TY - THES A1 - Schneider, Eberhard T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Genen für sensorineurale Hörstörungen T1 - Identification and characterization of genes responsible for sensorineural deafness N2 - Ungefähr 1 -3 Lebendgeborene von 1000 sind von einer Hörstörung betroffen, wovon etwa 60% der Fälle genetisch bedingt sind und in der Mehrzahl einem autosomal rezessiven Erbgang unterliegen. Die Ursachen dieser, zumeist das Innenohr betreffenden, Schallempfindungsstörungen sind äußerst heterogen. Rund 50 Gene konnten bisher mit angeborener, nicht-syndromaler Schallempfindungsschwerhörigkeit in kausalen Zusammenhang gebracht werden, mit GJB2 als dem bislang bedeutendsten, das für bis zu 50% aller Fälle verantwortlich ist. Die Identifizierung weiterer Hörstörungsgene und deren Charakterisierung war Gegenstand dieser Arbeit. Dafür wurden Positionsklonierungsverfahren einerseits und Patienten-screenings andererseits, angewandt. Wir fanden eine homozygote, reziproke Translokation 46,XY,t(10;11),t(10;11) bei einem Patienten mit kongenitaler Schallempfindungsschwerhörigkeit. Beide Eltern und vier weitere Geschwister waren heterozygote Träger der Translokation. Nach der Einengung der Bruchpunktregionen durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) von spezifischen BAC-Klonen, konnte der exakte Bruchpunkt mittels Vektor-Ligation der Fusionsfragmente und anschließender Sequenzierung bestimmt werden. PDZD7 ist ein PDZ-Domänen-kodierendes Gen auf Chromosom 10, das durch die Translokation beim Patienten zerrissen ist. PDZD7 ist ein Paralog zu den PDZDomänen enthaltenden Genen Harmonin und Whirlin. Mutationen in beiden Genen können kongenitale nicht-syndromale Taubheit und das Usher-Syndrom verursachen, eine Erkrankung mit Taub- und Blindheit. Funktionelle Protein-Protein Interaktionsstudien und Genexpressionsmessungen konnten zeigen, dass PDZD7 mit den beiden Usher-Proteinen interagiert und im menschlichen Innenohr exprimiert wird. Diese Daten unterstützen eine starke Evidenz für PDZD7 als syndromales und nicht-syndromales Hörstörungsgen. Weiterhin wurden durch Screenings eines Hörstörungspatientenkollektives (n=534) genetische und epigentische, möglicherweise pathogene Mechanismen charakterisiert. Diese Screenings wurden für PDZD7, CX30, CX30.3, CX43 (Exomsequenzierung); OTOF, KCNE1 (SNP-Typisierung); del(chr13:19,837,344- 19,968,698) (Deletionsscreening) und GJB2 (Promotermethylierung) durchgeführt. N2 - Congenital deafness occurs with a frequency of 1 -3 in 1000 live births. Genetic defects cause nearly 60% of all cases with 70% of them being autosomal recessive disorders. There are heterogenous reasons for genetic hearing loss which affect mostly structures of the inner ear. To date some 50 genes could have been linked to sensorineural non-syndromic deafness. Among them GJB2 is the most prominent and important gene and it accounts for up to 50% of all cases. Positional cloning and screening of patients had been applied for the identification and characterization of additional deafness genes which was an issue of this work. A homozygous reciprocal translocation 46,XY,t(10;11),t(10;11) was detected in a patient with congenital non-syndromic sensorineural deafness. Both parents and their four other children were heterozygous translocation carriers. Fluorescence in situ Hybridisation (FISH) of region-specific clones to patient chromosomes was used to narrow down the breakpoint regions. Vector ligation of junction fragments were cloned and subsequently sequenced to localize the exact breakpoint. PDZD7, a PDZ domain coding gene on chromosome 10, was disrupted by the chromosomal break. PDZD7 is a paralog of PDZ domain containing genes harmonin and whirlin. Mutations in both genes can cause congenital non-syndromic deafness and/or Usher syndrome. Functional protein-protein interaction assays and gene expression experiments revealed that PDZD7 is integrated in the Usher network and is expressed in the human inner ear, respectively. These data support strongly that PDZD7 is a further autosomal recessive deafness- and Usher syndrome-gene. Further on we screened a panel of genes in deafness patients (n=534) to characterize potentially pathogenic genetic and epigenetic mechanisms. The analysed genes had been PDZD7, CX30, CX30.3, CX43 (exome-sequencing); OTOF, KCNE1 (SNP-genotyping); del(chr13:19,837,344-19,968,698) (deletionscreening) and GJB2 (promotermethylation). KW - Hörstörung KW - Lautwahrnehmung KW - Erbkrankheit KW - congenital KW - deafness KW - sensorineural KW - genetic Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51231 ER - TY - THES A1 - Schmid, Christian T1 - Klinik und Genetik der myotonen Dystrophie Curschmann-Steinert, der facio-scapulo-humeralen Muskeldystrophie und der Gliedergürtelmuskeldystrophie T1 - clinic and genetic of myotonic dystrophie, facio-scapulo-humeral dystrophie and limb-girdle dystrophie N2 - Im ersten Teil dieser Arbeit wird überprüft, inwieweit bei einer Patientengruppe, die molekulargenetisch negativ auf fazioscapulohumerale Muskeldystrophie untersucht wurde, differentialdiagnostisch eine myotone Dystrophie in Frage kommt. Der zweite Abschnitt hat zum Ziel, zu kontrollieren, ob im Patientenkollektiv derer, die negativ auf eine häufige Mutation im -Sarkoglycangen (Adhalingen) getestet wurden, differentialdiagnostisch eine fazioscapulohumerale Muskeldystrophie in Betracht zu ziehen ist. N2 - In the first part of this work it is examined to what extent at a group of patients, which was examined molecular-genetically negatively for fazioscapulohumerale dystrophie, differential-diagnostically a myotonic dystrophie is applicable. The second section has the goal to check whether in the patient collective of those, which were tested negatively on a frequent mutation in the Sarkoglycangene (Adhalingene), differential-diagnostically a fazioscapulohumerale dystrophie to consider is. KW - Myotone Dystrophie KW - Gliedergürtelmuskeldystrophie KW - facio-scapulo-humeralen Muskeldystrophie KW - FSHD KW - myotonic dystrophie KW - facio-scapulo-humeral dystrophie KW - limb-girdle dystrophie KW - FSHD Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13329 ER - TY - THES A1 - Schleider, Elisa T1 - Angiogenese-Modellsysteme zur Funktionsanalyse des humanen CCM3 Proteins T1 - Angiogenesis in vitro modeling of human CCM3 function N2 - Zerebrovaskuläre kavernöse Malformationen (CCM) sind Blutgefäßfehlbildungen, welche hauptsächlich im Gehirn vorkommen. Sie sind gekennzeichnet durch stark dilatierte kapillarähnliche Gefäße mit niedriger Flussrate („slow-flow lesions“). Intervenierendes Gehirnparenchym fehlt ebenso wie Perizyten oder glatte Gefäßmuskelzellen. Die klinischen Symptome reichen von starken Kopfschmerzen über Epilepsie bis hin zum Schlaganfall. Dennoch bleiben viele Kavernomträger aufgrund unvollständiger Penetranz ihr Leben lang asymptomatisch. Die Prävalenz beträgt ca. 0,5% in der Gesamtbevölkerung. Es gibt sowohl sporadische als auch dominant vererbte Krankheitsformen. In den letzten Jahren konnten 3 Gene ursächlich mit der Krankheit in Verbindung gebracht werden. Mutationen in CCM1, CCM2 oder CCM3 führen zu einem nicht unterscheidbaren klinischen Phänotyp. Alle drei Proteine bilden einen ternären Komplex in vitro, was eine Beteiligung an einem gemeinsamen molekularen Signalweg bekräftigt. Während die Proteine CCM1 und CCM2 in den letzten Jahren umfangreich erforscht wurden, ist über das CCM3-Protein bis heute wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CCM3 eine wichtige Rolle in der Angiogenese spielt und diese bei Überexpression in humanen Endothelzellen stark negativ reguliert: die Migration, die Proliferation und die Fähigkeit, kapillarähnliche Strukturen in Matrix-Gelen zu bilden kommt nahezu zum Erliegen. Ein gegenläufiger Effekt nach siRNA induziertem Knock-down von CCM3 war weniger stark ausgeprägt. Einzig die Fähigkeit, gefäßähnliche Strukturen in Matrigelen zu bilden, war erhöht. Um weiterhin Klarheit über die intrazellulären, von CCM3 beeinflussten Signalwege zu schaffen, wurden Tyrosin Kinase Arrays durchgeführt, bei welchen CCM3-überexprimierende HUVEC Lysate mit Kontrolllysaten verglichen wurden. Dabei stellte sich heraus, dass 5 Substrate signifikant erhöht phosphoryliert wurden: der Discoidin Domänen Rezeptor 1 (discoidin domain receptor; DDR1), die duale spezifitätstyrosinphosphorylierungsregulierte Kinase 1A (dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A; DYR1A), die Protoonkogen Tyrosin- Protein Kinase FER (proto-oncogene tyrosine-protein kinase FER; FER), die fynbezogene Kinase (Fyn-related kinase; FRK) und die phosphoinositolabhängige Kinase 1 (Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDPK-1). Im Folgenden bestätigten Western Blot, dass die Überexpression von CCM3 in Endothelzellen die phosphoinositolabhängige Kinase 1 und die nachgeschaltete Serin-Threonin Kinase Akt/PBK aktiviert, welche ein bedeutsames Überlebenssignal der Zelle darstellt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass CCM3 nicht nur antiangiogen, sondern auch antiapoptotisch wirkt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass CCM3 für die Integrität des ruhenden, adulten Endothelbettes wichtig ist. N2 - Cerebral cavernous malformations are slow-flow vascular lesions, mainly located in the brain. They consist of blood-filled dilated capillary-like vessels without brain parenchyma or mural cells. Clinical symptoms include intense headaches, epilepsy and stroke. However, about 40% of lesion carriers live without any symptoms throughout their lives due to incomplete penetrance. The disease prevalence is 0.5% in the population. Sporadic as well as autosomal-dominantly inherited familial forms exist. In recent years, 3 disease-related genes have been identified. Mutations within CCM1, CCM2 or CCM3 lead to indistinguishable clinical phenotypes. All three proteins form a ternary complex in vitro, confirming their participation in one main signaling pathway. While CCM1 and CCM2 have been explored to a great extent over the past years, little is known about CCM3 and its function so far. In this study, we show that CCM3 plays an important role in angiogenesis. Upon overexpression it has strong negative effects in endothelial cells. The ability to migrate, proliferate and to form capillary-like structures in matrix gels is significantly impaired. Knockdown experiments with siRNA against CCM3 did not reveal such distinct effects. Only the ability to form capillary-like structures was elevated. To identify signaling pathways modulated by CCM3, tyrosine kinase arrays were conducted. Lysates from HUVECs overexpressing CCM3 were compared with control lysates. Five substrates revealed significantly increased phosphorylation: the discoidin domain receptor 1 (DDR1), the dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A (DYR1A), the proto-oncogene tyrosine-protein kinase FER (FER), the fyn-related kinase (FRK) and the Phosphoinositidedependent kinase 1 (PDPK-1). The candidate 3-Phosphoinositide-dependent protein kinase- 1 is an important upstream activator of the serine-threonine kinase Akt/PKB. Subsequent experiments confirmed and demonstrated that p-PDPK-1 and p-Akt are activated in lysates overexpressing CCM3. In agreement with the fact that Akt is important for cell survival, we could finally show that CCM3 is both antiangiogenic and antiapoptotic. Our data suggest that CCM3 plays a role in maintaining quiescence of adult vascular endothelial cells. KW - Blutgefäß KW - Missbildung KW - Gehirn KW - Genanalyse KW - Endothelzelle KW - Angiogenese KW - CCM3 KW - Endothelzellen KW - CCM3 KW - endothelial cells KW - angiogenesis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51504 N1 - Includes articles: - Stahl, S., Gaetzner, S., Voss, K., Brackertz, B., Schleider, E., Sürücü, O., Kunze, E., Netzer, C., Korenke, C., Finckh, U., Habek, M., Poljakovic, Z., Elbracht, M., Rudnik-Schöneborn, S., Bertalanffy, H., Sure, U., Felbor, U. (2007) Novel CCM1, CCM2, and CCM3 mutations in patients with cerebral cavernous malformations: in-frame deletion in CCM2 prevents formation of a CCM1/CCM2/CCM3 protein complex. Hum Mutat, 29, 709-717. - Voss, K., Stahl, S., Reinders, J., Hogan, B.M., Schleider, E., Schulte-Merker, S., Felbor, U. (2009) Functional analysis of human and zebrafish 18 amino acid in-frame deletion pave the way for domain mapping of the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Hum Mutat, 30, 1003-1011. - Schleider, E., Stahl, S., Wüstehube, J., Walter, U., Fischer, A., Felbor, U. (2010) Evidence for anti-angiogenic and pro-survival functions of the cerebral cavernous malformation protein 3. Neurogenetics, submitted ER - TY - THES A1 - Schaafhausen, Anne T1 - Proteininteraktionen der Vitamin K Epoxid Reduktase Proteine VKORC1 und VKORC1L1 T1 - Protein interactions of the vitamin K epoxide reductase proteins VKORC1 and VKORC1L1 N2 - Seit der Entdeckung des ersten Gens für den Vitamin K Epoxid-Reduktase-Komplex (VKORC1), dem Schlüssel-Enzym für die Regenerierung von Vitamin K, sind keine zusätzlichen Komponenten des Komplexes beschrieben worden. Die einzige bekannte Funktion von VKORC1 ist bislang die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid, welches bei der post-translationalen Carboxylierung von Proteinen als oxidierter Kofaktor anfällt, und im sogenannten Vitamin K-Zyklus regeneriert wird. VKORC1 ist zugleich das Zielprotein antikoagulativer Medikamente der Coumarin-Gruppe, wie Warfarin oder Marcumar. Mutationen im VKORC1-Gen führen zu einem signifikanten Effekt auf die benötigte Coumarin-Dosis und die Stabilität der Hämostase in der Thrombosebehandlung mit Antikoagulanzien. Gleichzeitig mit VKORC1 wurde ein stark sequenz-homologes Protein identifiziert, das „VKORC1-like1“ (VKORC1L1) genannt wurde und dessen physiologische Funktion zu Beginn dieser Arbeit völlig unbekannt war. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit zwei Aspekten des Vitamin K-Stoffwechsels: A. Den enzym-kinetischen Eigenschaften und der subzellulären Lokalisation des VKORC1L1-Proteins sowie B. der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die Interaktionspartner der beiden VKOR-Proteine sein können. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: A.1. Die enzym-kinetischen Untersuchungen zeigen starke Ähnlichkeiten zwischen VKORC1 und VKORC1L1: Beide Enzyme haben eine Vitamin K-Epoxidase- und -Reduktase-Aktivität, wobei die Affinitäten zu Vitamin K2-Epoxid deutlich höher sind als die zu Vitamin K1-Epoxid. Beide Enzyme sind durch Warfarin hemmbar und der Austausch der vermutlich am Elektronentransfer beteiligten Cysteine an homologen Positionen führt in beiden Proteinen zu einem fast vollständigen Verlust der Aktivität. A.2. Mittels Ko-Lokalisation konnte VKORC1L1 – wie VKORC1 – in der ER-Membran lokalisiert werden. Folglich schließen wir, dass VKORC1L1 eine ähnliche Struktur, die gleiche zelluläre Lokalisation und zumindest in vitro auch eine VKOR-Aktivität hat und daher eventuell eine weitere Komponente des VKOR-Komplexes darstellen könnte. Allerdings sprechen gewichtige Argumente dagegen, dass beide Proteine funktionell austauschbar sind: Sowohl bei Patienten mit Mutationen in VKORC1 (VKCDF2-Erkrankung), als auch bei VKORC1-Knock-out Mäusen kann das intaktes VKORC1L1-Protein die inaktivierende Mutation im C1-Gen nicht kompensieren. B.1. Mit einem für Membranproteine adaptierten, modifizierten Yeast-Two-Hybrid Screen (Split-Ubiquitin-System) konnten mit VKORC1 und VKORC1L1 als Köder 114 Proteine aus einer Leber-cDNA-Bank als potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Davon wurden 6 Proteine aufgrund ihrer Trefferhäufigkeit und funktioneller Überlegungen mit Hilfe von Ko-Immunpräzipitationsexperimenten und Ko-Immunlokalisation näher untersucht. Interessanterweise zeigen die beiden Trefferlisten starke Überschneidungen. B.2. Es konnte eine in vitro- Interaktion von VKORC1 mit sich selbst und mit VKORC1L1 nachgewiesen werden, die bisher nicht bekannt war. Dies könnte auf der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie der beiden Proteine beruhen, führt aber auch zu neuen Hypothesen bezüglich des Vitamin K-Stoffwechsels. B.3. Die Interaktion von VKORC1 und dem „stress-associated endoplasmic reticulum protein 1“ (SERP1) bringt Vitamin K in Zusammenhang mit oxidativem Stress. Dazu passen auch die neuesten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Johannes Oldenburg (vormals Würzburg, jetzt Bonn) zur Funktion von VKORC1L1, die eine protektive Rolle von Vitamin K beim Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffverbindungen nahe legen. Ob und wie Vitamin K und VKORC1L1 einen neuen Schutzmechanismus gegen Sauerstoffradikale bilden bedarf weiterer Untersuchungen. B.4. Ferner wurde eine Interaktion zwischen VKORC1 und dem „Emopamil-binding-protein“ (EBP) nachgewiesen. Mutationen in EBP führen zu der seltenen genetischen Krankheit Chondrodysplasia punctata. Die Ähnlichkeit der Symptomatik zwischen Chondrodysplasia punctata und der sogenannten Warfarin-Embryopathie, die durch überhöhte Dosierung von Coumarinen während der Schwangerschaft verursacht wird, legt einen Zusammenhang zwischen Vitamin K- und dem Kalziumstoffwechsel nahe. B5. In den Ko-Immunpräzipitationsexperimenten nicht bestätigt haben sich die initial positiven Proteine Protein-Disulfid-Isomerase (PDIA6), CD63, und Fibrinogen-Gamma (FGG). Die Ergebnisse geben Hinweise auf neue Funktionen der VKOR-Proteine beim Schutz vor oxidativem Stress und in der Verbindung zum Kalzium-Stoffwechsel. Beide Aspekte bedürfen weiterführender Untersuchungen. Im Hinblick auf diese neuen Funktionen wäre auch eine kritische Betrachtung der übrigen 85 primären Treffer des Split-Ubiquitin-Screens sinnvoll. N2 - Since the first gene of the vitamin K epoxide reductase complex (VKORC1) - the key enzyme for the regeneration of vitamin KH2 - has been discovered, no more components of the complex have been described. To date, the only known function of VKORC1 is the reduction of vitamin K-2,3-epoxide (VKO) in the vitamin K cycle. VKO plays a role as an oxidative cofactor during post-translation carboxylation. VKORC1 is also the target protein of anticoagulant drugs of the coumarin type (e.g. warfarin or marcumar). Genetic variants in VKORC1 have recently been shown to significantly affect the coumarin dose and the stability of hamostasis (measured as INR level) during thrombosis treatment. Simultaneously with VKORC1, a homologues protein called VKORC1-like1 (VKORC1L1) was identified. The physiological function of VKORC1L1 was unknown at the beginning of this thesis. The present thesis focuses on two aspects: A. Kinetic properties and subcellular localization of VKORC1L1-protein as well as B. identification and characterization of potential interaction partners of VKORC1 and VKORC1L1, respectively. The results could be summarised as follows: A.1. Kinetic studies revealed a high similarity of VKORC1 and VKORC1L1: Both VKOR-proteins have shown a VKR-activity in our assay and a higher affinity for Vitamin K2-epoxid than for Vitamin K1-epoxid. Both enzymes could be inhibited by warfarin and the exchange of homologous Cysteins leads to an almost complete loss of function for both proteins. A.2. Localisation studies identified VKORC1L1 in the ER when co-expressed in HeLa cells with VKORC1. Accordingly, we suggest that VKORC1L1 has a similar function, localisation and structure as VKORC1 and therefore becomes a potential component of the VKOR-complex. Nevertheless, important arguments lead to the fact that both proteins are not interchangeable as neither patients with VKCDF2 nor VKORC1-knock out mice could be counterbalanced by VKORC1L1. B. Using the split-ubiquitin-system, a method based on yeast two-hybrid system which is capable to investigate membrane-proteins, 114 potential interactions candidates for VKORC1 and VKORC1L1 were found in a human adult liver cDNA library screen. 5 of them were further investigated using co-immunprecipitation and co-localisation studies. Interestingly, various similar hits could be detected for both proteins. B.1. For the first time we were able to show an in vitro-interaction of VKORC1 with itself and the homologues protein VKORC1L1. This might be due to the high level of homology between the two proteins but also leads to a new hypothesis in respect to the vitamin K metabolism. B.2. The interaction of VKORC1 and “stress-associated endoplasmatic reticulum protein 1” (SERP1) connects vitamin K with oxidative stress. This is in accordance with new results from the group of J. Oldenburg (formerly Würzburg, now Bonn). They postulate an antioxidant role of VKORC1L1. Whether VKORC1L1 and vitamin K have an antioxidative effect needs to be solved in further studies. B.2. Furthermore, we showed an interaction between VKORC1 and the “emopamil binding protein” (EBP). Genetic variants in EBP lead to a rare genetic disease chondrodysplasia punctata which can be considered a phenocopy of warfarin embryopathy, which is caused by medication of woman with coumarin derivatives during the first trimester of pregnancy. This interaction and the similar phenotypes suggest a connection between the vitamin K- and calcium metabolism. B.3. The following proteins, which were found using split-ubiquitin-system, could not be confirmed via co-immunoprecipitaion: protein-disulfide-isomerase A6 (PDIA6), CD63, a member of the tetraspanin-family, and fibrinogen-gamma-chain (FGG). A PDI-form was proposed to provide electrons for reduction of the thioredoxin-like CXXC center in VKORC1. Tetraspanins are a large family of cell-surface proteins, which interact with proteins in a molecular network that is known as the tetraspanin web. FGG is the gamma component of fibrinogen, the only identified protein which is known to play a role in blood coagulation. These results suggest new functions of VKOR-proteins related to protection against oxidative stress and a connection to the calcium-metabolism. Both aspects need to be analysed further. Therefore, it would make sense to analyse the remaining candidates found via split-ubiquitin-system with regard to these new functions. KW - Vitamin-K-Gruppe KW - Regeneration KW - Proteine KW - Molekulargenetik KW - Vitamin K KW - VKORC1 KW - VKORC1L1 KW - Proteininteraktion KW - vitamin K KW - VKORC1 KW - VKORC1L1 KW - protein interaction Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55442 ER - TY - THES A1 - Sauer, Christian T1 - Untersuchungen zu den genetischen Ursachen hereditärer Netzhautdegenerationen des Menschen T1 - Analyses of the genetic causes of hereditary retinal degenerations in human N2 - Die Positionsklonierung hat sich als erfolgreiche Strategie zur Identifizierung und Isolierung von Genen erwiesen. Da ihre Anwendung im Allgemeinen keine Informationen über den zugrundeliegenden Pathomechanismus einer Erkrankung voraussetzt, eignen sich die Methoden der Positionsklonierung in besonderem Maße für die Erforschung hereditärer Netzhauterkrankungen. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden sie zur Untersuchung ausgewählter retinaler Degenerationen eingesetzt. Dabei konnten wichtige Beiträge für die Aufklärung der genetische Ursachen dieser Erkrankungen geleistet werden. Die autosomal dominante North Carolina Makuladystrophie (NCMD) oder die zentral areoläre Pigmentepitheldystrophie (CAPED) sind allelische Erkrankungen mit allenfalls gering progredientem Verlauf. Ihr Genlokus liegt in einem etwa 7,2 cM großen Bereich auf 6q14-q16.2 zwischen den DNA-Markern D6S424 und D6S1671. Mit Hilfe von 21 polymorphen DNA-Markern welche den NCMD-Lokus (MCDR1) flankieren, wurden Kopplungsanalysen in drei deutschen NCMD-Familien durchgeführt. Die Analyse der krankheitsassoziierten Haplotypen erbrachte Hinweise auf einen gemeinsamen Vorfahren aller drei Familien. Darüber hinaus konnte der MCDR1-Lokus auf 3,2 cM eingeengt werden und wird von den Markern D6S249 und D6S475 flankiert. Dies bedeutet einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Klonierung des zugrundeliegenden Krankheitsgens. Eine häufige Ursache für den frühzeitigen Verlust der zentralen Sehschärfe bei Jungen ist die X-gebundene juvenile Retinoschisis (RS). Ihr Genlokus wurde in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert, wo er von den DNA-Markern DXS418 und DXS999/DXS7161 flankiert wird. Die Analyse von EST-Sequenzen aus dieser Region ermöglichte die Isolierung eines neuen retinaspezifischen Transkriptes, welches als RS1 bezeichnet wurde. Das RS1-Gen besteht aus sechs Exonen und codiert ein Protein, welches eine in der Evolution hoch konservierte Discoidin-Domäne enthält. Diese Domäne ist in anderen Proteinen u.a. an der Ausbildung von Zell-Zell-Interaktionen beteiligt. Mutationsanalysen in betroffenen Personen aus neun nicht-verwandten RS-Familien ergaben neun verschiedene Sequenzveränderungen die mit dem Krankheitsbild der jeweiligen Familie segregierten. Einen ersten Einblick in die zeitliche und räumliche Expression ergab die Untersuchung des murinen Orthologs Rs1h mit Hilfe von Northern Blot, RT-PCR und RNA in situ-Hybridisierungen. Rs1h wird in der Maus hauptsächlich in den Photorezeptoren exprimiert. Die Expression beginnt erst postnatal und ist mit der Entwicklung der Photorezeptoren korreliert. Das Auftreten zahlreicher weißlich-gelber Flecken, sogenannter Drusen, in radiärer Anordung am hinteren Augenpol ist das charakteristische Merkmal einer Gruppe von Netzhauterkrankungen mit gemeinsamer Ätiologie, die unter dem Begriffen Doynsche Honigwaben Dystrophie (DHRD), Malattia Leventinese (MLVT) oder radiäre Drusen zusammengefasst werden. Der Genlokus dieser Erkrankung wurde auf den kurzen Arm von Chromosom 2 in den Bereich 2p16 kartiert. Die Durchsuchung von EST-Datenbanken führte zur Identifizierung des neuronal exprimerten Gens pNEU60. Dieses besteht aus zwei Exonen, wobei der vollständige codierende Bereich im zweiten Exon liegt. Die Analyse des pNEU60-Proteins ergab eine Struktur aus sieben Transmembrandomänen, dem gemeinsamen Merkmal G-Protein gekoppelter Rezeptoren, wie z.B. Rhodopsin. Patienten mit radiären Drusen zeigten keinerlei Sequenzveränderungen in pNEU60. Die Untersuchung von fast 200 Patienten mit der phänotypisch sehr ähnlichen altersbedingten Makuladegeneration (AMD), führte zur Identifizierung von drei potentiellen Mutationen, darunter eine nonsense-Mutation, sowie zwei polymorphen Veränderungen. Die Assoziation einer einzigen missense-Mutation (R345W) im ubiquitär exprimierten Gen EFEMP1 (EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1) mit der DHRD und MLVT wurde von einer amerikanischen Arbeitsgruppe nachgewiesen. Die R345W Mutation in diesem proximal zu pNEU60 liegenden Gen wurde in den zur Verfügung stehenden zwei MLVT-Familien sowie einer DHRD-Familie nachgewiesen. Bei der Analyse von 14 Patienten mit sporadischen radiären Drusen konnte weder die R345W Mutation, noch irgendeine andere krankheitsassoziierte Mutation nachgewiesen werden. Es wurden jedoch drei polymorphe Sequenzvarianten, sowie zwei polymorphe Di- bzw. Trinukleotidsequenzen identifiziert. Die Klonierung des orthologen EFEMP1-Gens des Rinds diente als Voraussetzung zur Untersuchung der Interaktionsfähigkeit von EFEMP1 mit anderen Proteinen. Mit der Anwendung des Hefe Zwei-Hybrid Systems konnte gezeigt werden, dass die EGF-Domänen von EFEMP1 eine Interaktion mit sich selbst ermöglichen. Die Einführung der R345W Mutation hatte dabei keinen Einfluss auf diese Wechselwirkungen. Die beschriebene Interaktion mit dem zur Familie der Ubiquiline gehörenden Protein DA41 konnte nicht reproduziert werden. Das Gen welches mit der inkompletten Form der X-gebundenen kongenitalen stationären Nachtblindheit (CSNB2) assoziiert ist, codiert die a1-Untereinheit des retinaspezifischen spannungsabhängigen L-Typ Kalziumkanals (CACNA1F). Mit Hilfe von RT-PCR Analysen und RNA in situ-Hybridisierungen wurde die räumliche Expression dieses Gens in der Netzhaut untersucht. Dabei wurde das CACNA1F-Transkript in der äußeren und inneren Körnerschicht, sowie in der Ganglienzellschicht nachgewiesen. N2 - The positional cloning strategy is a powerful tool for the identification and isolation of genes. The application of positional cloning methods to the investigation of hereditary retinal disorders proved to be suitable as they require no informations about the pathology underlying the disease. For the investigations described in this thesis several retinal degenerations were selected for the examination with the positional cloning strategy. The findings of those researches contribute to the further enlightenment of the genetic causes of those disorders. Autosomal dominant North Carolina macular dystrophy (NCMD) or central areolar pigment epithelial dystrophy (CAPED) is an allelic disorder with slow progression. It maps to an approximately 7.2 cM interval between DNA markers at D6S424 and D6S1671 on 6q14-q16.2. A total of 21 polymorphic DNA markers flanking the NCMD locus (MCDR1) were used for genetic linkage analysis in three multigeneration families of German descent expressing the NCMD phenotype. The analysis of the disease associated haplotypes provide evidence for an ancestral founder for all three families. In addition the haplotype analysis refined the MCDR1 locus to a 3.2 cM interval flanked by markers D6S249 and D6S475. This facilitates further approaches in cloning the gene underlying NCMD. X-linked juvenile retinoschisis (RS) is an important cause of early vision lost in males. The RS gene has been localized to Xp22.2 to an approximately 900 kb interval between DXS418 and DXS999/DXS7161. The analysis of expressed sequence tags (ESTs) have identified a novel transcript, designated RS1, within the RS locus that is exclusively expressed in retina. RS1 consists of six exons and encodes for a protein containing the highly conserved discoidin-domain which is implicated in cell-cell interaction. Mutational analyses of RS1 in affected individuals from nine unrelated RS families revealed nine different sequence variations segregating with the disease phenotype in the respective families. The temporal and spatial expression of the murine ortholog Rs1h was studied by northern blot and RT-PCR analyses as well as RNA in situ hybridizations. Predominant expression of Rs1h was found in photoreceptor cells starting postnatal with correlation to photoreceptor development. The appearance of multiple yellowish-white drusen in the posterior pole of the retina is characteristic of a group of retinal disorders with a common etiology, often referred to a Doyne honeycomb retinal dystrophy (DHRD), Malattia Leventinese (MLVT) or radial drusen. The gene underlying this disorder has been mapped to the short arm of chromosome 2 at 2p16. EST database searches led to the identification of the neuronal tissue specific gene pNEU60. The complete coding sequence of this gene is located in the second of two exons. Motif searches in protein databases revealed homology to a seven transmembrane domain which is a hallmark for G-protein coupled receptors like rhodopsin. While mutational analyses in patients with radial drusen identified no sequence variation in pNEU60, three potential pathogenic variants and two frequent polymorphic changes were found in a cohort of almost 200 patients with phenotypically similar age-related macular degeneration (AMD). The association of DHRD and MLVT with a single missense mutation (R345W) in the ubiquitously expressed gene encoding the EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 (EFEMP1) has been recently demonstrated by a research group from the United States. The presence of the R345W mutation has been demonstrated for our two MLVT-families and the one DRHD-family. The mutational analyses in 14 unrelated individuals with sporadic early onset drusen did not detect the R345W mutation or any other disease-associated mutation. Three different polymorphic sequence variations and two intragenic polymorphic repeats were present in similar frequencies in the patients and control individuals. As a prerequisite to the analysis of the interaction capability of EFEMP1, he bovine ortholog of this gene has been cloned. The use of a yeast two hybrid system demonstrated that the EGF-motifs of EFEMP1 could interact with each other. The introduction of the R345W mutation had no effect on that interaction. The described interaction of EFEMP1 with DA41, a family member of the ubiquilin protein family could not be reproduced. The gene associated with the incomplete form of the X-linked congenital stationary nightblindness encodes the a1-subunit of a retina specific L-type calcium-channel (CACNA1F). The spatial expression of this gene within the retina has been investigated by RT-PCR analyses and RNA in situ hybridizations. Transcriptional activity could be detected in the outer an inner nuclear layer as well as in the ganglion cell layer. KW - Netzhautdegeneration KW - Erbkrankheit KW - Molekulargenetik KW - Netzhaut KW - Degeneration KW - Makula KW - Positionsklonierung KW - North Carolina Makuladystrophie KW - Retinoschisis KW - Radiäre Drusen KW - Nachtblindheit KW - retina KW - degeneration KW - makula KW - positional cloning KW - North Carolina Makuladystrophy KW - Retinoschisis KW - radial drusen KW - night blindness Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1936 ER - TY - THES A1 - Sanftl, Petra T1 - Erklärungsversuche der Ursachen des Down-Syndroms nach der Erstbeschreibung im Jahre 1866 bis zur Entdeckung der Trisomie 21 im Jahre 1959 T1 - Efforts to explain Down´s Syndrome´s cause from the initial description in 1866 to the discovery of Trisomy 21 in 1959 N2 - Die vorliegende Arbeit liefert einen historischen Abriss über Erklärungsmodelle des Down- Syndroms im Zeitraum von 1866 bis 1959. Es wird dargestellt, wie ausgehend von Einzelsymptomen das Syndrom Down definiert wurde und welche Thesen in Bezug auf Ätiologie und Pathogenese aufgestellt werden. Dem Down-Syndrom liegt nach heutigem Wissen eine autosomale Chromosomenaberration zugrunde. Statt einer zweifachen Ausführung des Autosoms 21 liegt ein weiteres Chromosom 21 vor, man spricht von einer Trisomie 21. Der Phänotyp des Down-Syndroms ist schon seit mindestens 150 Jahren bekannt, möglicherweise existierten sogar bereits im Zeitalter der Jungsteinzeit die ersten Krankheitsfälle. Der Erstbeschreiber J. L. H. Down war medizinischer Leiter eines Heimes für geistig Behinderte und stellte eine scheinbare Ähnlichkeit zwischen seinen Patienten und bestimmten Menschenrassen fest. In den folgenden Jahrzehnten wurden verschiedenste Theorien zur Ätiopathogenese der Trisomie 21 aufgestellt. 1959, mehr als 20 Jahren nachdem Waardenburg (1932) auf die Möglichkeit einer Chromosomenaberration hinwies, entdecken Lejeune und seine Mitarbeiter ein zusätzliches Chromosom im Karyogramm von Down-Patienten: 47 Chromosomen anstelle von 46 Chromosomen, Trisomie. N2 - This paper gives an historical synopsis of theories about Down´s Syndrome in the period from 1866 to 1959. Starting from singular symptoms the clinical picture of Down´s Syndrome was defined. Various theories concerning etiology and pathogenesis of Trisomy 21 are illustrated. As we know today, Down´s Syndrome bases on an autosomal chromosome aberration. In stead of two autosomes 21 there´s a third autosome 21, the so-called “trisomy 21”. The phenotypical Down´s Syndrome is known for at least more than 150 years, the first cases may have even existed in the Neolithic period. J. L. Down, who was the first to describe the disease pattern, was the medical director of a asylum for mentally retarded people. He discovered an apparent resemblance between his patients and certain human races. In the following decades various theories on the etiology of Trisomy 21 were proposed. In 1959, more than 20 years after Waardenburg suggested the idea of a chromosome aberration, Lejeune and his assistants discovered an additional chromosome in the karyogram of patients with Down´s Syndrome: 47 chromosomes instead of 46 chromosomes, trisomy. KW - Down Syndrom KW - Trisomie 21 KW - Chromosomenaberration KW - Langdon Down KW - Ätiologie KW - Down´s Syndrome KW - Trisomy 21 KW - chromosome aberration KW - Langdon Down KW - etiology Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22470 ER - TY - THES A1 - Rudorf, Antje T1 - Rekombinationshäufigkeit in Abhängigkeit vom Entbindungsalter der Mütter für das DMD-Gen (Xp 21.2) T1 - Frequency of recombination for DMD-Gene (Xp 21.2) in dependence on maternal age while childbirth N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Zusammenhang zwischen Alter und Rekombi-nationsrate für den Duchenne-Muskeldystrophie-Genabschnitt auf dem X-Chromosom (Xp21.2) zu ermitteln. In der vorliegenden Arbeit wurden von über 200 am Humangenetischen Institut der Universität Würzburg untersuchten Familien 110 informative Stammbäume ausgewertet. Bei diesen Familien waren bereits im Rahmen der genetischen Beratung mehrere flankierende und intragene Marker des DMD-Genes bekannt. Um eine Vergleichbarkeit der einzelnen Personen zu erreichen, wurden die Grenzen des zu untersuchenden DNA-Bereiches bei den Markern DYS I,II,III sowie STR 56 gesetzt. Die Frauen wurden anschließend nach dem Entbindungsalter in drei Gruppen eingeteilt. Gruppe 1 beinhaltet die unter 30-jährigen, Gruppe 2 die 30- bis 35-jährigen und Gruppe 3 die über 35-jährigen Frauen. Rekombinationen fanden sich in Gruppe 1 bei 17 von 129, in Gruppe 2 bei 9 von 40 und in Gruppe 3 bei 2 von 20 Frauen. Aus diesen Ergebnissen läßt sich χ² mit 2,513 bestimmen. Erst ab einem Wert von 5,99 kann man jedoch von einer Signifikanz sprechen. Somit gibt es keinen Zusammenhang zwischen dem Alter der Frauen bei der Entbindung und der Rekombinationsrate. Aufgrund anderer Arbeiten zum Thema Rekombinationsrate bei Autosomen in Abhängigkeit vom Alter wurde eine Abnahme der Rate im höheren Alter erwartet. Dies konnte jedoch bei der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Mögliche Fehlerquellen liegen hierbei in der stark variierenden Gruppengröße, dem Stichprobenumfang und falsch positiver Zuordnung bei der Phasenfestlegung. Außerdem besteht die Möglichkeit eines unterschiedlichen Rekombinatinsverhaltens bei Gonosomen im Vergleich zu Autosomen. Das Ergebnis dieser Arbeit ist trotz fehlender Signifikanz im Hinblick auf die genetische Beratung so zu beurteilen, daß jüngere Frauen (< 30 Jahre) kein erhöhtes Risiko für eine Rekombination tragen als Ältere (> 35 Jahre) und es damit in der Risikoberechnung bezüglich des Alters keine Unterschiede gibt. N2 - The aim of the work at hand is to determine the connection between age and recombination rate for the Duchenne muscle dystrophy-genetic segment on the X-chromosome (Xp21.2). In this clinical trial 110 informative family trees were evaluated out of over 200 families, who were examined at the human-genetic institute of the university of Wuerzburg. In these families several flanking and intragene markers of the DMD gene were already well-known in the context of the genetic consultation. In order to reach a comparability of the individual persons, the limits of the DNA range were placed with the markers DYS I, II, III as well as STR 56. Afterwards the participating women were divided into three groups to the maternal age at delivery. In Group 1 all women under 30 years of age are included, group 2 includes all 30- to 35-year-olds and the third group all women older than 35 years of age. Recombination were found in group 1 within 17 of 129, in group 2 in 9 of 40 and in group 3 in 2 of 20 women. From these results lets itself χ² with 2.513 determine. Nevertheless, only from a value of 5.99 one can speak of a significance. Thus there is no connection between the age of the women and the recombination rate. Due to other works to the subject recombination rate with autosome as a function of age a decrease of the rate was expected at the higher age. Nevertheless, this could not be proved at the present work. Possible sources of error lie, on this occasion, in the very varying group size, the random check circumference and wrongly positive allocation with the phase definition. In addition, the possibility of a different manner of recombination exists with gonosome in comparison to autosome. The result of this work is to be judged in spite of missing significance in view of the genetic consultation so that younger women (<30 years) no raised risk for a Recombination carry as old people (> 35 years) and there are no differences with it in the risk calculation with regard to the age. KW - DMD KW - BMD KW - Rekombination KW - Alter KW - DMD KW - BMD KW - recombination KW - age Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17452 ER - TY - THES A1 - Rost, Simone Esther T1 - Molekulare Ursachen Vitamin K-abhängiger Gerinnungsstörungen T1 - Molecular Causes of Vitamin K-dependent Coagulation Disorders N2 - Vitamin K ist ein essentieller Cofaktor für die posttranslationale Gamma-Carboxylierung von sog. Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren, Knochenproteinen, Zellwachstum-regulierenden und weiteren Proteinen mit noch unbekannter Funktion. Defekte im Vitamin K-Stoffwechsel führen einerseits zu zwei verschiedenen Formen des familiären Mangels aller Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren (VKCFD1 und 2) und andererseits zur Resistenz oder Hypersensitivität gegenüber Cumarinderivaten, wie Warfarin, die als Vitamin K-Antagonisten zur Antikoagulationstherapie bei thromboembolischen Erkrankungen, aber auch zur Bekämpfung von Ratten und Mäusen eingesetzt werden. Die Aufklärung und Charakterisierung der molekularen Ursachen dieser Erkrankungen wird in dieser Doktorarbeit anhand von Veröffentlichungen dokumentiert. Ausgehend von der Charakterisierung zweier Familien mit dem VKCFD2-Phänotyp, wird die Kartierung des VKCFD2-Locus auf dem kurzen Arm von Chromosom 16 beschrieben. Durch eine systematische Mutationssuche in der ca. 130 Gene umfassenden Kandidatenregion von Chromosom 16 konnte das für diese Erkrankung und die Warfarinresistenz ursächliche Gen ausfindig gemacht werden. Dabei handelt es sich um das Gen für die entscheidende Komponente der Vitamin K-Epoxid-Reduktase (VKORC1), die den Recycling-Prozess von Vitamin K im sog. Vitamin K-Zyklus katalysiert. Die Charakterisierung des VKORC1-Proteins umfasst dessen subzelluläre Lokalisation, den Vergleich orthologer Proteine in verschiedenen Species und die funktionelle Charakterisierung von rekombinant exprimiertem VKORC1. Durch positionsspezifische Mutagenesen und anschließende Expression in humanen Nierenzellen konnten mehrere für die Funktion der VKORC1 relevante Aminosäuren identifiziert werden. Die posttranslationale Modifikation der Vitamin K-abhängigen Proteine wird von der Gamma-Glutamyl-Carboxylase (GGCX) katalysiert. Defekte in diesem Enzym wurden von zwei verschiedenen Arbeitsgruppen als Ursache für die erste Form der VKCFD-Erkrankung nachgewiesen. In dieser Doktorarbeit werden drei weitere, von unserer Arbeitsgruppe identifizierte Mutationen im GGCX-Gen beschrieben, unter denen sich ein nachgewiesener Founder-Effekt an Position 485 des Proteins befindet. Die Arg485Pro-Variante wurde rekombinant in Insektenzellen exprimiert und konnte mittels kinetischer Studien als VKCFD1-verursachende Mutation verifiziert werden. N2 - Vitamin K is an essential cofactor for the posttranslational gamma-carboxylation of the so-called vitamin K-dependent coagulation factors, bone proteins, cell growth regulating proteins and others of unknown function. Defects in vitamin K metabolism cause two different forms of combined deficiency of vitamin K-dependent coagulation factors (VKCFD type 1 and type 2) as well as resistance or hypersensitivity to coumarin derivates, such as warfarin, which act as vitamin K antagonists. Coumarins are used for anticoagulation therapy of thromboembolic diseases and in higher dosis also for rodent pest control. The aim of this thesis is to characterize the molecular basis of these diseases. This work has led to six publications. The VKCFD type 2 phenotype as described in two unrelated families was used to perform a homozygosity mapping of the VKCFD2 locus on the short arm of chromosome 16. A systematic mutation screening in the candidate region on chromosome 16 comprising approximately 130 putative genes resulted in the identification of the gene causative for VKCFD2 and the allelic phenotype warfarin resistance. This gene encodes the first identified component of the vitamin K epoxide reductase (VKORC1) which catalyzes the reduction of vitamin K epoxide as an important part of the so-called vitamin K cycle. Characterization of the VKORC1 protein includes its subcellular localization, comparison of orthologous proteins in different species and functional studies of the recombinant VKORC1. Amino acids which are relevant for protein structure or function were identified by site-directed mutagenesis experiments and subsequent expression in human embryonic kidney cells (HEK293). Posttranslational modification of the vitamin K-dependent proteins is catalysed by the gamma-glutamyl carboxylase (GGCX), an enzyme of the endoplasmic reticulum. Mutations in the gene encoding this enzyme were demonstrated to be causative for VKCFD type 1 by two different working groups. Our working group identified three additional mutations in the GGCX gene. Recurrent mutations at position 485 of the protein were shown to result from a founder effect. The Arg485Pro variant was recombinantly expressed in insect cells using the baculovirus system and could be verified as a causative mutation for the VKCFD1 phenotype by kinetic studies. KW - Koagulopathie KW - Vitamin-K-Gruppe KW - Genanalyse KW - Vitamin K KW - Blutgerinnung KW - VKORC1 KW - Warfarin KW - Gamma-Carboxylase KW - phylloquinone KW - blood coagulation KW - VKCFD KW - coumarin KW - gamma-carboxylation Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17589 ER - TY - THES A1 - Rost, Michael T1 - Genetisch bedingte und genetisch mitbedingte Erkrankungen im Krankengut einer Allgemeinarztpraxis T1 - Genetic diseases in the clinic of a general practitioner N2 - Statistische Erfassung von genetisch bedingten und genetisch mitbedingten Erkrankungen einer Allgemeinarztpraxis. Es soll verdeutlicht werden, dass die Allgemeinmedizin und die Humangenetik im Rahmen der drastischen genetischen Entwicklung der Forschung enger zusammenarbeiten und die Lehre in der Ausbildung der Allgemeinmediziner intensivierte werden sollte. N2 - A statistic of genetic diseases in the clinic of a general practitioner. General medicine and human genetic should strengthen their cooperation and the teaching of the general practitioners should be intensified in genetic things. KW - Allgemeinmedizin KW - Genetik KW - Primary care KW - genetics Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8906 ER - TY - THES A1 - Rost, Isabell T1 - Gezielte Anreicherungs- und neue DNA-Sequenzierungsstrategien für die molekulare Analyse von Fanconi-Anämie-Genen T1 - Targeted enrichment and novel DNA sequencing strategies for the molecular analysis of fanconi anemia genes N2 - Fanconi-Anämie (FA) ist, mit Ausnahme von Mutationen in FANCR/RAD51, eine autosomal-rezessive oder X-chromosomal vererbte Krankheit, die sich durch eine ausgesprochene klinische als auch genetische Heterogenität auszeichnet. Neben einem fortschreitenden Knochenmarksversagen zählen zu den typischen Merkmalen eine Vielzahl an angeborenen Fehlbildungen, wie beispielsweise Radialstrahlanomalien, Minderwuchs oder Pigmentierungsstörungen. Zudem besteht für FA-Patienten ein überdurchschnittlich hohes Risiko bereits in jungen Jahren an akuter myeloischer Leukämie oder soliden Tumoren zu erkranken. Bislang konnten in 21 FA-Genen (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U oder -V) krankheitsverursachende Mutationen identifiziert werden, deren Proteinprodukte maßgeblich an der Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt sind und Komponenten des FA/BRCA-DNA-Reparaturweges darstellen. In der klassischen FA-Mutationsanalyse kommen meist Sanger-Sequenzierungen sowie MLPA- und Immunblot-Analysen zum Einsatz. Da im Wesentlichen keine Genotyp-Phänotyp-Korrelation besteht, gestaltet sich, gerade bei seltenen FA-Komplementationsgruppen, der Nachweis von krankheitsverursachenden Mutationen oftmals sehr zeit- und kostenintensiv. Während der letzten Jahre wurden verschiedene Strategien zur Anreicherung und Sequenzierung entwickelt, welche die parallele Sequenzanalyse einzelner ausgewählter Gene, ganzer Exome oder sogar des gesamten Genoms und somit eine kosten- und zeiteffiziente Mutationsanalyse ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Anreicherungsmethoden mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung auf ihre Anwendbarkeit in der molekulargenetischen FA-Diagnostik getestet, um klassische Mutationsanalyse-Methoden zu ergänzen oder möglicherweise sogar ganz ersetzen zu können. Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der Etablierung eines FA-spezifischen Genpanels zur Genotypisierung von FA-Patienten. Nachdem die Methode zunächst anhand von FA-Patienten mit bekannten Mutationen optimiert werden musste, erwies sie sich als effizienter Ansatz zum Nachweis krankheitsverursachender Mutationen bei FA-Patienten unbekannter Komplementationsgruppe. Durch die FA-Panelanalyse konnten 37 von 47 unklassifizierten Patienten einer FA-Komplementationsgruppe zugeordnet werden, indem deren kausalen Mutationen bestimmt wurden. In einem weiteren Ansatz sollte die Anwendbarkeit eines kommerziellen Anreicherungspanels zur FA-Diagnostik untersucht werden. Auch hier konnte ein Großteil der krankheitsverursachenden Mutationen von fünf bekannten wie auch 13 nicht zugeordneten FA-Patienten detektiert und somit eine molekulargenetische Diagnose bei neun weiteren, zuvor unklassifizierten FA-Patienten, gestellt werden. Ferner wurden sechs ausgewählte Patienten, zusätzlich zur Panelanreicherung, per Exomanalyse untersucht. Zum einen konnten Mutationen in bekannten FA-Genen bestätigt oder neu identifiziert werden. Zum anderen wurden auch potentiell pathogene Mutationen in DNA-Reparaturgenen außerhalb des FA/BRCA-Signalweges bei zwei Patienten mit unbestätigter Verdachtsdiagnose FA verifiziert. So wurde bei mehreren Mitgliedern einer Familie mit unterschiedlichen Tumorerkrankungen eine zuvor unbeschriebene homozygote Nonsense-Mutation in der BER-Glykosylase NTHL1 nachgewiesen, für welche bislang erst zwei pathogene Mutationen als Auslöser eines neuen Krebssyndroms bekannt sind. Bei einem weiteren Patienten wurden compound-heterozygote Mutationen in RPA1 detektiert, ein Gen für das bislang noch kein Krankheitsbild bekannt ist. Mit Hilfe der drei verschiedenen Anreicherungsstrategien konnten insgesamt 47 von 60 unklassifizierten FA-Patienten 13 verschiedenen Komplementationsgruppen eindeutig zugeordnet werden. Es zeigte sich dabei ein breites Spektrum an neuen, bislang unbeschriebenen FA-Mutationen. Den größten Anteil an der Gesamtzahl der nachgewiesenen Mutationen hatten Spleißmutationen, die auf eine Auswirkung auf das kanonische Spleißmuster untersucht wurden, um einen pathogenen Effekt nachweisen zu können. Weiterhin schloss die Arbeit die Charakterisierung einzelner FA-Patienten bzw. Komplementationsgruppen mit ein. Dazu zählen die seltenen Untergruppen FA-T und FA-Q, für die jeweils ein neuer Patient identifiziert werden konnte. Durch die funktionelle Charakterisierung der dritten jemals beschriebenen FA-Q-Patientin konnten Einblicke in das Zusammenspiel der Reparatur von DNA-Quervernetzungen und der Nukleotidexzisionsreparatur gewonnen und die phänotypische Variabilität von FA durch die subjektive als auch zelluläre UV-Sensitivität der Patientin ergänzt werden. Darüber hinaus konnte das Mutationsspektrum in FA-I sowie FA-D2 erweitert werden. Eine genauere Untersuchung der Pseudogenregionen von FANCD2 ermöglichte dabei die gezielte Mutationsanalyse des Gens. Insgesamt konnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, das Mutationsspektrum in FA zu erweitern und durch die Identifizierung und Charakterisierung einzelner Patienten neue Einblicke in verschiedene Komponenten des FA/BRCA-Signalweges zu erhalten. Es zeigte sich, dass neue DNA-Sequenzierungsstrategien in der FA-Diagnostik eingesetzt werden können, um eine effiziente Mutationsanalyse zu gewährleisten und klassische Methoden in Teilbereichen zu ersetzen. N2 - Fanconi anemia (FA) is, with the exception of mutations in FANCR/RAD51, an autosomal recessive or X-linked inherited disease that is characterized by a remarkable clinical and genetic heterogeneity. In addition to progressive bone marrow failure, typical features include a multitude of developmental malformations, such as radial ray anomalies, growth retardation or cutaneous pigment displacement. Additionally, FA patients have a higher risk for developing acute myelogenous leukemia or solid tumors early in life. To date, pathogenic mutations have been identified in 21 FA genes (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U or -V) whose protein products are responsible for maintaining genomic integrity and constitute components of the FA/BRCA DNA repair pathway. Typical methods for FA mutation analysis comprise Sanger sequencing as well as MLPA and immunoblot analyses. As no definite genotype-phenotype correlation exists, pathogenic mutation detection in rare subgroups is often quite time-consuming and cost-intensive. Within the last few years, distinct strategies for both enrichment and sequencing of a subset of genes, whole exomes or even the whole genome have been developed that facilitate a cost-effective and time-saving mutation analysis. In the present work different target-enrichment strategies followed by high-throughput sequencing were tested for their applicability in molecular genetic diagnostics of FA in order to complement or even replace classic strategies for mutation analysis. The first part of this work addressed the establishment of an FA-specific gene panel for genotyping FA patients. After optimizing this method by means of FA patients with known mutations, this proved to be an efficient approach for detecting pathogenic mutations in FA patients of unknown complementation groups. Due to FA gene panel analysis, 37 of 47 unclassified FA patients were assigned to a complementation group based on the identification of their causative mutations. In another approach, a commercial enrichment panel was tested for its application in FA diagnostics. Again, most pathogenic mutations of five classified and 13 unclassified FA patients were detected, enabling a molecular diagnosis for nine previously unclassified FA patients. Moreover, six selected patients were studied by exome analysis in addition to panel enrichment. This allowed for mutations in known FA complementation groups to be confirmed or newly identified. Additionally, potentially pathogenic variants in DNA-repair genes outside the FA/BRCA pathway were verified in two patients with an unconfirmed suspected diagnosis of FA. One previously undescribed homozygous nonsense mutation in the BER glycosylase NTHL1 was detected in several members of one family with various tumors. For this gene, only two distinct pathogenic mutations were previously described to cause a novel cancer syndrome. In another patient, compound heterozygous mutations in RPA1 were detected, a gene for which no disease pattern is yet known. By means of the three different enrichment strategies a total of 47 of 60 unclassified FA patients were definitely assigned to 13 diverse complementation groups. In this context, a broad spectrum of previously undescribed mutations was identified. The majority of all verified mutations were splice mutations that were examined for an effect on the canonical splicing pattern in order to verify a pathogenic effect. Additionally, this work also included the characterization of individual FA patients and complementation groups, respectively. These include the rare subgroups FA-T and FA-Q, for each of which one new patient was identified. Functional characterization of the third ever described FA-Q patient allowed new insights into the interplay of DNA interstrand-crosslink and nucleotide excision repair and broadened the spectrum of phenotypic variability of FA by the subjective and cellular UV sensitivity of this patient. Furthermore, the mutation spectrum in both FA-I and FA-D2 was expanded. Here, a closer investigation of the pseudogene regions of FANCD2 facilitated a precise mutation screening of the gene. Overall, the results of this work broadened the mutation spectrum of FA and allowed new insights into diverse components of the FA/BRCA pathway by identifying and characterizing individual patients. It became apparent that novel strategies for DNA sequencing can be applied in FA diagnostics to ensure an efficient mutation analysis, as well as to replace some parts of classical approaches. KW - Fanconi-Anämie KW - DNS-Reparatur KW - Sequenzdaten KW - Genpanel KW - Next generation sequencing KW - Mutationsanalyse Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151096 ER - TY - THES A1 - Riemens, Renzo J. M. T1 - Neuroepigenomics in Alzheimer’s disease: The single cell ADds T1 - Neuroepigenomik bei der Alzheimer-Krankheit: Die Einzelzell ADds N2 - Die Forschung, die in dieser Arbeit zusammengestellt wird, kann in zwei Teile geteilt werden. Der erste Teil, bestehend aus vier Kapiteln, konzentriert sich auf die Rolle der epigenetischen Dysregulation in der Ätiopathophysiologie der sporadischen Alzheimer-Krankheit (sAD). Neben Einblicken in die neuesten Entwicklungen in neuroepigenomischen Studien zu dieser Krankheit geht der erste Teil der Arbeit auch auf verbleibende Herausforderungen ein und gibt einen Ausblick auf mögliche Entwicklungen auf diesem Gebiet. Der zweite Teil, der drei weitere Kapitel umfasst, konzentriert sich auf die Anwendung von auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierenden Krankheitsmodellen für das Studium der AD, einschließlich, aber nicht beschränkt auf mechanistische Studien zur epigenetischen Dysregulation unter Verwendung dieser Plattform. Neben der Skizzierung der bisherigen Forschung mit iPSC-basierten Modellen für sAD gibt der zweite Teil der Arbeit auch Einblicke in die Gewinnung krankheitsrelevanter Nervenkulturen auf Basis der gezielten Differenzierung von iPSCs und beinhaltet darüber hinaus einen experimentellen Ansatz für den Aufbau eines solchen Modellsystems. N2 - The research that is compiled in this thesis can be divided in two parts. The first part, consisting of four chapters, is centered around the role of epigenetic dysregulation in the etiopathophysiology of sporadic alzheimer's disease (sAD). In addition to providing insights into the most recent developments in neuroepigenomic studies of this disease, the first part of the thesis also touches upon remaining challenges, and provides a future outlook on possible developments in the field. The second part, which includes three more chapters, is focused on the application of induced pluripotent stem cell (iPSC)-based disease models for the study of AD, including but not limited to mechanistic studies on epigenetic dysregulation using this platform. Aside from outlining the research that has been conducted using iPSC-based models for sAD to date, the second part of the thesis also provides insights into the acquisition of disease-relevant neural cultures based on directed differentiation of iPSCs, and furthermore includes an experimental approach for the establishment of such a model system. KW - Epigenetik KW - Alzheimerkrankheit KW - Neuroepigenomics KW - Alzheimer's disease Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-254574 SN - 978-94-6423-524-1 ER - TY - THES A1 - Riekert, Elisa T1 - Der Einfluss von Tnap auf die Zahnentwicklung im Zebrafisch (Danio rerio) T1 - The influence of Tnap on tooth development in zebrafish (Danio rerio) N2 - Aufgrund mangelnder Aktivität der Gewebe-unspezifischen Phosphatase (tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP) kommt es zum Krankheitsbild der Hypophosphatasie (HPP). Neben skelettalen und neuronalen Symptomen leiden Patienten mit HPP häufig an einem vorzeitigen Verlust der Milchzähne und weiteren dentalen Manifestationen, wie Zahnhartsubstanzdefekten, Eruptionsstörungen, erweiterte Pulpenkammern oder einer verringerten alveolären Knochenhöhe. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss der TNAP auf die Zahnentwicklung von Zebrafischlarven zu untersuchen, um ein neues in-vivo Modell für die dentalen Auswirkungen bei Hypophosphatasie etablieren zu können. Um die sehr kleinen Zähne der Zebrafischlarven auch in frühen Entwicklungsstadien darzustellen, wurden mittels verschiedener histologischer Färbungen die Zahnstrukturen angefärbt und die Larven danach in JB4®, einen polymeren Kunststoff, eingebettet. Im Anschluss wurden histologische Schnitte angefertigt und am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Einerseits konnte durch In-situ-Hybridisierung die Expression verschiedener Gene, wie z.B. alpl (welches für die Tnap im Zebrafisch kodiert), im Bereich von dentalen Strukturen in verschiedenen Entwicklungsstadien nachgewiesen werden. Außerdem zeigte die Analyse der dentalen Strukturen nach Inhibition der Tnap mittels Levamisol bei fünf Tage alten Zebrafischlarven eine Veränderung von Form, Größe und Struktur der ersten Zähne. Die TNAP-Inhibition führte auch zur quantitativ nachweisbaren Steigerung des Fluoreszenzsignals von ß-Catenin, welches eine zentrale Funktion im Wnt/ß-Catenin-Signalweg besitzt und essenziell in verschiedenen zellulären Prozessen während der Embryogenese ist. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der Arbeit, dass der Zebrafisch großes Potenzial als in-vivo Modell für die dentalen Symptome bei HPP bietet. Außerdem eröffnen sich neue interessante Fragen in Bezug auf den Einfluss von ß-Catenin bei den frühen pathophysiologischen Prozessen der Erkrankung. N2 - Lack of activity of the tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP, can result in the clinical manifestation of hypophosphatasia (HPP). Besides skeletal and neuronal symptoms, patients with HPP often suffer from premature loss of deciduous teeth and other dental manifestations, e.g. defects in tooth structure, eruption disorders, widened pulp chambers, or decreased alveolar bone height. The aim of this work was to investigate the influence of TNAP (Tnap) on tooth development in zebrafish larvae and to investigate the possibility to establish a new in-vivo model for the dental effects in hypophosphatasia. To visualize the very small teeth of zebrafish even at early developmental stages, tooth structures were stained with different histological staining methods and larvae were subsequently embedded in JB4®, a polymeric resin. Afterwards, histological sections were prepared from embedded specimen and evaluated on the fluorescence microscope. Coloration of mRNA transcripts by in-situ-hybridization marked the expression of different genes, e.g. alpl (which encodes Tnap in zebrafish), within the area of dental structures at different developmental stages. Further analysis of dental structures after inhibition of Tnap by levamisole incubation showed changes in the shape, size and structure of teeth in five-day-old zebrafish larvae. In addition, after inhibition of Tnap there was a quantitatively detectable increase in the fluorescent signal of ß-catenin, which has a central function in the Wnt/ß-catenin signaling pathway and in a wide number of cellular processes during embryogenesis. In summary, the presented results of this work show that the zebrafish offers great potential as an in-vivo model for dental symptoms in HPP. It also raises interesting questions regarding the influence of ß-catenin in the early pathophysiological processes of the disease. KW - Zebrabärbling KW - Alkalische Phosphatase KW - Hypophosphatasie KW - Tnap KW - Gewebe-unspezifische Alkalische Phosphatase KW - zebrafish KW - Zahnentwicklung KW - tooth development KW - Tissue Nonspecific Alkaline Phosphatase Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-287406 ER - TY - THES A1 - Reichenbach, Juliane Renate T1 - Paternal age effects on sperm DNA methylation and its impact on the next generation T1 - Der väterliche Alterseffekt auf das Spermienmethylom und seine Auswirkungen auf die nächste Generation N2 - The effect of late parenthood on the offspring´s physical and mental health status has recently become an increasingly important topic of discussion. Studies on neurodevelopmental disorders in children of older parents (Naserbakht et al., 2011) outline the negative consequences of aging fathers as unpredictable compared to the better-understood unfavorable maternal influences (Cedars et al. 2015). This may be due to the fact that lifelong production of male gametes becomes more susceptible to error, not only for somatic mutations. Non-genomic mechanisms such as epigenetic methylation also alter DNA dynamically throughout life (Jones et al., 2015) and influence the aging human sperm DNA (Jenkins et al., 2014). These methylation changes may be transmitted to the next generation via epigenetic inheritance mechanisms (Milekic et al., 2015), which may negatively impact the sensitive epigenetic regulation of cell differentiation in the embryonic period (Curley et al., 2011; Spiers et al., 2015). Accordingly, Nardone et al. (2014) reported several hypomethylated regions in autistic patients, illustrating potential epigenetic influences on the multifactorial pathogenesis of neuropsychiatric disorders. In the present study, the methylation status of five gene regions in the sperm DNA of males of different ages was analyzed by two techniques - pyrosequencing and deep bisulfite sequencing. Two gene regions, FOXK1 and DMPK, showed a highly significant age-related methylation loss and FOXK1 a reduced methylation variation at the level of single alleles. In addition, the examined gene region of FOXK1 showed significant methylation changes in the fetal cord blood DNA of the respective offspring of the sperm donor. This fact suggests a transfer of age-related methylation loss to the next generation. Interestingly, a methylation analysis at the level of single alleles showed that the methylation loss was inherited exclusively by the father. FOXK1 is a transcription factor that plays an important role in the epigenetic regulation of the cell cycle during embryonic neuronal development (Huang et al., 2004; Wijchers et al., 2006). For this reason, the methylation status of FOXK1 in the blood of autistic patients and an age- and sex-matched control group was investigated. While both groups showed age-associated FOXK1 methylation loss, a faster dynamics of methylation change was observed in the autistic group. Although further studies are needed to uncover inheritance mechanisms of epigenetic information, the present results show an evident influence of age-related methylation changes on offspring. When advising future fathers, it is important to consider how the paternal epigenome is altered by aging and can have a negative impact on the developing embryo. N2 - Die Auswirkungen einer späten Elternschaft auf die körperliche und geistige Gesundheit der Nachkommen wurde in letzter Zeit zunehmend diskutiert. Studien zu neurologischen Entwicklungsstörungen bei Kindern älterer Eltern (Naserbakht et al. 2011) skizzieren insbesondere die negativen Folgen alternder Väter (Cedars et al. 2015). Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass die lebenslange Produktion männlicher Gameten im Laufe des Lebens nicht nur für somatische Mutationen fehleranfälliger wird. Auch nicht-genomische Mechanismen wie die epigenetische Methylierung verändert die DNA im Laufe des Lebens dynamisch (Jones et al. 2015) und beeinflussen die alternde menschliche Spermien-DNA (Jenkins et al. 2014). Möglicherweise werden diese Methylierungsveränderungen über epigenetische Vererbungsmechanismen an die nächste Generation übertragen (Milekic et al. 2015), was sich negativ auf die empfindliche epigenetische Regulation der Zelldifferenzierung in der Embryonalperiode auswirken kann (Curley et al. 2011; Spiers et al. 2015). Mögliche epigenetische Einflüsse auf die multifaktorielle Pathogenese neuropsychiatrischer Erkrankungen veranschaulichend, zeigten Nardone et al. (2014) mehrere hypomethylierte Regionen bei autistischen Patienten auf. In der vorliegenden Arbeit wurde der Methylierungsstatus von fünf Genregionen in der Spermien-DNA von Männern unterschiedlichen Alters durch zwei Techniken analysiert – das Pyrosequencing und das Deep Bisulfite Sequencing. Zwei Genregionen, FOXK1 und DMPK, zeigten einen hochgradig signifikanten altersbedingten Methylierungsverlust und FOXK1 auf der Ebene einzelner Allele eine verringerte Methylierungsvariation. Darüber hinaus zeigte die untersuchte Genregion von FOXK1 signifikante Methylierungsveränderungen in der Nabelschnurblut-DNA der jeweiligen Nachkommen der Samenspender. Diese Tatsache spricht für eine Übertragung des altersbedingten Methylierungsverlustes auf die nächste Generation. Anhand einer Methylierungsanalyse auf der Ebene einzelner Allele konnte interessanterweise gezeigt werden, dass der Methylierungsverlust ausschließlich durch den Vater vererbt wurde. FOXK1 ist ein Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle bei der epigenetischen Regulation des Zellzyklus während der embryonalen neuronalen Entwicklung spielt (Huang et al. 2004; Wijchers et al. 2006). Aus diesem Grund wurde der Methylierungsstatus von FOXK1 im Blut autistischer Patienten und einer alters- und geschlechtsentsprechenden Kontrollgruppe untersucht. Während beide Gruppen einen altersassoziierten FOXK1-Methylierungverlust zeigten, wurde in der autistischen Gruppe eine schnellere Dynamik der Methylierungsänderung beobachtet. Obwohl weitere Studien erforderlich sind, um Vererbungsmechanismen epigenetischer Information aufzudecken, zeigen die vorliegenden Ergebnisse einen offensichtlichen Einfluss altersbedingter Methylierungsveränderungen auf die Nachkommen. Bei der Beratung zukünftiger Väter ist es wichtig zu berücksichtigen, wie das väterliche Epigenom durch das Altern verändert wird und negative Auswirkungen auf den sich entwickelnden Embryo haben kann. KW - Epigenetik KW - Vater KW - Spermium KW - Autismus KW - Methylierung KW - paternal age KW - epigenetics KW - sperm KW - methylation KW - reproduction KW - autism KW - Väterliches Alter KW - Epigenetik KW - Spermien KW - Methylierung Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199805 ER - TY - THES A1 - Prell, Andreas T1 - The effects of paternal age on DNA methylation of developmentally important genes in human and bovine sperm T1 - Der väterliche Alterseffekt auf DNA-Methylierung in entwicklungsrelevanten Genen im menschlichen und bovinen Spermienepigenom N2 - Western societies are steadily becoming older undergoing a clear trend of delayed parenthood. Children of older fathers have an undeniably higher risk for certain neurodevelopmental disorders and other medical conditions. Changes in the epigenetic landscape and especially in DNA methylation patterns are likely to account for a portion of this inherited disease susceptibility. DNA methylation changes during the ageing process are a well-known epigenetic feature. These so-called age-DMRs exist in developmentally important genes in the methylome of several mammalian species. However, there is only a minor overlap between the age-DMR datasets of different studies. We therefore replicated age-DMRs (which were obtained from a genome wide technique) by applying a different technical approach in a larger sample number. Here, this study confirmed 10 age-DMRs in the human and 4 in the bovine sperm epigenome from a preliminary candidate list based on RRBS. For this purpose, we used bisulphite Pyrosequencing in 94 human and 36 bovine sperm samples. These Pyrosequencing results confirm RRBS as an effective and reliable method to screen for age-DMRs in the vertebrate genome. To decipher whether paternal age effects are an evolutionary conserved feature of mammalian development, we compared methylation patterns between human and bovine sperm in orthologous regulatory regions. We discovered that the level of methylation and the age effect are both species-specific and speculate that these methylation marks reflect the lineage-specific development of each species to hit evolutionary requirements and adaptation processes. Different methylation levels between species in developmentally important genes also imply a differing mutational burden, representing a potential driver for point mutations and consequently deviations in the underlying DNA sequence of different species. Using the example of different haplotypes, this study showed the great effect of single base variations on the methylation of adjacent CpGs. Nonetheless, this study could not provide further evidence or a mechanism for the transfer of epigenetic marks to future generations. Therefore, further research in tissues from the progeny of old and young fathers is required to determine if the observed methylation changes are transmitted to the next generation and if they are associated with altered transcriptional activity of the respective genes. This could provide a direct link between the methylome of sperm from elderly fathers and the development potential of the next generation. N2 - Unsere westliche Gesellschaft wird immer älter und unterliegt einem eindeutigen Trend zur verzögerten Elternschaft. Kinder von älteren Vätern haben ein unbestreitbar höheres Risiko für bestimmte neurologische Entwicklungsstörungen und andere Erkrankungen. Epigenetische Veränderungen insbesondere im DNA-Methylierungsmuster sind wahrscheinlich für einen Teil dieser vererbten Krankheitsanfälligkeit verantwortlich. Altersbedingte Veränderungen im DNA-Methylierungsmuster sind ein bekanntes und gut erforschtes Phänomen in der Epigenetik. Diese so genannten Alters-DMRs konnten im Methylom mehrerer Säugetierarten nachgewiesen werden, insbesondere in entwicklungsrelevanten Genen. Allerdings gibt es nur geringe Überschneidungen zwischen den Alters-DMR-Datensätzen verschiedener Studien. Unser Ziel war es daher, die Vertrauenswürdigkeit eines laborinternen Datensatzes, der auf Reduced Representation Bisulphite Sequencing (RRBS) basierte, zu erhöhen, indem wir einen anderen technischen Ansatz in einer unabhängigen Kohorte anwenden. Mit der Methode des Bisulphite Pyrosequencing konnten wir in dieser Studie 10 Alters-DMRs im menschlichen und 4 im Rinder-Spermienepigenom aus einer vorläufigen Kandidatenliste basierend auf RRBS validieren. Diese Ergebnisse bestätigen, dass RRBS eine wirksame und zuverlässige Methode ist, um neue Alters-DMRs im Wirbeltiergenom zu finden. Um festzustellen, ob väterliche Alterseffekte in der Evolution verschiedener Säugetierarten konserviert wurden, verglichen wir die Methylierungsmuster orthologer Regionen zwischen dem menschlichem und dem Rinderspermienepigenom. Es zeigte sich, dass sowohl der Methylierungsgrad als auch der Alterseffekt artspezifisch sind. Daher vermuten wir, dass diese Methylierungsmuster die artspezifische Entwicklung als Antwort auf evolutionäre Anforderungen und durchlebte Anpassungsprozesse darstellen. Diese unterschiedlichen Methylierungslevel zwischen verschiedenen Arten in entwicklungswichtigen Genen implizieren auch eine unterschiedliche Mutationslast, die einen potenziellen Treiber für Punktmutationen und folglich Abweichungen in der zugrunde liegenden DNA-Sequenz der verschiedenen Arten darstellt. Am Beispiel verschiedener Haplotypen konnten wir exemplarisch den ausgeprägten Einfluss bereits einzelner DNA-Basenvariationen auf die Methylierung benachbarter CpGs demonstrieren. Allerdings konnte diese Studie keinen weiteren Beweis oder einen Mechanismus für die Übertragung von epigenetischen Markierungen auf künftige Generationen liefern. Daher sind weitere Untersuchungen an embryonalen, fötalen und adulten Geweben von Nachkommen alter bzw. junger Väter unabdingbar, um festzustellen, ob die beobachteten Methylierungsveränderungen auch auf die nächste Generation übertragen werden. Ferner ist festzustellen, ob sie die Transkriptionsaktivität der betroffenen Gene beeinflussen. Dies könnte einen direkten Einfluss des Spermienmethyloms älterer Väter auf das Entwicklungspotenzial der nächsten Generation belegen. KW - Epigenetik KW - Spermium KW - Methylierung KW - DNA-Methylation KW - Paternal age effect Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-347866 ER - TY - THES A1 - Pokall, Jörg Fabian T1 - Somatische Gentherapie monogener Erbkrankheiten - Einfache Lösungen für einfache Defekte? T1 - Somatic gene therapy for monogeneic disorders - Simple solutions for simple defects ? N2 - Die Jahrtausendwende bildete den Rahmen einer lebhaften Zeit in der Gentherapie. Öffentlichkeitswirksame Berichte von bahnbrechenden Erfolgen schienen die Mühen jahrzehntelanger Grundlagenforschung endlich zu den prognostizierten Ergebnissen geführt zu haben, wenn auch vorerst nur in recht kleinen Nischen des Feldes. Begleitet von geschärfter öffentlicher Aufmerksamkeit, vor allem nach einem Todesfall im Rahmen einer gentherapeutischen Studie, schuf die Publikation des ersten therapeutischen Erfolges bei der „Severe Combined Immuno Deficiency“ (SCID) im Millenniumsjahr eine willkommene Atempause für die somatische Gentherapie. Da bei monogenen Defekten im Gegensatz zu polygenen bzw. multifaktoriell bedingten Leiden die Reparatur des jeweiligen Genlokus theoretisch zu einer vollständigen Korrektur führt, waren erste gentherapeutische Fortschritte vor allem in diesem Feld prognostiziert worden. Allerdings stellten sich diese Überlegungen sehr bald als ein in der täglichen Praxis der Laborarbeit mit immer neuen Hindernissen behaftetes Unternehmen heraus, so dass entgegen vorschnell geäußerter Ankündigungen die erwarteten Lösungen meist nur in Ansätzen zu Stande kamen. Ziel dieser Arbeit ist es, anhand ausgewählter monogener Erbkrankheiten den derzeitigen Stand der somatischen Gentherapie einer eingehenden Analyse zu unterziehen. N2 - The millenium set the stage for a vivid time in gene therapy. After decades of basic scientific work the often prematurely proclaimed breakthrough in this form of therapy finally seemed at hands, if only in a small niche of the field. After the death of one of the patients enrolled in a clinical gene therapy trial, the publication of the first clinical therapeutic success was met with sharpened public scrutiny. However, the successful replacement of the genetic defect in "severe combined immuno deficiency" led to some relaxation amongst researchers. As opposed to polygeneic disorders the simple correction of the single genetic defect in monogeneic disorders in theory should lead to a cure. Nevertheless over the years gene therapy was facing setbacks that in practice led to a rather reserved wording of positive results. Focusing on a choice of monogeneic disorders this work will analyse the current state of somatic gene therapy. KW - Gentherapie KW - Monogen KW - Erbkrankheiten KW - Vektoren KW - gene therapy KW - monogeneic KW - inherited disorders KW - vectors Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7994 ER - TY - THES A1 - Patzina, Tobias T1 - Genetische Veränderungen am SOX9 Lokus bei Pierre-Robin-Sequenz T1 - Genetic variations at the SOX9 lokus in patients with Pierre-Robin-Sequence N2 - Die Pierre-Robin-Sequenz ist eine angeborene kraniofaziale Fehlbildung, bei der häufig eine Triade von Symptomen, bestehend aus mandibulärer Mikrognathie/Retrognathie, Glossoptose und einer Gaumenspalte, beobachtet werden kann. Aufgrund der Heterogenität der PRS und der häufigen Vergesellschaftung mit Syndromen, konnten Ätiologie und Pathogenese der PRS bisher nur unzureichend geklärt werden. Für einen Teil der Patienten mit isolierter PRS konnte eine familiäre Häufung von PRS-Fällen nachgewiesen werden, was auf eine erbliche Komponente als krankheitsauslösenden Faktor hinweist. In diesem Zusammenhang konnten bei Patienten mit isolierter PRS gehäuft genetische Veränderungen mit einer Entfernung von über 1Mb zentromerisch (5´) von SOX9 auf dem Chromosom 17 detektiert werden. Es wird vermutet, dass diese genetischen Aberrationen am SOX9 Lokus eine gewebsspezifische Fehlregulation von SOX9 während der Embryonalentwicklung auslösen und somit ursächlich für die Entstehung von PRS sein können. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine Würzburger Patientenkohorte mit isolierter PRS zu gewinnen und Informationen über die phänotypischen Merkmale der Studienteilnehmer auszuwerten. Im Anschluss sollte die Patienten-DNS mittels molekulargenetischen Analysemethoden auf potenziell krankheitsauslösende genetische Aberrationen am SOX9 Lokus untersucht werden. Zunächst konnte eine Kohorte mit sieben PRS-Patienten erstellt und Informationen über die phänotypischen Krankheitsmerkmale erfasst und ausgewertet werden. Anschließend wurden bei den Studienteilnehmern eine Array-CGH, eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion und im Bereich von drei konservierten, potenziell regulatorischen Elementen des SOX9 Lokus eine Sanger Sequenzierung durchgeführt. Die Array-CGH ergab zunächst bei einem Patienten zwei große Deletionen im regulativen Umfeld des SOX9 Lokus, welche im Weiteren nicht durch qPCR bestätigt werden konnten. Letztendlich konnten durch die Sanger Sequenzierung 22 Varianten detektiert werden, wovon für drei Einzelnukleotid-Polymorphismen eine prädisponierende Wirkung diskutierbar und für zwei Einzelnukleotid-Varianten eine ursächlich pathogene Wirkung nicht auszuschließen ist. N2 - The Pierre-Robin-Sequence is a congenital craniofacial disorder mostly described as a triade of symptoms, consisting of mandibular micrognathia, glossoptosis and cleft palate. Due to its heterogenity, the aetiology and pathogenesis of PRS is not recognized in every case of the disease. Nevertheless familial accumulation in isolated PRS cases pointed to a possible genetic source of pathology. In this context, genetic analysis in patients with isolated PRS pointed to genetic variations far upstream (more than 1Mb) of the SOX9 gene on chromosome 17 as possibly disease-inducing. These genetic variations at the SOX9 lokus are supected to cause tissue specific misregulation of SOX9 during embryogenesis and thus can be seen as causal for the development of isolated PRS. The objective of this study was to form a group of patients with isolated PRS and to gain information about their phenotype. Subsequently, genetic analysis should be used to find potentially disease inducing genetic variations at the SOX9 lokus. A cohort of 7 patients with isolated PRS was formed and the phenotypes of these patients were registered and evaluated. In addition, array-CGH, real-time quantitative polymerase chain reaction and sanger sequencing was performed for all the participants of this study. Array-CGH resulted in two big deletions within the regulary domain of the SOX9 lokus, which could not be confirmed with qPCR. Eventually, sanger sequencing of three conserved, non coding elements at the SOX9 lokus showed 22 variants, of which three single-nucleotid polymorphisms could potentially prove to have a predisposing effect and two singlenucleotid-variants, for which a pathogenic effect cannot be ruled out. KW - Robin-Syndrom KW - Mikroarray KW - CNV KW - Sanger Sequenzierung KW - Sanger sequencing KW - quantitative Polymerasekettenreaktion KW - qPCR KW - Mikroarray KW - SOX9 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186893 ER - TY - THES A1 - Orlitsch, Carolin T1 - Zellzyklusdiagnostik bei Fanconi Anämie T1 - Cellcyclediagnostic in Fanconi Anaemia N2 - In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse der Fanconi Anämie Diagnostik am Humangenetischen Institut der Universität Würzburg des Jehres 1999 analysiert und validiert. N2 - Cellcyclediagnostic in Fanconi Anaemia KW - Fanconi Anämie KW - Zellzyklusdiagnostik KW - Fanconi Anaemia KW - Cellcycle blockage Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6456 ER - TY - THES A1 - Neveling, Kornelia T1 - Molecular causes and consequences of genetic instability with respect to the FA/BRCA Caretaker Pathway T1 - Molekulargenetische Ursachen und Folgen genetischer Instabilität am Beispiel des FA/BRCA Caretaker Pathways N2 - In the context of this thesis, I investigated the molecular causes and functional consequences of genetic instability using a human inherited disease, Fanconi anemia. FA patients display a highly variable clinical phenotype, including congenital abnormalities, progressive bone marrow failure and a high cancer risk. The FA cellular phenotype is characterized by spontaneous and inducible chromosomal instability, and a typical S/G2 phase arrest after exposure to DNA-damaging agents. So far, 13 genes have been identified, whose biallelic (or, in the case of X-linked FANCB, hemizygous) mutations cause this multisystem disorder. The FA proteins interact in a multiprotein network, instrumental and essential in the cellular response to DNA damage. A more comprehensive summary of Fanconi anemia and its myriad clinical, cellular and molecular manifestations is provided in the introduction section of this thesis. The results of my experimental work are presented as published papers and manuscripts ready to be submitted. In the first publication, I investigated the connection between FA genes and bladder tumors. The question I tried to answer was whether a disruption of the FA/BRCA pathway may be a frequent and possibly causal event in bladder cancer, explaining the hypersensitivity of these cells to DNA-crosslinking agents. On the basis of my experimental data I arrived at the conclusion that disruption of the FA/BRCA pathway might be detrimental rather than advantageous for the majority tumor types by rendering them vulnerable towards DNA damaging agents and oxidative stress. The second publication deals with the gene coding for the core complex protein FANCE and tries to answer the question why FANCE is so rarely affected among FA-patients. The conclusion from these studies is that like FANCF, FANCE functions as a probable adaptor protein with a high tolerance towards amino acid substitutions which would explain the relative rareness of FA-E patients. I have also investigated the FANCL gene whose product functions as the catalytic subunit of the E3 ligase. The third publication addresses this issue by providing the first comprehensive description of genetic alterations and phenotypic manifestations in a series of three FA-L patients. The results of my study show that genetic alterations of FANCL are compatible with survival, these alterations may include large deletions such as so far common only in the FANCA gene, FA-L phenotypes can be mild to severe, and FANCL belongs to the group of FA genes that may undergo somatic reversion. The central protein of the FA/BRCA network, FANCD2, is the subject of the fourth publication presented in this thesis. Most importantly, we were able to show that there are no biallelic null mutations in FANCD2. Correspondingly, residual protein of both FANCD2-isotypes (FANCD2-S and FANCD2-L) was present in all available patient cell lines. This suggests that complete abrogation of the FANCD2 protein cannot be tolerated and causes early embryonic lethality. There are at least three FA proteins that are not required for the posttranslational modification of FANCD2. One of these proteins is the 5’-3’ helicase BRIP1 (BRCA1-interacting protein 1), a protein that interacts directly with the breast cancer susceptibility protein BRCA1. I participated in the identification of BRIP1 as the FA protein FANCJ. This discovery is described in the fifth publication of this thesis. The newly discovered protein BRIP1/FANCJ seems to act as one of the mediators of genomic maintenance downstream of FANCD2. Another protein identified downstream of FANCD2 is PALB2. PALB2 was originally discovered as “partner and localizer of BRCA2”. In a candidate gene approach we tested patients with early childhood cancers but without mutations in BRCA2 for mutations in PALB2 (publication 6). PALB2 was identified as a novel FA gene and designated FANCN. FA-N patients are very severely affected. The last publication included in my thesis describes the identification of the FA gene FANCI as the second monoubiquitinated member of the FA/BRCA pathway (publication 7). We identified biallelic mutations in KIAA1794 in four FA patients, thus proving the genuine FA-nature of this candidate sequence. The general discussion provides a synopsis of the results and conclusions of my work with the state of art of FA research. N2 - Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden molekulare Ursachen und funktionale Konsequenzen genetischer Instabilität am Beispiel der menschlichen Erbkrankheit Fanconi Anämie (FA) untersucht. FA Patienten zeigen einen sehr variablen klinischen Phänotyp, der in der Regel angeborene Fehlbildungen, progressives Knochenmarkversagen und ein hohes Risiko für Tumorerkrankungen beinhaltet. Der zelluläre Phänotyp der FA ist durch eine spontane und induzierbare chromosomale Instabilität und einen typischen S/G2-Phasen-Arrest nach Exposition mit DNA-schädigenden Agentien charakterisiert. Biallelische oder -im Fall des X-chromosomalen FANCB- hemizygote Mutationen, die zu dieser Erkrankung führen, wurden in bislang 13 Genen identifiziert. Die FA Proteine arbeiten in einem gemeinsamen Netzwerk und sind essentiell beteiligt an der zellulären Antwort auf DNA Schädigung. Eine umfassendere Übersicht über Fanconi Anämie und ihre vielfältigen klinischen, zellulären und molekularen Erscheinungsformen ist in der Einleitung dieser Dissertation gegeben. Die Ergebnisse meiner experimentellen Arbeiten sind in Form von publizierten Fachartikeln und fertigen Manuskripten dargestellt. In der ersten Publikation habe ich den Zusammenhang von FA Genen und Harnblasentumoren untersucht. Die Frage, die ich zu beantworten versucht habe, war, ob ein Defekt im FA/BRCA Weg eine mögliche Ursache für die Entstehung von Blasentumoren sein könnte. Aufgrund meiner experimentellen Daten bin ich zu dem Schluss gekommen, dass ein Defekt im FA/BRCA Weg für einen Tumor vermutlich eher schädlich als vorteilhaft ist, da so ein Defekt den Tumor gegenüber DNA-schädigenden Agentien und oxidativem Stress anfällig machen würde. Meine zweite Publikation befasst sich mit dem Kern-Komplex Protein FANCE und versucht die Frage zu beantworten, warum das FANCE Gen in so wenigen FA Patienten betroffen ist. Die Schlussfolgerung dieser Arbeit war, dass FANCE vermutlich genauso wie FANCF im Kern-Komplex die Rolle eines Adaptor-Proteins mit einer hohen Toleranz gegenüber Aminosäure-Austauschen innehat, was die relative Seltenheit von Patienten dieser Untergruppe erklären könnte. Ich habe weiterhin das FANCL Gen untersucht, dessen Produkt als katalytische Untereinheit der E3-Ligase fungiert. Die dritte Publikation in dieser Dissertation befasst sich mit diesem Thema und enthält eine umfassende Beschreibung von genetischen Veränderungen und phänotypischen Auswirkungen in einer Gruppe von 3 FA-L Patienten. Die Ergebnisse meiner Arbeit haben allerdings gezeigt, dass genetische Veränderungen in FANCL mit dem Leben vereinbar sind, dass diese Veränderungen sehr große Deletionen beinhalten können, was bisher nur für FANCA gezeigt werden konnte, dass FA-L Phänotypen von mild bis schwer betroffen reichen können und dass FANCL zu den Genen gehört, in denen somatische Reversionen stattfinden. Das Schlüsselprotein des FA/BRCA Netzwerks, FANCD2, ist das Thema der vierten Publikation in dieser Dissertation. Insbesondere konnten wir zeigen, dass es keine biallelischen Nullmutationen in FANCD2 zu geben scheint. Dementsprechend war Restprotein von beiden FANCD2-Isoformen, FANCD2-L und FANCD2-S, in allen verfügbaren Patienten-Zelllinien nachweisbar. Dies ließ vermuten, dass ein komplettes Fehlen des FANCD2 Proteins nicht tolerierbar ist und frühe embryonale Letalität verursacht. Es mindestens drei Proteine, die nicht für diese posttranslationale Modifikation benötigt werden. Eines dieser Proteine ist die 5’-3’ Helikase BRIP1 (BRCA1-interagierendes Protein 1), ein Protein, das direkt mit dem Brustkrebs-assoziierten Protein BRCA1 interagiert. Ich war an der Identifizierung von BRIP1 als FA Protein (FANCJ) beteiligt. Diese Entdeckung ist in der fünften Publikation meiner Dissertation beschrieben. Das neu entdeckte Protein BRIP1/FANCJ, das direkt mit BRCA1 interagiert, scheint als einer der Mediatoren zur Aufrechterhaltung genomischer Stabilität downstream von FANCD2 zu wirken. Ein weiteres Protein downstream von FANCD2 ist PALB2. PALB2 wurde ursprünglich als „Partner und Lokalisierer von BRCA2“ entdeckt. In einer Kandidatengen-Studie haben wir Patienten mit frühkindlichen Tumoren, aber ohne Mutationen in BRCA2, auf Mutationen in PALB2 untersucht (Publikation 6). Aufgrund unserer Ergebnisse haben wir PALB2 als ein neues FA Gen identifiziert und haben es FANCN genannt. Genauso wie FA-D1 Patienten sind FA-N Patienten sehr schwer betroffen. Die letzte Publikation meiner Dissertation beschreibt die Identifikation des FA Genes FANCI, dessen Produkt das zweite monoubiquitinierte Mitglied des FA/BRCA Weges darstellt (Publikation 7). Wir haben in vier Patienten biallelische Mutationen in KIAA1794 gefunden, und so zeigen können, dass KIAA1794 wirklich ein FA Gen ist. Die generelle Diskussion birgt eine Synopsis der Ergebnisse und Schlussfolgerungen meiner Forschung mit dem aktuellen Wissensstand über FA. KW - Fanconi-Anämie KW - DNS-Reparatur KW - Chromosomenbruch KW - Blasentumor KW - Brustkrebs KW - Methylierung KW - DNA-Instabilitätssyndrom KW - Mutationsanalyse KW - DNA-Quervernetzung KW - Genetik KW - Zellzyklus KW - Fanconi anemia KW - DNA repair KW - chromsomal instability KW - interstrand crosslink Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27383 ER - TY - THES A1 - Neumayr, Annette T1 - Häufigkeit der proximalen myotonen Myopathie (PROMM/DM2) im Vergleich zur Myotonen Dystrophie (DM1) in der deutschen Bevölkerung T1 - Frequency of proximal myotonic myopahty (PROMM/DM2) compared to myotonic dystrophy (DM1) in germans population N2 - Die Arbeit befasst sich mit Abschätzung der Häufigkeit der proximalen myotonen Myopahtie (PROMM/DM2) in der deutschen Bevölkerung. Zugrunde liegend sind Daten aus dem Institut für Humangenetik der Universität Würzburg von 1993 bis 2006, sowie Daten der deutschlandweiten Diagnostik anbietenden Zentren aus den Jahren 2005 und 2006. Die Auswertung der Daten der Humangenetik in Würzburg bestätigte die Vermutung, dass die myotone Dystrophie (DM1) und die proximale myotone Myopathie (PROMM/DM2) gleich häufig sind. Aus dem Wissen heraus, dass frühere Angaben für die Häufigkeit der DM1 nicht nur diese Erkrankung erfasst haben, sondern auch Fälle mit PROMM/DM2, kann man davon ausgehen, dass damalige Häufigkeitsangaben anteilig beide Erkrankungen gemeinsam erfasssen. Das Ergebniss spricht für eine Inzidenz von 2,75/100.000 Einwohnern in Deutschland. N2 - The central question of this work was, to asses the frequency of proximal myotonic dystrophy (PROMM/DM2) in germanys population. Based on data of the years 1993 to 2006 from institute for human genetics at the university of wuerzburg and data from laboratories all over germany offering genetic testing for proximal myotonic myopathy, the assumption of having both, proximal myotonic myopathy and myotonic dytsrophy, the same frequency has been confirmed. We know that data refering to the frequency of myotonic dystrophy must also have includet cases of proximal myotonic dytsrophy. Proceeding that previous data includes both malaties and that they are both, same often, we can say that the incidence of proximal myotonic dystrophy must be 2,75/100.000 inhabitans. KW - PROMM KW - DM2 KW - DM1 KW - Proximale myotone Myopathie KW - Myotone Dystrophy KW - PROMM KW - DM2 KW - DM1 KW - proximal myotonic myopathy KW - myotonic dytsrophy Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25445 ER - TY - THES A1 - Münch, Andrea T1 - Funktionsstörungen von DNA-Reparaturgenen als Risikofaktor für die Entwicklung von hereditären kolorektalen Karzinomen T1 - Defects in DNA repair genes as a risk for the development of hereditary colorectal cancer N2 - 5 bis 10 % aller kolorektalen Karzinome entstehen auf dem Boden einer erblichen Disposition. Bei der Tumorgenese dieser hereditären kolorektalen Karzinome spielen pathogenetisch vor allem Mutationen in DNA-Reparaturgenen eine wichtige Rolle. Ziel dieser Arbeit war es, anhand neuester Literatur darzustellen, welche Bedeutung Funktionsstörungen in DNA-Reparaturgenen als Risikofaktoren bei der Entstehung von erblichen kolorektalen Karzinomen haben.Die meisten Mutationen unter den DNA-Reparaturgenen finden sich in Genen des Mismatch-Reparatursystems. Genetische Keimbahnmutationen in MMR-Genen sind an der Pathogenese von vier verschiedenen Krebssyndromen beteiligt, die zu kolorektalen Karzinomen führen können. Es sind das autosomal-dominant vererbte HNPCC-Syndrom mit Mutationen im hMLH1-, hMSH2-, hMSH6-, hMLH3-, hPMS2- und hPMS1-Gen, das autosomal-dominant vererbte Muir-Torre-Syndrom dessen Grundlage Mutationen im hMSH2-, hMLH1- und hMSH6-Gen sind, das autosomal-dominant oder autosomal-rezessiv vererbte Turcot-Syndrom mit Mutationen im hMLH1-, hPMS2-, hMSH2- und hMSH6-Gen sowie das autosomal-rezessiv vererbte Mismatch-Repair-Deficiency-Syndrom mit Mutationen im hMLH1-, hMSH2-, hMSH6- und hPMS2-Gen. Neben genetischen Mutationen werden auch zunehmend epigenetische Modifikationen entdeckt, die DNA-Reparaturgene durch Promotorhypermethylierung inaktivieren und so an der Pathogenese erblicher kolorektaler Karzinome mitwirken. Bis jetzt sind Epimutationen in den MMR-Genen hMLH1 und hMSH2 in der Literatur beschrieben worden. Auch im DNA-Reparaturgen MGMT, einem Gen aus dem Reversions-Reparatursystem, konnten Epimutationen nachgewiesen werden, die die Entstehung von kolorektalen Tumoren fördern.Funktionsstörungen in DNA-Reparaturgenen des Basen-Exzisions-Reparatursystems sind ebenso an der Tumorgenese des kolorektalen Karzinoms beteiligt. Genetische Keimbahnmutationen im DNA-Reparaturgen MUTYH führen zur MUTYH-assoziierten Polyposis (MAP), einem erblichen Krebssyndrom, mit einem autosomal-rezessiven Erbgang. Genetische Mutationen konnten auch im MBD4-Gen, einem weiteren BER-Gen, in kolorektalen Karzinomen nachgewiesen werden. N2 - In about 5-10% of all cases, colorectal cancer is associated with a highly penetrant dominant or recessive inherited syndrome. Mutations in DNA repair genes play an important role in the tumorigenesis of hereditary colorectal cancer. A systematic literature search was performed to show the role of defects in DNA repair genes as a risk for the development of hereditary colorectal cancer. Germline mutations in DNA mismatch repair (MMR) genes are associated with four different hereditary colorectal cancer syndromes. The most common of these is HNPCC (hereditary non-polyposis colorectal cancer), an autosomal dominant tumour predisposition and is caused by a mutation in one of the mismatch repair genes: hMLH1, hMSH2, hMSH6, hPMS2, hMLH3 or hPMS1. Muir-Torre syndrome is an autosomal dominant inherited disorder associated with germline mutations in the MMR genes hMSH2, hMLH1 or hMSH6. Both autosomal dominant and autosomal recessive modes of inheritance have been described of Turcot syndrome with MMR germline mutations in hMLH1, hPMS2, hMSH2 or hMSH6. The Mismatch-repair-deficiency (MMR-D) syndrome, a novel recessively inherited cancer syndrome, is due to biallelic mutations in one of the MMR genes hMLH1, hMSH2, hMSH6 or hPMS2. Not only genetic alterations play an important role in the development of colorectal cancer also epigenetic modifications are involved. Germline epimutations by promoter hypermethylation of the mismatch repair genes hMLH1 and hMSH2 in HNPCC has been revealed as well as the inactivation of the DNA repair gene MGMT by promoter hypermethylation as a common event in colorectal cancer. Inherited defects in base excision repair genes are also implicated in the colorectal tumorigenesis. MAP (MUTYH-associated polyposis) is a recently described colorectal adenoma and carcinoma predisposition syndrome with biallelic-inherited mutations of MUTYH gene, which encodes a DNA glycosylase in the base excision repair pathway. Mutations of MBD4 gene have also been reported in colorectal cancer. KW - Dickdarmkrebs KW - DNS-Reparatur KW - DNA-Reparaturgene KW - Kolorektales Karzinom KW - DNA repair gene KW - colorectal cancer Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-50072 ER - TY - THES A1 - Milenkovic, Vladimir M. T1 - Structural and functional analysis of bestrophin N2 - Morbus Best (OMIM 153700), auch als vitelliforme Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) bezeichnet, ist eine autosomal dominant vererbte Makuladystrophie mit juvenilem Beginn. Die Erkrankung geht einher mit einer Ansammlung von Lipofuscin-ähnlichem Material im sowie unterhalb des retinalen Pigmentepithels (RPE). Das bei Morbus Best mutierte VMD2- Gen kodiert für ein 585 Aminosäuren langes Transmembranprotein, genannt Bestrophin, und wird vorwiegend im RPE exprimiert. Das Protein hat eine komplexe Membrantopologie mit 4-6 putativen Transmembrandomänen (TMD) und ist vermutlich in den Ca2+-abhängigen Transport von Chloridionen durch die Plasmamembran involviert. Die überwiegende Mehrheit der krankheitsassoziierten Veränderungen bei M. Best Patienten sind Missense-Mutationen, die innerhalb der hochkonservierten N-terminalen Hälfte des Proteins nahe der mutmaßlichen Transmembrandomänen akkumulieren. Der Zusammenhang zwischen Pathologie und identifizierter Mutationen bzw. der Chloridkanal- Funktion von Bestrophin-1 ist noch unklar. Um die biologische Funktion von Bestrohin-1 weiter aufzuklären und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der BMD besser zu verstehen, wurde mit Hilfe des GAL4-basierenden Hefe-Zwei-Hybridsystems (Y2H) nach interagierenden Partnern von Bestrophin-1 gesucht. Ein Screen in einer bovinen RPE cDNABank mit verschiedenen verkürzten Fragmenten von Bestrophin-1 ergab 53 mögliche interagierende Partner. Allerdings schlossen anschließende Verifikationsexperimente die Kandidatengene aus. Somit deuten die Resultate dieser umfangreichen YH2-Studie daraufhin, dass Bestrophin für das herkömmliche Zwei-Hybrid-System nicht geeignet ist. Zum einen könnte dies daran liegen, dass das Protein ein integraler Bestandteil der Membran ist und zum anderen, dass möglicherweise der Transport der gewählten Bestrophin-Fragmente zum Nukleus nicht stattfindet. Dies gilt jedoch als Grundvoraussetzung für eine Proteininteraktion im Hefe-2-Hybridsystem. Bestrophin gehört zu einer großen Familie von integralen Membranproteinen, von der bis heute bereits über 100 Mitglieder bei verschiedenen Organismengruppen wie denSäugern, Insekten und Würmern identifiziert werden konnten. Als auffälligste Besonderheit in der Familie der Bestrophine zeigt sich neben einer nicht-variablen RFP-Domäne (Arginin- Phenylalanin-Prolin) eine evolutionär hochkonservierte N-terminale Region. Um die phylogenetische Beziehung der Bestrophine zu untersuchen sowie den Aufbau und die Funktion von konservierten Motiven innerhalb der Familienmitglieder zu identifizieren, wurde diese konservierte N-terminale Region sowohl bioinformatisch wie auch Chapter Two: Zusammenfassung 4 phylogenetisch weiter untersucht. Die phylogenetische Analyse der Bestrophin Homologen brachte vier evolutionär konservierte Familienmitglieder in Säugern hervor, die jeweils eine starke Homologie zu den Proteinen VMD2, VMD2-L1 bis VMD2-L3 des Menschen zeigen. Die signifikante Ähnlichkeit der Proteinsequenz innerhalb der vier Familienmitglieder lässt die Schlussfolgerungen zu, dass zum einen jedes einzelne Familienmitglied ihre eigene evolutionär konservierte Funktion hat und zum anderen dass die Divergenz des Bestrophins in verschiedene Familienmitglieder zeitlich vor der Divergenz der verschiedenen Säugerspezien erfolgt sein muss. N2 - Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species. KW - Makuladegeneration KW - Membranproteine KW - Molekularbiologie KW - VMD2 KW - bestrophin KW - VMD2 KW - bestrophin Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19372 ER - TY - THES A1 - Meyer, Johanna T1 - Untersuchungen von Cyrillic 2.13 zur Abschätzung der Mutations- und Erkrankungswahrscheinlichkeit bei erblichem Mamma- und Ovarialkarzinom T1 - Examinations of Cyrillic 2.13 for the Estimation of Mutationrate and the likeliness of disease in hereditary breast- and ovarian cancer N2 - In dieser Arbeit wird anhand eines Würzburger Studienkollektivs von erblich an Brust-und Ovarialkrebs Erkrankten, das 150 Ratsuchende umfasst, das Risikokalkulationsprogramm Cyrillic 2.13 zur Abschätzung von Mutations- und Erkrankungswahrscheinlichkeiten bei erblichem Brust- und Ovarialkrebs untersucht. Es werden die vom Programm berechneten Mutationswahrscheinlichkeiten mit dem tatsächlichen Mutationsstatus der Probanden verglichen. Außerdem werden Stammbäume der Probanden auf Angehörige 1. und 2. Generation gekürzt, um zu untersuchen, ob dies die errechneten Ergebnisse beeinflusst. Es zeigt sich hierbei jedoch kein signifikanter Unterschied. N2 - The risk calculating programme Cyrillic 2.13 for the likeliness of developing hereditary breast- and ovarian cancer is being examined in 150 Probands of Würzburg who had already been tested for mutations in brca -genes. It was known whether they had or did not have a mutation. The results are being compared to those calculated by Cyrillic 2.13 depending on their pedegree. The probands' pedigrees then were reduced to only first- and second degree relatives in order to figure out whether there is an influence on the calculated mutation rate or not. The results show, that there is no significant difference between the mutation rates offered by the programme compared to those tested for the probands. KW - Brustkrebs KW - Eierstockkrebs KW - Excelsior Cyrillic KW - Genmutation KW - Mutationswahrscheinlichkeit KW - Rechenprogramme KW - Cyrillic 2.13 KW - Erkrankungswahrscheinlcihkeit KW - Mutationrate KW - Breastcancer KW - Ovariancancer KW - Cyrillic 2.13 Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65757 ER - TY - THES A1 - Meier, Daniel T1 - Konservierte transkriptionelle Regulationsmechanismen der Fanconi Anämie core complex Gene T1 - Conserved regulatory mechanisms of the Fanconi anemia core complex genes N2 - Fanconi Anämie (FA) ist eine autosomal rezessive, im Falle der Untergruppe FA-B X-chromosomale Erbkrankheit, die mit chromosomaler und genomischer Instabilität verbunden ist und sich durch große phänotypische und genetische Heterogenität auszeichnet. Symptomatisch sind Knochenmarksversagen, eine Vielfalt angeborener Fehlbildungen, die weit überdurchschnittliche Disposition für akute myeloische Leukämie (AML), Plattenepithelkarzinome (SCC) sowie eine zelluläre Hypersensitivität gegenüber DNA Doppelstrangvernetzenden Substanzen. FA wird kompliziert durch ein progressives Knochenmarksversagen. Die FA Proteine sind essentiell für die interstrand crosslink (ICL) repair sowie an anderen DNA Reparatursystemen, beteiligt. Bisher wurden hauptsächlich Regulationsmechanismen untersucht, die die FA Proteine betreffen. Die Regulation der Transkripte war bisher nahezu unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation der sogenannten FA core complex Gene untersucht. Dabei handelt es sich um acht Gene, deren Produkte im Falle eines DNA Schadens den ersten Proteinkomplex des FA/BRCA Signalweges bilden. Für diese acht Gene wurden in dieser Arbeit die Promotoren identifiziert und ihr Aktivierungspotential charakterisiert. Dabei stellte sich heraus, dass diese ein starkes Potential für die Transkriptionsinitiierung besitzen. Des Weiteren zeigten sich Gemeinsamkeiten in Form von Sequenzmotiven sowie Transkriptionsfaktorbindestellen, die in allen core complex Genen nahezu identisch waren. Durch diese Analysen ergaben sich Hinweise, dass die untersuchten Gene durch Mitglieder des JAK/ STAT (STAT1/4) sowie des TGF-b Signalwegs (SMAD1/4) reguliert werden. Funktionelle Untersuchungen mittels siRNA sowie Fibroblastenzelllinen, die biallelische FANCA Mutationen trugen, bestätigten diese Verbindungen. So hatte der knockdown der entsprechenden Transkriptionsfaktoren einen reduzierenden Einfluss auf die Transkriptmenge der core complex Gene. FANCA-mutierte Zelllinen weisen reduzierte mRNAs von STAT und SMAD auf. Darüber hinaus fanden sich signifikante Änderungen der Transkriptmenge in 112 verschiedenen Mitgliedern dieser Signalwege in den FA-A Zellinien. Eines dieser Mitglieder, IRF1, zeigte fast identische Ergebnisse wie sie bei STAT1/4 sowie SMAD1/4 beobachtet werden konnten. Die vorliegende Arbeit trägt dazu bei, die transkriptionelle Regulation der core complex Gene besser zu verstehen. Die auffälligen Gemeinsamkeiten ihrer Regulation liefern neue Argumente für eine Koevolution dieser Gene. N2 - Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive, in the case of subgroup B X-linked, disease that is characterized by chromosomal and genomic instability. FA reveals remarkable phenotypic and genetic heterogeneity. Clinical symptoms include the variable presence of typical congenital malformations, progressive bone marrow failure, and a pronounced predisposition for the occurrence of malignancies such as acute myelogenous leukemia (AML) and squamous cell carcinoma (SCC). The FA proteins are essential for the repair of DNA-interstrand crosslinks and are members of the DNA damage response network. This is why FA cells are hypersensitive to agents inducing doublestrand lesions. In the past, a major topic of research was the interaction of the FA proteins. In this thesis work, transcriptional regulation of the FA core complex genes was investigated. These genes include eight members that form, in response to DNA damage, the first protein complex acting in the FA/BRCA pathway. As part of this thesis, the promoters of the FA core complex genes were identified, and their potential for transcriptional activation was studied. All of them revealed strong power for transcriptional activation. There were marked similarities among them including the presence of two shared sequence motifs, of transcription factor binding sites and in the presence of repressor elements defining them as bipartite in their nature. These analyses provided clues that these genes are regulated, in part, by components of theJAK/ STAT (STAT1/4) and the TGF-ß signaling pathways. Functional studies including knockdown experiments or using fibroblast lines with biallelic mutations in FANCA confirmed these connections. Down-regulation of the designated transcription factors decreased the transcript levels of the FA core complex genes. Likewise, FANCA-mutant cell lines showed reduced amounts of mRNA of STAT and SMAD. Moreover, there were significant changes in the expression of 112 members of the corresponding signaling pathways in FA-A cell lines. The present work contributes to a better overall understanding of the transcriptional regulation of the FA core complex genes. Shared similarities provide arguments in favor of a co-evolution of these genes. KW - Fanconi Anämie KW - Genregulation KW - DNS-Reparatur KW - Fanconi Anämie KW - Genregulation KW - DNA-Reparatur KW - Fanconi Anemia KW - Genregulation KW - DNA-Repair Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65552 ER - TY - THES A1 - Mattern, Felix T1 - Alterungsbedingte Effekte auf DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene in Eizellen und Embryonen am Modellorganismus Bos taurus T1 - Aging-induced effects on DNA methylation profiles of developmental genes in oocytes and embryos on the model organism Bos taurus N2 - Die postovulatorische Alterung sowie die ovarielle Alterung konnten bei der Anwendung assistierter Reproduktionstechniken (ARTs) als entscheidende Faktoren identifiziert werden, die den Reproduktionserfolg nachhaltig beeinträchtigen. Die postovulatorische Alterung tritt ein, sobald die reife Eizelle nicht mehr innerhalb ihres physiologischen Zeitfensters befruchtet wird. Die ovarielle Alterung beschreibt hingegen die Abnahme des Follikel-Vorrats mit zunehmendem Alter des weiblichen Individuums bzw. des Ovars. Sowohl die postovulatorische Alterung als auch die ovarielle Alterung führen u.a. zu einer reduzierten Oozytenqualität und einer geringeren Blastozystenrate. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss der postovulatorischen Alterung und der ovariellen Alterung im Holstein-Rind (Bos taurus) auf die DNA-Methylierung entwicklungsrelevanter Gene in Eizellen und Embryonen zu untersuchen. Aus Schlachthof-Ovarien wurden Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) isoliert. Eizellen aus Follikeln der Größe 3-5 mm wurden für 24h (physiologisch) und 48h (gealtert) in vitro gereift (IVM). Die gereiften Oozyten wurden anschließend in vitro fertilisiert und Embryonen im 4-6 Zellstadium generiert. Sowohl in den unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe als auch in den gereiften Oozyten und den Embryonen wurde die Promotormethylierung der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo und bDNMT3Ls analysiert. Zur Untersuchung der ovariellen Alterung wurden mittelgroßen Antralfollikel aus Ovarien lebender Rinder (in vivo) unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) gewonnen. In den daraus isolierten unreifen Eizellen wurde die DNA-Methylierung der Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN bestimmt. Als Methode zur Analyse der Promotormethylierung wurde die Limiting Dilution Bisulfit-Sequenzierung angewendet. In unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) konnte ein erhöhtes Auftreten abnormal methylierter Allele in den geprägten Genen bH19 und bSNRPN von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) identifiziert werden. Dieses Ergebnis könnte eine mögliche Ursache einer bereits bekannten und mehrfach beschriebenen geringeren Entwicklungskompetenz von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) auf epigenetischer Ebene darstellen. Die verlängerte Reifungsdauer der IVM-Eizellen hatte eine signifikante Hypermethylierung in der Promotorregion des Gens DNMT3Lo von 48h-gereiften Eizellen zur Folge. Beim Übergang von 48h-gereiften Eizellen zum Embryo konnte eine signifikante Hypomethylierung von CpG7 des stammzellspezifischen Transkripts DNMT3Ls beobachtet werden. Diese CpG-Stelle wies ebenfalls einen signifikanten Anstieg von CpGs mit nicht-eindeutigem Methylierungszustand in unreifen Eizellen mit steigender Follikelgröße auf. Da sich die CpG-Position innerhalb eines Sequenz-Motivs einer Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors CREB befindet, könnten die Methylierungsdaten auf eine Interaktion zwischen dem Transkriptionsfaktor CREB und der DNA-Methylierung während der Entwicklung und Reifung der Eizelle sowie der Transition von der Eizelle zum Embryo hindeuten. Die DNA-Methylierungsprofile der untersuchten Gene in unreifen Eizellen aus Kühen unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) wiesen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Altersgruppen auf. Die ovarielle Alterung bei Rindern zwischen 9 Monaten und 11 Jahren zeigte damit keinen Effekt auf die DNA-Methylierung der untersuchten Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN. Nach einer simulierten postovulatorischen Alterung durch eine in vitro Reifung für 48h konnte eine Veränderung der DNA-Methylierung der Oozyten-spezifischen (DNMT3Lo) und Stammzell-spezifischen (DNMT3Ls) Promotoren des katalytisch inaktiven Cofaktors von DNMT3A, DNMT3L, beobachtet werden. Die veränderte DNA-Methylierung von DNMT3Ls tritt dabei erst im frühen Embryo in Erscheinung und interagiert vermutlich mit dem Transkriptionsfaktor CREB. Die Veränderungen von DNMT3Lo in Eizellen und DNMT3Ls in den daraus generierten Embryonen lässt vermuten, dass es sich hierbei um eine dynamische Anpassung des Embryos auf äußere Umweltbedingungen der Eizelle über die Methylierung der DNA handelt. N2 - Postovulatory aging and ovarian aging have been identified as key factors in assisted reproductive techniques (ARTs) and have a lasting effect on reproductive success. Postovulatory aging occurs if the mature egg is not fertilized within its physiological time window. On the other hand, ovarian aging describes the decrease in the follicular reserve with increasing age of the female or the ovary, respectively. Both post-ovulatory aging and ovarian aging result in reduced oocyte quality and lower blastocyst rate. The aim of this thesis was to explore the effects of postovulatory aging and ovarian aging in Holstein cattle (Bos taurus) on the DNA methylation of developmentally important genes in oocytes and embryos. Antral follicles of different sizes (<2 mm, 3-5 mm and> 6 mm) were isolated from slaughterhouse ovaries. Female germ cells from middle-sized follicles (3-5 mm) were matured for 24h (physiological conditions) and 48h (aged conditions) in vitro (IVM). The IVM- oocytes were subsequently fertilized in vitro and embryos at the 4-6 cell stage were generated. Promoter methylation of the genes bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo and bDNMT3Ls was analysed in immature oocytes from antral follicles of different sizes as well as in matured oocytes and the respective embryos. For studying ovarian aging, middle-sized antral follicles were obtained in vivo from animals of different age groups (9-12 months, 3-7 years and 8-11 years). In the extracted immature gametes, the DNA methylation of the promoter regions of bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN was examined. The limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing method was applied to determine the promoter methylation of the candidate genes at the single allele level. In immature oocytes from antral follicles of different diameters (<2 mm, 3-5 mm and> 6 mm) an increased occurrence of abnormally methylated alleles of the imprinted genes bH19 and bSNRPN was identified in small follicles (<2 mm). This failure to establish imprinting could be a possible cause of a well-known reduced developmental potential of small follicles (<2 mm) at the epigenetic level. The extended maturation time of the IVM-oocytes resulted in a significant hypermethylation in the promoter region of DNMT3Lo in 48h matured oocytes. After transition from 48h matured oocytes to embryos, a significant hypomethylation of CpG7 of the stem cell specific transcript DNMT3Ls was detected. The same CpG site showed a significant increase of CpGs with unclear methylation state in immature female germ cells with increasing follicular size. This CpG position is located within a potential binding site of the transcription factor CREB. Thus, the methylation data indicates an interaction between the transcription factor CREB and the DNA methylation during development and maturation of oocytes as well as during transition from the oocyte to the embryo. The DNA methylation profiles of the analysed genes in immature oocytes from cows of different age (9-12 months, 3-7 years and 8-11 years) showed no significant differences between age groups. Hence, the ovarian aging in cattle between 9 months and 11 years caused no effect on the DNA methylation of bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN. After a simulated postovulatory aging by in vitro maturation for 48h, a change in the DNA methylation of the oocyte-specific (DNMT3Lo) and stem cell-specific (DNMT3Ls) promoters of the catalytically inactive DNA-methyltransferase DNMT3L was observed. The altered DNA methylation of DNMT3Ls occurs in the early embryo and probably interacts with the transcription factor CREB. The changes of DNMT3Lo in oocytes and DNMT3Ls in the resulting embryos might represent a dynamic adaptation to external environmental conditions. KW - Oozyte KW - Epigenetik KW - Altern KW - DNS-Methyltransferase KW - Ovarielle Alterung KW - Postovulatorische Alterung KW - Antralfollikel KW - Holstein Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144562 ER - TY - THES A1 - Marquardt, Andreas T1 - Positionsklonierung des Morbus Best-Gens VMD2 T1 - Positional cloning of the Best's Disease gene VMD2 N2 - Die Dissertation beschreibt die Positionsklonierung von VMD2, einem Krankheitsgen des Menschen, dass der dominant vererbten vitelliformen Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) zugrundeliegt. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein etwa 1.4 Mbp großer Klon-'Contig' aus artifiziellen Phagenchromosomen ('phage artificial chromosomes', PAC) erstellt, der die VMD2-Kandidatengenregion auf Chromosom 11q12-q13.1 physikalisch repräsentiert. Durch die Identifizierung polymorpher (CA)n-Dinukleotidmarker aus dem kritschen Intervall und anschließender Kopplungsanalyse gelang es, die Kandidatengenregion auf ca. 500 kbp zu reduzieren. In der öffentlichen Datenbank (GenBank) bereitgestellte Nukleinsäuresequenzen zweier genomischer Klone aus dem Kern des relevanten chromosomalen Bereichs von zusammen etwa 290 kbp wurden dazu genutzt, über eine Kombination aus computergestützter Vorhersagen kodierender Sequenzen, Kartierung von EST-Klonen ('expressed sequence tags'), RT-PCR-Analysen und, wenn erforderlich, 5'-RACE-Experimenten, acht neue Gene des Menschen zu isolieren. Von den charakterisierten Genen erwiesen sich mehrere als potentielle Kandidaten für VMD2. Ein Gen, provisorisch als Transkriptionseinheit TU15B bezeichnet, konnte durch eine Mutationsanalyse schließlich eindeutig mit der Erkrankung assoziiert werden und wurde 1998 als VMD2 publiziert. Drei Gene aus der untersuchten Region kodieren Mitglieder einer Familie von Fettsäuredesaturasen (FADS1, FADS2 und FADS3), während ein anderes Gen ('Rabin3 interacting protein-like 1'; RAB3IL1) signifikante Sequenzidentität zu einem Transkript der Ratte besitzt, welches das GTPase-interagierende Protein Rabin3 kodiert. Den putativen Translationsprodukten drei weiterer Gene (C11orf9, C11orf10 und C11orf11) konnte bislang keine präzise Funktion zugeschrieben werden. Mit FTH1 ('ferritin heavy chain 1') und FEN1 ('flap endonuclease 1') liegen zudem zwei bekannte Gene im analysierten Intervall, deren cDNA-Sequenzen bereits 1984 bzw. 1995 von anderen Forschungsgruppen isoliert und publiziert wurden. Zweifellos kann die Region als sehr genreicher Abschnitt des menschlichen Genoms bezeichnet werden. Neben der Erstellung des PAC-'Contigs', der Einengung der VMD2-Kandidatenregion und der Klonierung von VMD2 war die vollständige genetische Charakterisierung der genannten Fettsäuredesaturase-Gene ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit. Unabhängig von der Klonierung und Charakterisierung des VMD2-Gens sowie der chromosomal eng benachbarten Gene, richtete sich mein Interesse schließlich noch auf drei Gene des Menschen, provisorisch als TU51, TU52 und TU53 bezeichnet, die gemeinsam mit VMD2 eine Genfamilie bilden und auf den Chromosomen 19p13.2-p13.12 (TU51), 12q14.2-q15 (TU52) und 1p32.3-p33 (TU53) lokalisiert werden konnten. Durch die Aufklärung der kodierenden Nukleinsäuresequenzen der Gene wurden konservierte Sequenzabschnitte innerhalb der Genfamilie erkennbar, die auf wichtige funktionelle Abschnitte der Translationsprodukte schließen lassen. N2 - This work describes the positional cloning of the VMD2 gene responsible for vitelliform macular dystrophy type 2 (VMD2), a dominantly inherited eye disorder in human. A physical contig of phage artificial chromosomes (PAC clones) covering 1.4 Mbp of genomic sequence was established, representing the entire VMD2 candidate region on chromosome 11q12-q13.1. Identification and subsequently linkage analysis of polymorphic (CA)n-dinucleotide repeats was performed to refine the critical interval to approximately 500 kbp. Genomic sequences of approximately 290 kbp from the central part of the VMD2 candidate region, available at the public database (GenBank), were helpful to reveal the structure of eight novel genes by using computational exon prediction, comprehensive mapping and assembling of expressed sequence tags (ESTs), RT-PCR and 5'-RACE analysis. Some of the identified genes were found to represent excellent candidates for VMD2. One gene, provisionally designated 'transcription unit 15B' (TU15B) has been shown to be associated with the disease and was published as VMD2 in 1998, according to the official gene nomenclature. Three genes encode family members of the human fatty acid desaturases (FADS1, FADS2 and FADS3), one gene (rab interacting protein like 1, RAB3IL1) shows high sequence identity to Rabin3, an GTPase-interacting protein first described in rat and another three genes encode proteins of unknown function (C11orf9, C11orf10, C11orf11). Additional two genes localized in the same region, FTH1 (ferritin heavy chain 1) and FEN1 (flap endonuclease 1), have been characterized previously by other research groups. The analyzed interval represents a gene-rich segment of the human genome. In addition to the assembly of PAC clones from the VMD2 candidate region, the refinement of the critical interval using polymorphic dinucleotide repeats and the cloning of VMD2, this work also includes the complete characterization of the three fatty acid desaturase genes. Finally, three genes, provisionally termed TU51, TU52 and TU53 showed high sequence identity to VMD2 and were characterized as paralogous members of the VMD2 gene family. The corresponding gene loci were assigned to chromosome 19p13.2-p13.12 (TU51), 12q14.2-q15 (TU52) and 1p32.3-p33 (TU53), respectively. By determining the coding nucleic acid sequences of the genes conserved sequence elements in the gene family were identified, possibly representing functional important protein domains. KW - Makuladystrophie KW - Genort KW - VMD2 KW - Morbus Best KW - Makuladystrophie KW - Makuladegeneration KW - Positionsklonierung KW - Fettsäuredesaturasen KW - FADS1 KW - FADS2 KW - FADS3 KW - VMD2 KW - Best's Disease KW - macula dystrophy KW - macular degeneration KW - positional cloning KW - fatty acid desaturases KW - FADS1 KW - FADS2 KW - FADS3 Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-414 ER - TY - THES A1 - Maierhofer, Anna T1 - Altersassoziierte und strahleninduzierte Veränderungen des genomweiten DNA-Methylierungs-Profils T1 - Age-associated and radiation-induced changes in genome-wide DNA methylation N2 - Der Prozess des Alterns ist ein komplexer multifaktorieller Vorgang, der durch eine sukzessive Verschlechterung der physiologischen Funktionen charakterisiert ist. Ein hohes Alter ist der Hauptrisikofaktor für die meisten Krankheiten, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Das Verständnis der epigenetischen Mechanismen, die in den Prozess des Alterns involviert sind, könnte zur Entwicklung pharmakologischer Interventionen beitragen, die nicht nur die Lebenserwartung erhöhen, sondern auch den Beginn des altersassoziierten funktionellen Abbaus verzögern könnten. Durch die Langzeit-Kultivierung primärer humaner Fibroblasten wurde ein in vitro Modell für das Altern etabliert, das die Identifizierung altersassoziierter DNA-Methylierungs-Veränderungen ermöglichte. Die in vitro Alterung konnte mit einer globalen Hypomethylierung und einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA assoziiert werden. Darüber hinaus konnten DNA-Methylierungs-Veränderungen in Genen und Signalwegen, die für das Altern relevant sind, und ein erhöhtes epigenetisches Alter nachgewiesen werden. Das in vitro Modell für das Altern wurde verwendet, um neben den direkten Effekten ionisierender Strahlung auf die DNA-Methylierung auch deren Langzeit-Effekte zu untersuchen. Die Strahlentherapie ist ein entscheidendes Element der Krebstherapie, hat aber auch negative Auswirkungen und kann unter anderem das Risiko für die Entwicklung eines Zweittumors erhöhen. Bei externer Bestrahlung wird neben dem Tumor auch gesundes Gewebe ionisierender Strahlung ausgesetzt. Daher ist es wichtig zu untersuchen, wie Zellen mit intakten DNA-Reparatur-Mechanismen und funktionierenden Zellzyklus-Checkpoints durch diese beeinflusst werden. In der frühen Phase der DNA-Schadensantwort auf Bestrahlung wurden in normalen Zellen keine wesentlichen DNA-Methylierungs-Veränderungen beobachtet. Mehrere Populations-Verdoppelungen nach Strahlenexposition konnten dagegen eine globale Hypomethylierung, eine erhöhte DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und ein erhöhtes epigenetisches Alter detektiert werden. Des Weiteren zeigten Gene und Signalwege, die mit Krebs in Verbindung gebracht wurden, Veränderungen in der DNA-Methylierung. Als Langzeit-Effekte ionisierender Strahlung traten somit die mit der in vitro Alterung assoziierten DNA-Methylierungs-Veränderungen verstärkt auf und ein epigenetisches Muster, das stark an das DNA-Methylierungs-Profil von Tumorzellen erinnert, entstand. Man geht davon aus, dass Veränderungen der DNA-Methylierung eine aktive Rolle in der Entwicklung eines Tumors spielen. Die durch ionisierende Strahlung induzierten DNA-Methylierungs-Veränderungen in normalen Zellen könnten demnach in die Krebsentstehung nach Strahlenexposition involviert sein und zu dem sekundären Krebsrisiko nach Strahlentherapie beitragen. Es ist bekannt, dass Patienten unterschiedlich auf therapeutische Bestrahlung reagieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die individuelle Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung auch auf epigenetischer Ebene beobachtet werden kann. In einem zweiten Projekt wurden Gesamtblutproben von Patienten mit Werner-Syndrom, einer segmental progeroiden Erkrankung, und gesunden Kontrollen analysiert, um mit dem vorzeitigen Altern in Verbindung stehende DNA-Methylierungs-Veränderungen zu identifizieren. Werner-Syndrom konnte nicht mit einer globalen Hypomethylierung, jedoch mit einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und einem erhöhten epigenetischen Alter assoziiert werden. Das vorzeitige Altern geht demzufolge mit spezifischen epigenetischen Veränderungen einher, die eine Beschleunigung der mit dem normalen Altern auftretenden DNA-Methylierungs-Veränderungen darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Bedeutung epigenetischer Mechanismen im Prozess des Alterns hervorgehoben werden und gezeigt werden, dass sowohl exogene Faktoren, wie ionisierende Strahlung, als auch endogene Faktoren, wie das in Werner-Syndrom-Patienten mutiert vorliegende WRN-Gen, altersassoziierte DNA-Methylierungs-Veränderungen beeinflussen können. N2 - Aging is a complex, multifactorial process that is characterized by the successive deterioration of normal physiological functions. Age is the main risk factor for most diseases, including cancer. Understanding the epigenetic mechanisms that are involved in the aging process could contribute to the development of pharmacological interventions not only increasing lifespan but also delaying the onset of age-dependent functional decline. An in vitro model for aging was established by long-term culturing of primary human fibroblasts and used to identify age-associated changes in DNA methylation. In vitro aging could be linked to global hypomethylation, elevated DNA methylation of ribosomal DNA, a higher epigenetic age and alterations in DNA methylation of genes and pathways being relevant for aging. The in vitro model for aging allowed to analyse the long-term effects of ionizing radiation on DNA methylation in addition to their direct effects. Radiotherapy is an important element of cancer treatment but can also have negative effects and increase the risk of second cancers. Although radiotherapy is targeted to the tumour, it also affects the surrounding healthy tissue. Therefore, it is important to analyse the impacts of ionizing radiation on normal cells with intact DNA repair and cell cycle checkpoints. The early phase of DNA damage response to radiation does not seem to include great changes in DNA methylation in normal cells. In contrast, several population doublings after radiation exposure, global hypomethylation and DNA methylation changes of genes and pathways being linked to tumorigenesis were detected. Furthermore, DNA methylation of ribosomal DNA and the epigenetic age were increased. Thus, as long-term effects of ionizing radiation the age-associated changes in DNA methylation were enhanced and an epigenetic pattern strongly resembling the DNA methylation profile of tumour cells was observed. It is assumed that alterations in DNA methylation are not only side effects of carcinogenesis but rather play an active role during this process. Radiation-induced changes in DNA methylation could thus be involved in tumour development and contribute to the secondary cancer risk after radiotherapy. It is well known that patients react differently to therapeutic radiation. The results of this study suggest that individual radiation sensitivity is also reflected on epigenetic level. In a second project whole blood samples from patients with Werner syndrome, a segmental progeroid syndrome, and healthy controls were analysed to identify changes in DNA methylation associated with premature aging. Werner syndrome could not be linked to global hypomethylation, but to an increased epigenetic age and elevated methylation levels of ribosomal DNA. Hence, premature aging seems to be accompanied by specific alterations in DNA methylation representing an acceleration of the DNA methylation changes associated with normal aging. This work outlines the importance of epigenetic mechanisms in the aging process and shows that not only exogenous factors like ionizing radiation but also endogenous factors like Werner syndrome causing mutations in the WRN gene can influence age-associated changes in DNA methylation. KW - Methylierung KW - Ionisierende Strahlung KW - Altern KW - Progeria adultorum KW - Epigenetik KW - Epigenetische Uhr Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174134 ER - TY - THES A1 - Macht, Anna T1 - Pränatale FISH-Diagnostik am Institut für Humangenetik der Universität Würzburg im Zeitraum von 01/1998-08/1999 T1 - Prenatal diagnosis using FISH at the Institut Institut für Humangenetik der Universität Würzburg in between 01/1998-08/1999 N2 - Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hat in viele Gebiete der modernen Medizin und Biologie Einzug gehalten. Ein wichtiges Anwendungsfeld hat sie in der pränatalen Diagnostik gefunden. An kultivierten Interphasekernen sowie Metaphasechromosomen eingesetzt kann sie zusätzliche Informationen zur zytogenetischen Analyse liefern. Chromosomenspezifische Sonden können auch auf native Fruchtwasserzellen, Chrorionzottenzellen und fetale Blutzellen hybridisiert werden. Seit einigen Jahren wird FISH an unkultivierten Amniozyten bei bestimmten Indikationen ergänzend zur herkömmlichen Chromosomenanalyse durchgeführt. Nach der Hybridisierung werden die Prozentsätze der Kerne mit disomem (2 Signale) und aberrantem (z.B. 3 Signale bei Trisomie) Signalmuster analysiert. Für eine zuverlässige Information müssen mindestens 50 Kerne pro Sonde ausgewertet werden. Bei weniger als 10 Prozent aneuploiden Kernen wird das Ergebnis als unauffällig gewertet, bei mehr als 60 Prozent aberranten Kernen als auffällig und dazwischen als uneindeutig bzw. kontrollbedürftig. Die konventionelle Chromosomenanalyse erfordert in der Regel ein 2-3wöchige Zellkultur. Das Ergebnis der FISH-Analyse ist dagegen nach 1-3 Tagen erhältlich, verkürzt so die für die werdende Mutter oft quälende Wartezeit beträchtlich und ist damit besonders für Hochrisikogruppen geeignet. Mit FISH für die Chromosomen 13, 18, 21 und XY können können bis zu 90 Prozent der im 2. Trimenon erwarteten Chromosomenanomalien diagnostiziert werden. 10-15 Prozent der Anomalien, z.B. strukturelle Aberrationen können mit dieser Methode grundsätzlich nicht erfasst werden. Technische Probleme, wie z.B. Versagen der Hybridisierung, eine zu geringe Anzahl auswertbarer Kerne oder eine Kontamination der nativen Fruchtwasserprobe mit Zellen mütterlichen Ursprungs können die Aussagekraft des Tests beträchtlich herabsetzen. In der vorliegenden Arbeit werden die ersten 129 FISH-Untersuchungen an unkultivierten Fruchtwasserproben, die am Institut für Humangenetik in Würzburg in der klinischen Diagnostik durchgeführt wurden, retrospektiv aufbereitet. Die einzelnen Fälle werden nach den oberngenannten Kriterien in Gruppen mit unauffälligen, auffälligen und problematischen FISH-Befunden aufgeteilt. Der Anteil der letztgenannten Gruppe ist recht groß: In lediglich 20 Prozent (n=26) der Fälle konnten 50 Zellkerne pro Sonde ausgewertet werden, in 22 Prozent (n=28) der Fälle war das Ergebnis mit 10-60 Prozent aberranten Kernen uneindeutig und in 26 Prozent (n=33) der Fälle schlug die Hybridisierung für mindestens eine Sonde fehl. Dennoch konnten 79 Prozent (15/19) der erkennbaren Anomalien korrekt identifiziert werden: 5 Trisomie 21-Fälle, darunter eine Robertson-Translokation, 3 Trisomie 18-Fälle, 4 Fälle mit Triploidie, 2 Fälle mit Monosomie X und eine Fall mit dem Chromosomensatz 48, XXY, +21. Nicht diagnostiziert wurden aufgrund von fehlgeschlagener Hybridisierung 2 Fälle mit Trisomie 21 und ein Fall mit Trisomie 13. ein Fall von Trisomie 18 zeigte ein unauffälliges Signalmuster. Es traten keine falsch positiven Befunde auf. Fünf Fälle mit strukturellen Aberrationen entgingen der FISH-Analyse. In der folgenden Arbeit werden die Anzahl auswertbarer Kerne, die Signalverteilung in den verschiedenen Gruppen, Probleme bei Hybridisierung oder Auswertung und beeinflussende Faktoren wie Indikation, Gestationsalter, Farbe und Menge des Fruchtwassers beschrieben. In der Diskussion wird auf grundsätzliche technische Besonderheiten der FISH-Analyse eingegangen, wie z.B. Sondenqualität, Gestationsalter und Zellzahl. Das Problem der Kontamination der Fruchtwasserproben mit mütterlichen Zellen wird erläutert. Anschließend wird nochmals auf die pathologischen, problematischen und diskrepanten FISH-Befunde eingegangen. Daten und Erfahrungen verschiedener Arbeitsgruppen aus der Literatur werden jeweils berücksichtigt und mit den eigenen Daten in Beziehung gesetzt. Sensitivität und Spezifität der Methode werden diskutiert. FISH kann eine wertvolle Ergänzung zum Goldstandard der pränatalen Diagnostik und insbesondere der psychischen Entlastung der Patientin dienen. Einen vollständigen Ersatz der konventionellen Technik kann sie wegen der oben erwähnten Limitationen nicht bieten. Die Entscheidung über die Anwendung der FISH-Diagnostik, wie auch der Pränataldiagnostik überhaupt, sollte der betroffenen Frau überlassen werden und erst nach ausführlicher Information über Vor- und Nachteile sowie mögliche Konsequenzen, im Idealfall im Rahmen einer Genetischen Beratung, erfolgen. N2 - Fluorescence-in-situ-hybridization (FISH) on metaphase- and interphase chromosomes has been introduced in many fields of modern medicine and biology. One important application it has found in prenatal diagnosis. Used with cultivated interphase cells or metaphase chromosomes it can provide additional information to cytogenetic analysis. Chromosome specific probes can also be hybridized on native amniotic fluid cells, chorionic villus cells and fetal blood cells. Since several years FISH on uncultivated amniotic fluid cells has been carried out under certain indications in addition to conventional chromosome analysis. After hybridization the percentages of nuclei with disomic (2 signals) or aberrant (e.g. 3 signals in case of trisomy) signal patterns are analysed. For reliable information it is necessary to analyse 50 or more nuclei per probe. A case is classified as normal for the tested chromosome if less than 10 per cent of the cells show aberrant signals and it is classified as beiing aberrant if more than 60 per cent of nuclei are with aberrant signal patterns. If 10-60 per cent aberrant signals are counted the result is judged to be uncertain. For conventional cytogenetic analysis amniotic fluid cells have to be cultivated for 2-3 weeks. With FISH on uncultured amniocytes the result is available after 1-3 days. So waiting time which is often very stressful for the pregnant woman can be decreased and therefore the method is of special use in high risk groups. With FISH for chromosomes 13, 18 21 and XY up to 90 per cent of the chromosomal disorders expected in the second trimester can be discovered. 10-15 per cent of the abnormalities, e.g. structural aberrations cannot be diagnosed by FISH. Technical problems like failure of hybridization, to less countable nuclei or contamination of the native amniotic fluid sample with cells of maternal origin can decrease the reliability of the test significantly. In this study are represented the first 129 FISH analyses on uncultured amniotic fluid samples which were carried out at the Institut für Humangenetik in Würzburg. Following the abovementioned guidelines the different cases are divided in groups with normal, abnormal and problematic FISH results. The latter group is rather big: in only 20 per cent (n=26) of cases 50 nuclei per probe could be analysed. In 22 per cent (n=28) the result was uncertain with 10-60 per cent abnormal cells and in 26 per cent (n=33) of cases hybridization failed for at least one of the probes. 79 per cent (15/19), however, of the detectable abnormalities could be identified correctly: 5 cases of trisomy 21, of these one robertsonian translocation, 3 cases of trisomy 18, 4 cases of triploidy, 2 cases of monosomy X and one case with 48, XXY, +21. Because of failure of hybridization 2 cases of trisomy 21 and one case of trisomy 13 could not be detected. One case of trisomy 18 showed normal signal patterns. There were no false positive findings. Five structural aberrations could not be diagnosed by FISH analysis. In the following study the number of analysable nuclei, the signal patterns in the different groups, problems with hybridization or analysis, and influencing factors like indications, gestational age, colour and amount of amniotic fluid are described. In the discussion technical issues like quality of the probes, age of gestation, number of cells and the problem of maternal cell contamination are illustrated. Normal, abnormal and problematic FISH findings are related with dates and experiences of other authors in the literature. Sensitivity and specificity of the method are discussed. FISH can be a valuable tool in prenatal diagnosis in addition to the gold standard of cytogenetic analysis and especially contribute to the relief of patients, which often suffer from substantial anxietes. Because of the described limitations it cannot completely substitute the conventional technique. The decision of applying FISH and of generally applying prenatal diagnosis has to be taken by the pregnant woman. It requires full information about advantages, disadvantages and possibly consequences, which at best should be provided by a complete genetic counselling. KW - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung KW - FISH KW - Pränatale Diagnostik KW - Fruchtwasserzellen KW - Chromosomenaberrationen KW - Fluorescence-in-situ-hybridization KW - FISH KW - prenatal diagnosis KW - amniotic fluid cells KW - chromosomal aberrations Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-308 ER - TY - THES A1 - Löwe, Julia Irmgard T1 - Genetische Erkrankungen bei Figuren in der Märchensammlung der Brüder Grimm T1 - Genetic diseases in the characters of the brothers Grimm fairy-tale collection N2 - Wissenschaftliche Untersuchung über einzelne humangenetische Erkrankungsbilder, welche mit bestimmten Märchenfiguren korreliert werden können. N2 - Scientific study of human genetic diseases, which can be correlated with certain fairy-tale characters. KW - Brüder Grimm KW - genetische Erkrankungen KW - brothers grimm KW - genetic diseases Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69774 ER - TY - THES A1 - Luber, Verena T1 - Einfluss des Keimzellmosaiks auf die Segregation bei den Muskeldystrophien Duchenne und Becker T1 - The Influence of germline mosaicism to the muscular dystrophies Duchenne and Becker N2 - Schätzung der Segregation beim Keimzellmosaik in Familien mit DMD/BMD anhand ausgewählter Stammbäume zur Verbesserung der Situation in der genetischen Beratung N2 - Estimation of the segregation in DMD/BMD-families with germ-line mosaicism with the help of selected pedigrees to improve the situation in genetic counseling KW - Duchenne-Syndrom KW - Muskeldystrophie KW - DMD KW - BMD KW - Muskeldystrophie Duchenne KW - Muskeldystrophie Becker KW - Keimzellmosaik KW - Segregation KW - germinal mosaicism KW - germ-line mosaicism KW - duchenne muscular dystrophy KW - becker muscular dystrophy Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65866 ER - TY - THES A1 - Lekszas, Caroline T1 - Erweiterung des genetischen Mutationsspektrums verschiedener Krankheitsbilder und Identifizierung neuer krankheitsrelevanter Gene im Menschen mittels Whole Exome Sequenzierung T1 - Expansion of the genetic mutation spectrum of different pathologies and identification of new disease-relevant genes in humans by means of Whole Exome Sequencing N2 - Trotz der rasanten Entwicklung molekulargenetischer Analysemethoden sind die Auslöser vieler Erbrankheiten bislang ungeklärt. Eine Identifikation der genetischen Ursache einer Erkrankung ist jedoch essenziell, um zusätzliche invasive Tests vermeiden, adäquate Therapiemaßnahmen in die Wege leiten, akkurate Prognosen stellen und eine entsprechende genetische Beratung anbieten zu können. Next Generation Sequencing (NGS)-basierte Techniken wie die Whole Exome Sequenzierung (WES) haben die humangenetische Forschung und Diagnostik in den letzten Jahren revolutioniert. Die WES ermöglicht die Sequenzierung der Exons aller proteincodierenden Gene von mehreren Individuen gleichzeitig und stellt ein hilfreiches Werkzeug bei der Suche nach neuen kranheitsrelevanten Genen im Menschen dar. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Aufklärung genetischer Ursachen verschiedenster Erkrankungen in konsanguinen Familien aus dem nahen und mittleren Osten mittels WES. Insgesamt wurden 43 Patienten mit unterschiedlichen Krankheitsbildern untersucht, darunter viele mit Skelettdysplasien oder Neuropathien. In 22 Fällen (51%) konnte die entsprechende krankheitsverursachende Mutation ausfindig gemacht werden. In 21% der aufgeklärten Fälle wurden Sequenzvarianten detektiert, die in der Literatur bereits als pathogen beschrieben wurden, während 63% bisher noch unbekannte Mutationen in bereits als krankheitsrelevant beschriebenen Genen darstellten. Zudem konnten im Rahmen dieser Arbeit drei neue, für den Menschen krankheitsrelevante Gene identifiziert werden, solute carrier family 10 member 7 (SLC10A7), T-box 4 (TBX4) und MIA SH3 domain ER export factor 3 (MIA3). SLC10A7 codiert für einen Transporter aus der Familie der solute carrier, der in der Plasmamembran verankert ist. In dieser Arbeit geleistete Analyseergebnisse konnten zu der Erstbeschreibung von homozygoten pathogenen SLC10A7-Mutationen als Ursache für eine Skelettdysplasie mit Amelogenesis imperfecta beitragen. Bei TBX4 handelt es sich um einen hochkonservierten Transkriptionsfaktor, der während der embryonalen Entwicklung an der Ausbildung der unteren Extremitäten beteiligt ist. Homozygote pathogene TBX4-Mutationen wurden im Kontext dieser Arbeit erstmalig mit einer posterioren Amelie mit Becken- und Lungenhypoplasie in Verbindung gebracht. MIA3 ist ein Transmembranprotein des endoplasmatischen Retikulums, das eine essenzielle Rolle bei der Proteinsekretion spielt. Die hier vorgestellten Patienten mit homozygoten pathogenen MIA3-Mutationen zeigen eine komplexe syndromale Erkrankung, die sich hauptsächlich in einer Kollagenopathie, Diabetes mellitus und milder mentaler Retardierung manifestiert und ein neues Krankheitsbild darstellt. Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse erweitern somit zum einen das Mutationsspektrum verschiedener bekannter Krankheitsbilder und offenbaren zum anderen neue krankheitsrelevante Gene im Menschen. N2 - Despite the rapid development of molecular genetic analysis methods, the causes of many hereditary diseases are still unknown. However, it is essential to identify the genetic cause of a disease in order to avoid additional invasive tests, to initiate adequate therapeutic measures, to be able to provdide accurate prognoses, and to offer appropriate genetic counselling. Over the past years, Next Generation Sequencing (NGS)-based technologies such as Whole Exome Sequencing (WES) have revolutionized research and diagnostics in human genetics. WES enables sequencing of the exons of all protein-coding genes from several individuals simultaneously and is a powerful tool in identifying new disease-relevant genes in humans. The present work deals with the elucidation of genetic disease causes in consanguineous families from the Near and Middle East by means of WES. A total of 43 patients with various clinical phenotypes were examined, including many with skeletal dysplasias or neuropathies. In 22 cases (51%), the genetic cause of the disease could be found. In 21% of the solved cases, sequence variants were detected that were already described as pathogenic in the literature, while 63% showed previously unknown mutations in genes already described as disease-relevant in humans. In addition, three new disease-relevant genes could be identified within the scope of this work: solute carrier family 10 member 7 (SLC10A7), T-box 4 (TBX4) and MIA SH3 domain ER export factor 3 (MIA3). SLC10A7 encodes a transporter from the family of solute carriers, which is anchored in the plasma membrane. The analysis results performed in this study could contribute to the first description of homozygous pathogenic SLC10A7 mutations as the cause of a novel skeletal dysplasia with amelogenesis imperfecta. TBX4 is a highly conserved transcription factor that is involved in the formation of the lower extremities during embryonic development. Homozygous pathogenic TBX4 mutations were associated for the first time with posterior amelia with pelvic and pulmonary hypoplasia in the context of this study. MIA3 is a transmembrane protein of the endoplasmic reticulum that plays an essential role in the secretory pathway. The patients presented here with homozygous pathogenic MIA3 mutations show a complex syndromal disease manifesting mainly in a collagenopathy, diabetes mellitus, and mild mental retardation, representing a novel clinical picture. The results obtained within the scope of this work expand on the one hand the range of mutations of various known diseases and on the other hand reveal novel disease-relevant genes in humans. KW - Verwandtenehe KW - Exomsequenzierung KW - Konsanguinität KW - autosomal rezessiver Erbgang Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208807 ER - TY - THES A1 - Larsen, Mirjam T1 - Zur genetischen Heterogenität der Muskeldystrophien: alternative genetische Ursachen der Myotonen Dystrophie und FSHD T1 - The genetic heterogeneity of the muscular dystrophies: alternative genetic causes of myotonic dystrophy and FSHD N2 - Die klinische Symptomatik verschiedener erblicher Muskelerkrankungen verläuft oft erstaunlich ähnlich mit Muskelschwäche und -schwund als den hervorstechenden Alltagsproblemen. Dem gegenüber sind die genetischen Grundlagen sehr vielfältig mit > 250 bisher identifizierten Genen (musclegenetable.org). Auch innerhalb eines definierten Krankheitsbildes werden verschiedene genetische Ursachen nebeneinander gefunden, was durch die Verknüpfung in einem gemeinsamen Pathomechanismus begründet sein kann. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit verschiedenen Aspekten dieser genetischen Heterogenität am Beispiel der beiden häufigen Muskelerkrankungen Myotone Dystrophie (DM) und Facioscapulohumerale Muskeldystrophie (FSHD), bei denen alternative genetische Ursachen, sowie anknüpfende Fragestellungen untersucht wurden. Das erste Projekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit Fragestellungen, welche die DM betreffen. Die DM Typ 1 und Typ 2 (DM1 und DM2) bilden zusammen die häufigste Muskelerkrankung im Erwachsenenalter. Sie ist durch die gemeinsamen Symptome Myotonie, Muskelschwäche und Katarakt sowie die Beteiligung weiterer Organsysteme gekennzeichnet, was sie zu einer multisystemischen Erkrankung macht. Die genetische Ursache liegt für beide Formen in einer Repeatexpansion eines Mikrosatelliten in der untranslatierten Region zweier Gene (DMPK in DM1, CNBP in DM2). Dem gemeinsamen Pathomechanismus liegt eine toxische Funktionsgewinn-Mutation des expandierten RNA-Transkripts zugrunde. Die beiden bekannten Formen der DM sind phänotypisch häufig nicht unterscheidbar, weshalb in vielen Fällen beide Erkrankungen molekulargenetisch untersucht werden müssen. Dabei ist die Diagnostik der DM durch die Notwendigkeit des Nachweises von sehr großen Repeatexpansionen recht aufwändig und die Bestimmung der Repeatlänge im Fall der DM2 nur eingeschränkt möglich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Test zum Nachweis der Repeatexpansionen auf der Basis der Methode des Molecular Combing entwickelt, welche den gleichzeitigen Nachweis der beiden Loci von DM1 und DM2 erlaubt und zusätzlich eine direkte Messung der Repeatlänge ermöglicht. Das Molecular Combing ist eine fluoreszenz-mikroskopische Einzelmolekül-Analysemethode, durch die es erstmals möglich wurde, die vermutete somatische Instabilität bei DM2 darzustellen. Das zweite DM-Teilprojekt beschäftigt sich mit der Identifikation möglicher alternativer genetischer Ursachen für die Erkrankung. Dies wurde anhand einer Kohorte von 138 DM1- und DM2-negativen Indexpatienten mit dem typischen DM-Phänotyp untersucht. Ausgehend von dem gemeinsamen Pathomechanismus wurden die primären Krankheitsgene DMPK und CNBP, sowie CELF1 und MBNL1, welche wichtige Rollen auf sekundärer Ebene des Pathomechanismus spielen, mittels Next Generation Sequencing untersucht. Dabei wurde eine auffällige Variante in DMPK gefunden, keine Varianten in CNBP oder CELF1 und drei Varianten in MBNL1, was auf MBNL1 als Kandidatengen einer alternativen Ursache für DM hinweist. MBNL1 ist ein gewebespezifischer Spleißregulator, welcher einen Wechsel von einem fetalen zu einem adulten Spleißmuster im Muskel steuert. Die Pathogenität einer der Varianten wurde in einem RNA-Spleißassay mit MBNL1-Targetgenen untersucht. Dabei konnten keine spezifischen Spleiß-Effekte festgestellt werden, aber eine Verminderung des Expressionsniveaus im Sinne einer Haploinsuffizienz. Die 3D-Modellierung dieser Variante deutet auf Änderungen der Oberflächenladungen in MBNL1 hin. Der Nachweis der Pathogenität der Varianten und somit die Ursächlichkeit von MBNL1-Mutationen für DM konnte hiermit nicht abschließend geklärt werden. Die gefundenen Ergebnisse regen jedoch hoffentlich zu nachfolgenden Studien an. Das zweite Projekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit Fragestellungen um die FSHD. Diese bildet die dritthäufigste Muskelerkrankung, charakterisiert durch eine oft asymmetrische Schwäche der Muskulatur von Gesicht, Schultergürtel und Oberarmen. Genetisch ist die FSHD Typ 1 (FSHD1) mit einer Kontraktion des Makrosatelliten D4Z4 verknüpft, was eine Relaxation der Chromatinstruktur der Region mit sich bringt und damit die ektopische Expression des apoptotisch wirkenden Proteins DUX4 ermöglicht. Die pathogene Ausprägung dieser Funktionsgewinn-Mutation findet dabei nur in Verbindung mit einem FSHD-permissiven Haplotyp statt. Auf der Grundlage des gleichen Pathomechanismus wurde eine zweite Form der FSHD (FSHD2) vorgestellt, bei der die Chromatinrelaxation unabhängig von der Länge von D4Z4 durch einen Defekt in dem an der DNA-Methylierung beteiligten Gen SMCHD1 assoziiert sein soll. Die Vererbung von FSHD2 verläuft digenisch mit Mutationen in SMCHD1 und dem FSHD-permissiven Haplotyp auf zwei unabhängigen Loci. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Kohorte von 55 FSHD1-negativen Patienten mit dem typischen FSHD-Phänotyp untersucht. Dabei wurden der Haplotyp, die Methylierung von D4Z4 sowie das SMCHD1-Gen analysiert. Es konnten neun Patienten mit einem Defekt in SMCHD1 identifiziert werden. In einer zweiten Kohorte von 45 FSHD1-positiven Patienten wurde untersucht, ob SMCHD1-Mutationen auch in Kombination mit einer Kontraktion von D4Z4 vorkommen. Dieser Fall von FSHD1+2 konnte für drei Patienten gezeigt werden, welche außerdem einen auffällig schweren Phänotyp zeigten. SMCHD1 kann also als Modifier-Gen für die Schwere der Erkrankung bei FSHD1 angesehen werden. Damit wurden insgesamt zwölf SMCHD1-Mutationsträger identifiziert, davon sind zehn der Varianten noch nicht beschrieben worden. Für alle erkrankten Mutationsträger konnte eine Methylierung von D4Z4 ≤ 20 % ermittelt werden, was als diagnostisches Kriterium verwendet werden kann. Mit einem Anteil von 16,3 % Mutationsträger in der FSHD1-negetiven Kohorte bildet FSHD2 einen bedeutenden Anteil an dem Krankheitsbild der FSHD, weshalb die entwickelten Analysen in die Routinediagnostik eingegliedert wurden. Das zweite Teilprojekt der FSHD beschäftigt sich mit der Funktion des SMCHD1-Gens bei der X-Inaktivierung (XI). Es ist bekannt, dass SMCHD1 bei weiblichen Mäusen an der Aufrechterhaltung der XI mitwirkt. Die Untersuchung der XI bei FSHD2-Frauen ergab eine extreme Verschiebung der erwarteten XI von 50:50 auf 0:100 oder 100:0 bei sechs von 13 Patientinnen. Die übrigen sieben zeigten eine XI im Normalbereich von > 20:80 oder < 80:20. Der Befund der einseitigen Verschiebung könnte auf einen negativen Selektionsdruck gegenüber Zellen mit unvollständiger XI hindeuten. Es wäre interessant zu untersuchen, ob sich der gleiche Effekt auch in einer größeren Kohorte wiederfindet und ob er sich mit der Art der Mutation korrelieren lässt. N2 - The clinical presentation of many inherited muscular disorders is often remarkably similar with muscle weakness and wasting as the most prominent everyday problems. By contrast, the genetic basis is highly heterogeneous with so far > 250 identified genes (musclegenetable.org). Even within a defined disease group different genetic causes are found side by side which can be explained by linking into a common pathomechanism. The present thesis deals with different aspects of this genetic heterogeneity using the two common muscular disorders myotonic dystrophy (DM) and facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) as examples. It addresses questions on alternative genetic causes and related issues. The first project of this work is focused on issues related to DM. DM type 1 and DM type 2 (DM1 and DM2) together represent the most frequent muscular disorder in adulthood. Clinically, the disease is characterized by the common symptoms myotonia, muscular weakness and cataract as well as multi organ involvement, making it a multisystemic disorder. The genetic cause of both forms is the expansion of a microsatellite repeat in the untranslated regions of two different genes (DMPK in DM1, CNBP in DM2). The common pathogenic mechanism is based on a toxic gain of function mutation of the expanded RNA transcript. The two known forms of DM are phenotypically often not distinguishable which is why in many cases molecular genetic testing for both forms must be performed. In addition, the diagnosis of DM is quite challenging due to the need of detecting very large repeat expansions. Furthermore, an exact determination of repeat length in DM2 has so far not been possible. In this study, a test based on the method Molecular Combing was developed for detection of the repeat expansions, which allows for the simultaneous detection of the two loci of DM1 and DM2 in a single assay and in addition for a direct measurement of the repeat length. The Molecular Combing is a fluorescence microscopic single-molecule method which enables for the first time the visualization of the suspected somatic instability in DM2. The second DM-project deals with the identification of possible alternative genetic causes of the disease. This was investigated by a cohort of 138 DM1- and DM2-negative index patients displaying the typical DM-phenotype. Based on the common pathogenic mechanism, the primary disease genes DMPK and CNBP, as well as CELF1 and MBNL1 which play important roles on a secondary level of the pathomechanism were examined by Next Generation Sequencing. One candidate variant was found in DMPK, no variants in CNBP or CELF1 and three variants in MBNL1, suggesting that MBNL1 is an alternative candidate gene for DM. MBNL1 is a tissue-specific splicing regulator which controls the change from a fetal to an adult splicing pattern in muscle. Pathogenicity of one of the variants was tested in an RNA splicing assay with MBNL1 target genes. No alternative splicing patterns were observed but a reduction in expression levels suggests a haploinsufficiency mechanism. 3D-modelling of this variant suggests a change in surface charge of MBLN1. However, the proof of the pathogenicity of the three variants and thus the causality of MBNL1 mutations as a cause for DM still remains to be confirmed. Hopefully, our observations may foster further studies into this direction. The second project of this thesis deals with the genetic causes of FSHD. This is the third most common muscular disorder, characterized by often asymmetric weakness of the muscles of the face, shoulder girdle and upper arms. Genetically, FSHD type 1 (FSHD1) is associated with a contraction of the macrosatellite repeat D4Z4 which induces a relaxation of the chromatin structure of the region and thus allows ectopic expression of the apoptotic DUX4 protein. Pathogenicity of this gain-of-function mutation is exclusively associated with a permissive FSHD haplotype. Based on the same pathomechanism, a second form of FSHD (FSHD2) has been described in which chromatin relaxation is caused by a defect in the SMCHD1 gen that is involved in DNA methylation - independent of the D4Z4 repeat length. The inheritance of FSHD2 is therefore digenic with mutations in SMCHD1 and a FSHD permissive haplotype, located on two different chromosomes. In this study, a cohort of 55 FSHD1-negative patients displaying the typical FSHD phenotype was studied. The haplotype, methylation of D4Z4 and the SMCHD1 gene were analyzed. A number of nine patients with mutations in SMCHD1 could be identified. In a second cohort 45 FSHD1-positive patients were examined, addressing the question, whether SMCHD1 mutations also occur in combination with a contraction of D4Z4. The condition of FSHD1 + 2 was found in three patients who also showed a strikingly severe phenotype. SMCHD1 therefore can be regarded as a modifier gene for disease severity in FSHD1. In total, twelve SMCHD1 mutation carriers were identified in this study with ten novel variants. For all affected mutation carriers methylation of D4Z4 was found to be ≤ 20 % which can be used as a diagnostic criterion. With a proportion of 16.3 % mutation carriers in the FSHD1-negative cohort FSHD2 represents a significant part of the clinical spectrum of FSHD. Based on these findings, a modified algorithm for routine diagnostics of FSHD is presented. The second FSHD-project deals with the function of the SMCHD1 gene in X-inactivation (XI). It is known that in female mice SMCHD1 is involved in the maintenance of XI. The investigation of XI in FSHD2-women showed an extreme shift of the expected XI of 50:50 to 0:100 or 100:0 in six of 13 patients. The remaining seven patients showed XI in the normal range of > 20:80 or < 80:20. The finding of this one-sided shift could indicate a negative selection pressure against cells with incomplete XI. It would be interesting to investigate whether this effect can be confirmed in a larger cohort and whether it can eventually be correlated with the type of mutation. KW - Humangenetik KW - Myotonische Dystrophie KW - Landouzy-Déjerine-Atrophie KW - Gen Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123431 ER - TY - THES A1 - Langer, Stefanie T1 - Genetisches Modell der Spinalen Muskelatrophie T1 - Genetic model of the spinal muscular atrophy N2 - Die proximale infantile und juvenile spinale Muskelatrophie (SMA) ist die zweithäufigste autosomal rezessive Erbkrankheit nach der Mukoviszidose. Das hauptsächlich verantwortliche Gen, das survival motor neuron (SMN1) Gen, ist auf Chromosom 5 lokalisiert. Man unterscheidet Normalallele (mit einer oder zwei SMN1-Kopien) und Defektallele (einfache Deletion, große Deletion oder Punktmutation). Für die vorliegende Arbeit wurden zahlreiche in der Literatur verfügbare Daten zur SMA Typ I-III zusammengetragen und in ihrer Abhängigkeit in ein genetisches Modell gebracht, um so fehlende Parameter berechnen zu können. Etwa einer von 9.693 Lebendgeborenen ist von der Erkrankung betroffen, während einer von 6.117.733 Feten aufgrund von homozygoter großer Deletion pränatal verstirbt. Mit einer berechneten unvollständigen Penetranz von etwa 0,8418 ergibt sich, dass einer von 51.572 homozygot Deletierten oder compound-Heterozygoten nicht erkrankt. Dies ergibt eine Genfrequenz von etwa 1:90 und eine Heterozygotenwahrscheinlichkeit von 1:46. Die einzelnen Allelfrequenzen konnten wie folgt berechnet werden: einfache Deletion a (0-SMN1-Kopien): ≈ 0,0104; Normalallel b (1-SMN1-Kopie): ≈ 0,9527; Normalallel c (2-SMN1-Kopien): ≈ 0,0362; Punktmutation d (1-SMN1-Kopie): ≈ 0,0003; große Deletion g (0-SMN1-Kopien): ≈ 0,0004. Die Hardy-Weinberg-Regel ist eine wichtige Grundlage, um A-priori-Wahrscheinlichkeiten zu bestimmen. Es wird demonstriert, wie sich unter Berücksichtigung gesunder Angehörige, den Ergebnissen molekularer Tests sowie des genetischen Modells mit Hilfe des Bayesschen Rechnetableaus genauere Risikoberechnungen als bisher durchführen lassen. N2 - Spinal muscular atrophy (SMA) is the second most common autosomal recessive disorder after cystic fibrosis. SMA is caused by mutations in the survival motor neuron 1 (SMN1) gene, which is located on chromosome 5. There is a division into normal alleles (with one or two SMN1 gene copies) and disease alleles (deletion, large scale deletion or point mutation). To create this dissertation, a wide range of data published in various works was collected and incorporated into a genetic model under consideration of their interdependence. This complex genetic model of SMA allows a calculation of all parameters even those which have not seen exact research so far. Approximately one in every 9.693 live births is affected by the illness, while one of 6.117.733 fetuses dies prenatally because of homozygous scale deletion. With a calculated incompleted penetrance of approximately 0,8418 one of 51.572 persons with two disease alleles is not affected. The result is a gene frequency of approximately 1:90 and a carrier frequency of about one in 46. We calculated that the SMN1 allele frequencies are: deletion a (0-copy of SMN1): ≈ 0,0104; normal allele b (1-copy of SMN1): ≈ 0,9527; normal allele c (2-copy of SMN1): ≈ 0,0362; point mutation d (1-copy of SMN1): ≈ 0,0003; large scale deletion g (0-copy of SMN1): ≈ 0,0004. The Hardy-Weinberg law forms an important basis for the determination of a priori probabilities. We demonstrate how genetic risk calculation with the help of Bayesian calculation tables can be done more exactly by taking into account healthy relatives, molecular test results and the genetic model. KW - Spinale Muskelatrophie KW - SMA KW - Genetisches Modell KW - Risikoberechnungen KW - SMN1-Kopien KW - Allelfrequenzen KW - SMA KW - genetic model KW - risk assesment KW - autosomal recessive heredity KW - SMN1-copies KW - allelefrequences Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78784 ER - TY - THES A1 - Kühl, Julia T1 - FAAP100, der FA/BRCA-Signalweg für genomische Stabilität und das DNA-Reparatur-Netzwerk T1 - FAAP100, the FA/BRCA pathway for genomic stability and the DNA repair network N2 - Die Fanconi-Anämie (FA) ist eine seltene, heterogene Erbkrankheit. Sie weist ein sehr variables klinisches Erscheinungsbild auf, das sich aus angeborenen Fehlbildungen, hämatologischen Funktionsstörungen, einem erhöhten Risiko für Tumorentwicklung und endokrinen Pathologien zusammensetzt. Die Erkrankung zählt zu den genomischen Instabilitätssyndromen, welche durch eine fehlerhafte DNA-Schadensreparatur gekennzeichnet sind. Bei der FA zeigt sich dies vor allem in einer charakteristischen Hypersensitivität gegenüber DNA-quervernetzenden Substanzen (z. B. Mitomycin C, Cisplatin). Der zelluläre FA-Phänotyp zeichnet sich durch eine erhöhte Chromosomenbrüchigkeit und einen Zellzyklusarrest in der G2-Phase aus. Diese Charakteristika sind bereits spontan vorhanden und werden durch Induktion mit DNA-quervernetzenden Substanzen verstärkt. Der Gendefekt ist dabei in einem der 22 bekannten FA-Gene (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U, -V, -W) oder in noch unbekannten FA-Genen zu finden. Die FA-Gendefekte werden mit Ausnahme von FANCR (dominant-negative de novo Mutationen) und FANCB (X-chromosomal) autosomal rezessiv vererbt. Die FA-Genprodukte bilden zusammen mit weiteren Proteinen den FA/BRCA-Signalweg. Das Schlüsselereignis dieses Signalwegs stellt die Monoubiquitinierung von FANCD2 und FANCI (ID2-Komplex) dar. Ausgehend davon lässt sich zwischen upstream- und downstream-gelegenen FA-Proteinen unterscheiden. Letztere sind direkt an der DNA-Schadensreparatur beteiligt. Zu den upstream-gelegenen Proteinen zählt der FA-Kernkomplex, der sich aus bekannten FA-Proteinen und aus FA-assoziierten-Proteinen (FAAPs) zusammensetzt und für die Monoubiquitinierung des ID2-Komplexes verantwortlich ist. Für FAAPs wurden bisher keine pathogenen humanen Mutationen beschrieben. Zu diesen Proteinen gehört auch FAAP100, das mit FANCB und FANCL innerhalb des FA-Kernkomplexes den Subkomplex LBP100 bildet. Durch die vorliegende Arbeit wurde eine nähere Charakterisierung dieses Proteins erreicht. In einer Amnion-Zelllinie konnte eine homozygote Missense-Mutation identifiziert werden. Der Fetus zeigte einen typischen FA-Phänotyp und auch seine Zellen wiesen charakteristische FA-Merkmale auf. Der zelluläre Phänotyp ließ sich durch FAAP100WT komplementieren, sodass die Pathogenität der Mutation bewiesen war. Unterstützend dazu wurden mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems weitere FAAP100-defiziente Zelllinien generiert. Diese zeigten ebenfalls einen typischen FA-Phänotyp, welcher sich durch FAAP100WT komplementieren ließ. Die in vitro-Modelle dienten als Grundlage dafür, die Funktion des FA-Kernkomplexes im Allgemeinen und die des Subkomplexes LBP100 im Besonderen besser zu verstehen. Dabei kann nur durch intaktes FAAP100 das LBP100-Modul gebildet und dieses an die DNA-Schadensstelle transportiert werden. Dort leistet FAAP100 einen essentiellen Beitrag für den FANCD2-Monoubiquitinierungsprozess und somit für die Aktivierung der FA-abhängigen DNA-Schadensreparatur. Um die Funktion von FAAP100 auch in vivo zu untersuchen, wurde ein Faap100-/--Mausmodell generiert, das einen mit anderen FA-Mausmodellen vergleichbaren, relativ schweren FA-Phänotyp aufwies. Aufgrund der Ergebnisse lässt sich FAAP100 als neues FA-Gen klassifizieren. Zudem wurde die Rolle des Subkomplexes LBP100 innerhalb des FA-Kernkomplexes weiter aufgeklärt. Beides trägt zu einem besseren Verständnis des FA/BRCA-Signalweges bei. Ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von FAAP100138, einer bisher nicht validierten Isoform von FAAP100. Durch dieses Protein konnte der zelluläre FA-Phänotyp von FAAP100-defizienten Zelllinien nicht komplementiert werden, jedoch wurden Hinweise auf einen dominant-negativen Effekt von FAAP100138 auf den FA/BRCA-Signalweg gefunden. Dies könnte zu der Erklärung beitragen, warum und wie der Signalweg, beispielsweise in bestimmtem Gewebearten, herunterreguliert wird. Zudem wäre eine Verwendung in der Krebstherapie denkbar. N2 - Fanconi Anemia (FA) is a rare heterogeneous hereditary disease. It shows a highly variable clinical presentation including congenital malformations, bone marrow failure and increased risk for cancer and endocrine pathologies. The disease is classified as one of the genomic instability disorders that are characterized by failure of DNA damage repair processes. FA shows a typical hypersensitivity toward DNA crosslinking agents (e.g. Mitomycin C, cisplatin). There is an increased rate of chromosomal breakage and cell cycle arrest in the G2 phase. These characteristics are present spontaneously and after incubation with DNA crosslinking agents. The genetic defect can be found in one of the 22 reported FA genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U, -V, -W) or yet unknown FA genes. FA gene defects are inherited in an autosomal recessive way with the exceptions of FANCR (dominant negative de novo mutations) and FANCB (X-linked). Together with other proteins, the FA gene products establish the FA/BRCA pathway. The key event of this pathway is the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI (ID2 complex). From this point it is possible to differentiate between upstream and downstream FA proteins. The latter are directly involved in FA-dependent DNA repair processes. The upstream positioned FA proteins form the FA core complex that includes FA and FA-associated proteins (FAAPs). The FA core complex is responsible for the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI. To date no pathogenic human mutations of the FAAPs have been described. Among these proteins is FAAP100 which together with FANCB and FANCL forms the subcomplex LBP100 within the FA core complex. In the present thesis a closer characterization of this protein has been achieved. In an amniotic cell line a homozygous missense mutation could be identified. The affected fetus displayed a typical FA phenotype and the cells also showed characteristics of FA. The cellular phenotype was complemented by FAAP100WT, thus proving the pathogenicity of the mutation. Supporting this result, additional FAAP100-deficient cell lines have been generated using the CRISPR/Cas9 system. These also exhibited a typical FA cellular phenotype which could be complemented by FAAP100WT. In vitro models served as a basis for better understanding the function of the FA core complex in general and of the LBP100 subcomplex in particular. Only in the presence of an intact FAAP100 the LBP100 module can be formed and transported to sites of DNA interstrand crosslinks. There, FAAP100 significantly contributes to the FANCD2 monoubiquitination process and thus to the activation of FA-dependent DNA damage repair. In order to also examine the function of FAAP100 in vivo, an Faap100-/- mouse model has been generated which shows a relatively severe FA phenotype comparable to other FA mouse models. Because of these results FAAP100 can be categorized as a new FA gene. Moreover, the role of the LBP100 subcomplex within the FA core complex was further elucidated and a better understanding of the FA/BRCA pathway was achieved. Another part of this thesis deals with the characterization of FAAP100138, a hitherto not validated isoform of FAAP100. The cellular FA phenotype of FAAP100-deficient cell lines could not be complemented by this isoform. However, there are clues pointing to a dominant negative effect of FAAP100138 on the FA/BRCA pathway. This finding could serve as a potential explanation of how and why the FA signaling pathway is downregulated in certain tissues. A therapeutic application for cancer of FAAP100138 appears possible. KW - Fanconi-Anämie KW - DNA-Reparatur KW - FAAP100 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171669 ER - TY - THES A1 - Kuhtz, Juliane T1 - Epimutationen humaner Keimzellen und Infertilität T1 - Epimutations of human germ cells and infertility N2 - Infertilität stellt in unserer heutigen Gesellschaft ein zunehmendes Problem dar. Bei der Suche nach den der Infertilität zugrunde liegenden Ursachen gerät immer mehr die Epigenetik in den Fokus. Epigenetische Prozesse sind nicht nur in die Embryo-nalentwicklung und Wachstumsprozesse des Kindes involviert, sondern auch in korrekte Funktionsweisen von Gameten. Störungen können die Fertilität beeinträch-tigen. Eine besondere Rolle spielen geprägte Gene, die auf einem ihrer Allele, je nach parentaler Herkunft, ein Imprint in Form von DNA-Methylierung tragen. Fehl-regulationen solcher geprägter Gene können zu Imprinting-Erkrankungen führen. Seit Einführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) wurden verschiedene assistierte Re-produktionstechniken (ART) entwickelt, um infertilen Paaren zu helfen. Die Sicher-heit dieser Techniken ist nicht abschließend geklärt. Immer wieder wird von nach ART-Behandlung gehäuft auftretenden Imprinting-Erkrankungen berichtet. Diese Erkrankungen stehen jedoch eher in Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Infertilität, als mit ART selbst. Dennoch ist es notwendig zu untersuchen inwieweit sich ART eventuell auf den Gesundheitszustand dieser Kinder auswirken könnte. In der hier vorgelegten Arbeit wurde der Zusammenhang von Epigenetik, Infertilität und ART von verschiedenen Standpunkten aus beleuchtet. In humanen Spermien wurde die DNA-Methylierung verschiedener geprägter Gene hinsichtlich Epimutationen untersucht. ICSI (intracytoplasmatic sperm injection) und IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) sind verschiedene Techniken zur Selektion von Spermien für eine ART-Behandlung. Hier wurde un-tersucht, ob IMSI epigenetisch bessere Spermien selektiert als die konventionelle ICSI-Methode. Außerdem ist bekannt, dass in Spermienköpfen fertiler und infertiler Männer Vakuolen vorkommen können, deren epigenetische Bedeutung jedoch un-bekannt ist. Ob diese Vakuolen in Zusammenhang mit Epimutationen stehen könn-ten, wurde ebenfalls überprüft. Dazu wurde bisulfitkonvertierte DNA weniger Sper-mien (11 je Probe) mithilfe der Limiting Dilution (LD)–Technik und Pyrosequenzie-rung analysiert. Insgesamt standen 880 Spermien für diese Untersuchung zur Ver-fügung. Es konnte kein Unterschied zwischen IMSI- und ICSI-selektierten Spermien gefunden werden. Vorhandene Vakuolen im Spermienkopf beeinträchtigten nicht die DNA-Methylierung der Gene hGTL2, hLIT1 und hPEG3. Ein weiteres Projekt befasste sich mit der Frage, inwieweit die Technik der In-vitro-Maturation (IVM) DNA-Methylierung in humanen Oocyten beeinflussen könnte. Bisulfitkonvertierte DNA einzelner humaner Oocyten wurde mit LD und Pyrose-quenzierung analysiert. Verglichen wurden IVM und in vivo gereifte Oocyten. Hier-für standen 139 Oocyten zur Verfügung, wovon 90 mittels IVM und 49 in vivo gereift waren. Untersucht wurden vier geprägte Gene (hGTL2, hLIT1, hPEG3 und hSNRPN) und drei nicht geprägte Gene (hDNMT3Lo, hNANOG und hOCT4). Es konnten keine IVM-bedingten Epimutationen gefunden werden. Im dritten Projekt wurde untersucht, ob sich die DNA-Methylierung normaler Sper-mien von Spermien aus Oligozoospermie-Asthenozoospermie-Teratozoospermie (OAT)–Syndrom-Patienten unterscheidet. Eine weitere Frage war, ob Epimutationen einen Einfluss auf den ART-Ausgang haben. Untersucht wurden 54 Spermienpro-ben von Paaren in ART-Behandlung. Zur Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster der geprägten Gene hGTL2 und hPEG3 sowie der beiden nicht geprägten Pluripotenzgene hNANOG und hOCT4 wurde die Methode Deep Bisulfite Sequencing (DBS) verwendet. Dies ist eine Next Generation Sequencing (NGS)–Technik, angewandt an bisulfitkonvertierter DNA. Diese Technik ermöglicht es mehrere Proben sowie Gene gleichzeitig zu analysieren. Es zeigte sich, dass OAT-Spermien, die zu einer Lebendgeburt geführt hatten, sich epigenetisch nicht von normalen Spermien unterschieden. Besonders viele Epimutationen konnten hingegen in OAT-Spermien gefunden werden, die zu keiner Schwangerschaft ge-führt hatten. Zwischen Spermien die zu einer Lebendgeburt oder keiner Schwan-gerschaft geführt hatten, zeigten sich Unterschiede in der Häufigkeit von hGTL2-Epimutationen. Über die Häufigkeit von Epimutationen konnte eine prädiktive Aus-sage zum ART-Ausgang getroffen werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass sich eine Häu-fung von Epimutationen darauf auswirkt, ob eine Schwangerschaft erreicht werden kann oder nicht. Diese Epimutationen liegen bereits im parentalen Genom vor. Sie werden nicht durch ART verursacht. Allerdings muss man Techniken finden, mit denen man Gameten mit möglichst wenig Epimutationen selektiert, um eine Über-tragung solcher auf das Kind zu verhindern. N2 - Infertility is an increasing problem in today’s society. The search for the underlying causes of infertility reveals more and more the role of epigenetics. Epigenetic pro-cesses are involved in embryo development and growth, but also in the proper func-tion of gametes. Disturbances have been shown to impair fertility. Imprinted genes play an important role. They carry a parental-specific DNA methylation imprint on one of their alleles. Deregulation of these genes leads to imprinting diseases. Since the introduction of in vitro fertilisation (IVF), different assisted reproductive technologies (ART) have been developed to treat infertile couples. The safety of these techniques is not finally solved. Increased rates of imprinting diseases in ART offspring have been reported, but seem more likely to be linked to the underlying parental infertility problems than to ART itself. Nevertheless it is of importance to in-vestigate how ART could affect the health of those children. In the work presented here the relations between epigenetics, infertility and ART have been investigated from different points of view. Firstly, the DNA methylation pattern of different imprinted genes has been investi-gated in human sperm with regard to the frequency of epimutations. ICSI (intracyto-plasmatic sperm injection) and IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) are different techniques to select sperm for ART treatment. It was analysed whether IMSI selects epigenetically superior sperm than the conventional ICSI method. Furthermore it is known that sperm from fertile and infertile men can carry vacuoles in their sperm heads. Their epigenetic relevance is unknown. Whether these vacuoles are linked to epimutations has also been investigated here. Bisulfite converted DNA of a few sperm (11 per sample) was analysed using the Limiting Dilution (LD) technique followed by pyrosequencing. In total 880 sperm were available for analysis. No difference between IMSI and ICSI selected sperm was found. Further, no influence of sperm head vacuoles on the DNA methylation patterns of the genes hGTL2, hLIT1 and hPEG3 could be observed. Secondly, it was of interest whether the in vitro maturation (IVM) technique has an influence on DNA methylation in human oocytes. Bisulfite converted DNA of single human oocytes was analysed with LD and pyrosequencing. IVM oocytes were com-pared to in vivo grown oocytes. A total of 139 oocytes were available, of which 90 oocytes were IVM treated while 49 oocytes were grown in vivo. Four imprinted genes (hGTL2, hLIT1, hPEG3 and hSNRPN) and three non-imprinted genes (hDNMT3Lo, hNANOG and hOCT4) were analysed. No IVM-induced epimutations were detected. Finally, it was investigated whether DNA methylation patterns of normal sperm would differ from sperm of oligozoospermia-asthenozoospermia-teratozoospermia (OAT) syndrome patients. Furthermore it was of interest whether epimutations would influence the ART outcome. A total of 54 sperm samples from couples undergoing ART treatment were investigated. To analyse DNA methylation of the imprinted genes hGTL2 and hPEG3 as well as the non-imprinted pluripotency genes hNANOG and hOCT4, Deep Bisulfite Sequencing (DBS) was applied. This is a Next Generation Sequencing (NGS) technique applied on bisulfite converted DNA, al-lowing the analysis of several samples and genes at once. The obtained results showed that OAT samples, which had led to a live-birth, did not differ epigenetically from normal sperm. Much more epimutations were found in OAT sperm which had failed to achieve a pregnancy. Sperm not being able to achieve a pregnancy differed from sperm that had led to a live-birth with regard to hGTL2 epimutation frequency. In addition, ART outcome can be predicted using the frequency of epimutations. Taken together this work shows that the amount of epimutations influences whether a pregnancy can be achieved or not. Epimutations already exist within the parental genome. They are not caused by ART. Nevertheless, one needs to find techniques with which gametes with as few as possible epimutations are being selected to pre-vent the transmission of these onto the offspring. KW - Epigenetik KW - Sterilität KW - Epimutationen KW - geprägte Gene KW - humane Keimzellen KW - Infertilität Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108248 ER - TY - THES A1 - Kuhn [geb. Bach], Julia Elisa T1 - Design und Etablierung von Next Generation Sequencing-Methoden zur Diagnostik verschiedener Erbkrankheiten T1 - Design and establishment of next-generation sequencing methods for diagnostics of different hereditary diseases N2 - Innerhalb des letzten Jahrzehnts entstanden zahlreiche neue Anreicherungs- und Sequenzier-technologien der zweiten (und dritten) Generation, die in rasantem Tempo weiterentwickelt und schon jetzt in vielen Bereichen als neuer Goldstandard für molekulargenetische For-schung und Diagnostik angesehen werden. Als Hochdurchsatz-Verfahren ermöglichen diese Next Generation Sequencing-Methoden (NGS) in immer kürzerer Zeit die parallele Analyse zahlreicher Proben und immer größerer Zielregionen bis hin zum ganzen Genom und führten in der Humangenetik dadurch zu Forschungsansätzen in neuen Dimensionen. In dieser Doktorarbeit, die im molekulargenetischen Diagnostik-Labor der Humangenetik Würzburg durchgeführt wurde, wurden in fünf Projekten NGS-Ansätze unterschiedlicher Stufen bzw. Größenordnungen für verschiedene erblich bedingte Erkrankungen konzipiert und etabliert und in Forschungsprojekten sowie der Routinediagnostik eingesetzt. Dabei wurden verschiedene Methoden zur Anreicherung der Zielsequenzen und zur NGS-Sequenzierung erprobt und auf ihre Effizienz beurteilt. Die Ergebnisse des NGS und darauf basierender Nachweis-Experimente wurden in sieben Veröffentlichungen dokumentiert, auf denen diese Dissertation aufbaut. In den drei ersten Projekten wurden das Access Array-System (Fluidigm) zur Anreicherung der Zielsequenzen und der GS Junior (Roche) zur Erzeugung der Sequenzen verwendet. In Projekt 1 wurde COL4A6 als neues Kandidatengen für nicht-syndromale Hörstörungen identifiziert. Um mögliche weitere Mutationsträger zu detektieren, wurde erfolgreich ein kleiner NGS-Ansatz für das zügige Screening dieses Gens bei knapp 100 weiteren Patienten etabliert. Diese und weitere Ergebnisse bestätigten die Kausalität der COL4A6-Mutation eines Index-Patienten mit schwerer, X-chromosomal-rezessiver Hörstörung. Ein geeigneter NGS-Ansatz für die Analyse des großen RYR1-Gens wurde in Projekt 2 ge-sucht. Der erste Ansatz mit Access Array-System und GS Junior führte zwar bei 39 von 87 Patienten mit Maligner Hyperthermie und/oder Central Core Disease zu dem Auffinden einer (potentiell) pathogenen Variante, allerdings mit hohen Ausfallquoten. Mit der zweiten Methode (Anreicherung: SureSelect-System custom design, Agilent; Sequenzierung: HiSeq, Illumina) wurden neben RYR1 noch 63 weitere Gene analysiert, was zu deutlich besseren Ergebnissen und vier Mutationsfunden führte. Projekt 3 beinhaltete die Etablierung zwei kleiner Panels für Muskelkrankheiten. Ein Panel für drei Gene für Gliedergürteldystrophien wurde sogar erfolgreich in die akkreditierte Rou-tinediagnostik übernommen. Mit dem zweiten Panel für acht Kandidatengene myofibrillärer Myopathien (MFM) wurde u.a. eine neue Mutation im BAG3-Gen identifiziert. Das Exom eines MFM-Patienten wurde in Projekt 4 nach Anreicherung mit dem SureSelect-System (Agilent) auf dem HiSeq (Illumina) sequenziert. Nach Auswertung und Beurteilung der identifizierten Varianten wurde ein neuer Erbgang für Myotilinopathien entdeckt. Verschiedene Nachweisexperimente bestätigten die Kausalität der Mutation im Myotilin-Gen. In Projekt 5 wurde die komplette genomische Sequenz des F8-Gens nach tiefen intronischen Mutationen bei Hämophilie-Patienten abgesucht (Anreicherung SureSelect custom design, Agilent; Sequenzierung MiSeq, Illumina). Bei jedem der analysierten Patienten konnte min-destens eine verdächtige Variante identifiziert werden, die zu verändertem Spleißverhalten führen könnte. Drei Mutationen waren schon durch Publikationen bekannt, bei einer weite-ren konnten in vitro-Spleißanalysen die Kausalität bestätigen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die zur Verfügung stehenden Methoden zur An-reicherung von Zielsequenzen aus dem menschlichen Genom und zu deren Sequenzierung je nach Komplexität der Fragestellung, d.h. der Anzahl und Größe der Gene sowie der Anzahl der zu untersuchenden Proben, sinnvoll und effizient kombiniert werden können. Im Verlauf der Arbeit haben sich die NGS-Techniken rasant weiterentwickelt. So sind PCR-basierte Ansätze zur Anreicherung der Zielsequenzen für die meisten Anwendungen von hybridisierungs-basierten Methoden verdrängt worden. Von den ursprünglich drei konkur-rierenden Verfahren zur Hochdurchsatzsequenzierung hat sich die Methode des „sequen-cing-by-synthesis“ (Illumina) weitgehend durchgesetzt. Diese Entwicklung spiegelt sich auch in den während dieser Arbeit erhobenen Daten wider. N2 - Several enrichment and sequencing technologies of the second (and third) generation have been developed in the past decade, were rapidly refined and are already considered as new state of the art method in several fields of molecular genetic research and diagnostics. Con-sidered as high-throughput technologies, these next-generation sequencing methods (NGS) allow the parallel analysis of several samples and regions of interests up to whole genomes in decreasing time and thus permitted research projects with novel dimensions in human genetics. This doctoral thesis was performed at the molecular genetic laboratory at the Department of Human Genetics in Würzburg. In five projects, NGS approaches of variable scale and for different hereditary diseases were designed, established and applied in research and routine diagnostics. Different methods for target enrichment and NGS analysis were tested and evaluated concerning their efficiency. The results of NGS and subsequent verification ex-periments were documented in seven publications forming the basis of this dissertation. In project 1 - 3, the Access Array system (Fluidigm) was used for target enrichment and the GS Junior (Roche) for sequence generation. COL4A6 has been identified as novel candidate gene for non-syndromic hereditary hearing loss in project 1. A small NGS approach was established to screen this gene in approx. 100 patients with hearing loss in order to search for additional carriers of COL4A6 mutations. The results of this and further experiments confirmed the causality of the COL4A6 mutation found in the index patient with severe X-linked hearing loss. Project 2 aimed at finding a convenient NGS method for the analysis of the large RYR1 gene. A first approach with the Access Array system and the GS Junior lead to the identifi-cation of a (potential) pathogenic mutation in 39 out of 87 patients with malignant hyper-thermia and / or central core disease, but with high failure rates. RYR1 and 63 further genes were then analyzed in a second approach (target enrichment with SureSelect custom design, Agilent; sequence analysis on a HiSeq, Illumina) providing considerably improved results and the identification of four mutations in five patients. Two small panels for muscular diseases were established in project 3. A panel for three genes associated with limb-girdle muscular dystrophies were even successfully applied in accredited routine diagnostics. A novel mutation in the BAG3 gene could be identified using the second panel established for eight candidate genes of myofibrillar myopathies (MFMs). The exome of a patient with MFM was analyzed in project 4 after target enrichment with the SureSelect system (Agilent) and sequence analysis on a HiSeq (Illumina). A novel in-heritance pattern of myotilinopathy was identified after analysis and evaluation of the de-tected variants. Several experiments confirmed the causality of the mutation in the myotilin gene. In project 5, the whole genomic sequence of the F8 gene was analyzed for deep intronic mutations in haemophilic patients (target enrichment with SureSelect custom design, Ag-ilent; sequence analysis on a MiSeq, Illumina). In each of the patients at least one conspicu-ous variant was identified probably leading to alternative splicing. Three mutations were known by publications and for another one causality could be proven by an in vitro splicing assay. The results of this doctoral thesis show that the available methods for target enrichment and sequence analysis of specific targets of the human genome can be combined in a reasonable and efficient way considering the number and size of the targeted genes and probes. During the course of this doctoral thesis, NGS technologies have been further developed in a rapid way. For most applications, PCR-based technologies for target enrichment have been dis-placed by hybridization-based methods. Of the originally three competing techniques of high-throughput sequencing the “sequencing-by-synthesis” method (Illumina) has become the widely accepted standard. This development is reflected in the data generated in this doctoral thesis. KW - Diagnostik KW - DNA-Sequenz KW - Erbkrankheit KW - Next Generation Sequencing KW - Mutation KW - Humangenetik Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116854 ER - TY - THES A1 - Krüger, Miriam T1 - Schätzungen der männlichen und weiblichen Mutationsraten bei Duchennescher Muskeldystrophie T1 - Estimation of the male and female mutation rate in Duchenne muscular dystrophy N2 - Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Bestimmung des Verhältnisses der männlichen und weiblichen Mutationsraten bei der Duchenneschen Muskeldystrophie (DMD), wobei jeweils zwischen Deletionen und Punktmutationen unterschieden wird. Bei der Duchenneschen Muskeldystrophie handelt es sich um eine X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit. Es existiert derzeit keine kausale Therapie, die Patienten versterben meist im 2. Lebensjahrzehnt. Heterozygote Frauen, die in der Regel phänotypisch gesund sind, kommen als Überträgerinnen der Krankheit in Frage. Bislang gibt es keine absolut verlässlichen direkte Heterozygotentests, es können nicht alle Überträgerinnen identifiziert werden. Stattdessen wird bei einer genetischen Beratung das Risiko einer Frau, Überträgerin zu sein, berechnet. Hierbei werden zunächst mit Hilfe des Familienstammbaums sowie weiteren Phänotypinformationen wie dem Creatinkinase-Wert (CK), Informationen erfasst. Für die Berechnung sind dann die Neumutationsrate für DMD im Allgemeinen sowie das Verhältnis der männlichen (Ny) und weiblichen (My) Mutationsraten Grundlage (k = Ny / My). Die möglichst genaue Kenntnis des genannten Quotienten k ist daher wesentlich für die Ermittlung des Heterozygotenrisikos, um eine kompetente genetische Beratung dieser Frauen zu ermöglichen. Es galt ursprünglich die Annahme Ny = My und somit k =1. Aufgrund der durchgeführten Berechnungen konnte gezeigt werden, dass die Mutationsraten in weiblichen Keimzellen (My) und in männlichen Keimzellen (Ny) nicht, wie anfänglich angenommen, gleich groß sind. Es ist also My ungleich Ny, und somit k ungleich 1. Insbesondere muss hierbei zwischen Deletionen und Punktmutationen unterschieden werden. Es lässt sich sagen, dass für Deletionen My > Ny gilt, während für Punktmutationen My < Ny gilt (k = 3,04 also Ny ca 3 My). Die Ergebnisse zeigen, dass ca. 60% der Punktmutationen in der Spermatogenese entstehen, während fast die Gesamtheit der Deletionen in der Oogenese entsteht. Diese Erkenntnis hat für die humangenetische Beratung einer möglichen Konduktorin für die Duchennesche Muskeldystrophie eine große Bedeutung. Aufgrund unserer Berechnungen können wir davon ausgehen, dass bei Deletionen näherungsweise 50% der Fälle tatsächliche Neumutationen sind, während es sich in 50% der Fälle bei den Müttern um Konduktorinnen handelt. Damit ist die die Zahl der tatsächlichen Neumutationen deutlich höher als durch theoretische Überlegungen früher angenommen (33%), während die Zahl der Konduktorinnen deutlich niedriger ist als angenommen (66%). Für eine Mutter, die ein Kind mit Duchennescher Muskeldystrophie geboren hat, bei dem eine Deletion vorliegt, gilt nun, dass das Risiko, erneut ein krankes Kind zu gebären, signifikant niedriger ist als das geschätzte Risiko unter der Annahme gleicher Mutationsraten in Oogenese und Spermatogenese. Für Punktmutationen können wir davon ausgehen, dass etwa 20% der Fälle tatsächliche Neumutationen sind, während es sich in 80% der Fälle bei den Müttern um Konduktorinnen handelt. Damit ist die die Zahl der tatsächlichen Neumutationen deutlich niedriger, während die Zahl der Konduktorinnen deutlich höher ist als angenommen. Für eine Mutter, die ein Kind mit Duchennescher Muskeldystrophie geboren hat, bei dem eine Punktmutation vorliegt, gilt nun, dass das Risiko, erneut ein krankes Kind zu gebären, deutlich höher ist als zunächst angenommen. N2 - The study shows the results of the estimation of the male and female mutation rates in Duchenne muscular dystrophy, where deletions and point mutations are seen separately. Duchenne muscular dystrophy is a X linked recessive, genetically lethal disorder. There is no causal therapy, most of the patients die before the age of 20. Heterozygote women, who do not show any symptoms are carriers and transmit the disease to their sons. There are no reliable tests for heterozygote women, not all carriers can be identified. Instead you do a calculation of the women’s risk being a carrier in a genetic consultation. Collecting information is done among other with the help of a family tree and the creatin kinase (CK). For the calculation you need the general mutation rate for DMD and the proportion of the male (Ny) and female (My) mutation rate (k = Ny / My). So it is important to know the quotient k exactly to do a correct calculation and to give a competent consultation to these women. Earlier it was assumed that Ny = My and so k =1. With the help of our calculations we could show that the female mutation rate (My) and the male mutation rate (Ny) are not equal. So it is My unequal í and k unequal 1. Besides we have to distinguish deletions and point mutations. It is seen for deletions that My > Ny whereas for point mutations My < Ny (k = 3,04 so í ca 3 Ny). The results show that about 60% of the point mutations arise in spermatogenesis whereas almost all deletions arise in oogenesis. This is of great importance for a genetic consultation of a possible carrier. We could show that in deletions about 50% of all the cases are new mutations whereas in the other 50% the mother is a carrier. So the number of real new mutations is significantly higher an earlier assumed in theory (33%) and the number of carriers significantly lower (66%). For a mother who has born a child with Duchenne muscular dystrophy having a deletion is therefore the risk of having another child suffering from the disease significantly lower than the estimated risk under the assumption of equal mutation rates in oogenesis and spermatogenesis. For point mutations we could show that about 20% of the cases are new mutations whereas in about 80% the mother is a carrier. So the number of real new mutations is significantly lower than assumed, whereas the number of carriers is significantly higher. For a mother who has born a child with Duchenne muscular dystrophy having a point mutation is therefore the risk of having another child suffering from the disease significantly higher than the estimated risk under the assumption of equal mutation rates in oogenesis and spermatogenesis. KW - Duchennesche Muskeldystrophie KW - Mutationsraten KW - Duchenne muscular dystrophy KW - mutationrate Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15833 ER - TY - THES A1 - Krämer, Franziska T1 - Molecular and Biochemical Investigations into VMD2, the gene associated with Best Disease T1 - Molekulare und biochemische Untersuchungen zur Charakterisierung des Morbus Best Gens, VMD2 N2 - Best disease (OMIM 153700) is an early-onset, autosomal dominant maculopathy characterized by egg yolk-like lesions in the central retina. The disease gene, the vitelliform macular dystrophy gene type 2 (VMD2), encodes a 585-aa VMD2 transmembrane protein, termed bestrophin. The protein is predominantly expressed on the basolateral side of the retinal pigment epithelium (RPE) and is thought to be involved in the transport of chloride ions. Bestrophin as well as three closely related VMD2-like proteins (VMD2L1-L3) contain multiple putative transmembrane (TM) domains and an invariant tripeptide (RFP) motif in the N-terminal half of the protein. This and the tissue-restricted expression to polarized epithelial cells are typical features of the VMD2 RFP-TM family. Best disease is predominantly caused by missense mutations, clustering in four distinct „hotspots“ in the evolutionary highly conserved N-terminal region of the protein. To further augment the spectrum of mutations and to gain novel insights into the underlying molecular mechanisms, we screened VMD2 in a large cohort of affected patients. In total, nine novel VMD2 mutations were identified, raising the total number of known Best disease-related mutations from 83 to 92. Eight out of nine novel mutations are hotspot-specific missense mutations, underscoring their functional/structural significance and corroborating the dominant-negative nature of the mutations. Of special interest is a one-basepair deletion (Pro260fsX288) encoding a truncated protein with a deletion of an important functional domain (TM domain four) as well as the entire C-terminal half of bestrophin. For the first time, a nonsense mutation leading to a 50 % non-functional protein has been identified suggesting that on rare occassions Best disease may be caused by haploinsufficiency. Molecular diagnostics strongly requires a reliable classification of VMD2 sequence changes into pathogenic and non-pathogenic types. Since the molecular pathomechanism is unclear at present, the pathogenicity of novel sequence changes of VMD2 are currently assessed in light of known mutations. We therefore initiated a publicly accessible VMD2 mutation database (http://www.uni-wuerzburg.de/humangenetics/vmd2.html) and are collecting and administrating the growing number of mutations, rare sequence variants and common polymorphisms. Missense mutations may disrupt the function of proteins in numerous ways. To evaluate the functional consequences of VMD2 mutations in respect to intracellular mislocalization and/or protein elimination, a set of molecular tools were generated. These included the establishment of an in vitro COS7 heterologous expression assay, the generation of numerous VMD2 mutations by site-directed mutagenesis as well as the development of bestrophin-specific antibodies. Surprisingly, membrane fractionation/Western blot experiments revealed no significant quantitative differences between intact and mutant bestrophin. Irrelevant of the type or location of mutation, incorporation of mutant bestrophin to the membraneous fraction was observed. Thus, impaired membrane integration may be ruled out as causative pathomechanism of Best disease consistent with a dominant-negative effect of the mutations. In a different approach, efforts were directed towards identifying and characterizing the VMD2 RFP-TM protein family in mouse. While clarification of the genomic organization of murine Vmd2 was required as basis to generate Vmd2-targeted animals (see below), the study of closely related proteins (Vmd2L1, Vmd2L2 and Vmd2L3) may provide further clues as to the function of bestrophin. For this, biocomputational as well as RT PCR analyses were performed. Moreover, the novel genes were analyzed by real time quantitative RT PCR, displaying predominant expression in testis, colon and skeletal muscle of Vmd2, Vmd2L1 and Vmd2L3 transcripts, respectively as well as in eye tissue. Interestingly, neither an ORF was determined for murine Vmd2L2 nor was the transcript present in a panel of 12 mouse tissues, suggesting that murine Vmd2L2 may represent a functionally inactive pseudogene. The murine Vmd2L3 gene, as its human counterpart, is a highly differentially spliced transcript. Finally, generating mouse models of Best disease will provide essential tools to investigate the pathophysiology of bestrophin in vivo. We have initiated the generation of two different mouse lineages, one deficient of Vmd2 (knock-out) and the other carrying a human disease-related mutation (Tyr227Asn) in the orthologous murine gene (knock-in). Genetic engineering of both constructs has been achieved and presently, four ES clones harboring the homologous recombination event (Vmd2+/-) have been isolated and are ready for the subsequent steps to generate chimeric animals. The resulting mouse lineages will represent two key models to elucidate the functional role of bestrophin in Best disease, in RPE development and physiology. N2 - Morbus Best (OMIM 153700) ist eine autosomal dominant vererbte Makulopathie mit juvenilem Beginn. Charakteristisch sind Eidotter-ähnliche Läsionen im zentralen Bereich der Retina. Das krankheitsverursachende Gen, das vitelliforme Makuladystrophie-Gen Typ 2 (VMD2), kodiert für ein 585 Aminosäuren langes Transmembranprotein. Das als Bestrophin bezeichnete Protein ist vorwiegend auf der basolateralen Seite des retinalen Pigmentepithels (RPE) exprimiert und wahrscheinlich am Transport von Chloridionen beteiligt. Bestrophin wie auch die drei eng-verwandten VMD2-ähnlichen Proteine (VMD2L1-L3) gehören zur Familie der VMD2 RFP-TM Proteine und sind durch putative Transmembrandomänen (TM) und ein invariantes Tripeptid (RFP) gekennzeichnet. Morbus Best wird hauptsächlich durch „missense“ Mutationen verursacht die in vier Bereichen („hotspots“) akkumulieren. Um das Mutationsspektrum zu erweitern und darüber hinaus den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus weitergehend aufzuklären, wurde das VMD2 Gen in betroffenen Patienten untersucht. Insgesamt wurden neun bisher nicht beschriebene Mutationen identifiziert, wodurch sich die Anzahl der bekannten krankheitsassoziierten Mutationen auf 92 erhöhte. Wie die meisten der bisher bekannten Mutationen befinden sich acht „missense“ Mutationen in den sogenannten „hotspots“ des Gens. Dies unterstreicht die funktionelle bzw. strukturelle Bedeutung der betroffenen Regionen sowie den dominant-negativen Effekt der Mutationen. Bemerkenswert ist eine atypische 1-Basenpaar-Deletion (Pro260fsX288) in Exon 7. Denn erstmals wurde eine „nonsense“ Mutation im VMD2 Gen identifiziert, die 50 % nicht-funktionelles Protein zur Folge hat. In seltenen Fällen scheint daher die durch „nonsense“ Mutationen bedingte Haploinsuffizienz der Krankheit zugrunde liegen. Die molekulare Diagnostik verlangt eine zuverlässliche Einteilung der VMD2 Sequenzänderungen in pathogene und nicht-pathogene Gruppen. Da der molekulare Pathomechanismus zurzeit weitgehend ungeklärt ist, wird die Pathogenität neuer Sequenzänderungen aufgrund bereits bekannter Mutationen eingestuft. Es wurde daher eine öffentlich zugängliche VMD2 Mutationsdatenbank eingerichtet (http://www.uni-wuerzburg.de/humangenetics/vmd2.html), in der die wachsende Zahl an Mutationen, Sequenzvarianten und Polymorphismen gesammelt und verwaltet wird. „Missense“ Mutationen können die Proteinfunktion auf verschiedene Weise beeinträchtigen. Geeignete molekulare Assays wurden daher etabliert, um die funkionellen Auswirkungen der VMD2 Mutationen in Hinblick auf die intrazelluläre Lokalisation zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein heterologes COS7 Expressionssystem entwickelt, es wurden verschiedene Mutationen mittels „site-directed mutagenesis“ generiert sowie Bestrophin-spezifische Antikörper hergestellt. Überraschenderweise konnte anhand von Membranfraktionierungs- und Westernblot-Analysen keine signifikanten quantitativen Unterschiede zwischen intakten und mutierten Bestrophin nachgewiesen werden. Unabhängig von Art oder Position der Mutation konnte der Einbau von mutiertem Bestrophin in die Membran gezeigt werden. Die Experimente deuten erstmalig darauf hin daß eine fehlerhafte Membranintegration als kausaler krankheitsverursachender Mechanismus ausgeschlossen werden kann. Dies liegt in Übereinstimmung mit dem dominant-negativen Effekt der Mutationen. In einem alternativen Ansatz wurde die VMD2 RFP-TM Proteinfamilie im Mausgenom identifiziert und charakterisiert. Während die Aufklärung der genomischen Struktur des Vmd2 Gens die Grundlage zur Herstellung Vmd2 transgener Mäuse darstellte (siehe unten), gewährte die Charakterisierung der eng verwandten Vmd2L1-L3 Mausgene weitere Einblicke in die Funktion des Bestrophins. Hierzu wurden bioinformatische sowie RT PCR Analysen durchgeführt. Darüber hinaus wurde die präferientielle Expression der jeweiligen Transkripte in Testis, Kolon und Skelettmuskel sowie Augengewebe anhand von „real-time quantitative“ RT PCR nachgewiesen. Interessanterweise stellt Vmd2L2 wahrscheinlich ein funktionell inaktives Pseudogen dar. Ähnlich wie sein humanes Gegenstück wird das Maus Vmd2L3- Transkript auf mRNA Ebene differentiell prozessiert. Mausmodelle für Morbus Best stellen grundlegende Hilfsmittel dar, die Pathophysiology von Bestrophin in vivo zu untersuchen. Es wurde die Herstellung zweier verschiedener Mauslinien initiiert: zum einen ein Vmd2-defizientes „knock-out“ Modell, zum anderen eine „knock-in“ Maus, die eine humane krankheitsassoziierte Mutation (Tyr227Asn) im mausorthologen Gen trägt. Die entsprechenden Konstrukte wurden hergestellt und in ES Zellen eingeschleust. Ausgehend von bislang vier isolierten ES Klonen, die den Vmd2+/- Genotyp tragen, können nun in nachfolgenden Schritten chimäre Tiere generiert werden. Die resultierenden Mauslinien repräsentieren neue experimentelle Ansätze, die funktionelle Rolle des Bestrophins in Morbus Best sowie in der Entwicklung und Physiologie des RPEs aufzukären. KW - Best-Krankheit KW - Genmutation KW - Morbus Best KW - BMD KW - VMD2 KW - Makuladegeneration KW - Mausmodell KW - Best Disease KW - BMD KW - VMD2 KW - macular degeneration KW - mouse model Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5761 ER - TY - THES A1 - Kreuzer, Mirjam T1 - Umgang mit der Legasthenie - vier Fallbeschreibungen T1 - Coping with dyslexia - four case reports N2 - Die Fallbeschreibungen der vorliegenden Arbeit befassen sich mit der Entwicklung von vier Legasthenikern bis in das Erwachsenenalter hinein. Dabei wird besonders auf die schulische und berufliche Entwicklung, die Förderung und Therapie sowie die psychische Situation eingegangen. Anschließend erfolgt ein Vergleich mit weiteren Studien, die Legastheniker über einen längeren Zeitraum begleitet haben. Es wird deutlich, dass die Entwicklung von Kindern mit einer Lese-Rechtschreibstörung entscheidend von verschiedenen Rahmenbedingungen, wie zum Beispiel einer frühen legastheniespezifischen Förderung, einer schulischen Berücksichtigung der Lese-Rechtschreibstörung, der Unterstützung durch die Familie und der Herkunft abhängt. Unter optimalen Rahmenbedingungen haben auch Legastheniker die Chance, einen ihrer Intelligenz entsprechenden Schulabschluss und einen gehobenen Beruf zu erlangen. N2 - The case reports of this dissertation describe the development of four dyslexics from childhood to adulthood. Principal topics are the school career, the profession, emotional disorders and options for support and training. The results are compared with other studies about the long-term outcome of dyslexics. The development of dyslexic children depends on several conditions, for example an early specific treatment, a remedial work at school, support of family members and the social background. If these conditions are appropriate, an academic achievement corresponding to the intellectual abilities of the dyslexic is possible. KW - Legasthenie KW - Lese-Rechtschreibstörung KW - Entwicklung KW - Förderung KW - psychische Probleme KW - Erfolg KW - dyslexia KW - development KW - treatment KW - emotional disorders KW - success Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69896 ER - TY - THES A1 - Kolokotronis, Konstantinos T1 - Genetische Ursachen hereditärer Herzerkrankungen T1 - Genetic causes of inherited cardiac diseases N2 - Hereditäre Kardiomyopathien sind durch klinische und genetische Heterogenität gekennzeichnet, welche die Kardiogenetik vor Herausforderungen stellt. In dieser Arbeit wurden manche dieser Herausforderungen angegangen, indem anhand einer Kohorte von 61 Patienten mit Kardiomyopathie bzw. primärer Arrhythmie eine Exom-Diagnostik mit anschließender stufenweiser Datenanalyse vorgenommen wurde. Ein Ziel der Arbeit war, die aktuellen diagnostischen Detektionsraten zu prüfen sowie zu bewerten, ob eine erweiterte Exom-Diagnostik im Vergleich zur üblichen Genpanel-Analyse einen diagnostischen Zugewinn bringt. Zudem sollten potenzielle Krankheitsgene sowie komplexe Genotypen identifiziert werden. Die Ergebnisse zeigten, dass bei insgesamt 64% der Patienten eine Variante von Interesse gefunden wurde. Hervorzuheben ist die hohe Detektionsrate in der größten Subkohorte, die aus Patienten mit dilatativer bzw. linksventrikulärer Non-Compaction Kardiomyopathie bestand: 69% und damit höher im Vergleich zur in der Literatur berichteten Detektionsrate von bis zu 50%. Im Rahmen der stufenweisen Daten-Auswertung zeigte sich zwar, dass die meisten kausalen Varianten in den phänotypspezifischen Panels zu finden waren, die Analyse eines erweiterten Panels mit 79 Genen sowie der Gesamtexom-Daten aber zu einer zusätzlichen Aufklärungsquote von 13% bzw. 5% führte. Durch die Erweiterung der Diagnostik konnten interessante, teilweise neue Assoziationen zwischen Genotyp und Phänotyp sowie neue Kandidatengene identifiziert werden. Das beste Beispiel dafür ist eine trunkierende Variante im STK38-Gen, das an der Phosphorylierung eines Regulators der Expression kardialer Gene beteiligt ist. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass, obwohl die Detektionsrate von Genpanels für die Routine-Diagnostik akzeptabel ist, die Anwendung von Exom-Diagnostik einen diagnostischen Zugewinn, die Entdeckung von interessanten Genotyp-Phänotyp-Korrelationen sowie die Identifizierung von Kandidatengenen ermöglicht. N2 - Hereditary cardiomyopathies are characterized by clinical and genetic heterogeneity, which poses challenges to genetic diagnostics in cardiogenetics. In this study, some of these challenges were addressed on the basis of the genetic analysis of 61 cardiomyopathy and arrhythmia patients using exome sequencing with subsequent stepwise analysis of the genetic data. One objective of the study was to examine the current diagnostic yield of genetic analysis as well as to assess the diagnostic benefit of an extended exome analysis vs. targeted gene panel analysis. Another aim was to identify novel candidate genes and describe new genotype-phenotype correlations. Regarding the results, a variant of interest could be detected in 64% of the patients. Of note is the high detection rate in the main subcohort of patients with dilated cardiomyopathy and/or left ventricular noncompaction cardiomyopathy: 69% vs. the reported detection rate of max. 50% in the literature. To evaluate the additional diagnostic benefit of extensive exome testing, a stepwise analysis of the exome data was performed. It was shown here that most of the variants of interest were detected in the phenotype-specific core gene panels; however, the analysis of an extended gene set with 79 genes and subsequently of the complete exome data led to an additional diagnostic yield of 13% and 5% respectively. Through the expansion of the genetic analysis, interesting or new genotype-phenotype correlations could be documented and candidate genes could be identified. The best candidate was a truncating variant in STK38, a gene coding for a kinase that phosphorylates a transcription regulator of genes encoding for cardiac sarcomere proteins. In conclusion, although the detection rate of gene panels is acceptable for the clinical routine, the use of exome analysis enables the highest possible diagnostic yield, the detection of interesting genotype-phenotype correlations as well as the identification of new candidate genes. KW - Herzmuskelkrankheit KW - Massive parallele Sequenzierung KW - Kandidatengen KW - Genanalyse KW - Arrhythmie KW - whole exome sequencing KW - gene panel KW - cardiogenetics KW - next generation sequencing Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-231164 ER - TY - THES A1 - Kocot, Arkadius T1 - Molekulare Ursachen des hereditären Angioödems T1 - Molecular genetics of hereditary angioedema N2 - Mutationen im C1-Inhibitor(C1-INH)-Gen manifestieren sich in Form autosomal dominant vererbter Angioödeme (hereditäres Angioödem (HAE)), wobei zwei Typen unterschieden werden. Während der HAE-Typ I mit einer Häufigkeit von 85% auftritt und durch erniedrigte C1-INH-Plasmaspiegel mit daraus resultierender niedriger Aktivität gekennzeichnet ist, liegt beim HAE-Typ II ein in seiner inhibitorischen Funktion eingeschränktes neben dem intakten Protein vor. Beide Typen unterscheiden sich nicht hinsichtlich ihrer klinischen Symptomatik und können zur Ausbildung eines lebensbedrohlichen Larynxödems führen. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die molekulargenetischen Ursachen des hereditären Angioödems untersucht. Mit Hilfe der DGGE als Screeningverfahren zur Mutationssuche im C1-Inhibitor-Gen wurde eine effiziente Methode etabliert, die eine Detektion von Punktmutationen, kleinen Deletionen und Insertionen ermöglichte. In deren Anschluss konnte durch Sequenzierung eine genaue Charakterisierung der Mutationen erfolgen. Im untersuchten Patientenkollektiv wurden 23 Mutationen bei Patienten mit HAE-Typ I identifiziert, von denen 19 bisher nicht bekannt waren. Dabei handelt es sich um 9 Missense- und 2 Nonsense-Mutationen, 5 kleine Deletionen (1-3 bp) sowie 3 Spleissmutationen, aus denen z. T. mit hoher Wahrscheinlichkeit ihre Bedeutung für die Ausbildung eines HAE erklärbar ist, wobei die Beurteilung der Kausalität der identifizierten Mutationen sich nach dem Mutationstyp und der Mutationslokalisation im Gen richtet. Erst durch die Charakterisierung des zugrundeliegenden Gendefekts wird eine Sicherung der Diagnose HAE und der Ausschluss anderer Differentialdiagnosen ermöglicht und führt damit zu einer Steigerung der Behandlungssicherheit betroffener Patienten. N2 - Mutations in the C1 esterase inhibitor (C1-INH) gene cause the autosomal dominant disorder hereditary angioedema (HAE). HAE type I (85% of kindreds) is characterized by diminished levels of functional and antigenic C1-INH, while patients with HAE type II synthetize a dysfunctional C1-INH protein having normal or raised antigenic levels. A severe complication of HAE is complete airway obstruction, caused by laryngeal edema. The presented thesis shows nineteen previously unknown mutations in the C1-INH gene causing HAE. Using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) followed by direct sequencing nine missense, two nonsense, three splicing mutations and five small deletions (1-3 bp) have been identified in the screened families. KW - Hereditäres Angioödem KW - HAE KW - C1-Inhibitor KW - C1-INH KW - hereditary angioedema KW - HAE KW - C1-inhibitor KW - C1-INH Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9227 ER - TY - THES A1 - Kochler, Yvonne T1 - Der zeitliche Verlauf von Parametern des Zellzyklus bei Patienten mit Fanconi Anämie T1 - Development of Cell Cycle Parameter in Patients with Fanconi Anemia N2 - Es werden die Parameter Summe-G2/GF und G0/G1 der hochauflösenden, zweiparametrigen Zellzyklusanalyse von Lymphozyten bei Fanconi-Anämie-Patienten, bei denen mehrere Meßwerte vorliegen, im Hinblick auf Schwankungen untersucht. Nach Auswertung der Daten stellen die Werte keine konstanten Parameter für den einzelnen Patienten dar. Die Langzeitanalyse des Zellzyklusverhaltens peripherer Blutlymphozyten reflektiert jedoch weitgehend die klinische Situation der Patienten. N2 - Two Parameter - Sum of G2/GF and G0/G1 - of twoparametric, high definition Cellcycle Analyses from Lymphocytes of Fanconi-Anemia-Patients were examined over the time. After Evaluation of Data it became clear, that Sum G2/GF and G0/G1-Parameter are not constant for each Patient over the time. But the longtime Analyses of peripheric Lymphocytes showed that they almost represent the clinical Situation of a Patient. KW - Fanconi-Anämie KW - Änderung KW - Zellzyklus KW - Parameter KW - G0/G1 KW - Summe G2/GF KW - Fanconi Anemia KW - Development KW - Parameter KW - Cellcycle Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67204 ER - TY - THES A1 - Knies, Kerstin T1 - Neue Fanconi-Anämie-Gene als Wächter des Genoms T1 - New Fanconi anemia genes as guardians of the genome N2 - Fanconi Anämie (FA) gehört zu den seltenen Chromsomeninstabilitäts-Syndromen. Ursächlich für die Erkrankung sind biallelische Mutationen mit autosomal rezessiver Vererbung in einem der bisher bekannten 21 Genen (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U und –V). Eine Ausnahme stellen FANCB und FANCS dar, die X-chromosomal rezessiv bzw. mit einem dominant negativen Effekt vererbt werden. Die Genprodukte sind als Teil des FA/BRCA-DNA-Reparatur Netzwerks bei der Beseitigung von DNA-Interstrang-Quervernetzungen (ICL) involviert. ICLs führen zu einer Stagnation der Replikationsgabel und blockieren somit wichtige zelluläre Prozesse wie Replikation und Transkription, sodass eine Aufrechterhaltung der Genomstabilität nicht mehr gewährleistet ist. FA ist gekennzeichnet durch angeborene Fehlbildungen, fortschreitendes Knochenmarkversagen und eine erhöhte Prädisposition gegenüber Krebserkrankungen. Die Diagnose basiert auf phänotypischen Auffälligkeiten und wird auf zellulärer Ebene durch die Hypersensititvät gegenüber DNA-quervernetzenden Substanzen wie Mitomycin C (MMC) bestätigt. Da nicht jeder Patient einer bisher bekannten Komplementationsgruppe zugeordnet werden kann und herkömmliche molekulare Diagnostikverfahren mit der steigenden Anzahl an FA-Genen mühsam, zeitaufwändig und teuer geworden sind, war es nötig, neue molekulare Verfahren wie Whole Exome Sequencing (WES) zu etablieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Potential dieser Methode im Bezug auf die FA-Genotypisierung erforscht. Bei der Suche nach einer optimalen Anwendung des WES, untersuchten wir verschiedene Anreicherungs- und Sequenziertechniken. Dennoch führen Fehler in den Datenbanken sowie Pseudogene zu falschen Dateninterpretationen und –darstellungen und stellen somit eine Herausforderung dar. Trotzdem zeigen unserer Daten, dass WES eine wertvolle Methode in der Molekulardiagnostik von FA ist. Dies bestätigte sich durch die Zuordnung mehrerer, vorher unklassifizierter FA-Patienten zu den bekannten Komplementationsgruppen und der Ergänzung eines siebten Patienten zum Subtyp FA-P, im Rahmen von zwei Next Generation Sequencing (NGS) Publikationen. Außerdem wurden mit Hilfe von WES zwei neue FA-Gene (FANCQ und FANCW) im Rahmen dieser Arbeit gefunden, wobei XPF (FANCQ) das erste Gen überhaupt war, welches anhand von NGS detektiert wurde. ERCC4/XPF ist eine strukturspezifische Endonuklease, die durch ein Gen kodiert wird, welches bereits vorher mit den Krankheiten Xeroderma Pigmentosum (XP) und dem segmentalen XFE progeroid Syndrom in Verbindung gebracht wurde. Unsere Daten zeigen, dass abhängig von der Mutation in XPF, Patienten eine der drei unterschiedlichen Funktionsstörungen aufweisen. Dies hebt die multifunktionale Stellung der XPF Endonuklease im Rahmen der Genomstabilität und von humanen Erkrankungen hervor. Das zweite Gen, das während dieser Arbeit entdeckt wurde, ist die WD40-Domäne tragende E3 Ubiquitin Ligase RFWD3, die kürzlich mit DNA Reparatur und insbesondere HR verknüpft wurde. Wir konnten zeigen, dass eine RFWD3 Mutation in der WD40-Domäne bei einem FA-Patienten mit der genetischen Erkrankung Fanconi Anämie assoziiert ist. Die HR ist in RFWD3 (FANCW) mutierten Zellen gestört, was auf einer verminderten Relokalisation von mutiertem RFWD3 an das Chromatin und einer defekten Interaktion mit RPA beruht. Des Weiteren weisen Rfwd3 defiziente Mäuse typische Merkmale anderer FA-Mausmodelle auf, wie verminderte Fertilität, ovarielle und testikuläre Atrophie sowie eine reduzierte Lebenserwartung. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass neue molekulare Ansätze wie NGS ein wertvolles Hilfsmittel in der FA-Diagnostik sind um bisher unklassifizierte Patienten einer Komplementationsgruppe zuordnen zu können. Zudem konnten mit Hilfe dieser Technik zwei neue Gene identifiziert werden. Deren Charakterisierung trägt zu einer Vervollständigung und weiteren Aufklärung des FA/BRCA-DNA-Reparatur-Netzwerks bei. N2 - Fanconi anemia (FA) is a rare genomic instability syndrome. Biallelic mutations are disease causing in any one of at least 21 genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U and -V). All are inherited in an autosomal recessive way, except FANCB and FANCS, which are inherited in a X-chromosomal recessive and a dominant negative way, respectively. The gene products are involved in the FA/BRCA DNA damage response pathway to remove interstrand-crosslinks (ICL). ICLs cause stalled replication forks and hence block crucial cellular processes like replication and transcription resulting in decreased maintenance of genome stability. FA is characterized by congenital malformations, progressive bone marrow failure (BMF), and susceptibility to malignancies. Patients are diagnosed based upon phenotypical manifestations and the diagnosis of FA is confirmed by the hypersensitivity of cells to DNA interstrand crosslinking agents such as Mitomycin C (MMC). Since not every patient can be assigned to a complementation group and customary molecular diagnostics has become increasingly cumbersome, time-consuming and expensive the more FA genes have been identified new molecular approaches like Whole Exome Sequencing (WES) has been established. The potential of this method for FA genotyping has been investigated in the context of this thesis. By exploring different enrichment and sequencing techniques, we were able to identify the pathogenic mutations in each case using WES. However, database errors and pseudogenes pose challenges to interpret data correctly. Nevertheless our results show that WES is a valuable tool for molecular diagnosis of FA, since we were able to assign several previously unclassified FA patients to known complementation groups in the framework of two Next Generation Sequencing (NGS) studies. In addition WES revealed two new FA-genes, XPF and RFWD3. Extraordinarily, XPF (FANCQ) is the first gene to be detected with NGS. ERCC4/XPF is a structure specific nuclease - encoding a gene previously connected to xeroderma pigmentosum (XP) and segmental XFE progeroid syndrome. Depending on the type of ERCC4 mutation individuals present with one of the three clinically distinct disorders highlighting the multifunctional nature of the XPF endonuclease in genome stability and human disease. The second gene identified within this thesis is the WD40-containing E3 ubiquitin ligase RFWD3, which has been recently linked to the repair of DNA damage by Homologous Recombination (HR). Here, we show that an RFWD3 mutation within the WD40 domain of a patient with typical FA malformations is connected to the genetic disease Fanconi anemia (FA). Disordered HR is the result of depleted relocation of mutant RFWD3 to chromatin and defective physical interaction with RPA. In addition, Rfwd3 knockout mice show ovarian and testicular atrophy, a reduced life span and pups with sub-Mendelian birth ratios indicating embryonal-lethality. These features resemble other FA mouse models. In summary, this work showed that new molecular approaches like WES are valuable tools for FA diagnosis. Additionally, this method is a useful medium to assign FA patients to so far unknown complementation groups. Two novel genes have been identified and contribute to further completion of the FA/BRCA DNA repair network in the context of genome stability. KW - DNA Reparatur KW - Fanconi Anämie KW - Neue Fanconi Anämie Gene Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150669 ER - TY - THES A1 - Klein, Andreas T1 - Der altersabhängige Verlust der Geschlechtschromosomen beim Menschen unter Einwirkung von 5-Azadeoxycytidin T1 - Age related loss of human sex chromosomes induced by 5-azadeoxycytidine N2 - Die vorliegende Arbeit untersucht, ob mit zunehmendem Alter während der Mitose häufiger Geschlechtschromsomen verlorengehen. Die Beobachtungen erfolgten an Lymphozytenkulturen gesunder weiblicher und männlicher Probanden aus drei verschiedenen Altersgruppen. Unter Zugabe von 5-Azadeoxycytidin, einem Nukleosidanalogon, ergab sich in den höheren Altersgruppen ein verstärktes Auftreten von Mikronuklei. Mikronuklei enthalten Chromosomen oder -bruchstücke, die während der Mitose nicht in die Tochterzellkerne integriert wurden. Mittels in situ Hybridisierung konnte in den Mikronuklei der Frauen zu 5,5 Prozent ein X-Chromosom, bei den Männern mit 10,7 Prozent überzufällig häufig ein Y-Chromosom nachgewiesen werden. Zwischen den einzelnen Altersstufen änderte sich dieser Anteil nicht wesentlich. 5-Azadeoxycytidin wird als Nukleosidanalogon während der Replikation in die DNA eingebaut und verhindert die Methylierung des Tochterstrangs, da ein Kohlenstoffatom im Pyrimidinrings durch ein Stickstoffatom substituiert ist. Wahrscheinlich resultiert aus der Hyomethylierung eine falsche "Verpackung" des Gonosoms während der Mitose, dadurch erfolgt eine fehlerhafte Aufteilung des Chromosoms mit Bildung eines Mikronukleus. N2 - In lymphocyte cultures, the number of aneuploid cell nuclei increases with age. A preferential loss of sex chromosomes is supected. Lymphocyte cultures of female and male probands were treated with 5-azadeoxycytidine and an increased frequency of micronuclei in relation to age was observed. In situ hybridizations with X-specific and Y-specific DNA probes were carried out, and 5.5 per cent of female and 10.7 per cent of male micronuclei contained a sex chromosom. 5-azadeoxycytidine induces hypomethylation of the DNA and undercondensation in the heterochromatic regions of chromosomes 1, 9, 15, 16, and Y. The results suggest that in 5-azadeoxycytidine-treated cultures the Y-chromosome is lagged during mitosis, with subsequent chromosome loss via micronucleus formation. This mechanism may explain hypoploidy of sex chromosomes with ageing. KW - Altern KW - Geschlechtschromosomen KW - Chromosomenverlust KW - 5-Azadeoxycytidin KW - Mikronukleus KW - ageing KW - sex chromosomes KW - chromosome loss KW - 5-azadeoxycytidine micronucleus Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-327714 N1 - Dieses Dokument wurde aus Datenschutzgründen - ohne inhaltliche Änderungen - erneut veröffentlicht. Die ursprüngliche Veröffentlichung war am 12.08.2002 ER - TY - THES A1 - Klein, Andreas T1 - Der altersabhängige Verlust der Geschlechtschromosomen beim Menschen unter Einwirkung von 5-Azadeoxycytidin T1 - Age related loss of human sex chromosomes induced by 5-azadeoxycytidine N2 - Die vorliegende Arbeit untersucht, ob mit zunehmendem Alter während der Mitose häufiger Geschlechtschromsomen verlorengehen. Die Beobachtungen erfolgten an Lymphozytenkulturen gesunder weiblicher und männlicher Probanden aus drei verschiedenen Altersgruppen. Unter Zugabe von 5-Azadeoxycytidin, einem Nukleosidanalogon, ergab sich in den höheren Altersgruppen ein verstärktes Auftreten von Mikronuklei. Mikronuklei enthalten Chromosomen oder -bruchstücke, die während der Mitose nicht in die Tochterzellkerne integriert wurden. Mittels in situ Hybridisierung konnte in den Mikronuklei der Frauen zu 5,5 Prozent ein X-Chromosom, bei den Männern mit 10,7 Prozent überzufällig häufig ein Y-Chromosom nachgewiesen werden. Zwischen den einzelnen Altersstufen änderte sich dieser Anteil nicht wesentlich. 5-Azadeoxycytidin wird als Nukleosidanalogon während der Replikation in die DNA eingebaut und verhindert die Methylierung des Tochterstrangs, da ein Kohlenstoffatom im Pyrimidinrings durch ein Stickstoffatom substituiert ist. Wahrscheinlich resultiert aus der Hyomethylierung eine falsche "Verpackung" des Gonosoms während der Mitose, dadurch erfolgt eine fehlerhafte Aufteilung des Chromosoms mit Bildung eines Mikronukleus. N2 - In lymphocyte cultures, the number of aneuploid cell nuclei increases with age. A preferential loss of sex chromosomes is supected. Lymphocyte cultures of female and male probands were treated with 5-azadeoxycytidine and an increased frequency of micronuclei in relation to age was observed. In situ hybridizations with X-specific and Y-specific DNA probes were carried out, and 5.5 per cent of female and 10.7 per cent of male micronuclei contained a sex chromosom. 5-azadeoxycytidine induces hypomethylation of the DNA and undercondensation in the heterochromatic regions of chromosomes 1, 9, 15, 16, and Y. The results suggest that in 5-azadeoxycytidine-treated cultures the Y-chromosome is lagged during mitosis, with subsequent chromosome loss via micronucleus formation. This mechanism may explain hypoploidy of sex chromosomes with ageing. KW - Altern KW - Geschlechtschromosomen KW - Chromosomenverlust KW - 5-Azadeoxycytidin KW - Mikronukleus KW - ageing KW - sex chromosomes KW - chromosome loss KW - 5-azadeoxycytidine micronucleus Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181416 N1 - Aus datenschutzrechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. Eine inhaltlich identische neue Version ist erhältlich unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-32771 ER - TY - THES A1 - Kiene, Carmen T1 - Immunozytogenetische Analysen an Interphase-Zellen und Meiose-Stadien der Maus T1 - Immunocytogenetic analysis of mouse interphase cells and meiotic stages N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden mittels 5-Methylcytosin Immunofärbung zytogenetische Analysen an Metaphasechromosomen aus der Mitose, an Interphase-Zellen verschiedener Organe und an Meiose-Stadien der Maus (Mus musculus) zur Detektion hypermethylierter DNA durchgeführt. Zusätzlich erfolgte eine C-Bänderung an Metaphasechromosomen und Meiose-Stadien zum Nachweis von konstitutivem Heterochromatin. N2 - In the present work, 5-methylcytosine immunostaining was used to perform cytogenetic analysis on metaphase chromosomes from mitosis, on interphase cells from various organs and on meiotic stages of the mouse (Mus musculus) to detect hypermethylated DNA. In addition, C-banding was performed on metaphase chromosomes and meiosis stages to detect constitutive heterochromatin. KW - Cytogenetik KW - Maus KW - Immunfluoreszenz KW - Meiose KW - Zellkern KW - DNA-Methylierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-279109 ER - TY - THES A1 - Kern, Christine T1 - Zytogenetische Analysen von multiplen Chromosomen- Translokationen bei der Maus mit spektraler Karyotypenanalyse T1 - Cytogenetic analysis of multiple chromosomal translocations of the mouse with spectral karyotyping N2 - Das Mausmodell war in der Säugetiergenetik schon immer ein interessantes Forschungsobjekt, insbesondere die in bestimmten geographischen Gebieten vorkommenden Mauspopulationen mit zahlreichen Robertson`schen Translokationen. Mit Kreuzungsversuchen von Mauspopulationen mit unterschiedlichen Robertson`schen Translokationen lassen sich chromosomale Interaktionen in der Meiosephase und morphogenetische Auswirkungen von dadurch entstandenen Mono- oder Trisomien untersuchen. Mit Hilfe der Spektralen Karyotypisierung gelang es in dieser Arbeit die chromosomale Anordnung in der Meiose bei Mauspopulationen mit Robertson`schen Translokationen exakt darzustellen. Hierbei wurde diese Technik an Meiosezellen der Maus etabliert. Es konnten dabei interessante Lagebeziehungen zwischen Meioseformationen und frei liegenden Chromosomen beobachtet werden. Auch fiel die erhebliche Stabilität der Multivalent- Formationen der F1- Tochtergeneration auf. Die Spektrale Karyotypisierung erwies sich hierbei als äußerst effizientes Verfahren, das aufgrund seiner relativ unkomplizierten Handhabung, seiner sehr guten Reproduzierbarkeit und universellen Einsetzbarkeit als Screening Verfahren ideal erscheint Um die dabei gewonnenen Ergebnisse richtig interpretieren zu können sind sicherlich weitere Untersuchungen auf molekularer Ebene nötig. N2 - The mouse model has always been an interesting field of research in the mammalian genetic, especially mice populations with robertsonian translocations. Crossbreeding experiments of mice population with different robertsonian translocations allow examination of chromosomal interactions in the meiotic process and morphogenetic effects of resulting chromosomal aberrations. With spectral karyotyping it was possible to describe the chromosomal arrangement in the meiotic process of mice population with robertsonian translocations. This technique was established for meiotic cells in this work. An interesting spatial relationship between the meiotic ring formation and particular chromosomes during the meiotic process was observed. Additionally, the multivalent- meiotic formations were found to be highly stable. To interpret the results of this study more in detail further molecular analysis will be necessary. This technique proved to be an efficient procedure. Use as a screening technique is possible due to the streamlined work-flow, high reproducibility and its universal applicability. KW - Robertsonsche Translokation KW - spektrale Karyotypenanalyse KW - robertsonian translocation KW - spectral karyotyping Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21097 ER - TY - THES A1 - Kenner, Julia Elke T1 - Inzidenzschätzung der Gliedergürtelmuskeldystrophien für Deutschland T1 - Estimation on the incidence of limb-girdle muscular dystrophies for Germany N2 - Die LGMD ist eine seltene Erbkrankheit der Muskelfasern, die zur Abnahme der Muskelmasse und der Muskelkraft führt. Das Institut der Humangenetik der Universität Würzburg ist eine der wenigen Stellen in Deutschland, die die molekulargenetische Diagnostik der LGMD 1B, 1C, 2A, 2B, 2D und 2I anbietet. Demnach liegen hier viele Daten vor und anhand dieser Daten konnten die Inzidenzen dieser Formen für Deutschland geschätzt werden. Zur Schätzung der LGMD-Inzidenz wurde eine andere Erkrankung herangezogen, die ähnlich selten auftritt wie die LGMD: DM1 und DM2. Die Schätzung ergab eine Inzidenz von 1: 33 000 für die autosomal-rezessiven Formen der LGMD und eine Inzidenz von 1: 272 000 für die autosomal-dominanten Formen der LGMD für Deutschland. Vergleicht man diese Daten mit den Daten aus der Weltliteratur , sieht man, dass die Häufigkeiten nahezu identisch sind. N2 - LGMD is a rare hereditary disease of muscular fibres which leads to a decrease in muscle mass and muscle strength. The 'Institut der Humangenetik' at Würzburg University is one of the few bodies in Germany that offers molecular genetic diagnosis of LGMD types 1B, 1C, 2A, 2B, 2D, and 2I. Accordingly, it offers a lot of data which allow an estimation of the incidence of these types for Germany. For the estimation of LGMD incidence, another disease that occurs similarly rarely, is used for comparison: DM1 and DM2. The estimation resulted in an incidence of 1: 33,000 for the autosomal recessive forms of LGMD and an incidence of 1: 272,000 for the autosomal dominant forms of LGMD for Germany. A comparison of these data with data from international literature leads to the result that the incidences are almost identical. KW - Inzidenz KW - Gliedergürtelmuskeldystrophie KW - Inzidenzschätzung KW - Muskeldystrophie KW - autosomal-dominant KW - autosomal-rezessiv KW - incidence KW - limb-girdle muscular dystrophies KW - autosomal recessive KW - autosomal dominant Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75562 ER - TY - THES A1 - Kellner, Dorothee T1 - Molekulargenetische Diagnostik von FGFR-/TWIST-Defekten im Verlauf: eine retrospektive Studie im Zeitraum 2000-2004 T1 - Molecular genetic diagnostics of FGFR-/TWIST-defects: a retrospektive study in the period 2000-2004 N2 - Im Zeitraum 2000 - 2004 wurden dem Institut für Humangenetik der Universität Würzburg insgesamt 12.049 Patienten zur molekulargenetischen Diagnostik zugewiesen. Anforderungen zum Ausschluss von FGFR-/TWIST-Defekten machen hierbei 6% des gesamten Patientenguts aus (714 untersuchte Patienten). Innerhalb der Krankheitsgruppe der FGFR-/TWIST-Defekte steht die molekulargenetische Bestätigung bzw. der Ausschluss eines Muenke-Syndroms mit 219 Patienten im Zeitraum 2000-2004 an erster Stelle. An zweiter Stelle folgt das Saethre-Chotzen-Syndrom mit 180 untersuchten Patienten. Am dritthäufigsten wurden Anfragen zur molekulargenetischen Diagnostik bei Verdacht auf ein Crouzon-/bzw. Pfeiffer-Syndrom (152 Patienten) gestellt. Die Zahl der Anforderungen blieb im Fünfjahresverlauf relativ konstant, d. h. es gab in Bezug auf die Anzahl der untersuchten Patienten/Jahr nur geringfügige Fluktuationen. Die Anforderungen einer molekulargenetischen Diagnostik bei klinischem Verdacht auf FGFR-/TWIST- Defekte kamen schwerpunktmäßig aus Würzburg, München, Ansbach, Erfurt und Berlin. Am häufigsten konnte die klinische Verdachtsdiagnose beim Apert-Syndrom durch den Mutationsnachweis im FGFR2-Gen bestätigt werden (in 67% der Fälle). An zweiter Stelle, d. h. in 33% der Fälle, konnte durch die molekulargenetische Diagnostik des FGFR3-Gens die Verdachtsdiagnose der Achondroplasie bestätigt werden. Am dritthäufigsten, d.h. in 20% der Fälle konnten die Genanalysen die Verdachtsdiagnose Crouzon-/bzw. Pfeiffer-Syndrom bestätigen. Die grössten differentialdiagnostischen Schwierigkeiten bestehen klinischerseits offenbar beim Muenke-Syndrom (FGFR3) sowie beim Saethre-Chotzen-Syndrom (TWIST1) und der Hypochondroplasie (FGFR3). Bei diesen Entitäten konnte die klinische Verdachtsdiagnose lediglich in weniger als 15% der Fälle auf der molekulargenetischen Ebene bestätigt werden. Diese Ergebnisse verdeutlichen die ausgeprägte phänotypische Variabilität die bei den einzelnen Erkrankungen besteht. Die molekulargenetische Bestätigung bzw. der Ausschluss der klinischen Verdachtsdiagnose bildet die Grundlage für Prognose und Therapie der Patienten. Dies wird insbesondere hinsichtlich der Implikationen der molekulargenetischen Differenzierung zwischen den phänotypisch ähnlichen Kraniosynostose-Syndromen (Saethre-Chotzen vs. Muenke) deutlich. Z. B. kennzeichnen progressive multisuturale Fusionen das Saethre-Chotzen-, nicht jedoch das Muenke-Syndrom. Wegen des hohen Risikos einer rekurrenten intrakraniellen Hypertension benötigen SCS-Patienten im Kindesalter eine regelmässige Kontrolle. N2 - During a five year time period (2000 - 2004) the Department of Human and Medical Genetics at the University of Wurzburg School of Medicine received a total of 12.049 requests for molecular genetic investigations of a variety of inherited conditions. The group of patients requiring exclusion and/or confirmation of defects in the FGFR- and TWIST genes amounted to 6% of the total requests (714 patients). The most frequent requests for mutation analysis involved patients with the clinical suspicion of Muenke-syndrome (219 patients), followed by patients thought to be affected by the Saethre-Chotzen syndrome (180 patients). Third in frequency were patients in whom the clinicians requested the exclusion and/or confirmation of the Crouzon and Pfeiffer syndromes (152 patients). The number of requests remained quite constant throughout the five year period, with only minor fluctuations. Most of the requests originated from clinical centres in Wurzburg, Munich, Ansbach, Erfurt and Berlin. In terms of the molecular confirmation of the clinical diagnosis, the Apert-syndrome ranked first with 67% of cases confirmed by mutation analysis. In contrast, the growth disorder achondroplasia could be confirmed at the molecular level in only 33% of the referrals. This figure was even lower (around 20%) for the clinical suspicion of the Crouzon and/or Pfeiffer syndromes. With only 15% positive results of the mutation analysis Muenke and Saethre-Chotzen syndromes ranked last. These relative low yields of patients who proved positive for the respective mutations reflect the difficulties with regard to differential diagnosis of phenotypically overlapping and highly variable clinical conditions. Exclusion and/or confirmation of a molecular defect in one of the disease causing genes therefore is the starting point for the optimal clinical management of these patients. This is illustrated by the comparison between syndromes with overlapping clinical features, such as the Saethre-Chotzen and the Muenke syndromes: whereas progressive multisutural fusions (with a high risk of recurrence after surgical intervention) characterize the variable TWIST1 mutations causing Saethre-Chotzen syndrome, the Pro250Arg substitution in FGFR3 underlying the Muenke syndrome leads to mental delay and sensorineural hearing loss rather than intracranial hypertension. Because of the high risk of recurrent intracranial hypertension, Saethre-Chotzen patients require close follow-ups during their childhood years. KW - Würzburg / Institut für Humangenetik KW - Kraniosynostosen KW - Muenke-Syndrom KW - Pfeiffer-Syndrom KW - Achondroplasie KW - Craniosynostosis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46884 ER - TY - THES A1 - Karkazis, Andreas T1 - Vergleich von sozialrechtlichen Gestaltungsmöglichkeiten der medizinischen Versorgung in der Humangenetik an der Universität Würzburg durch das SGB V / 2004 T1 - Comparison of different scopes of design in medical sercice in the field of Human Genetics according to Health Care legislation N2 - „Die berufspolitische Situation für die Humangenetischen Institute hat sich an den Universitäten in den letzten zwei Jahren leider nicht verbessert. Vielen Instituten wurde der Zugang zur Erbringung von Kassenleistungen deutlich erschwert bzw. gänzlich entzogen.“ (Grimm, T.; Zerres, K., 2005, S. 41). Eine Analyse der Rechtsform und Aufbauorganisation sowie der Leistungen des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg kann als Grundlage dienen, um die Auswirkungen einer entzogenen Kassenzulassung besser verstehen zu können. Zudem ermöglicht eine solche Betrachtung die Ableitung von Erfordernissen, die eine optimale Rechtsform und Aufbauorganisation des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg erfüllen sollte. Zusammenfassend können dann die aktuellen und zukünftigen Rahmenbedingungen für die humangenetische Leistungserbringung bei bestehender Rechtsform und Aufbauorganisation beschrieben werden. Es wird deutlich, dass aufgrund eines drohenden Entzuges der Kassenzulassung eine Gefährdung der Erbringung humangenetischer Leistungen an der Universität Würzburg besteht. Die Finanzierung der erbrachten Leistungen in der Patientenversorgung wird zu ca. 75% von den gesetzlichen Krankenkassen getragen. Ein Wegbrechen eines solchen Leistungsumfanges hätte kaum kompensierbare Auswirkungen auf Forschung, Lehre, Weiterbildung und die Patientenversorgung an sich. Durch die Reformen des SGB aus dem Jahre 2004 sind verschiedene Alternativen zur bestehenden Rechtsform und Aufbauorganisation möglich geworden. Hierbei handelt es sich um Hochschulambulanzen (gem. §117 SGB V), Integrierte Versorgung (gem. §140 SGB V) und Medizinische Versorgungszentren (gem. §95 SGB V). Zudem gibt es die Möglichkeit einer „Praxis im Institut“-Kooperation. Diese Alternativen werden in der hier vorliegenden Arbeit kurz einzeln charakterisiert, um dann eine Bewertung der möglichen Rechtsformen und Aufbauorganisationen gemäß am Institut bestehender Erfordernisse zu ermöglichen. Die vergleichende Betrachtung wird zeigen, dass ein Medizinisches Versorgungszentrum (MVZ) eine gute Möglichkeit darstellt, die beschriebene Problematik zu lösen und die Erfordernisse des Instituts zu erfüllen. Im Anschluss werden die rechtlichen und organisatorischen Ausgestaltungsmöglichkeiten eines MVZs zur Erbringung humangenetischer Leistungen beleuchtet. Hierbei wird im Besonderen auf die gesetzlichen Gründungsvoraussetzungen eingegangen. Die Anforderungen an Gründer, Rechtsform, Leistungserbringer und ärztliche Leitung werden detailliert beschrieben, und die jeweiligen Gestaltungsmöglichkeiten im Hinblick auf die am Institut bestehenden Erfordernisse gewertet. Im Anschluss kann der Zulassungsprozess des MVZs an sich betrachtet werden. N2 - Comparison of different scopes of design in medical sercice in the field of Human Genetics according to Health Care legislation KW - Humangenetik KW - Humangenetik KW - Medizinisches Versorgungszentrum KW - Organisationsform KW - integrierte Versorgung Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34679 ER - TY - THES A1 - Kalb, Reinhard T1 - Fanconi anemia and RAD50 deficiency : genetic and functional analysis T1 - Fanconi Anämie und RAD50-Defizienz : genetische und funktionelle Analysen N2 - Human caretaker genes play a central role in the DNA damage response. Their defects cause a number of rare diseases which show genetic instability and increased propensity to malignant cell growth. The first of these diseases to be described in this thesis is Fanconi anemia (FA), a rare chromosome instability disorder with recessive inheritance characterized by progressive bone marrow failure, variable congenital malformations, and cancer predisposition. There are at least 13 FA complementation groups (FA-A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), each representing mutations in a distinct gene. To date, except FANCI all the corresponding genes have been identified, denoted as FANC-A, B, C, D1/BRCA2, D2, E, F, G, J/BRIP1/BACH1, L/PHF9, M/Hef and N/PALB2.Further information is provided in chapters 1 and 2. FA cells are characterized by high sensitivity to DNA crosslinking agents and to elevated oxygen tension, but it is controversial whether they are also radiosensitive. Systematic testing (chapter 3) of primary skin fibroblast cultures from all currently known FA complementation groups revealed no increased sensitivity towards ionizing radiation (IR) and ultra-violet light (UV) when growing cells at physiological (5% v/v) oxygen levels. Despite considerable interstrain variations FA cells showed no systematic differences to cell cultures derived from healthy controls, whereas positive controls (Ataxia telangiectasia and Cockayne syndrome) proved highly sensitive to IR or UV. Lack of radiosensitivity was also shown for the FANCD2 gene, a central gene in the FA/BRCA pathway whose mutational inactivation was studied in a large patient cohort. FA patients excluded previously from complementation groups FA-A, -C, E, F, G or L were screened for mutations in FANCD2. Even though mutation analysis of FANCD2 is complicated by the presence of pseudogene regions, biallelic FANCD2 mutations were identified in a series of 32 patients (chapter 4). The predominant types of mutations result in aberrant splicing causing exon skipping, exonisation of intronic sequence, activation of cryptic and creation of new 3´ splice sites. Many alleles were recurrent and could be associated with ethnicity. Interestingly, residual FANCD2 protein was observed in all available patient cell lines, and functionality was indicated by the presence of the monoubiquitinated FANCD2 isoform. This suggests that viability of FA-D2 patients depends on the presence of hypomorphic or leaky mutations. In chapter 5 the worldwide second FA patient belonging to complementation group FA-L is reported. Genetic analysis of patient derived fibroblasts revealed heterozygosity for a 5-bp deletion (exon 7) and a missense substitution (exon 11). In contrast to the tested fibroblasts two independent lymphoid cell lines proved resistant to the DNA crosslinking agent mitomycin C and showed proficient FANCD2 monoubiquitination. The functional reversion due to a compensating mutation in the splice acceptor site results in aberrant splicing and the restoration of the open reading frame. However, the revertant mosaicsm was restricted to the lymphatic cell lines such that there was no clinical improvement involving the other hematopoietic cell lineages, and bone marrow transplantation was required to treat the patients bone marrow failure. A direct link of Fanconi anemia to other DNA repair processes was provided by the identification of the BRCA1 interacting protein 1, BRIP1/BACH1, as a genuine FA gene (chapter 6). Genetic mapping of consanguineous Inuit families resulted in the identification of truncating mutations in BRIP1. In contrast to most of the other FA patients FANCD2 monoubiquitination was intact, linking these patients to complementation group FA-J. Biallelic mutations in BRIP1 were found in eight additional patients, one of whom was assigned previously to FA-J by somatic cell fusion. Therefore it could be shown that the postulated FANCJ gene is identical with BRIP1. This finding emphasizes the close connection between the BRCA- and the FA-family of genes, both involved in the DNA damage response. Biallelic mutations in BRCA2/FANCD1 cause a severe form of Fanconi anemia with childhood malignancies. Recently, a BRCA2 interacting protein was identified as a “partner and localizer of BRCA2” (PALB2) which confers cellular MMC resistance. A candidate gene approach revealed biallelic mutations in seven FA patients that developed solid tumors in early childhood (chapter 7). Patient cells show no or little PALB2 protein, lack of MMC induced RAD51 foci formation, and high chromosomal instability. Transduction of PALB2 cDNA complemented the MMC sensitive phenotype. Therefore, biallelic mutations in PALB2 cause a new subtype of FA, denoted as FA-N, which is connected with a high and early cancer risk. With respect to one of the most prominent but least understood caretaker gene syndromes, Fanconi anemia, this thesis has expanded our knowledge as follows: 1. refutation of major cellular radiosensitivity of FA cell lines regardless of complementation group, 2. detection of hypomorphic mutations and residual protein levels as a prerequisite for viability of the FANCD2 gene, 3. description of the worldwide second patient belonging to complementation group FA-L whose lymphocytes exhibit a novel type of somatic reversion, 4. participation in the discovery and functional characterization of two novel FA genes (FANCJ and FANCN). The last chapter of the thesis deals with a DNA repair pathway that is activated following exposure to ionizing radation. One of the central proteins responding to radiation-induced DNA damage is the product of the ATM gene which signals to a myriad of other proteins in response to DNA double strand breaks, including the NMR complex. This complex formed by the NBS1/MRE11/RAD50 proteins is thought to act as a specifi c sensor of DNA double-strand breaks. Mutations of MRE11 and NBS1 are associated with the radiation sensitivity syndromes Ataxia-telangiectasia-like disorder (AT-LD) and Nijmegen breakage syndrome (NBS), respectively. Chapter 8 presents the first ever identified patient with RAD50 deficiency due to biallelic germline mutations in the RAD50 gene. An 18-year-old German girl who has a variant form of NBS without immunodeficiency was found to be compound heterozygous for a nonsense mutation and the loss of the natural termination signal in the RAD50 gene. RAD50 protein expression was reduced to less than one tenth of normal in her fibroblasts and lymphoblastoid cells. At the nuclear level, RAD50 deficiency was associated with a high frequency of spontaneous chromatid exchanges and with the failure to form MRE11 and NBS1 nuclear foci in response to irradiation. ATM autophosphorylation, phosphorylation of p53 at serine 15 and the transcriptional induction of p21/WAF1 mRNA were reduced, and there was no evidence for Ser343 phosphorylation of NBS1 in RAD50 defi cient cells following irradiation. These defects could be complemented by expression of wildtype RAD50 cDNA. Our data shows that RAD50 modulates, like NBS1 and MRE11, the ATM-mediated DNA damage response and the G1/S cell cycle checkpoint. In addition, RAD50 appears to be required for nuclear localization of MRE11, and for NBS1 focus formation, underlining its importance for the proper function of the NMR complex. Owing to the studies performed within the framework of this thesis, RAD50 deficiency can now be added to the growing list of human caretaker gene syndromes with pronounced radiosensitivity that is distinctive at both the cellular and the clinical level from deficiencies involving the other members of the NMR complex. N2 - Die sogenannten “Caretaker”-Gene spielen eine zentrale Rolle in der zellulären Antwort auf DNA Schäden. Mutationen in diesen Genen führen zur Ausprägung von einigen seltenen Erbkrankheiten, die sich durch genetische Instabilität und in vielen Fällen durch erhöhtes Krebsrisiko auszeichnen. Eine dieser Erkrankungen, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde, ist Fanconi Anämie (FA). Dabei handelt es sich um eine sehr seltene chromosomale Instabilitätserkrankung, die einem rezessiven Erbgang folgt. Der klinische Phänotyp von FA ist gekennzeichnet durch ein variables Spektrum von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarksversagen und einer Prädisposition für Neoplasien. Durch somatische Zellfusionstudien und in einigen Fällen durch direkte genetische Zuordnung konnten bisher 13 Komplementationsgruppen definiert werden (FAA, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), von denen jede einen Defekt in einem bestimmten Gen widerspiegelt. Inzwischen sind, mit Ausnahme von FANCI, alle korrespondierenden FA Gene identifiziert. Ein Überblick über den aktuellen Stand ist in den Kapiteln 1 und 2 dieser Arbeit zu finden. Zellen von FA-Patienten zeichnen sich durch eine hohe Sensitivität gegenüber DNA quervernetzenden Substanzen und einer hohen Empfindlichkeit gegenüber einer erhöhten Sauerstoffkonzentration aus. Zur Frage der Radiosensitivität von FA-Zellen gab es bisher nur widersprüchliche Daten. Mit Hilfe einer systematischen Analyse von primären Fibroblasten aller (zum Zeitpunkt der Untersuchung) bekannten Komplementationsgruppen konnte gezeigt werden, dass unter physiologischen Sauerstoffkonzentrationen keine erhöhte Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung (IR) und ultraviolettem Licht (UV) besteht (Kapitel 3). Trotz einigen Zellinien-spezifischen Schwankungen waren die Unterschiede zwischen Patientenzellen und gesunden Kontrollen marginal, verglichen mit der eindeutig erhöhten Sensitivität von Zellen positiver Kontrollen (Ataxia telangiactasia (IR Kontrolle) bzw. Cockayne Syndrom (UV-Kontrolle)). Die in Kapitel 3 nachgewiesene fehlende Radiosensitivität von FA-Zellen ist im Kontext des FANCD2-Gens von besonderem Interesse, da diesem Gen eine Schlüsselposition im FA/BRCA Doppelstrangbruch-Reparaturweg zukommt. Das Screening von FA-Patienten, bei denen bereits eine Zuordnung zu den Komplementationsgruppen FA-A, C, E, F, G und L ausgeschlossen war, führte zur Identifikation einer Reihe von FA-D2 Patienten. In einer großen Kohortenstudie wurden 29 FA-D2 Patienten mit klinischen Informationen sowie 3 zusätzliche FA-D2 Patienten hinsichtlich ihrer Mutationen in FANCD2 untersucht (Kapitel 4). Für alle 32 Patienten konnten biallelische Mutationen nachgewiesen werden, auch wenn das Vorhandensein von pseudogenen Regionen die Mutationsanalyse erschwerte. Wie in keinem der anderen FA-Gene führt die Mehrzahl der Mutationen in FANCD2 zu verändertem Spleißenverhalten, wie zum Beispiel zur Exklusion eines Exons, zur Exonisation intronischer Bereiche, der Aktivierung von kryptischen oder der Erzeugung von neuen 3´ Spleißstellen. Viele Allele wurden mehrfach gefunden und konnten einem ethnischen Hintergrund zugeordnet werden. In allen verfügbaren lymphoblastoiden Patienten-Zelllinien wurde residuales FANCD2-Protein detektiert, wobei das Vorhandensein der monoubiquitinylierten Isoform auf ein funktionelles Protein hindeutet. Zusammen mit der Tatsache, dass in keinem der Patienten eindeutige biallelische Nullmutationen nachgewiesen werden konnten, ist somit offenbar das Vorhandensein von hypomorphen Mutationen und entsprechendem Restprotein für die Lebensfähigkeit von FA-D2 Patienten essentiell. In Kapitel 5 wird der weltweit zweite FA Patient vorgestellt, welcher der Komplementationsgruppe FA-L zugeordnet werden konnte. Die genetische Analyse von primären Fibroblasten dieses Patienten führte zum Nachweis einer 5 Basen umfassenden Deletion in Exon 7 sowie zu einer Missense-Mutation in Exon 11. Im Gegensatz zu den untersuchten Fibroblasten zeigten zwei unabhängig etablierte lymphoblastoide Zellinien keine erhöhte Sensitivität gegenüber Mitomycin C, was auf einer somatische Reversion beruhen kann. Diese Vermutung wurde durch den Nachweis einer induzierbaren Monoubiquitinylierung von FANCD2 in Lymphoblasten bestätigt. Die funktionelle Reversion basiert auf einer zur Deletion in cis befindlichen kompensatorischen Mutation im Spleiß-Akzeptor von Exon 7, die zu einem veränderten Spleißprodukt und der Wiederherstellung des Leserahmens führt. Die somatische Reversion beschränkt sich jedoch auf die lymphatischen Zellreihen und hatte daher nur einen partiellen Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Ein allgemeines Knochenmarksversagens machte eine Transplantation unumgänglich. Die Konditionierung wurde jedoch auf das vorhandene hämatopoietische Mosaik abgestimmt, um eine Graft vs. Host Reaktion zu vermeiden. Die Identifizierung des BRCA1 interagierenden Proteins 1 (BRIP1/BACH1) als ein bona fide FA-Gen (Kapitel 6) verdeutlicht die direkte Verknüpfung des FA/BRCA DNA Reparaturweges mit anderen DNA Reparaturwegen. Trunkierende Mutationen in BRIP1 wurden in zwei blutsverwandten Eskimofamilien mittels genetischer Positionsanalysen gefunden. Im Gegensatz zu den meisten anderen FA Patienten war die Monoubiquitinylierung von FANCD2 trotz MMC Empfindlichkeit intakt, was für eine Zuordnung zur Komplementationsgruppe FA-J sprach. Biallelische Mutationen in BRIP1 wurden in 8 weiteren Patienten gefunden, von denen einer ursprünglich durch somatische Zellfusion zu FA-J zugeordnet wurde. Dadurch konnte gezeigt werden, dass das postulierte FANCJ Gen mit BRIP1 identisch ist. Als eines der wenigen FA Gene besitzt BRIP1 bekannte funktionelle Domänen (DNA Helikase), die somit biochemisch für die Entschlüsselung des FA/BRCA Weges genutzt werden können. Biallelische Muatationen in FANCD1, welches identisch mit dem bekannten Brustkrebsgen BRCA2 ist, führen zu einer besonders schweren Form von Fanconi Anämie, die bereits im frühen Kindesalter mit einem sehr hohen Krebsrisko verbunden ist. Kurz vor Abschluss dieser Arbeit gelang die Charakterisierung eines mit BRCA2 interagierendes Proteins, welches als „partner und localizer of BRCA2“ (kurz PALB2) bezeichnet wurde und offenbar zelluläre Resistenz gegenüber Mitomycin C (MMC) bedingt. Ein genetischer Screen von bisher nicht-klassifizierten FA-Patienten führte zur Identifizierung von sieben Patienten mit biallelischen Mutationen in PALB2 (Kapitel 7). Alle Patienten entwickelten bereits im frühen Kindesalter bösartige Tumore. Der zelluläre Phänotyp von PALB2- defizienten Zellen weist eine Störung der MMC induzierten RAD51 Foci-Bildung auf. Darüberhinaus zeigen PALB2-defiziente Zellen eine spontane chromosomale Instabilität, die durch eine MMC-Gabe stark erhöht werden kann. Die Transduktion von PALB2 cDNA führt zur Reduktion der MMC induzierten G2 Phasen Arretierung und zur Reversion des MMC-sensitiven Phänotyps. Biallelische Mutationen in PALB2 verursachen somit eine Form von Fanconi Anämie, die mit hohem Krebsrisiko verbunden ist. PALB2 wird nach der gängigen FA-Nomenklatur als FANCN bezeichnet und liegt der neu definierten Komplementationsgruppe FA-N zugrunde. Die vorliegende Arbeit hat in mehreren Punkten zur Verbesserung des derzeitigen Wissenstandes über die komplexe genetisch bedingte Erkrankung Fanconi Anämie beigetragen 1. trotz molekularer Wechselwirkung von FA-Proteinen mit Komponenten aus anderen DNA-Reparatursystemen zeigen Zellen von FA Patienten unabhängig von der Komplentationsgruppe weder Strahlen- noch UV-Sensitivität; 2. die Existenz von hypomorphen Mutationen in FANCD2 und das Auftreten von Restprotein korreliert offenbar mit der Lebensfähigkeit von biallelischen Mutationen im FANCD2 Gen. 3. unter den bisher nicht klassifizierten Patienten wurde der weltweit zweite Patient der Komplementationsgruppe FA-L gefunden, in dessen Blutzellen ein neuartiger Mechanismus von somatischer Reversion nachgewiesen werden konnte 4. die Beteiligung an der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung von zwei neuen FA-Genen (FANCJ und FANCN), welche die FA-abhängigen DNA-Reparaturwege direkt mit den Brustkrebsgenen BRCA1 und BRCA2 in Verbindung bringen. Das letzte Kapitel der Arbeit befasst sich mit einem DNA-Reparaturweg, der insbesondere nach Strahlenexposition aktiviert wird. Eines der zentralen Proteine, das an der Erkennung von strahleninduzierten DNA Schäden beteiligt ist, ist die Kinase ATM. Eine Reihe von Proteinen wird von ATM phosphoryliert, womit eine DNA Schadensantwort bei Doppelstrangbrüchen ausgelöst wird. Der NMR-Proteinkomplex, bestehend aus NBS1, MRE11 und RAD50, ist an der Aktivierung der ATM Kinase beteiligt und wird daher als ein Sensor für DNA Doppelstrangbrüche angesehen. Biallelische Mutationen in MRE11 und NBS1 führen zu den Radiosensitivitätssyndromen „Ataxia telangiectasia-like disease“ (AT-LD) bzw. „Nijmegen breakage syndrome“ (NBS). In Kapitel 8 wird der erste Patient mit RAD50 Defizienz vorgestellt. Bei einer 18 jährigen Patientin mit einem NBS- ähnlichem klinischem Phänotyp, jedoch ohne Immundefizienz, wurden eine prämature Stopp- Mutation und der Verlust des natürlichen Translationsterminations-Signals gefunden. Die Expression von RAD50 ist in Fibroblasten und Lymphozyten der Patientin auf weniger als 10% reduziert. Auf zellulärer Ebene ist eine hohe Chromosomenbruchrate, eine dosisabhängige Arretierung in der G2 Phase des Zellzyklus, Defekte in den G1 und S Phase Kontrollpunkten, sowie das Fehlen der IR-induzierten Relokalisation von NBS1 und MRE11 zu beobachten. Korrekte Relokalisation und normale Phosphorylierungsmuster wurden experimentell durch transiente Transfektion von RAD50 cDNA wiederhergestellt, was die Bedeutung von RAD50 für diese Prozesse belegt. Die vorgestellten Daten zeigen, dass RAD50, ebenso wie NBS1 und MRE11, die ATM abhängige DNA Schadensantwort und die G1/S Zellzykluskontrolle moduliert. RAD50 scheint für die nukleäre Lokalisation von MRE11, sowie für die induzierte Relokalisation von MRE11 und NBS1 in nukleäre Foci notwendig zu sein. Als Ergebnis dieser Untersuchungen kann die RAD50-Defizienz zu der wachsenden Liste von Caretaker-Syndromen als eine neue Radiosensitivität-Erkrankung hinzugefügt werden. Das Krankheitsbild unterscheidet sich trotz enger molekularer Interaktion zwischen RAD50, NBS1 und MRE11 im NMR-Komplex von den Defekten in diesen Genen. KW - DNS-Reparatur KW - Fanconi-Anämie KW - Erbkrankheit KW - Genmutation KW - chromosomale Instabilität KW - FA KW - RAD50-Defizienz KW - Fanconi anemia KW - chromosomal instability KW - DNA repair KW - FA KW - mutation analysis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25823 ER - TY - THES A1 - Hünerberg, Mirja Maaret T1 - Erstcharakterisierung des Vitamin K-Epoxid-Reduktase Komplex 1-like 1 Proteins T1 - Characterization of the Vitamin K-Epoxide Reductase Komplex 1-like 1 Protein N2 - Im Jahre 2004 wurden in unserem Labor zwei Gene einer neuen Proteinfamilie kloniert, deren Charakterisierung seither im Gange ist. Das eine Protein, VKORC1, konnte durch Mutationsanalysen und biochemische Untersuchungen als eine zentrale Komponente des so genannten Vitamin K-Zyklus identifiziert werden. Vitamin K wird für die γ-Carboxylierung der Vitamin K-abhängigen Proteine wie z.B. der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X als Cofaktor der γ-Glutamyl-Carboxylase benötigt. Da Vitamin K essentiell ist, wird seine Epoxidform vom Organismus wieder in eine physiologisch aktive Hydrochinon-Form überführt. Für diese Reaktion wird die Vitamin K-Epoxid-Reduktase (VKORC1) benötigt. Mutationen in VKORC1 führen einerseits zu einem erblich bedingten Mangel an Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren vom Typ 2 (VKCFD2) mit starken Blutungen durch eine nicht oder nur unvollständig ablaufende Blutgerinnung. Das VKORC1 ist andererseits auch das Ziel von Medikamenten der Coumaringruppe, der sog. Vitamin K-Antagonisten, die zur Verhinderung einer unzeitigen Gerinnung eingesetzt werden. In höheren Dosen wird diese Substanzklasse als Rattenbekämpfungsmittel eingesetzt. Bei manchen Rattenpopulationen, aber auch bei einigen Patienten, ist die Wirksamkeit der Coumarine durch bestimmte Mutationen im VKORC1-Protein, welche eine Warfarinresistenz hervorrufen, erheblich eingeschränkt. Zu diesem VKORC1 existiert ein paraloges Protein, das Vitamin K-Epoxid-Reduktase Komplex 1-like 1 Protein (VKORC1L1), dessen Funktion bislang unbekannt ist und welches Gegenstand der vorliegenden Arbeit war. Es wurden unterschiedliche Methoden angewandt, um das VKORC1L1-Protein zu charakterisieren und seine mögliche Funktion(en) aufzuklären. Zum einen sollte die Herstellung einer Knockout-Maus dazu dienen, durch den erhaltenen Phänotyp Hinweise auf die mögliche physiologische Aufgabe zu erhalten. Allerdings gelangten die Versuche nur bis zur Generierung der Chimären, so dass dieses Teilprojekt nicht zum Abschluss gebracht werden konnte. Die biochemische Charakterisierung des Proteins zeigte eine Expression des VKORC1L1-Gens in allen untersuchten Geweben, wobei keine starke Expression für ein bestimmtes Gewebe ermittelt werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass das Protein Vitamin K-Epoxid auf gleiche Weise wie das VKORC1 recyceln kann und durch Warfarin gehemmt wird. Einige der in eingeführten VKORC1L1 Mutationen vermitteln darüber hinaus eine Warfarinresistenz. Des Weiteren wurden Enzymkinetiken für die Spezies Maus und Ratte sowie für die Stachelmaus erstellt. Die erhaltenen Werte für die Michaelis-Menten-Konstante und die Maximalgeschwindigkeit sind untereinander sehr ähnlich und sprechen für eine Oxido-Reduktase-Aktivität des VKORC1L1-Proteins. Bioinformatische Analysen konzentrierten sich auf die Aufklärung von konservierten Aminosäureresten im VKORC1L1. Dadurch konnten funktionell wichtige Positionen des Proteins ermittelt werden. Ein evolutiver Stammbaum konnte weiterhin zeigen, dass die paralogen Proteine VKORC1 und VKORC1L1 sehr wahrscheinlich aus einem gemeinsamen Vorläuferprotein bei der Entwicklung der Wirbeltiere aus einer Duplikation entstanden sind und nach der Entstehung der Landwirbeltiere ihre spezifischen Funktionen ausgebildet haben. Ein Homologievergleich zwischen den humanen Chromosomen 7 und 16 und den jeweiligen Chromosomen verschiedener Spezies zeigte, dass sich nach der Duplikation die Gene für das VKORC1 und das VKORC1L1 bei fast allen betrachteten Spezies unabhängig voneinander auf verschiedenen Chromosomen evolutiv entwickelt haben. Dies ist ein weiteres Indiz dafür, dass die Duplikation schon sehr lange zurück liegt. N2 - In 2004 two genes of a new protein family were cloned in our institute. Since then the characterization of this protein family is in progress. Through mutation and biochemical analyses one protein, VKORC1, could be identified as a central component of the so-called vitamin K cycle. Vitamin K is required as a cofactor of the γ-glutamyl carboxylase for the γ-carboxylation of the vitamin K-dependent proteins such as the coagulation factors II, VII, IX and X. As vitamin K is essential, the epoxide form is again transferred by the organism into a physiologically active hydrochinone form. For this reaction vitamin K epoxide reductase (VKORC1) is necessary. On the one hand mutations in VKORC1 lead to a hereditary combined deficiency of vitamin K-dependent clotting factors of type 2 (VKCFD2) with heavy bleedings because of missing or insufficient blood coagulation. On the other hand VKORC1 is also the target of medical treatment with the coumarin derivative group, the so-called vitamin K antagonists, which are used for preventing untimely coagulation. In higher doses this class of substances is used as rodenticides. In some rat populations as well as in case of some human patients the efficiency of the coumarins is considerably reduced through specific mutations in the VKORC1 protein leading to a warfarin resistance. There is a paralogue protein to VKORC1, the vitamin K epoxide reductase complex 1-like 1 protein (VKORC1L1), the function of which is not known so far and which is the subject of this study. Different methods have been applied in order to characterize the VKORC1L1-protein and to explain its potential functions. One the one hand, the creation of a knockout mouse was to give information on potential physiological tasks through its specific phenotype. The experiments, however, were only successful as far as the creation of chimeras was concerned. Thus, this part of the project could not be completed totally. The biochemical characterization showed an expression of the VKORC1L1-gene in all tissues examined. It was, however, not possible to find a strong expression for a specific tissue. We were able to show that the protein can recycle vitamin K epoxide in the same way as VKORC1 and that it is inhibited by warfarin. Some of the mutations within the VKORC1L1 lead to a warfarin resistance. Moreover, enzyme kinetics were applied for the mouse, rat and acomys species. The calculated values of the Michaelis-Menten constant and of the maximal speed Vmax are very similar to each other and support an oxido-reductase activity for the VKORC1L1-protein. Bioinformatic analyses were focused on the explanation of the conserved amino acids within VKORC1L1. So, functionally important positions could be determined. Moreover, an evolutionary life tree showed that the paralogue proteins VKORC1 and VKORC1L1 have probably been arisen from a common precursor protein by duplication when vertebrates developed and formed its specific functions after the tetrapod vertebrates came into being. A homological comparison between the human chromosomes 7 and 16 and the corresponding chromosomes of different species showed that the duplication of the genes for VKORC1 and VKORC1L1 evolved independently of each other on different chromosomes within all species examined. This is a further indication that the duplication took place a long time ago. KW - Vitamin-K-Epoxid-Reduktase KW - VKORC1L1 KW - Vitamin K KW - VKORC1L1 KW - vitamin K Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36166 ER - TY - THES A1 - Hövel, Thorsten T1 - Charakterisierung der Funktion des Tight Junction Proteins hu-CLDN1 und seine Bedeutung bei der Tumorgenese T1 - Functional Characterisation of the Tight Junction Protein hu-CLDN1 and its Relevance for the Process of Cancerogenesis N2 - Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandomänen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der überwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz während der Tumorgenese untersucht werden. Für diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antikörper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antikörper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifität und Epitoperkennungsstelle überprüft. Für biologische Untersuchungen wurden für die neuen Antikörper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper wurde die zelluläre Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandomänen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der überwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz während der Tumorgenese untersucht werden. Für diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antikörper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antikörper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifität und Epitoperkennungsstelle überprüft. Für biologische Untersuchungen wurden für die neuen Antikörper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper wurde die zelluläre Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. Für die Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen wurden retrovirale Genshuttlesysteme hergestellt. Die retroviralen Genshuttlesysteme basieren auf dem MoMuLV Grundgerüst und als Besonderheit wurde der l-NGFR Rezeptor zur schnellen und sicheren Identifkation transduzierter Zellen einkloniert. Hergestellt wurde ein Mock Kontrollvektor (nur l-NGFR) und der hu-CLDN1 Vektor mit l-NGFR. Die hu-CLDN1 retroviralen Überstände wurden verwendet, um verschiedene Brusttumorzellinien zu transduzieren. Die Expression von hu-CLDN1 wurde mittels eigens entwickelter quantitativer gekoppelter Reverser Transkription Polymerase Ketten Reaktion (qRT PCR) in verschiedenen Brusttumorzellinien untersucht. Wie aus der vorliegenden Arbeit ersichtlich, konnten erstmalig monoklonale Antikörper gegen hu-CLDN1 entwickelt werden. Diese sind spezifisch und haben eine hohe Sensitivität gegenüber hu-CLDN1. Desweiteren gelang es erstmals Antikörper gegen alle 4 extra- und intrazellulären Domänen zu gewinnen. Mit diesen Antikörpern gelang es nachzuweisen, daß es sich bei hu-CLDN1 um ein ausschließlich membranständiges Protein handelt. Die Expression des Proteins findet sich nur in konfluenten Zellkulturen von natürlicherweise hu-CLDN1 exprimierenden Brusttumorzellen (T47D, MCF7), wobei die Lokalisation ausschließlich auf die Zell-Zell Kontaktstelle beschränkt ist. Bei der hu-CLDN1 Transduktion in hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellinen zeigte sich eine konstitutive mRNA Expression in subkonfluenten und konfluenten Zellkulturen. Allerdings ist fluoreszenzmikroskopisch hu-CLDN1 Protein nur in konfluenten Zellkulturen nachweisbar, wobei diese Tumorzellen das Protein korrekt nur an der Zell-Zell Kontaktstelle einbauen. Offensichtlich haben die hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellen noch den intakten Signalweg zur korrekten Expression mit einer noch unbekannten posttranskriptionellen Kontrolle. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, daß in Brusttumorzellen, die weder Occludin noch ZO-1 exprimieren (MDA-MB-435) die physiologisch korrekte Expression von hu-CLDN1 existiert. Offensichtlich ist die Lokalisation von hu-CLDN1 von beiden Proteinen unabhängig. Die Analyse von unterschiedlichen hu-CLDN1 positiven und negativen Brusttumorzellen zeigte, daß der Verlust der hu-CLDN1 Expression besser zur in vitro Invasivität von Brusttumorzellen korreliert als der Expressionsverlust von Occludin und ZO-1. Die klinische Relevanz des Verlustes von hu-CLDN1 während der Tumorgenese wurde bei den Expressionsanalysen auf normalen Brust- und Darmgewebe gegenüber transformierten Brust- und Darmgewebe untersucht. Bei der Analyse von normalem Brustgewebe konnte festgestellt werden, daß hu-CLDN1 ein rein epthelial/endotheliales Protein mit eindeutiger Membranlokalisation darstellt. In den untersuchten transformierten Geweben zeigte keines der transformierten Gewebe mehr die membranständige Färbung, sondern nur noch zytoplasmatische Färbung. Desweiteren war eine signifikant reduzierte oder nicht vorhandene hu-CLDN1 Färbung in einer größeren Anzahl von Tumoren zu beobachten. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Verlust der Expression zumindest bei der Brust- und Darmtumorentwicklung offensichtlich mit der in vivo Tumorprogression korreliert. Um die Bedeutung der hu-CLDN1 Relokalisation bzw. verringerten Expression während der Tumorgenese zellphysiologisch zu verstehen, wurden in vitro Zellkulturstudien mit hu-CLDN1 negativen Zellinien und ihren hu-CLDN1 transduzierten Tochterpopulationen durchgeführt. In den adhärenten Zellkulturen hat die hu-CLDN1 Expression keinen Einfluß auf Zellwachstum und Apoptose. Allerdings zeigte sich in drei dimensional wachsenden Tumorzellaggregaten, daß die Reexpression von hu-CLDN1 zu einer drastischen Erhöhung der Apoptose führt. Die parazellulären Fluxstudien ergaben, daß bei der Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen der parazelluläre Flux zwischen den Zellen deutlich zurückgeht. Somit könnte die reduzierte Wachstumskapazität bzw. erhöhte Apoptose in 3 D Kulturen mit einer reduzierten Zugänglichkeit von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren in hu-CLDN1 transduzierten Zellen verursacht sein. Dies würde auch erklären, warum bei den untersuchten transformierten noch hu-CLDN1 positiven Brust- und Darmtumorgeweben sich ausschließlich eine zytoplasmatische Lokalisation in den Tumorzellen findet. Während in Organen und Drüsengeweben Epithelien einschichtig vorkommen und die Versorgung der Zellen mit Wachstumsfaktoren basolateral oder apikal durch Diffusion und Mikro-/Makropinozytose erfolgen kann, wachsen Tumorepithelzellen mehrschichtig. Wären die Tight Junctions im Tumor noch intakt, so könnte es zu einer Mangelversorgung und somit zur Apoptose kommen. Für das in vivo Wachstum eines Tumors ist es also notwendig, Membranproteine, die den parazellulären Flux inhibieren, zu verringern. Wie die zellphysiologischen in vitro Studien der vorliegenden Arbeit zeigen, ist es aber möglich, einen tumorinhibierenden Effekt allein durch die Reexpression von hu-CLDN1 unabhängig von Occludin und ZO-1 zu erreichen. In diesem Sinne kann zumindest zellphysiologisch hu-CLDN1 als Tumorsuppressorprotein betrachtet werden. N2 - Two years ago probably the most important tight junction proteins in mice were identified: claudin-1 and -2 . By sequence homology up to 18 members could be assigned to this 4 transmembrane protein family. The human claudin-1 with a 91 per cent sequence similarity to the murine claudin-1 was isolated in parallel (Swisshelm et al. 1999) and it has been shown that most breast cancer cell lines lost the expression of hu-CLDN1. The goal of this Ph. D. thesis was the evaluation of the cell physiological function of the human Claudin-1 (hu-CLDN1) and its relevance during tumorigenesis. To investigate the protein expression and cellular homing monoclonal antibodies using DNA vaccination were generated. The antibodies were analyzed for hu-CLDN1 specifity by Western blot and the epitope binding sites were identified by a competetive hu-CLDN1 peptide ELISA. Using the monoclonal antibodies optimal immunocytochemical and immunohistochemical methods for biological methods were established. With these antibodies the cellular expression and localization, and the expression of hu-CLDN1 in tissue slices of tumor versus normal tissues was analyzed. For the reexpression of hu-CLDN1 in breast tumor cells, retroviral shuttle systems were generated, based on a MoMuLV backbone using the l-NGFR receptor for efficient and rapid transduction of breast cancer cells with hu-CLDN1. For this purpose a mock vector (containing l-NGFR only ) and a hu-CLDN1 vector with l-NGFR were cloned. The expression of hu-CLDN1 in various breast cancer cell lines was analysed using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT PCR). The monoclonal antibodies against hu-CLDN1 are specific against hu-CLDN1. In addition antibodies for all 4 extra- and cytosolic domains were generated. Using these antibodies it was shown by immunofluorescence microscopic analysis that hu-CLDN1 is an exclusively membrane located protein. The expression of the protein is detectable only in confluent cell cultures of naturally hu-CLDN1 expressing cell lines (T47-D, MCF7) and only in the areas of direct cell cell contact. The transduction of hu-CLDN1 negative cell lines analyzed by qRT PCR displayed a mRNA expression in subconfluent and confluent cell cultures, while the protein was only detectable in confluent cell cultures. This indicates that the hu-CLDN1 negative breast tumor cell lines still have the intact signal transduction pathway for the correct expression with an up to now unknown posttranscriptional control mechanism of protein expression. In this context it is noteworthy that even occludin and ZO-1 negative breast tumor cell lines (e. g. MDA-MB-435) still have the physiological homing mechanism of hu-CLDN1. Therefore it can be suggested that expression and homing at hu-CLDN1 might be independent of occludin and ZO-1. The analysis of different hu-CLDN1 positive and negative breast tumor cells showed that the loss of expression of hu-CLDN1 correlates more significantly to the tumorigenesis of cells in comparison to occludin and ZO-1. The clinical relevance of the downregulation and loss of hu-CLDN1 was analyzed using expression analysis of breast and colon tissue versus tumor tissue on tissue microarrays. Normal breast tissue displayed a epithelial/endothelial hu-CLDN1 membrane localization only. None of the breast tumor tissue displayed a membrane localization of the hu-CLDN1 however a relocalization to the cytoplasm was evident. Additionally a significant reduction or loss of expression could be detected in the majority of tumor tissues. These results show that the loss of expression of hu-CLDN1 in breast and colon tumors correlates with tumor progression. In order to analyze the relevance of hu-CLDN1 relocalization and reduction of expression during tumorigenesis on a cellphysiological level, in vitro cell culture studies were performed using hu-CLDN1 negative cell lines (MDA-MB-361) and their hu-CLDN1 transduced counterparts. Hu-CLDN1 transduced cells growing in 2 D cell cultures displayed no altered growth or increased levels of apoptosis. However in three dimensional growing tumor cell aggregates the reexpression of hu-CLDN1 results in a significantly increased induction of apoptosis. In addition paracellular flux analysis revealed that reexpression of hu-CLDN1 decreased the paracellular flux significantly. This data suggests that the reduced growth and increased apoptosis in hu-CLDN1 positive tumor cell aggregates could be due to reduced accessibility of growth factors in hu-CLDN1 transduced cell aggregates. This would explain the necessity for the cytoplasmic homing and loss of expression of hu-CLDN1 during tumorprogression in breast and colon tumors. Most epithelia exist as single layers in organs and lobular structures resulting in a good accessibility of growth factors via diffusion or micro-/macropinocytosis. However, carcinoma tumor cells grow in multilayers. Intact tight junction complexes in carcinoma multi layers would result in a reduced accessibility of growth factors and nutrients. Therefore it is suggested that it is essential for the in vivo growth of a tumor to decrease the expression of tight junctions regulating the paracellular flux. According to the molecular and cell physiological studies presented it might be possible to achieve a tumor inhibiting effect by re-expression of hu-CLDN1. Therefore at least from a cell physiological point of view hu-CLDN1 can be considered to be a tumor suppressor protein. KW - Proteine KW - Tight junction KW - Carcinogenese KW - Molekularbiologie KW - - KW - - Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1409 ER - TY - THES A1 - Höhn, Katharina T1 - Genotyp-Phänotyp Korrelation bei Fanconi Anämie T1 - Genotype-Phenotype Correlation of Fanconi Anemia N2 - Die Fanconi Anämie (FA) stellt eine sowohl genetisch als auch phänotypisch äußerst heterogene, autosomal rezessiv und X-chromosomal vererbte Erkrankung dar. Sie ist gekennzeichnet durch chromosomale Instabilität, ein chronisch progredientes Knochenmarkversagen, multiple kongenitale Fehlbildungen und eine Prädisposition zu diversen Neoplasien. Auf zellulärer Ebene ist die FA durch eine erhöhte spontane Chromosomenbrüchigkeit sowie einer Hypersensitivität gegenüber DNA-schädigenden Agenzien charakterisiert. Bislang konnten 13 Komplementations-gruppen (FA-A bis FA-N) und ihre jeweiligen Gene identifiziert werden. Die FA-Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrang-brüchen. Die breite genetische Heterogenität der Fanconi Anämie und die große Anzahl privater Mutationen, aufgrund derer kaum interindividuelle Vergleiche möglich sind, erschweren eine Genotyp-Phänotyp Korrelation ebenso wie der compound-heterozygote Mutationsstatus vieler FA-Patienten. Bisherige Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Art der jeweiligen Mutation einen größeren Einfluß auf die phänotypische Ausprägung der Erkrankung hat als die Art des betroffenen Gens. Zusätzlich zeichnet die Fanconi Anämie eine große phänotypische Variabilität aus, die sich in höchst unterschiedlichen Krankheitsausprägungen und –verläufen äußert. Um aussagekräftige Genotyp-Phänotyp Korrelationen etablieren zu können, bedarf es einer ausreichenden Anzahl von FA-Patienten, bei denen sowohl die Komplementationsgruppe als auch die zugrunde liegende Mutation eindeutig definiert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden exemplarisch die Krankheitsverläufe einiger Patienten (4 x FA-A, 1 x FA-B, 3 x FA-C, 1 x FA-D2 und 2 x FA-G) analysiert und mit den jeweiligen molekulargenetischen Befunden korreliert. Im Anschluss daran wurden in der Literatur beschriebene Genotyp-Phänotyp Korrelationen erläutert, verschiedene Mechanismen der phänotypischen Variabilität dargestellt und abschließend prägnante Kasuistiken nochmals hervorgehoben. N2 - Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive disorder that is defined by cellular hypersensitivity to DNA crosslinking agents, and is characterized by the variable presence of congenital malformations, progressive bone-marrow failure, and predisposition to leukemia and solid tumors. There are at least different 13 complementation groups. FA genes are thought to play an important role in the removal of DNA interstrand crosslinks. Genotype-phenotype correlations are further complicated by the obvious heterogeneity of the mutational spectrum within each FA gene, the private character of mutations and the high prevalence of compound heterozygosity. Studies so far indicate that the nature of the underlying mutation is more important than the underlying complementation group. Furthermore there is a wide variation of phenotypes. Clinical course and severity of FA vary strongly between and even within families. Any definite conclusion about genotype-phenotype correlation needs a sufficient number of FA patients whose underlying complementation group and mutation has been identified and whose clinical course has been analysed equally. The present dissertation represents a first step in this direction. KW - Fanconi-Anämie KW - Genetische Variabilität KW - Phänotypische Heterogenität KW - Genotyp-Phänotyp Korrelation KW - Fallbeispiele KW - Fanconi anemia KW - genetic heterogeneity KW - phenotypic heterogeneity KW - genotype-phenotype correlation KW - case reports Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37542 ER - TY - THES A1 - Höfling, Christine T1 - Gentherapie bei Fanconi Anämie T1 - gene therapy in fanconi anemia N2 - Unter Fanconi Anämie versteht man eine rezessiv vererbbare Multisystem-Erkrankung, die einhergeht mit erhöhter spontaner Chromosomenbrüchigkeit, sowie erhöhter Anfälligkeit für toxische Substanzen, wie Mitomycin C (MMC) oder Diepoxybutan (DEB).Gentherapeutische Versuche scheitern bei FA letztlich daran, dass bei fortgeschrittener aplastischer Anämie (= Knochenmarkversagen) die Gewinnung der zur erfolgreichen Transduktion erforderlichen Mengen an CD34 positiven Stamm-Blutzellen schwierig bis unmöglich ist. Die Fortschritte bei den Fremdspender-Transplantationen lassen erwarten, dass zukünftig nahezu alle FA-Patienten mit dieser Therapieform mit guten Erfolgsaussichten behandelt werden können. Insofern ist auch zu erwarten, dass die Option einer somatischen Gentherapie - trotz vielversprechenden Ergebnissen - zukünftig wieder an Bedeutung verlieren wird. N2 - Fanconi anemia (FA) is an inherited autosomal recessive disease, which is accompanied by increased spontaneous chromosomal breackage, and increased susceptibility to DNA-crosslinking agents such as mitomycin C (MMC) or diepoxybutane (DEB).There are various treatment options to improve life expectancy and quality of life of Fanconi anemia patients. Therapeutic options include administration of androgens or growth factors, hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), but also somatic gene therapy. Gene therapy experiments at FA fail in advanced aplastic anemia (bone marrow failure) because getting the necessary quantities of CD34 positive blood stem cells for successful transduction is difficult, if not impossible. With further improvements, HSCT will become the treatment of choice, even though this does not eliminate the life-long thread of solid tumors in FA-patients. KW - Gentherapie KW - Fanconi-Anämie KW - Deutschland / Stammzellgesetz KW - Stammzelltransplantation KW - gene therapy KW - fanconi anemia KW - stem cell transplantation Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26363 ER - TY - THES A1 - Hoßfeld, Andrea T1 - Mutationsscreening im Ryanodinrezeptor 1 bei Patienten mit maligner Hyperthermie T1 - mutation screening of the ryanodine receptor 1 in patients with malignant hyperthermia N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden aus den Testzentren Würzburg und Wien DNA-Proben von Patienten, die im Laufe einer Anästhesie eine maligne Hyperthermie (MH) entwickelt hatten, und deren Angehörigen auf MH-verursachende Mutationen im Gen für den Ryanodinrezeptor 1 (RYR 1) untersucht. Es wurde dabei eine Hotspotregion des RYR 1 ausgewählt, für die bereits im Vorfeld mehrere Mutationen bekannt waren. Das Screening wurde mit Hilfe der Methode single-stranded conformation polymorphism (SSCP) durchgeführt. Eine dem abweichenden Laufverhalten eventuell zugrunde-liegende Mutation wurde anschließend durch die automatische Sequenzierung identifiziert. Unter 190 Patienten aus 126 Familien konnte in 18 Fällen eine Mutation gefunden werden. Das entspricht einer Detektionsrate von 14,29%. Insgesamt traten 10 verschiedene Mutationen auf, von denen eine (G6377A) vorher noch nicht beschrieben war. Die Mutationshäufigkeiten unterschieden sich zum Teil erheblich innerhalb der beiden untersuchten Populationen und im Vergleich zu Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen. Alle Indexpatienten und viele Angehörige hatten sich bereits einem in-vitro-Kontrakturtest (IVCT) zur Diagnostik der MH unterzogen. So konnten die Ergebnisse des IVCT mit denen der genetischen Untersuchung verglichen werden. Es fand sich eine gute Übereinstimmung, die die Zuverlässigkeit des IVCT stützt. Begleitend zur Screeninguntersuchung wurden die Methoden SSCP und automatische Sequenzierung hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit im Screening großer Patientenkollektive bewertet. Bei vergleichbarer Sicherheit ist mit dem SSCP in kürzerer Zeit bei geringerem Kostenaufwand eine größere Anzahl an Patientenproben auswertbar. Der Stellenwert der genetischen Diagnostik bei der MH wurde als ideale Methode zur Identifikation betroffener Familienmitglieder in MH-Familien mit bekannter Mutation bestätigt. N2 - Samples of patients with malignant hyperthermia during general anesthesia from the mh-centers Wien and Würzburg were investigated for mutations in the ryanodine receptor 1. Only hotspot regions were chosen. Screening was performed using the method single stranded conformation polymorphism (SSCP). Mutations were analysed by automatic sequenzing. In 190 patients from 126 families 18 mutations were found. Mutation frequence differed between the two analysed populations and compared to results of other studies. Results of genetic testing were compared to results of IVCT. High sensitivity and specifity of IVCT was confirmed. In addition the methods SSCP and automatic sequenzing were compared with respect to big patient collectives. With the SSCP samples can be analysed more quickly while security is comparably high and cost are lower. Genetic testing is the ideal method for identification of affected members in mh-families with known mutation. KW - maligne Hyperthermie KW - Ryr 1 KW - Mutation KW - Screening KW - malignant hyperthermia KW - ryr 1 KW - mutation KW - screening Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16545 ER - TY - THES A1 - Hohnbaum, Grit T1 - Fanconi Anämie im Erwachsenenalter T1 - Fanconi Anemia in Adulthood N2 - Die Fanconi Anämie (FA) ist eine seltene autosomal und X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit, die zur Gruppe der Chromosomeninstabilitäts-Syndrome gehört. Klinisch manifestiert sich die FA durch kongenitale Fehlbildungen, progressives Knochenmarkversagen und eine Prädisposition für die Entwicklung von malignen Neoplasien in frühen Jahren. Am häufigsten ist unter FA-Patienten die Entstehung einer aplastischen Anämie zu beobachten mit einer kumulativen Inzidenz von 90% im Alter von 40 Jahren (Huck et al., 2006). Vom frühen Erwachsenenalter an stellen solide Tumoren, vornehmlich Plattenepithel-Karzinome des Oropharygeal- und Genitaltraktes, das Hauptproblem dar. Auf zellulärer Ebene ist die FA durch eine hohe spontane Chromosomenbrüchigkeit verbunden mit einer erhöhten chromosomalen Sensibilität gegenüber genotoxischen Substanzen und reaktiven Sauerstoffspezies gekennzeichnet. Seit einer stetigen Verbesserung der hämatopoietischen Stammzelltransplantation durch spezifische Konditionierungsprotokolle erreichen immer mehr FA-Patienten das Erwachsenenalter. In der Literatur häufen sich Berichte von FA-Patienten, die erstmalig im Erwachsenenalter durch ein frühes Auftreten von Malignomen oder Komplikationen in der Behandlung von Neoplasien diagnostiziert werden. Neben einer erfolgreichen HSZT können auch „ milde“ Mutationen oder die Bildung eines somatischen Mosaiks für das Überleben der FA Patienten in das Erwachsenenalter verantwortlich sein. Dies bedeutet, dass sich die FA als bisher rein pädiatrisch angesehenes Krankheitsbild mehr und mehr zu einer auch das Erwachsenenalter betreffenden Entität entwickelt. In der vorliegenden Arbeit wurden 131 FA-Patienten mit einem Alter von über 20 Jahren identifiziert und in verschiedene Gruppen eingeteilt. Damit wurde es möglich, die Verteilung der Patienten hinsichtlich ihres Geschlechts, der Komplementationsgruppe sowie der vermutlichen Ursachen für ein verlängertes Überleben dokumentieren zu können. 42 Patientenbeispiele stammen aus Literaturberichten von 1964 bis 2008, Informationen über 36 Patienten wurden dem US-amerikanischen Fanconi Anemia Research Fund („FARF“) entnommen und für 53 Patienten dienten die Krankenunterlagen des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg als Grundlage. Es konnte gezeigt werden, dass etwa doppelt soviel Frauen wie Männer mit FA ein Alter jenseits des 20. Lebensjahres erreichten. Eine Zuordnung zu einer Komplementationsgruppe war bei 66 Patienten möglich. Diese ließ erkennen, dass im erwachsenen Patientenkollektiv die Komplementationsgruppen FA-A, FA-C, FA-D2, FA-G, FA-I und FA-J, jedoch keine der Gruppen FA-B, FA-D1, FA-E, FA-F, FA-L, FA-M und FA-N vertreten sind. Weiterhin wurden die erwachsenen FA-Patienten in vier verschiedene Gruppen nach der wahrscheinlichen Ursache ihres Überlebens eingeteilt werden: 26% erhielten eine erfolgreiche hämatopoietische Stammzelltransplantation, 17% entwickelten im Verlauf ein Mosaik, 4% konnten als Träger einer milden Mutation identifiziert werden. Die genaue Ursache für ein verlängertes Überleben bleibt jedoch bei 53% der FA-Patienten unbekannt, da Informationen bezüglich früherer Therapien und vor allem die Ergebnisse molekulargenetischer Untersuchungen fehlen. Bemerkenswert ist, dass der Großteil der über 50Jährigen ein Mosaik aufwies, während in dieser Altersgruppe Patienten mit erfolgreicher HSZT oder einer milden Mutation nur zu einem geringen Teil vertreten sind. Die für die FA charakteristische genetische Instabilität spiegelt sich in der hohen Anzahl (64%) von FA-Patienten wider, die auch ohne vorhergehende HSZT ein Plattenepithel-Karzinom (SCC) entwickelten. Nach HSZT manifestierte sich bei 25% der erwachsenen FA-Patienten ein SCC. Die Beachtung der medizinischen Besonderheiten des Erwachsenenalters ist von großer Bedeutung in der Prävention und Therapie von Komplikationen der FA und erfordert modifizierte Behandlungsstrategien für erwachsene FA-Patienten. Sorgfältig dokumentierte Langzeitbeobachtungen sowie die Identifizierung von Komplementationsgruppen und Mutationen bei jedem einzelnen FA-Patienten bilden die Grundlage für prognostische Aussagen, die derzeit nur beschränkt möglich sind. In zukünftigen Untersuchungen werden eine Reihe bisher ungelöster Fragen zu beantworten sein. Hierzu gehören die mögliche Rolle der Androgentherapie hinsichtlich der Förderung einer Mosaikbildung, die Faktoren, welche zu der auffälligen Geschlechterverteilung im Erwachsenenalter beitragen, sowie die Erforschung der Bedeutung „milder“ Mutationen und somatischer Reversionen. Die insgesamt sehr beeindruckenden Langzeitverläufe sowie die hohe Inzidenz von nicht-hämatologischen Komplikationen/Malignomen zeigen deutlich, dass sich die Fanconi Anämie zunehmend auch zu einer internistisch/onkologischen Krankheit entwickelt. N2 - Fanconi anemia (FA) is a rare autosomal and X-chromosomal recessive disorder belonging to the group of chromosomal instability syndromes. FA is clinically characterised by congenital malformations, progressive bone marrow failure and a high risk for developing malignant neoplasia. FA-patients frequently present as aplastic anemia with a cumulative incidence of 90% at 40 years of age (Huck et al., 2006). From early adulthood on the mean clinical problem for FA-patients is the high incidence of solid tumors, predominantly squamous cell carcinomas of the oropharyngeal and genital tracts. At the cellular level FA is characterized by high spontaneous chromosomal breakage combined with strongly increased sensitivity to genotoxic agents such as DEB or MMC. Due to recent improvements of hematopoietic stem cell transplantation more and more FA-patients survive to adulthood. There is an increasing number of reports of adult FA patients being diagnosed in adulthood because of early onset of malignancies and/or unusually severe reactions towards radio- or chemotherapy. Surival to adulthood may result from successful HSCT, but also be due to the existence of a hypomorphic mutation or the development of a somatic reversion of a germline mutation. These life-extending events imply that FA changes more and more from a purely pediatric to an adulthood disease. Here we report 131 FA-patients older than 20 years and attempt to elucidate the probable reasons for their relative longevity. Among other parameters we document these patients with regard to gender, complementation group and presumable underlying causes of survival. 42 patients were reported in the literature from 1964 to 2008. Information of 36 patients derives from the American Fanconi Anemia Research Fund (“FARF”), and 53 patients were found in the local diagnostic database. We show that there are twice as many women as men reaching the adulthood. 66 patients could be assigned to complementation groups FA-A, FA-C, FA-D2, FA-G, FA-I and FA-J. In contrast, patients belonging to complementation groups FA-B, FA-D1, FA-E, FA-F, FA-L, FA-M and FA-N were not represented among our adult patient cohorts. The adult FA-patients were operationally divided in four different groups according to the presumptive cause of survival to adulthood: 26% received a successful HSCT, 17% developed a somatic mosaicism, 4% were likely to carry a hypomorphic mutation. The precise cause of the prolonged survival remains unknown in 53% of the FA-patients. This largest group lacks essential information about clinical course, previous therapeutic interventions, complementation group and mutations. A surprising finding is that there are more cases of somatic reversions among the very few patients older than 50 years. Due to lack of molecular analysis, the number of patients surviving due to hypomorphic mutations is likely to be underestimated. The characteristic genetic instability which affects all body cells is reflected in the high number of adult patients (64%) who developed a squamous cell carcinoma even in the absence of previous HSCT. 5 to 15 years after transplantation, 25% of the patients represented a SCC which again is a higher figure than among transplanted non-FA patients. Adult FA patients frequently present with clinical features that are different from childhood patients. These features include absent or only mild patterns of congenital malformations, normal or only mildly reduced blood counts, early onset SCC of the oropharyngeal and the anogenital region, and/or severe reaction to radiation or chemotherapy of such malignancies. In order to arrive at clinically useful prognostic data, long term monitoring of clinical course but also identification of complementation group and mutations are required in each FA-patient. Future studies should be aimed at elucidating the possible role of the steroid treatments for developing somatic reversion. Even though the primary non-hematological complications of adult FA-patients are early onset squamous cell carcinomas, there are a number of additional organ malfunctions (e.g. diabetes mellitus, hypothyroidism, gonadal failure, osteoporosis) which require attention by physicians trained in endocrinology, internal medicine and oncology. Clearly, FA evolves from a primary childhood to an adult disease. KW - Fanconi-Anämie KW - Erwachsener KW - Fanconi Anemia KW - Adulthood Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38124 ER - TY - THES A1 - Hildebrandt-Kunz, Jeanette Annabelle T1 - Fanconi-Anämie : eine unverstandene Krankheit auf dem Weg zur Gentherapie ; am Beispiel einer jungen Patientin T1 - Fanconi anemia N2 - Ziel dieser Arbeit war aufgrund eines sehr gut dokumentierten Krankheitsverlaufes einer jetzt 20-jaehrigen Patientin die Darstellung der Interaktion zwischen therapeutischen Massnahmen und dem tatsaechlichen Verlauf und der Entwicklung der Erkrankung, sowie aufgrund persoenlicher Gespraeche mit der betroffenen Patientin und ihrer Familie die Dokumentation einer Beeinflussung der Lebensweise und -qualitaet. Die Ergebnisse brachten bezueglich der Blutwerte im Verlaufe der Jahre 1985-1996 ein zwar stetes Absinken des Haemoglobins, allerdings mit Stabilisierung auf niedrige Durchschnittswerte unter maximaler Therapie. Gleiches zeigte sich bei den Thrombozyten, bei den Leukozytenzahlen war sogar ein leichter Anstieg zu verzeichnen. Grundlage hierfuer ist ein ausgekluegeltes Therapieschema, das zum Teil von den in Eigeninitiative zu Experten herangereiften Eltern mit initiiert und aufrecht erhalten wird. Auffaellig war die lange Zeit bis zur Diagnosestellung. Besonders im Hinblick auf die noch nicht abgeschlossene Familienplanung bei einer so jungen Familie und den bestehenden Behandlungsmoeglichkeiten der Krankheit, im weiteren Sinne auch die Prognose betreffend, waere heutzutage eine rasche Diagnosestellung ueberaus wichtig und wuenschens-wert. Fuer beide Parteien, Eltern und medizinisches Personal, sollte im Mittelpunkt des Interesses die optimale Behandlung und Therapie des Patienten stehen. Um dieses zu erreichen, ist eine Zusammenarbeit auf allen Ebenen erforderlich. Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181039 ER - TY - THES A1 - Heinrich, Tilman T1 - Validierung der Zellzyklusdiagnostik bei Ataxia telangiectasia T1 - Exclusion/confirmation of Ataxia telangiectasia via cell cycle analysis N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der durchflusszytometrischen Zellzyklusanalyse von Lymphozyten bei Patienten mit der klinischen Verdachtsdiagnose Ataxia telangiectasia beschrieben. Hierzu wurden die Daten von 327 Patienten ausgewertet. In 82 Fällen ergab sich eine Bestätigung der Verdachtsdiagnose, in 225 Fällen konnte das Vorliegen dieser Erkrankung ausgeschlossen werden, bei den übrigen untersuchten Fällen ergab die Zellzyklusanalyse Auffälligkeiten hinsichtlich des Proliferationsverhaltens der untersuchten Zellen und/oder ihrer Strahlensensitivität, die eine eindeutige Zuordnung zu einer der beiden Gruppen (AT-postiv/AT-negativ) zunächst nicht gestatteten. Diese Auffälligkeiten lassen sich teils auf technische Probleme (geronnenes Blut, langer Zeitraum zwischen Blutentnahme und Analyse), teils auf biologische Besonderheiten (bestehende Begleiterkrankungen wie Leukämie, Lymphom) zurückführen. Die durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse von Lymphozyten ergibt als diagnostisch relevante Parameter den Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1) sowie den Anteil der in der G2-Phase des 1. Zellzyklus verbleibenden Zellen bezogen auf die Wachstumsfraktion (G2/GF). Der Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1) ist ein Maß für die Stimulierbarkeit der Lymphozyten. Diese Stimulierbarkeit ist bei Zellen von AT-Patienten häufig vermindert, d.h. das Ausmaß der Mitogenantwort gibt ebenso einen Hinweis auf das Vorliegen der Erkrankung AT wie die Strahlensensitivität der Zellen. Letztere wird durch den zweiten der oben angeführten Parameter (G2/GF) repräsentiert. Der für die Erkrankung AT charakteristische Funktionsverlust des ATM-Proteins, welches im unbeeinträchtigten Zustand für die Kontrolle der Reparatur von strahleninduzierten DNA-Schädigungen verantwortlich ist, führt typischerweise zu einer Erhöhung des Anteils von Zellen in der G2-Phase, nachdem diese Zellen ionisierender Strahlung ausgesetzt waren. Die zweidimensionale Auftragung dieser Parameter (G0,G1 gegen G2/GF) erlaubt in der Regel bereits eine guten Abgrenzung der Gruppe der AT-positiven gegen die AT-negativen Fälle. Die Berücksichtigung eines weiteren Parameters, nämlich des AFP-Wertes, gestattet darüberhinaus in mehreren Fällen die Zuordnung der oben erwähnten, zunächst unklaren Fälle zu einer dieser Gruppen. Die durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse von bestrahlten Lymphozyten kann daher als Screening-Methode bei der Untersuchung von Patienten mit der Verdachtsdiagnose Ataxia telangiectasia als ein dem CSA überlegenes Verfahren angesehen werden. Die Kombination dreier Parameter: 1) Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1), 2) Anteil der in der G2-Phase des 1. Zellzyklus verbleibenden Zellen bezogen auf die Wachstumsfraktion (G2/GF) und 3) AFP-Wert erlaubt hierbei im Rahmen der AT-Diagnostik in >93% der Fälle eine eindeutige Zuordnung zur Gruppe der AT-negativen bzw. AT-positiven Fälle. N2 - Ataxia telangiectasia (AT) is an autosomal recessive multisystem disorder with increased radiosensitivity and cancer susceptibility. The responsible gene (ATM) consists of 66 exons and a coding region of 9171 bp which precludes direct sequencing as a screening assay for confirmation or exclusion of the clinical suspicion of AT. Peripheral blood mononuclear cells of 327 patients refered for the exclusion of AT were exposed to ionizing radiation (IR) and incubated for 72 h in the presence of PHA. Using bivariate BrdU-Hoechst/Ethidium bromide flowcytometry, the following cell cycle parameters were ascertained: (1) proportion of non-proliferating (G0,G1) cells as a measure of mitogen response, (2) proportion of first cycle G2-phase cells relative to the growth fraction (G2/GF) as a measure of radiosensitivity. >93% of the cases could be unequivocally assigned either to the AT-negative or the AT-positive group of patients. Combination of cell cycle data with serum AFP concentrations led to the exclusion of AT in nearly all of the uncertain cases. We conclude that cell cycle testing complemented by serum AFP measurements fulfills the criteria as a rapid and economical screening procedure in the differential diagnosis of juvenile ataxias. KW - Ataxia telangiectasia KW - Zellzyklus KW - ATM KW - Durchflusszytometrie KW - Radiosensitivität KW - childhood ataxia KW - ataxia telangiectasia KW - cell cycle KW - flowcytometry KW - radiosensivitity Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14654 ER - TY - THES A1 - Haertle, Larissa T1 - Gestationsdiabetes und fetale Programmierung: Epigenetische Untersuchungen mit verschiedenen Next Generation Sequencing Techniken T1 - Gestational Diabetes Mellitus and fetal programming: Epigenetic investigations with different Next Generation Sequencing Techniques N2 - Eine intrauterine Gestationsdiabetes (GDM) Exposition induziert in den betroffenen Nachkommen eine lebenslang erhöhte Prädisposition für metabolische und komplexe Erkrankungen. Die Krankheitssuszeptibilität wird dabei durch epigenetische Veränderungen vermittelt, die sich über die Regulation der Genaktivität auch auf das Expressionsniveau und den Phänotypen auswirken. Um neue Gene zu finden, die eine Rolle in der fetalen Programmierung spielen, wurden in dieser Arbeit genomweite Methylierungsmuster von Nabelschnurbluten (FCBs) aus GDM-Schwangerschaften und Kontrollen miteinander verglichen. Mit Illumina Infinium HumanMethylation 450K Arrays konnten signifikante Gruppenunterschiede für insgesamt 65 CpG-Stellen (52 davon genassoziiert) festgestellt werden, die multiplem Testen standhielten. Mittels Pyrosequenzierung wurden vier dieser Kandidaten-Loci (ATP5A1, MFAP4, PRKCH, SLC17A4), sowie ein Gen aus der Literatur (HIF3A) genauer untersucht und die Effekte erfolgreich validiert. Für das zugrundeliegende multivariate Regressionsmodell wurden die potenziellen Störfaktoren Gestationsalter, kindliches Geschlecht und mütterlicher BMI berücksichtigt. Der GDM-Effekt zeigte sich stärker in der insulinbehandelten Subgruppe (I-GDM) als in der diätisch behandelten (D GDM) und scheint insgesamt multifaktoriell bedingt zu sein, da viele Gene betroffen waren, jedoch alle mit einer vergleichsweise niedrigen Effekt-Größe. Zusätzlich konnten für den MEG3 Promotor, MEST und PEG3, drei von vier geprägten Genen, die mittels Deep Bisulfite Sequencings (DBS) analysiert wurden, ebenfalls signifikante Methylierungs-unterschiede zwischen der GDM- und Kontroll-Gruppe detektiert werden. Die identifizierten Gene stellen labile Zielregionen für die GDM-induzierte intrauterine Programmierung dar und können zukünftig nützliche Biomarker für Krankheitsdiagnosen und Prognosen sein. Mittels DBS können darüber hinaus Einzelmolekül-Analysen durchgeführt werden, für die in differentiell methylierten Regionen (DMRs) anhand eines informativen SNPs die parentale Allel-Herkunft bestimmt und bei der Berechnung von Epimutationsraten einbezogen werden kann. Epimutationen wurde als solche gewertet, wenn sie ein > 50 % abnormal (de)methyliertes Methylierungsprofil aufwiesen. Die DBS-Daten wurden mit zwei verschiedenen Sequenzierplattformen generiert (Roche GS Junior und Illumina MiSeq). Für Zweitere wurde ein eigenes, unabhängiges Library-Präparations-Protokoll entwickelt. In Nabelschnurblut, adultem Blut und Viszeralfett wurden für die paternal exprimierte MEST Promotor DMR und die maternal exprimierte MEG3 intergenic (IG) DMR hohe Epimutationsraten für das jeweils unmethylierte Allel detektiert. Die geprägten (methylierten) Allele wiesen dagegen nur niedrige Epimutationsraten auf. Da MEST und MEG3 invers geprägte Gene sind, war die Hypermethylierung des nicht geprägten Allels (HNA) demnach unabhängig von der parentalen Allel-Herkunft. Die HNA scheint außerdem erst nach der Fertilisation aufzutreten, da in Spermien nur sehr wenige Epimutationen gefunden wurden. Für die sekundäre MEG3 Promotor DMR (deren Prägung von der primären MEG3 IG-DMR reguliert wird) wurde ein deutlich schwächerer, wenngleich signifikanter HNA-Effekt im FCB gemessen, für die paternal exprimierte PEG3 Promotor DMR konnte dagegen kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden parentalen Epimutationsraten festgestellt werden. Der HNA-Effekt für die MEST DMR, MEG3 IG-DMR und MEG3 Promotor DMR war weder mit GDM noch mit Adipositas assoziiert und zeigte allgemein eine große interindividuelle Varianz. Die Aufrechterhaltung differenzieller Methylierungsmuster in Imprinting Kontrollregionen (ICRs) scheint in manchen Entwicklungs-Zeitspannen von großer Bedeutung und damit streng kontrolliert zu sein, später jedoch redundant zu werden, was sich in der Anreicherung von stochastischen sowie umweltinduzierten Fehlern auf dem nicht geprägten Allel äußern kann. HNA-suszeptible geprägte Gene ähneln in mancherlei Hinsicht metastabilen Epiallelen. Diese Studie zeigt, dass sowohl stochastische Faktoren als auch Umweltstimuli während der frühen embryonalen Entwicklung u.a. über HNA-Effekte geprägte Gen-Netzwerke programmieren, die in Wachstumsprozesse involviert sind. Um tiefere Einblicke in allelspezifische Prägungsprofile zu erhalten, wären umfangreiche DBS HNA-Längsschnittstudien aller 50-100 human geprägten Gene in unterschiedlichen Gewebetypen und Differenzierungsstadien wünschenswert.   N2 - Intrauterine exposure to gestational diabetes mellitus (GDM) induces lifelong increased predisposition for metabolic and complex diseases in the exposed progeny. The elevated disease susceptibility is transmitted via epigenetic alterations that influence gene expression levels and phenotypes through regulation of gene activity. Genome-wide methylation profiles of fetal cord bloods (FCBs) were investigated in GDM and control pregnancies in order to identify new genes susceptible to fetal programming. After multiple testing correction, we found 65 significantly differentially methylated CpG sites between GDM and control groups (52 of which were gene associated) within the Illumina Infinium HumanMethylation 450K array data. Using pyrosequencing, we successfully confirmed the observed results in four of these candidate loci (ATP5A1, MFAP4, PRKCH, SLC17A4) and one gene from the literature (HIF3A). A multivariate regression model was adjusted for the confounding factors gestational age, fetal sex and maternal BMI. The GDM effect was stronger within the insulin treated subgroup (I-GDM) compared to the dietary subgroup (D GDM), suggesting that GDM is a multifactorial disease evidenced by changes of small effect size in multiple genes. Significant mean methylation differences were detected between the GDM group and controls in three out of four imprinted genes (MEG3 promoter, MEST and PEG3) that were analyzed with Deep Bisulfite Sequencing (DBS). The identified genes represent labile target regions for GDM-induced intrauterine programming and could represent future biomarkers for disease diagnosis and prognosis. Furthermore, DBS enables sequencing at a single allele resolution and the calculation of allele specific epimutation rates by differentiating the parental origin of alleles via an informative SNP within differentially methylated regions (DMRs). Epimutations were characterized as alleles showing > 50 % aberrantly (de)methylated CpG sites. DBS data were generated using two different sequencing platforms (Roche GS Junior and Illumina MiSeq). An independent library preparation protocol was established for Illumina MiSeq sequencing. The paternally expressed MEST promoter DMR and the maternally expressed MEG3 intergenic (IG) DMR showed high epimutation rates for the unmethylated alleles in FCB, as well as adult blood and visceral adipose tissue. On the contrary, only minor epimutation rates were displayed by the imprinted (methylated) alleles. Thus, hypermethylation of the non-imprinted allele (HNA) was independent of parental origin, as MEST and MEG3 are opposingly imprinted genes. Very low epimutation rates in sperm indicate that the HNA effect arises after fertilization. A weak but significant HNA was also found for the secondary MEG3 promoter DMR (which is known to be regulated by the MEG3 IG-DMR). The paternally expressed PEG3 promoter DMR showed no HNA and no difference in parental epimutation rates. The observed HNA effect (for the MEST DMR, the MEG3 IG-DMR and the MEG3 promoter DMR) was neither associated with GDM nor obesity and exhibited a large interindividual variance. Maintenance of differential methylation profiles in imprinting control regions (ICRs) seems to be of great importance during some developmental periods and is therefore strictly controlled in germ cells. Later on, it might become redundant manifested in the accumulation of stochastic as well as environmentally-induced errors on the non-imprinted allele. There is evidence that HNA-susceptible imprinted genes resemble metastable epialleles in many aspects. Therefore, we suggest that stochastic as well as environmental stimuli program imprinted gene networks that are important for growth related processes during early development using HNA. Further longitudinal studies of all 50 – 100 imprinted genes would benefit in a deeper insight in allele-specific imprinting patterns of various human tissues. KW - Schwangerschaftsdiabetes KW - Genetisches Imprinting KW - Epigenetik KW - Next Generation Sequencing (NGS) KW - Fetale Programmierung Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156465 ER - TY - THES A1 - Göbel, Almut T1 - Jugendliche und Erwachsene mit Cornelia-de-Lange-Syndrom : Darstellung der Mannigfaltigkeit des klinischen Erscheinungsbildes anhand der Beschreibung von 17 Probanden T1 - Cornelia-de-Lange-syndrome in juvenile and adult patients N2 - Das Cornelia-de-Lange-Syndrom (CdLS) ist ein angeborenes Fehlbildungs- und Retardierungssyndrom, dessen Diagnose ausschließlich klinisch gestellt wird, wobei die charakteristischen Gesichtszüge, Fehlbildungen der oberen Extremitäten, Minderwuchs und geistige Behinderung wichtige Kriterien sind. Seit den Erstbeschreibungen wurden viele Arbeiten über dieses Syndrom veröffentlicht, die sich jedoch meist auf Erfahrungen mit Kindern beschränken. Ziel dieser Arbeit ist es, jugendliche und erwachsene Patienten mit CdLS zu beschreiben, um durch einen Einblick in ihre Biographie die Kenntnisse über diese Erkrankung zu stabilisieren und betroffenen Familien die Mannigfaltigkeit des Syndroms zu veranschaulichen. In einem weiteren Abschnitt werden Fälle aus der Literatur vorgestellt, in denen die Problematik der Schwangerschaft von Patientinnen mit CdLS und die Vererbbarkeit der Erkrankung besondere Beachtung findet. Die Adressen der Probanden stellte der Arbeitskreis „Cornelia de Lange-Syndrom e.V.“ zur Verfügung. Dieser Verein ist eine Initiative betroffener Familien, die deutschlandweit tätig ist und derzeit über 80 Patienten mit der Diagnose CdLS erfaßt hat. Anhand der Angaben aus Fragebögen und telefonischen Gesprächen mit den Eltern werden 17 Probanden beschrieben. N2 - CdLS is a well-known retardation syndrome, whose cause is still unknown. It consists of a characteristic face, upper limb defects, growth deficiency and mental handicap in a wide variabilty. After the reports of Brachmann 1916 and de Lange 1933 many patients with this syndrome were described, but mainly children. This study presents 17 juvenile and adult patients with CdLS to show their clinical phenotype and development in the adulthood and to illustrate the variety of the syndrome. A review of the literature shows the possibility of affected people to reproduce. The parents of all investigated patients are members in the German CdLS Foundation, which is an organisation to support involved families. Data were collected by questionaires and personal conversations with the parents. KW - Cornelia-de-Lange-Syndrom KW - Brachmann-de-Lange-Syndrom KW - Jugendliche und erwachsene Probanden KW - Cornelia-de-Lange-syndrome KW - Brachmann-de-Lange-syndrome KW - juvenile and adult patients Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10350 ER - TY - THES A1 - Groß, Michaela T1 - Genomic changes in Fanconi anemia: implications for diagnosis, pathogenesis and prognosis T1 - Genomische Veränderungen bei Fanconi-Anämie N2 - Fanconi anemia (FA) is a genetically and phenotypically heterogenous autoso- mal recessive disease associated with chromosomal instability, progressive bone marrow failure, typical birth defects and predisposition to neoplasia. The clinical phenotype is similar in all known complementation groups (FA-A, FA-B, FA-C,FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F and FA-G). The cellular phenotype is characterized by hypersensitivity to DNA crosslinking agents (MMC,DEB), which is exploited as a diagnostic tool. Alltogether, the FA proteins constitute a multiprotein pathway whose precise biochemical function(s) remain unknown. FANCA, FANCC, FANCE, FANCF and FANCG interact in a nuclear complex upstream of FANCD2. Complementation group FA-D1 was recently shown to be due to biallelic mutations in the human breast cancer gene 2 (BRCA2). After DNA damage, the nuclear complex regulates monoubiquitylation of FANCD2, result- ing in targeting of this protein into nuclear foci together with BRCA1 and other DNA damage response proteins. The close connection resp. identity of the FA genes and known players of the DSB repair pathways (BRCA1, BRCA2, Rad51) firmly establishs an important role of the FA gene family in the maintenance of genome integrity. The chapter 1 provides a general introduction to the thesis describing the current knowledge and unsolved problems of Fanconi anemia. The following chapters represent papers submitted or published in scientific literature. They are succeeded by a short general discussion (chapter 7). Mutation analysis in the Fanconi anemia genes revealed gene specific mutation spectra as well as different distributions throughout the genes. These results are described in chapter 1 and chapter 2 with main attention to the first genes identified, namely FANCC, FANCA and FANCG. In chapter 2 we provide general background on mutation analysis and we report all mutations published for FANCA, FANCC and FANCG as well as our own unpublished mutations until the year 2000. In chapter 3 we report a shift of the mutation spectrum previously reported for FANCC after examining ten FA-patients belonging to complementation group C. Seven of those patients carried at least one previously unknown mutation, whereas the other three patients carried five alleles with the Dutch founder mu- tation 65delG and one allele with the Ashkenazi founder mutation IVS4+4A>T, albeit without any known Ashkenazi ancestry. We also describe the first large deletion in FANCC. The newly detected alterations include two missense mu- tations (L423P and T529P) in the 3´-area of the FANCC gene. Since the only previously described missense mutation L554P is also located in this area, a case can be made for the existence of functional domain(s) in that region of the gene. In chapter 4 we report the spectrum of mutations found in the FANCG gene com- piled by several laboratories working on FA. As with other FA genes, most muta- tions have been found only once, however, the truncating mutation, E105X, was identified as a German founder mutation after haplotype analysis. Direct compar- ison of the murine and the human protein sequences revealed two leucine zipper motifs. In one of these the only identified missense mutation was located at a conserved residue, suggesting the leucine zipper providing an essential protein-protein interaction required for FANCG function. With regard to genotype-phenotype correlations, two patients carrying a homozygous E105X mutation were seen to have an early onset of the hematological disorder, whereas the missense mutation seems to lead to a disease with later onset and milder clinical course. In chapter 5 we explore the phenomenon of revertant mosaicism which emerges quite frequently in peripheral blood cells of patients suffering from FA. We de- scribe the types of reversion found in five mosaic FA-patients belonging to com- plementation groups FA-A and FA-C. For our single FA-C-patient intragenic crossover could be proven as the mechanism of self-correction. In the remaining four patients (all of them being compound heterozygous in FANCA), either the paternal or maternal allele has reverted back to WT sequence. We also describe a first example of in vitro phenotypic reversion via the emergence of a compensat- ing missense mutation 15 amino acids downstream of the constitutional mutation explaining the MMC-resistance of the lymphoblastoid cell line of this patient. In chapter 6 we report two FA-A mosaic patients where it could be shown that the spontaneous reversion had taken place in a single hematopoietic stem cell. This has been done by separating blood cells from both patients and searching for the reverted mutation in their granulocytes, monocytes, T- and B-lymphocytes as well as in skin fibroblasts. In both patients, all hematopoietic lineages, but not the fibroblasts, carried the reversion, and comparison to their increase in erythrocyte and platelet counts over time demonstrated that reversion must have taken place in a single hematopoietic stem cell. This corrected stem cell then has been able to undergo self-renewal and also to create a corrected progeny, which over time repopulated all hematopoietic lineages. The pancytopenia of these patients has been cured due to the strong selective growth advantage of the corrected cells in vivo and the increased apoptosis of the mutant hematopoietic cells. N2 - Fanconi Anämie (FA) stellt eine sowohl genetisch als auch phänotypisch hetero- gene, autosomal rezessive Erkrankung dar. Charakteristische Merkmale dieser Erkrankung sind die chromosomale Instabilität, ein fortschreitendes Knochen- marksversagen, multiple kongenitale Abnormalitäten und eine Prädisposition zu diversen Neoplasien. Dieser klinische Phänotyp ist bei allen bisher bekannten Komplementationsgruppen (FA-A, FA-B, FA-C, FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F and FA-G) ähnlich, ebenso wie der zelluläre Phänotyp, der durch Hy- persensitivität zu DNA-quervernetzenden Substanzen, wie MMC und DEB, gekennzeichnet ist. Diese Hypersensitivität wird dementsprechend in der FA-Diagnostik verwandt. Alle FA-Proteine arbeiten in einem "Multiprotein- Pathway" zusammen, dessen exakte biochemische Funktion noch nicht geklärt ist. FANCA, FANCC, FANCE, FANCF und FANCG interagieren in einem nukleären Komplex, der nach DNA-Schädigung die Monoubiquitylierung von FANCD2 reguliert, woraufhin man FANCD2 zusammen mit BRCA1 und anderen DNA-Reparaturproteinen in nukleären Foci detektieren kann. Die Komplemen- tationsgruppe FA-D1 wurde kürzlich biallelischen Mutationen im menschlichen Brustkrebsgen BRCA2 zugeordnet. Die enge Verbindung zwischen den FA- Genen und den Doppelstrangbruch(DSB)-Reparaturgenen (BRCA1, BRCA2, Rad51) deutet auf eine wichtige Rolle der FA-Genfamilie in der Erhaltung der genomischen Stabilität hin. Kapitel 1 gibt eine allgemeine Einleitung dieser Promotionsarbeit. Es liefert Hintergrundinformationen zu Fanconi Anämie basierend auf Publikationen bis einschließlich Mai 2002. In den darauffolgenden Kapiteln 2-6 sind eigene Veröf- fentlichungen zur Fanconi Anämie wiedergegeben, die entweder schon publiziert oder zur Veröffentlichung eingereicht worden sind. Zusätzlich zu den Diskussionsabschnitten in den einzelnen Veröffentlichungen werden diese fünf Arbeiten in Kapitel 7 kurz gemeinsam diskutiert. Die Mutationsanalyse in den diversen FA-Genen lieferte genspezifische Mutations- spektren sowie genspezifische Mutations-Verteilungen. Diese werden in Kapitel 1 und 2 beschrieben, wobei Kapitel 2 nur auf die zuerst entdeckten FA-Gene, FANCC, FANCA und FANCG, eingeht. In Kapitel 2 werden allgemeine Hinter- grundinformationen zur Mutationsanalyse geliefert und alle bis zum Jahr 2000 für FANCA, FANCC und FANCG publizierten Mutationen sowie unsere eigenen bis dato unveröffentlichten Veränderungen dargestellt. In Kapitel 3 berichten wir über eine bemerkenswerte Verschiebung des bisher beschriebenen FANCC-Mutationsspektrums. Von den zehn von uns untersuchten FA-C-Patienten trugen acht zumindest eine neue Mutation, wohingegen die drei restlichen Patienten fünf 65delG-Allele und ein IVS4+4A>T-Allel besaßen. Inter- essanterweise fanden wir auch erstmals große Deletionen im FANCC-Gen, deren Existenz bisher nur für FANCA beschrieben war. Weiterhin werden zwei bisher nicht bekannte Missense Mutationen (L423P und T529P) im 3´-Bereich des Gens beschrieben. In dieser Region findet sich auch der bisher einzige pathogene Aminosäureaustausch, L554P, was auf die Existenz einer funktionellen Domäne in dieser Genregion hindeutet. Außerdem scheinen unsere neu detektierten Muta- tionen vielmehr verstreut im Gen vorzuliegen als dies bisher angenommen worden war. Denn die bisher beschriebenen Veränderungen betreffen vor allem den Exon-bereich 5-6 sowie das amino- und carboxyterminale Ende von FANCC. Kapitel 4 beschreibt das Mutationsspektrum für FANCG, zusammengetragen von verschiedenen FA-Arbeitsgruppen. Wie in den anderen FA-Genen traten die meisten Mutationen auch hier nur einmal auf. Allerdings konnte die trunkierende Mutation, E105X, nach einer Haplotyp-Analyse als deutsche Gründermutation beschrieben werden. Ein direkter Vergleich der Proteinsequenzen von Men- sch und Maus ergab Hinweise auf konservierte Genabschnitte sowie auf zwei Leuzin-Zipper-Motive. Die einzige beschriebene Missense Mutation befindet sich in einem konservierten Bereich eines dieser beiden Leuzin-Zipper, was auf eine wichtige Rolle dieses Motivs für FANCG in Bezug auf Protein-Protein- Interaktionen schließen läßt. Obwohl die Anzahl der Patienten mit vergleichbaren Mutationen zu gering für statistisch signifikante Aussagen war, so fiel doch auf, dass bei den beiden Patienten mit einer homozygoten E105X-Mutation wesentlich früher hämatologische Probleme auftraten als bei dem Patienten mit der heterozygoten Missense Mutation, für den ein milder klinischer Verlauf sowie ein späteres Einsetzen hämatologischer Probleme berichtet wurde. Kapitel 5 und 6 behandeln das Phänomen des reversen Mosaizismus, der sehr häu- fig im Blut von FA-Patienten zu diagnostizieren ist. In Kapitel 5 beschreiben wir die Reversionsmechanismen von fünf Patienten, von denen einer der Komplemen- tationsgruppe C und die anderen vier der Komplementationsgruppe A angehören. Der Mechanismus, welcher der Selbstkorrektur des FA-C-Patienten zugrunde lag, konnte als intragene Rekombination definiert werden. Bei den verbleibenden vier compound heterozygoten FA-A-Patienten war jeweils eine Rückmutation zum Wildtyp auf dem mütterlichen bzw. väterlichen Allel ursächlich für die phäno- typische Gesundung der Blutzellen. Desweiteren beschreiben wir eine in vitro-Reversion in der lymphoblastoiden Linie eines unserer Patienten erstmals den Mechanismus einer sekundären Missense Mutation 15 Aminosäuren nach der kon- stitutionellen Mutation. Diese "kompensatorische" Mutation ist für die MMC- Resistenz der Zellinie verantwortlich. 4 von 5 der untersuchten Mosaik-Patienten zeigten eine eindeutige Verbesserung ihrer Blutwerte. Die Diagnose "Mosaizis-mus" verbessert offenbar die Prognose des Krankheitsbildes vor allem dann, wenn die Reversion eines Allels in einem frühen Stadium der Hämatopoiese auftritt. In Kapitel 6 berichten wir von zwei Mosaik-Patienten, bei denen untersucht wurde, wann in der Hämatopoiese die Reversion stattgefunden haben muss. Es konnte gezeigt werden, dass die Reversion in einer einzelnen hämatopoietischen Stammzelle erfolgte. Der Nachweis wurde durch die Isolierung einzelner Blutzell- typen, wie Granulozyten, Monozyten, T- und B-Zellen, aus dem peripheren Blut unserer Patienten sowie durch das Vorhandensein bzw. Nichtvorhanden- sein der Reversion in diesen Zellen geführt. Zum Vergleich wurden Hautfibrob- lasten herangezogen, da diese bei Mosaizismus im Blut nicht revertiert sind. In beiden Patienten trugen alle isolierten Blutzellen, nicht jedoch die Hautzellen, die Reversion. Dies und ein zusätzlicher Vergleich mit den zu diesem Zeit- punkt angestiegenen Erythrozyten- und Thrombozytenzahlen zeigten, dass die Reversion in einer einzigen hämatopoietischen Stammzelle stattgefunden haben muss. Dieser revertierten Stammzelle sind alle jeweils phänotypisch korrigierten Blutzellen zuzuschreiben, die dann die gesamte Hämatopoiese übernahmen und aufgrund eines in vivo Wachstumsvorteils sowie der erhöhten Apoptoserate der mutierten Zellen die Panzytopenie beider Patienten im Sinne einer "natürlichen" oder "spontanen" Gentherapie zur Ausheilung brachten. KW - Fanconi-Anämie KW - Genmutation KW - Fanconi Anämie KW - Mutationen KW - Mosaizismus KW - Reversion KW - Fanconi anemia KW - mutations KW - mosaicism KW - reversion Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6579 ER - TY - THES A1 - Gramer, Gwendolyn Christine T1 - Familienanamnese, genetisches Risikoprofil und Risikofaktoren der Glaukome - Eine Untersuchung von 2170 Patienten mit Glaukom oder Okulärer Hypertension T1 - Familiy history, genetic risk and risk factors in the glaucomas - Evaluation of 2170 patients with glaucoma or ocular hypertension N2 - Bei 2170 Patienten mit Glaukom oder Okulärer Hypertension wurden die Häufigkeit eines Glaukoms in der Familienanamnese, das genetische Risikoprofil, sowie okuläre und allgemeine Risikofaktoren untersucht, um aus der Korrelation dieser Faktoren mit dem Schweregrad des Gesichtsfeldausfalls und dem Alter bei Diagnosesstellung Rückschlüsse auf die Bedeutung dieser Faktoren für die Pathogenese und Prognose der Glaukome ziehen zu können. Um zu untersuchen, bei welchen Verwandten die höchste Findungswahrscheinlichkeit einer Glaukomerkrankung besteht, haben z. B. 1335 Patienten mit GCS 5312 Verwandte mit einem standardisierten Fragebogen befragt. Die 10 wichtigsten neuen Erkenntnisse aus dieser Untersuchung sind: 1. Es besteht verglichen zum GCS, bei dem 40 % aller Patienten ein Glaukom in der Familienanamnese haben, kein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit eines Glaukoms in der Familienanamnese bei Patienten mit NTG, OH, GCS mit engem KW und PG. Alle Glaukomformen haben somit eine genetische Disposition. 2. Patienten mit Glaukom in der Familienanamnese sind zum Zeitpunkt der Diagnosestellung signifikant jünger als Patienten ohne Glaukom in der Familienanamnese. Kenntnisse über die genetische Disposition der Glaukome führten somit früher zu Screeninguntersuchungen. 3. Patienten mit Glaukom in der Familienanamnese haben keine schlechtere Prognose für den Erhalt des Gesichtsfeldes als Patienten ohne Glaukom in der Familienanamnese. 4. Bei allen Glaukomformen besteht bei Untersuchung von Geschwistern und Müttern von Glaukompatienten die höchste Findungswahrscheinlichkeit einer Glaukomerkrankung. 5. Verglichen zum GCS besteht ein signifikanter Unterschied im Alter bei Diagnosestellung und damit im Erkrankungsbeginn bei unterschiedlichen Glaukomformen, was für die Wahl des ersten Untersuchungszeitpunkts bedeutend ist. 6. Eine rein altersabhängige Wahl des Screeningzeitpunkts bei GCS zwischen 51. und 60. Lebensjahr führte nicht zur Frühdiagnostik, da in diesem Diagnosezeitraum gleich häufig Patienten mit beginnendem, fortgeschrittenem und schwerem Gesichtsfeldausfall diagnostiziert wurden. 7. Die zeitliche Dynamik des Gesichtsfeldverfalls ist bei unterschiedlichen Glaukomformen unterschiedlich und abhängig von der Höhe des unbehandelten IOD max. Bei 20% der GCS und 40% der NTG Patienten liegen so schwere beidseitige Gesichtsfeldausfälle vor, dass sie kein Fahrzeug steuern können. 8. Die Untersuchung des Alters bei Diagnosestellung in Korrelation zum Stadium der Erkrankung ergibt, dass das NTG verglichen zum GCS nicht wie bisher angenommen eine Erkrankung des älteren Menschen ist, sondern eine Erkrankung ist, die häufiger als das GCS erst im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert wird. 9. Patienten mit NTG haben entgegen der bisherigen Annahme nicht häufiger Herzerkrankungen als Patienten mit GCS oder Patienten mit anderen Glaukomformen. Die Häufigkeit von Herzerkrankungen ist sowohl bei GCS als auch bei NTG rein altersabhängig. 10. Patienten mit NTG haben alterskorrigiert verglichen zu Patienten mit GCS eine um 63,5% höhere Wahrscheinlichkeit an Migräne zu leiden, wobei Frauen häufiger an Migräne erkrankt sind als Männer. Dies kann erklären, warum bei NTG Frauen häufiger erkrankt sind. Eine vaskuläre Dysregulation ist ein Risikofaktor für NTG. Durch humangenetische Untersuchungen könnte die Risikogruppe der Patienten mit Glaukom in der Familienanamnese möglicherweise auf eine Hochrisikogruppe von Personen mit Mutationen in Glaukomgenen eingegrenzt werden. Da Mutationen in den drei bisher bekannten Glaukomgenen jedoch nur bei 10% aller Glaukompatienten gefunden werden, ein GL in der FA hingegen bei 40% der Patienten vorliegt, definiert das Vorliegen eines Glaukoms in der Familienanamnese die Zielgruppe für ein effektives Glaukomscreening. Eine bessere Information der Bevölkerung, dass bei Vorliegen eines Glaukoms in der Familienanamnese Screeninguntersuchungen, besonders bei den Geschwistern der Patienten, erforderlich sind, kann zur Verbesserung der Frühdiagnose und damit der Prognose der Glaukomerkrankung beitragen. N2 - In 2170 patients with glaucoma or ocular hypertension the frequency of family history of glaucoma was evaluated. In addition the genetic risk profile in the glaucomas as well as ocular and general risk factors were assessed. From the correlation of these factors with the stage of visual field loss and the age of patients at diagnosis it was possible to gain information on the significance of these factors for the pathogenesis and prognosis of the glaucomas. In order to identify the groups of relatives with the highest detection probability for glaucoma, e.g. 1335 patients with primary open angle glaucoma (POAG) interviewed 5312 relatives by means of a detailed standardized questionnaire. The 10 most important new results from this evaluation are: 1. In POAG 40% of all patients have a family history of glaucoma. There is no significant difference in the frequency of family history of glaucoma between patients with POAG and patients with NTG, OH, PACG and PG. Therefore all types of glaucoma show a genetic disposition. 2. Patients with a family history of glaucoma are significantly younger at the time of diagnosis than patients without family history of glaucoma. This signifies that knowledge of the genetic disposition of the glaucomas led to earlier glaucoma screening. 3. Patients with family history of glaucoma do not have a higher risk of visual field progression than patients without family history of glaucoma. 4. In all types of glaucoma the highest detection probability for glaucoma was found in patients' siblings and mothers. 5. Compared to POAG there is a significant difference in the age at diagnosis between different types of glaucoma. This means that there is a difference in the onset of the disease and consequently in the adequate age for glaucoma screening between different glaucomas. 6. Age related screening for POAG in patients aged 51 to 60 years does not lead to early detection of glaucoma. This result is derived from the fact, that in this time period an equal proportion of patients with beginning, moderate and severe visual field loss were diagnosed with glaucoma. 7. The time dynamic of visual field loss progression differs between different types of glaucoma and depends on the level of the maximal intraocular pressure before treatment. 20% of patients with POAG and 40% of patients with NTG would not meet the driving standard because of severe bilateral visual field defects. 8. Evaluation of age at diagnosis in correlation to stage of visual field loss at diagnosis shows, that NTG is not a disease of the elderly compared to POAG, as has been described in literature previously, but that NTG is a disease with late diagnosis and consequently severe visual field defects at detection. 9. Patients with NTG do not show a higher frequency of heart disease compared to patients with POAG and other types of glaucoma. The frequency of heat disease is solely age dependant in NTG as well as in GCS. 10. Patients with NTG have a 63.5% higher probability to have migraine than patients with POAG. Women have a higher frequency of migraine than men. This could explain why NTG is more frequent in women than men. Vascular dysregulation seems to be a risk factor for NTG. Genetic testing could restrict the risk group of patients with family history of glaucoma to a high risk group of patients with mutations in glaucoma genes. Mutations in the three glaucoma genes detected so far are only found in 10% of all patients with glaucoma, whereas a family history of glaucoma is found in 40% of all patients. This signifies that family history of glaucoma does so far best identify people who should undergo glaucoma screening tests. Better information of the population that glaucoma screening is essential in people with family history of glaucoma and especially in siblings of glaucoma patients can lead to earlier diagnosis and therefore to a better prognosis of glaucoma. KW - Glaukom KW - Familienanamnese KW - Risikofaktoren KW - Genetik KW - Screening KW - glaucoma KW - family history of glaucoma KW - risk factors KW - genetic risk KW - screening Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19979 ER - TY - THES A1 - Golitschek, Robert von T1 - Charakterisierung von genomischer Instabilität mit Hilfe der Spektralen Karyotypisierung beim Werner-Syndrom T1 - characterization of genomic instability in Werner syndrome fibroblast cultures with spectral karyotyping. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals Metaphasen von Fibroblastenkulturen (AA, WL, SCH, H-51) von Patienten mit der klinischen Verdachtsdiagnose Werner Syndrom (WS) mit der Spektralen Karyotypisierung (SKY) analysiert. Die Auswertung bestätigte in allen vier Zelllinien (ZLL) die zuvor mit konventionellen Methoden (z.B. mit G- und R-Bänderung) etablierten zytogenetischen Charakteristika des WS in Form des „Variegated Translocation Mosaicism“ (VTM) und der im zeitlichen Verlauf einer Zellkultur vorherrschenden zytogenetischen, dominanten Klone, deren Eigenschaften mit den drei Schlagwörtern „clonal attenuation“, „clonal succession“ und „clonal expansion“ bereits durch Salk et al. [28] treffend umschrieben wurden. Alle ZLL wurden nach 7 oder 8 Passagen seneszent, einer für WS-Fibroblasten typischen, reduzierten Lebensspanne. In der genaueren Analyse der aberranten Metaphasen war SKY den konventionellen Methoden deutlich überlegen. Während bei Salk et al. in 1005 Metaphasen 271 Brüche entdeckt wurden, wurden mit SKY in 69 Metaphasen 108 Brüche eindeutig klassifiziert, was außerdem eine detailliertere Einteilung der Klone in unterschiedliche, teilweise singuläre Subklone erforderlich machte. Die bisher noch nie in WS-Zellen festgestellten trizyklischen Chromosomenaustausche und dreifach-rekombinanten Chromosomen zeigten die Fähigkeit der SKY-Methode, komplexe genomische Veränderungen genau darzustellen. Zudem wurde erstmals ein pseudotetraploider Subklon T mit 87-90 Chromosomen entdeckt, der aus der Mutterkultur WL stammte und ein ungewöhnliches Wachstumspotential von etwa 45 Populationsverdoppelungen (PD) erreichte und die durchschnittlichen 20 PD von WS-Fibroblasten um mehr als das Doppelte überschritt, aber unter den 54 PD von Kontrollfibroblasten lag. Eine Tetrasomie wurde für alle autosomalen Chromosomen außer den Chromosomen 4 und 6 festgestellt, die jeweils dreimal, die Geschlechtschromosomen X und Y jeweils zweimal vertreten waren. Die Translokationen waren identisch mit denen von Klon a aus WL, allerdings in jeweils zweifacher Ausführung. 77 der 10 Chromosomen beinhalteten in den 69 Metaphasen ≥6 Brüche und waren in jeweils mindestens 3 der 4 ZLL an Chromosomenaberrationen beteiligt. V.a. Chromosom 16 war mit 17 Bruchpunkten bzw. in 23 von 78 aberranten Chromosomen am häufigsten involviert. Zudem war es an zwei der drei dreifach-rekombinierten Chromosomen und bei einem der zwei trizyklischen Chromosomenaustausche beteiligt. Dies weist auf eine möglicherweise große Bedeutung von Chromosom 16 in Rekombinationsprozessen hin. Auffällig war eine nicht-zufällige Bruchpunktverteilung. Die Bruchpunkte 3q11→q12, 9q13, 15q15, 16q12→q13 und 16q22 waren mögliche hot spots für Bruchereignisse und trugen Rechnung für ≈21% der Bruchereignisse. V.a. 16q22 brach am häufigsten (11mal), war als einziger Bruchpunkt in allen 4 Zelllinien vorhanden und maßgeblich für die hohe Beteiligung des Chromosoms 16 an strukturellen Aberrationen verantwortlich. 16q22 wurde in vorherigen Untersuchungen bisher noch nicht als einer der bevorzugten Bruchpunkte in WS festgestellt. Einige der bei Salk et al. genannten hot spots wurden in dieser Arbeit bestätigt, jedoch mit unterschiedlichem Verteilungsmuster. Dies hängt möglicherweise mit der höheren Sensitivität von SKY, aber auch mit der in dieser Arbeit relativ niedrigen Anzahl an Metaphasen zusammen. Für SKY bestehen weitere mannigfaltige Anwendungsmöglichkeiten , die in der zytogenetischen Forschung nicht nur auf dem Gebiet des WS Fortschritte erzielen können. SKY ist zudem eine sichere Methode, erfordert jedoch einen hohen zeitlichen und materiellen Aufwand, die die Anwendungsmöglichkeiten wiederum limitieren. Als diagnostisches Instrument erscheint SKY daher nur in Fällen sinnvoll, in denen nach der Anwendung konventioneller Methoden weiterhin Unsicherheiten bezüglich der Diagnose bestehen. Mit der Eigenschaft komplexe Rearrangements mit hoher Sensitivität zweifelsfrei nachzuweisen, kann es jedoch als der Gold-Standard bei unklaren Fällen gelten. N2 - Four werner snydrome (ws) fibroblast cultures were analyzed by spectral karyotyping (sky) in this thesis work. There were multiple, pseudotetraploid clones in all cultures, mostly marked by random balanced reciprocal translocations and were therefore clearly showing "variegated translocation mosaicism", the cytogenetic hallmarks of werner syndrome fibroblasts in vitro. One culture contained two clones with three-way exchanges involving the chromosomes 2, 3, 16 and X, 2, 13. Two cultures contained threetime-recombinant chromosomes: der(3)t(3;11;4)(q22;?;q34), der(10)t(10;13;16)(q22;q31;q22), der(16)t(6;16;11)(q24;p13→q22;p15). In 69 metaphases 108 chromosomal breaks were detected, which shows the high sensitivity of sky. In the most extensive study in 1981 Salk et al. detected 271 breaks in 1005 metaphases. The most frequent breakpoint was 16q22(11 times)and was in all cultures immanent. It corresponds to FRA16B, possibly reflecting difficulties of WS cells in replicating AT-rich repetitive DNA structures. All cultures ceased proliferation after 7 or 8 in vitro passages, but a single clone with exceptional growth potential emerged in one of the senescing cultures. Due to its identical translocations, the derivation of this near tetraploid clone (tetrasomy of all autosomes except chromosomes 4 and 6) could be traced to the most prevalent pseudodiploid clone of the parental mass culture. The proliferation of the subclone ceased after 45 population doublings and exceeded the normal average proliferation rate of WS cells which is normally 20. The tetraploidization in combination with certain chromosome rearrangements and selective chromosome dosage may overcome the severely limited in vitro lifespan of WS fibroblasts. The results cleary show the ability of the sky method to confirm and enhance the knowledge of the cytogentic characteristics of ws cells due to its high sensitivity. As a diagnostic tool it should only be used in cases where conventional methods like g- or r-banding failed. KW - Progeria adultorum KW - werner syndrom KW - spektrale karyotypisierung KW - zytogenetik KW - pseudotetraploidisierung KW - 16q22 KW - werner syndrome KW - spectral karyotyping KW - cytogenetics KW - pseudotetraploidization KW - 16q22 Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24957 ER - TY - THES A1 - Gerlinger, Simone T1 - DNA-Reparaturgene als Risikofaktoren für familiären Brustkrebs T1 - DNA repair genes as risk factors for familial breast cancer N2 - Die Voraussetzung für die genomische Integrität einer Zelle ist eine funktionierende DNA-Reparatur. Bei deren Zusammenbruch kommt es zur Tumorgenese. In dieser Arbeit wurde literarisch untersucht, welchen Einfluss DNA-Reparaturgene auf das Risiko für die Entwicklung von familiärem Brustkrebs nehmen. Basis für die Brusttumorgenese ist eine defekte Rekombinations-Reparatur. Zunehmend treten auch andere, teilweise weniger erforschte, Reparaturwege in den Vordergrund. Diese könnten miteinander sogar ein komplexes DNA-Reparatur-Netzwerk bilden. Sind deren Komponenten defekt, kommt es zur Brusttumorgenese. Heterozygote Träger einer Mutation in den zentralen Genen haben dabei ein erhöhtes Risiko für familiäre Mammakarzinome. Biallele Träger entwickeln teilweise sehr spezifische hereditäre Brustkrebssyndrome oder Brustkrebs-assoziierte hereditäre Krebssyndrome. Trägerinnen von Mutationen in den DNA-Reparaturgenen mit hoher Penetranz, BRCA1, BRCA2 und TP53, haben ein zwischen 3- und 22-fach erhöhtes Brustkrebsrisiko. Mutationsträgerinnen von Genen mit niedriger Penetranz wie CHEK2, ATM, NBS1 und die FA-Gene BRIP1 und PALB2 haben ein etwa 2- bis 5-faches Risiko. Normvarianten der DNA-Reparaturgene können sogar für ein noch höheres Risiko prädisponieren. Die Polymorphismen üben einen additiven oder dominant negativen Effekt aus und modifizieren so das familiäre Brustkrebsrisiko kumulativ. Weiterhin wird dieses polygene Modell durch Umweltfaktoren moduliert, die das Risiko zusätzlich erhöhen können. Die modulierenden Einflüsse aller bislang detektierten Risikofaktoren müssen jedoch immer wieder durch neue genetische Modelle evaluiert werden. Die DNA-Reparaturgene sind für etwa 30% aller familiären Brustkrebsfälle verantwortlich, der große Rest ist weiterhin unerforscht. Viele, bislang noch wenig beachtete oder unbekannte DNA-Reparaturgene und Gene, die nicht als solche klassifiziert sind, haben das Potential zum Risikogen für Brustkrebs. Nach heutigem Kenntnisstand handelt es sich bei der Entstehung von familiärem Brustkrebs um ein multifaktorielles Geschehen auf der Basis polygenetischer Veränderungen in den DNA-Reparaturgenen. N2 - Mutations in DNA repair genes play an important role in the tumorigenesis of hereditary carcinomas. A systematic literature search was performed to show the influence of these genes as a risk factor for the development of familial breast cancer. Breast tumour cells lost their genomic integrity mainly due to a defective recombination repair. Increasingly other DNA damage response pathways will be more and more involved and they could pool a complex DNA repair network. If components of the network are mutated, it comes to the breast tumour genesis. Carriers of germline mutations in one of both alleles of the central genes have a higher risk for familial breast cancer. On the other hand, carriers of biallelic mutations develop partially specific recessive hereditary breast cancer syndromes or hereditary cancer syndromes associated with breast cancer. BRCA1, BRCA2 and TP53 are high-penetrance breast cancer susceptibility genes, and disease-causing variants confer a high risk of breast cancer, approximately 3- to 22-fold relative risk. CHEK2, ATM, NBS1 and the both Fanconi anemia genes BRIP1 and PALP2 have a lower penetrance for developing breast cancer and they increase a relative risk about 2- to 5-fold. Additionally, single nucleotide polymorphism exerts influence on the familial breast cancer risk in form of an additive or negative dominant effect. Last but not least this polygenic model will be modulated by various environmental factors. After today's state of knowledge, the origin of familial breast cancer is a matter of multifactorial events on the base of polygenic changes in DNA repair genes. KW - Brustkrebs KW - DNS-Reparatur KW - Familiärer Brustkrebs KW - DNA-Reparaturgene KW - Familial breast cancer KW - DNA repair genes Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-50087 ER - TY - THES A1 - Geier, Katja T1 - Durchflusszytometrische Diagnostik bei Verdacht auf Nijmegen Breakage Syndrom T1 - Diagnostic in suspicion of Nijmegen breakage syndrome by flow cytometry N2 - Das Nijmegen Breakage Syndrom ist eine seltene autosomal- rezessive Erkrankung, die durch ein typisches Erscheinungsbild mit Mikrozephalie, Wachstumsretardierung, Immundefizienz sowie durch eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung und eine erhöhte Prädisposition gegenüber malignen Tumoren charakterisiert wird. Die Erkrankung wird durch Mutationen im NBS1-Gen verursacht, welches auf Chromosom 8q21 lokalisiert werden konnte. Das NBS1-Gen Produkt, Nibrin, ist Teil des MRE11-RAD50-Nibrin Proteinkomplexes, welcher eine zentrale Rolle bei der Erkennung und der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen spielt. Das Fehlen von Nibrin führt zu einer fehlerhaften DNA-Reparatur und erklärt die verschiedenen klinischen und zellulären Symptome bei NBS-Patienten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Daten von 40 Patienten ausgewertet, die im Rahmen der Verdachtsdiagnose eines Nijmegen Breakage Syndroms mit der Durchflusszytometrie untersucht wurden. Für die Unterscheidung zwischen NBS-positiven und NBS-negativen Fällen sind folgende Parameter von diagnostischer Relevanz: 1) der Anteil nichtproliferierender Zellen (G0/G1-Phase-Zelle), welcher bei NBS-Patienten meist deutlich höher sind als bei gesunden Kontrollen. Sie spiegeln bei erhöhten Werten die herabgesetzte Mitogenantwort wider. 2) die G2/GF-Ratio als Maß für Strahlensensitivität, welche bei NBS-Patienten charakteristischerweise erhöht ist. Die Auswertung der Daten erlaubte es in 22 Fällen die Verdachtsdiagnose NBS auszuschließen, da diese für beide Parameter Werte im Normalbereich zeigten. In 16 Fällen ergab sich ein positives Ergebnis mit erhöhtem Anteil nichtproliferierender Zellen und erhöhter Strahlensensitivität. Unter den positiven Fällen konnte bei 9 Patienten die Diagnose des Nijmegen Breakage Syndroms mittels Mutationsanalyse bestätigt werden. Bei 7 Patienten konnte jedoch trotz erhöhter Strahlensensitivität keine Mutation im NBS1-Gen nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Durchflusszytometrie das Vorliegen einer erhöhten Strahlensensitivität eindeutig nachweisen kann. Eine erhöhte Strahlensensitivität ist wiederum ein charakteristisches Merkmal des Nijmegen Breakage Syndroms, da es in direkten Zusammenhang mit dem verursachenden Gendefekt steht. Die Durchflusszytometrie kann daher als ein sinnvolles diagnostisches Verfahren von hoher Sensitivität bei Patienten mit der Verdachtsdiagnose NBS angesehen und erfolgreich eingesetzt werden. Allerdings ist die Spezifität des Verfahrens sehr viel geringer. Die Methode der Wahl für die Primärdiagnostik des Nijmegen Breakage Syndroms wird in Zukunft daher die Mutationsanalyse sein. N2 - Nijmegen breakage syndrome is a rare autosomal recessive chromosomal instability disorder with hypersensitivity to ionizing radiation and an increased cancer risk. The clinical phenotype is characterized by congenital microcephaly, dysmorphic facial appearance, growth retardation and immunodeficiency. At the cellular level NBS is characterized with increased spontaneous and induced chromosomal breaks and cell cycle aberrations. NBS1, the gene defective in Nijmegen breakage syndrome, is located on chromosome 8q21 and has been cloned. The NBS1 gene codes for the protein nibrin which is a member of the MRE11-RAD50-NBS1 complex, a central player associated with double–strand breaks repair. Most NBS patients are Slavic origin and homozygous for the founder mutation 657del5, which leads to a frameshift and protein truncation. We have studied 40 patients with the clinical suspicion of NBS using a cell cycle based screening assay. Peripheral blood mononuclear cells were exposed to ionizing radiation and incubated for 72 h in the presence of phytohemagglutinin. To decide between NBS-positive and NBS-negative group the following cell cycle parameters were ascertained: 1. proportion of non-proliferation (G0/G1) cells as a measure of the mitogen response. 2. Proportion of first cycle G2-phase cells relative to the growth fraction as a measure of radiosensitivity. 22 cases could assign to the NBS-negative group and 16 cases could assign to the NBS-positive group. 9 cases of the NBS-positive group were confirmed by NBS mutation analysis. In the other 7 cases no NBS-mutation could be found. We conclude that cell cycle testing by flow cytometry is a very sensitive screening procedure for radiosensitivity and can be successfully applied to the diagnostic of Nijmegen breakage syndrome. But the primary diagnostic of NBS is mutation analysis. KW - Durchflusscytometrie KW - Nijmegen Breakage Syndrom KW - Nibrin KW - Chromosomeninstabilitätssyndrome KW - Strahlensensitivität KW - Nijmegen breakage syndrome KW - chromosomal instability disorder KW - nibrin KW - radiosensitivity KW - flow cytometry Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27695 ER - TY - THES A1 - Gehrig, Andrea T1 - Untersuchungen zu den molekularen Ursachen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis - vom Gendefekt zum Mausmodell T1 - Molecular studies of X-linked juvenile Retinoschisis - from gene defect to the mouse model N2 - Hereditäre Netzhautdegenerationen betreffen weltweit etwa 15 Millionen Menschen. Sie sind klinisch und genetisch auffällig heterogen. Bisher wurden 139 verschiedene chromosomale Genorte mit Netzhautdystrophien assoziiert, wovon inzwischen 90 Gene identifiziert werden konnten. Mit Hilfe verschiedener Klonierungsstrategien konnte in der vorgelegten Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der genetischen Ursachen einiger ausgewählter Retinopathien geleistet werden. So konnte durch die Positionsklonierung das Gen, das mit der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (RS) assoziiert ist, identifiziert werden. Funktionelle Analysen des Genproduktes sowie die Generierung eines Mausmodells der RS geben einen Einblick in die Physiologie der Retina sowie den Pathomechanismus der Erkrankung. Die genomische Organisation des Interphotorezeptor-Matrixproteoglykans-1 (IMPG1) wurde aufgeklärt und die chromosomale Lokalisation auf 6q13-15 bestimmt. Damit kartierte das Gen in eine Region, in die die Genorte für 7 Retinopathien des Menschen kartiert wurden. Durch Kopplungs- und Mutationsanalysen konnten unsere Arbeiten ausschließen, daß IMPG1 mit North Carolina Makuladystrophie (MCDR1) oder der progressiven bifokalen chorioretinalen Atrophie (PBCRA) in Zusammenhang steht. Die Diacylglycerin Kinase-3 (DAGK3) konnte nach der Bestimmung der genomischen Organisation in die Region 3q27-28 kartiert werden. Dieser chromosomale Abschnitt deckt sich mit der chromosomalen Lokalisation der autosomal dominanten Optikusatrophie (OPA1). Auch hier konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen ein Ausschluß des Gens erfolgen. Die X-gebundene juvenile Retinoschisis ist eine häufige Ursache juveniler Makula-degenerationen und betrifft etwa 300.000 junge Männer weltweit. Charakteristische Kennzeichen der Erkrankung sind Aufspaltungen in den inneren Netzhautschichten, die zu zystischen Veränderungen der zentralen Retina führen. Ungefähr 50 % der Patienten entwickeln auch periphere Manifestationen. Durch die Arbeit unserer und anderer Forschergruppen konnte der Krankheitslokus in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert werden. Durch einen Vergleich der genomischen DNA Sequenzen mit öffentlich zugänglichen ESTs (expressed sequence tags) konnte ein retinaspezifisches Transkript identifiziert werden. Es besteht aus 6 Exonen und kodiert für ein putatives 224 Aminosäuren großes Protein, das sekretiert wird und ein hochkonserviertes Discoidindomänen-Motiv enthält. Discoidindomänen sind in Zelladhäsion oder in Zell-Zell Interaktionen involviert. Mutationsanalysen in RS-Patienten bestätigten, daß es sich bei diesem Transkript um RS1, d.h. um das krankheitsassoziierte Gen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis handelte. Das RS1-Protein (Retinoschisin) kommt in homo-oligomeren Komplexen, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, auf der Zelloberfläche der Photorezeptoren und der Bipolaren sowie in den synaptischen Regionen der äußeren (OPL) und innere plexiformen Schicht (IPL) vor. Um die Funktion des normalen Retinoschisins zu untersuchen und um einen Einblick in die RS-Pathogenese zu bekommen, wurde nach der Charakterisierung des orthologen murinen Gens (Rs1h) eine Retinoschisin-defiziente knock-out Maus generiert. Ophthalmologische und histologische Untersuchungen der Rs1h-/Y-Maus zeigen signifikante Parallelen zu dem RS-Erkrankungsbild des Menschen. Damit stellt die Rs1h knock-out Maus ein ideales Tiermodell für die Untersuchung des zugrundeliegenden Krankheitsmechanismusses dar. So konnten wir inzwischen zeigen, daß apoptotische Prozesse zur Degeneration der Photorezeptoren führen. Gegenwärtig werden mit diesem Tiermodell erste gentherapeutische Versuche durchgeführt. Diese Arbeiten sollen Aufschluß darüber geben, ob ein Adeno-assoziierter Virus (AAV)-Transfer des RS1 Gens in die erkrankte Retina ein möglicher Therapieansatz für RS auch beim Menschen sein könnte. N2 - The World Health Organization (WHO) estimates that worldwide approximately 15 million people are affected with hereditary retinal degenerations. Retinal dystrophies are clinically and genetically heterogeneous. To date, 90 retinal disease genes have been identified and of 139 retinal disease genes the chromosomal location is known. In this study, different strategies of disease gene cloning were utilized to elucidate the underlying genetic defects of selected retinopathies. This has led to the identification of the gene associated with X-linked juvenile retinoschisis (RS) by positional cloning. Both, functional analysis of the gene product, named retinoschisin (RS1), and the generation of a mouse model for RS provide novel insight into retinal physiology and the pathomechanism of the disease. The genomic organization of the interphotoreceptor matrix proteoglycan-1 (IMPG1) was established and its chromosomal localization was identified (6q13-15). Seven different human retinal dystrophies have previously been mapped to this region on chromosome 6. A possible genetic association between IMPG1 and two retinal dystrophies, North Carolina macular dystrophy (MCDR1) and progressive bifocal chorioretinal atrophy (PBCRA), was investigated. By means of linkage studies and mutation analysis in affected patients the involvement of IMPG1 in these two different diseases was ruled out. The genomic organization of diacylglycerol kinase-3 (DAGK3) was determined and the gene locus was mapped to chromosome 3q27-28. The autosomal dominant optic atrophy (OPA1) was independently localized to the same chromosomal region. This has prompted us to investigate the role of DAGK3 in OPA1. By mutation analysis such a correlation could be excluded. X-linked juvenile retinoschisis is a common cause of juvenile macular degeneration affecting approximately 300.000 young males worldwide. The disease is characterized by a slitting of the inner retinal layers resulting in cystic degeneration of the central retina. Half of the patients also develop peripheral manifestations. Our laboratory and others localized the RS gene to a 900 kb interval on the short arm of chromosome Xp22.2. Comparison of genomic DNA sequences with publicly available expressed sequence tags (ESTs) have identified a retina-specific transcript. This novel transcript is composed of six exons that encode a 224-amino acid protein including a 23 amino acid signal peptide. Bioinformatical analysis revealed that the putative protein consists almost exclusively of a discoidin domain wich is highly conserved from slime mold to human. Discoidin domains are implicated in cell adhesion or cell-cell interactions. On the basis of mutation analysis in patients affected with RS, we confirmed that the gene indeed is responsible for RS pathology. The RS1 protein is found at the cell surfaces of photoreceptors and bipolar cells and within the synaptic regions of the outer (OPL) and the inner plexiform layers (IPL) most likely as a homo-oligomeric complex. To clarify the function of the normal RS1 and to gain insight into RS pathogenesis a mouse model deficient of the endogenous RS1 protein was generated. For these purposes the genomic organization of the murine orthologous RS1 gene (Rs1h) was identified. Ophthalmologic and histologic analysis of Rs1h-/Y mice revealed significant parallels to the human RS phenotyp. Therefore, the knock-out mouse represents an ideal model to further study the underlying disease mechanism. Recently, we showed that apoptosis is the final pathway of photoreceptor degeneration in Rs1h-/Y mice. Most importantly this mouse model can serve as proof-of-concept for gene therapy. Towards this end we are testing adeno-associated virus (AAV)-based gene transfer of RS1 into the defect murine retina. This may pave the way for a gene based future intervention in humans affected with this condition. KW - Maus KW - Retinoschisis KW - Erbkrankheit KW - Molekulargenetik KW - X-gebundene juvenile Retinoschisis KW - Gendefekt KW - Mausmodell KW - X-linked juvenile retinoschisis KW - gene defect KW - mouse model Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7212 ER - TY - THES A1 - Gavvovidis, Ioannis T1 - Primäre Mikrozephalie: Einblicke in Expression und Funktion von MCPH1/Microcephalin und seiner Isoformen T1 - Primary microcephaly: insights into expression and function of MCPH1/Microcephalin and their isoforms N2 - Primäre Mikrozephalie (MCPH) ist eine heterogene, autosomal rezessive Störung des Menschen, die durch eine enorme Reduzierung des Hirnvolumens und variable geistige Behinderung ohne zusätzliche neurologische Defizite charakterisiert ist. Fünf einzeln ursächliche Gene sind bislang identifiziert. Zelluläres Merkmal von Patienten mit biallelischen Mutationen im MCPH1-Gen ist die vorzeitige Chromosomenkondensation in der G2-Phase des Zellzyklus sowie die verzögerte Chromosomendekondensation in der darauf folgenden G1-Phase (PCC-Syndrom). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass MCPH1 für zwei Haupttranskripte kodiert: Full-length-MCPH1 und ein Transkript ohne die Sequenz der letzten fünf Exons (MCPH1De9-14). Das vom Full-length-Transkript kodierte Polypeptid enthält eine N-terminale und zwei C-terminale BRCT-Domänen, während der MCPH1De9-14-Isoform die beiden C-terminalen BRCT-Domänen fehlen. Beide Varianten zeigen eine ähnliche Höhe der Gewebe-spezifischen Expression und sind in bestimmten fötalen Organen stärker vertreten als in adulten. Beide Isoformen werden während des Zellzyklus antagonistisch reguliert. Beide sind Zellkern-spezifische Proteine. Drei Kernlokalisierungssequenzen wurden in silico identifiziert. Die funktionelle Untersuchung dieser Signale ergab, dass zwei von ihnen unabhängig voneinander den Kerntransport des Proteins bewerkstelligen können. Die alleinige Expression der jeweiligen Variante ist ausreichend, um die defekte Chromosomenkondensation in MCPH1-defizienten Zellen zu komplementieren. Fehlende Komplementation mit der Deletionsvariante MCPH1De1-7 weist die N-terminale Region von MCPH1 als unentbehrlich zur Verhinderung von PCC aus. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten auf eine redundante Funktion der beiden Isoformen in der Regulierung der Chromosomenkondensation hin. Im Gegensatz dazu verhalten sie sich unterschiedlich im Bezug auf die DNA-Schadensantwort. Während Full-length-MCPH1 in strahlungsinduzierten Reparaturfoci lokalisiert werden kann, wird für MCPH1De9-14 keine Kolokalisierung mit phosphoryliertem H2AX nach DNA-Schadensinduktion beobachtet. Zusammenfassend kann man feststellen, dass das MCPH1-Gen für unterschiedliche Isoformen mit differenzieller Regulation auf RNA-Ebene und verschiedenen Funktionen auf Protein-Ebene kodiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erleichtern das Verständnis der diversen Funktionen von MCPH1 in der Zelle. N2 - Primary microcephaly (MCPH) is a heterogeneous autosomal recessive human disorder characterized by pronounced reduction of brain size and variable mental retardation without additional neurological deficits. To date, biallelic mutations in any of five genes have been identified to cause MCPH. A hallmark of patients with mutations in the MCPH1 gene is a cellular phenotype with premature chromosome condensation in the G2 phase of the cell cycle and delayed decondensation in the subsequent G1 phase (PCC syndrome). Here, we find that MCPH1 encodes two major species of transcripts: full-length MCPH1 and a transcript lacking sequence of the five 3’-exons of the gene (MCPH1De9-14). The polypeptide encoded by the full length transcript contains one N-terminal and two C-terminal BRCT domains, while the protein encoded by the MCPH1De9-14 variant is lacking the tandem C-terminal BRCT domains. Both variants show similar tissue-specific expression patterns, are likewise abundant in many foetal over adult organs, but are regulated antagonistically during cell cycle progression. Both MCPH1 isoforms show nuclear localization. Three nuclear localization signal sequences were identified in silico two of which proved to contribute individually to nuclear targeting. Expression of full-length MCPH1 or MCPH1De9-14 is independently able to complement the defective chromosome condensation in MCPH1-deficient cells. In contrast, attempts to complement with the mutant variant MCPH1De1-7 failed and thus identify the N-terminus of MCPH1 as crucial for the prevention of PCC. The present results suggest a redundant function of full-length and De9-14 MCPH1 in the regulation of chromosome condensation but different behaviour in the DNA damage response: While full-length MCPH1 localizes to nuclear repair foci following ionizing irradiation, MCPH1De9-14 fails to co-localize with phosphorylated H2AX. The results of the present study show that the MCPH1 gene encodes different isoforms that are differentially regulated at the transcript level and have differential functions at the protein level. These findings facilitate a better understanding of the diverse cellular functions claimed to MCPH1. KW - Mikrozephalie KW - DNS-Reparatur KW - PCC-Syndrom KW - Mentale Retardierung KW - Alternatives Spleißen KW - NLS-Sequenz KW - Chromosomenkondensation KW - Primary Microcephaly KW - DNA damage response KW - chromosome condensation KW - alternative splicing Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51816 ER - TY - THES A1 - Gauß, Frieder T1 - Genetische Diagnostik bei Hämophilie A und Hereditärem Angioödem: eine retrospektive Studie T1 - Genetic diagnostics of haemophilia A and hereditary angioedema: a retrospective study N2 - Im Fünfjahreszeitraum der Jahre 2000 bis 2004 wurden am Institut für Humangenetik der Universität Würzburg mehr als 2300 Untersuchungen zur molekulargenetischen Bestätigung bzw. Ausschluss eines Betroffenen-Status bzw. eines Überträger-Status für die Hämophilie A durchgeführt. Dies waren 20% aller in dieser Arbeit erfassten molekulargenetischen Untersuchungen des Instituts. Die Zahl der Untersuchungen stieg von knapp über 400 im Jahre 2000 auf 550 im Jahre 2003, fiel aber im Jahr 2004 wieder auf den Ausgangswert zurück. Anforderungen für F8-Mutationsanalysen kamen schwerpunktmäßig aus Bonn, Frankfurt, München und den neuen Bundesländern. 55% der untersuchten Patienten waren männlich, 39% weiblich, wobei die Zahl der weiblichen Patienten (Überträgerdiagnostik) bis zum Jahre 2003 einen deutlichen Anstieg verzeichnete. In 72% der Fälle konnte eine Mutation nachgewiesen, in 25% der Fälle konnte eine Mutation ausgeschlossen werden. Durchschnittlich 3% der Fälle blieben ohne definitives Ergebnis, wobei dieser Wert am Ende des Beobachtungszeitraums mit 1% deutlich unter den initialen 6% im Jahre 2000 lag. Die primäre Untersuchungsrate auf die Intron 22 Inversion sank von initial 40% (im Jahre 2000) auf knapp unter 20% im Jahre 2004. Gleichzeitig stieg die Analytik mittels DGGE und anschließender Sequenzierung von 60% auf 80%. Im Gegensatz zur Intron 22 Inversion mit 29% der positiv-getesteten Fälle spielte die Intron 1 Inversion mit knapp 1% der positiven Ergebnisse nur eine geringe Rolle. Im gleichen Fünfjahreszeitraum wurden 350 Untersuchungen zur Bestätigung bzw. zum Ausschluss genetischer Veränderungen als Ursache des Hereditären Angioödems (HAE) durchgeführt. Die Häufigkeit der Mutationsanalysen im SERPING1-Gen ergab eine bimodale Verteilung: Während im Jahr 2000 knapp über 100 Analysen durchgeführt wurden, sank diese Zahl im Jahr 2001 auf unter 50, um dann bis zum Jahre 2004 auf nahezu 200 Fälle pro Jahr anzusteigen. 62% der untersuchten Patienten waren weiblich, 38% männlich, was der klinischen Präsentation der Erkrankung entspricht. Das Durchschnittsalter lag zwischen 30 und 40 Jahren. In 52% der Untersuchungen gelang der Nachweis einer Mutation, in 34% der Fälle war das Ergebnis negativ. In durchschnittlich 14% der Fälle konnte kein definitives Ergebnis erzielt werden. Während dieser Wert initial (im Jahre 2000) bei 30% lag, konnte er durch die Verbesserung der molekulargenetischen Analytik bis zum Jahre 2004 auf unter 2% gesenkt werden. Unter den Einsendern dominierten die Großräume Frankfurt und Mainz, während nur jeweils 1% der Anforderungen auf die Großräume München, Gera und Belgien entfielen. Lt. Gößwein et al. (2008) [C1CYG08] fanden sich in der Würzburger Kohorte mit jeweils 33% bis 34% am häufigsten Missense-Mutationen sowie kleinere Deletionen und Insertionen. Große Deletionen, Splice-site-Mutationen und Nonsense-Mutationen waren mit jeweils ca. 10% sehr viel seltener. Zusammenfassend ergeben sich aus der retrospektiven Auswertung der Daten zur molekulargenetischen Analytik von Hämophilie A und Hereditärem Angioödem wichtige Hinweise auf zeitlich und technisch bedingte Fluktuationen, welche als Grundlage zukünftiger analytischer Strategien dienen können. N2 - At the Department of Human Genetics of the University of Würzburg, between the years 2000 and 2004 more than 2300 blood samples have been tested in order to rule out or to confirm genetic alterations in the X-chromosomal factor VIII gene. This amounts to 20% all genetic tests carried out during the five year interval. The number of tested specimens increased from an initial 400 per year in the year 2000 to 550 per year in the year 2003, and dropped down to around 400 in the year 2004. Requests for FVIII mutation analysis came mainly from Bonn, Frankfurt, Munich and from former East-German-States. Initially, 55% of the analyzed patients were male and 39% female, but female carrier diagnostics increased during the five year interval. A disease-causing genetic alteration was detected in 72% of cases, while a negative result was obtained in 25%. Initially, a result was not obtained in 6% of cases, but this figure decreased to 1% at the end of the study period. At the beginning of the study, 40% of the specimens were first subjected to intron 22 inversion analysis. This rate dropped down to 20% at the end of the study. Concurrently, the utilization of DGGE-prescreening increased from 60 to 80%. Whereas the intron 22 inversion comprised 29% of all positive cases, less than 1% of all cases had an intron 1 inversion. During the same five year period, 350 analyses for confirmation or exclusion of genetic alterations as cause of hereditary angioedema (HAE) were performed. There was a bimodal distribution of the frequency of the molecular HAE tests which declined from an initial 100 per year (in 2000) to 50 per year. Collectively, the results of this retrospective analysis document substantial temporal, geographic and methodological fluctuations in the provision of specialized genetic services which may serve as guidelines for future improvements. KW - Würzburg / Institut für Humangenetik KW - Hämophilie A KW - Hereditäres Angioödem KW - department of human genetics KW - haemophilia a KW - hereditary angioedema KW - wuerzburg Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45995 ER - TY - THES A1 - Gahn, Carolin T1 - Die Häufigkeiten der Mutationstypen und deren Verteilung im Dystrophin-Gen T1 - The Frequency of the Mutation Types and their Distribution in the Dystrophin Gene N2 - Die progressiven Muskeldystrophien Duchenne (DMD) und Becker (BMD) entstehen durch verschiedene Mutationstypen (Deletionen, Duplikationen, Punktmutationen) im Dystrophin-Gen, welches als größtes Gen des Menschen 79 Exons aufweist und sich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms befindet. Es wurden Daten von 1365 Personen bezüglich der Häufigkeit der Mutationstypen sowie der Verteilung der einzelnen Mutationen auf die Exons des Dystrophin-Gens ausgewertet. Hieraus konnte ermittelt werden, dass sich bei 780 männlichen Patienten mit gesicherter Diagnose zu 65 Prozent Deletionen, 9 Prozent Duplikationen und 26 Prozent Punktmutationen nachweisen ließen. Desweiteren wurde gezeigt, dass sich bei der Verteilung der Deletionen auf das Dystrophin-Gen zwei hot spot Regionen finden, eine größere im Bereich der Exons 45 - 54 und eine kleinere im Bereich 11 - 20. Die Duplikationen weisen eine Häufung der betroffenen Exons am Anfang des Gens auf, wobei Exon 2 am häufigsten das erste betroffene Exon darstellt. Die Punktmutationen dagegen verteilen sich zufällig über das Gen. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass hinsichtlich der Verteilung der gleichen Mutationen auf das Dystrophin-Gen zwischen einer Gruppe von männlichen Patienten und der Gesamtheit aller Probanden einschließlich Konduktorinnen keine Unterschiede bestehen. Dagegen unterschieden sich die verschiedenen Mutationstypen im Vergleich miteinander hinsichtlich ihrer Verteilung auf das Dystrophin-Gen. Bei der Untersuchung der geographischen Verteilung der DMD und BMD konnte lediglich bei den Duplikationen eine Gleichverteilung in Deutschland bestätigt werden. N2 - The progressive muscular dystrophies Duchenne (DMD) and Becker (BMD) originate from different mutation types (deletions, duplications, point mutations) in the dystrophin gene, the biggest human gene, which has 79 exons and is located on the short arm of the X-chromosome. Data of 1365 people were evaluated with regard to the frequency of the mutation types as well as the distribution of mutations over the exons of the dystrophin gene. We found that in 780 male patients with secured diagnosis, there were deletions in 65 percent of the cases, duplications in 9 percent and point mutations in 26 percent. Furthermore it was shown that the distribution of deletions in the dystrophin gene shows two hot spot regions, a larger one in the area of exons 45 - 54 and a smaller one in the area of exons 11 - 20. Duplications showed an accumulation of affected exons at the beginning of the gene, with exon 2 being the first affected exon most often. Point mutations in contrast are distributed over the gene randomly. Moreover it was found out that the distribution of mutations in the dystrophin gene did not differ between a group of male patients and the group of all patients including female carriers, whereas mutation types differed regarding their dissemination over the dystrophin gene. With the analysis of the geographic distribution of DMD and BMD a uniform geographical distribution over Germany could be confirmed merely with duplications. KW - Muskeldystrophie KW - Duchenne KW - Dystrophin-Gen KW - Mutation KW - Verteilung KW - Muskeldystrophie KW - Duchenne KW - Dystrophin-Gen KW - Mutation KW - Verteilung KW - Muscular Dystrophy KW - Duchenne KW - Dystrophin Gene KW - Mutation KW - Frequency Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56490 ER - TY - THES A1 - Förster, Tanja T1 - Molekulargenetik des Hereditären Angioödems T1 - Molecular genetics of hereditary angioedema N2 - Das Hereditäre Angioödem (HAE) ist eine seltene autosomal dominante Erkrankung, die durch einen angeborenen quantitativen oder funktionellen Defekt des C1-Inhibitors (C1-INH) verursacht wird. Das C1-INH-Protein, ein Serin Protease Inhibitor (Serpin) ist der einzige Inhibitor der C1s und C1r Komponenten des klassischen Wegs der Komplementaktivierung. Weiterhin reguliert er die Aktivierung der Faktoren XI und XII im intrinsischen Teil der Blutgerinnung und die Generierung von Kallikrein im Kontaktsystem. Durch die fehlende Kontrolle dieser Systeme kommt es zur vermehrten Bildung vasoaktiver Substanzen, die für die charakteristischen Symptome wie rezividierende, nicht juckende Schwellungen der Haut und Schleimhäute sowie krampfartige Schmerzen im Abdomen verantwortlich sind. HAE-Attacken werden durch psychologischen und/oder physiologischen Stress ausgelöst und manifestieren sich häufig isoliert im Kehlkopfbereich, wobei die Gefahr des Erstickens durch ein Larynx- oder Glottisödem droht. Die vorliegende Arbeit beschreibt die C1-INH-Genanalyse von 208 Familien mit 359 Mitgliedern, die aufgrund der Differentialdiagnose HAE zwischen 1999 und 2005 von spezialisierten klinischen Zentren eingesandt wurden. Bei 32 Patienten wurden durch Southern-Blot und dHPLC Untersuchungen große Deletionen des C1-INH-Gens nachgewiesen. Weiterhin wurden durch Komplett-Sequenzierung der 8 Exons und angrenzenden Intronbereiche des Gens identifiziert. Bei 96 Familien mit 172 Mitgliedern wurden 80 verschiedene Punktmutationen nachgewiesen, die bei Abschluss der vorliegenden Arbeit nicht in der Literatur beschrieben waren. Die HAE-Datenbank kann als Folge auf insgesamt 279 bekannte Mutationen im C1-INH-Gen erweitert werden. Da viele Patienten Missense-Mutationen unbekannter Kausalität aufwiesen, wurden 29 anhand ihrer Lokalisation oder Homologie ausgewählte Mutationen durch zielgerichtete Mutagenese in einen Expressionvektor eingefügt und anschließend in HEK-293 Zellen exprimiert. Die Funktion der rekombinanten Proteine wurde mittels eines C1-INH-Aktivitäts-Assays überprüft. Während bei den meisten rekombinant exprimierten mutanten Proteinen die Kausalität für das HAE durch sehr geringe C1-INH-Restaktivitäten bestätigt werden konnten, zeigten einige mutante Proteine kaum beeinträchtige Aktivitäten. Die zugrunde liegenden Punktmutationen dürften deshalb sehr seltene Polymorphismen sein. Um weiteren Aufschluss über die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen zu erhalten, wurden diese in ein 3D-Modell des C1-INH eingebaut und mit einem wildtypischen C1-INH-Modell verglichen. Das verfügbare Modell, das nicht auf Strukturdaten, sondern auf der Homolgie zu anderen Serpinen beruht und nur die Serpindomäne erfasst, erwies sich jedoch bei einigen inaktivierenden Mutationen als unzureichend bzw. unvollständig. Die C1-INH-Gendiagnostik konnte in den meisten Fällen eine Mutation bei den betroffenen Familien nachweisen und auch Mutationsträger vor der Erstmanifestation lebensbedrohender Symptome identifizieren. Die rekombinante Expression und Aktivitätsmessung mutanter C1-INH-Proteine ist ein nützliches Hilfsmittel um die Kausalität von Missense-Mutationen aufzuklären und liefert wertvolle Einblicke in die Funktion individueller Aminosäuren im C1-INH-Protein. N2 - Hereditary Angioedema (HAE) is a rare autosomal dominant disease due to quantitative or functional deficiency of the C1 inhibitor (C1-INH) protein. The C1-INH protein, a serine protease inhibitor (serpin), is the sole inhibitor of the C1r and C1s components of the classical complement pathway and the major regulator of factors XI and XII in the intrinsic blood coagulation and of plasma kallikrein in the contact system. With C1-INH deficiency, proper control of these systems is lacking and vasoactive peptides are generated in excess and are responsible for the characteristic symptoms like recurrent non pruritic swellings of the skin or mucosa as well as painful crampi of the abdomen. HAE episodes are triggered by psychological and/or physiological stress and often manifest in the laryngeal region with the risk of suffocation. This thesis describes the genetic analysis of the C1-INH gene in 208 families with 359 members which were suspicious for HAE and were sent from specialised outpatient clinics from 1999 to 2005. In 32 patients large deletions of the C1-INH gene were detected by Southern-Blot and dHPLC. Sequencing of all 8 exons and flanking intronic regions revealed 93 point mutations and small deletions/insertions. In 96 families with 172 members 80 different point mutations were detected which have not been published in the literature yet. As a result the HAE-database can be enlarged to 279 known mutations in the C1-INH gene. A large number of patients presented with missense mutations of unknown causality. On the basis of their localisation or homology, 29 mutations were chosen and inserted into an expression vector by site-directed mutagenesis and expressed in HEK-293 cells. The activity of the recombinant proteins was measured by a functional C1-INH assay. While most recombinant proteins resulted in almost no detectable activity thus verifying their causality for HAE, some mutant proteins showed only a reduced activity compared to wildtype. The underlying point mutations are therefore likely to be rare polymorphisms. In order to gain further insight into the effects of different mutations they were modelled into a 3D-model of the C1-INH protein and compared to a wildtype model of the C1-INH. While the model demonstrated remarkable structural alterations for some mutations it failed to do so for other clearly inactivating mutations. Since no 3D-crystallography of C1-INH is available yet, the model is based on sequence similarity of the serpin domain to other serpins with apparent limitations. Routine genetic analysis of the C1-INH gene has identified mutations in most of the HAE families and has characterised several HAE carriers prior to manifestation of life threatening symptoms. Recombinant expression and measurement of the activity of mutated C1-INH proteins is a useful tool to elucidate the causality of missense mutations and helps to characterize the role of individual amino acid residues within the C1-INH protein. KW - Gefäßkrankheit KW - Ödem KW - Erbkrankheit KW - Molekulargenetik KW - Hereditäres Angioödem KW - HAE KW - C1-Inhibitor KW - C1INH KW - Serpin KW - Hereditary Angioedem KW - HAE KW - C1 Inhibitor KW - C1INH KW - Serpin Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20340 ER - TY - THES A1 - Förster, Johanna R. T1 - Identifizierung und Analyse von Proteininteraktionen bei zwei Mitgliedern der MAGUK-p55-Subfamilie, MPP4 und MPP5 T1 - Identification and analysis of protein interactions of two members of the MAGUK p55 subfamily, MPP4 and MPP5 N2 - Gegenstand der vorliegenden Untersuchungen waren das retinaspezifische palmitoylierte Membranprotein 4 (engl. membrane palmitoylated protein 4, MPP4) und das ubiquitär exprimierte MPP5, die beide zur großen Familie der Membran-assoziierten Guanylatkinasen (engl. membrane-associated guanylate kinases, MAGUKs) gehören. Beide Proteine haben wichtige organisatorische Funktionen als Adapterproteine in der Netzhaut. MPP4 ist am Aufbau von präsynaptischen Proteinkomplexen in den Photorezeptor-Ribbonsynapsen beteiligt. Ein Fehlen von MPP4 in Mäusen führt zum Verlust von einigen präsynaptischen Proteinen von der Ribbonsynapse, was eine wichtige Rolle von MPP4 für die Organisation dieses Komplexes indiziert. Um neue Komponenten dieses Multiproteinkomplexes zu identifizieren, wurde in der vorliegenden Arbeit ein proteomischer Ansatz etabliert. Dazu wurde der MPP4-assoziierte Proteinkomplex aus Proteinextrakten der bovinen Retina durch Immunaffinitätschromatographie isoliert, mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt und resultierende Protein-spots massenspektrometrisch analysiert. Diese Untersuchungen identifizierten 18 kopräzipitierte Proteine. Darunter waren der bekannte Interaktionspartner Veli3 und das MAGUK-Protein PSD95. Für letzteres konnte gezeigt werden, dass speziell die β-Isoform von PSD95 mit MPP4 über die N-terminalen L27-Domänen heterodimerisiert. Daneben konnte die Assoziation von MPP4 mit Hsc70 und Recoverin durch unabhängige Bindungs-assays verifiziert werden, wobei diese Interaktionen indirekt waren und möglicherweise von retinaspezifischen Proteinen vermittelt werden. Diese Ergebnisse unterstützen die herausragende Rolle von MPP4 als Gerüstprotein für die Organisation eines Proteinkomplexes der Photorezeptorsynapse, der an der Regulierung der Ca2+-Homöostase in den präsynaptischen Enden, sowie vermutlich auch an der Exozytose der synaptischen Vesikel beteiligt ist. Die übrigen kopräzipitierten Proteine waren Bestandteile des Zytoskeletts und verschiedener Signalwege und wahrscheinlich unspezifische Kontaminanten. Das MPP5-Protein ist Teil eines evolutionär konservierten Proteinkomplexes, der für die Entstehung und Aufrechterhaltung der apikobasalen Polarität in Epithelzellen eine wichtige Rolle spielt und in der Netzhaut für die speziellen Zellverbindungen zwischen Müller-Gliazellen und Photorezeptoren in der externen limitierenden Membran essentiell ist. Mutationen, die zu Störungen in der Funktion dieses Proteinkomplexes führen, verursachen retinale Defekte bei Mensch (z.B. Retinitis Pigmentosa, Lebersche kongenitale Amaurose), Maus, Zebrafisch und Fruchtfliege. Die PDZ-Domäne von MPP5 bindet an den C-Terminus der CRB-Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung einer Punktmutation in der PDZ-Domäne von MPP5 (V301N), funktionell untersucht. Diese hat im Zebrafisch eine fehlende Photorezeptoradhäsion und die Zerstörung der retinalen Architektur zur Folge. Es wurde gezeigt, dass die V301N-Mutation die Interaktion zwischen MPP5 und den drei CRB-Isoformen verhindert. Außerdem führt sie zu einer Fehllokalisierung von heterolog exprimiertem MPP5V301N in MDCK-Zellen, die zudem einen erhöhten transepithelialen Widerstand aufweisen. Über quantitative real-time PCR wurde in diesen Zellen eine verminderte Genexpression von Untereinheiten des apikalen epithelialen Natriumkanals ENaC und der basolateralen Na+/K+-ATPase festgestellt, was die Ursache für einen verminderten Ionenfluss durch die Zellschicht darstellen könnte. Somit übt heterolog exprimiertes MPP5V301N in MDCK-Zellen einen dominanten Effekt aus, der möglicherweise über einen Einfluss auf die Genregulation bestimmter Proteine vermittelt wird. Zur Untersuchung welche Auswirkungen die MPP5V301N-Mutation in vivo hat, wurde eine MPP5V301N-knock-in-Mauslinie generiert. Die bisherige Charakterisierung der Mäuse zeigte bei heterozygoten Tieren keinen äußerlich erkennbaren Phänotyp, wohingegen homozygote Mäuse nicht lebensfähig waren. Vermutlich führt das Vorkommen beider mutanter Allele in frühen embryonalen Stadien zum Abstoßen der Embryos. Das Mausmodell bietet die Basis für weitere Untersuchungen über die molekularen Konsequenzen einer Expression von MPP5V301N in der Netzhaut und anderen Geweben und wird Beiträge zur Aufklärung von Entstehungsmechanismen CRB1-MPP5-assoziierter Netzhauterkrankungen liefern. N2 - The objects of the present study were the retina specific membrane palmitoylated protein 4 (MPP4) and the ubiquitous expressed MPP5 protein which belong to the large family of the membrane-associated guanylate kinase homologs (MAGUKs). Both proteins have important organizational functions as adaptor proteins in the retina. MPP4 is involved in the assembly of presynaptic protein complexes in the photoreceptor synapses. The absence of MPP4 in mice leads to the loss of several presynaptic proteins from the ribbon synapse indicating an important role for MPP4 in organizing this complex. This work was aimed to identify new components of this multiprotein complex by establishing a proteomic approach. More precisely, the MPP4-associated protein complex was isolated with immunoaffinity chromatography from bovine retinal protein extracts followed by two-dimensional electrophoresis and analysis of the resulting protein spots by mass spectrometry. This analysis identified 18 co-precipitated proteins. Among these molecules the known interacting partner Veli3 and the MAGUK protein PSD95 were detected. For the latter, a selective association between MPP4 and the PSD95-β isoform was demonstrated showing specific heterodimerization of their N-terminal L27 domains. Additionally independent binding assays verified the association of MPP4 with recoverin and Hsc70. These interactions seem to be indirect and are presumably mediated by retina specific proteins in vivo. In summary, these findings support a protruding role for MPP4 as scaffolding protein for the organization of a protein complex of the photoreceptor synapses, which is involved in the regulation of Ca2+ homeostasis within the presynaptic terminals and eventually plays a role in synaptic vesicle exocytosis. The remaining co-precipitated proteins represented cytoskeletal constituents and components of different pathways and were probably unspecific contaminants. The MPP5 protein, a member of the evolutionarily conserved CRB protein complex, plays an important role in establishing and maintaining the apicobasal polarity of epithelial cells. Furthermore, this complex is essential for specific cell junctions between Müller glia cells and photoreceptors in the outer limiting membrane of the retina. Mutations that disrupt the function of this protein complex were reported to cause retinal defects in human (e.g. retinitis pigmentosa, Leber’s congenital amaurosis), mouse, zebrafish and fruit fly. The PDZ domain of MPP5 binds to the C-terminus of the CRB proteins. The present study aimed to analyze the consequences of a point mutation within the PDZ domain of MPP5 (V301N). In zebrafish, this mutation resulted in the loss of photoreceptor adhesion and in the disruption of retinal layers. It was demonstrated that the V301N mutation prevents the interaction between MPP5 and the three CRB isoforms. Additionally, heterologously expressed MPP5V301N mislocalizes in MDCK cells which furthermore develop an increased transepithelial resistance. Quantitative real-time PCR revealed decreased gene expression levels for subunits of the apical epithelial sodium channel (ENaC) and the basolateral Na+/K+-ATPase, supposedly causing the reduced ion movement through the cell layer. Thus, heterologously expressed MPP5V301N apparently has a dominant effect in MDCK cells which might be mediated by an influence on the gene expression of other yet unknown proteins. To further elucidate the MPP5V301N mutation in vivo, a knock in mouse line was generated. So far the characterization of these mice revealed no apparent phenotype for heterozygous animals, whereas homozygous mice were not viable. The presence of both mutant alleles presumably results in a rejection at early embryonic stages. The mouse model provides the basis to further analyze molecular consequences of MPP5V301N expression in the retina and other tissues and will contribute to enlighten the development of CRB1-MPP5-associated retinal diseases. KW - Netzhaut KW - Multiproteinkomplex KW - Domäne KW - Ribbon-Synapse KW - Proteomanalyse KW - MPP4 KW - PSD95 KW - MPP5 KW - ENaC KW - Na-K-ATPase KW - photoreceptor synapse KW - proteomic approach KW - multi protein complex KW - retina KW - PDZ domain Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37269 ER - TY - THES A1 - Flunkert, Julia T1 - Analyse genetischer Stabilität in den Nachkommen bestrahlter Zellen mittels klassischer Chromosomenbänderung und verschiedener Hochdurchsatz-Techniken T1 - Analysis of genetic stability in the clonal descendants of irradiated cells using conventional chromosome banding and various high-throughput methods N2 - Ionisierende Strahlung (IR) ist in der medizinischen Diagnostik und in der Tumortherapie von zentraler Bedeutung, kann aber Genominstabilität und Krebs auslösen. Strahleninduzierte Genominstabilität (RIGI) ist in den klonalen Nachkommen bestrahlter Zellen zu beobachten, die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch unverstanden. Zur Erforschung von verzögerten Strahleneffekten wurden primäre embryonale Fibroblastenkulturen mit 2 Gray bestrahlt und für 20 Populationsverdopplungen klonal expandiert. Zellen, die keiner Strahlung ausgesetzt waren, dienten als Kontrolle für normale Alterungsprozesse. Die Klone wurden durch klassische Chromosomenbänderungstechniken analysiert und in Abhängigkeit der Stabilität ihres Genoms in Gruppen eingeteilt. Ein Klon wurde als stabil gewertet, wenn die analysierten Metaphasen keinerlei Auffälligkeiten zeigten, während instabile Klone ein Mosaik aus normalen und abnormalen Metaphasen waren. Die Zellen von zwei Spendern wurden untersucht, um interindividuelle Strahleneffekte zu beurteilen. Nach Bestrahlung hatten mehr als die Hälfte der Klone Metaphasen mit strukturellen Aberrationen und wurden dementsprechend als instabil eingestuft. Drei Klone zeigten zudem numerische Aberrationen, die ausschließlich das Y Chromosom betrafen. Fluoreszenz in situ Hybridisierungen verifizierten diese Beobachtung in weiteren Klonen und deuteten an, dass der Verlust des Y Chromosoms mit RIGI assoziiert ist. Molekulare Karyotypisierungen mit SNP Arrays ergaben, dass IR in den Klonen Veränderungen der Kopienzahl auslöst. Ein Unterschied zwischen chromosomal stabilen und instabilen Klonen konnte jedoch nicht detektiert werden. Chromosomale Regionen, in denen sich bekanntermaßen fragile Stellen befinden, zeigten eine Anhäufung von CNVs. Ein RIGI Effekt konnte für die fragile Stelle 3B, in der sich das Gen FHIT befindet, identifiziert werden. Exom Sequenzierungen von Klonen und der entsprechenden Massenkultur zeigten eine alterungsassoziierte Entstehung von Varianten. Der Effekt wurde durch die Einwirkung von Strahlung erhöht. Auf Ebene von einzelnen Nukleotiden konnten ebenfalls Anhäufungen von Schäden in bestimmten genomischen Bereichen detektiert werden, dieser Effekt ging ohne die typischen RIGI Endpunkte einher. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass strahlenbedingte Veränderungen auf verschiedenen Ebenen (Chromosomen, Genkopienzahl und einzelnen Nukleotiden) beobachtet werden können, welche, unabhängig von RIGI, die Tumorentstehung begünstigen. Speziell Veränderungen im FRA3B Lokus und der Verlust des Y Chromosoms scheinen jedoch über die Destabilisierung des Genoms zur Krebsentstehung beizutragen. N2 - Ionizing radiation is important in medical diagnosis and cancer treatment but can lead to genomic instability and secondary malignancies as a late effect. Radiation induced genomic instability (RIGI) can be observed in the progeny of irradiated cells but the underlying cellular processes remain to be elucidated. To study delayed genetic radiation effects, single cell fibroblast clones from two different male donors were established after a single X ray dose of 2 Gray. Non irradiated cells were used as controls to account for aging related effects. Clones were characterized using chromosome banding analysis. Stable clones were endowed with no karyotype abnormalities in all analysed metaphases after 20 Population doublings, whereas unstable clones showed both normal and abnormal metaphases. Two fibroblast strains were used to detect differences in radiation sensitivity. More than half of the irradiated clones were chromosomally abnormal and thus classified as unstable. Both banding analysis and fluorescence in situ hybridization revealed an increased rate of Y chromosome loss in irradiated clones which might be associated with RIGI. Using SNP Arrays, an increased rate of de novo copy number variations (CNVs) was detected in the progeny of irradiated cells when compared to non irradiated controls. However, a significant difference between chromosomally stable and unstable clones was not found. CNVs clustered in chromosomal regions that are associated with known fragile sites. The fragile site 3B, which encompasses the gene FHIT, was found to be affected by CNVs in unstable clones suggesting a RIGI related effect. Exome sequencing of clones and the respective primary cultures revealed an increased rate of variants during in vitro aging. This effect was further increased by radiation exposure. Analysis of single nucleotides showed a RIGI independent accumulation of damage in specific regions. The results of the present study show that radiation induced changes can manifest as chromosomal abnormalities, copy number variations and DNA sequence mutations promoting tumorigenesis independent from RIGI. However, changes in FRA3B and loss of Y chromosome might trigger cancer through destabilizing the genome. KW - Ionisierende Strahlung KW - High throughput screening KW - Instabilität KW - Strahleninduzierte Genominstabilität KW - Genom KW - Genetik Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173670 ER - TY - THES A1 - Fadl El Mola, Faisal Mohamed T1 - Bioinformatic and molecular approaches for the analysis of the retinal pigment epithelium (RPE) transcriptome N2 - There is substantial interest in the identification of genes underlying susceptibility to complex human diseases because of the potential utility of such genes in disease prediction and therapy. The complex age-related macular degeneration (AMD) is a prevalent cause of legal blindness in industrialized countries and predominantly affects the elderly population over 75 years of age. Although vision loss in AMD results from photoreceptor cell death in the central retina, the initial pathogenesis likely involves processes in the retinal pigment epithelium (RPE) (Liang and Godley, 2003). The goal of the current study was to identify and characterize genes specifically or abundantly expressed in the RPE in order to determine more comprehensively the transcriptome of the RPE. In addition, our aim was to assess the role of these genes in AMD pathogenesis. Towards this end, a bovine cDNA library enriched for RPE transcripts was constructed in-house using a PCR-based suppression subtractive hybridization (SSH) technique (Diatchenko et al., 1996, 1999), which normalizes for sequence abundance and achieves high enrichment for differentially expressed genes. CAP3 (Huang and Madan, 1999) was used to assemble the high quality sequences of all the 2379 ESTs into clusters or singletons. 1.2% of the 2379 RPE-ESTs contains vector sequences and was excluded from further analysis. 5% of the RPE-ESTs showed homology to multipe chromosomes and were not included in further assembly process. The rest of the ESTs (2245) were assembled into 175 contigs and 509 singletons, which revealed approximately 684 unique genes in the dataset. Out of the 684, 343 bovine RPE transcripts did not align to their human orthologues. A large fraction of clones were shown to include a considerable 3´untranslated regions of the gene that are not conserved between bovine and human. It is the coding regions that can be conserved between bovine and human and not the 3’ UTR (Sharma et al., 2002). Therefore, more sequencing from the cDNA library with reclustering of those 343 ESTs together with continuous blasting might reveal their human orthologoues. To handle the large volume of data that the RPE cDNA library project has generated a highly efficient and user-friendly RDBMS was designed. Using RDBMS data storage can be managed efficiently and flexibly. The RDBMS allows displaying the results in query-based form and report format with additional annotations, links and search functions. Out of the 341 known and predicted genes identified in this study, 2 were further analyzed. The RPE or/and retina specificity of these two clones were further confirmed by RT-PCR analysis in adult human tissues. Construction of a single nucleotide polymphism (SNP) map was initiated as a first step in future case/control association studies. SNP genotyping was carried out for one of these two clones (RPE01-D2, now known as RDH12). 12 SNPs were identified from direct sequencing of the 23.4-kb region, of which 5 are of high frequency. In a next step, comparison of allele frequencies between AMD patients and healthy controls is required. Completion of the expression analysis for other predicted genes identified during this study is in progress using real time RT-PCR and will provide additional candidate genes for further analyses. This study is expected to contribute to our understanding of the genetic basis of RPE function and to clarify the role of the RPE-expressed genes in the predisposition to AMD. It may also help reveal the mechanisms and pathways that are involved in the development of AMD or other retinal dystrophies. N2 - Es besteht ein grosses medizinisches Interesse an der Identifizierung von Genen, welche an der Entstehung komplexer, häufiger Krankheiten des Menschen beteiligt sind. Eine solche Krankheit ist die alters-korrelierte Makuladegeneration (AMD). Die AMD ist eine der häufigsten Ursachen für den Verlust der Sehfähigkeit im Alter von über 75 Jahren. Obwohl die Erblindung bei der AMD letztlich durch das Absterben von Photorezeptor-Zellen in der zentralen Retina bedingt wird, gibt es genügend Hinweise dafür, dass die Pathogenese der AMD ihren Ausgang vom retinalen Pigmentepithel (RPE) nimmt (Liang and Godley, 2003). Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung von RPE-spezifischen Genen als Beitrag zur umfassenden Charakterisierung des RPE-Transkriptoms. Darüberhinaus war es Ziel der Arbeit, die mögliche Rolle der RPE-spezifischen Gene bei der Entstehung der AMD zu explorieren. Ausgangspunkt der Arbeit war eine RPE-spezifische, bovine cDNA Bibliothek, welche in der Arbeitsgruppe auf der Grundlage der SSH-Technik (Diatchenko et al, 1996, 1999) hergestellt worden war. Die SSH-Technik gestattet die Anreicherung von differentiell exprimierten Genen bei gleichzeitiger Normalisierung redundanter Sequenzen. Mit Hilfe des Software-Programms CAP3 (Huang and Madan, 1999) wurden insgesamt 2379 ESTs gruppiert und geordnet. 1,2% der 2379 RPE-ESTs enthielten Vektor Sequenzen und wurden daher von der weiteren Analyse ausgeschlossen. 5% der RPE-ESTs wiesen Homologien zu multiplen Chromosomen auf und wurden daher ebenfalls von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Die übrigen 2245 ESTs wurden in 175 Contigs und 509 Singletons gruppiert, woraus sich Hinweise auf insgesamt 684 putative Einzelgene ergaben. 343 dieser 684 Klone zeigten jedoch keine Homologien zu humanen orthologen Sequenzen. Ursache für die fehlende Homologie muss in der grossen Zahl der Klone gesehen werden, bei welchen nur die 3´untranslatierten verglichen wurden. Im Gegensatz zu den kodierenden Sequenzabschnitten kommt es in den nicht-kodierenden Regionen in der Regel zu einer relativ raschen evolutionären Divergenz und damit zum Verlust der Homologie (Sharma et al, 2002). Durch zusätzliche Sequenzierung und Sequenzvergleiche der kodierenden Bereiche dieser 343 Klone lassen sich möglicherweise weitere RPE-spezifische Gene finden. Um die grosse Anzahl der im Rahmen des RPE-Projektes generierten Daten bearbeiten zu können wurde eine sehr effiziente und Benutzer-freundliche Datenbank auf Grundlage des RDBMS-Moduls etabliert. Dieses System gestattet die interaktive Bearbeitung der gespeicherten Daten im Query-Format. Darüberhinaus können die Daten in beliebiger Weise annotiert und verbunden werden. Nach Abzug der 343 nicht-homologen cDNA Klone von den 684 putativen Einzelsequenzen verblieben 341 Kandidaten-Sequenzen. 2 dieser Sequenzen wurden als putative neue RPE-spezifische Gene einer weiteren Analyse zugeführt. Dabei wurde zunächst die RPE- bzw. Retina-Spezifität dieser Kandidaten-Sequenzen mit Hilfe der RT-PCR Analyse bestätigt. Als Basis für zukünftige Fall-Kontroll- und Assoziationsstudien wurde eine SNP-Genotypisierung eines dieser zwei Klone (ursprüngliche Bezeichnung: RPE01-D2; derzeitige Bezeichnung: RDH12) durchgeführt. Die direkte Sequenzanalyse umfasste 23.4 kb und ergab insgesamt 12 SNPs, von denen sich 5 als hoch-informativ erwiesen. Auf dieser Grundlage können zukünftig Allel-Frequenzen zwischen Kontrollpersonen und AMD-Patienten ermittelt und verglichen werden. Zukünftig werden darüberhinaus real-time PCR Methoden zur Expressionsanalyse der verbliebenen Kandidaten-Klone eingesetzt. Zusammenfassend liefert die vorliegende Arbeit einen Beitrag zum Verständnis der genetischen Grundlagen der RPE-Funktionen und trägt zur Aufklärung der Rolle von RPE-spezifischen Genen bei der Disposition zur AMD bei. Zusätzlich ergaben sich Hinweise auf Kandidatengene, welche möglicherweise in der Pathogenese der AMD eine Rolle spielen. KW - Senile Makuladegeneration KW - Netzhaut KW - Pigmentepithel KW - Molekulargenetik KW - RPE KW - Bioinformatics KW - Age-related macular degeneration KW - Molecular approaches Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6877 ER - TY - THES A1 - Fach, Cornelia T1 - Selektive Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung eines hypermutablen Bereiches des Fanconi-Anämie-A (FANCA)-Gens aus Fibroblasten-Kulturen unterschiedlicher Passagen und Genotypen T1 - Selective amplification, cloning and sequencing of a hypermutable region of the Fanconi anemia A (FANCA) gene from fibroblast cultures of different passages and types of genes N2 - Fanconi-Anämie gehört zu den Chromosomenbruch-Syndromen und zeichnet sich durch eine genomische Instabilität aus. Die genomische Instabilität ist auch Ursache häufiger Rückmutationen. Solche kommen vermehrt in Genabschnitten hoher Sequenzvariabilität vor. Insbesondere gilt dies für das Exon 10 des FANCA-Gens. Dieser Abschnitt des Gens wurde herausgesucht, da dieser als hypermutabler Bereich in der Literatur beschrieben ist. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Sequenzen des Exon 10 somatische Instabilität aufweisen. Hierzu wurden Fibroblasten eines Patienten und entsprechende Kontrollen in der Zellkultur seriell passagiert und gealtert. Im Zuge der Zellalterung konnte gezeigt werden, dass sich die Wachstumsrate verringerte. Die Zellen, die mit MMC behandelt wurden, stellten das Wachstum nach 1-2 Zellpassagen ein. Der Sequenzabschnitt aus FANCA wurde aus isolierter DNA der Zellen amplifiziert und im PCR-TOPO TA kloniert. Die erhaltenen Klone wurden sequenziert. Die Sequenzanalysen ergaben als häufigste Basensubstitution einen T nach C Austausch oder revers komplementär einen Austausch von A nach G. Dies wird als Artefakt interpretiert. Vermutliche Ursache ist die relativ hohe Fehlerrate der Taq-Polymerase. Für die Amplifizierung des Genomabschnittes aus dem FANCA-Gen sollte eine Polymerase verwendet werden, die eine höhere Genauigkeit als die Taq-Polymerase aufweist, wie z. B. die Pfu-Polymerase. N2 - Fanconi anemia belongs to the chromosome breakage syndromes and is characterised by a spontaneous chromosomal instability. This instability is also a cause of frequent back mutations. Such are increased in gene sections of high sequence variability. In particular this applies to the Exon 10 of the FANCA gene. This section of the gene was picked out, because this is described as hypermutable range in the literature. In this work it should be investigated if sequences of the Exon 10 show somatic instability. For this fibroblasts of a patient and appropriate controls in the cell culture were serially divided and aged. Because of the cell aging it could be shown that the growth rate was reduced. The cells, which were treated with MMC, stopped growth after 1-2 cell passages. The segment of the FANCA sequence was amplified from isolated DNA of the cells and cloned in the PCR TOPO TA. The received clones were made sequences. The sequence analyses resulted as the most frequent substitution a T to C exchange or revers complementary an exchange from A to G. This is interpreted as artifact. A supposed cause is the relatively high error rate of the Taq polymerase. For the amplification of the segment of the FANCA gene a polymerase should be used, which has a higher accuracy than the Taq polymerase, e.g. the Pfu polymerase. KW - Fanconi Anämie A KW - Zellkultur KW - PCR KW - Mutation KW - Hypermutabilität KW - Fanconi anemia A KW - cell culture KW - PCR KW - mutation KW - hypermutable Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10464 ER - TY - THES A1 - Ernst, Simon Jonas T1 - Serum-Creatin-Kinase Spiegel von Konduktorinnen der Duchenneschen und Beckerschen Muskeldystrophie unter besonderer Berücksichtigung einer Schwangerschaft T1 - Creatine Kinase levels in female carriers of Duchenne and Becker muscular dystrophy with particular reference to pregnancy N2 - Diese Arbeit analysiert die Serum-Creatin-Kinase Spiegel von Konduktorinnen der Duchenneschen und Beckerschen Muskeldystrophie. Besonderes Augenmerk dieser Arbeit liegt auf den CK-Werten von schwangeren Konduktorinnen für die Muskeldystrophie Duchenne und Becker. Es werden Unterschiede im CK-Wert zwischen Schwangeren und nicht Schwangeren aufgezeigt. Die Berechnung der Odds-Ratio für die Gruppen der schwangeren Frauen soll es ermöglichen, auch nach bereits eingetretener Schwangerschaft, eine möglichst genaue Ermittlung des Carrierstatus durchzuführen. Die CK-Werte wurden auch für nicht schwangere Frauen reevaluiert. Es wurden retrospektiv über einen Zeitraum von 7 Jahren Daten für die CK-Werte von Frauen gesammelt und ausgewertet, bei denen es innerhalb der Familie zu Fällen von Beckerscher oder Duchennescher Muskeldystrophie kam. Die Bestimmung der Serum Creatin-Kinase erfolgte nach der von der IFCC empfohlenen Methode bei 37 °C. Die Auswertung der Daten erfolgte nach folgenden Kriterien. Es wurden folgende Gruppen gebildet: Muskeldystrophie Duchenne, Muskeldystrophie Becker und Kontrollen. Innerhalb dieser Gruppen wurden zwei Altersgruppen gebildet. Die Altersgrenze lag bei 16 Jahren. Schwangere Frauen wurden getrennt von Frauen bei denen keine Schwangerschaft bestand analysiert. Die gewonnenen Daten wurden nach folgenden Gesichtspunkten ausgewertet: Die CK-Werte wurden logarithmiert, um einer Normalverteilung zu entsprechen. Die logarithmierten Creatin-Kinase Werte aller Gruppen waren normalverteilt. Die Verteilung der Daten innerhalb der relevanten Gruppen unterschied sich signifikant voneinander. Die Anzahl der ausgewerteten CK-Werte für die Gruppe der schwangeren BMD Überträgerinnen war deutlich zu klein. Es wurde der Mindestumfang für diese Gruppe ermittelt, um in zukünftigen Analysen signifikante Ergebnisse zu erhalten. Für die Gruppe der nicht schwangeren Überträgerinnen für die Duchennesche Muskeldystrophie bestand ein signifikanter Zusammenhang zwischen Alter und CK-Wert. Es konnte eine Regressionsgerade bestimmt werden und anhand dieser eine Alterskorrektur durchgeführt werden. Die Odds Ratio, die anhand des CK-Werts einer Frau errechnet wird, ist ein Element für die individuelle Risikoberechnung. Es ließ sich anhand der statistischen Kennwerte, Mittelwert µ und Standardabweichung σ, der einzelnen Gruppen Formeln zur Berechnung der Odds Ratio herleiten. Abschließend erfolgte die Berechnung der Sensitivität und Spezifität der CK-Wert Bestimmung. N2 - Creatine Kinase levels in female carriers of Duchenne and Becker muscular dystrophy with particular reference to pregnancy KW - Becker-Kiener-Syndrom KW - Duchenne-Syndrom KW - DMD KW - BMD KW - genetische Beratung KW - Schwangerschaft KW - Creatin Kinase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107469 ER - TY - THES A1 - Engel, Jakob T1 - Untersuchung der Korrelation von Genotyp und Phänotyp bei der Hypophosphatasie T1 - Investigation of the correlation of genotype and phenotype in hypophosphatasia N2 - Die Arbeit zeigt, dass die Symptome der HPP sehr variabel und unterschiedlich stark auftreten können. Dies erschwert die klinische Diagnosestellung der Erkrankung. Nahezu alle Patienten berichteten von starken Knochen-, Gelenk,- und Muskelschmerzen, von Karies und Parodontose sowie von vermehrten Frakturen, die zum Teil weitere chronische Schmerzen und Wiederholungsfrakturen erzeugen. Eine deutlich verminderte Leistungsfähigkeit im Vergleich zu Gleichaltrigen wurde ebenso häufig angegeben. Es konnte keine eindeutige Phänotyp -  Genotyp Korrelation gefunden werden, allerdings geben die Daten einen deutlichen Hinweis, dass Patienten mit zwei Mutationen am stärksten symptomatisch betroffen sind. Ebenfalls konnten keine Unterschiede zwischen dominant negativen Mutationen und nicht dominant negativen Mutationen gefunden werden. N2 - The work shows that the symptoms of HPP can be very variable and vary greatly. Almost all patients reported severe bone, joint, and muscle pain, caries and periodontal disease, as well as increased fractures, some of which produced further chronic pain and recurrent fractures. Significantly reduced performance compared to peers was also reported frequently. No definite phenotype - genotype correlation could be found, but the data provide a clear indication that patients with two mutations are most symptomatically affected. Also, no differences between dominant negative mutations and non-dominant negative mutations could be found. KW - Hypophosphatasie KW - Korrelation KW - Genotyp KW - Phänotyp Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-181751 ER - TY - THES A1 - Endt, Daniela T1 - Fanconi Anämie : Entwicklung von hämatopoetischen Mosaiken sowie funktionelle Studien von FANCO (RAD51C) und FANCN (PALB2) T1 - Fanconi Anämie : Development of hematopoetic mosaicism and functional studies of FANCO (RAD51C) and FANCN (PALB2) N2 - Zur Wahrung der Genomstabilität entwickelten sich verschiedene Reparaturmechanismen, deren Defekte zu diversen Erkrankungen führen. Der 1927 erstmals beschriebenen Fanconi Anämie (FA) (Fanconi 1927) liegt eine fehlerhafte Reparatur der DNA-Doppelstrang-Quervernetzung zugrunde. Als Ursache wurden Defekte innerhalb des FA/BRCA-Weges lokalisiert, welche zur Chromosomeninstabilität führen. Das Krankheitsbild der autosomal rezessiven oder X-chromosomalen Erkrankung wird meist von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarkversagen sowie bereits im jugendlichen Alter erhöhten Tumor-raten und Anämien geprägt. Bisher wurden Defekte in 19 verschiedenen Genen als ursächlich für diese Erkrankung diskutiert. Anhand des betroffenen Gens können nur begrenzt Rückschlüsse auf die Ausprä-gung des Phänotyps geschlossen werden, vielmehr scheinen die Art der Mutation und deren Position im Gen mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Im Laufe der Zeit wurden immer mehr Patienten mit mild ausgeprägtem Erkrankungsbild beobachtet. Eine mögliche Erklärung hierfür liefern milde Mutationen, eine weitere das Vorhandensein von Mosaiken blutbildender Zellen. Zu letzterem führt die Reversion einer der beiden Mutationen. Diese Art der „natürlichen Gentherapie“ wurde bei 10-30% der FA-Patienten beobachtet. Um die Entwicklung von Reversionen besser zu verstehen, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit die Untersuchung verschiedener Zelllinien von 5 Patienten im Alter von 11 (Pat. 5) bis 33 (Pat. 4) Jahren. Die FA-A-Patienten 1 und 2 wurden bereits von Gross et al. 2002 als Mosaikpatienten beschrieben. Für die weiteren Patienten führten unterschiedliche Aspekte, wie normale Blutwerte, MMC-tolerante lympho-blastoide Zelllinien und gDNA-Analysen des Blutes zum Mosaikverdacht. Nähere Analysen bestätigten für die FA-D2-Patienten (Pat. 4, 5) ebenfalls das Vorliegen einer Reversion in den Blutzellen. Allen Patienten gemein war die Reversion in Form einer Rückmutation (Pat. 1: c.971T>G, Pat. 2: c.856 C>T, Pat. 4: c.3467-2A>G, Pat. 5: c.3707G>A), welche meist in einem oder in der Nähe eines Mutationsmotives vorlag. Zur Einschätzung des Mosaikstatus in den Patientenblutzellen wurden, neben der meist mehrjährigen Be-obachtung der Blutwerte (Thrombo-, Mono-, Granulo-, Lymphozyten, Hämoglobin), gDNA-, Chromoso-menbruch- und Zellzyklusanalysen durchgeführt. Chromosomenbruchanalysen von Metaphasen der T-Lymphozyten der Patienten 4 und 5 zeigten nach MMC-Behandlung die mosaik-typische bimodale Vertei-lung der Chromosomenbruchraten. Die nur moderat erhöhten Bruchraten in Metaphasen des Patienten 1 sprachen für eine starke Reversion. Zur besseren Abschätzung des Mosaikstatus wurden Zellzyklusanaly-sen an Mischungsreihen aus FA- und nicht FA- Blut durchgeführt. Die Detektionsgrenze für FA-Mosaike lag bei einem Anteil von 30% Zellen mit spontanem/MMC-induziertem G2-Phasen-Arrest. In Anlehnung an Mischungskurven wurden für die vier Patienten Reversionen von 0% (Pat. 4) bis 90-95% (Pat. 2) ange-nommen. Die gDNA-Analyse MACS-sortierter T-/B-Lympho-, Mono- und Granulozyten sowie von Fib-roblasten und lymphoblastoiden Zelllinien ermöglichte einen detaillierten Einblick in die Mosaikstatus auf molekularer Ebene. Wir fanden bei allen Patienten einen unterschiedlich stark ausgeprägten Mosaikstatus ihrer Blutzellreihen. Tendenziell scheinen die Reversionsgrade mit der Zell-Lebensdauer korrelieren, hier-bei zeigen kurzlebige Zellen (Mono-, Granulo-, B-Lymphozyten) höhere Reversionsgrade als langlebige T-Lymphozyten. Das Auftreten von gleichen Reversionen in allen Zelllinien lässt eine Reversion in einer gemeinsamen Vorläuferzelle vermuten. Als Besonderheit fanden wir, unseren Erachtens erstmalig, eine komplette Reversion einer Knochenmark-Fibroblastenzelllinie (Pat. 1). Häufig in Kultur stattfindende Re-versionen in lymphoblastoiden Zelllinien beobachteten wir für alle vier Patienten. Die Mosaikentstehung im Patientenblut konnte mit allen Methoden bestätigt werden. Jede Methode wies Vor- und Nachteile auf. Zur Abschätzung der Mosaikstatus empfiehlt sich deshalb eine Kombination der Methoden. Ein weiteres Projekt beschäftigte sich mit Interaktionen des FANCO (RAD51C) innerhalb der RAD51 Paraloge (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) und mit RAD51. Die Analysen erfolgten im Mammalian Two- und Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Die Untersuchungen bestätigten die meisten der bisher detektierten Interaktionen, welche zur Ausbildung des RAD51C-XRCC3 Komplexes und des, aus den Subkomplexen RAD51B-RAD51C (BC) und RAD51D-XRCC2 (DX2) bestehenden, BCDX2-Komplex führen. Die M3H-Analysen weisen auf eine wichtige Rolle des RAD51B-Proteins bei der Ausprägung dieses Komplexes hin. Es scheint die Ausbildung der RAD51C-RAD51D-Interaktion erst zu ermöglichen und zusätzlich, anders als bisher beobachtet, auch mit XRCC2 zu interagieren. Diese Interaktion wiederum wird durch die Anwesenheit von RAD51D stark gefördert. Unsere M2H-/M3H-Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Ausbildung der Subkomplexe für die Entstehung des BDCX2-Komplexes wichtig ist und dieser vermutlich als Ringstruktur vorliegt. Zusätzlich fanden wir Hinweise auf mögliche Wechselwir-kungen zwischen den BCDX2- und den XRCC3-Komplexproteinen. Aufgrund der Beteiligung der Protei-ne an der Doppelstrangläsionsreparatur wurde die Auswirkung von MMC-induzierten DNA-Schäden un-tersucht. Diese führten innerhalb der Subkomplexe zu gegensätzlichen Änderungen der Interaktionsinten-sität. Während die Substanz im DX2-Komplex zum Sinken der Interaktionsstärke führte, erhöhte sich diese im BC-Komplex. Die in der Literatur beschriebene und charakterisierte RAD51C-FANCN-Interation war im M2H-Test nicht darstellbar. Möglicherweise würde diese jedoch durch die Anwesenheit eines drit-ten Proteins gefördert werden. Zusätzlich wurde ein RAD51C-Protein, welches die Patientenmutation R258H enthielt, überprüft. Es zeigte nur in der M3H-Analyse, mit pMRAD51D und nativem RAD51B, nach Behandlung mit MMC eine reduzierte Interaktionsstärke im Vergleich zum Wildtyp. Dies unter-streicht einmal mehr die als hypomorph beschriebene Mutation des Proteins. Das dritte Projekt, die angestrebte Strukturaufklärung des RAD51C-Proteins erwies sich als schwierig. Eine für eine Kristallisation ausreichende Proteinmenge konnte, weder im E. coli-System noch in Insektenzellen oder in Co-Expression mit seinem Interaktionspartner XRCC3, isoliert und aufgereinigt werden. Elektro-phoretische Mobility Shift Assays des CX3-Proteinkomplexes mit DNA-Strukturen (ssDNA, Open Fork, 3‘-/ 5‘-Überhang-Struktur), zeigten eine Bevorzugung des 3‘-Überhang-DNA-Substrates. Diese Art der Analyse könnte in weiterführenden Analysen zur Abschätzung der Auswirkung von Patientenmutationen herangezogen werden. bb N2 - For maintaining genomic stability several repair mechanisms have evolved. Defects in these mechanisms lead to diverse diseases. One of these Fanconi Anemia (FA), first described in 1927, evoked by deficient mechanism of interstrand crosslinks. As causative reason defects within the FA-BRCA pathway were iden-tified leading to chromosome instability. To date 19 different genes were found to cause Fanconi Anemia. Most commonly for the clinical picture of FA are congenital malformations, progressive bone marrow defects as like an increased tumor rates and anemia at a juvenile age. Knowing the affected gene only lim-ited conclusions could be considered of the phenotypical appearance. More likely the kind of mutation and the affected position within the gene seems to correlate with the severity of the disease. Over the time an elevated number of patients with mild phenotype were observed. One possible explanation may be mild mutations another a mosaic state developed within the blood forming cells. The latter was caused by rever-sion of one of both mutations. This kind of “natural gene therapy” was observed in the blood of 10 up to 30 % FA- patients. To get better insights in to the mosaic development we investigated different cell lines of five patients aged between 11 (pat. 5) and 33 (pat. 4) years. Both FA-A patients (pat. 1, 2) were described as mosaic patients before by Gross et al. 2002. The other patients arouse suspicion for developing mosai-cism by different aspects like normal blood counts, MMC tolerant lymphoblastiode cell lines and analyzing gDNA from blood. Detailed analyses confirmed the reversion of one mutation in blood of the FA-D2 patients (pat. 4, 5). In common for all four mosaic was the kind of reversion, a back mutation (pat. 1: c.971T>G, pat. 2: c.856 C>T, pat. 4: c.3467-2A>G, pat. 5: c.3707G>A) mostly in or near by a mutation motive. To get insights in to the mosaic state of the patients’ blood cells, gDNA, chromosomal breakage and cell cycle analyses were performed and blood cell counts of thrombo-, mono-, granulo-, lymphocytes and haemoglobin were observed for several years. Chromosomal breakage analyses of t-lymphocytes met-aphases (pat. 4, 5) treated with MMC showed a mosaicism typical bimodal distribution. The only moderate increased chromosomal breakage rate in metaphases of patient 1 points out a strong pronounced reversion. For better estimation of the Mosaic state in patient blood we performed cell cycle analysis with mixtures of FA- and non FA-blood. Thereby we observed the border for mosaic detection at a degree of 30 % cells with spontaneous /MMC induced G2-phase arrest. Compared to the mixing study reversion degrees of 0 % (pat. 4) up to 90-95 % (pat. 2) were assumed for four of the patients. At molecular base gDNA analyses of MACS sorted T-/ B- lympho, mono and granulocytes as well as from fibroblasts and lymphoblastoide cell lines allowed a more detailed insight in to the mosaic statuses. In all patients we observed different distinct of mosaic state in their blood cell lines. We observed a tendency of correlation between reversion degree and the longevity of blood cells – cells with short life spans (mono-, granulo-, B-lymphoytes) showed higher reversion degrees than log living T-lymphocytes. The fact that we detected the same rever-sion in the different cell lines of a patient suggests a reversion within a common precursor cell. Further we observed, as we know for the first time, a reversion within a bone marrow fibroblast line (pat. 1). Four of our patients showed commonly observed reversions in cultured lymphoblastoide cell lines. With each of the tested methods we could show mosaic development in blood of our patients. Every of them showed pros and cons. For this reason a combination of the different methods would be recommendable for cal-culation of the mosaic state in patient blood. The second project investigated the interactions of FANCO (RAD51C) within the group of the RAD51 paralogs (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) and with RAD51. Interactions were tested by Mammalian Two- and Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Our investigations confirm most of the up to now detected interactions leading to RAD51C-XRCC3-complex (CX3) and RAD51B-RAD51C-RAD51D-XRCC2 com-plex (BCDX2) formation – latter consisting of the subcomplexes RAD51B-RAD51C (BC) and RAD51D-XRCC2 (DX2). M3H analyses give a hint for the importance of the RAD51B protein for the BCDX2 complex formation. The protein seems to be necessary for RAD51C-RAD51D interaction and also to interact, other than intended before, with XRCC2. In turn this interaction seems to be strongly promoted by RAD51D. In M2H and M3H analyses we found evidence of the importance of subcomplex formation for the formation of the whole BCDX2 complex and that the complex may be a circular structure. Addi-tionaly we observed evidence for interdependency between the BCDX2- and the XRCC3- complex pro-teins. Because of the proteins involvement into the double strand lesion repair the effect of MMC induced DNA lesions were tested. MMC treatment leads to different changes of interaction within the subcom-plexes. We observed a decrease of interaction strength between RAD51D and XRCC2 and an increased interaction within the BC-complex. The interaction between RAD51C and FANCN was not detectable in our M2H assay but may be promoted by another protein in M3H analysis. Additionally we tested a RAD51C protein inherited the patient mutation R258H. Only in M3H analysis with pMRAD51D and native RAD51B and with additional MMC treatment reduced interaction strength was detectable compared to the wildtype RAD51C. This underlines the hypomorphic nature of the mutation described before. The third project – the elucidation of the RAD51C protein structure proved to be difficult. We could not isolate and purify enough protein for crystallization, neither by expression within a E.coli or an insect cell system not even by co-expression of the complex partner XRCC3. Electrophoretic mobility shift assays of the CX3 complex with different DNA-structures (ssDNA, open fork, 3’- and 5’- overhang structures) showed preference for the 3’-overhang DNA substrate. This method may be used for further investiga-tions of mutations in patient DNA in future. KW - Fanconi Anämie KW - Hämatopoese KW - Mosaik KW - Remission KW - Molekulargenetik KW - Fanconi Anämie KW - hämatopoetisches Mosaik KW - Reversion KW - RAD51C KW - FANCO Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127836 ER - TY - THES A1 - Endres, Karlheinz T1 - Zellzykluseffekte von Mitomycin C T1 - cellcycle effects of mitomycin C N2 - ZELLZYKLUSEFFEKTE VON MITOMYCIN C Im Rahmen dieser Arbeit sollten die durch Mitomycin C (MMC) exogen induzierten Zellzyklusstörungen mit den endogenen Störungen des Zellzyklus bei Fanconi-Anämie in unterschiedlichen Zellsystemen (periphere Blutlymphozyten, lymphoblastoide Zellen und Fibroblasten) verglichen werden. Die Zellzyklusanalysen wurden mit der zweidimensionalen Durchflusszytometrie nach dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren durchgeführt. Mit diesem Verfahren ist es möglich zwischen proliferierenden und nichtproliferierenden Zellen (Ellwart, Stunkel et al. 1981) zu unterscheiden und Verteilungen der Zellen in bis zu vier Zellzyklusphasen mit quantitativer Analyse der Populationen während der G0-G1-, G1-, S- und G2-Phasen zu erfassen (Kubbies 1989). Das Ausscheiden von Zellen aus dem Zellzyklus kann dabei über die Akkumulation in den entsprechenden Phasenanteilen des Zellzyklus erfasst werden. Die Induktion von Zellzyklusstörungen erfolgte mit dem bifunktionellen Alkylanz Mitomycin C. Die Applikation von Mitomycin C (MMC) führte dabei vor allem zu einer dosisabhängigen Zunahme der G2-Phasenanteile der Zellzyklen, was als Akkumulation von Zellen innerhalb dieses Kompartiments zu verstehen ist. Diese Akkumulation konnte bei den durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen mit der abgeleiteten Größe Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) proliferationsunabhängig erfasst werden. Die konzentrationsabhängige Zunahme der G2-Phasenakkumulation und die unterschiedliche Verteilung innerhalb der Zellzyklen wurden mit den beiden Parametern Increased S G2+G2`/GF und Increased S G2/GF festgehalten und ausgewertet. Die Untersuchungen mit peripheren Blutlymphozyten, lymphoblastoiden Zellen (B-LCL) und Fibroblasten von gesunden Kontrollpersonen zeigten, dass sich die durch Mitomycin C induzierten DNA-Schädigungen bei durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen vor allem als G2-Phasenakkumulation darstellen. Demgegenüber lagen die ermittelten Werte der S G2/GF von Fa-Individuen bereits bei Standardzellkulturen über denen der gesunden Versuchspersonen. Vor allem bei den Zellzyklusstudien mit peripheren Blutlymphozyten von Fanconi-Anämie Patienten zeigten sich bereits endogen eine massive Erhöhung der G2-Phasenanteile. Im Vergleich zu den untersuchten Kontrollen war die Mitomycin C induzierte Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen nicht beliebig steigerbar. Die untersuchten Zellsysteme zeigten verschiedene Proliferationsmuster und reagierten mit einer unterschiedlich starken Arretierung von Zellen in den G2-Phasen bei Zugabe von Mitomycin C. Als sensitivste Zellart reagierten subkutane menschliche Fibroblasten bei Applikation von Mitomycin C. Bei den durchgeführten Zellzyklusanalysen zeigte sich aber auch, dass bei hohen Konzentration von Mitomycin C (MMC) die zytoxischen Effekte von Mitomycin C überwiegen und es zu einem starken Rückgang des Zellwachstums kommt. Da die exogen induzierten Zellzyklusstörungen durch Mitomycin C bei gesunden Kontrollpersonen mit den typischen endogenen Störungen des Zellzyklus bei Fa-Individuen vergleichbar waren, kann als mögliche Ursache für Fanconi-Anämie auf einen DNA-Reparaturdefekt geschlossen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auch Zellen von obligat heterozygoten Fa-Individuen mit dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren untersucht. War bei Fa-homozygoten Patienten bereits endogen die Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen deutlich gegenüber den gesunden Kontrollpersonen erhöht, so konnte dies für Fa-heterozygote Individuen nicht gezeigt werden. Die ermittelten Werte der Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) lagen zwar dabei vor allem bei den untersuchten peripheren Blutlymphozyten und subkutanen Fibroblasten etwas über den Kontrollen. Mit den hier vorgelegten Daten aus den Zellzyklusanalysen war aber keine Unterscheidung zwischen den obligat heterozygoten Fa-Individuen und den gesunden Probanden möglich. Die Ergebnisse stehen dennoch im Einklang mit den zytogenetischen Untersuchungen auf erhöhte Chromosomenbruchraten bei Verdacht auf Fanconi-Anämie. N2 - CELL CYCLE EFFECT`S OF MITOMYCIN C With this work the exogen induced effects of mitomycin C were compared in different cell systems (human blood lymphocytes, lymphoblastoid cells and dermal fibroblasts) with the endogen existing cell cycle defects in Fanconi Anaemia. The cell cycle analysis were done via the BrdU/Hoechst flow cytometry. With this technique it is possible to detect and quantitate proliferating and non-proliferating fractions in the cell cycle (Ellwart, Stunkel et al. 1981). The method also allows to get information about the population of cells within the G0-G1-, G1-, S- and G2- phase (Kubbies 1989). The separation of cells during the cell cycle can be measured as an accumulation in the correspondent fraction. The induction of cell cycle arrest were done with the alkylating agent mitomycin C. After the application of mitomycin C cell cycle analysis showed an increase of the G2- phase, depending on the concentration of this agent. With the parameters sum of G2 / growth fraction (S G2/GF) and Increased S G2+G2`/GF and Increased S G2/GF the effects of mitomycin C were characterised. The cell cycle analysis with human blood lymphocytes, lymphoblastoid cells and dermal fibroblasts from healthy persons showed, that the damage induced by mitomycin C is like an accumulation of cells in the G2- phase. Already the studies with cells from Fanconi Anaemia patients without treatment of mitomycin C showed elevated values for the sum of G2 / growth fraction (S G2/GF). Over all the arrest of cells in the G2- phase were mainly seen with cell cultures from human blood lymphocytes. In relation to healthy persons the mitomycin C induced accumulation of cells in the G2- phase couldn’t intensify as will by a higher concentration of the alkylating agent. The cell cycle analysis with blood lymphocytes, lymphoblastoid cells and fibroblasts showed different cellular proliferation and arrest in the G2- phase under the treatment of mitomycin C. As the most sensitive react dermal fibroblasts under the treatment with mitomycin C. Also the result of the cell cycle analysis demonstrate that at high levels of mitomycin C the cytotoxic effects predominate and the cell proliferation decrease. In the respect that the exogen induced effects by mitomycin C can compared with the endogen cell cycle defects in Fanconi Anaemia it is possible that a deficient DNA repair caused Fanconi Anaemia. Furthermore with this work cells from FA- heterozygotes were analysed. The data of the cell cycle analysis showed that it is not possible to decide between a healthy persons and a FA- heterozygotes. But the results correspondent with the cytogenetic analysis of higher chromosomal breakage level in Fanconi Anaemia. KW - Zellzykluseffekte KW - Mitomycin C KW - Zellzyklus KW - G2 Phase KW - Fanconi Anämie KW - cellcycle effects KW - mitomycin c KW - cellcycle KW - g2 phase KW - Fanconi Anaemia Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12647 ER - TY - THES A1 - El Hajj, Nady T1 - Epimutations in Germ-Cell and Embryo Development: Possible Consequences for Assisted Reproduction T1 - Epimutationen in der Keimzell- und Embryonalentwicklung : Mögliche Konsequenzen für die assistierte Reproduktion N2 - Assisted reproductive technologies (ART) emerged in the late 1970’s as a therapy for human infertility. Up till now more than 3 million babies have been conceived through ART, demonstrating the safety and efficiency of the technique. Published reports showed an increase in the rate of imprinting disorders (Beckwith Wiedemann Syndrome, Angelman Syndrome, etc.) in babies born after ART. What are the effects imposed through ART and should researchers reassess its safety and implications on the future offspring? Throughout this thesis, I analyzed the methylation patterns of germ cells and embryos to determine whether in vitro maturation and in vitro fertilization have a negative impact on the epigenetic patterns. Furthermore, DNA methylation was compared between sperm of infertile and presumably fertile controls in order to understand whether epigenetic disturbances lead to infertility at the first place. The occurrence of methylation aberrations in germ cells of infertile patients could be transmitted to new-borns and then cause epigenetic disorders. In order to elucidate the imprinting status within single cells, I developed a new technique based on limiting dilution where bisulfite treated DNA is distributed across several wells before amplification. This allowed methylation measurement at the single allele level as well parent of origin detection. In a total of 141 sperm samples from couples undergoing in vitro fertilization (IVF) or intracytoplasmic sperm injection (ICSI) including 106 with male factor or combined infertility and 28 with female infertility, I detected a significant correlation between lower quality of semen parameters (sperm count, percentage of abnormal sperm, and percentage of motile sperm) and the rate of imprinting errors. ALU repeats displayed a higher methylation in sperm DNA of patients leading to a pregnancy and live birth, compared to patients in which pregnancy was not achieved or a spontaneous abortion occurred. A discriminant analysis based on ALU methylation allowed correct classification of >70% of cases. Preliminary data from illumina methylation arrays where more than 27,000 CpGs were analyzed determined that only a single CpG site from the open reading frame C14orf93 was significantly different between the infertile and presumably fertile control group. However, further improvements on data normalization might permit detection of other differentially methylated regions. Comparison of embryos after natural conception, in vitro fertilized embryos from superovulated oocytes, and embryos achieved through fertilization of in vitro cultured oocytes revealed no dramatic effect on the imprinting patterns of Igf2r, H19, and Snrpn. Oocyte cryotop vitrification did not result in a dramatic increase of imprinting mutations in oocytes even though the rate of sporadic methylation errors in single Snrpn CpGs were higher within the in-vitrified group. Collectively, the results I will present within this thesis suggest an increase in the rate of imprinting errors within the germ cells of infertile patients, in addition to a decrease in genome wide methylation of ALU repetitive elements. I did not observe a detrimental effect on the methylation patterns of oocytes and the resulting embryos using in vitro maturation of oocytes and/or standard IVF with in vivo grown superovulated oocytes. N2 - Assistierte Reproduktionstechniken (ART) wurden in den späten 1970er Jahren als Therapie für unfruchtbare Paare mit Kinderwunsch etabliert. Bis zum heutigen Tage wurden dank ART weltweit mehr als 3 Millionen Kinder geboren, ein eindrucksvoller Beweis für die Sicherheit und Effizienz dieser Methode. Dennoch zeigen veröffentlichte Studien einen Anstieg in der Rate von Imprinting-Erkrankungen (Beckwith Wiedemann-Syndrom, Angelman-Syndrom, etc.) bei Kindern, die nach assistierter Reproduktion geboren wurden. Es stellt sich die Frage, welche Effekte durch ART ausgelöst werden können und ob eine neue Einschätzung dieser Methode bezüglich ihrer gesundheitlichen Implikationen für künftige Generationen notwendig ist. In dieser Arbeit habe ich mögliche negative Effekte von in vitro-Maturation und -Fertili-sierung auf Methylierungsmuster humaner und muriner Keimzellen, sowie Maus-Embryonen untersucht. Aberrante DNA-Methylierungsmuster in Keimzellen von infertilen Patienten könnten auf die Neugeborenen übertragen werden und epigenetische Erkrankungen zur Folge haben. Ob epigenetische Störungen im Zusammenhang mit Infertilität stehen, wurde außerdem durch den Vergleich der DNA-Methylierung von Spermien infertiler und fertiler Männer untersucht. Um den Imprintigstatus auf Einzelzellebene zu bestimmen, habe ich basierend auf „Limiting Dilution“ eine neue Methode entwickelt. Bei diesem Verfahren wird Bisulfit-behandelte DNA vor der PCR-Amplifikation in mehrere Reaktionsgefässe verdünnt. Dies erlaubt die Methylierungsanalyse einzelner Allele und die Detektion elternspezifischer Methylierungsmuster. Mit insgesamt 141 Sperma-Proben von Paaren, die sich einer in vitro- Fertilisierung (IVF) oder einer Intrazytoplasmischen Spermieninjektion (ICSI) unterzogen hatten, davon 28 mit weiblicher und 106 mit männlicher oder kombinierter Unfruchtbarkeit, konnte ich einen positiven Zusammenhang zwischen der Rate an Imprinting-Fehlern und geringer Sperma-Qualität (gemessen an Standardparametern) ableiten. ALU-Sequenzen zeigten in Spermien-DNA von Patienten mit erfolgreicher Schwangerschaft und Geburt eine höhere Methylierung als von Patienten mit fehlgeschlagener Schwangerschaft oder Spontanabort. Eine auf der ALU-Methylierung basierende Diskriminanzanalyse konnte mehr als 70% aller Fälle korrekt klassifizieren. Vorläufige Daten aus Experimenten mit Illumina Methylierungs-Arrays mit einer Auflösung von mehr als 27.000 CpG-Positionen identifizierten einen signifikanten Gruppenunterschied zwischen Patienten- und Kontrollgruppe für eine CpG-Position innerhalb des offenen Leserahmens C14orf93. Verbesserungen der Datenauswertung (Normalisierung, Testung etc.) sollten die Entdeckung weiterer differenziell methylierter Regionen erlauben. Der Vergleich von Mausembryos aus natürlicher Konzeption, aus in vitro kultivierten und fertilisierten Oozyten und aus in vitro Fertilisation nach Superovulation zeigte keine dramatischen Effekte auf die Imprinting-Muster der geprägten Gene Igf2r, H19 und Snrpn. Das gilt auch für Cryo-Top vitrifizierte Oozyten, wenn auch die Rate sporadischer Methylierungsfehler einzelner CpG-Positionen in Snrpn etwas höher war als in den Kontrollgruppen. Zusammengenommen lassen die in dieser Arbeit präsentieren Resultate auf eine Zunahme an Imprinting-Fehlern und eine genomweite Abnahme der Methylierung repetitiver ALU-Sequenzen in den Keimzellen infertiler Patienten schließen. KW - Reproduktionsmedizin KW - Epigenotypus KW - Mutation KW - assistierte Reproduktion KW - Keimzell- und Embryonalentwicklung KW - Epimutation KW - Epigenetics KW - Asisted Reproduction KW - Imprinting Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65995 ER - TY - THES A1 - Doll, Julia T1 - Identifizierung und Charakterisierung neuer, mit Hörstörungen assoziierter Gene und Varianten mittels Exom-Sequenzierung T1 - Identification and characterization of novel hearing loss associated genes and variants by Exome Sequencing N2 - Laut des aktuellen Reports der Weltgesundheitsorganisation sind ca. 466 Millionen Menschen weltweit von einer Hörstörung (HS) betroffen. Durch die enorme Heterogenität und die klinische Variabilität, die diese Erkrankung ausmacht, und viele bisher nicht mit HS assoziierte Gene, bleibt ein großer Teil der erblich bedingten HS in vielen Familien unaufgeklärt. Die Entwicklung moderner Techniken, wie die Next-Generation Sequenzierung (NGS) und der Fortschritt bei der Untersuchung von Modellorganismen trugen jedoch in den letzten Jahren immens dazu bei, neue Gene zu identifizieren, die innerhalb des auditorischen Signalwegs oder damit assoziierten Strukturen beteiligt sind. Die vorliegende Arbeit umfasst Ergebnisse dreier Veröffentlichungen, in denen iranische und pakistanische Familien und eine deutsche Familie mit erblich bedingter HS untersucht und neue, krankheitsverursachende Varianten identifiziert und funktionell charakterisiert wurden. Im ersten Abschnitt konnten zwei neue rezessive Varianten im CDC14A-Gen als krankheitsverursachend identifiziert werden, die zu einem potentiellen Funktionsverlust des kodierten Proteins in einer iranischen und einer pakistanischen Familie führen. Mit Hilfe einer funktionellen Charakterisierung auf RNA-Ebene (Spleiß-Assay und RT-qPCR) konnte der Funktionsverlust beider Varianten bestätigt werden. Der zweite Abschnitt umfasst eine deutsche Familie mit sieben von einer HS betroffenen Familienmitgliedern, in der eine heterozygote missense Variante in MYO3A identifiziert wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte somit die erste autosomal dominante Variante in einer europäischen Familie mit einer bilingualen, sensorineuralen Hochtonschwerhörigkeit beschrieben werden und der dominante Charakter von MYO3A bestätigt werden. Im dritten Abschnitt konnten die krankheitsverursachenden Varianten in 13 Familien aus einer Kohorte mit 21 pakistanischen Familien mit einer syndromalen und nicht-syndromalen HS ausfindig gemacht werden. Hierbei wurden sowohl bekannte, als auch bisher nicht beschriebene Varianten detektiert. Die Aufklärungsrate innerhalb dieser Kohorte betrug 61,9% und es konnte somit das Spektrum syndromaler und nicht-syndromaler HS erweitert werden. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschreibt eine iranische Familie mit einer milden HS und milden Intelligenzminderung, in der eine homozygote missense Variante im Kandidatengen DBN1 ausfindig gemacht wurde. Um die Funktion und die Auswirkungen eines potentiellen Verlusts des codierten Proteins Drebrin zu untersuchen, wurden immunhistochemische Färbungen und auditorische Messungen an Dbn1 Knockout (KO)-Mäusen durchgeführt. Hierbei konnte eine Expression innerhalb der Nervenfasern, die innere Haarzellen innervieren, nachgewiesen werden. Eine leicht verlängerte Latenz für die ABR-Welle IV in KO-Mäusen im Vergleich zum Wildtyp ergab den Hinweis auf einen Defekt innerhalb des zentralen auditorischen Signalwegs, der möglicherweise mit einer Sprachverarbeitungsstörung im Menschen korreliert. N2 - According to the latest World Health Organization report, approximately 466 million people are affected by hearing loss (HL) worldwide. Due to the enormous heterogeneity and clinical variability that comes with this disorder and the previously unassociated HL genes, a large proportion of hereditary HL remains unexplained in many families. However, the development of modern techniques such as next-generation sequencing (NGS) and constant progress in the study of model organisms contributed immensely to the identification of new genes involved within the auditory pathway or associated structures. This thesis includes results of three publications in which Iranian and Pakistani families and a German family with HL were studied and novel disease-causing variants were identified and characterized. In the first section, two novel recessive variants in the CDC14A gene were identified as disease-causing, leading to a loss-of-function of the encoded protein in an Iranian and a Pakistani family. Functional characterization on RNA level (splice assay and RT-qPCR) confirmed the loss of function of both variants. The second section includes a German family with seven family members affected by HL, in which a heterozygous missense variant in MYO3A was identified. Thus, the first autosomal dominant variant in a European family with a bilingual sensorineural high-frequency hearing loss could be described in the current work. In the third section, the disease-causing variants were established in 13 families from a cohort of 21 Pakistani families with syndromic and non-syndromic HL. Both known and previously undescribed variants were detected. The detection rate within this cohort was 61.9% and thus the spectrum of syndromic and non-syndromic HL could be expanded. The final section of this work describes an Iranian family with mild HL and mild intellectual disability in which a homozygous missense variant in the candidate gene DBN1 was detected. To investigate the function and effects of a potential loss of the encoded protein Drebrin, immunohistochemical staining and auditory measurements were performed in Dbn1 knockout mice. Here, expression within nerve fibers innervating inner hair cells was detected. A slightly prolonged latency for ABR wave IV in the auditory pathway in KO mice compared to wild type mice provided evidence for a defect within the central auditory pathway that might correlate with a speech processing disorder in humans. KW - Hörstörung KW - Exomsequenzierung KW - Konsanguinität KW - Hörstörungen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-261097 ER - TY - THES A1 - Dellinger, Eva T1 - Expression von Myotubularin und seiner Mutanten im bakteriellen System T1 - Expression of myotubularin and its mutations in a bacterial system N2 - Die X-gebundene Myotubuläre Myopathie (XLMTM) ist eine sehr seltene und schwere angeborene Muskelschwäche, die durch Mutationen im MTM 1 Gen verursacht wird. In der histopathologischen Untersuchung ist auffällig, dass die Muskelfasern fetalen Myotuben ähneln. Das Gen MTM 1 wurde auf Xq28 lokalisiert und kodiert für das Protein Myotubularin. Die Myotubularine stellen eine große Familie eukaryotischer Lipid-Phosphatasen und Anti-Phosphatasen dar. Da der direkte Nachweis von Myotubularin in Muskelbiopsien von Patienten aufgrund der sehr niedrigen Expression nicht gelingt, weder durch immunhistochemische Methoden noch im Western-Blot oder durch einen spezifischen Enzymtest, steht ein funktioneller Test für die gefundenen Genmutationen nicht unmittelbar zur Verfügung. In der Arbeit sollte versucht werden, zunächst Wildtyp-Myotubularin im bakteriel-len System zu exprimieren, im Western-Blot nachzuweisen und die Phosphatase-Enzymaktivität in vitro zu messen. Als Substrat für Myotubularin wurde p-Nitrophenolphosphat verwendet. In der Durchfüh-rung des experimentellen Teils zeigten sich verschiedene Probleme, aus denen sich jedoch interessante Schlüsse ziehen liessen. Zum ei-nen konnte der Verdacht bekräftigt werden, dass Myotubularin keine Dual-spezifische Phosphatase ist, wie zunächst angenommen wurde. Problematisch war auch, dass der E.coli M15 Bakterienstamm an-scheindend selbst so viele eigene Phosphatasen produzierte, die das Substrat p-Nitrophenolphosphat dephosphorylierten. Diese Hintergrundgrundaktivität störte die eigentliche Aktivitätsmessung des Myotubularins und machte diese kaum verwertbar. Ebenso zeigte sich, dass das Myotubularin in dem untersuchten bakteriellen System nicht in größeren Mengen exprimiert wurde. Letzendlich ergab dies die Schlussfolgerung, dass zukünftige Untersuchungen berücksichtigen sollten, dass eukaryontische Expressionssysteme sich offensichtlich besser für die Mitglieder der Genfamilie der Myotubularine eigenen und dass Myotubularine Lipidphopshatasen sind mit in vivo sehr spe-zifischen Substraten (Phopshatidyl-Inositolphosphate). Jedes artifizielle Substrat sollte diese natürlichen Strukturen möglichst nachahmen. N2 - X-linked myotubular myopathy ist a very rare and severe muscle diseasse. It is cause by a mutation in the MTM1 gene. The musclefibres have a significant similarity to fetal mytotubes. The gene MTM1 was located on Xq28 und is encoding a protein called myotubularin. The myotubularin family consists of eucaryontic lipid phosphatases and anti-phosphatases. The detection of myotubularin in biopsies ist not possible, neither by immunological methods nor by Western Blot or specific enzyme-testing. The goal was to express myotubularin in a bacterial system, to detect it by western blot and to measure the phosphatase activity in vitro. As a substrate for myotubularin p-nitrophenophosphate was used. Several problems occured during testing, which lead to some interesting conclusions. For one, the suspicion that myotubularin ist no dual-specific phosphatase could be confirmed. Another problem was, that the M 15 e. coli bacteria itself seemed to produce phosphatases, that dephosphorylate p-nitrophenolphosphate. That made screening the activity of myotubularin nearly impossible. Also, myotubularin was not expressed in large amounts in M 15 e-coli cells. In the end it turned out that for further tests, an eukaryontic system should be used for expression, and that myotubularine is a lipid-phosphatase with very specific substrates in vivo. Every artifical substrate should imitate that natural structure als closely as possible. KW - Molekulargenetik KW - Erbkrankheit KW - Muskelentwicklung KW - Myotubuläre Myopathie KW - MTM KW - Myotubular Myopathy KW - MTM Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25366 ER - TY - THES A1 - Damatova, Natalja T1 - Identifizierung und Charakterisierung von krankheitsassoziierten Mikrodeletionen mit modernen molekularzytogenetischen Methoden T1 - Identification and characterization if disease associated microdeletions with modern molecular cytogenetic methods N2 - Das Hauptziel der medizinischen Genetik ist es, die Ursachen für genetisch hervorgerufene Krankheiten zu finden, um eine bessere Behandlung der Patienten zu gewährleisten, sei es um die Medikamente auf den Metabolismus des Individuums anzupassen oder natürlich dazu, um die Krankheit selbst zu behandeln und in Zukunft auch heilen zu können. Um dieses Ziel zu erreichen werden immer neue Technologien entwickelt, die mit Hilfe von bereits etablierten Methoden auf ihre Eignung hin überprüft werden müssen. Eine der neuesten Entwicklungen stellt die Array-Technologie dar. In dieser Studie wurde versucht zu überprüfen, inwieweit diese neue Methode zur Analyse von einzelnen bis wenigen Patienten mit bestimmten Syndromen geeignet ist. Dafür wurden mehrere Patienten mir sehr unterschiedlichen Phänotypen ausgesucht, die verschiedene Ursachen und Entstehungsmechanismen der genetischen und phänotypischen Veränderung vermuten ließen. Die erste hier dargestellte Publikation beschreibt einen Fall mit einer einseitigen Schalleitungsschwerhörigkeit, der mit einer Translokation der(18)t(18;22) mit der involvierten Deletion 22pter→q11.21, sowie den darin enthaltenden Genen der CES-Region, erklärt wurde. Der in der zweiten Publikation beschriebene Fall mit MR und Verhaltensauffälligkeiten wurde mit einer intragenischen Mikrodeletion im Gen IL1RAPL1 korreliert. Zwei Fälle autoimmunbedingten Leberversagens bei einem Phelan-McDermid Syndrom wurden in der dritten Publikation primär auf eine Deletion des Gens PIM3 zurückgeführt. Ein autistischer Junge mit einer Entwicklungsverzögerung und gewalttätigen Ausbrüchen zeigte in der vierten Publikation ein sehr komplexes Rearrangement mit mehreren Brüchen im Gen CNTNAP2 und Deletionen anderer Gene, die zusammen für den Phänotyp verantwortlich sein können. Keine Mikrodeletion, sondern eine Epimutation in Chromosom 14q32.2 war die Ursache für die Adipositas mit einer Sprachentwicklungsverzögerung bei einem Jungen, der in der fünften Publikation beschrieben ist. Um die o. g. genetischen Veränderungen zu finden, wurden verschiedene Methoden wie die GTG-Bänderung, FISH, MLPA und verschiedene Array-Systeme verwendet. Mit jeder von diesen Methoden konnten neue und einander ergänzende Daten zu den genetischen Veränderungen eines Individuums gewonnen werden. Keine der Methoden konnte für sich allein ein vollständiges Bild liefern. Die GTG-Bänderung zeigt zwar das ganze Genom, hat aber die Limitierung der niedrigen Auflösung. Sie konnte dennoch Anhaltspunkte für höherauflösende Untersuchungsmethoden geben. Dazu gehörte die FISH, die entweder zur feineren Auflösung der Bänderungsdaten oder zur Bestätigung von Array-Befunden verwendet wurde. Die MLPA wurde unterstützend auf der Suche nach sehr kleinen Veränderungen in eingegrenzten Regionen eingesetzt. In einigen der beschriebenen Fälle wurden trotz eines negativen Bänderungsbefundes aufgrund des auffälligen Phänotyps genetische Ursachen vermutet, und daher feiner auflösende Methoden eingesetzt. Die am höchsten auflösenden Array-basierten Methoden wurden eingesetzt, wenn ansonsten keine Ergebnisse zu erzielen waren, oder eine feinere Auflösung der vorhandenen Daten erreicht werden sollte. Anschließend konnten die Erkenntnisse über die Veränderungen mit dem Phänotyp korreliert werden, um ein Kandidatengen oder eine Kandidatengenregion zu ermitteln. Aufgrund der großen Datenmenge aus den Array-Experimenten, waren zur Entscheidung über die Relevanz der Daten bezüglich der Entstehung des Phänotyps umfassende Datenbank- und Literatur-Recherchen notwendig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Array-Technologie einen großen Fortschritt darstellt, in der Suche nach Ursachen für genetische Erkrankungen. Sie hat aber technische Limitierungen und um das Problem der Phänotyp-Genotyp-Korrelation zu vereinfachen, werden weltweit noch viele Daten gesammelt werden müssen. Das ist eine Frage der Zeit und der Weiterentwicklung geeigneter Technologien. N2 - The major aim of medical genetics is to find the reasons for genetic diseases, to ensure better treatment of patients, for example to better adapt medication to the patient’s metabolism or to treat and in the future also to cure the illness. To reach this goal new technologies are developed, which have to be tested for their applicability by already established methods. One of the newest developments is constituted by the array-technology. In this study it has been tried to find out to which extent this new method is suited for testing individual or few patients with certain syndromes. To do that several patients have been chosen with very different phenotypes, for which different mechanisms underlying the genetic and phenotypic changes were presumed. The first paper presented here describes a case with unilateral conductive hearing loss, which was explained by the translocation der(18)t(18;22) including the deletion of the region 22pter→q11.21 and the genes of the CES region. The case with MR and behavioral abnormalities described in the second paper was associated with an intragenic deletion of IL1RAPL1. Two cases of hepatic failure caused by an autoimmune reaction in patients with the Phelan-McDermid syndrome were explained by the deletion of PIM3 in the third paper. In the fourth paper an autistic boy with a developmental delay and violent outbursts had a very complex rearrangement containing many breaking points in CNTNAP2 and deletion of other genes, which altogether explain the phenotype. Not a microdeletion, but an epimutation in 14q32.2 was the cause for the obesity with a speech delay in a boy described in the fifth paper. Different methods were used to find the above mentioned genetic changes, i.e. GTG-banding, FISH, MLPA and several array-systems. Each of these methods revealed new and complementing data about the genetic changes of an individual. None of the methods alone could provide a complete picture. GTG-banding shows the entire genome, but has the limitation of a low resolution. This banding method provided candidate regions for further investigations with higher resolving methods. FISH was used for this cause or to confirm array data. MLPA was used to search for very small changes in specific regions. In some of the described cases with negative findings in the GTG-banding but a noticeable phenotype, genetic cause was assumed and higher resolving methods were used. The method with the highest resolution were the array-based technologies, which were used as screening method if no information could be obtained by any other method. Finally, the findings on the genetic changes were correlated with the phenotype to determine the candidate gene or a candidate gene region. Due to the large amount of data obtained from the array-experiments, the correlation required a decision about the relevance of the data for the development of the phenotype based on thorough database research. Collectively, it can be said that the array-technology is a useful technique for searching for reasons of genetic diseases. But it has its technical limitations. To facilitate the problem of the phenotype-genotype-correlation, data has to be accumulated worldwide. It is a question of time and further development of adequate technologies. KW - Deletion KW - Erbkrankheit KW - Microarray KW - Mikrodeletionen KW - Array-Methoden KW - Microdeletions KW - array-CGH KW - SNP-Array Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65727 ER - TY - THES A1 - Böhm, Christian T1 - Zytogenetische Untersuchungen an Pankreaskarzinom-Zelllinien transgener TGFalpha/p53+/-Mäuse T1 - Cytogenetic tests of pancreatic carcinoma cell lines of p53 deficient mice overexpressing TGFalpha N2 - Sechs verschiedene Tumorzelllinien aus duktalen Pankreaskarzinomen transgener TGFalpha/p53+/-M?se wurden molekular-zytogenetisch durch Spectral Karyotyping analysiert, um Hinweise auf sekund?e genetische Ver?derungen zu erhalten, die f? die Tumorgenese in diesem Mausmodell verantwortlich sind. Es wurden haupts?hlich numerische Abberationen mit hypertriploiden bis hypotetraploiden Karyotypen detektiert, wohingegen durchschnittlich nur 4,3 Strukturaberrationen pro Metaphase nachgewiesen werden konnten. Fast immer stellten sich einige kleine Markerchromosomen dar, die durch SKY nicht eindeutig identifiziert werden konnten. Auff?ligste Ver?derung der Zelllinie TD2 (MMUPaTu7 und 8=7B) war ein gro?s Markerchromosom, dessen proximaler Anteil mit drei charakteristischen dunklen Banden aus Material von Chromosom 11 bestand, w?rend der distale Abschnitt zu Chromosom 5 geh?te. Durch FISH-Analyse mit spezifischen BAC-Proben f? das Chromosom 11 konnte hierf? eine Amplifikation der Kandidatengene Egfr und c-Rel festgestellt werden. Auch in den anderen Zelllinien traten geh?ft Strukuraberrationen des Chromosoms 11 auf, f? die ebenfalls eine Beteiligung dieser Genloci postuliert werden kann. Weitere strukturelle Ver?derungen betrafen Chromosom 15 mit c-Myc-Amplifikationen in Form von extrachromosomalen "double minutes", welche in h?eren Passagen der Zelllinie TD2 als homogeneously stained regions (HSR) integriert an variablen Positionen des Chromosoms 6 sichtbar wurden. In den analysierten Metaphasen trat zus?zlich h?fig ein vergrößertes Chromosom 8 auf, allerdings im Bandenmuster mit unterschiedlichen Amplifikationseinheiten, wobei ein Gewinn des dort lokalisierten Transkriptionsfaktors Jun-B m?lich w?e. F? eine genauere Charakterisierung der in die verschiedenen Strukturaberrationen involvierten Kandidatengene sind gezielte FISH-Analysen mit lokusspezifischen BAC-Proben oder andere weiterf?rende molekular-genetische Untersuchungen erforderlich. KW - Pankreaskarzinom KW - Spectral Karyotyping KW - transgene TGFalpha-Mäuse KW - pancreatic carcinoma KW - spectral karyotyping KW - p53-deficient mice overexpressing TGFalpha Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18623 ER - TY - THES A1 - Buwe, Andrea T1 - Geschlechts-chromosomale Kopplung der Fanconi Anämie Gene FANCC und FANCG im Hühnergenom und die geschlechtsspezifische Sensibilität der Hühnerzellen gegenüber Mitomycin C T1 - Sex-chromosomal linking of Fanconis Anemia gene FANCC and FANCG in chicken and gender-related sensibility to mitomycin C. N2 - Fanconi Anämie ist eine seltene rezessiv vererbte Erkrankung, deren zu Grunde liegende Enzymdefekte in ein Netzwerk unterschiedlichster DNA-Reparaturproteine eingewoben sind. Phylogenetisch sind uns Vögel relativ nahe verwandt, was sie zu einem guten Modellorganismus jenseits der Säugetiermodelle macht. Eine von Hühnerzellen abgeleitete Zelllinie (DT40) wurde bereits schon breit eingesetzt um die Funktion des FA-Signalwegs zu erforschen. Nachdem auch das Hühnergenom vollständig entschlüsselt wurde, konnten zu fast allen FA-Genen Orthologe gefunden werden. Unter den zahlreichen FA-Genen sind für diese Arbeit vor allem FANCC und -G von Bedeutung, da beide Gene auf dem Z-Geschlechtschromosom des Huhns liegen und eine Inaktivierung des zweiten Z-Chromosoms beim Hahn äquivalent zur X-Inaktivierung beim Menschen nicht stattfindet. Somit sollte es ein ´natürliches´ Gendosisungleichgewicht zwischen den Geschlechtern geben. Im durchgeführten Southern Blot konnte keine geschlechtsspezifisch weibliche Bande (für FANCC und -G) gefunden werden. Somit ist davon auszugehen, dass die FA-Gene C und G ausschließlich auf dem Z-Chromosom lokalisiert sind. Dies wurde auch nochmals mittels FISH bestätigt - beide Gene fanden sich auf dem kurzen Arm des Z-Chromosoms (FANCC zentromernah, FANCG zentromerfern). Aus Studien mit DT40 Zellen ist bereits bekannt, dass FA defiziente Zellen ähnlich wie humane FA-Zellen eine Hypersensitivität gegenüber Substanzen zeigen, die DNA-crosslinks verursachen. In Anlehnung an die humane FA-Diagnostik wurden die neu etablierten embryonalen Fibroblasten mit unterschiedlichen Konzentrationen und Einwirkzeiten von MMC behandelt und die Schäden ausgewertet. In allen Untersuchungen trugen die weiblichen Zellen mehr Schäden davon als die männlichen. Bei niedrigen Konzentrationen zeigte sich dies nur als Trend, bei höheren MMC-Konzentrationen und längeren Einwirkzeiten fanden sich bei fast allen durchgeführten Untersuchungen auch statistisch signifikante Unterschiede. Somit ergibt sich aus dieser Arbeit ein deutlicher Hinweis auf ein funktionelles Ungleichgewicht zwischen Henne und Hahn was die DNA-Reparatur nach Schädigung durch MMC angeht. N2 - Fanconi anemia is a rare recessive disorder whose underlying enzyme deficiencies are woven into a network of various DNA repair proteins. Phylogenetically related birds are relatively close to us, which makes it a good model organism beyond the mammalian models. A cell line derived from chicken cells (DT40) has already been widely used to study the FA pathway. Even after the chicken genome was completely decoded, orthologs could be found for almost all FA genes. Among the numerous FA genes are mainly FANCC and G of importance since both genes are located on the Z sex chromosome of chicken. An inactivation of the second Z chromosome as the inactivation of the x chromosom in human does not take place. Thus there should be a 'natural' imbalance of the gen dose between the sexes. Southern blot showed no gender female band (for FANCC and G). Thus it can be assumed that the FA genes C and G are exclusively localized on the Z chromosome. This was also confirmed by FISH, both genes were located on the short arm of the Z chromosome. From studies in DT40 cells is already known that FA deficient cells, similar to a human FA cell show hypersensitivity to substances that cause DNA crosslinks. Based on the human FA diagnosis, newly established embryonic fibroblasts were treated with different concentrations of MMC and chromosomal the damage was evaluated. In all studies, the female cells contributed more damage than the male. At low concentrations, this was only shown as a trend, at higher MMC concentrations and longer exposure times there was a significant differences. Thus, results from this study, a clear indication of a functional imbalance between hen and rooster in terms of DNA repair after damage by MMC. KW - Mitomycin C KW - Fanconi Anämie KW - Fanconi Anaemia Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77593 ER - TY - THES A1 - Blaurock, Claudia T1 - Mosaikbildung bei Fanconi-Anämie T1 - Mosaicism in fanconi anaemia N2 - Die Fanconi-Anämie ist eine autosomal-rezessiv vererbte Krankheit, die mit progredientem Knochenmarksversagen, Fehlbildungen und Tumoren einhergeht. Diagnostiziert wird diese Krankheit durch eine vermehrte Chromosomenbrüchigkeit nach Behandlung mit Diepoxybutan oder Mitomycin C oder durch einen erhöhten Anteil von Zellen in der G2-Phase in der Durchflußzytometrie. Bei einigen Patienten wurden Verläufe mit stabilen Blutbildern beschrieben. Als Erklärung wurde das Vorhandensein einer Mosaikkonstellation bei diesen Patienten diskutiert. Hier wird ein FA-Patient der Komplementationsgruppe A beschrieben, bei dem es im Alter von 2 Jahren zu einer Thrombozytopenie kam und ein dysplastisches Knochenmark vorlag. Zusätzlich liegt bei dem Patienten noch ein Wachstumshormonmangel bei dysplastischer Hypophyse vor. Im Alter von 3 ½ Jahren kam es zu einer deutlichen Stabilisierung des Blutbildes; auch fand sich bei wiederholten Knochenmarkspunktionen ein normozelluläres Mark. Nachdem zuvor die Diagnose FA mittels Chromosomenbruchanalyse und Durchflußzytometrie gestellt und später durch Untersuchung von Fibroblasten bestätigt worden war, stellte sich jetzt die Frage eines Mosaiks. Weitere Zellzyklusanalysen ergaben annähernd normale Befunde. Bei einer weiteren, im Alter von 6 Jahren durchgeführten Chromosomenbruchanalyse zeigte sich eine bimodale Verteilung der MMC-Sensitivität. Auf Grund dieser Bimodalität, also der Koexistenz von defekten und intakten Zellen, kann von der Existenz einer Mosaikkonstellation ausgegangen werden, die für das Auftreten intakter Zellen verantwortlich ist und dadurch zu einer Stabilisierung des Blutbildes geführt hat. Die erste Mutation des Patienten wurde auf Exon 10 gefunden, wo anstelle von Glutaminsäure ein Stopcodon gebildet wird. Ob die Mosaikkonstellation im vorliegenden Fall durch intragenes Crossover oder Genkonversion entstanden ist, kann erst nach der Identifizierung der Mutation auf dem zweiten Allel des Patienten abgeklärt werden. N2 - Fanconi anaemia is an autosomal-recessive inherited disease, which is associated with progredient bone-marrow failure, malformations and tumors. It is diagnosed on the basis of an increased chromosome instability after treatment with di-epoxy-butane or mitomycin C, or because of an accumulation of cells in the G2-phase of flow cytometric testing. In the case studies of several patients the development of stable blood counts has been described. A possible explanation for this phenomenon might be the existence of mosaicism. Here is described a patient belonging to complementation group A, who developed thrombocytopenia at the age of 2 and who had dysplastic bone-marrow. In addition, the patient had a growth hormone deficiency in connection with a dysplastic pituitary stalk. At the age of 3 ½ years, the blood count became stable and the bone-marrow normal. After FA had initially been diagnosed by testing for chromosome instability and by flow cytometry, a result which was later confirmed by the examination of fibroblasts, the question now arose whether the patient had developed a mosaic. Further cell cycle analysis tests gave almost normal results. Another testing for chromosome instability at the age of 6 showed a bimodal distribution of MMC-sensitivity. Because of this co-existence of defect and intact cells, the formation of a mosaic is probable, which is responsible for the appearance of intact cells and has led to the stabilisation of the blood count. The first mutation of the patient’s genome was found on exon 10, where a stop codon was produced instead of glutamin acid. Whether the mosaicism in this case was caused by intragene crossover or gene conversion, can only be clarified once the mutation on the patient’s second allele has been identified. KW - Fanconi-Anämie KW - Mosaik KW - Kasuistik KW - Durchflußzytometrie KW - Zellzyklusanalyse KW - Knochenmarksversagen KW - Thrombozytopenie KW - Wachstumshormonmangel KW - fanconi anaemia KW - mosaicism KW - case report KW - flow cytometry KW - cell cycle analysis KW - bone-marrow failure KW - thrombozytopenia KW - growth hormone deficiency Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181548 ER - TY - THES A1 - Bechtold, Astrid T1 - Funktionelle und molekulare Pränataldiagnostik der Fanconi-Anämie T1 - Prenatal exclusion/confirmation of Fanconi Anemia via flowcytometry N2 - Die Zellzyklusanalyse an kultivierten Fruchtwasserzellen zur pränatalen Diagnostik der Fanconi-Anämie ist nicht hinreichend zuverlässig und sollte aufgrund der teilweisen Verfälschung des Ergebnisses durch tetraploide Zellen und unzureichende Mitogenantwort sowie eventuell einen hohen Anteil nichtstimulierbarer Zellen (sog. noncycling fraction) stets mit einer weiteren Untersuchung an Nabelschnurblutzellen bestätigt werden. Durch eine Kombination von Amnionzelll- und NS-Blut- Untersuchung mit Hilfe der Durchflußzytometrie kann die Diagnose FA dann in der Mehrzahl der Fälle sicher ausgeschlossen oder bestätigt werden. Diese funktionelle Testung ist insbesondere für das Screening von Niedrig-Risiko-Schwangerschaften geeignet, bei denen eine pränatale Diagnostik auf Grund eines auffälligen Ultraschallbefundes bei sonst leerer Familienanamnese durchgeführt wird. Indirekte und direkte Gendiagnostik setzen die Kenntnis des betroffenen Gens bzw. beider krankheitsverursachender Mutationen voraus. Im engen zeitlichen Fenster der pränatalen Diagnostik können diese nicht immer rechtzeitig bestimmt werden. In den Fällen, in welchen sowohl funktionelle als auch Gendiagnostik durchgeführt wurde, konnte das Ergebnis der funktionellen Diagnostik stets bestätigt werden. Die einzige Fehldiagnose unter den hier vorgestellten Familien beruhte auf der Tatsache, dass in diesem Fall das Ergebnis der Zellzyklustestung an kultivierten Fruchtwasserzellen nicht durch eine Untersuchung von Nabelschnurblut kontrolliert wurde. Werden sowohl Amnionzellen als auch Nabelschnurblut untersucht und wird die Untersuchung der Amnionzellen durch eine einfache Sensitivitätsmessung gegenüber MMC ergänzt, so ist die funktionelle pränatale Diagnostik eine verlässliche Methode zur Bestätigung oder zum Ausschluß der Diagnose Fanconi-Anämie. Die größtmögliche Sicherheit der pränatalen Diagnostik wird jedoch mit molekulargenetischen Methoden erreicht. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn Komplementationsgruppenzugehörigkeit und die Art der krankheitsverursachenden Mutationen vor Beginn der Schwangerschaft bekannt sind. N2 - Objective: To explore the potential of flowcytometry in the prenatal exclusion or confirmation of Fanconi anemia (FA). Methods: Indications for prenatal diagnosis were (1) FA-negative family history, but suspicious ultrasound findings such as radial ray aplasia, (2) FA-positive family history, but without knowledge of the affected gene and/or mutation. Amniotic fluid (AF) cell cultures and umbilical cord (UC) blood cultures were assayed for typical cell cycle changes (G2-phase accumulations) without and with Mitomycin C-treatments using single and dual parameter (BrdU-Hoechst) flowcytometry. Results: Single parameter flowcytometry correctly identified 2 positive and 9 negative cases on the basis of MMC-sensitivity of cultivated AF cells. Likewise, 8 negative cases and 2 positive cases were correctly predicted using bivariate flowcytometry of 72 h umbilical cord blood cultures. In contrast, bivariate flowcytometry applied to AF cells grown in the presence of bromodesoxyuridine (BrdU) yielded false positive and false negative results. Conclusions: Single parameter flowcytometry of AF-cell cultures and bivariate flowcytometry of UC-cell cultures have the potential to correctly predict the affected status in cases at risk for FA, whereas bivariate flow cytometry proved unreliable when applied to BrdU-substituted AF-cell cultures. Cases with a low a priori risk (e.g. sonographic finding of radial ray abnormalities and negative family history) would benefit most from flowcytometry as a rapid and economical prenatal screening procedure. KW - Fanconi-Anämie KW - Pränataldiagnostik KW - Durchflusszytometrie KW - Zellzyklus-Analyse KW - Prenatal diagnosis KW - Fanconi anemia KW - flowcytometry KW - cell cycle analysis Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14663 ER - TY - THES A1 - Balzar, Alla T1 - Morbidität und Mortalität sowie Prognose kleiner Frühgeborener < 32 Schwangerschaftswochen 1995 bis 2001 T1 - Morbidity, mortality, and outcome of low birth weight premature infants born before 32 weeks of gestational age between 1995 and 2001 N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden die Krankenblätter 366 kleiner Frühgeborener (Schwangerschaftswochen (SSW) 23/0 bis 32/0), die im Zeitraum von 1995 bis 2001 in der Frauenklinik des Klinikums Süd Nürnberg aus Einlingsschwangerschaften geboren wurden, retrospektiv ausgewertet. 136 Schwangere wurden nach einem vorzeitigen Blasensprung entbunden. 16 Kinder sind innerhalb der Neonatalperiode gestorben. Erfasst wurden zum einen wichtige prä- und peripartale Faktoren, u.a. mütterliches Alter und Risiko,Schwangerschaftsalter, Indikation zur Schwangerschaftsbeendigung und Entbindungsmodus, und zum anderen fetale Outcome-Parameter wie Gewicht, Apgar Score, Nabelarterien-pH-Wert, Base Excess und Intubation. Darüber hinaus wurden für jedes Kind die Morbiditätsdiagnosen und bei gestorbenen Kindern die Todesursachen aufgenommen. In 37 % der Fälle lag der Frühgeburt ein vorzeitiger Blasensprung zugrunde, in 31 % eine vorzeitige Wehentätigkeit. Die übrigen 32 % wurden durch maternofetale Pathologie hervorgerufen. Das Gewicht der Frühgeborenen lag zu 75 % unter 1500 g. In einer schweren Azidose befanden sich 6 % der Kinder. Eine starke Abhängigkeit der Outcome-Parameter von Poleinstellung und Entbindungsmodus war nicht zu beobachten. Frühgeborene nach fetaler Entbindungsindikation wiesen ein schlechteres Outcome auf als nach maternaler Indikation. Von den beobachteten Krankheiten kam das Atemnotsyndrom am häufigsten vor (in 63 % der Fälle), bei 20 % der Kinder III.-IV. Grades. Hochgradige Retinopathie (Grade III-IV) wurde in 5,4 %, retrolentale Fibroplasie in 0,6 % der Fälle diagnostiziert. Ein Drittel der Kinder erkrankten an einer Sepsis. Bei 18 % entwickelte sich im Verlauf eine bronchopulmonale Dysplasie. Schwere Hirnblutungen (III.-IV. Grades) erlitten 4,5 % der Frühgeborenen, periventrikuläre Leukomalazie 3,6 % und nekrotisierende Enterokolitis 1,5 %. Die genannten Krankheiten traten mit zunehmendem Schwangerschaftsalter weniger häufig auf. Die Prognose verbesserte sich besonders stark in den SSW 28-30. 6 von 16 Todesfällen (38 %) entfielen auf die ersten 24 Lebensstunden. Die Todesursachen waren Unreife/Mangelgeburt (31 %), Sepsis (31 %), Fehlbildungen und intrauterine Asphyxie (jeweils 13 %). Die neonatale Mortalitätsrate nahm mit zunehmendem Geburtsgewicht deutlich ab: Von 33 % für Frühgeborene unter 500 g, auf 3 % ab 1000 g. Die mittlere Latenzperiode nach einem vorzeitigen Blasensprung betrug 9,1 Tage (in 90 % der Fälle bis zu 3 Wochen, Maximum: 10 Wochen). Kinder beider betrachteter Gruppen von 23-28 und 29-32 SSW profitierten vom angewendeten konservativen Management: Bezüglich der Lungenreife war eine klare Verbesserung zu beobachten, falls die RDS-Prophylaxe 48 Stunden vor der Geburt abgeschlossen war. Sepsis kam zwar in der Gruppe mit niedrigerem Gestationsalter häufiger vor, war jedoch nicht direkt abhängig von der Latenzperiode. Im Vergleich mit anderen aktuellen Studien lagen die in dieser Arbeit festgestellten Morbiditätsraten etwa gleichauf. Die Kinder des eigenen Kollektivs entwickelten aber seltener intraventrikuläre Hämorrhagie und periventrikuläre Leukomalazie. Die starke Abnahme von Morbidität und Mortalität mit zunehmendem Schwangerschaftsalter wird in den Vergleichsstudien ähnlich berichtet. Eine nicht vernachlässigbare Überlebenschance kann bereits ab 23 SSW gegeben sein (4 von 6 dieser Kinder überlebten die Neonatalperiode). Die Chancen auf ein gesundes Überleben jedoch steigen besonders in den SSW 28-30. Daher ist in den sehr frühen SSW die Prolongation der Schwangerschaft zu empfehlen. N2 - 1 Introduction 2 Patients and Methods 2.1 Collected Data 2.1.1 Mother 2.1.2 Child 2.2 Definitions 3 Results 3.1 Prenatal Factors 3.1.1 Maternal Age 3.1.2 Parity 3.1.3 Gestational Age 3.1.4 Maternal Risk 3.1.5 Fetal presentation 3.1.6 RDS Prophylaxis 3.1.7 Indications for delivery 3.1.8 Infection 3.1.9 Priming 3.2 Perinatal Factors 3.2.1 Mode of delivery 3.3 Outcome 3.3.1 Sex 3.3.2 Weight 3.3.3 Apgar Score 3.3.4 Cord pH Value 3.3.5 Base Excess 3.3.6 Lactate Value 3.3.7 Intubation 3.3.8 Influence of the Mode of Delivery on the Fetal Outcome 3.3.9 Influence of the Indication for Delivery on the Fetal Outcome 4 Discussion 4.1 Birth Factors and Outcome 4.1.1 Maternal Age 4.1.2 Influence of the Mode of Delivery 4.2 Morbidity 4.3 Delay of Delivery After Preterm Prelabor Rupture of the Membranes 4.3.1 Latency Period and Infantile Rate of Survival 4.3.2 Neonatal Sepsis 4.4 Survival of Very Low Birth Weight Infants 4.5 Mortality 5 Summary A Nomenclature Bibliography KW - Frühgeburt KW - Morbidität KW - Mortalität KW - früher vorzeitiger Blasensprung KW - preterm labor KW - morbidity KW - mortality KW - preterm prelabor rupture of the membranes Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13205 ER - TY - THES A1 - Aichinger, Eric T1 - Risikoberechnung bei der Muskeldystrophie Duchenne und der Muskeldystrophie Becker T1 - Risk estimation in families with Duchenne muscular dystrophy or Becker muscular dystrophy N2 - Risikoberechnung in Familien mit Muskeldystrophie Duchenne oder Muskeldystrophie Becker. Unter Berücksichtigung eines Keimzellmosaiks, heterogener Neumutationsraten und der Möglichkeit homozygot betroffener Frauen. N2 - Risk estimation in families with Duchenne muscular dystrophy or Becker muscular dystrophy. Regarding germline mosaicism, specific mutation rates and homozygote affected women. KW - Risikoberechnung KW - Duchenne KW - Becker KW - Keimzellmosaik KW - Mutationsrate KW - Risk estimation KW - Duchenne KW - Becker KW - germline mosaicism KW - mutation rate Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27000 ER - TY - THES A1 - Abdel Rahman, Faisal Mirghani T1 - Systematic analysis of genes expressed in the retinal pigment epithelium (RPE) and identification of candidates for genetic susceptibility to age-related macular degeneration (AMD) N2 - Age related macular degeneration (AMD) is the leading cause of visual impairment in the elderly and the major cause of blindness in the developed world. To date, the molecular mechanisms underlying the disease are not well understood although in recent years a primary involvement of the retinal pigment epithelium (RPE) has become evident. The aim of the present study is to systematically analyse genes which are differentially expressed in the RPE, and to assess their possible association with mechanisms and pathways likely to be related to retinal disease, in particular AMD. Towards this goal, 2379 expressed sequence tags (ESTs) were established from an inhouse generated RPE cDNA library. This library was constructed by using the suppression subtraction hybridization (SSH) technique which normalises redundant sequences and ensures enrichment of rare transcripts. In a first phase, 1002 ESTs were sequenced and subjected to comprehensive alignment with public nucleotide and protein databases. A search of the 1002 ESTs against the human genome draft sequence yielded 168 known genes, 51 predicted genes, 15 unknown transcripts and 41 clones with no significant similarity. Reverse Northern blot hybridization was performed for 318 EST clusters to identify abundantly expressed genes in the RPE and to prioritize subsequent analyses. Representative clones were spotted onto a nylon membrane and hybridized with cDNA probes of driver (heart and liver) and tester (RPE) used in the cDNA library construction. Subsequently, 107 EST clusters were subjected to Northern blot hybridizations. These analyses identified 7 RPE-specific, 3 retina-specific, 7 RPE/retina-specific, and 7 tissue restricted transcripts, while 29 EST clusters were ubiquitously expressed, and evaluation was not possible for another 54 EST clusters. Of the 24 transcripts with specific or restricted expression, 16 clones were selected for further characterization. The predicted gene MGC2477 and 2 novel isoforms of the human transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 3 (TRPM3) were cloned and further described in detail. In addition, polymorphic variations for these 2 genes as well as for the human MT-Protocadherin gene were determined. For MGC2477, 15 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified, with 13 having a frequency of the minor allele greater than 20%. 10 of the 15 SNPs have not been reported in so far in public SNP repertoires. Partial assessment of the TRPM3 gene yielded 35 SNPs. Of these, 30 (85.7%) were highly frequent (0.17-0.5%), and 14 (40%) were novel. The MT-Protocadherin gene revealed 35 SNPs, including 28 (80%) with high frequency of the minor allele. 23 (65.7%) were novel SNPs. These SNPs will be used to construct the most common haplotypes. These will be used in case/control association studies in 400 AMD patients and 200 ethnically and aged matched controls to assess a possible contribution of these genes in the etiology of AMD. N2 - Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache von gravierenden Einschränkungen des Sehvermögens im fortgeschrittenen Lebensalter. In den Industriestaaten ist die AMD zudem die Hauptursache für Altersblindheit. Die molekularen Mechanismen, die zur Entstehung der AMD führen, sind bisher nur unzureichend bekannt. In den letzten Jahren hat es sich jedoch herausgestellt, dass das retinale Pigmentepithel (RPE) eine primäre Rolle in der Pathogenese der AMD spielt. Ziel dieser Arbeit war die systematische Analyse von Genen, welche im RPE differentiell exprimiert werden. Entsprechende Kandidatengene sollten auf deren mögliche Beteiligung an der Entstehung von Erkrankungen der Retina, insbesondere der AMD, untersucht werden. Zunächst wurden 2379 ESTs aus einer innerhalb der Arbeitsgruppe generierten RPE cDNA Bibliothek definiert. Die dazu verwendete cDNA Bibliothek wurde durch die Suppressions- Subtraktions Hybridisierungs-Technik (SSH) konstruiert. Diese Technik gestattet eine Normalisierung gegenüber redundanten Sequenzen und begünstigt gleichzeitig die Anreicherung von seltenen Transkripten. In einer ersten Phase wurden 1002 ESTs sequenziert und einer umfassenden bioinformatischen Analyse mit Hilfe der verfügbaren DNA- und Protein Datenbanken unterzogen. Der Vergleich der 1002 ESTs mit der Draft Sequenz des menschlichen Genoms ergab den Hinweis auf 168 bereits bekannte Gene, 51 mögliche Gene, 15 völlig unbekannte Transkripte und 41 nicht weiter zuordenbare cDNA Klone. 318 EST Cluster wurden einer reversen Northen-Blot Analyse unterzogen um hochexprimierte Gene zu identifizieren und damit Prioritäten für die weiteren Analysen zu setzen. Im Rahmen der Northern-Analyse wurden repräsentative Klone von 107 EST-Klustern mit cDNA Sonden der ursprünglichen cDNA-Bibliothek hybridisiert. Als Ergebnis dieser Analyse fanden sich 7 RPE-spezifische, 3 Retina-spezifische, 7 sowohl RPE- als auch Retinaspezifische sowie 7 auf einzelne Gewebe limitierte Transkripte. 29 EST Cluster erwiesen sich als ubiquitär exprimiert, und 54 Kluster konnten nicht näher zugeordnet werden. Von den 24 Transkripten mit spezifischer oder zumindest begrenzter Expression wurden 16 Klone zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Aus diesen Material wurden im Rahmen dieser Arbeit das Kandidatengen MGC2477 sowie 2 neue Isoformen des menschlichen TRPM3-Gens kloniert und näher charakterisiert. Weiterhin wurden polymorphe Varianten dieser beiden Isoformen und des menschlichen MTProtocadherin- Gens definiert. Im Gen MGC2477 wurden 15 SNPs identifiziert, wovon die Allelhäufigkeit des selteneren Allels bei 13 der SNPs über 20% lag. Für 10 der insgesamt 15 vii SNPs dieses Gens fanden sich bisher keine Einträge in den entprechenden Datenbanken. Die SNP-Suche wurde auch für das TRPM3-Gen durchgeführt und ergab 35 SNPs, wovon 30 (85,7%) als hochfrequent eingestuft werden konnten. 14 dieser 35 SNPs waren bisher nicht in den Datenbanken verzeichnet. Beim MT-Protocadherin-Gen fanden sich ebenfalls 35 SNPs, wobei 80% eine hohe Frequenz des selteneren Allels aufwiesen. In diesem Fall handelte es sich bei 23 der insgesamt 35 SNPs um bisher unbekannte Allele. Diese SNPs bilden den Ausgangspunkt zur Konstruktion der häufigsten Haplotypen der genannten Gene. Mit der Charakterisierung der Einzel-Nukleotid Polymorphismen der Kandidatengene wurde die Grundlage zur Durchführung von Fall/Kontrollstudien gelegt, in deren Rahmen die Bedeutung der jeweiligen Kandidatengene in der Pathogense der AMD untersucht werden kann. KW - Senile Makuladegeneration / Pigmentepithel / Genexpression KW - RPE KW - AMD KW - RPE specific genes Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7053 ER -