TY  - JOUR
A1  - Abda, Ebrahim M.
A1  - Krysciak, Dagmar
A1  - Krohn-Molt, Ines
A1  - Mamat, Uwe
A1  - Schmeisser, Christel
A1  - Förstner, Konrad U.
A1  - Schaible, Ulrich E.
A1  - Kohi, Thomas A.
A1  - Nieman, Stefan
A1  - Streit, Wolfgang R.
T1  - Phenotypic Heterogeneity Affects Stenotrophomonas maltophilia K279a Colony Morphotypes and \(\beta\)-Lactamase Expression
JF  - Frontiers in Microbiology
N2  - Phenotypic heterogeneity at the cellular level in response to various stresses, e.g., antibiotic treatment has been reported for a number of bacteria. In a clonal population, cell-to-cell variation may result in phenotypic heterogeneity that is a mechanism to survive changing environments including antibiotic therapy. Stenotrophomonas rnaltophilia has been frequently isolated from cystic fibrosis patients, can cause numerous infections in other organs and tissues, and is difficult to treat due to antibiotic resistances. S. maltophilia K279a produces the Li and L2 beta-lactamases in response to beta-lactam treatment. Here we report that the patient isolate S. rnaltophilia K279a diverges into cellular subpopulations with distinct but reversible morphotypes of small and big colonies when challenged with ampicillin. This observation is consistent with the formation of elongated chains of bacteria during exponential growth phase and the occurrence of mainly rod-shaped cells in liquid media. RNA-seq analysis of small versus big colonies revealed differential regulation of at least seven genes among the colony morphotypes. Among those, bleu and bla(L2) were transcriptionally the most strongly upregulated genes. Promoter fusions of b/a(L1) and b/a(L2) genes indicated that expression of both genes is also subject to high levels of phenotypic heterogeneous expression on a single cell level. Additionally, the comE homolog was found to be differentially expressed in homogenously versus heterogeneously bla(L2) expressing cells as identified by RNA(seq) analysis. Overexpression of cornE in S. maltophilia K279a reduced the level of cells that were in a bla(L2)-ON mode to 1% or lower. Taken together, our data provide strong evidence that S. maltophilia K279a populations develop phenotypic heterogeneity in an ampicillin challenged model. This cellular variability is triggered by regulation networks including b/a(L1), b/a(L2), and comE.
KW  - xanthomonas maltophilia
KW  - gram-negative bacteria
KW  - RNA-seq
KW  - pseudomas aeruginosa
KW  - antibiotic resistance
KW  - colony morphotypes
KW  - beta-lactamases
KW  - K279a
KW  - Stenotrophomonas maltophilia
KW  - phenotypic heterogeneity
KW  - persister cells
KW  - streptococcus pneumoniae
KW  - nosocomial pathogen
KW  - membrane vesicles
KW  - sinorhizobium fredii NGR234
KW  - red fluorescent protein
KW  - escherichia coli
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136446
VL  - 6
IS  - 1373
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Adelfinger, Marion
A1  - Gentschev, Ivaylo
A1  - de Guibert, Julio Grimm
A1  - Weibel, Stephanie
A1  - Langbein-Laugwitz, Johanna
A1  - Härtl, Barbara
A1  - Escobar, Hugo Murua
A1  - Nolte, Ingo
A1  - Chen, Nanhai G.
A1  - Aguilar, Richard J.
A1  - Yu, Yong A.
A1  - Zhang, Qian
A1  - Frentzen, Alexa
A1  - Szalay, Aladar A.
T1  - Evaluation of a New Recombinant Oncolytic Vaccinia Virus Strain GLV-5b451 for Feline Mammary Carcinoma Therapy
JF  - PLoS ONE
N2  - Virotherapy on the basis of oncolytic vaccinia virus (VACV) infection is a promising approach for cancer therapy. In this study we describe the establishment of a new preclinical model of feline mammary carcinoma (FMC) using a recently established cancer cell line, DT09/06. In addition, we evaluated a recombinant vaccinia virus strain, GLV-5b451, expressing the anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) single-chain antibody (scAb) GLAF-2 as an oncolytic agent against FMC. Cell culture data demonstrate that GLV-5b451 virus efficiently infected, replicated in and destroyed DT09/06 cancer cells. In the selected xenografts of FMC, a single systemic administration of GLV-5b451 led to significant inhibition of tumor growth in comparison to untreated tumor-bearing mice. Furthermore, tumor-specific virus infection led to overproduction of functional scAb GLAF-2, which caused drastic reduction of intratumoral VEGF levels and inhibition of angiogenesis.
In summary, here we have shown, for the first time, that the vaccinia virus strains and especially GLV-5b451 have great potential for effective treatment of FMC in animal model.
KW  - antibodies
KW  - cancer treatment
KW  - carcinomas
KW  - vaccinia virus
KW  - oncolytic viruses
KW  - viral replication
KW  - cell cultures
KW  - enzyme-linked immunoassays
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119387
VL  - 9
IS  - 8
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Afonso-Grunz, Fabian
A1  - Hoffmeier, Klaus
A1  - Müller, Sören
A1  - Westermann, Alexander J.
A1  - Rotter, Björn
A1  - Vogel, Jörg
A1  - Winter, Peter
A1  - Kahl, Günter
T1  - Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells
JF  - BMC Genomics
N2  - Background: 
The interaction of eukaryotic host and prokaryotic pathogen cells is linked to specific changes in the cellular proteome, and consequently to infection-related gene expression patterns of the involved cells. To simultaneously assess the transcriptomes of both organisms during their interaction we developed dual 3'Seq, a tag-based sequencing protocol that allows for exact quantification of differentially expressed transcripts in interacting pro-and eukaryotic cells without prior fixation or physical disruption of the interaction. 

Results: 
Human epithelial cells were infected with Salmonella enterica Typhimurium as a model system for invasion of the intestinal epithelium, and the transcriptional response of the infected host cells together with the differential expression of invading and intracellular pathogen cells was determined by dual 3'Seq coupled with the next-generation sequencing-based transcriptome profiling technique deepSuperSAGE (deep Serial Analysis of Gene Expression). Annotation to reference transcriptomes comprising the operon structure of the employed S. enterica Typhimurium strain allowed for in silico separation of the interacting cells including quantification of polycistronic RNAs. Eighty-nine percent of the known loci are found to be transcribed in prokaryotic cells prior or subsequent to infection of the host, while 75% of all protein-coding loci are represented in the polyadenylated transcriptomes of human host cells.

Conclusions: 
Dual 3'Seq was alternatively coupled to MACE (Massive Analysis of cDNA ends) to assess the advantages and drawbacks of a library preparation procedure that allows for sequencing of longer fragments. Additionally, the identified expression patterns of both organisms were validated by qRT-PCR using three independent biological replicates, which confirmed that RELB along with NFKB1 and NFKB2 are involved in the initial immune response of epithelial cells after infection with S. enterica Typhimurium.
KW  - complete genome sequence
KW  - secretion systems
KW  - RNA-Seq
KW  - deepSuperSAGE
KW  - transcriptome
KW  - gene expression
KW  - serovar Typhimurium
KW  - human macrophages
KW  - epithelial cells
KW  - infection
KW  - SuperSAGE
KW  - receptors
KW  - Dual 3'seq
KW  - MACE
KW  - tag based
KW  - simultaneous
KW  - genome wide
KW  - gene expression profiling
KW  - host pathogen interaction
KW  - Salmonella enterica Typhimurium strain SL1344
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-143230
VL  - 16
IS  - 323
ER  - 
TY  - THES
A1  - Agarwal, Shruti
T1  - Functional characterization of four CDK-like kinases and one Calmodulin-dependent kinase of the human malaria parasite, Plasmodium falciparum
T1  - Funktionelle Charakterisierung von vier CDK-like kinasen und eine Calmodulin-dependent kinasen des human Malaria parasite, Plasmodium falciparum
N2  - Malaria still persists as one of the deadliest infectious disease in addition to AIDS and tuberculosis. lt is a leading cause of high mortality and morbidity rates in the developing world despite of groundbreaking research on global eradication of the disease initiated by WHO, about half a century ago. Lack of a commercially available vaccine and rapid spread of drug resistance have hampered the attempts of extinguishing malaria, which still leads to an annual death toll of about one million people. Resistance to anti-malarial compounds thus renders search for new target proteins imperative. The kinome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum comprises representatives of most eukaryotic protein kinase groups, including kinases which regulate proliferation and differentiation processes. Several reports till date have suggested involvement of parasite kinases in the human host and as well as in the mosquito vector. Kinases essential for life cycle stages of the parasite represent promising targets for anti-malarial compounds thus, provoking characterization of additional malarial kinases. Despite extensive research on most plasmodial enzymes, very little information is available regarding the four identified members of the cyclin dependent kinase like kinase (CLK) family. Thus, the present thesis dealt with the functional characterization of four members of the PfCLK kinase family of the parasite denoted as PfCLK-1/Lammer, PfCLK-2, PfCLK-3 and PfCLK-4 with a special focus on the first two kinases. Additionally, one Ca2+/Calmodulin dependent putative kinase-related protein, PfPKRP, presumed to be involved in sexual stage development of the parasite, was investigated for its expression in the life cycle of the parasite. In other eukaryotes, CLK kinases regulate mRNA splicing through phosphorylation of Serine/Arginine-rich proteins. Transcription analysis revealed abundance of PfCLK kinase genes throughout the asexual blood stages and in gametocytes. By reverse genetics approach it was demonstrated that all four kinases are essential for completion of the asexual replication cycle of P. falciparum. PfCLK 1/Lammer possesses two nuclear localization signals and PfCLK-2 possesses one of these signals upstream of the C-terminal catalytic domains. Protein level expression and sub-cellular localization of the two kinases was determined by generation of antiserum directed against the kinase domains of the respective kinase. Indirect immunofluorescence, Western blot and electron microscopy data confirm that the kinases are primarily localized in the parasite nucleus, and in vitro assays show that both enzymes are associated with phosphorylation activity. Finally, mass spectrometric analysis of co immunoprecipitated proteins shows interactions of the two PfCLK kinases with proteins, which have putative nuclease, phosphatase or helicase functions. PfPKRP on the other hand is predominantly expressed during gametocyte differentiation as identified from transcriptional analysis. Antiserum directed against the catalytic domain of PfPKRP detected the protein expression profile in both asexual and gametocyte parasite lysates. Via immunofluorescence assay, the kinase was localized in the parasite cytoplasm in a punctuated manner, mostly in the gametocyte stages. Reverse genetics resulted in the generation of PfPKRP gene-disruptant parasites, thus demonstrating that unlike CLK kinases, PfPKRP is dispensable for asexual parasite survival and hence might have crucial role in sexual development of the parasite. On one hand, characterization of PfCLK kinases exemplified the kinases involved in parasite replication cycle. Successful gene-disruption and protein expression of PfPKRP kinase on the other hand, demonstrated a role of the kinase in sexual stage development of the parasite. Both kinase families therefore, represent potential candidates for anti-plasmodial compounds.
N2  - Malaria stellt neben AIDS und Tuberkulose weiterhin eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten dar. Trotz intensiver, auf die Auslöschung der Krankheit abzielender Forschung, welche vor etwa 50 Jahren durch die Weltgesundheitsorganisation initiiert wurde, bleibt Malaria einer der Hauptgründe für hohe Mortalität und Morbidität in Entwicklungsländern. Das Fehlen eines Impfstoffes und die schnelle Ausbreitung von Resistenzen erschweren die Versuche, Malaria zu eliminieren, welche jährlich weiterhin eine Todesrate von einer Millionen Menschen aufweist. Aufgrund der Zunahme an Resistenzen ist die Suche nach neuen Angriffspunkten für Antimalariamedikamente zwingend erforderlich. Das Kinom des humanpathogen Parasiten Plasmodium falciparum besteht aus Vertretern der meisten eukaryotischen Proteinkinasegruppen, einschließlich einiger Kinasen, welche Proliferations- und Differenzierungsprozesse regulieren. Verschiedenen Berichten zufolge ist eine Rolle von Parasitenkinasen sowohl im menschlichen Wirt als auch in der die Krankenheit übertragende Mücke denkbar. Kinasen, welche für verschiedene Parasitenstadien essentiell sind, stellen viel versprechende Angriffspunkte für Malariamedikamente dar. Dies bestätigt die Bedeutung der Erforschung von weiteren, bisher uncharakterisierten Kinasen. Trotz extensiver Forschungsarbeit an den meisten Enzymen des Parasiten ist bisher sehr wenig über die vier identifizierten Mitglieder der Proteinfamilie Zyklin-abhängige Kinase-ähnlicher Kinasen (cyclin-dependent kinase like kinases, CLK) bekannt. Aufgrund dessen war die Charakterisierung der vier Mitglieder der PfCLK Kinasefamilie, PfCLK-1/PfLAMMER, PfCLK-2, PfCLK-3 und PfCLK-4 Bestandteil dieser Arbeit. Der Forschungsschwerpunkt lag hierbei auf den beiden erstgenannten Kinasen. Zusätzlich wurde die stadienspezifische Expression von PfPKRP, einer Kinase, welche vermutlich in der Entwicklung der Sexualstadien des Parasiten beteiligt ist, untersucht. In anderen Eukaryoten regulieren die CLK kinases das Spleißen von mRNA durch die Phosphorylierung von Serin-/Arginin-reichen Proteinen. Untersuchungen hinsichtlich der Expression der CLK kinase zeigten eine Transkriptabundanz in allen asexuellen Blutstadien sowie in Gametozyten. Mit Hilfe der Reverse-Genetics-Technik, wurde festgestellt, dass alle vier Kinasen essentiell sind für die asexuelle Replikation von P. falciparum. PfCLK-1/Lammer besitzt zwei Kernlokalisationssequenzen, während PfCLK-2 ein solches Signal stromaufwärts der C-terminalen katalytischen Domäne aufweist. Die Expression auf Proteinebene sowie die subzelluläre Lokalisation der beiden Kinasen wurde durch die Herstellung von Antiseren gegen die jeweilige Kinasedomainen hergestellt. Indirekte Immunfluoreszenzstudien, Westernblots und elektronenmikroskopische Daten bestätigten die Lokalisation vornehmlich in Zellkern des Parasiten. In-vitro-Studien demonstrierten, das beide Enzyme mit Phosphorylierungsaktivität assoziierte sind. Die massenspektrometrische Analyse von ko-immunopräzipitierten Proteinen zeigten Interaktionen der beiden PfCLK Kinasen mit Proteinen, welche vermutlich Nuklease-, Phosphatase- oder Helikase-Funktion besitzen. Im Gegensatz zu den CLK-Kinasen wird PfPKRP wird hauptsächlich während der Differenzierung der Gametozyten exprimiert wie Transkriptanalysen zeigten. Antiseren gegen die katalytische Domäne von PfPKRP detektierten jedoch Proteinexpression sowohl in Lysaten asexueller Parasiten als auch in Gametozytenlysaten. In Immunfluoreszenzstudien wurde ein punktiertes Expressionsmuster im Zytoplasma beobachtet, wobei die Expression vornehmlich in Gametozyten stattfand. Die Tatsache, dass die Herstellung einer PfPKRP-Knock out Mutante möglich war, zeigt, dass PfPKRP für das Überleben asexueller Parasiten entbehrlich ist, weshalb eine wichtige Rolle in der sexuellen Entwicklung der Parasiten möglich ist. Zum Einen dient die Charakterisierung der PfCLK-Kinasen als Beispiel für Kinasen, welche eine wichtige Rolle im Replikationszyklus der Parasiten spielen. Das erfolgreiche Ausschalten von PfPKRP sowie Untersuchungen zur Expression der PfPKRP-Kinase lassen zum Anderen eine Rolle in den Sexual- oder Transmissionstadien vermuten. Aufgrund dessen stellen beide Kinasefamilien viel versprechende Kandidaten für die Herstellung von malariamedikamenten dar.
KW  - Plasmodium falciparum
KW  - Kinasen
KW  - RNS-Spleißen
KW  - Malaria
KW  - Kinase
KW  - Calcium
KW  - Splicing
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48522
ER  - 
TY  - THES
A1  - Agarwal, Vaibhav
T1  - Role of PspC interaction with human polymeric immunoglobulin receptor and Factor H in Streptococcus pneumoniae infections and host cell induced signalling
N2  - Streptococcus pneumoniae ist ein Gram-positives Bakterium und ein Kommensale des humanen Nasenrachenraums. Pneumokokken sind andererseits auch die Verursacher schwerer lokaler Infektionen wie der Otitis media, Sinusitis und von lebensbedrohenden invasiven Erkrankungen. So sind Pneumokokken die wichtigsten Erreger einer ambulant erworbenen Pneumonie und sie sind häufige Verursacher von Septikämien und bakteriellen Meningitiden. Die initiale Phase der Pathogenese ist verbunden mit der Besiedelung der mukosalen Epithelzellen des Rachenraumes. Diese Kolonisierung erleichtert die Aufnahme der Bakterien in die Zelle bzw. deren Dissemination in submukosale Bereiche und den Blutstrom. Die Konversion des Kommensalen zu einem invasiven Mikroorganismus ist assoziiert mit der Anpassung des Krankheitserregers an die verschiedenen Wirtsnischen und wird auf der Wirtsseite durch die Zerstörung der transepithelialen Barriere begleitet. Die Anpassung des Erregers ist vermutlich ein in hohem Grade regulierter Prozess. Die Oberfläche von Streptococcus pneumoniae ist mit Proteinen bedeckt, die kovalent oder nicht kovalent mit der Zellwand verknüpft sind. Eine einzigartige Gruppe von Oberflächenproteinen in der Zellwand der Pneumokokken sind die cholinbindenden Proteine (CBPs). Für einige der CBPs konnte bereits die Bedeutung für die Virulenz gezeigt werden. PspC, auch als SpsA oder CbpA bezeichnet, ist ein multifunktionales Oberflächenprotein, das als Adhesin und Faktor H-Bindungsprotein eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Pneumokokken hat. PspC vermittelt als Adhesin die Anheftung der Bakterien an die mukosalen Epithelzellen, indem es human-spezifisch an die sekretorische Komponente (SC) des polymeren Immunoglobulinrezeptors (pIgR) bindet. SC ist die Ektodomäne des pIgR und PspC kann ebenso die freie SC binden oder an die SC des sekretorischen IgA Moleküls binden. PspC interagiert auch mit dem löslichen Komplement Faktor H. Die SC und der Faktor erkennen zwei verschiedene Epitope im bakteriellen PspC Protein. Der genaue Mechanismus der jeweiligen Interaktionen unter physiologischen- bzw. wirtspezifischen Bedingungen ist noch nicht vollständig verstanden. In dieser Arbeit wurde die Auswirkung der PspC Interaktion mit dem humanen pIgR (hpIgR) bzw. dem Faktor H auf die Virulenz der Pneumokokken und die Wirtszellantwort, d.h. die induzierten Signalkaskaden in den eukaryotischen Zellen untersucht. Die molekulare Analyse und die Verwendung von spezifischen pharmakologischen Inhibitoren der Signalmoleküle zeigten, dass verschiedene Signalmoleküle an der PspC-pIgR vermittelten Internalisierung beteiligt sind. Die Aktivierung, d.h. die Phosphorylierung der Signalmoleküle wurde in Immunblots demonstriert. Die Studien zeigten, dass das Aktinzytoskelett und die Mikrotubuli für die bakterielle Aufnahme essentiell sind. Es konnte auch zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass Cdc42 die entscheidende GTPase für die Invasion der Pneumokokken in die Wirtsepithelzellen, vermittelt über den PspC-hpIgR Mechanismus, ist. Der Einsatz von PI3-kinase und Akt Kinase Inhibitoren reduzierte signifikant die hpIgR-vermittelte Aufnahme der Pneumokokken in die Wirtszelle. Zusätzlich durchgeführte Infektionen von hpIgR exprimierenden Zellen zeigten eine zeitabhängige Phosphorylierung von Akt und der p85α Untereinheit der PI3-Kinase. Damit ist neben der GTPase Cdc42 der PI3K und Akt Signalweg entscheidend für die PspC-pIgR vermittelte Invasion der Pneumokokken. Des Weiteren sind an der Infektion mit Pneumokokken auch die Protein Tyrosin Kinasen Src, ERK1/2 und JNK beteiligt. Dabei wird die Src Kinase unabhängig von der PI3K in hpIgR exprimierenden Zellen aktiviert. Inhibitionsexperimente und genetische Knockdown Versuche mit siRNA bewiesen, dass die Endozytose der Pneumokokken über PspC-pIgR ein Clathrin und Dynamin abhängiger Mechanismus ist. Im weiterenn Teil der Arbeit wurde der Einfluss des PspC gebundenen Faktor H auf die Anheftung an und Invasion in die Epithelzellen analysiert. Die Bindung von Faktor H erfolgte unabhängig vom PspC-Subtyp. Die Bindungsversuche bewiesen, dass die Kapselmenge negativ korreliert mit der Bindung des Faktor H. Der Einsatz von Faktor H aus Maus oder Ratte zeigte keine typische Bindung. Daraus kann abgeleitet werden, dass diese Interaktion humanspezifisch ist. Die Infektionsexperimente demonstrierten, dass Faktor H die Adhärenz und die Invasion der Bakterien in die Nasenrachenraumzellen (Detroit562), alveolären Lungenepithelzellen (A549) und humanen Hirnendothelzellen (HBMEC) steigert. Der Faktor H hat Heparin Bindestellen. Diese Bindestellen vermitteln die Adhärenz der Faktor H gebundenen Pneumokokken mit Epithelzellen. Inhibitionsstudien mit spezifischen monoklonalen Antikörpern, die gegen die short consensus repeats (SCRs) von Faktor H gerichtet waren, konnten die essentielle Bedeutung der SCR19-20 für die Anheftung der Pneumokokken über Faktor H an die Wirtszellen nachweisen. Die Faktor H vermittelte Assoziation der Pneumokokken an polymorphonukleäre Leukozyten (PMNs) erfolgt über das Integrin CD11b/CD18. Die weiteren Inhibitionsstudien zeigten dann auch zum ersten Mal den Einfluss des Aktinzytoskeletts der Wirtszelle auf die Faktor H-vermittelten bakterieller Internalisierung und den dabei bedeutsamen Signaltransduktionswegen in der eukaryotischen Zelle. Dabei wurden insbesondere die Proteintyrosinkinasen und die PI3K als wichtige Signalmoleküle für die Faktor H vermittelte Invasion der Pneumokokken identifiziert. Die in dieser Arbeit erhaltenen Resultate belegen, dass die Faktor H vermittelte Infektion der Zellen mit S. pneumoniae ein konzertierter Mechanismus ist, bei dem Oberflächen-Glycosaminoglycane, Integrine und Signaltransduktionswege der Wirtsepithelzellen involviert sind. Des Weiteren wurde aufgezeigt, dass die PspC-pIgR-vermittelte Invasion in mukosale Epithelzellen unterschiedliche Signalwege wie z.B. den PI3K und Akt Weg induziert und abhängig von Cdc42 und einer Clathrin vermittelten Endozytosemechanismus ist.
N2  - Streptococcus pneumoniae (pneumococci) are Gram-positive bacteria and commensals of the nasopharyngeal cavity. Besides colonization, pneumococci are responsible for severe local infections such as otitis media, sinusitis and life-threatening invasive diseases, including pneumonia, sepsis and meningitis. The surface of pneumococci is decorated with proteins that are covalently or non-covalently anchored to the cell wall. The most unique group of cell wall associated proteins in pneumococci are the choline-binding proteins (CBPs). PspC, also known as SpsA or CbpA, is a multifunctional choline-binding protein that plays an essential role in pneumococcal pathogenesis by functioning as an adhesin. PspC promotes adherence of pneumococci to mucosal epithelial cells by interacting in a human specific manner with the free secretory component (SC) or to SC as part of the secretory IgA (SIgA) or polymeric immunoglobulin receptor (pIgR). PspC also interacts specifically with the soluble complement Factor H. Apparently, PspC uses two different epitopes for binding the soluble host protein Factor H and SC of pIgR. However, the mechanism by which these independent interactions facilitate pneumococcal infections under physiological and host specific conditions have not yet been completely elucidated. This study aims to explore the impact of the PspC interaction with human pIgR (hpIgR) or complement regulator Factor H on pneumococcal virulence. Here the cellular and molecular basis of PspC-mediated adherence to and invasion of host epithelial and endothelial cells was demonstrated. The genetic approach, specific pharmacological inhibitors and immunoblot analysis demonstrated the complexity of the induced signal transduction pathways during PspC-hpIgR mediated pneumococcal uptake by host cells. Inhibition studies with specific inhibitors of actin cytoskeleton and microtubules demonstrated that the dynamics of host cell cytoskeleton are essential for pneumococcal uptake by mucosal epithelial cells. Moreover, this study reports for the first time that the small GTPase Cdc42 is essential for pneumococcal internalization into epithelial cells via the PspC-hpIgR mechanism. In addition, in infection experiments performed in presence of specific inhibitors of PI3-kinase/Akt and protein tyrosine kinase (PTKs), hpIgR-mediated pneumococcal uptake by host cells was significantly blocked. Amongst PTKs the Src kinase pathway, ERK1/2 and JNK pathways were implicated during pneumococcal ingestion by hpIgR expressing cells. In addition, inhibition experiments performed in the presence of individual inhibitors or with a combination of inhibitors suggested the independent activation of PI3-kinase/Akt and Src kinase pathways during pneumococcal infections of hpIgR expressing cells. By employing specific inhibitors and siRNA in cell culture infection experiments it was further demonstrated that pneumococcal endocytosis by host epithelial cells via the PspC-hpIgR mechanism depends on clathrin and dynamin. PspC recruits also Factor H to the pneumococcal cell surface. Consequently, the impact of pneumococcal cell surface bound Factor H on adherence to host cells and the molecular mechanism facilitating the uptake of Factor H bound pneumococci by epithelial cells was investigated. Flow cytometry and immunoblots revealed that S. pneumoniae has evolved the ability to recruit both purified Factor H as well as Factor H from human plasma or serum. Moreover, it was demonstrated that the recruitment of Factor H is independent of the PspC-subtypes and that capsular polysaccharide (CPS) interferes with its recruitment. Factor H bound to pneumococci significantly increased bacterial attachment to and invasion of host epithelial cells including nasopharyngeal cells (Detroit562), lung epithelial cells (A549), and human brain-derived endothelial cells (HBMEC). Blocking experiments demonstrated that bacteria bound Factor H interacts via the heparin binding sites on Factor H with eukaryotic cell surface glycosaminoglycans and that this interaction promotes pneumococcal adherence to host cells. In addition, inhibition studies with mAbs recognizing specifically different short consensus repeats (SCR) of Factor H suggested that SCR 19-20 of Factor H are essential for the pneumococcal interaction with host epithelial cells via Factor H. In the presence of Factor H, attachment of pneumococci to human polymorphonuclear leukocytes (PMNs) is enhanced. The integrin CD11b/CD18 was identified as the cellular receptor on PMNs. By using pharmacological inhibitors the impact of host cell cytoskeleton and signalling molecules, such as PTKs and PI3-kinase, for Factor H-mediated pneumococcal internalization into eukaryotic cells was shown. Taken together, the results revealed that Factor-H mediated pneumococcal infection requires a concerted role of host epithelial cell surface glycosaminoglycans, integrins and host cell signalling pathways.
KW  - Streptococcus pneumoniae
KW  - Polymeric Immunoglobulin receptor
KW  - Factor H
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36526
ER  - 
TY  - THES
A1  - Agerer, Franziska
T1  - Integrin-vermittelte Invasion von Staphylococcus aureus in Säugerzellen
T1  - Integrin mediated internalisation of Staphylococcus aureus in human cells
N2  - Der Gram-positive Erreger Staphylococcus aureus ist ein Bestandteil der normalen Haut und Schleimhautflora des Menschen, kann aber auch ein weites Spektrum von Krankheitsbildern hervorrufen. Ein besonderes Charakteristikum dieses Pathogens besteht in der Expression von Oberflächenstrukturen, welche eine hohe Affinität für Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) von eukaryontischen Organismen aufweisen und die kollektiv als MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) bezeichnet werden. Das auf der Bakterienoberfläche gebundene Fn kann in der Folge als eine Art molekulare Brücke zwischen FnBP exprimierenden S. aureus und dem Fn-Rezeptor auf der Wirtszellseite, dem Integrin 51, dienen. Neben der Anheftung an das Wirtsgewebe kann die indirekte Assoziation mit Integrin 51 die Aufnahme der Bakterien durch die eukaryontische Zelle auslösen. Wie die bakterielle Adhäsion an Integrin 51 und die Aggregation der Integrine durch die mit Fn-beschichteten Bakterien in ein Signal zur Aufnahme der Pathogene durch die Zelle umgesetzt wird, ist nicht vollständig geklärt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein neues und effektives Protokoll zur fluoreszenzmikroskopischen Differenzierung von extra- und intrazellulären Bakterien entwickelt. Diese Methode besitzt den Vorteil, von Bakterien-spezifischen Antikörpern unabhängig zu sein. Dadurch bietet sich die Möglichkeit, Bakterien, gegen die es noch keine spezifischen Antiseren gibt, dennoch auf ihre zelluläre Lokalisation und Invasivität mittels mikrobiologischer Methoden untersuchen zu können. Im Hinblick auf die nähere Untersuchung der Signaltransduktion bei der Invasion von S. aureus war die kritische Rolle von Tyrosinkinasen für die Integrin-vermittelte Invasion ein erster wichtiger Hinweis. Diese Befunde führten zu weiteren spezifischeren Untersuchungen, wobei eine wichtige Rolle für Kinasen der Src Familie gezeigt werden konnte. Ein weiterer Hinweis auf die Bedeutung der Src-Kinasen für die Internalisierung von S. aureus war ein dramatischer Rückgang der Aufnahmerate in Src/Yes/Fyn-defizienten Maus-Fibroblasten, verglichen mit Src-rekonstituierten Zellen. Auf biochemischer Ebene konnte eine deutliche Aktivierung der Src-Kinase nach einer Infektion mit S. aureus, nicht aber nach Infektion mit dem nicht-pathogenen S. carnosus festgestellt werden. Integrin-reiche fokale Kontakte (FK) sind angereichert mit Proteinen wie Talin, Vinculin, Paxillin, Tensin, -Actinin oder Zyxin sowie Signalenzymen wie der Fokalen Adhäsions Kinase (FAK) oder Kinasen der Src Familie. Die Protein Tyrosin Kinase (PTK) FAK ist nach Integrinstimulierung eines der Schlüsselenzyme in FK. Dies war der Anlass nach der Bedeutung von FAK für die Integrin-vermittelte Internalisierung von S. aureus zu fragen. Ebenfalls ein wichtiger Hinweis waren die starken Rekrutierungen von Markerproteinen von fokalen Komplexen zum Ort von zellgebunden S. aureus nicht aber von S. carnosus. Daraufhin wurde mittels dominant-negativer FAK-Mutanten und FAKdefizienter Mausfibroblasten der Einfluss von FAK für die Internalisierung von S. aureus untersucht. Bei beiden Versuchsansätzen konnte ein starker Rückgang der Aufnahme beobachtet werden. Zusammengefasst bestätigten diese Ergebnisse die essentielle Rolle von FAK für die Integrin vermittelte Aufnahme der pathogenen S. aureus. Bei der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts spielen eine Reihe von Proteinen eine wichtige Rolle, darunter auch Cortactin. Cortactin ist ein bekanntes Substrat der Src-Kinasen und es lag nahe, nach einer funktionellen Verbindung von Src, FAK und Cortactin zu suchen. Dominant-negative Cortactin-Mutanten, die keine Assoziation mit dem Arp2/3 Komplex oder mit Dynamin aufweisen, oder welche die von Src-vermittelte Phosphorylierung am C-Terminus verhindern, blockierten die Aufnahme von S. aureus. Mikroskopisch konnte eine starke Rekrutierung von Cortactin zu zellgebundenen S. aureus beobachtet werden, jedoch wurde die Rekrutierung nicht von FAK beeinflusst. Die Phosphorylierung von Cortactin aufgrund S. aureus-Infektion war allerdings FAK- und Src-abhängig. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ine bisher unbeschriebene FAK/Src Cortactin Signalachse für die Regulation der Integrin-Internalisierung verantwortlich ist. Die detaillierten Untersuchungen der rezeptorvermittelten Aufnahme und der dabei induzierten Signaltransduktion in Wirtszellen gaben neue Erkenntnisse über die Pathogenitätsstrategien von S. aureus. Darüber hinaus ermöglichen diese Arbeiten neue Einblicke in die molekularen Vorgänge, welche die Internalisierung von Integrinen steuern.
N2  - The gram-positive bacterium S. aureus is part of the normal skin and mucosal flora of humans, but it can also give rise to a wide spectrum of infectious diseases. Virulence-associated features of this pathogen include surface structures that interact with extracellular matrix (ECM) proteins of eukaryotic organisms. These adhesins have been collectively termed MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules). Fibronectin (Fn) binding to bacterial FnBPs functions as a molecular bridge linking the pathogen to the principal cellular Fn receptor, the integrin 51. In addition to allowing adherence of the bacteria to the host cell surface, the clustering of integrins also leads to the internalization of the microorganisms. How the integrin engagement by the fibronectin-coated bacteria is transduced into the cell and how this signal initiates bacterial engulfment is poorly characterized. Therefore, the major aim of this work was to identify host components that regulate integrin-dependent internalization of pathogenic S. aureus. As a first step, a novel and elegant microscopic method for the evaluation of bacterial invasiveness into eukaryotic cells was developed. The protocol is based on differential fluorescent staining of extracellular and intracellular bacteria and allows quantification of bacterial invasiveness using a fluorescence microscope. The most important advance of this method is the fact, that the bacteria are covalently labeled and therefore, robust and invariant staining of the total bacterial population is achieved. In addition, the protocol does not rely on bacteria-specific antibodies making this the method of choice in case specific antisera against the pathogen are not available. Functional analysis of signaling pathways involved in the uptake process revealed an important role for protein tyrosine kinases (PTKs) during integrin-mediated internalisation of S. aureus. The important function of Src PTKs was further corroborated by the dramatic decrease of S. aureus uptake by Src/Yes/Fyn-deficient cells compared to Src-expressing cells. Biochemically, a significant activation of Src PTKs was observed in human epithelial cells in response to infection with S. aureus, whereas there was no activation after an infection with the non-pathogenic S. carnosus. Integrin-initiated focal contacts (FC) are enriched in specific marker proteins such as vinculin, paxillin, tensin, actinin, or zyxin as well as signaling enzymes including the focal adhesion kinase (FAK) or Src PTKs. In contrast to S. carnosus, contact of S. aureus with the eukaryotic host cell membrane resulted in strong recruitment of FC marker proteins to the site of adherent bacteria. To investigate the role of FAK for the internalization of S. aureus, dominantnegative FAK-mutants and FAK-deficient mouse cells were infected with the pathogen. In all cases, a major reduction in the number of internalized S. aureus was observed. Taken together these results demonstrated an essential role of FAK for the integrin-mediated uptake of S. aureus and suggested that an active FAK/Src complex regulates bacterial internalization via integrins. In a further approach, effectors of the FAK/Src complex and potential regulators of actin cytoskeleton dynamics during internalization of S. aureus were investigated. Biochemical analysis of infected cells revealed the actin-binding protein cortactin as a major tyrosine phosphorylated protein in response to pathogenic staphylococci. Furthermore, cortactin was recruited to the vicinity of cell-bound S. aureus, but not to S. carnosus. Various dominant-negative cortactin mutants that were either compromised in their association with the Arp2/3 complex or dynamin-2, or that lacked critical tyrosine phosphorylation sites in the C-terminal domain interfered with the uptake of S. aureus. As both FAK and cortactin are substrates of active Src kinases and both are responsive to integrin stimulation, it was hypothesized that there is a functional link between FAK, Src, and cortactin. Though the recruitment of cortacin to the vicinity of cell-bound S. aureus was not influenced by the presence of FAK, the phosphorylation status of cortactin after infection with S. aureus or after integrin stimulation by a fibronectin matrix was dependent on both FAK and Src. Together, these results reveal a novel FAK/Src-cortactin signalling axis regulating integrin internalisation. The detailed examination of the FnBP-triggered, integrin-mediated bacterial uptake offers new insight into the pathogenicity strategies of S. aureus and might open up novel avenues for therapeutic intervention. In addition, this work furthers our understanding of the molecular processes regulating the internalisation of integrins.
KW  - Staphylococcus aureus
KW  - Integrine
KW  - Infektion
KW  - Signaltransduktion
KW  - Invasion
KW  - S.aureus
KW  - Integrine
KW  - Signaltransduktion
KW  - invasion
KW  - S.aureus
KW  - integrin
KW  - signal transduction
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14557
ER  - 
TY  - THES
A1  - Albert-Weißenberger, Christiane
T1  - Regulation of the Flagellar Biogenesis in Legionella pneumophila
T1  - Die Regulation der Flagellenbiogenese in Legionella pneumophila
N2  - The bacterial pathogen Legionella pneumophila replicates intracellularly in protozoa, but can also cause severe pneumonia, called Legionnaires' disease. The bacteria invade and proliferate in the alveolar macrophages of the human lung. L. pneumophila bacteria exhibit a biphasic life cycle: replicative bacteria are avirulent; in contrast, transmissive bacteria express virulence traits and flagella. Primarily aim of this thesis was to evaluate the impact of the regulatory proteins FleQ, FleR, and RpoN in flagellar gene regulation. Phenotypic analysis, Western blot and electron microscopy of regulatory mutants in the genes coding for FleQ, RpoN and FleR demonstrated that flagellin expression is strongly repressed and that these mutants are non-flagellated in transmissive phase. Transcriptomic studies of these putative flagellar gene expression regulators demonstrated that fleQ controls the expression of numerous flagellar biosynthetic genes. Together with RpoN, FleQ controls transcription of 14 out of 31 flagellar class II genes, coding for the basal body, hook, and regulatory proteins. Unexpectedly, 7 out of 15 late flagellar genes class III and IV) are expressed dependent on FleQ but independent of RpoN. Thus, in contrast to the commonly accepted view that enhancer binding proteins as FleQ always interact with RpoN to initiate transcription, our results strongly indicate that FleQ of L. pneumophila regulates gene expression RpoN-dependent as well as RpoN-independent. Moreover, transcriptome analysis of a fleR mutant strain elucidated that FleR does not regulate the flagellar class III genes as previously suggested. Instead FleR regulates together with RpoN numerous protein biosynthesis and metabolic genes. Based on these experimental results our modified model for the transcriptional regulation of flagellar genes in L. pneumophila is that flagellar class II genes are controlled by FleQ and RpoN, while flagellar class III and IV genes are controlled in a fleQ-dependent but rpoN-independent manner. Although all L. pneumophila strains share the same complex life style, various pathotypes have evolved. This is reflected by the genomes, which contain e.g. genomic islands. The genomic island Trb-1 of L. pneumophila Corby, carries all genes necessary for a type-IV conjugation system, an integrase gene and a putative oriT site. The second aim of this thesis was to investigate the implication of this genomic island in conjugative DNA transfer. Using conjugation assays we showed that the oriT site located on Trb-1 is functional and contributes to conjugation between different L. pneumophila strains. As this is the first oriT site of L. pneumophila known to be functional our results provide evidence that conjugation is a major mechanism for the evolution of new pathotypes in L. pneumophila.
N2  - Das pathogene Bakterium Legionella pneumophila repliziert sich in der Natur intrazellulär in Protozoen. Beim Menschen kann das Bakterium eine schwere Pneumonie, die sogenannte Legionärskrankheit auslösen. Hierbei vermehren sich die Bakterien in Alveolarmakrophagen der Lunge. Der Lebenszyklus von L. pneumophila Bakterien ist gekennzeichnet durch zwei Phase: replikative Bakterien sind avirulent; im Gegensatz dazu sind transmissive Bakterien virulent und flagelliert. Hauptziel dieser Arbeit war es die Beteiligung der regulatorischen Proteins FleQ, FleR, and RpoN an der Flagellengenregulation zu ermitteln. Mutanten für die Gene welche für FleQ, FleR oder RpoN codieren exprimieren in der transmissiven Phase im Genesatz zum Wildtyp nur wenig Flagellin und sind nicht flagelliert. Nachgewiesen wurde dies durch eine phänotypische Analyse, Western blot und Ektronenmikroskopie. Studien des Transkripoms dieser Mutanten zeigten, daß FleQ die Expression zahlreicher Flagellenbiosynthesegenen kontrolliert. Gemeinsam mit RpoN kontrolliert FleQ die Transkription von 14 der 31 Klasse II Flagellengene, welche für Basalkörper, Haken und regulatorische Proteine codieren. Überraschenderweise sind 7 der 15 späten Flagellengenen (Klasse III und IV) abhängig von FleQ, aber unabhängig von RpoN exprimiert. Daher und entgegen der allgemeinen Auffassung dass sogenannte ‚enhancer binding' Proteine wie FleQ zur Transkriptionsinitiation immer mit RpoN interagieren, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass FleQ von L. pneumophila Genexpression sowohl RpoN-abhängig, als auch RpoN-unabhängig reguliert. Ebenso anders als zuvor vorgeschlagen, verdeutlichen Studien des Transkriptoms einer fleR Mutante, dass FleR nicht die Expression der Klasse III Flagellengene induziert. Statt dessen reguliert FleR gemeinsam mit RpoN zahlreiche Gene der Proteinbiosynthese und des Metabolismus. Basierend auf diesen experimentellen Ergebnissen sind in unserem modifizierten Modell für die transkriptionelle Regulation der L. pneumophila Flagellengene die Flagellengene der Klasse II von FleQ und RpoN kontrolliert, während die Flagellengene der Klasse III und IV in einer fleQ-abhängigen aber rpoN-unabhängigen Weise kontrolliert sind. Obwohl alle L. pneumophila Stämme den zweiphasigen Lebenszyklus aufweisen haben sich unterschiedliche Pathotypen evolviert. Das ist auch in den Genomen sichtbar, die z. B. genomische Inseln enthalten. Die genomische Insel Trb-1 von L. pneumophila Corby trägt alle Gene eines Typ-IV Konjugationssystem, ein ntegrase-Gen und einen putative oriT-Bereich. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es also zu untersuchen, inwieweit Trb-1 an konjugativem DNA-Transfer beteiligt ist. Mit Hilfe von Konjugationsexperimenten, zeigten wir, dass der oriT-Bereich von Trb-1 funktional ist und zur Konjugation zwischen verschiedenen L. pneumophila Stämmen beiträgt. Dies ist der erste oriT Bereich von L. pneumophila, dessen Funktionalität nachgewiesen wurde. Damit bekräftigen unsere Ergebnisse, dass Konjugation eine treibende Kraft für die Evolution neuer Pathotypen in L. pneumophila ist.
KW  - Legionella pneumophila
KW  - Genregulation
KW  - Legionella pneumophila
KW  - gene regulation
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34335
ER  - 
TY  - THES
A1  - Alzheimer, Mona
T1  - Development of tissue-engineered three-dimensional infection models to study pathogenesis of \(Campylobacter\) \(jejuni\)
T1  - Entwicklung dreidimensionaler Infektionsmodelle basierend auf Gewebezüchtung zur Erforschung der Pathogenese von \(Campylobacter\) \(jejuni\)
N2  - Infectious diseases caused by pathogenic microorganisms are one of the largest socioeconomic burdens today. Although infectious diseases have been studied for decades, in numerous cases, the precise mechanisms involved in the multifaceted interaction between pathogen and host continue to be elusive. Thus, it still remains a challenge for researchers worldwide to develop novel strategies to investigate the molecular context of infectious diseases in order to devise preventive or at least anti-infective measures. One of the major drawbacks in trying to obtain in-depth knowledge of how bacterial pathogens elicit disease is the lack of suitable infection models to authentically mimic the disease progression in humans. Numerous studies rely on animal models to emulate the complex temporal interactions between host and pathogen occurring in humans. While they have greatly contributed to shed light on these interactions, they require high maintenance costs, are afflicted with ethical drawbacks, and are not always predictive for the infection outcome in human patients. Alternatively, in-vitro two-dimensional (2D) cell culture systems have served for decades as representatives of human host environments to study infectious diseases. These cell line-based models have been essential in uncovering virulence-determining factors of diverse pathogens as well as host defense mechanisms upon infection. However, they lack the morphological and cellular complexity of intact human tissues, limiting the insights than can be gained from studying host-pathogen interactions in these systems. 
The focus of this thesis was to establish and innovate intestinal human cell culture models to obtain in-vitro reconstructed three-dimensional (3D) tissue that can faithfully mimic pathogenesis-determining processes of the zoonotic bacterium Campylobacter jejuni (C. jejuni). Generally employed for reconstructive medicine, the field of tissue engineering provides excellent tools to generate organ-specific cell culture models in vitro, realistically recapitulating the distinctive architecture of human tissues. The models employed in this thesis are based on decellularized extracellular matrix (ECM) scaffolds of porcine intestinal origin. Reseeded with intestinal human cells, application of dynamic culture conditions promoted the formation of a highly polarized mucosal epithelium maintained by functional tight and adherens junctions. While most other in-vitro infection systems are limited to a flat monolayer, the tissue models developed in this thesis can display the characteristic 3D villi and crypt structure of human small intestine. 
First, experimental conditions were established for infection of a previously developed, statically cultivated intestinal tissue model with C. jejuni. This included successful isolation of bacterial colony forming units (CFUs), measurement of epithelial barrier function, as well as immunohistochemical and histological staining techniques. In this way, it became possible to follow the number of viable bacteria during the infection process as well as their translocation over the polarized epithelium of the tissue model. Upon infection with C. jejuni, disruption of tight and adherens junctions could be observed via confocal microscopy and permeability measurements of the epithelial barrier. Moreover, C. jejuni wildtype-specific colonization and barrier disruption became apparent in addition to niche-dependent bacterial localization within the 3D microarchitecture of the tissue model. Pathogenesis-related phenotypes of C. jejuni mutant strains in the 3D host environment deviated from those obtained with conventional in-vitro 2D monolayers but mimicked observations made in vivo. Furthermore, a genome-wide screen of a C. jejuni mutant library revealed significant differences for bacterial factors required or dispensable for interactions with unpolarized host cells or the highly prismatic epithelium provided by the intestinal tissue model. Elucidating the role of several previously uncharacterized factors specifically important for efficient colonization of a 3D human environment, promises to be an intriguing task for future research. 
At the frontline of the defense against invading pathogens is the protective, viscoelastic mucus layer overlying mucosal surfaces along the human gastrointestinal tract (GIT). The development of a mucus-producing 3D tissue model in this thesis was a vital step towards gaining a deeper understanding of the interdependency between bacterial pathogens and host-site specific mucins. The presence of a mucus layer conferred C. jejuni wildtype-specific protection against epithelial barrier disruption by the pathogen and prevented a high bacterial burden during the course of infection. Moreover, results obtained in this thesis provide evidence in vitro that the characteristic corkscrew morphology of C. jejuni indeed grants a distinct advantage in colonizing mucous surfaces. 
Overall, the results obtained within this thesis highlight the strength of the tissue models to combine crucial features of native human intestine into accessible in-vitro infection models. Translation of these systems into infection research demonstrated their ability to expose in-vivo like infection outcomes. While displaying complex organotypic architecture and highly prismatic cellular morphology, these tissue models still represent an imperfect reflection of human tissue. Future advancements towards inclusion of human primary and immune cells will strive for even more comprehensive model systems exhibiting intricate multicellular networks of in-vivo tissue. Nevertheless, the work presented in this thesis emphasizes the necessity to investigate host-pathogen interactions in infection models authentically mimicking the natural host environment, as they remain among the most vital parts in understanding and counteracting infectious diseases.
N2  - In der heutigen Zeit tragen insbesondere durch pathogene Mikroorganismen ausgelöste Infektionskrankheiten zur sozioökonomischen Belastung bei. Obwohl bereits jahrzehntelang an der Entstehung von Infektionskrankheiten geforscht wird, bleiben in zahlreichen Fällen die genauen Mechanismen, welche an den vielfältigen Interaktionen zwischen Pathogen und Wirt beteiligt sind, unbeschrieben. Gerade deshalb bleibt es für Wissenschaftler weltweit eine Herausforderung, neue Strategien zur Untersuchung des molekularen Kontexts von Infektionskrankheiten zu entwickeln, um präventive oder zumindest anti-infektive Maßnahmen ergreifen zu können. In den meisten Fällen ist jedoch das Fehlen geeigneter Infektionsmodelle, mit denen der Krankheitsverlauf im Menschen authentisch nachgestellt werden kann, eines der größten Hindernisse um detailliertes Wissen darüber gewinnen zu können wie bakterielle Pathogene die Krankheit auslösen. 
Zahlreiche Studien sind dabei auf Tiermodelle angewiesen, um die komplexen zeitlichen Abläufe zwischen Wirt und Pathogen im menschlichen Körper nachzuahmen. Während diese Modelle in hohem Maß dazu beigetragen haben, Aufschluss über diese Abläufe zu geben, sind sie doch sehr kostenintensiv, mit ethischen Bedenken behaftet und können nicht immer die Folgen einer Infektion im menschlichen Patienten vorhersagen. Seit Jahrzehnten werden daher alternativ in-vitro 2D Zellkultursysteme eingesetzt, um den Verlauf von Infektionskrankheiten zu erforschen, welche die Bedingungen im menschlichen Wirt wiederspiegeln sollen. Diese auf Zelllinien basierenden Modelle sind essentiell in der Entdeckung von Virulenzfaktoren diverser Pathogene, aber auch in der Aufklärung von wirtsspezifischen Abwehrmechanismen. Dennoch fehlt ihnen die morphologische und zelluläre Komplexität von intaktem menschlichen Gewebe. Dadurch sind die Erkenntnisse, die mit diesen Systemen über Infektionsverläufe gewonnen werden können, limitiert. 
Die vorgelegte Arbeit konzentriert sich auf die Etablierung und Weiterentwicklung intestinaler, humaner Zellkulturmodelle, um dreidimensionales Gewebe in vitro zu rekonstruieren mit dem Ziel, Pathogenese-beeinflussende Prozesse des zoonotischen Bakteriums C. jejuni nachzustellen. Das Fachgebiet der Gewebezüchtung wird üblicherweise für rekonstruktive Medizin eingesetzt und bietet exzellente Mittel zur in-vitro Herstellung organspezifischer Zellkulturmodelle, welche die unverkennbare Mikroarchitektur humanen Gewebes realistisch nachempfinden können. Die in dieser Arbeit verwendeten Modelle basieren auf einem extrazellulären Matrixgerüst, das aus der Dezellularisierung von Schweinedarm gewonnen wurde. Durch die Wiederbesiedelung mit human Kolonzellen und der Kultivierung unter dynamischen Bedingungen entwickelte sich ein hochpolarisiertes mucosales Epithel, das durch funktionale Zell-Zell-Kontakte (tight und adherens junctions) aufrechterhalten wird. Während andere in-vitro Infektionssysteme meist durch die Präsenz einer flachen Zellschicht limitiert werden, entwickelt das in dieser Arbeit eingeführte Gewebemodell die für den menschlichen Dünndarm charakteristische Architektur aus Villi und Krypten. 
Zunächst wurden experimentelle Bedingungen für die Infektion eines zuvor entwickelten, statisch kultivierten Dünndarmmodells mit C. jejuni etabliert. Dies beinhaltete die erfolgreiche Isolierung koloniebildender Einheiten, die Messung der epithelialen Barrierefunktion, sowie immunhistochemische und histologische Färbetechniken. Dadurch konnte die Anzahl der Bakterien sowie deren Translokalisierung über das polarisierte Epithel während des Infektionsprozesses nachvollzogen werden. Außerdem konnte die Beeinträchtigung von Zell-Zell-Kontakten durch konfokale Mikroskopie und Permeabilitätsmessungen der epithelialen Barriere beobachtet werden. Neben der Bestimmung der Kolonisierungsrate von C. jejuni Isolaten und der dadurch hervorgerufenen spezifischen Zerstörung der epithelialen Barriere konnten die Bakterien auch innerhalb der 3D Mikroarchitektur des Gewebemodells lokalisiert werden. Außerdem konnte im Rahmen der 3D Gewebeumgebung beobachtet werden, dass Pathogenese-relevante Phänotypen von C. jejuni Mutantenstämmen im Vergleich zu konventionellen in-vitro 2D Zellschichten abwichen, diese aber dafür mit den in-vivo gemachten Beobachtungen übereinstimmten. Darüber hinaus wies die genomweite Suche einer C. jejuni Mutantenbibliothek signifikante Unterschiede zwischen bakteriellen Faktoren, die für die Interaktion mit nicht polarisierten Wirtszellen oder dem hochprismatischen Epithel des Gewebemodells bedeutsam oder entbehrlich waren, auf. Die Aufklärung der Funktion einiger bisher nicht charakterisierter Faktoren, die zu einer effizienten Kolonisierung menschlichen Gewebes beitragen, verspricht eine faszinierende Aufgabe für die zukünftige Forschung zu werden.
Die vorderste Verteidigungslinie gegen eindringende Pathogene bildet die schützende, viskoelastische Mukusschicht, die mukosale Oberflächen entlang des menschlichen Gastrointestinaltrakts überzieht. Mit der Entwicklung eines mukusproduzierenden Gewebemodells in der hier vorgelegten Arbeit gelang ein entscheidender Schritt zur Erforschung der Wechselbeziehungen zwischen bakteriellen Pathogenen und wirtsspezifischen Muzinen. Während des Infektionsverlaufs wurde das unterliegende Epithel durch die Anwesenheit der Mukusschicht vor der Zerstörung durch die Mikroben geschützt und eine erhöhte bakterielle Belastung verhindert. Darüber hinaus liefern die Resultate dieser Arbeit einen in-vitro Nachweis für den bakteriellen Vorteil einer spiralförmigen Morphologie, um muköse Oberflächen zu besiedeln. 
Zusammenfassend unterstreicht diese Arbeit das Potential der hier entwickelten Gewebemodelle, entscheidende Eigenschaften des menschlichen Darms in einem leicht zugänglichen in-vitro Infektionsmodell zu vereinigen. Der Einsatz dieser Modelle im Rahmen der Infektionsforschung bewies deren Fähigkeit in-vivo beobachtete Infektionsverläufe widerzuspiegeln. Während diese Infektionsmodelle bereits organotypische Architektur und hochprismatische Zellmorphologie aufweisen, ist ihre Darstellung von menschlichem Gewebe noch nicht perfekt. Durch den Einsatz von humanen Primär- und Immunzellen wird es in Zukunft möglich sein, noch umfassendere Modellsysteme zu entwickeln, die komplexe multizelluläre Netzwerke von in-vivo Geweben aufweisen. Nichtsdestotrotz verdeutlicht die hier vorgelegte Arbeit wie wichtig es ist, die Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen innerhalb von Infektionsmodellen zu erforschen, welche die natürliche Wirtsumgebung wiedergeben. Dies spielt eine entscheidende Rolle, um die Entstehung von Infektionskrankheiten nachvollziehen und ihnen entgegenwirken zu können.
KW  - Campylobacter jejuni
KW  - Tissue Engineering
KW  - Small RNA
KW  - 3D tissue model
KW  - Bacterial infection
KW  - 3D Gewebemodelle
KW  - Bakterielle Infektion
KW  - 3D cell culture
KW  - Infection models
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193440
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Alzheimer, Mona
A1  - Svensson, Sarah L.
A1  - König, Fabian
A1  - Schweinlin, Matthias
A1  - Metzger, Marco
A1  - Walles, Heike
A1  - Sharma, Cynthia M.
T1  - A three-dimensional intestinal tissue model reveals factors and small regulatory RNAs important for colonization with Campylobacter jejuni
JF  - PLoS Pathogens
N2  - The Gram-negative Epsilonproteobacterium Campylobacter jejuni is currently the most prevalent bacterial foodborne pathogen. Like for many other human pathogens, infection studies with C. jejuni mainly employ artificial animal or cell culture models that can be limited in their ability to reflect the in-vivo environment within the human host. Here, we report the development and application of a human three-dimensional (3D) infection model based on tissue engineering to study host-pathogen interactions. Our intestinal 3D tissue model is built on a decellularized extracellular matrix scaffold, which is reseeded with human Caco-2 cells. Dynamic culture conditions enable the formation of a polarized mucosal epithelial barrier reminiscent of the 3D microarchitecture of the human small intestine. Infection with C. jejuni demonstrates that the 3D tissue model can reveal isolate-dependent colonization and barrier disruption phenotypes accompanied by perturbed localization of cell-cell junctions. Pathogenesis-related phenotypes of C. jejuni mutant strains in the 3D model deviated from those obtained with 2D-monolayers, but recapitulated phenotypes previously observed in animal models. Moreover, we demonstrate the involvement of a small regulatory RNA pair, CJnc180/190, during infections and observe different phenotypes of CJnc180/190 mutant strains in 2D vs. 3D infection models. Hereby, the CJnc190 sRNA exerts its pathogenic influence, at least in part, via repression of PtmG, which is involved in flagellin modification. Our results suggest that the Caco-2 cell-based 3D tissue model is a valuable and biologically relevant tool between in-vitro and in-vivo infection models to study virulence of C. jejuni and other gastrointestinal pathogens.
KW  - in vitro
KW  - stem cells
KW  - invasion
KW  - host
KW  - adhesion
KW  - epithelial cells
KW  - translocation
KW  - virulence
KW  - responses
KW  - microenvironment
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229454
VL  - 16
IS  - 2
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Amich, Jorge
A1  - Krappmann, Sven
T1  - Deciphering metabolic traits of the fungal pathogen Aspergillus fumigatus: redundancy vs. essentiality
JF  - Frontiers in Microbiology
N2  - Incidence rates of infections caused by environmental opportunistic fungi have risen over recent decades. Aspergillus species have emerged as serious threat for the immunecompromised, and detailed knowledge about virulence-determining traits is crucial for drug target identification. As a prime saprobe, A. fumigatus has evolved to efficiently adapt to various stresses and to sustain nutritional supply by osmotrophy, which is characterized by extracellular substrate digestion followed by efficient uptake of breakdown products that are then fed into the fungal primary metabolism. These intrinsic metabolic features are believed to be related with its virulence ability. The plethora of genes that encode underlying effectors has hampered their in-depth analysis with respect to pathogenesis. Recent developments in Aspergillus molecular biology allow conditional gene expression or comprehensive targeting of gene families to cope with redundancy. Furthermore, identification of essential genes that are intrinsically connected to virulence opens accurate perspectives for novel targets in antifungal therapy.
KW  - Aspergillus fumigatus
KW  - aspergillosis
KW  - virulence
KW  - conditional promoter replacement
KW  - nutrients
KW  - gene family targeting
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123669
VL  - 3
ER  -