integrin-abhängigen Adhäsion von Zellen zu. Aktivierung von Epac, einem Guanin-Nukleotid- Austauschfaktor von Rap1, führt in Wildtyp-Zellen zur Verstärkung des Widerstandes gegenüber mechanischen Kräften, die auf Fibronektin-beschichtete Perlen wirken, ohne dabei die Membranrigidität zu verändern. Diese Kraft-Verstärkung wird weder vom Aktin- noch vom Mikrotubuli-Zytoskelett beeinflusst. Es exisitiert daher ein Mechanismus, bei dem die Länge von elastischen Membranfortsätzen unabhängig von der Membranfestigkeit und dem Aktin-Zytoskelett reguliert wird. Diese Experimente zeigen, dass VASP eine wichtige Rolle bei der Stabilität und Kontraktilität des Aktin-Zytoskeletts, der Membranrigidität sowie bei der zellulären Adhäsion spielt. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass hierbei weniger die direkte Interaktion von VASP mit dem Aktin-Zytoskelett von Bedeutung ist, sondern viel mehr seine mögliche Funktion als Gerüstprotein (Scaffold), das eine geregelte Signaltransduktion organisiert. N2 - The actin-cytoskeleton associated protein VASP (vasodilator stimulated phosphoprotein) is a founding member of the Ena (enabled)/VASP protein family. Its function in actinpolymerisation, platelet aggregation, axon-guidance, cell motility and Listeria monocytogenes is yet not completely understood. In this work I could show that the phosphorylation of two amino acid residues of VASP diminishes its interaction with F-actin. Transfection experiments with VASP and RhoA suggest a possible role for VASP in the RhoA signalling pathway. Both, overexpression and deletion of VASP results in a similar stressfiber phenotype, which is independent of the stimulatory effect of serum. Furthermore membrane rigidity and myosin light chain phosphorylation in VASP deficient cells is increased, indicating a more contracted and rigid cytoskeleton in these cells. Cell adhesion is influenced by the regulation and organisation of the actin-cytoskeleton. VASP deficient cells not only adhere significantly stronger to fibronectin-coated beads but also resistance to displacement by mechanical forces is enhanced. This effect results from greater stability of the actin-cytoskeleton while there is no evidence for microtubuli involvement. Experiments with reconstituted VASP (-/-) cell lines proof this effect being VASP-dependent. The GTPase Rap1 is an important regulator of integrin-dependent cell adhesion. Activation of Epac, a guanine nucleotid exchange factor for Rap1, in wildtyp cells leads to enhanced resisting forces to mechanical displacement of fibronectin-coated beads while membrane rigidity remains unchanged. This phenomenon is neither dependent on F-actin nor microtubuli indicating a modulation of membrane tethers independently of membrane rigidity. These results show that VASP is an important regulator of actin-cytoskeletal stability and contractility, as well as membrane rigidity and cell adhesion. Furthermore these data suggest a possible role for VASP as a scaffold protein organising intracellular signal transduction. KW - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein KW - Actin KW - Zellskelett KW - VASP KW - Aktin-Zytoskelett KW - Zelladhäsion KW - VASP KW - actin cytoskeleton KW - cell adhesion Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6518 ER - TY - THES A1 - Krohne, Katharina T1 - Die Rolle des Proteins VASP für die Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen T1 - The role of the VASP-Protein for the proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells N2 - Im Rahmen der Arbeit wurden in mehreren Teilprojekten die Eigenschaften und Funktionen des Vasodilatator stimulierenden Phosphoproteins (VASP) untersucht. Es wurde ein neuer Antikörper (5C6) charakterisiert, der für an Serin157 phosphoryliertes VASP spezifisch sein sollte. Es konnte gezeigt werden, dass der 5C6 Antikörper spezifisch VASP erkennt, welches an der Stelle Serin157 phosphoryliert ist. Auch konnten mit dem neuen Antikörper Ergebnisse bestätigt werden, die vorher mit anderen Methoden erhoben wurden, nämlich, dass Serin157 sowohl cAMP- als auch cGMP-vermittelt phosphoryliert wird. Der Antikörper 5C6 stellte sich als ein guter Marker für die Phosphorylierung von VASP an Serin157 durch die PKA dar und ermöglichte, die Zeitkinetik der VASP-Phosphorylierung zu beschreiben. In einem weiteren Projekt wurde die Rolle des Proteins VASP bei der Proliferation und Differenzierung von Knochenmark-Stammzellen zu Megakaryozyten und Thrombozyten untersucht. Die Stammzellen wurden zusätzlich zu Wachstumsfaktoren mit unterschiedlichen Dosen eines cGMP-Analogons stimuliert. Es zeigte sich hierbei, dass 8-pCPT-cGMP einen dualen, konzentrationsabhängigen Effekt auf die Proliferation und die Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen von Wildtypmäusen hat. Niedrige Dosen hemmten die Proliferation und förderten die Differenzierung, dagegen hatten höhere Konzentrationen einen proliferationsfördernden und differenzierungshemmenden Effekt auf die Stammzellen. Im Vergleich hierzu ergab eine Stimulation mit 8-pCPT-cGMP bei VASP knock out Mäusen immer einen proliferationsfördernden Effekt, hingegen einen hemmenden Effekt auf die Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellen. Bei den knock out Zellen führten höhere Konzentrationen lediglich zu einer stärkeren Reaktion als niedrige. N2 - The attributes and functions of the vasodilator stimulating phosphoprotein (VASP) were investigated in this work in different projects. A new VASP antibody (5C6) has been characterized. It was shown that this antibody is specific for VASP phosphorylated at Serin157. I confirmed that the phosphorylation at this position was mediated by cAMP as well as by cGMP. This antibody seemed to be a good marker for the phosphorylation of VASP at Serin157 by the PKA and allowed to describe the time kinetics of the VASP- phosphorylation. In a further project the role of VASP for the proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells into megakaryocytes and platelets has been analyzed. The stem cells were grown in the presence of growth-factors and cytokines and were stimulated with different amounts of a cGMP-analogue. It could be shown that 8-pCPT-cGMP had a dual concentration depending effect on the proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells of wildtype mice. Low amounts of 8-pCPT-cGMP inhibited the proliferation and enhanced the differentiation whereas high amounts enhanced the proliferation and inhibited the differentiation of the stem cells. In contrast, in stem cells from VASP knock out mice the stimulation with 8-pCPT-cGMP showed always an enhancement of the proliferation and an inhibition of the differentiation. The observed effects in the cells of VASP knock out mice increased with the concentration of the cGMP analogue. KW - VASP KW - Thrombozyten KW - 5C6 KW - hämatopoetische Stammzellen KW - Megakaryozyten KW - VASP KW - platelets KW - 5C6 KW - hematopoietic stem cells KW - megakaryocytes Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15639 ER - TY - THES A1 - Reibetanz, Konrad Joachim T1 - Das prokoagulatorische Potential hoher Faktor XI-Spiegel bei der venösen Thromboembolie T1 - Enhanced Thrombin Formation due to High Factor XI-Levels N2 - Hoher Faktor XI stellt einen Risikofaktor der venösen Thrombose dar, über welchen Mechanismus hohe Faktor XI-Spiegel dabei thrombogen wirken ist noch weitestgehend unklar. Denkbar wäre eine Faktor XI-abhängige gesteigerte Thrombingenerierung. Andererseits ist eine gesteigerte Thrombingenerierung ein Merkmal von Patienten mit einer Faktor V Leiden-Mutation. Allerdings zeigen bei weitem nicht alle dieser Patienten eine Hyperkoagulabilität und nur ein Bruchteil davon wird jemals durch Thrombosen auffällig. Entsprechend den Vorstellungen einer multifaktoriellen Thrombogenese war es daher unsere Vermutung, dass erhöhte Faktor XI-Spiegel bei bereits bestehender thrombophiler Gerinnungsstörung die Thrombinbildung zusätzlich triggern könnten und so das Risiko der Thromboseentstehung bei diesen Patienten weiter steigern. Zwei Patientengruppen nach venöser Thrombose wurden untersucht: 76 Faktor V Leiden-Träger und 116 nicht-thrombophile Thrombosepatienten, alters- und geschlechtsgematchte Blutspender dienten als Kontrollen. Faktor XI, TAFIa/ai und F1+2-Spiegel wurden mittels ELISA, die Faktor V Leiden-Mutation, der Prothrombin-Polymorphismus, Faktor VIII, AT, PC und PS, sowie Antiphospholipid-Antikörper mittels Routine-Assays bestimmt. Mit unseren Ergebnissen konnten wir zeigen, dass ein erhöhter Faktor XI-Spiegel keinen eigenständigen Risikofaktor für die venöse Thromboembolie darstellt, sondern seine thrombogene Wirkung erst im Zusammenwirken mit einer zugrunde liegenden Faktor V Leiden-Mutation erhält. Bei diesen Patienten scheint das mit hohen Faktor XI-Spiegeln assoziierte Thromboserisiko in einer beschleunigten Thrombinbildung und weniger in einer Faktor XI-abhängigen Fibrinpolysehemmung begründet zu sein. Wir konnten daher Faktor XI als einen von der Faktor V Leiden-Mutation abhängigen, in seiner Ausprägung moderaten Risikofaktor der Thrombose identifizieren. Dies steht in Einklang mit unseren Ergebnissen: Faktor XI nimmt bei diesen Patienten Einfluss auf die Thrombingenerierung, darüber hinaus jedoch nicht auf das fibrinolytische System. N2 - High factor XI (FXI)-levels evolved as a new risk factor for venous thromboembolism. FXI can be activated by thrombin whose generation is sustained via a feedback mechanism. Higher than normal FXI levels could be speculated to provide for hypercoagulability in-vivo. Sometimes hypercoagulability is a phenomenon in symptomatic patients with thrombophilia. Enhenced thrombin generation may be induced by additionally high FXI-levels. Therefore, we focused on the interaction of high FXI-levels and the frequent factor V Leiden-mutation. Two groups of patients after deep venous thrombosis were investigated: 76 patients with factor V Leiden only and 116 patients without any thrombophilic defects. Patients have previously been excluded if known causes for changes of FXI- or prothrombin fragments 1+2 (F1+2)-levels could be found (e.g. diabetes mellitus, pregnancy, neoplasia, liver- or renal disease, surgery, acute phase reaction). Age- and sex-matched blood donors served as controls. Additionally, asymptomatic factor V Leiden carriers were studied. FXI, TAFIa/ai and F1+2 (as a measure of thrombin formation) were measured by ELISA. Factor V Leiden, prothrombin G20210A polymorphism, inhibitors, factor VIII and antiphospholipid antibodies were determined by routine assays. To summarize our results, both patient groups were comparable (mean age at first thrombotic event: 34 years both; non-idiopatic events in 53(70%) and 77(66%) patients, resp.). The odds ratio (OR) for high FXI-levels (< vs.> 90th percentile of blood donors´ levels) was 3.3 (95% CI: 1.3-8.1) in thrombosis patients with factor V Leiden. In these patients the OR showed a strong correlation to FXI-levels. High FXI-levels as thrombotic risk could not be confirmed in patients without thrombophilia (OR 1.3, 95% CI: 0.6-3.0). OR did not increase with increasing FXI-levels in these patients. F1+2-levels showed a slight correlation with FXI in mutation carriers, but not in non-thrombophilic patients or blood donors. Differences in TAFIa/ai-levels between factor V Leiden-carriers and blood donors were statistically significant, although a correlation between FXI and TAFIa/ai was not found. In conclusion, high FXI-levels are not an independent risk factor for venous thromboembolism. In view of the multigentic origin of thrombosis, they act synergistically with factor V Leiden thus facilitating the manifestation of thrombosis. In contrast to in vitro-situation, high FXI levels do not contribute to an enhenced thrombin generation and do not act in a dose-resonse-relation with TAFIa/ai in-vivo. KW - Hoher Faktor XI KW - Faktor V Leiden KW - Thrombose KW - Thrombingenerierung KW - high factor XI KW - factor V Leiden KW - thrombosis KW - thrombin generation Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18634 ER - TY - THES A1 - Bundschu, Karin T1 - Generation and characterization of spred-2 knockout mice T1 - Generierung und Charakterisierung von Spred-2 Knockout Mäusen N2 - Spreds are a new Sprouty-related family of membrane-associated proteins inhibiting the MAPK signaling pathway by interacting with Ras and Raf-1. Different studies have already demonstrated the inhibitory function of Spreds in cell culture systems, but the in vivo function of Spreds in the whole organism was still unclear. Therefore, Spred-2 knockout mice were generated using a gene trap approach. The Spred-2 deficiency was verified on RNA and protein levels and the lack of functional Spred-2 protein in mice caused a dwarf phenotype similar to achondroplasia, the most common form of human dwarfism. Spred-2-/- mice showed reduced growth and body weight, they had a shorter tibia length and showed narrower growth plates as compared to wildtype mice. Spred-2 promoter activity and protein expression were detected in chondrocytes, suggesting an important function of Spred-2 in chondrocytes and bone development. Furthermore, stimulation of chondrocytes with different FGF concentrations showed earlier and augmented ERK phosphorylation in Spred-2-/- chondrocytes as compared to Spred-2+/+ chondrocytes. These observations suggest a model, in which loss of Spred-2 inhibits bone growth by inhibiting chondrocyte differentiation through upregulation of the MAPK signaling pathway. An additional observation of Spred-2-/- mice was an increased bleeding phenotype after injuries, whereas the bleeding volume was extremely enlarged and the bleeding time was significantly prolonged. So far, hypertension as cause could be excluded, but to discover the physiological reasons for this phenotype, the different steps of the clotting cascade have to be investigated further. As the Spred-2 promoter activity studies demonstrated a high and specific Spred-2 expression in vascular smooth muscle cells and previous studies showed an interaction of Spreds with RhoA, a key regulator of vascular smooth muscle contraction, the regulation of smooth muscle contractility seems to be a good candidate of this phenomenon. Moreover, Spred-1 and Spred-2 specific antibodies were generated as important tools to study the protein expression patterns in mice. Furthermore, nothing was known about the Spred-2 promoter region and its regulation. Here, a detailed in situ analysis of the physiological promoter activity profile in the gene trapped Spred-2-deficient mouse strain was shown. In these mice, the beta-galactosidase and neomycin fusion gene (β-geo) of the gene trap vector was brought under control of the endogenous Spred-2 promoter, giving the opportunity to monitor Spred-2 promoter activity in practically every organ and their corresponding sub-compartments. X-Gal staining of sections of newborn and adult mice revealed 1) a very high Spred-2 promoter activity in neural tissues and different glands; 2) a high activity in intestinal and uterine smooth muscle cells, and kidney; 3) a low activity in heart, testis, lung, and liver; 4) an almost lacking activity in skeletal muscle and spleen, and 5) very interestingly, a very distinct and strong activity in vascular smooth muscle cells. Moreover, comparison of newborn and adult mouse organs revealed a nearly congruent Spred-2 promoter activity. These detailed data provide valuable information for further studies of the physiological functions of Spred-2 in organs showing strong Spred-2 promoter activity, which are in most of these organs still unclear. Finally, gene targeting vectors for Spred-1 and Spred-2 were cloned, to generate ES cells with a floxed exon 2 of the Spred-1 and Spred-2 gene, respectively. Now, these ES cells are valuable tools to establish conditional knockout mice. This is of major interest to investigate the physiological tissue specific functions of Spred-1 and Spred-2, especially if the double knockout mice are not viable. N2 - Spreds gehören zu einer neuen Sprouty-verwandten Familie Membran-assoziierter Proteine, welche den MAPK Signalweg hemmen, indem sie mit Ras und Raf-1 interagieren. In Zellkultur-Systemen haben mehrere Studien bereits die hemmende Funktion von Spred gezeigt, aber die in vivo Funktion im Gesamtorganismus blieb bisher noch ungeklärt. In dieser Arbeit wurden deshalb Spred-2 Knockout Mäuse mithilfe eines Gene-trap Ansatzes generiert. Die Spred-2 Eliminierung konnte auf RNA- und Protein-Ebene bestätigt werden, und der Verlust des funktionsfähigen Spred-2 Proteins führte zu einem Achondroplasie-ähnlichen Zwergenwuchs, der häufigsten Form des menschlichen Zwergenwuchses. Die Spred-2-/- Mäuse waren insgesamt kleiner und hatten ein vermindertes Körpergewicht. Im Vergleich zu Wildtyp Mäusen war die Tibia-Länge verkürzt und die Wachstumsfugen verschmälert. In Knorpelzellen wurde sowohl die Aktivität des Spred-2 Promoters, als auch eine Spred-2 Proteinexpression detektiert, was auf eine wichtige Funktion in Knorpelzellen und bei der Knochenentwicklung schließen lässt. Im Vergleich zu Spred-2+/+ Knorpelzellen zeigte die Stimulierung von Spred-2-/- Knorpelzellen mit verschiedenen FGF-Konzentrationen eine frühere und verstärkte ERK-Phosphorylierung. Diese Beobachtungen deuten auf einen Mechanismus hin, bei dem der Verlust von Spred-2 das Knochenwachstum hemmt, indem die Knorpel-Differenzierung durch eine Hochregulation des MAPK Signalweges gehemmt wird. Spred-2-/- Mäuse zeigten nach Verletzungen eine erhöhte Blutungsneigung, wobei das verlorene Blutvolumen extrem vergrößert und die Blutungszeit signifikant verlängert war. Bislang konnte Bluthochdruck als Ursache ausgeschlossen werden, aber die verschiedenen Stufen der Blutstillung und Gerinnungskaskade müssen noch weiter untersucht werden, um die physiologischen Ursachen dieses Phänotyps ausfindig machen zu können. Untersuchungen der Spred-2 Promotoraktivität zeigten eine starke und spezifische Expression von Spred-2 in glatten Gefäßmuskelzellen. Außerdem zeigten vorhergehende Studien eine Interaktion von Spreds mit RhoA, einem Hauptregulator der Kontraktion glatter Gefäßmuskelzellen. Diesen Beobachtungen zufolge scheint die Regulation der Kontraktilität glatter Gefäßmuskelzellen ein guter Kandidat für dieses Phänomen zu sein. Weiterhin wurden Spred-1 und Spred-2 spezifische Antikörper hergestellt, die als elementares Werkzeug zur Untersuchung der Proteinexpression in der Maus notwendig waren. Bisher gab es noch keine Informationen über die Region und Regulation des Spred-2 Promotors. In dieser Arbeit wurde eine detaillierte in situ Analyse des physiologischen Promotoraktivitätsprofils in der Spred-2 defizienten Mauslinie gezeigt, die mit Hilfe des Gene-trap Vektors generiert wurde. In diesen Mäusen wurde das beta-Galaktosidase/Neomycin-Resistenz Fusionsgen (β-geo) des Gene-trap Vektors unter die Kontrolle des endogenen Spred-2 Promotors gebracht, und lieferte damit die Möglichkeit, die Spred-2 Promotoraktivität in praktisch jedem Organ und den zugehörigen Teilstrukturen beobachten zu können. X-Gal Färbungen von Gewebeschnitten neugeborener und erwachsener Mäuse zeigten 1) eine sehr starke Spred-2 Promotoraktivität in Nervengeweben und verschiedenen Drüsen; 2) eine starke Aktivität in glatten Muskelzellen des Uterus und Verdauungstraktes, sowie der Nieren; 3) eine geringe Aktivität in Herz, Hoden, Lunge und Leber; 4) eine fast fehlende Aktivität in Skelettmuskeln und Milz; und 5) interessanterweise eine starke und eindeutige Aktivität in glatten Gefäßmuskelzellen. Außerdem zeigte der Vergleich zwischen Organen von neugeborenen und erwachsenen Mäusen ein fast identisches Aktivitätsmuster. Diese detaillierten Daten liefern hilfreiche Informationen für weitere Untersuchungen der physiologischen Funktionen von Spred-2 vor allem in Organen mit starker Spred-2 Promotoraktivität, die in den meisten dieser Organe bisher noch immer ungeklärt sind. Zuletzt wurden in dieser Arbeit noch Gene-targeting Vektoren für Spred-1 und Spred-2 kloniert, die zur Generierung von embryonalen Stammzellen mit gefloxtem Exon 2 des Spred-1 bzw. Spred-2 Gens genutzt wurden. Diese embryonalen Stammzellen stehen nun als wertvolle Grundlage zur Etablierung von konditionalen Knockout Mäusen zur Verfügung. Dies ist von großem Interesse, um die physiologischen gewebespezifischen Funktionen von Spred-1 und Spred-2 zu untersuchen, vor allem wenn die Doppel-Knockout Mäuse nicht lebensfähig sein sollten. KW - Spred Protein KW - Knockout KW - Maus KW - Spred KW - Knockout Mäuse KW - Zwergenwuchs KW - EVH-1 KW - MAP Kinase KW - Spred KW - knockout mice KW - dwarfism KW - EVH-1 KW - MAP kinase Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14333 ER - TY - THES A1 - Engelhardt, Catherine Marie T1 - Identification and characterisation of the Spred protein family T1 - Identifizierung und Charakterisierung der Spred Proteinfamilie N2 - The subject of this thesis was the cloning and the initial biochemical and functional characterisation of novel human proteins with an N-terminal Ena-VASP homology (EVH)-1 domain and a C-terminal Sprouty homologous region (SPR), which are related to the Drosophila AE33 protein. During the course of this work, three mouse homologues of the AE33 fly protein have been reported and termed Sprouty-related protein with an EVH-1 domain 1, 2 and 3 (Spred-1, -2, -3)(Wakioka et al, 2001; Kato et al, 2003). Spred-1, -2 and -3 are membrane associated substrates of receptor tyrosine kinases and they act as negative regulators of the Ras pathway during growth factor stimulation. As the Spred-family members seem to exert similar functions, the specific function of each member remains enigmatic. Therefore, we investigated the mRNA and protein expression patterns of the two murine protein family members Spred-1 and Spred-2 on the whole organ level. Furthermore, we focussed on the cellular localisation and the role of human and murine Spred-2 in the organism. The expression patterns of Spred-1 and Spred-2 differed markedly among various tissues and cell types. In mouse, Spred-1 is abundantly expressed in adult brain, cerebellum, and fetal tissues, whereas Spred-2 was ubiquitously expressed. In humans, Spred-2 was found to be strongly expressed in glandular epithelia and in invasive cytotrophoblasts, and at the subcellular level its immunoreactivity was associated with secretory vesicles and was found to colocalise with Rab11 GTPase. The new human Spred gene family was investigated in detail. Cloning of the fulllength form of human Spred-2 resulted in an 1254 bp coding sequence, corresponding to a 418 amino-acids protein. Immunoblotting with a set of affinitypurified antibodies confirmed the expression of a 47 kDa protein and suggested the presence of additional differently sized variants. Cloning of various shortened Spred- 2 mRNAs and identification of 2 additional human Spred genes (localised on different chromosomes) with their respective EST (expressed sequence tag) revealed that the new human Spred gene family displays extensive splicing, leading to the generation of short and long Spred proteins. All protein isoforms and splicing variants contain an EVH1-domain located at the N-terminus of the protein. The full-length forms (“a” forms) comprised the SPR, another functional domain localised at the C-terminus whereas the short variants (Spred-1b, 2 c-e, 3 c) lack the entire C-terminal SPR domain or part of it. The existence of short and long splicing variants of Spred-1, -2 and -3 revealed a common principle of organisation and splicing pattern in the Spred family. Functional analyses of the 5 cloned Spred-2 splicing variants revealed differential subcellular localisation and differential regulation of serum- and EGF- mediated ERK activation in HEK-293 cells. Taken together, these results indicate a highly specific expression pattern of Spred-1 and Spred-2 in various tissues suggesting a specific physiological role for the individual Spred isoform in these tissues. For example, Spred-2 appears to be involved in regulating secretory pathways. Furthermore, the human Spred family contains three genes, which are subject to extensive alternative splicing resulting in at least 8 different proteins with differential subcellular localisation and differential regulatory potential of the MAPK pathways during growth factor stimulation. N2 - Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Klonierung, sowie die biochemische und funktionelle Charakterisierung der neuen Spred Proteinfamilie, welche sich durch eine N-terminale EVH1-Domäne und C-terminal eine Sprouty homology Domäne (SPR) auszeichnet (Sprouty-related protein with an EVH-1 domain, Spred). Spred-1, -2, -3 sind membranassoziierte Substrate von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und hemmen den Wachstumsfaktor-stimulierten Ras Signalweg. Während für die drei Mitglieder der Spred-Familie ähnliche biochemische Funktionen beschrieben sind, ist bislang deren spezifische physiologische Funktion unbekannt. Wir haben deshalb zunächst die mRNA- und Protein-Expression von Spred-1 und Spred-2 in verschiedenen Organen der Maus untersucht. Zudem haben wir die zelluläre und subzelluläre Lokalisation bestimmt. Dabei zeigte sich, daß sich die Expression der Spred-Isoformen deutlich voneinander unterscheidet. Während Spred-1 stark im Großhirn, Kleinhirn und in fetalen Geweben exprimiert wird, kommt Spred-2 verstärkt in adulten Geweben vor. Beim Menschen konnte zudem gezeigt werden, daß Spred-2 stark in Drüsenepithelien, in Zytotrophoblasten und auf subzellulärer Ebene mit sekretorischen Vesikeln assoziiert war. Das Expressionsmuster der humanen Spred-Proteine wurde im Detail untersucht. Die Klonierung des humanen Spred-2 ergab eine 1254 bp lange kodierende Sequenz, die für ein Protein mit 418 Aminosäuren kodiert. Durch einen Immunoblot mit affinitätsgereinigten Antikörpern bestätigte sich die Expression eines 47 kD großen Proteins, gleichzeitig zeigten sich zusätzliche Varianten des Proteins mit abweichenden Größen. Daraufhin konnten vier kürzere mRNAs für Spred-2 kloniert werden, die durch alternatives Spleißen entstehen. Zudem konnten zwei neue Spred-Gene identifiziert werden, die auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind und die jeweils für mehrere Proteine unterschiedlicher Größe kodieren. Alle Proteinisoformen und Spleißvarianten enthalten eine N-terminale EVH-1-Domäne, während nur die langen Isoformen (“a-Formen”) zusätzlich eine C-terminale SPRDomäne enthalten. Die Untersuchung der Funktion der 5 klonierten Spleißvarianten von Spred-2 ergab eine differentielle subzelluläre Lokalisation. Zudem zeigte sich eine unterschiedliche Regulation der Serum- und EGF-induzierten ERK-Aktivierung durch die verschiedenen Spred-2 Spleißvarianten. Diese Ergebnisse zeigen, daß Spred-1 und Spred-2 ein hochspezifisches Expressionsmuster in verschiedenen Organen aufweisen, ein Befund, der auf eine spezifische funktionelle Rolle der einzelnen Isoformen hindeutet. Die vorliegenden Befunde weisen darauf hin, daß Spred-2 an der Regulation sekretorischer Vorgänge beteiligt ist. Die Mitglieder der humanen Spred Proteinfamilie werden von drei Genen kodiert, durch alternatives Spleißen resultieren hieraus mindestens 8 verschiedene mRNAs. Werden die korrespondierenden Proteine überexprimiert, zeigen sie differentielle subzelluläre Lokalisationen und unterschiedliche Regulation der MAPKinase Aktivität. KW - Spred Protein KW - RNS-Spleißen KW - EVH1 Domäne KW - Spred Protein KW - Spleißvarianten KW - EVH1 domain KW - Spred protein KW - splice variant Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11456 ER - TY - THES A1 - Fischer, Anna T1 - Die Regulation aktivierender und hemmender Signalwege in humanen neutrophilen Granulozyten durch cAMP- und cGMP-erhöhende Vasodilatatoren T1 - Regulation of activatory and inhibitory signalling pathways in neutrophils mediated by cAMP- and cGMP-elevating vasolidators N2 - Neutrophile Granulozyten sind wichtige Effektorzellen des menschlichen Immunsystems. Eine Suppression der Neutrophilen kann zur Immundeffizienz mit Gefahr für bakterielle Erkrankungen und maligne Tumoren führen, eine Überstimulation dieser Zellen ist jedoch an der Entstehung der Autoimmunerkrankungen beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden aktivierende und hemmende Wege untersucht, die für zukünftige Strategien in Prävention und Therapie dieser Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Neutrophile Granulozyten enthalten VASP in hoher Konzentration. VASP ist ein bereits gut charakterisiertes Substrat der cAMP-PK und der cGMP-PK. Phosphorylierungsversuche mit cAMP-erhöhenden Substanzen ergaben eine rasche, reversible Phosphorylierung dieses Proteins an Ser-157 und Ser-239 in intakten humanen Neutrophilen Granulozyten. Versuche mit cGMP-erhöhenden Substanzen zeigten jedenfalls eine Phosphorylierung am Ser-157, jedoch keine Phosphorylierung am Ser-239. Diese Ergebnisse unterstreichen deutlich das Vorhandensein und die physiologische Funktion der cAMP-PK bezüglich der Phosphorylierung von VASP, stellen jedoch die Funktion der cGMP-PK in humanen Neutrophilen Granulozyten in Frage. Basierend auf der Methode der Immunfluoreszenz wurde gezeigt, dass VASP bei der Adhärenz der Neutrophilen eine entscheidende Rolle spielt. So ist mit Hilfe der spezifischen monoklonalen Antikörper eine Phosphorylierung am Ser-157 und am Ser-239 nach der Adhäsion der Neutrophilen an die Objektträger nachgewiesen worden. Nach zusätzlicher Stimulation mit PG-E1 zeigte sich kein wesentlicher Phosphorylierungsanstieg in adhärierten Neutrophilen. Zahlreiche chemotaktische Faktoren wie fMLP führen zur Phosphorylierung der p42/p44-, p38-MAPK sowie auch der PKB. Diese intrazellulären Signalmoleküle spielen eine zentrale Rolle bei der Neutrophilenaktivierung. Da es bereits von hemmenden Einflussen der Vasodilatatoren auf die Aktivierung der Neutrophilen Granulozyten berichtet worden ist, wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von cAMP- und cGMP-erhöhenden Substanzen auf die fMLP-induzierte Phosphorylierung der p42/p44-, p38-MAPK sowie der PKB untersucht. Flolan, ein cAMP-erhöhender Vasodilatator führte zur signifikanten Hemmung der fMLP-induzierten p42/p44-, p38- sowie PKB-Phosphorylierung. cGMP-erhöhender Vasodilatator SNP zeigte jedoch keinen Einfluss auf die fMLP-induzierte Aktivierung dieser Signalmoleküle. Physiologisch vorkommende cAMP-erhöhende Substanzen besitzen im menschlichen Körper eine wichtige regulatorische Funktion, die Neutrophile Granulozyten vor der „Überstimulation“ bewahrt. N2 - Neutrophil granulocytes are critical effector cells in human humoral and innate immunity and play a vital role in phagozytosis and bacterial killing. Patients with deficient function of neutrophils commonly suffer from repeated bacterial infections. Moreover, neutrophils are active in immunosurveillance against tumours. However, the capacity for bacterial killing carries with it an implicit capacity for host tissue destruction, as observed in autoimmune disease. This study is focussed on the characterization of activatory and inhibitory signalling pathways in neutrophils which will allow new approaches in the therapy of cancer, inflammatory and autoimmune diseases. Neutrophils contain high concentrations of VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein). VASP is an established substrate of both cAMP- and cGMP- dependent protein kinases. This study demonstrates that cAMP-elevating drugs cause reversible VASP phosphorylation at serine 157 and at serine 239 in intact human neutrophils, whereas cGMP-elevating drugs cause VASP phosphorylation only at serine 157 but not at serine 239. This indicates that cAMP-dependent protein kinases play a functional role in neutrophils, the physiologic role of cGMP-dependent protein kinases in these cells still remains unresolved. Furthermore, immunofluorescence microscopy demonstrated VASP phosphorylation at serine 157 and serine 239 during neutrophil adhesion. After stimulation of adherent neutrophils with PG-E1 no increase in VASP phosphorylation could be observed compared to unstimulated adherent cells. Multiple chemotactic factors including fMLP cause phosphorylation and activation of p42/p44-MAPK, p38-MAPK and protein kinase B (Akt-kinase, PKB). These are intracellular signalling molecules which play an important role in neutrophil activation. This study investigates the effects of cAMP- and cGMP-elevating drugs on the fMLP-induced phosphorylation of p42/p44-MAPK, p38-MAPK and PKB. The cAMP-elevating prostacyclin I2 (Flolan™) shows inhibition of fMLP-induced phosphorylation of p42/p44-MAPK, p38-MAPK and PKB. The cGMP-elevating drug sodium nitroprusside did not influence fMLP-induced phosphorylation of these signalling molecules. Therefore, physiological cAMP-elevating substances seem to play a regulatory role and prevent neutrophil granulocytes from “overstimulation”. KW - Neutrophile KW - VASP KW - MAPK KW - Vasodilatatoren KW - neutrophils KW - VASP KW - MAPK KW - vasodilators Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13331 ER - TY - THES A1 - Vielreicher, Martin Christian T1 - Fluoreszenz-mikroskopische Untersuchung der Inaktivierung der Tyrosinkinase SRC im Integrin alphaIIb-beta3 -Signalweg T1 - Studies on the inactivation process of the tyrosine kinase Src in the integrin alphaIIb-beta3 signaling pathway by fluorescence microscopy N2 - Essentiell für die Blutstillung (Haemostase) ist die Thrombozyten- oder Blutplaettchen-Adhaesion und die Thrombus-Bildung. Beide Vorgaenge werden hauptsaechlich durch den Thrombozyten-Rezeptor Integrin alphaIIb-beta3 vermittelt. Nach Bindung des Liganden Fibrinogen aendert sich die Rezeptor-Konformation, Integrine assoziieren und ein intrazellulaeres Signalnetzwerk wird aktiviert, welches die Organisation des Aktin-Zytoskeletts steuert. Diese Zytoskelett-Reorganisationen sind Grundlage für zellulaere Adhaesions- und Aggregations-Prozesse. Die Signalvermittlung vom Integrin zum Zytoskelett wird durch die Protein-Tyrosinkinase Src eingeleitet, deren Aktivitaetszustand den Signalweg reguliert. Bei der Src-Aktivierung wird Tyrosin 418 durch Autokatalyse phosphoryliert. Die Kinase muss jedoch wieder inaktiviert werden. Dies übernimmt in Plaettchen ausschliesslich die Tyrosinkinase Csk (C-terminale Src Kinase) durch Phosphorylierung von Tyrosin 529 im C-terminalen Ende des Proteins. Die Csk-vermittelte Inaktivierung von Src stellt den entscheidenden Kontrollschritt des alphaIIb-beta3-vermittelten Signalwegs dar. Obwohl bekannt ist, dass die Src-Aktivierung bei der Zelladhaesion an den Zellraendern der Lamellipodien geschieht und man den Mechanismus und die Kinetik der Src-Csk Interaktion genauer versteht, ist bislang immer noch unbekannt, wo und wie Src inaktiviert wird bzw. welche Rolle der Src-Inaktivierung genau zukommt. FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) ist ein physikalischer Effekt, mit dem Interaktionen beliebiger fluoreszenzmarkierter Proteine mikroskopisch detektiert werden koennen. Diese Technik wurde genutzt, um die Src-Csk-Interaktion waehrend der alphaIIb-beta3-vermittelten Fibrinogen-Adhaesion in einer etablierten Thrombozyten-Modellzelllinie (A5-CHO) direkt visualisierbar zu machen. Es zeigten sich starke Src-Csk Interaktionen (FRET-Signale) an den Zellraendern aktiver Lamellipodien und zusaetzlich in Fokalkontakten, wo beide Proteine mit Vinculin, einem Fokalkontakte-Marker, co-lokalisierten. Die Proteininteraktionen folgten einem hochdynamischen Ablauf. Nach der Akkumulation der Src-Csk Komplexe an den Zellraendern wanderten sie in Abstaenden von 2-3 Minuten nach innen, fragmentierten und bildeten schliesslich stabile Fokal-Adhaesionen. FRET-Signale an den Zellraendern fanden sich vor allem in ruhenden Lamellipodien bzw., waehrend des Lamellipodien-Rückzugs, in wachsenden Lamellipodien traten die FRET-Signale dort dagegen nicht auf. In unabhaengigen biochemischen Tests im Zeitfenster der FRET-Beobachtungen wurde ein spezifischer Anstieg der Src-Tyr529-Phosphorylierung (Inaktivierung) und eine parallele Abnahme der Src-Tyr418-Phosphorylierung (Aktivierung) gemessen. Weiterführende Ergebnisse lieferten Versuche mit Src- und Csk-Mutanten. Die Co-Expression von Wildtyp-Src mit Kinase-inaktivem CskK222R hatte weder einen Effekt auf die Adhaesion und Ausbreitung der Zellen noch auf die Praesenz von FRET, es aenderte sich jedoch drastisch die zellulaere Verteilung der FRET-Signale sowie das Wachstum und die Form der Lamellipodien. Die Co-Expression von Wildtyp-Csk mit konstitutiv aktivem SrcY529F verursachte dagegen eine stark verringerte Adhaesionsfaehigkeit und Hemmung der Lamellipodien-Bildung. Die Fokal-Adhaesionspunkte in diesen Zellen waren sehr schwach und ueberdimensioniert und lagen ungeordnet verteilt in der Adhaesionsebene. Zusaetzlich verursachte SrcY529F eine starke Ueberaktivierung des Zytoskeletts und das fast vollstaendige Verschwinden der FRET-Signale. Die ermittelten Daten zeigen, dass die enge Kontrolle der Src-Aktivitaet durch Csk eine bedeutende Rolle für die funktionelle Zell-Adhaesion and -Ausbreitung spielt. Co-Immunpraezipitations-Resultate und Messungen der Menge an markiertem Protein in Zellen, in welchen FRET detektierbar war, untermauern zusaetzlich unsere These, zum ersten Mal die Src-Regulation durch Csk in lebenden Zellen direkt beobachtbar gemacht zu haben. Dieser neue FRET-Ansatz kann auch als Reporter-System für Prozesse der Src-Inaktivierung in anderen Signalwegen und Zellen angewendet werden. Das Messprinzip kann weiterhin auf das Studium der Inaktivierung weiterer Mitglieder der Familie der Src-Kinasen (in verschiedensten Signalwegen) erweitert werden. N2 - Platelet adhesion and thrombus formation required for functional hemostasis depends on integrin receptor mediated “outside-in” signaling to the cytoskeleton. Integrin alphaIIb-beta3 is the major integrin on the platelet surface and acts as a specific receptor for the plasma protein fibrinogen. Fibrinogen binding causes clustering of integrins within the plasma membrane activating the protein tyrosine kinase Src (signal initiation) by phosphorylation of tyrosine 418. Src, however, is negatively regulated by another tyrosine kinase, Csk (C-terminal Src kinase), which phosphorylates tyrosine 529. Although, in adhering cells, it is believed that Src is getting activated at lamellipodia leading edges, neither the cellular location nor the dynamics and exact role of Src inactivation is known to date. Here, we studied Src inactivation during alphaIIb-beta3-dependent adhesion to fibrinogen in the established platelet model cell line A5-CHO. Using a live cell FRET (fluorescence resonance energy transfer) microscopy technique with CFP and YFP label molecules (cyan and yellow fluorescent protein), we were able to image highly dynamic Src-Csk interactions at the leading edges of active lamellipodia. Every 2-3 minutes, signals detecting Src-Csk interactions (complexes) appeared at the cell periphery before they begin to move inward in the cell and reorganize while lamellipodia start to protrude (grow). FRET signals were also found in small accumulations at the fringe and also further to the centre of the adhesion plane (focal complexes and adhesions). Src and Csk co-localize with vinculin (a focal adhesion marker) within these regions. During the runtime of FRET observation a specific increase in Src-Tyr529 phosphorylation with a parallel decrease in Src-Tyr418 phosphorylation was observed supporting the idea that Src inactivation occurs within the cells. The role of Src-Csk interaction was studied in further detail using Src and Csk mutants. The data revealed that co-expression of inactive CskK222R did not alter the presence of FRET signals, but fundamentally changed its distribution within the cell. Furthermore it caused lamellipodia shape changes and a tendency of constant lamellipodia protrusion. Co-expression of constitutively active SrcY529F in turn caused a severe adhesion and spreading dysfunction. Adherent cells showed very weak, disorganized and oversized focal adhesions, a hyper-activated cytoskeleton (visible in fast-changing membrane blebs) and absence of FRET signals. Results from immunoprecipitation analyses and protein level determination within cells, in which FRET was detectable, further supported that we were able, for the first time, to directly visualize Src (and integrin) regulation by Csk control in live cells. The results show that Src control by Csk is ultimately required for lamellipodia and focal adhesion function and thus for cell anchorage and spreading. The novel FRET-approach reported here can be readily applied to other integrin and signaling pathways including the study of closely related Src family kinases (SFKs). Results may also contribute to a better understanding of the processes of tumor formation. KW - Antigen CD41 KW - Src-Proteine KW - C-terminal-Src-Kinase KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Thrombozyt KW - CHO-Zelle KW - Lamellipodium KW - Zellskelett KW - Zelladhäsion KW - Integrin alphaIIb-beta3 KW - integrin alphaIIb-beta3 KW - src kinase KW - csk KW - FRET KW - platelet KW - cell adhesion KW - CHO cell KW - lamellipodium KW - actin cytoskeleton Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26743 ER - TY - THES A1 - Thumati, Naresh Reddy T1 - Characterization of new protein kinases of the EVH1 domain containing protein VASP and identification of binding partners for a new EVH1 domain of the Spred2 protein : A case study on protein interactions of EVH1 domain containing proteins N2 - Protein interactions as mediated by catalytic or non-catalytic protein domains contribute to cellular signal transduction processes by covalent protein modification of or non-covalent binding to interaction partners. Ena/VASP homology 1 (EVH1) domains are found in different signal transduction proteins as N-terminal non-catalytic adaptor modules of ~ 115 amino acids sharing a common fold. By targeting their host proteins to subcellular sites of action they are involved in several signalling cascades which include protein phosphorylation and cytoskeletal reorganisation. In this study, protein interactions of the two EVH1 domain containing proteins VASP and Spred2 were studied according to their involvement in different and non-overlapping signal transduction pathways of the cell. EVH1 domains were first described in the Ena/VASP protein family with the Vasodilator-stimulated phosphoprotein VASP being its founding member. As a cytoskeleton-associated protein VASP not only interacts with different proteins of the actin network but it is also a substrate for cAMP- and cGMP-dependent protein kinases. However the full complement of protein kinases targeting VASP as their substrate is still unknown. Here we used mouse cardiac fibroblast (MCFB) cells in order to study the phosphorylation status of VASP and identify new candidate protein kinases involved after serum stimulation of these cells. Using phosphosite-specific antibodies we found that serum stimulation induces a phosphorylation of VASP at Ser-157 in a time-dependent manner reaching its maximum after 90 min of stimulation. We developed an interaction graph model of possible candidate protein kinases involved. Using a pharmacological perturbation analysis with different combinations of specific protein kinase inhibitors and activators we excluded any contribution of cGMP-dependent protein kinase and Rho kinases to this process and identified a combined action of classical isoforms of PKCs and PKA in serum-stimulated VASP phosphorylation at Ser-157 positioning PKC upstream of PKA in this signalling pathway. We hypothesise that PKC receives an external stimulatory signal upon serum stimulation of MCFB cells which is passed either directly or indirectly to PKA which finally phosphorylates VASP at Ser-157. A new EVH1 domain has been described recently in the Spred proteins (Sprouty related proteins containing an EVH1 domain) which are inhibitors of the Ras/Raf/MAP kinase pathway. Our laboratory has been involved in the elucidation of the atomic structure of the human Spred2 EVH1 domain by protein NMR spectroscopy (PDB 2JP2; 2007). A positively charged binding interface of this EVH1 domain suggests an interaction with negatively charged ligands; however no interaction partners of this domain have been described so far. In the second part of this study, we used different genetic and biochemical screening methods to search for ligands of the Spred2 EVH1 domain. A bacterial two-hybrid system was established using a physically well characterized interaction of the VASP EVH1 domain with a panel of its ActA binding peptides as positive controls to screen a human brain cDNA expression library at different stringencies for candidate Spred2 EVH1 interaction partners. However none of the clones isolated could be genetically and physically validated to support Spred2 EVH1 specific interactions. An in-vitro screening of a 9-mer phage display peptide library using purified GST-Spred2 EVH1 fusion protein was performed together with a Fyn-SH3 fusion protein as a positive control. In contrast to the Fyn-SH3 domain the majority of phages isolated with the Spred2 EVH1 domain either carried no inserts or inserts with stop codons suggesting a highly non-specific interaction of the phage coat protein with the latter domain but neither the Fyn-SH3 domain nor the GST moiety. Isolation of a 13-mer proline-rich sequence was particularly surprising in this context. In order to address possible interactions of the Spred2 EVH1 domain with non-peptidergic ligands protein-lipid interaction assays were performed. Quantitative binding studies to purified Spred2 EVH1 using a liposome sedimentation assay however excluded any interaction of candidate phospholipids of the phosphatidyl inositol phosphate class with the Spred2 EVH1 domain. A natively folded and thus binding-competent conformation of the purified proteins used was assessed independently by 1H protein NMR spectroscopy. In summary the cumulative evidence of our genetic and biochemical screening experiments suggests that the still elusive Spred2 EVH1 ligand(s) may be formed of hydrophobic peptide epitopes larger than nine amino acids in size and carrying negative charge(s). A phosphorylation of Spred2 EVH1 binding epitopes by a post-translational modification should be seriously considered in future experiments. N2 - Proteininteraktionen, wie sie durch katalytisch oder nicht-katalytisch wirksame Proteindomänen vermittelt werden können, spielen eine wesentliche Rolle in zellulären Signaltransduktionsprozessen durch die kovalente Modifikation oder nicht-kovalente Bindung von Interaktionspartnern. Ena/VASP Homologie 1 (EVH1) Domänen finden sich als N-terminale, nicht-katalytische, etwa 115 Aminosäuren große und konserviert gefaltete Adaptormodule in vielen verschiedenen Signaltransduktionsproteinen. Indem sie ihre jeweiligen Wirtsproteine an deren subzellulärem Wirkort verankern helfen, sind sie an vielen verschiedenen Signalkaskaden wie z.B. Proteinphosphorylierungen oder Umbauprozessen des Zytoskeletts beteiligt. In dieser Arbeiten wurden Proteininteraktionen der beiden EVH1 domänen-haltigen Proteine VASP and Spred2 untersucht, die in nicht überlappenden Signaltransduktionswegen der Zelle vorkommen. EVH1 Domänen wurden zuerst innerhalb der Ena/VASP-Proteinfamilie beschrieben, deren Gründungsmitglied das Vasodilator-stimulierte Phosphoprotein VASP ist. Als zytoskelett-assoziiertes Protein wechselwirkt VASP nicht nur mit verschiedenen Aktin-bindenden Proteinen, sondern ist auch ein Substrat der cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen. Der vollständige Satz jener Proteinkinasen, die VASP als eines ihrer Substrate aufweisen, ist immer noch unbekannt. Hier haben wir kardiale Mausfibroblasten (MCFB) Zellen verwendet, um nach Serum-Stimulation dieser Zellen den Phosphorylierungsstatus von VASP zu bestimmen und daran beteiligte, neue Kandidaten-Proteinkinasen zu identifizieren. Mit Hilfe von Phosphorylierungsstellen-spezifischen Antikörpern konnten wir zeigen, dass eine Serum-Stimulation eine zeitabhängige Phosphorylierung von VASP an Serin 157 induziert, die ein Maximum 90 min nach Stimulation erreicht. Wir entwickelten ein Interaktionsgraphen-Modell möglicher Kandidaten-Proteinkinasen, die an diesem Prozess beteiligt sein könnten. Mit Hilfe pharmakologischer Perturbationsexperimente auf der Grundlage spezifischer Proteinkinase-Inhibitoren und Aktivatoren konnten wir einerseits eine Beteiligung der löslichen cGMP-abhängigen Proteinkinase und von Rho-Kinasen an diesem Prozess ausschliessen und anderseits die gemeinsame Beteiligung der klassischen Proteinkinase C Isoform(en) und der cAMP-abhängigen Proteinkinase nachweisen. In diesem Signalweg liegt dabei die Proteinkinase C stromaufwärts vor letzterer. Nach unserer Interpretation der Daten wird die PKC nach Serum-Stimulation der MCFB-Zellen aktiviert und aktiviert ihrerseits direkt oder indirekt die cAMP-abhängige Proteinkinase, die schliesslich VASP als proximales Substrat am Serin 157 phosphoryliert. Eine neue EVH1 Domäne wurde kürzlich in den Spred Proteinen (Sprouty related proteins containing an EVH1 domain) beschrieben, die neue Inhibitoren im Ras/Raf/MAP-Kinase-Signalweg darstellen. Unser Labor war an der NMR-gestützten Aufklärung der atomaren Struktur der Spred2 EVH1 Domäne beteiligt (PDB 2JP2; 2007). Die positiv geladene Bindungsfurche dieser EVH1 Domäne legt eine Interaktion mit anionischen Liganden nahe. Interaktionspartner für diese Domäne sind bisher jedoch nicht beschrieben worden. Im zweiten Teil dieser Arbeit verwendeten wir verschiedene genetische und biochemische Suchverfahren zur Identifizierung möglicher Spred2 EVH1 Liganden. Ein bakterielles Two-Hybrid-System mit der Spred2 EVH1 Domäne als Köderprotein wurde dazu etabliert unter Verwendung der physikalisch gut charakterisierten Wechselwirkung der VASP EVH1 Domäne mit ihren ActA Bindungspeptiden als eines positiven Kontroll-Interaktionspaars und zum verschieden stringenten Durchmustern einer humanen cDNA Expressionsgenbank aus Gehirn eingesetzt. Keiner der isolierten Klone ließ sich jedoch genetisch oder nach Sequenzierung in Hinblick auf eine Spred2 EVH1 spezifische Wechselwirkung validieren. Mittels gereinigtem GST-Spred2 EVH1 Protein wurde daher eine 9-mer Peptid-Genbank im Phage-Display-Verfahren durchgemustert unter Verwendung eines Fyn-SH3 Fusionsproteins als positiver Kontrolle. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit letzterer trugen die mit der Spred2 EVH1 Domäne isolierten Phagen überwiegend keine Inserts oder solche mit Stop-Codons, was eine unspezifische Wechselwirkung mit den Phagen-Hüllenproteinen dieser Domäne nicht jedoch der Fyn-SH3 Domäne oder des GST-Partners nahelegt. Die Isolierung einer 13-mer großen prolin-reichen Bindesequenz war in diesem Zusammenhang besonders überraschend. Um eine mögliche Wechselwirkung von Spred2 EVH1 mit nicht-peptidergen Liganden zu untersuchen, wurden Protein-Phospholipid-Interaktionsassays durchgeführt. Mittels quantitativer Bindungsstudien unter Verwendung der isolierten Domäne konnte eine Interaktion mit Kandidaten-Phospholipiden aus der Klasse der Phosphatidylinositolphosphate in einem Liposomen-Sedimentationsassay ausgeschlossen werden. Eine native Faltung und damit prinzipiell bindungskompetente Konformation(en) der gereinigten Proteine konnten mittels 1H Protein-NMR-Spektroskopie sichergestellt werden. Zusammengenommen lassen unsere Experimente vermuten, dass es sich bei den noch immer nicht dingfest gemachten Spred2 EVH1 Liganden um hydrophobe, negative geladene, mehr als neun Aminosäuren umfassende Peptidepitope handeln könnte. Bei deren Identifizierung in zukünftigen Experimenten sollte mit ihrer Phosphorylierung durch post-translationale Modifikationen gerechnet werden. KW - VASP KW - Spred KW - EVH1 domains KW - Protein interactions KW - VASP KW - Spred KW - EVH1 domains KW - Protein interactions KW - VASP KW - Spred KW - EVH1 domains KW - Protein interactions Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26617 ER - TY - THES A1 - Jurak Begonja, Antonija T1 - NO/cGMP and ROS Pathways in Regulation of Platelet Function and Megakaryocyte Maturation T1 - NO/cGMP und ROS Singnalwege in Regulation der Plättchen Funktion und Megakaryozyten Entwicklung N2 - Blutplättchen spielen unter physiologischen Bedingungen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der Hämostase. So verhindern sie ein andauerndes Bluten von Wunden, indem sie in Blutgefässen zwischen normalen Zellen des Endothels und beschädigten Bereichen unterscheiden und sich dort gezielt anheften können. Das Zusammenspiel der Plättchenagonisten und den dazugehörigen Rezeptoren wird durch intrazelluläre Signalmoleküle kontrolliert, die die Aktivierung der Blutplättchen regulieren. Äusserst wichtige intrazellulare Signalmoleküle stellen dabei die zyklischen Nukleotide cGMP und cAMP dar, die bei der Hemmung der Plättchen beteiligt sind. Die Bildung von cGMP und cAMP in den Blutplättchen wird durch die aus dem Endothel freigesetzten Moleküle NO und Prostacyclin (PGI2) stimuliert, die ihrerseits Blutplättchen hemmen, indem sie Proteinkinase G (PKG) und Proteinkinase A (PKA) aktivieren. Neuerdings wird vorgeschlagen, dass es sich bei ROS („reactive oxygen species“) um einen neuen Modulator bei der Signaltransduktion zwischen verschiedenen Zelltypen handelt. Die hier zusammengefasste Arbeit beschreibt die Rolle der ROS-Produktion bei der Aktivierung von Blutplättchen, die Beziehung zwischen dem NO/cGMP/PKG I Signalweg und der ROS bzw. MAP-Kinase Signaltransduktion, und die Rolle von zyklischen Nukleotiden bei der Entwicklung von Megakaryozyten und Blutplättchen. Werden Blutplättchen durch unterschiedliche Einflüsse aktiviert, so produzieren sie über die Aktivierung von NAD(P)H-Oxidase nur intrazelluläres aber nicht extrazelluläres ROS. Dabei beinflusst das in den Blutplättchen produzierte ROS signifikant die Aktivierung von αIIbβ3 Integrin, nicht jedoch die Sekretion von alpha- bzw. dichten Granula oder die Gestalt der Blutplättchen. Die Thrombin-induzierte Integrin αIIbβ3-Aktivierung ist nach Behandlung der Blutplättchen mit Hemmstoffen der NAD(P)H-Oxidase oder Superoxid-Fängern signifikant reduziert. Diese Inhibitoren reduzieren auch die Aggregation der Blutplättchen bzw. die Thrombusbildung auf Kollagen, wobei diese Effekte unabhängig vom NO/cGMP Signalweg vermittelt werden. Sowohl ADP, das von dichten Granula der Blutplättchen sezerniert wird und zur Aktivierung von P2Y12-Rezeptoren führt, als auch die Freigabe von Thromboxan A2 stellen wichtige, vorgeschaltete Vermittler bei der p38 MAP Kinase-Aktivierung durch Thrombin dar. Jedoch spielt die p38 MAP-Kinase-Aktivierung keine signifikante Rolle bei der Thrombin-induzierten Kalzium-Mobilisierung, P-Selektin Exprimierung, αIIbβ3 Integrin Aktivierung oder Aggregation der Blutplättchen. Abschliessend kann festgestellt werden, dass sich die Aktivierung der PKG insgesamt klar hemmend auf die p38 and ERK MAP-Kinasen in menschlichen Blutplättchen auswirkt. Desweiteren zeigt diese Studie, dass zyklische Nukleotide nicht nur die Blutplättchen hemmen, sondern auch einen Einfluss auf die Entwicklung der Megakaryozyten und Blutplättchen haben, aber auf unterschiedliche Weise. cAMP ist an der Differenzierung von embryonalen hämatopoietischen Zellen zu Megakaryozyten beteiligt, wobei cGMP keine Rolle bei diesem Prozess spielt. Während PKA in embryonalen Zellen schon vertreten ist, steigt beim Reifungsprozess der Megakaryozyten die Expression von Proteinen, die bei der cGMP Signalverbreitung („soluble guanylyl cyclase“, sGC; PKG) mitwirken, stetig an. In der letzten Phase der Reifung von Megakaryozyten, die durch die Freisetzung der Blutplättchen charakterisiert ist, zeigen cGMP und cAMP leicht divergierende Effekte: cGMP verstärkt die Bildung von Blutplättchen, während cAMP dieselbe reduziert. Dies deutet auf einen fein abgestimmten Prozess hin, abhängig von einem Stimulus, der von den benachbarten Zellen des Sinusoid-Endothels stammen könnte. Die Ergebnisse dieser Dissertation tragen zu einen besseren Verständnis der Regulation von Blutplättchen sowie der möglichen molekularen Mechanismen bei, die eine Rolle bei der Reifung von Megakaryozyten im vaskularen Mikroumfeld des Knochenmarks innehaben. N2 - In physiological conditions platelets have a major role in maintaining haemostasis. Platelets prevent bleeding from wounds by distinguishing normal endothelial cells in vasculature from areas with lesions to which they adhere. Interaction of platelet agonists and their receptors is controlled by intracellular signaling molecules that regulate the activation state of platelets. Very important intracellular signaling molecules are cyclic nucleotides (cGMP and cAMP), both involved in inhibition of platelet activation. Formation of cGMP and cAMP in platelets is stimulated by endothelial-derived NO and prostacyclin (PGI2), which then mediate inhibition of platelets by activating protein kinase G (PKG) and protein kinase A (PKA). Recently, it has been suggested that reactive oxygen species (ROS) represent new modulators of cell signaling within different cell types. The work summarized here describes the involvement of platelet ROS production in platelet activation, the relation of NO/cGMP/PKG I pathway to ROS and to mitogen-activated protein kinases (MAP kinase) signaling, and the involvement of cyclic nucleotides in megakaryocyte and platelet development. Platelets activated with different agonists produce intracellular but not extracellular ROS by activation of NAD(P)H oxidase. In addition, ROS produced in platelets significantly affects αIIbβ3 integrin activation but not alpha/dense granule secretion and platelet shape change. Thrombin induced integrin αIIbβ3 activation is significantly decreased after pretreatment of platelets with NAD(P)H oxidase inhibitors and superoxide scavengers. These inhibitors also reduce platelet aggregation and thrombus formation on collagen under high shear and achieve their effects independently of the NO/cGMP pathway. ADP secreted from platelet dense granules with subsequent activation of P2Y12 receptors as well as thromboxane A2 release are found to be important upstream mediators of p38 MAP kinase activation by thrombin. However, p38 MAP kinase activation does not significantly contribute to calcium mobilization, P-selectin expression, αIIbβ3 integrin activation and aggregation of human platelets in response to thrombin. Finally, PKG activation does not stimulate, but rather inhibit, p38 and ERK MAP kinases in human platelets. Further study revealed that cyclic nucleotides not only inhibit platelet activation, but are also involved, albeit differentially, in megakaryocyte and platelet development. cAMP is engaged in haematopoietic stem cell differentiation to megakaryocytes, and cGMP has no impact on this process. While PKA is already present in stem cells, expression of proteins involved in cGMP signaling (soluble guanylyl cyclase, sGC; PKG) increases with maturation of megakaryocytes. In the final step of megakaryocyte maturation that includes release of platelets, cGMP and cAMP have mild but opposing effects: cGMP increases platelet production while cAMP decreases it indicating a finely regulated process that could depend on stimulus coming from adjacent endothelial cells of sinusoids in bone marrow. The results of this thesis contribute to a better understanding of platelet regulation and of the possible molecular mechanisms involved in megakaryocyte maturation in bone marrow vascular microenvironment. KW - Thrombozyt KW - Megakaryozyt KW - Signaltransduktion KW - Stickstoffmonoxid KW - Cyclo-GMP KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Plättchen KW - NO KW - cGMP KW - ROS KW - Megakaryozyten KW - Platelets KW - NO KW - cGMP KW - ROS KW - Megakaryocytes Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21954 ER - TY - THES A1 - Poppe, Heiko Anton T1 - Bestimmung der Substrat- und Inhibitorspezifität von Phosphodiesterasen mittels Mikrokaloriemetrie T1 - Phosphodiesterase activity and specificity measured using microcalorimetry N2 - Neben den cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkanäle CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor“ Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinität für ihr Zielprotein, über ihre Hydrolysestabilität gegenüber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am häufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln häufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Veränderungen der intrazellulären cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP – eine unerwünschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Domänen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivität, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des für ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates. N2 - cAMP and cGMP are critical second messengers that regulate multiple targets including different cAMP/cGMP-dependent protein kinases (PKA/PKGs), exchange proteins directly activated by cAMP (Epacs), phosphodiesterases (PDEs) and cyclic nucleotide-gated ion channels (CNGs). Second and third generation cyclic nucleotide analogs are widely used to elucidate specificity of cellular signaling, mediated by these target proteins. However, the selectivity and stability of these analogs need to be fully understood in order to properly interpret results and rigorously assess the mechanisms by which these analogs work in the cell. To better understand the selectivity and cross-reactivity of these analogs I measured the activation or inhibitory activity of 13 commonly-used cyclic nucleotide analogs 8 different PDEs. To measure their stability to hydrolysis I utilized isothermal microcalorimetry, a method that allows to evaluate whether or not an analog can function as a substrate or inhibitor for PDEs. I demonstrate that indeed some of these analogs can be hydrolyzed by multiple PDEs and others are competitive inhibitors. Herein I provide Ki data for all of the non-hydrolyzable analogs and Km and Vmax values for all of the hydrolyzable analogs. Each of these values, as well as their mode of inhibition can be determined in a single experiment. The data strongly implied that several of these analogs might, in addition to their primary effects, also cause elevation of cAMP or cGMP indirectly by inhibiting PDEs in the cell. Such an effect could of course cloud interpretation of the use of these analogs. Similarly, those that are PDE substrates also might have their duration of action substantially reduced. To illustrate this point we show that Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS, a highly specific non-hydrolyzable Epac activator in vitro, can under certain conditions enhance cGMP/PKG and cAMP/PKA signaling pathways in intact platelets. Specifically we found enhanced VASP phosphorylation at both PKA and PKG phosphorylation sites after the addition of Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS. These data indicate that this “selective Epac activator” is able to indirectly activate the cAMP/PKA and cGMP/PKG signalling pathways presumably through inhibition of platelet PDE5 and/or PDE3. The data together allow to provide recommendations for how best to probe the different cyclic nucleotide signalling pathways using cyclic nucleotide analogs. In summary, the data provide evidence that most cAMP and cGMP analogs have multiple targets. Therefore, interpretation of any effects these analogs have in cells should take into consideration their possible cross-target reactivities. KW - Cyclisches Nucleotid Phosphodiesterase <3 KW - 5-> KW - Proteinkinase A KW - Hydrolyse KW - Mikrokalorimetrie KW - Cyclo-GMP KW - Cyclo-GMP-Derivate KW - Dissoziationskonstante KW - Enzymkinetik KW - Inhibition KW - Cyclo-AMP KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyt KW - Immunoblot KW - Stickst KW - Proteinkinase G KW - Adenylatcyclase KW - Epac KW - Linear Mixed Inhibition KW - GAF Domaine KW - Proteinkinase G KW - Adenylylcyclase KW - Epac KW - Linear mixed inhibition KW - Gaf domaine Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34477 ER - TY - THES A1 - Grünewald, Thomas Georg Philipp T1 - Zelluläre, histologische und statistische Untersuchungen zur Funktion des Proteins LASP-1 in humanen Ovar- und Mammakarzinomen T1 - Cellular, histological and statistical analyses concerning the function of the protein LASP-1 in human ovarian and mammary carcinomas N2 - Brustkrebs ist, verbunden mit einem Lebenszeitrisiko von 12.5 % daran zu erkranken, die häufigste maligne Erkrankung der Frau in der westlichen Welt. Das LIM- und SH3-Domänen Protein LASP-1 wurde erstmalig 1995 als spezifisch in fokalen Kontakten akkumulierendes Protein in humanen Brustkrebszellen beschrieben. Eine eigene Patientenstudie (n = 83) ergab, dass LASP-1 in 55.4 % der untersuchten invasiven Mammakarzinome eindeutig überexprimiert wird und die LASP-1-Expressionshöhe signifikant positiv mit der Tumorgröße (p < 0.05) und der Wahrscheinlichkeit für Nodalpositivität (p < 0.01) korreliert. Als Actin-bindendes Protein mit ubiquitärer Expression interagiert LASP-1 mittels seiner SH3-Domäne auch mit Zyxin. Zyxin ist ein Signalprotein, das zwischen fokalen Kontakten und dem Zellkern pendelt und an der Regulation von Transcription, Zellzyklus und Zellbewegung beteiligt ist. In dieser Doktorarbeit untersuchte ich die Funktion von LASP-1 in verschiedenen humanen Brustkrebszelllinien und einer humanen Ovarkarzinomzelllinie unter Verwendung der RNA-Interferenz zum sequenzspezifischen knock-down von LASP-1. Die Transfektion der Zellen mit LASP-1-spezifischer small-interfering-RNA (siRNA) senkte die Proteinexpression um ca. 50 - 58 %, was zu einer Arretierung des Zellzyklus in der G2-Phase führte und die Proliferation der Brust- und Eierstockkrebszellen um 30 - 50 % reduzierte. Apoptotische und nekrotische Prozesse wurden dabei durch Caspase-3 Western-blots und Trypan-Blau-Färbungen ausgeschlossen. Außerdem verringerte der knock-down von LASP-1 die Migration der Krebszellen, wohingegen die Überexpression von LASP-1 in PTK2- (Potorous tridactylis kidney) Zellen, welche kein endogenes LASP-1 exprimieren, in einer signifikanten Steigerung der Migration resultierte. Immunfluoreszenzfärbungen zeigten, dass der knock-down von LASP-1 von einer verringerten Konzentration seines Interaktionspartners Zyxin an fokalen Kontakten begleitet wird, ohne dabei das Actin-Zytoskelett oder die Morphologie der fokalen Kontakte zu verändern. Die Transfektion der Brust- und Eierstockkrebszellen mit einer Kontroll-siRNA (scrambled Neuropilin1) beeinflusste hingegen keinen der genannten Parameter. Diese Daten unterstreichen die wichtige Rolle von LASP-1 für die Tumorzellproliferation und -migration. LASP-1 könnte daher in Interaktion mit Zyxin an der molekularen Karzinogenese von Brust- und Eierstockkrebs beteiligt sein und in der Zukunft als viel versprechender Prognosemarker dienen. N2 - LIM and SH3 protein (LASP-1), initially identified from human breast cancer, is a specific focal adhesion protein involved in cell migration. LASP-1 is an actin binding protein, which also interacts with the proline-rich domains of zyxin, a scaffolding protein required for cell movement and gene transcription. In an own patient study (n=83) strong cytoplasmatic expression of LASP-1 was detected in 55.4 % of the invasive carcinomas, which correlated significantly with increased tumor size (p < 0.05) and rate of nodal-positivity (p < 0.01). Furthermore, transfection with LASP-1-specific siRNA resulted in a reduced protein level of LASP-1 in different breast and ovarian cancer cell lines (BT-20, MCF-7 and SKOV-3). The siRNA-treated cells were arrested in G2/M phase of cell cycle, and proliferation of the tumor cells was suppressed by 30-50% corresponding to around 50% of the cells being transfected successfully as seen by immunofluorescence. In addition, tumor cells showed a 50% reduced migration after siRNA treatment, while overexpression of LASP-1 in non-tumor PTK-2 cells, which do not express endogenous LASP-1, resulted in a significant increase in cell motility. LASP-1 silencing is accompanied with a reduced binding of the of LASP-1 binding partner zyxin to focal contacts without changes in actin stress fiber organization as observed in immunofluorescence experiments. The data provide evidence for an essential role of LASP-1 in tumor cell growth and migration, possibly by influencing the localization of zyxin. Since the increased expression of LASP-1 in vivo is present in breast carcinomas with higher tumor stage, LASP-1 expression may be related with worse prognosis concerning patients' overall survival, hinting to a potential role of LASP-1 as a prognstic marker. KW - Brustkrebs KW - Eierstockkrebs KW - RNS-Interferenz KW - LASP-1 KW - LASP-2 KW - Zyxin KW - Mammakarzinom KW - Ovarkarzinom KW - LASP-1 KW - LASP-2 KW - Zyxin KW - mammary carcinoma KW - ovarian carcinoma Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29524 ER - TY - THES A1 - Rauchfuß, Steffen T1 - Der Einfluss des Insulins auf die Thrombozyten und auf die Wechselwirkung zwischen den Blutplättchen und dem Endothel T1 - The Effect of Insulin on Platelets and on Platelet-Endothelium Interactions N2 - Unter physiologischen Bedingungen spielen die Thrombozyten oder Blutplättchen eine zentrale Rolle bei der Erhaltung der Hämostase. Indem sie in Blutgefäßen beschädigte Bereiche erkennen und sich dort gezielt anheften können, verhindern sie das Austreten von Blut in subendotheliale Bereiche und halten eine Blutung gering. Intrazelluläre Signalmoleküle kontrollieren das Zusammenspiel der Plättchenagonisten und der dazugehörigen Rezeptoren und regulieren somit die Aktivierung der Blutplättchen. Verschiedene vorangegangene Publikationen demonstrierten sowohl aktivierende als auch inhibierende Effekte des Insulins auf die Aktivierung, Adhäsion und Aggregation der Blutplättchen. Diese durch das Insulin hervorgerufenen Effekte sollen hauptsächlich über den cGMP und cAMP Signalweg sowie über die Aktivierung von eNOS durch Insulin in den Blutplättchen wirken. Unsere Forschungsergebnisse weisen darauf hin, daß ein akuter, durch das Insulin hervorgerufener Effekt auf die Blutplättchen sowohl unter physiologischen wie auch unter pathologischen Glukosekonzentrationen nicht nachweisbar ist. Insulin zeigte keine Wirkung auf die intrazellulären Signalmoleküle PKB, VASP, P38 und ERK, welche in der Aktivierung/Hemmung der Blutplättchen eine wichtige Rolle spielen. Gleichfalls blieb eine Wirkung auf die Aggregation der Blutplättchen und Aktivierung des Oberflächenrezeptors Integrin αIIbβ3 sowie die Expression von P-Selektin auf der Oberfläche der Thrombozyten nach der Stimulation durch Insulin aus. Auch konnte der Insulinrezeptor durch uns auf der Oberfläche der Thrombozyten weder in seiner unphosphorylierten, noch in seiner phosphorylierten Form nach der Stimulation mit Insulin nachgewiesen werden. Zusammen mit dem Fehlen eines direkten, akuten Insulin-abhängigen Effekts auf die Thrombozyten läßt dies auf das Fehlen eines funktionell aktiven Insulinrezeptors auf der Oberfläche der Thrombozyten schließen. Wir konnten zeigen, daß eNOS in den Blutplättchen nicht vorhanden und damit seine in anderen Publikationen beschriebene Aktivierung durch Insulin in den Thrombozyten nicht gegeben ist. Der von uns und in anderen Publikationen verwendete Antikörper gegen phospho-eNOS erkennt vielmehr ein anderes Protein gleicher Größe, wie wir im Kontrollexperiment mit eNOS-/- knockout Mäusen zeigen konnten. Im Flußkammerexperiment konnte ein indirekter insulinabhängiger Effekt auf die Adhäsion der Thrombozyten an das Endothel und ihre Bildung von Aggregaten beobachtet werden. Die Gabe von pathologischen Insulinmengen führte zu einem Anstieg der NO Sekretion durch das Endothel, welches hemmend auf die Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten wirkte. N2 - Under physiologic conditions platelets play a central role in upholding the haemostasis. By recognizing lesions in the vessel walls and attachment to those areas they prevent an influx of blood into subendothelial areas. Intracellular molecules mediate the interaction of platelet agonists and their receptors and therefore control platelet activation. Several previous publications demonstrated enhancing as well as inhibiting effects by insulin on platelet activation, adhesion and aggregation. These insulin- mediated effects are reported to act via the cGMP and cAMP pathway as well as the activation of eNOS by insulin in platelets. Our findings show that there is no acute insulin dependent effect on platelet function under physiologic and pathologic glucose levels. Insulin showed no effect on the phosphorylation of intracellular markers of platelet activation like PKB, VASP, P38 und ERK. Furthermore an effect on platelet aggregation and the activation of the platelet surface receptor integrin αIIbβ3 and the expression of P-Selectin on the platelet surface after insulin stimulation was also not detectable. Expression of the IR was not detectable in platelets which agrees with our other data that insulin-stimulation did not trigger IR phosphorylation or activation of any insulin-induced downstream signalling pathways in platelets including eNOS, PKB, ERK, and p-38 MAPK. These data indicate that either there is no functionally active IR expressed in platelets or that the copy number of IR proteins is too low to activate downstream signalling systems like PKB and MAPK. We could also show that eNOS is not present in platelets and that its activation by insulin, postulated in previous publications, is therefore not given. The antibody which we employed and which was also used in other publications against phospho-eNOS recognizes another protein of the same size, which we could demonstrate in a control experiment with eNOS-/- knock out mice. However, we could detect an indirect insulin dependent effect on platelet endothel adhesion and aggregation in our flow chamber experiments. The insulin induced increase of endothelial NO caused a significant decrease of platelet adhesion to the endothelial cells. KW - Thrombozyt KW - Insulin KW - Insulinrezeptor KW - Diabetes mellitus KW - Endothel Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28432 ER - TY - THES A1 - Huang, Yi T1 - Structural and Functional Analysis of Chordin-like 2/BMP-2 Interaction N2 - We have established the novel interaction between mCHL2, Tsg and BMP-2 for the first time. Tsg binds to VWC1 and VWC3 of mCHL2 in a cooperative waz and plazs a role in strengthening the binding affinity. Furthermore, Tsg/mCHL2/BMP-2 termary complex and Tsg/mCHL2 binary complex have been isolated by gel-filtration chromatography. Therefore mCHL2 can form a ternary complex with Tsg and BMP-2 and this complex makes mCHL2 a better BMP-2 antagnonist. KW - BMP-2 Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29120 ER - TY - THES A1 - Brich, Jochen T1 - Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten T1 - Pharmacology of the ADP receptors on human platelets N2 - Die Thienopyridine Ticlopidin und Clopidogrel sind seit mehreren Jahren im klinischen Einsatz als Thrombozytenaggregationshemmer zur Sekundärprophylaxe bei arteriosklerotischen Erkrankungen der Herzgefäße, zerebralen Gefäße sowie der peripheren Arterien. Trotz ihrer nachgewiesenen klinischen Wirksamkeit war der Wirkmechanismus lange Zeit auf die Beschreibung als ADP-Rezeptorantagonist beschränkt. Im Zuge neuerer Erkenntnisse zum Mechanismus der Auslösung einer Aggregation, insbesondere der ADP-vermittelten Aggregation, sollte im Rahmen dieser Dissertation der Wirkmechanismus der Thienopyridine genauer untersucht werden sowie mögliche Auswirkungen auf intrazelluläre Kaskaden, die den aggregationshemmenden Effekt vermitteln. Zu diesem Zweck wurden die Effekte einer Thienopyridin-Einnahme auf die Thrombozytenfunktion gesunder Probanden untersucht. In unseren Versuchen bestätigte sich die gute Wirksamkeit der Substanzen hinsichtlich der deutlichen Reduktion der ADP-vermittelten Aggregation. Vor dem Hintergrund eines damals neu propagierten Drei-Rezeptoren-Modells für die ADP-vermittelte Aggregation konnten wir erstmals den Wirkmechanismus an humanen Thrombozyten auf eine Inhibierung des P2Yac-Rezeptors eingrenzen. Weiterhin konnten wir unter Thienopyridin-Einnahme eine Aufhebung der ADP-vermittelten Hemmung der PG-E1-vermittelten VASP-(VAsodilator-Stimulated Phosphoprotein) Phosphorylierung feststellen und somit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Wirkung der Substanzen beitragen. Zum besseren Verständnis der zum damaligen Zeitpunkt bereits auf molekularer Ebene bekannten humanen thrombozytären ADP-Rezeptoren P2Y1 und P2X1 wurden diese aus humanen Thrombozyten kloniert und mit verschiedenen Tags versehen in einer Astrozytoma-Zelllinine transient und stabil exprimiert. Es wurden verschiedene zellbiologische Methoden wie Immunpräzipitation, Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz etabliert, die als Grundlage für weitere Untersuchungen der intrazellulären Signalkaskaden der Rezeptoren dienen können. Die stabil exprimierenden Zelllinien dienten zur Verifizierung des pharmakologischen Profils der Rezeptoren, weiterhin konnten bereits erste Versuche zu einer möglichen Regulation der Rezeptoren durch zyklische Nukleotide durchgeführt werden. Durch die Etablierung dieser Zelllininen wurde insgesamt eine gute Grundlage für eine weitere Charakterisierung dieser ADP-Rezeptoren unter besser standardisierbaren Bedingungen geschaffen. N2 - The thienopyridines Ticlopidine and Clopidogrel are clinically well known platelet antagonists. To uncover their mechanism of action, we conducted a study with healthy human volunteers to identify the ADP receptor, which is directly affected by these drugs. We found the P2Y12 receptor to be the only ADP receptor being impaired by Ticlopidine and Clopidogrel. Moreover we found that this specific inhibion of P2Y12 is sufficient to prevent platelet aggregation. This effect could occur due to the higher state of VASP phosphorylation in these platelets. To characterize the other two known ADP receptors on human platelets, P2Y1 and P2X1, stable expressing cell lines were created and analyzed. These cell lines may be valuable tools to futher characterize the pharmacology and signal transduction properties of these receptors. KW - ADP-Rezeptoren KW - Thrombozyten KW - ADP receptors KW - platelets Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9620 ER -