TY - JOUR A1 - Puetz, Stephanie M. A1 - Vogiatzi, Fotini A1 - Stiewe, Thorsten A1 - Sickmann, Albert T1 - Malignant transformation in a defined genetic background: proteome changes displayed by 2D-PAGE N2 - Background: Cancer arises from normal cells through the stepwise accumulation of genetic alterations. Cancer development can be studied by direct genetic manipulation within experimental models of tumorigenesis. Thereby, confusion by the genetic heterogeneity of patients can be circumvented. Moreover, identification of the critical changes that convert a pre-malignant cell into a metastatic, therapy resistant tumor cell, however, is one necessary step to develop effective and selective anti-cancer drugs. Thus, for the current study a cell culture model for malignant transformation was used: Primary human fibroblasts of the BJ strain were sequentially transduced with retroviral vectors encoding the genes for hTERT (cell line BJ-T), simian virus 40 early region (SV40 ER, cell line BJ-TE) and H-Ras V12 (cell line BJ-TER). Results: The stepwise malignant transformation of human fibroblasts was analyzed on the protein level by differential proteome analysis. We observed 39 regulated protein spots and therein identified 67 different proteins. The strongest change of spot patterns was detected due to integration of SV40 ER. Among the proteins being significantly regulated during the malignant transformation process well known proliferating cell nuclear antigen (PCNA) as well as the chaperones mitochondrial heat shock protein 75 kDa (TRAP-1) and heat shock protein HSP90 were identified. Moreover, we find out, that TRAP-1 is already up-regulated by means of SV40 ER expression instead of H-Ras V12. Furthermore Peroxiredoxin-6 (PRDX6), Annexin A2 (p36), Plasminogen activator inhibitor 2 (PAI-2) and Keratin type II cytoskeletal 7 (CK-7) were identified to be regulated. For some protein candidates we confirmed our 2D-PAGE results by Western Blot. Conclusion: These findings give further hints for intriguing interactions between the p16-RB pathway, the mitochondrial chaperone network and the cytoskeleton. In summary, using a cell culture model for malignant transformation analyzed with 2D-PAGE, proteome and cellular changes can be related to defined steps of tumorigenesis. KW - Medizin Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68321 ER - TY - THES A1 - Diessner, Ernst Joachim T1 - Konstruktion eines Balanced lethal Systems für Salmonella typhi Ty21a T1 - Construction of a balanced lethal systems for Salmonella typhi Ty21a N2 - Ziel der Arbeit ist unter anderem die Entwicklung von Vakzinen gegen maligne Neoplasien auf der Basis von attenuierten Bakterien. Sie dienen hierbei als Träger von tumorspezifischen Antigenen. Diese können mit Hilfe des E. coli Hämolysin-a-Sekretionssystems von Salmonella-Bakterienstämmen sezerniert werden und eine spezifische Immunreaktion induzieren. Sowohl die Gene, die für das Sekretionssystem kodieren als auch die Gensequenzen des tumorspezifische Antigens sind bei dem Projekt auf dem detailliert beschriebenen Antigendelivery Plasmid pMO kodiert. Die bis dato angewandte Methode der pMO-Plasmidstabilisierung mit Hilfe von Antibiotikaresistenzgenen beinhaltet jedoch zahlreiche, beschriebene Probleme und wird seitens der Behörden in Impfstämmen zunehmend restriktiv gehandhabt. Im Rahmen der Entwicklung eines bakteriellen Tumorimpfstoffes war es daher das Ziel dieser Arbeit ein System zur Stabilisierung des Antigendelivery Plasmids pMO zu etablieren, das auf den Einsatz von Antibiotikaresistenzgenen verzichtet. N2 - Development of a system to stabilize plasmids in bacteria, by using a balanced lethal system, Development of tumor vaccines by using Salmonella bacteria KW - Salmonella KW - Balanced lethal Systeme KW - Stabilisierung von Plasmiden KW - Tumorvaccine KW - Immuntherapie KW - Balanced lethal Systeme KW - Salmonella typhi KW - Balanced lethal System KW - Salmonella typhi Ty21a KW - immunotherapy Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51638 ER - TY - THES A1 - Zanucco, Emanuele T1 - Role of oncogenic and wild type B-RAF in mouse lung tumor models T1 - Untersuchungen zur Rolle der onkogenen und wildtypischen B-RAF Kinase in Lungentumormodellen der Maus N2 - Von Wachstumsfaktoren regulierte Signalkaskaden sind Schlüsselelemente in der Gewebeentwicklung und Geweberegeneration. Eine Deregulation dieser Kaskaden führt zu Entwicklungsstörungen und neoplastischen Krankheiten. Für viele humane Krebsformen sind aktivierende Mutationen der Kinasen der RAF Familie verantwortlich. Das erste Projekt dieser Doktorarbeit fokussiert auf der Rolle des B-RAF V600E, welches als eine der am häufigsten vorkommenden Mutantionen in humanen Krebszellen identifiziert worden ist. Um die onkogene Funktion des B-RAF V600E zu untersuchen, haben wir transgene Mauslinien hergestellt, welche das aktivierte Onkogen spezifisch in alveolaren Lungenepithelzellen des Typ II exprimieren. Konstitutive Expression des B-RAF V600E führte zu einer abnormen alveolaren Epithelzellbildung und zu Emphysem-ähnlichen Läsionen. Diese Läsionen wiesen Zeichen einer Gewebsumstrukturierung auf, oft in Assoziation mit chronischer Inflammation und geringer Inzidenz von Lungentumoren. Die Infiltration der entzündlichen Zellen erfolgte erst nach der Entstehung von Emphysem-ähnlichen Läsionen und könnte zur späteren Tumorbildung beigetragen haben. Diese Ergebnisse unterstützen ein Modell, in welchem der kontinuierliche regenerative Prozess eine tumorfördernde Umgebung schafft. Dabei induziert die Aktivität des onkogenen B-RAF eine alveolare Störung, welche ursächlich verantwortlich ist für den kontinuierlichen regenerativen Prozess. Das zweite Projekt fokussiert auf die Rolle von endogenem (wildtypischen) B-RAF in einem durch onkogenes C-RAF induzierten Maus Lungentumormodell. Für unsere Untersuchungen haben wir eine Mauslinie geschaffen, in welcher B-RAF in den C-RAF Lungentumoren konditionell eliminiert werden kann. Eine konditionelle Eliminierung des B-RAF hat die Entstehung von Lungentumoren nicht blockiert, aber zu reduziertem Tumorwachstum geführt. Dieses reduzierte Tumorwachstum konnte auf eine reduzierte Zellproliferation zurückgeführt werden. Außerdem konnten wir durch die B-RAF Elimination eine Reduktion der Intensität der mitogenen Signalkaskade beobachten. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass das onkogene Potential von C-RAF in vivo unabhängig von B-RAF ist und eine Kooperation von B-RAF und C-RAF jedoch für die vollständige Aktivierung der mitogenen Signalkaskade wichtig ist. N2 - Growth factor induced signaling cascades are key regulatory elements in tissue development, maintenance and regeneration. Deregulation of the cascades has severe consequences, leading to developmental disorders and neoplastic diseases. As a major function in signal transduction, activating mutations in RAF family kinases are the cause of many human cancers. In the first project described in this thesis we focused on B-RAF V600E that has been identified as the most prevalent B-RAF mutant in human cancer. In order to address the oncogenic function of B-RAF V600E, we have generated transgenic mice expressing the activated oncogene specifically in lung alveolar epithelial type II cells. Constitutive expression of B-RAF V600E caused abnormalities in alveolar epithelium formation that led to airspace enlargements. These lung lesions showed signs of tissue remodeling and were often associated with chronic inflammation and low incidence of lung tumors. Inflammatory cell infiltration did not precede the formation of emphysema-like lesions but was rather accompanied with late tumor development. These data support a model where the continuous regenerative process initiated by oncogenic B-RAF-driven alveolar disruption provides a tumor-promoting environment associated with chronic inflammation. In the second project we focused on wild type B-RAF and its role in an oncogenic-C-RAF driven mouse lung tumor model. Toward this aim we have generated compound mice in which we could conditionally deplete B-RAF in oncogenic-C-RAF driven lung tumors. Conditional elimination of B-RAF did not block lung tumor formation however led to reduced tumor growth. The diminished tumor growth was not caused by increased cell death instead was a consequence of reduced cell proliferation. Moreover, B-RAF ablation caused a reduction in the amplitude of the mitogenic signalling cascade. These data indicate that in vivo B-RAF is dispensable for the oncogenic potential of active C-RAF; however it cooperates with oncogenic C-RAF in the activation of the mitogenic cascade. KW - Lungenkrebs KW - Biochemie KW - Maus KW - Lung cancer KW - RAF Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69603 ER - TY - THES A1 - Wruck, Robert T1 - Wachstums- und Sekretionsverhalten humaner fetaler Lungenfibroblasten nach Applikation von Gamma-Strahlung in vitro T1 - Growth and secretion behavior of human fetal lung fibroblasts after application of gamma-radiation in vitro N2 - Der wesentliche Dosis limitierende Faktor einer Strahlentherapie thorakaler Malignome ist die Strahlenempfindlichkeit des Lungenparenchymes, da sich mit einer Häufigkeit von 25-75 % aller Patienten ein Strahlenschaden des Lungengewebes entwickeln kann. Die Inzidenz einer Lungenfibrose nach 6- 12 Monaten liegt bei 15-30%. Die Kombination zytostatischer Medikamente mit ionisierender Strahlung kann die Ansprechraten verbessern, kann andererseits die Inzidenz einer Pneumonitis erhöhen. Die konkreten Mechanismen, die zu einer Pneumonitis und einer strahleninduzierten Fibrose führen, sind bislang noch nicht vollständig bekannt. Es wird vermutet, daß die ortsständigen Zellen der Lunge eine aktivere Rolle in der Pathogenese als bisher angenommen, einnehmen. Tiermodelle der Strahlenschädiung der Lunge zeigten ein sehr frühe Expression von TGF-ß-mRNA and fibronectin-mRNA nach Bestrahlung. TGF-ß und Fibronectin sind in der BALF und Serum von an thorakalen Malignomen erkrankten, strahlentherapeutisch behandelten Patienten erhöht. Neben Makrophagen und Typ II Pneumocyten als zelluläre Quellen der genannten Cytokine, sind Fibroblasten in der Lage beide Agentien in erheblichem Umfang zu synthetisieren. Ziele Um die aktive Rolle von Fibroblasten in der Pathogenese der strahleninduzierten Lungenfibrose in Abwesenheit von Entzündungszellen zu untersuchen, bestrahlten wir Lungenfibroblasten in vitro und beobachteten folgende Parameter. 1. Zellwachstum 2. Synthese von Fibronectin 3. Synthese von Kollagen ( Procollagen-I-Peptid) 4. Synthese von TGF-ß1 Methoden Humane fetale Lungenfibroblasten (MRC-5 ,ICN Biochemicals Eschwege ,Deutschland) wurden in DME Medium kultiviert unter Zugabe von 10% FCS plus L-Glutamine, Penicillin G , Amphotericin B und Gentamycin; Luftfeuchtigkeit 100% , Temperatur 37°, CO2 5%, Medienwechsel erfolgten zweimal wöchentlich und 24 Stunden vor den Messungen. 24h nach der Aussaat der Zellen erfolgte die Strahlenapplikation (CO 60; 4.5, 7.5, 10.5 Gy ). Messungen erfolgten an den Tagen 3,6,9,12,15 nach Bestrahlung. Hierfür wurden folgende Materialien verwandt. Fibronectin (ELISA), Takara TGF beta (ELISA), DPC Biermann Procollagen-I-Peptide (ELISA), Takara LDH ( kinetischer Assay), Sigma Cell counts (Zählkammer) Alle Messungen wurden zweimal unternommen. Ergebnisse: 1. Das Zellwachstum wurde dosisabhängig gehemmt. 2. Beginnend am 3 Tag stieg die Syntheserate des Fibronectin dosisabhängig. 3. Ähnliche Beobachtungen wurde bzgl der Procollagen-I-Peptid Synthese beobachtet. 4. TGF-ß Spiegel fanden sich nach Bestrahlung ab Tag 6 bis zum 4-fachen über dem Ausgangswert erhöht und kehrten ziwschen den Tagen 9 und 15 auf das Ausgangsniveau zurück. 5. Eine Erhöhung des LDH wurde nicht beobachtet. Dies zeigte, dass eine Zytolyse kein wesentlichen Einfluß hatte. Disskusion: Bei Bestrahlung humaner fetaler Lungenfibroblasten wird das Zellwachstum dosisabhängig limitiert. Dies wurde nicht durch einen strahlenbedingt erhöhten Zelltod hervorgerufen , da das bestimmte LDH ( ein Marker der Zytolyse) in den Zellkulturüberständen nicht erhöht war. Wir vermuten, das durch Bestrahlung eine Differenzierung von Progenitor Fibroblasten zu postmitotischen Fibrocyten erfolgte, wie auch bereits von anderen Arbeitsgruppen berichtet. TGF-ß fand sich nach Bestrahlung in den Zellkulturüberständen deutlich erhöht. Es wird angenommen , daß TGF-ß eine Schlüsselrolle in der Pathogenese fibrosierender Erkrankungen der Lunge, der Leber, der Niere spielt und ebenso in die Enstehung der durch ionisierende Bestrahlung hervorgerufene Lungenfibrose eingebunden ist. Unsere Experimente haben gezeigt , daß Fibroblasten in der Lage sind große Mengen TGF-ß and Fibronectin - sogar in Abwesenheit von Entzündungszellen- zu erzeugen und sich vermutlich autokrin stimulieren können. Dieser Mechanismus wird als wichtiger Co-Faktor in der Pathobiologie verschiedener zur Fibrose führender Lungenerkrankungen angenommen. Schlussfolgerung Fibroblasten produzieren erhöhte Mengen TGF-ß und Fibronectin nach Applikation ionisierender Strahlung. Sie könnten in der Pathogenese der Strahlenschädigung der Lunge eine aktivere Rolle spielen als bisher angenommen. N2 - Introduction The major dosis limiting factor of radiation therapy of thoracic malignomas is the lung which may develop radiation injury with a frequency of 25-70% of patients .The incidence of lung fibrosis after 6-12 months ist 15-30 %. Combination of cytostatic drugs with ionizid radiation can improve response rates, but may result in a higher incidence of pneumonitis. The exact mechanisms leading to pneumonitis and radiation induced fibrosis of the lung are yet unknown.The structural cells of the lung are of the lung are probably involved in the pathogenesis in a more active way than thougt until now. Animal models of radiation injury of the lung showed a very early expression of TGF-beta -mRNA and fibronectin-mRNA after irradiation. TGF-ß and Fibronectin were elevated in BALF and in serum. Macrophages and type-II-pneumocytes are thought to be the cellular source, but fibroblasts also are capable to synthesize both agents in large amounts. Aims In order to investigate the active role of fibroblasts in the pathogenesis of radiation fibrosis we irradiated human lung fibroblasts in vitro. We focused on following points: 1. cell growth 2. synthesis of fibronectin 3. synthesis of collagen (procollagen-I-peptid) 4. synthesis of TGF-beta-1 Methods Human fetal lung fibroblasts (MRC-5 ,ICN Biochemicals Eschwege ,Germany) cultured in DME-medium plus 10 % FCS plus L-glutamine, penicillin G, amphotericin B and gentamycine; air humidity 100 %, temp. 37°C, CO2 5%; change of medium twice weekly and 24 hr. before measurements. 24hrs. after seeding, application of ionizing radiation (CO 60; 4.5, 7.5, 10.5 Gy ). Measurements on day 3,6,9,12,15 after irradiation: Fibronectin (ELISA), Takara TGF beta (ELISA), DPC Biermann Procollagen-I-Peptide (ELISA), Takara LDH ( kinetic assay), Sigma Cell counts (counting chamber) All measurements have been done twice. Results 1. cell growth was inhibited in a dose dependent manner. 2. Beginning at day 3 cell related synthesis of fibronectin was increased depending on the dose of irradiation. 3. Similar observations were made in synthesis of procollagen-I-peptide. 4. TGF-beta levels were increased four fold after irradiation beginning on day 6 and returned to basal values between day 9 and 15 (the cells treated with 10.5 Gy were an exception. Here we found a furthermore higher secretion rate ). 5. No elevation of LDH was noticed, showing that cytolysis was not important in these effects. Discussion Irradiation of fetal human lung fibroblasts inihibited cell growth in a dose depend manner. This was not due to cell death initiated by ionizing rays, because LDH ( marker of cytolysis) was not elevated in culture supernatants. We assume that irradiation induces differentiation of progenitor-fibroblasts to promitotic fibrocytes as reported by other groups. TGF-beta was considerably elevated in culture supernatants after irradiation. TGF-beta is assumed to play a key role in fibrosing disease of lung, liver and kidney and may be involved in radiation induced lung fibrosis as well. Our experiments show, that fibroblasts are able to produce high amounts of TGF-beta and fibronectins - even if inflammatory cells are absent- and may stimulate themselves in an autocrine manner.This mechanism is thought to be an important co-factor in the pathobiology of different fibrosing disorders of the lung and may be important in radiation injury of the lung as well. Conclusion Fibroblasts produce increased amounts of TGF-beta and fibronectin after irradiation. They may play a more active role in the pathogenesis of radiation injury than thought up to now. KW - Ionisierende Strahlung KW - Strahlentherapie KW - Lungenfibrose KW - Fibroblast KW - Transforming Growth Factor beta 1 KW - Prokollagen KW - Fibronectin KW - Radiation KW - radiation therapy KW - pulmonary fibrosis KW - fibroblast KW - transforming growth factor beta 1 KW - procollagen KW - fibronectin Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70698 ER - TY - THES A1 - Sienerth, Arnold R. T1 - Regulation of anti-inflammatory cytokine IL-10 by the Polycomb Group Protein Bmi1 T1 - Regulation des anti-inflammatorischen Zytokines Il-10 durch das Polycomb Group Protein Bmi1 N2 - Macrophages are important effector cells of the innate and adaptive immune response and exert a wide variety of immunological functions which necessitates a high level of plasticity on the chromatin level. In response to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) or inflammatory signals macrophages undergo a process of cellular activation which is associated with morphologic, functional and biochemical changes. Toll-like receptors (TLR) are able to sense many different PAMPs. TLR4 is an important sensor for lipopolysaccharide (LPS) which elicits a major portion of the host’s inflammatory response through the activation of many different signaling pathways such as the NF-κB and the MAPK protein kinase pathways RASRAF- MEK-ERK, p38 and JNK. Polycomb group (PcG) proteins are well known chromatin modifiers which function in large complexes and are required to maintain chromatin structure in a transcriptionally repressed state. It has previously been shown that the PcG protein Bmi1 is phosphorylated by 3pK, a downstream effector kinase of the MAPK protein kinase pathways RAS-RAF-MEK-ERK, p38 and JNK. In this work I analyzed the role of Bmi1 as a downstream effector of MAPK signaling during macrophage activation. Unexpectedly a rapid up-regulation on the Bmi1 protein level was observed in bone marrow derived macrophages (BMDMs) after LPS treatment. The Bmi1 induction was associated with transient protein phosphorylation that occured downstream of MAPK signaling. LPS treatment of BMDMs in the absence of Bmi1 resulted in a pronounced increase of IL-10 secretion. This secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10 was associated with increased IL-10 mRNA levels. Furthermore, siRNA mediated knock down of Bmi1 in J774A.1 macrophages also resulted in elevated IL-10 mRNA levels in response to LPS. ChIP analysis revealed that Bmi1 binds to throughout the il-10 locus. Alternative activation of wild type BMDMs via concomitant TLR4 and FcγR activation which triggers high IL-10 expression is paralleled by an attenuated Bmi1 protein expression. These results identify Bmi1 as a repressor of IL-10 expression during activation of macrophages. N2 - Makrophagen sind wichtige Effektorzellen der angeborenen und adaptiven Immunantwort und üben eine große Fülle von immunologischen Funktionen aus. Deshalb benötigen sie eine hohe Plastizität auf Chromatinebene. Als Antwort auf pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) oder andere inflammatorische Signale machen Makrophagen einen zellulären Aktivierungsprozess durch, der mit morphologischen, funktionellen und biochemischen Veränderungen assoziiert ist. Toll-like Rezeptoren (TLR) sind fähig, solche PAMPs zu erkennen. Der TLR4 ist ein wichtiger Sensor für Lipopolysaccharid (LPS). LPS löst eine inflammatorische Antwort des Wirtes durch die Aktivierung vieler verschiedener Signalwege wie zum Beispiel des NF-κB Signalwegs und der MAPK Proteinkinasensignalwege RAS-RAFMEK- ERK, p38 und JNK aus. Polycomb Gruppen (PcG) Proteine arbeiten in großen Proteinkomplexen zusammen und werden benötigt, um das Chromatin in einem transkriptionell reprimierten Zustand beizubehalten. Es konnte gezeigt werden, dass das PcG Protein Bmi1 von 3pK, einer Effektorkinase der MAPK Proteinkinasensignalwege RAS-RAF-MEK-ERK, p38 und JNK, phosphoryliert wird. In meiner Doktorabeit analysierte ich die Rolle von Bmi1 als downstream-Effektor der MAPKSignaltransduktion während der Makrophagenaktivierung. Es wurde unerwarteterweise eine schnelle Induktion von Bmi1 auf Proteinebene in Knochenmarks-Makrophagen (BMDMs) beobachtet. Diese Induktion war MAPK-abhängig und mit einer transienten Proteinphosphorylierung assoziiert. Die LPS-Behandlung der BMDMs in Abwesenheit von Bmi1 hatte erhöhte IL-10 Sekretion zur Folge. Diese erhöhte Sekretion des antiinflammatorischen Zytokines IL-10 war mit erhöhten IL-10 mRNA Expression verbunden. Des Weiteren hatte ein Bmi1 siRNA-vermittelter Gen-Knockdown in J774A.1 Makrophagen eine erhöhte IL-10 mRNA-Expression zur Folge. ChIP Analysen haben gezeigt, dass Bmi1 am ganzen il-10-Locus verteilt binden kann. Eine TLR4 und FcγR vermittelte alternative Aktivierung von BMDMs, die mit hoher IL-10 Expression verbunden ist, führte zu einer attenuierten Bmi1 Proteinexpression. Diese Ergebnisse zusammengenommen weisen Bmi1 als Repressor von IL-10 während der Makrophagenaktivierung aus. KW - Interleukin 10 KW - Makrophage KW - Repression KW - Immunologie KW - Cytologie KW - Makrophage KW - Genregulation KW - Bmi1 KW - Polycomb KW - LPS KW - IL-10 KW - Bmi1 KW - Polycomb KW - LPS KW - IL-10 KW - Cell Biology KW - Immunology Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49990 ER - TY - THES A1 - Stark, Felix T1 - Funktionelle Untersuchungen zur Regulation der Protein Kinase CK2 durch Polyamine in Drosophila melanogaster und deren physiologische Bedeutung T1 - Functional analysis of the regulation of the protein kinase CK2 by polyamines in Drosophila melanogaster and its psyiological meaning N2 - Die heterotetramere Proteinkinase CK2 nimmt aufgrund der großen Anzahl und Diversität ihrer Substrate, sowie aufgrund ihrer Eigenschaft Signalwege miteinander zu vernetzen eine Sonderstellung innerhalb der Kinasen ein. CK2 beeinflusst Proliferation, Differenzierung und Apoptose, Prozesse an denen auch Polyamine und der MAPK-Signalweg beteiligt sind. Eine vor kurzem durchgeführte Arbeit beschreibt die Bindung von CK2 an das Gerüstprotein KSR und die Verstärkung des MAPK-Signalwegs durch Phosphorylierung von Raf-Proteinen in Vertebraten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CK2 auch in Drosophila mit KSR interagiert und das einzige in Drosophila vorhandene Raf-Potein (DRaf) in vitro phosphoryliert. Im Gegensatz zur Phosphorylierung der humanen B-Raf und C-Raf Proteine an Serin 446 bzw. Serin 338 innerhalb der „negative charge regulatory region“ (N-Region), führten Kinasereaktionen und Massenspektrometrische Untersuchungen zur Identifizierung von Serin 11 als CK2 Phosphorylierungsstelle in DRaf, während ein zu Serin 446 in B-Raf äquivalentes Serin in der N-Region in Drosophila nicht durch CK2 phosphoryliert wird. Durch Überexpression von DRaf sowie von zwei DRaf-Varianten bei denen Serin 11 durch Alanin oder Aspartat substituiert wurde (DRafS11A und DRafS11D) konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden, dass die Ladung an der Aminosäureposition 11 die Funktion von DRaf beeinflusst, wobei eine negative Ladung an dieser Stelle zur Phosphorylierung und Aktivierung der Effektorkinase Erk führt. Die Phosphorylierung durch CK2 ist unabhängig von regulatorischen Botenstoffen ("second messengers"), wird aber durch Bindung von Polyaminen moduliert. Intrazelluläre Polyamine entstammen zum grossen Teil dem zellulären Aminosäurekatabolismus und beeinflussen die Phosphorylierung von DRaf durch CK2 in vitro, wobei Spermin ein effizienter Inhibitor der Reaktion ist, während die Effekte von Putrescin und Spermidin gering sind. Auch in Drosophila Schneider S2 Zellen und in adulten weiblichen Fliegen hat Spermin einen inhibitorischen, CK2-abhängigen Effekt auf die Aktivierung von Erk. Ausserdem konnte gezeigt werden, dass Putrescin und Spermidin in der Lage sind die Aktivierung von Erk, im Vergleich zu Zellen die nur mit Spermin behandelt wurden, zu erhöhen. Das spricht dafür, dass die Phosphorylierung von DRaf und die davon abhängige Aktivierung von Erk durch CK2 von der Menge und Relation der verschiedenen Polyamine zueinander abhängt. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass der Polyaminmetabolismus über CK2 mit dem MAPK-Signalweg verknüpft ist. Nachdem Polyamine durch Aminosäurekatabolismus enstehen, kann auf diese Weise der MAPK-Signalweg in Abhängigkeit der Verfügbarkeit zellulärer Aminosäuren reguliert werden. Vorversuche zeigten eine Beeinflussung von Proliferation und Apoptose durch CK2 und Polyamine. Weitere Untersuchungen sind aber nötig um spezifische Einflüsse von Polyaminen und CK2 auf zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose aufzudecken. N2 - Because of its high number and diversity of substrates, as well as its ability to cross-link signalling pathways, the heterotetrameric protein kinase CK2 has an exceptional position within kinases. CK2 influences proliferation, differentiation and apoptosis, processes in which also polyamines and the MAPK-signalling pathway are involved. A recent publication delineates binding of CK2 to the scaffold protein KSR and the enhancement of the MAPK-signalling pathway by phosphorylation of Raf-proteins in vertebrates. In my thesis I could show that CK2 also interacts with KSR in Drosophila and phosphorylates the only existing Raf protein in Drosophila (DRaf) in vitro. In contrast to the phosphorylation of human B-Raf- and C-Raf-proteins on serine 446 respectively serine 338 within the "negative charge regulatory region" (N-region), kinase reactions and mass spectrometric analyses led to the identification of serine 11 as phosphorylation site in DRaf, whereas a serine in the N-region, which corresponds to serine 446 of B-Raf, is not phosphorylated by CK2 in Drosophila. In cell culture experiments overexpression of DRaf and two DRaf-variants, in which serine 11 was substituted by alanine or aspartate (DRafS11A and DRafS11D), revealed the charge at amino acid position 11 to affect the function of DRaf, with a negative charge leading to phosphorylation and activation of the effector kinase Erk. Phosphorylation by CK2 is independent of second messengers, whereas it is modified by binding of polyamines. Intracellular polyamines mainly derive from cellular amino acid catabolism and modulate the phosphorylation of DRaf by CK2 in vitro with spermine being an efficient inhibitor of the reaction, whereas the effects of putrescine and spermidine are minor. In Drosophila Schneider S2 cells and adult flies spermine inhibits the activation of Erk in a CK2-dependent way. Furthermore administration of putrescine and spermidine in combination with spermine leads to enhanced Erk activation in cells compared to cells that are treated with spermine. These results suggest that phosphorylation of DRaf and the subsequent activation of Erk by CK2 are dependent on the amount and relative concentrations of polyamines. Altogether the results of this work demonstrate a role for CK2 in linking polyamine metabolism to the MAPK-signalling pathway. Since polyamines derive from amino acid catabolism, the MAPK-signalling pathway can be regulated dependent on the availability of cellular amino acids. Preliminary experiments point to CK2- and polyamine-dependent effects on proliferation and apoptosis. Further investigations are necessary to reveal specific effects of polyamines and CK2 on cellular processes like proliferation, differentiation and apoptosis. KW - Protein Kinase CK2 KW - Polyamine KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Taufliege KW - Raf KW - MAPK-Signalweg KW - Drosophila melanogaster KW - DRaf KW - protein kinase CK2 KW - polyamines KW - MAPK signalling pathway KW - Drosophila melanogaster KW - DRaf Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57522 ER - TY - THES A1 - Götz, Andreas T1 - Replikation von enteroinvasiven Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium Stämmen in Epithelzellen unter besonderer Betrachtung des Kohlenstoffmetabolismus T1 - Replication of enteroinvasive Escherichia coli and Salmonella enterica Serovar Typhimurium strains in epithelial cells with particular examination of the carbon metabolism N2 - Schlagwörter: Salmonella , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium , Salmonellose , Escherichia coli , Shigella , Infektion , Bakterielle Infektion , Zellkultur , HeLa-Zelle , Apoptosis , Metabolismus , Stoffwechsel , Glucose , Glucosetransport , Glucosestoffwechsel , Katabolismus , Kohlenstoff , Kohlenstoffbedarf , Kohlenstoffhaushalt , Kohlenstoffstoffwechsel , Kohlenstoff-13 , Kohlenstoffisotop Salmonella Typhimurium und enteroinvasive E. coli (EIEC) sind fakultativ intrazelluläre Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Während erstere sich nach der Internalisierung durch eukaryotische Zellen normalerweise in einem spezialisierten Phagosom, der Salmonella-enthaltenden Vakuole (SCV), vermehren, replizieren EIEC im Zytoplasma der Wirtszellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst durch Mikroinjektion die Fähigkeit von S. Typhimurium 14028s untersucht, ebenfalls im Zytoplasma von Caco-2-Zellen replizieren zu können. Dabei wurde festgestellt, daß ein früher als S. Typhimurium 14028s WT bezeichneter Stamm eine Insertion eines Desoxythymidins an Position 76 des offenen Leserasters von rfbP trägt, einem Gen, dessen Protein an der LPS-Synthese beteiligt ist. Weiterhin synthetisierte dieser Stamm ein rauhes LPS. Aufgrund von Agglutination konnte der Rauh-Stamm nur mit geringem Erfolg mikroinjiziert werden. Hingegen lag 5 h nach der Mikroinjektion einer nicht invasiven Mutante von Salmonella mit vollständigem LPS der Anteil an Caco-2-Zellen, die mehr als 32 Bakterien enthielten, bei etwa 30 %. Der Anteil war 2-3 mal höher als bei früheren Mikroinjektionen in HeLa-Zellen. Daher wurde das Verhalten von HeLa-Zellen nach einer Infektion durch S. Typhimurium ΔsifA - einer Mutante, die aus der SCV ins Zytoplasma entkommt - untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die sifA-Mutante 10 h nach der Infektion die Aktivität der Caspasen 9 und 3 in HeLa-Zellen, aber nicht in Caco-2-Zellen induziert. In weiteren Versuchen wurde die Bedeutung von Glukose, Glukose-6-phosphat und Mannose als Kohlenstoffquellen für die extra- und intrazelluläre Replikation zweier Isolate enteroinvasiver E. coli und eines S. Typhimurium Stammes analysiert. Zu diesem Zweck wurden zunächst definierte Mutanten in den beiden wichtigsten Phosphoenolpyruvat-abhängigen Phosphotransferasesystemen (PTS) für die Aufnahme von Glukose und Mannose, ptsG und manXYZ, sowie im Antiporter für die Aufnahme von Glukose-6-phosphat, uhpT, konstruiert. Bei Wachstum im Minimalmedium mit Glukose als einziger C-Quelle waren die Generationszeiten aller ΔptsG- und ΔptsG, manXYZ-Mutanten im Vergleich zu den Wildstämmen deutlich verlängert. Ebenso wuchsen ΔmanXYZ-Mutanten bzw. ΔuhpT-Mutanten deutlich langsamer auf Mannose bzw. Glukose-6-phosphat. Jedoch ergaben sich hierbei Stamm-spezifische Unterschiede. So erreichte EIEC 4608-58 ΔuhpT in der stationären Phase eine ähnliche Zelldichte wie der Wildstamm in Gegenwart von Glukose-6-phosphat und eine ΔptsG, manXYZ-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnte immer noch effizient mit Glukose wachsen. Infektionsversuche mit Caco-2-Zellen zeigten weiterhin, daß die Deletion von ptsG zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasivität von EIEC 4608-58 führt, während sich die intrazellulären Generationszeiten aller hier untersuchten Mutanten kaum veränderten. Selbst die ΔptsG, manXYZ, uhpT-Dreifachmutanten der drei hier verwendeten Enterobakterien und die ΔptsG, manXYZ, glk-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnten immer noch in Caco-2-Zellen replizieren, wenn auch mit Stamm-spezifisch verringerten Geschwindigkeiten. 13C-Markierungsexperimente mit [U-13C6]-Glukose als Substrat ergaben jedoch, daß in der Tat alle hier untersuchten enterobakteriellen Wildstämme Glukose während der Replikation in Caco-2-Zellen unter Zellkulturbedingungen verwerten. Glukose-6-phosphat, Glukonat oder Fettsäuren konnten dagegen als wichtigste Kohlenstoffquellen für das intrazelluläre Wachstum ausgeschlossen werden. EIEC 4608-58 metabolisierte Glukose jedoch weniger effizient als EIEC HN280 und schien zudem noch zusätzlich C3-Substrate aus der Wirtszelle aufzunehmen. Das Markierungsmuster zeigte einen Stamm-spezifischen Kohlenstofffluß durch Glykolyse und/oder Entner-Doudoroff-Weg, Pentosephosphatzyklus, Citratzyklus und den anaplerotischen Reaktionen zwischen PEP und Oxalacetat. Mutanten mit Deletionen in ptsG und manXYZ konnten auf alternative C3-Substrate wechseln und glichen dies durch eine erhöhte Aufnahme von Aminosäuren aus den Wirtszellen aus. N2 - Salmonella Typhimurium and enteroinvasive E. coli (EIEC) are facultative intracellular bacteria belonging to the family of Enterobacteriaceae. After internalisation by eukaryotic cells Salmonella normally resides inside a specialised phagosome called Salmonella-containing vacuole (SCV) whereas EIEC replicates inside the cytosol of host cells. In this study the ability of S. Typhimurium 14028s to replicate inside the cytosol of Caco-2 host cells was investigated by microinjection. It was thereby observed that a formerly used strain also called S. Typhimurium 14028s WT harboured an insertion of one deoxythymidin at position 76 of the rfbP open reading frame, a gene whose protein is involved in the LPS biosynthesis. Furthermore this strain expressed a rough LPS. Due to agglutination the microinjection procedure of the rough strain had only little success. But the percentage of Caco-2 cells that harboured more than 32 bacteria was about 30 % 5 h after injection of a non invasive mutant of Salmonella expressing full-length LPS chains. This was 2-3 times higher than the results observed before using HeLa cells. Therefore, the behaviour of HeLa cells infected by S. Typhimurium ΔsifA - a mutant that escapes from the SCV into the cytosol - was studied. The results showed that the sifA mutant strain induced the activity of caspases 9 and 3 in HeLa cells 10 h after infection but not in Caco-2 cells. In further experiments the contribution of glucose, glucose 6-phosphate and mannose as carbon sources for extra- and intracellular growth of two enteroinvasive E. coli isolates and one S. Typhimurium strain was analysed. Therefore, defined mutants of the most important phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase systems (PTS) taking up glucose or mannose, i.e. ptsG and manXYZ, were constructed as well as mutants carrying a deletion of uhpT the antiporter for uptake of glucose 6-phosphate. During growth of the resulting ΔptsG and ΔptsG, manXYZ mutants in minimal medium with glucose as sole carbon source considerably longer generation times were observed. Likewise, ΔmanXYZ mutants and ΔuhpT mutants grew significantly slower on mannose or glucose 6-phosphate, respectively. But there were also strain specific differences. EIEC 4608-58 ΔuhpT reached a similar cell density as the wild-type strain during stationary phase when grown in the presence of glucose 6-phosphate and S. Typhimurium ΔptsG, manXYZ could still grow efficiently on glucose. Infections of Caco-2 cells showed that the deletion of ptsG increased the ability of EIEC 4608-58 significantly to adhere and invade these cells. But the intracellular generation times of all mutants under study were hardly changed. Even the triple mutants ΔptsG, manXYZ, uhpT of all three enterobacterial strains and the ΔptsG, manXYZ, glk mutant of S. Typhimurium 14028s were still able to replicate in Caco-2 cells, albeit at strain specific lower rates. 13C-Isotopologue profiling using [U-13C6]glucose as precursor revealed that in deed all analysed enterobacterial wild-type strains utilised glucose for their replication in Caco-2 cells under the applied conditions. Glucose 6-phosphate, gluconate and fatty acids could be ruled out as main carbon sources for intracellular growth. EIEC 4608-58 metabolised the applied glucose less efficiently than EIEC HN280 and seemed to take up C3-compounds from the host cells in addition to glucose. The labelling patterns reflected strain specific carbon fluxes via glycolysis and/or Entner-Doudoroff pathway, pentose phosphate pathway, citric acid cycle and the anaplerotic reactions between PEP and oxaloacetate. Mutants carrying deletions in ptsG and manXYZ switched to alternative C3-substrates and counterbalanced this by an increased uptake of amino acids from the host cells. KW - Escherichia coli KW - Intrazellulärraum KW - Salmonella typhimurium KW - Vermehrung KW - Kohlenstoffstoffwechsel KW - Salmonella KW - Salmonella enterica KW - Salmonella typhimurium KW - Salmonellose KW - Escherichia coli KW - Shigella KW - Infektion KW - Bakterielle Infektion KW - sifA KW - enteroinvasive KW - CaCo-2 cell KW - 13C-isotopologue profiling KW - microinjection Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57292 ER - TY - THES A1 - Obier, Nadine T1 - Defining the end of pluripotency in mouse embryonic stem cells T1 - Studien zum Ende der Pluripotenz in emrbyonalen Stammzellen der Maus N2 - Stammzellen mit ihrer besonderen Fähigkeit sich selbst zu erneuern und zu differenzieren stellen einen faszinierenden Zelltyp für Grundlagenforschung und angewandte Wissenschaften dar. Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen), die aus Zellen der inneren Zellmasse von Präimplantationsembryonen etabliert werden, können ekto-, meso- und endodermale Zelltypen sowie Keimzellen hervorbringen. Im Gegensatz dazu sind multipotente adulte Stammzellen in ihrem Entwicklungspotential eingeschränkt, sie differenzieren sich zu allen Zelltypen ihres Gewebes. Zum Beispiel hämatopoetische Stammzellen (HSZs), die sich in Blut-bildenden Geweben wie dem Knochenmark befinden, vermögen sich in alle Blutzellen zu differenzieren. Während der Differenzierung von Stammzellen ändert sich nicht deren Genom, sondern ihre epigenetische Regulation. Durch epigenetische Mechanismen werden Zelltypen mit verschiedensten Phänotypen und Funktionen generiert. Für Stammzelltherapien ist ein tieferes Verständnis des Zusammenhangs von Epigenom und zellulärer Funktion wichtig. Im Rahmen dieser Dissertation war es mein Ziel, differenzierende Stammzellkulturen auf ihre Genexpression, ihre Chromatinregulation und ihr Differenzierungspotiential hin zu analysieren. Um Histonmodifikationen, die einen möglichen Mechanismus epigenetischer Regulation darstellen, global untersuchen zu können, sind zunächst, durchusszytometrische Protokolle etabliert worden, die die Analyse einzelner Zellen ermöglichen sollten. Mit dieser Methode konnten reduzierte Levels von Histonazetylierung in differenzierten ES Zellen gezeigt werden. Im Gegensatz dazu beobachtete ich vergleichbare Levels von Histonazetylierung in unreifen und reifen Knochenmarkzellen. Zusätzlich untersuchte ich die Wirkung des Histondeazetylase-Inhibitors (HDI) Trichostatin A (TSA) auf Knochenmarkzellkulturen, in denen auch HSZs enhalten sind. Nach Behandlung mit TSA erhöhte sich der Anteil von Zellen mit in vitro und in vivo hämatopoetischer Aktivität, während vor allem differenzierte Zellen in Apoptose gingen. Außerdem wurde der Verlust der Pluripotenz in differenzierenden ES Zellkulturen untersucht. Marker-basierte Analysen und funktionelle Tests wurden mit ES Zellen durchgeführt, die kurzfristig in vitro differenziert wurden. Es stellte sich heraus, dass nach funktionellen Gesichtspunkten die Pluripotenz bereits nach 2 Tagen Differenzierung deutlich reduziert war, beurteilt anhand der Fähigkeit Kolonien zu bilden, embryoide Körperchen (EK) zu formieren und zu kontrahierenden Herzmuskelzelltypen zu differenzieren. Im Gegensatz dazu verringerte sich die Expression von Pluripotenzmarkern erst zu späteren Zeitpunkten. Ich habe weiterhin beobachten können, dass die Wahl des Differenzierungssystems (Aggregations-EK, klonale EKs oder als adhärente Einzelzellschicht) einen Einfluss auf den Fortschritt und die Homogenität der Differenzierung hatte. Um das Ende der Pluripotenz genauer zu untersuchen, wurden differenzierte ES Zellen zurück in ES Zellkulturbedingungen gebracht. Die Ergebnisse deuten an, dass 3 Tage differenzierte ES Zellen einen Punkt überschritten haben, an dem eine Rückkehr zur Pluripotenz allein durch Kulturbedingungen noch möglich ist. Durch die Behandlung mit HDIs starben selektiv differenzierte ES Zellen. Des Weiteren war es Ziel dieser Arbeit, den Einuss von EED - einer essentiellen Untereinheit des Histon-methylierenden Polycomb repressive complex 2 (PRC2) - auf das Chromatin und die Funktion von ES Zellen hin zu analysieren. ES Zellen ohne EED wiesen neben dem bereits bekannten Verlust der Trimethylierung von Histon 3 an Lysin 27 (H3K27me3), global reduzierte H3K9me3 Levels sowie erhöhte Histonazetylierung auf. Trotz typischer ES Zell-Morphologie und normaler Expression von Pluripotenzgenen, besaßen EED knockout (KO)ES Zellen eine veränderte Organisation der Heterochromatinstruktur im Zellkern, eine verlangsamte Chromatinmobilität und Probleme bei der Differenzierung. Zusammenfassend gewähren meine Daten Einblick in die epigenetische Regulation von Stammzellen. Im Besonderen konnte ich zeigen, dass die Behandlung mit HDIs für differenzierende Knochenmarkzellen und differenzierende ES Zellen nachteilig war und zu deren selektivem Zelltod führte. Die hier durchgeführten Analysen ergaben, dass ES Zellen nach 3 Tagen Differenzierung das Ende der Pluripotenz erreicht hatten. Schließlich zeigten die Versuche mit EED KO ES Zellen, dass sie sich zwar selbst erneuerten und morphologisch identisch mit wildtypischen ES Zellen waren, jedoch Defekte bei der Differenzierung besaßen. Dies deutet darauf hin, dass EED nicht nur für undifferenzierte ES Zellen wichtig ist, sondern auch während der Differenzierung von Bedeutung ist. N2 - Stem cells with the particular potential to self renew and to differentiate into multiple cell lineages are fascinating cell types for basic and applied research. Pluripotent embryonic stem (ES) cells are derived from the inner cell mass (ICM) of preimplantation embryos. Upon differentiation ES cells can give rise to cells of ecto-, meso- and endoderm including germ cells. In contrast, multipotent adult stem cells are more restricted in their differentiation outcomes,they differentiate into cells of their tissue of origin. For example, hematopoietic stem cells (HSCs) that reside in hemogenic tissues such as the bone marrow (BM) differentiate into hemato-/lymphoid cell lineages. Upon differentiation of stem cells not the genome, but the epigenetic regulation changes. Differentiation-associated epigenetic changes generate cell types with distinct phenotypes and functions. For stem cell-based therapies it is important to deeper understand the relation between epigenome and cellular function. In the scope of this thesis I aimed to analyze cultures of differentiating stem cells with respect to gene expression, chromatin regulation and differentiation potential. For the analysis of global histone modification levels, which represent one mechanism for epigenetic regulation, fow cytometric protocols were established that allow single cell measurements. By applying this methodology decreased histone acetylation levels were shown in differentiated ES cell populations. In contrast, comparable histone acetylation levels were observed in differentiated and undifferentiated BM cells. In addition, I investigated effects of the histone deacetylase (HDAC) inhibitor trichostatin A (TSA) on murine BM cells, comprising also HSCs. Upon TSA treatment the frequency of cells with in vitro and in vivo hematopoietic activity was increased, while lineage committed cells underwent apoptosis. Next, the loss of pluripotency was assessed in differentiating ES cell cultures. Using short-term in vitro differentiation protocols marker-based analyses and functional assays were performed.Functionally pluripotency was diminished after 2 days of differentiation as assessed by colony formation, embryoid body (EB) formation and cardiomyogenic differentiation approaches. In contrast, pluripotency marker expression was reduced at later time points. Further, the application of distinct differentiation systems (aggregation EB, clonal EB or monolayer (ML) culture) had an impact on the progression and homogeneity of differentiation cultures. To further study the end of pluripotency, differentiated ES cells were placed under ES cell culture conditions. The data suggest that 3 days differentiated ES cells had passed a point of no return and failed to regain Oct4-eGFP expression and that HDAC inhibitor treatment selectively killed differentiated ES cells. Finally, I aimed to study the effect of EED - a core subunit of the histone methylating Polycomb repressive complex 2 (PRC2) - on ES cell chromatin and function. ES cells lacking EED showed loss of histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3) accompanied by increased histone acetylation and reduced H3K9me3 levels. Despite typical ES cell morphology and pluripotency marker expression, EED knockout (KO) ES cells exhibited altered nuclear heterochromatin organization, delayed chromatin mobility and a failure in proper differentiation. Conclusively, my data provide insights into the epigenetic regulation of stem cells. Particularly, the results suggest that HDAC inhibitor treatment was detrimental for differentiated BM as well as for differentiated ES cells and that ES cells after 3 days of differentiation had lost pluripotency. Further, the data demonstrate that EED KO ES cells self renewed, exhibited morphology and pluripotency marker expression similar to wild type ES cells, but failed to differentiate. This indicates an important role of EED not only for undifferentiated but also for differentiating ES cells. KW - Stammzelle KW - Epigenetik KW - Pluripotenz KW - stem KW - epigenetic KW - pluripotency Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53722 ER - TY - THES A1 - Heisig, Martin T1 - Development of novel Listeria monocytogenes strains as therapeutic agents for targeted tumor therapy T1 - Entwicklung von neuen Listeria monocytogenes Stämmen zur Anwendung in der Tumortherapie N2 - Despite marked progress in development and improvement of cancer therapies the rate of cancer related death remained stable over the last years. Especially in treating metastases alternative approaches supporting current therapies are required. Bacterial and viral vectors have been advanced from crude tools into highly sophisticated therapeutic agents detecting and treating neoplastic leasions. They might be potent enough to fill in this therapeutic demand. In this thesis Listeria monocytogenes was investigated as carrier for targeted bacterial cancer therapy. One part of the study focussed on modification of a functional bacterial mRNA delivery system. Genomic integration of T7 RNA polymerase driving mRNA production allowed reduction to an one-plasmid-system and thereby partially relieved the growth retardation exerted by mRNA delivery. Importantly the integration allowed metabolic attenuation of the mRNA delivery mutant potentially enabling in vivo applications. Further expansion of the bacterial RNA delivery system for transfer of shRNAs was examined. Bacterial mutants producing high amounts of RNA containing shRNA sequences were constructed, however a functional proof of gene silencing on delivery in eukaryotic cell lines was not achieved. The second part of this thesis focussed on increasing tumor colonization by Listeria monocytogenes in vivo. Coating bacteria with antibodies against receptors overexpressed on distinct tumor cell lines enabled specific bacterial internalization into these cells in vitro. Optimization of the bacterial antibody coating process resulted in an up to 104-fold increase of intracellular bacteria. Combination of this antibody-mediated targeting with the delivery of prodrug-converting enzymes showed a cytotoxic effect in cell lines treated with the corresponding prodrug. Since incubation in murine serum completely abrogated antibodymediated bacterial internalization the antibodies were covalently linked to the bacteria for application in xenografted tumor mice. Bacteria coated and crosslinked in this manner showed enhanced tumor targeting in a murine tumor model demonstrating antibodymediated bacterial tumor targeting in vivo. Independent of antibody-mediated tumor targeting the intrinsic tumor colonization of different Listeria monocytogenes mutants was examined. Listeria monocytogenes ΔaroA ΔinlGHE colonized murine melanoma xenografts highly efficient, reaching up to 108 CFU per gram of tumor mass 7 days post infection. Taken together the presented data shows highly promising aspects for potential bacterial application in future tumor therapies. Combination of the delivery systems with antibodymediated- and intrinsic bacterial tumor targeting might open novel dimensions utilizing Listeria monocytogenes as therapeutic vector in targeted tumor therapy. N2 - Die Weiterentwicklung der Therapiemöglichkeiten bei Krebserkrankungen hat trotz deutlicher Fortschritte nicht zu einer grundsätzlichen Verringerung der krebsbedingten Sterberate geführt. Besonders in der Behandlung von Metastasen werden alternative Therapieansätze zur Unterstützung der etablierten Standardmethoden benötigt. Insbesondere bakterielle und virale Vektoren wurden von groben Werkzeugen zu hochtechnischen therapeutischen Instrumenten verfeinert und könnten in der Zukunft diese therapeutische Lücke schliessen. In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Anwendung von Listeria monocytogenes in der bakteriellen Tumortherapie untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde das bereits publizierte System zur bakteriellen Übertragung von mRNAs modifiziert. Die genomische Integration der T7 RNA Polymerase, welche die mRNA herstellt, erlaubte die Reduktion der Plasmidzahl und verringerte die Stoffwechselbelastung auf die RNA-übertragenden Bakterien. Diese Integration erlaubte zum ersten Mal die metabolische Attenuation von RNAübertragenden Listerien und ermöglicht damit den in vivo Einsatz dieser Stämme. Als Erweiterung zur bakteriellen mRNA Übertragung wurde die Übetragung von shRNAs untersucht. Obwohl große Mengen an bakteriellen RNAs nachgewiesen wurden, die die shRNA Sequenz enthielten, konnte nach Infektion eukaryotischer Zellen mit diesen Bakterienmutanten keine funktionale Genregulation nachgewiesen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mit verschiedenen Methoden die Kolonisierung von Tumoren durch Listeria monocytoges verbessert. Durch Beladung der Bakterien mit Antikörpern gegen Rezeptoren, die auf bestimmten Tumorzellen überexprimiert werden, wurde die bakterielle Internalisierung in diese Zelllinien ermöglicht. Durch Optimierung des Antikörper-Beladungsprozesses konnte die Antikörper-vermittelte bakterielle Internalisierung auf das 104 fache der Kontrollen gesteigert werden. In Verbindung mit der Übertragung von Enzymen, die Medikamentenvorstufen in cytotoxische Medikamente umwandeln, konnten in Zellen, die mit der Medikamentenvorstufe inkubiert wurden, zytotoxische Effekte beobachtet werden. Da aber die Behandlung Antikörper-beladener Bakterien mit murinem Serum die spezifische Internalisierung vollständig verhindert, wurden die Antikörper für die Anwendung in Xenograft Tumormäusen kovalent an die Bakterien gebunden. Auf diese Weise behandelte Bakterien zeigten eine verbesserte Tumorzielsteuerung bei Beladung mit tumorbindenden Antikörpern. Unabhängig von der Antikörper-vermittelten Tumorzielsteuerung wurde die Tumorkolonisation verschiedener Listeria monocytogenes Mutanten untersucht. Insbesondere Listeria monocytogenes ΔaroA ΔinlGHE kolonisierte Melanom-Xenograft Tumoren sehr effizient und erreicht bis zu 108 CFU pro Gramm Tumormasse. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit verschiedene vielversprechende Aspekte der bakteriellen Tumortherapie, die möglicherweise in Zukunft angewandt werden können. Durch Verbindung der RNA-Transfersysteme mit Antikörper-vermittelter- und intrinsischer Tumorzielsteuerung können neue Möglichkeiten für den Einsatz von Listeria monocytogenes als therapeutischer Vektor geschaffen werden. KW - Krebs KW - Therapie KW - Angewandte Mikrobiologie KW - bacterial cancer therapy KW - bacterial tumor targeting Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48628 ER - TY - THES A1 - Choi, Soon Won T1 - Analyse des neuralen Differenzierungspotentials androgenetischer muriner embryonaler Stammzellen in vitro und in vivo T1 - Analysis of the neural differentiation potential of androgenetic murine embryonic stem cells in vitro and in vivo N2 - Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) sind aufgrund ihrer Selbsterneuerung- und ihrer Multiliniendifferenzierungs-Fähigkeiten interessante Zelltypen sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die regenerative Medizin. Uniparentale Zygoten mit zwei väterlichen (androgenetisch: AG) oder zwei mütterlichen (gynogenetisch: GG; parthenogenetisch: PG) Genomen sind nicht in der Lage, lebensfähige Nachkommen zu entwickeln. Sie entwickeln sich jedoch erfolgreich bis zu Blastozysten, aus denen pluripotente ES Zellen abgeleitet werden können. Mit uniparentalen ES Zellen können zum Einen parent-of-origin-spezifische Einflüsse auf die Gewebeentwicklung untersucht und zum Anderen histokompatible und somit therapeutisch relevante Zellpopulationen generiert werden. Obwohl viele Aspekte des in vitro und in vivo Differenzierungspotenzials von PG ES Zellen aus mehreren Spezies in den zurückliegenden Jahren untersucht worden sind, ist das volle Differenzierungspotenzial von AG ES Zellen bisher nicht erschöpfend analysiert worden. Zellen der Inneren Zellmasse (ICM) von PG und AG Embryonen zeigten nach Blastozysteninjektion ortsspezifische Kontribution zur Gehirnentwicklung, wobei PG Zellen bevorzugt im Cortex und im Striatum lokalisierten, während sich AG Zellen verstärkt im Hypothalamus nachzuweisen waren. Aus AG und GG ES Zellen konnten zudem in vitro hämatopoetische Stammzellen differenziert werden, die nach Transplantation im Mausmodell tumorfrei das gesamte hämatopoetische System repopulierten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass AG ES Zellen ein mit N ES Zellen vergleichbares in vitro und in vivo Differenzierungspotential in der frühen neuralen Entwicklung besitzen. Das Ziel meiner Arbeit war es zu untersuchen, ob murine AG ES Zellen sich zu verschiedenen neuronalen Subtypen entwickeln können und ob sie tumorfrei neurale Zelltypen nach Transplantation bilden können. In dieser Studie wurden AG ES Zellen im Vergleich zu biparentalen (N) ES Zellen in vitro über Embryoid Bodies (EBs) zunächst zu pan-neuronalen Vorläuferzellen (pNPCs) und weiter zu Neuron- und Glialzell-Marker (ß-III Tubulin (Tuj-1), NeuN, TH und GFAP) positiven Zellen differenziert.. Weiterhin wurde das dopaminerge (DA) Differenzierungspotential von AG ES Zellen näher untersucht, indem sie in einem Ko-Kultursystem mit Stromazellen gerichtet differenziert wurden. Diese DA Neurone wurden durch semiquantitative RT-PCR Analysen und immunhistochemische Färbungen für DA Neuronen-spezifische Marker (TH, PITX3, Nurr1) charakterisiert. Darüber hinaus wurde der Imprinting-Status von neun ausgesuchten Loci in AG und N ES, pNPC und DA Zellkulturen durch real-time RT-PCR Analysen untersucht. Die hier analysierten Gene, die im Gehirn allelspezifisch exprimiert werden, zeigten in pNPCs eine parent-of-origin-spezifische Genexpression mit Ausnahme von Ube3a. Nach Blastozysteninjektion wurde die Bildung von DA Neuronen in AG und N fötalen chimären Gehirnen untersucht. Hier zeigte sich, dass TH- and PITX3-positive AG DA Neurone abgeleitet aus ES Zellen im Mittelhirn von E12.5 und E16.5 Chimären detektiert werden konnten. Diese fötalen chimären Gehirne zeigten eine verbreitete und gleichmäßige Verteilung der AG Donorzellen in den Arealen Cortex, Striatum und Hypothalamus. Stereotaktische Transplantationen von AG und N pNPCs in ein „Traumatic Brain Injury (TBI) Model“ zeigten zudem, dass frühe Differenzierungsstufen von AG und N pNPC-Kulturen häufig Teratome generierten. Durch die Transplantation von langzeitdifferenzierten AG oder N pNPC-Kulturen konnte jedoch ein tumorfreies Anwachsen neuronaler und glialer Zellen erreicht werden. Die immunhistochemische Auswertung von Transplantaten bezüglich der Donorzellkontribution im Gehirn erfolgten bis zu drei Monaten nach der Injektion. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass AG ES Zellen neurales Differenzierungspotential, speziell zur Bildung von DA Neuronen, besitzen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass langzeitdifferenzierte AG und N pNPCs nach Transplantation im traumatisierte Mausgehirnmodell tumorfrei anwachsen und anschließend zu neuralen Zellen differenzieren können. Trotz unbalancierter Genexpression von imprinted Genen lässt sich feststellen, dass AG ES Zellen therapeutisch relevant für zukünftige zelluläre Ersatzstrategien von Nervengewebe sein können. N2 - Pluripotent embryonic stem (ES) cells are interesting cell types both for basic research and for regenerative medicine because of their enormous self-renewal and multi-lineage differentiation capacity. Uniparental zygotes with two paternal (androgenetic: AG) or two maternal (gynogenetic: GG; parthenogenetic: PG) genomes are not able to develop into viable offsprings but develop successfully up to blastocysts, from which ES cells can be derived. Uniparental ES cells can be utilized to study parent-of-origin-specific influences on tissue development and histocompatible, and therapeutically-relevant cell populations could be generated from them. While many aspects of the in vitro and in vivo differentiation potential of PG uniparental ES cells were studied for several species, the capacity of AG ES cells have not been analyzed to the same extent. PG and AG inner cell mass (ICM) cells showed region-specific contribution in brain development following blastocyst injection. While PG cells were preferentially located in the cortex and the striatum, AG cells were most commonly found in the hypothalamus. Hematopoietic cells derived from AG and GG ES cells generated after transplantation long-term repopulating and tumor-free complete hematopoietic engraftments in irradiated transplant recipients. Furthermore, AG and N ES cells also show a comparable in vitro and in vivo neural differentiation potential during early development, The aim of the present study was to investigate whether AG ES cells can develop into specific neuronal subtypes, and whether they can form neural cell types after transplantation, lacking teratoma formation. In this study, AG ES cells and as controls biparental (N) ES cells were differentiated in vitro via embryoid bodies (EBs) into pan-neural progenitor cells (pNPCs) and consequently to cells which expressed a variety of neuron- and glial cell-specific markers, including ß-III tubulin (Tuj-1), NeuN, TH, and GFAP. Furthermore the dopaminergic (DA) differentiation potential of AG ES cells was investigated more closely, by directed neuronal differentiation of AG ES cells in a co-culture system with stromal cells. The resulting neurons were characterized by semi-quantitative RT-PCR analyses and immunohistochemical stainings for DA neuron-specific markers (TH, PITX3, Nurr1). Additionally, the imprinting status of nine selected loci in AG and N ES cell, pNPC and DA cell cultures was studied by real-time RT-PCR analyses. The genes analyzed here, known to be expressed allel-specific in the brain, maintained in pNPCs a parent-of-origin-specific gene expression with the exception of UBE3A.   Following blastocyst injection the formation of DA neurons was studied in the AG and N chimeric fetal brains. TH- and PITX3-positive DA neurons derived from ES AG cells in the midbrain of E12.5 and E16.5 chimeras were detected. These chimeric fetal brains showed a widespread and balanced distribution of AG cells in the brain areas Cortex, Striatum and Hypothalamus. Stereotactic transplantations of AG and N pNPCs in a "Traumatic Brain Injury (TBI) Model" showed that early neural differentiation stages of AG and N pNPC cultures tended to generate teratomas. Importantly, neuronal and glial tumor-free engraftments could be achieved by the transplantation of long-term differentiated AG or N pNPC cultures. The immunohistochemical assessment of the donor cell contribution of individual transplants was performed up to three months post-transplantation. The results presented here show that AG ES cells have DA neuronal differentiation potential, and that long-term differentiated AG and N pNPCs can engraft tumor-free in a brain injury model. In spite of imbalanced imprinted gene expressions my results suggest that AG ES cells could be therapeutically relevant for future cellular replacement strategies of neural tissues. KW - Deutschland / Stammzellgesetz KW - Dopaminerge Nervenzelle KW - Nervenzelle KW - Embryonale Stammzelle KW - Stammzelle KW - Embryonale Stammzelle KW - androgenetisch KW - Differenzierung KW - Imprinting KW - Transplantation KW - embryonic stem cell KW - androgenetic KW - differentiation KW - imprinting KW - transplantation Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48452 ER -