TY  - THES
A1  - Friedrich, Torben
T1  - New statistical Methods of Genome-Scale Data Analysis in Life Science - Applications to enterobacterial Diagnostics, Meta-Analysis of Arabidopsis thaliana Gene Expression and functional Sequence Annotation
T1  - Neue statistische Methoden für genomweite Datenanalysen in den Biowissenschaften - Anwendungen in der Enterobakteriendiagnostik, Meta-Analyse von Arabidopsis thaliana Genexpression und funktionsbezogenen Sequenzannotation
N2  - Recent progresses and developments in molecular biology provide a wealth of new but insufficiently characterised data. This fund comprises amongst others biological data of genomic DNA, protein sequences, 3-dimensional protein structures as well as profiles of gene expression. In the present work, this information is used to develop new methods for the characterisation and classification of organisms and whole groups of organisms as well as to enhance the automated gain and transfer of information. The first two presented approaches (chapters 4 und 5) focus on the medically and scientifically important enterobacteria. Its impact in medicine and molecular biology is founded in versatile mechanisms of infection, their fundamental function as a commensal inhabitant of the intestinal tract and their use as model organisms as they are easy to cultivate. Despite many studies on single pathogroups with clinical distinguishable pathologies, the genotypic factors that contribute to their diversity are still partially unknown. The comprehensive genome comparison described in Chapter 4 was conducted with numerous enterobacterial strains, which cover nearly the whole range of clinically relevant diversity. The genome comparison constitutes the basis of a characterisation of the enterobacterial gene pool, of a reconstruction of evolutionary processes and of comprehensive analysis of specific protein families in enterobacterial subgroups. Correspondence analysis, which is applied for the first time in this context, yields qualitative statements to bacterial subgroups and the respective, exclusively present protein families. Specific protein families were identified for the three major subgroups of enterobacteria namely the genera Yersinia and Salmonella as well as to the group of Shigella and E. coli by applying statistical tests. In conclusion, the genome comparison-based methods provide new starting points to infer specific genotypic traits of bacterial groups from the transfer of functional annotation. Due to the high medical importance of enterobacterial isolates their classification according to pathogenicity has been in focus of many studies. The microarray technology offers a fast, reproducible and standardisable means of bacterial typing and has been proved in bacterial diagnostics, risk assessment and surveillance. The design of the diagnostic microarray of enterobacteria described in chapter 5 is based on the availability of numerous enterobacterial genome sequences. A novel probe selection strategy based on the highly efficient algorithm of string search, which considers both coding and non-coding regions of genomic DNA, enhances pathogroup detection. This principle reduces the risk of incorrect typing due to restrictions to virulence-associated capture probes. Additional capture probes extend the spectrum of applications of the microarray to simultaneous diagnostic or surveillance of antimicrobial resistance. Comprehensive test hybridisations largely confirm the reliability of the selected capture probes and its ability to robustly classify enterobacterial strains according to pathogenicity. Moreover, the tests constitute the basis of the training of a regression model for the classification of pathogroups and hybridised amounts of DNA. The regression model features a continuous learning capacity leading to an enhancement of the prediction accuracy in the process of its application. A fraction of the capture probes represents intergenic DNA and hence confirms the relevance of the underlying strategy. Interestingly, a large part of the capture probes represents poorly annotated genes suggesting the existence of yet unconsidered factors with importance to the formation of respective virulence phenotypes. Another major field of microarray applications is gene expression analysis. The size of gene expression databases rapidly increased in recent years. Although they provide a wealth of expression data, it remains challenging to integrate results from different studies. In chapter 6 the methodology of an unsupervised meta-analysis of genome-wide A. thaliana gene expression data sets is presented, which yields novel insights in function and regulation of genes. The application of kernel-based principal component analysis in combination with hierarchical clustering identified three major groups of contrasts each sharing overlapping expression profiles. Genes associated with two groups are known to play important roles in Indol-3 acetic acid (IAA) mediated plant growth and development as well as in pathogen defence. Yet uncharacterised serine-threonine kinases could be assigned to novel functions in pathogen defence by meta-analysis. In general, hidden interrelation between genes regulated under different conditions could be unravelled by the described approach. HMMs are applied to the functional characterisation of proteins or the detection of genes in genome sequences. Although HMMs are technically mature and widely applied in computational biology, I demonstrate the methodical optimisation with respect to the modelling accuracy on biological data with various distributions of sequence lengths. The subunits of these models, the states, are associated with a certain holding time being the link to length distributions of represented sequences. An adaptation of simple HMM topologies to bell-shaped length distributions described in chapter 7 was achieved by serial chain-linking of single states, while residing in the class of conventional HMMs. The impact of an optimisation of HMM topologies was underlined by performance evaluations with differently adjusted HMM topologies. In summary, a general methodology was introduced to improve the modelling behaviour of HMMs by topological optimisation with maximum likelihood and a fast and easily implementable moment estimator. Chapter 8 describes the application of HMMs to the prediction of interaction sites in protein domains. As previously demonstrated, these sites are not trivial to predict because of varying degree in conservation of their location and type within the domain family. The prediction of interaction sites in protein domains is achieved by a newly defined HMM topology, which incorporates both sequence and structure information. Posterior decoding is applied to the prediction of interaction sites providing additional information of the probability of an interaction for all sequence positions. The implementation of interaction profile HMMs (ipHMMs) is based on the well established profile HMMs and inherits its known efficiency and sensitivity. The large-scale prediction of interaction sites by ipHMMs explained protein dysfunctions caused by mutations that are associated to inheritable diseases like different types of cancer or muscular dystrophy. As already demonstrated by profile HMMs, the ipHMMs are suitable for large-scale applications. Overall, the HMM-based method enhances the prediction quality of interaction sites and improves the understanding of the molecular background of inheritable diseases. With respect to current and future requirements I provide large-scale solutions for the characterisation of biological data in this work. All described methods feature a highly portable character, which allows for the transfer to related topics or organisms, respectively. Special emphasis was put on the knowledge transfer facilitated by a steadily increasing wealth of biological information. The applied and developed statistical methods largely provide learning capacities and hence benefit from the gain of knowledge resulting in increased prediction accuracies and reliability.
N2  - Die aktuellen Fortschritte und Entwicklungen in der Molekularbiologie stellen eine Fülle neuer, bisher kaum analysierter Daten bereit. Dieser Fundus umfasst unter Anderem biologische Daten zu genomischer DNA, zu Proteinsequenzen, zu dreidimensionalen Proteinstrukturen sowie zu Genexpressionsprofilen. In der vorliegenden Arbeit werden diese Informationen genutzt, um neue Methoden der Charakterisierung und Klassifizierung von Organismen bzw. Organismengruppen zu entwickeln und einen automatisierten Informationsgewinn sowie eine Informationsübertragung zu ermöglichen. Die ersten beiden vorgestellten Ansätze (Kapitel 4 und 5) konzentrieren sich auf die medizinisch und wissenschaftlich bedeutsame Gruppe der Enterobakterien. Deren Bedeutung für Medizin und Mikrobiologie geht auf ihre Funktion als kommensale Bewohner des Darmtraktes, ihre Nutzung als leicht kultivierbare Modellorganismen und auf die vielseitigen Infektionsmechanismen zurück. Obwohl bereits viele Studien über einzelne Pathogruppen mit klinisch unterscheidbaren Symptomen existieren, sind die genotypischen Faktoren, die für diese Unterschiedlichkeit verantwortlich zeichnen, teilweise noch nicht bekannt. Der in Kapitel 4 beschriebene umfassende Genomvergleich wurde anhand einer Vielzahl von Enterobakterien durchgeführt, die nahezu die gesamte Bandbreite klinisch relevanter Diversität darstellen. Dieser Genomvergleich bildet die Basis für eine Charakterisierung des enterobakteriellen Genpools, für eine Rekonstruktion evolutionärer Prozesse und Einflüsse und für eine umfassende Untersuchung spezifischer Proteinfamilien in enterobakteriellen Untergruppen. Die in diesem Kontext vorher noch nicht angewandte Korrespondenzanalyse liefert qualitative Aussagen zu bakteriellen Untergruppen und den ausschließlich in ihnen vorkommenden Proteinfamilien. In drei Hauptuntergruppen der Enterobakterien, die den Gattungen Yersinia und Salmonella sowie der Gruppe aus Shigella und E. coli entsprechen, wurden die jeweils spezifischen Proteinfamilien mit Hilfe statistischer Tests identifiziert. Zusammenfassend bilden die auf Genomvergleichen aufbauenden Methoden neue Ansatzpunkte, um aus der Übertragung der bekannten Funktionalität einzelner Proteine auf spezifische, genotypische Besonderheiten bakterieller Gruppen zu schließen. Aufgrund ihrer hohen medizinischen Relevanz war die Typisierung enterobakterieller Isolate entsprechend ihrer Pathogenität Ziel zahlreicher Studien. Die Microarray-Technologie bietet ein schnelles, reproduzierbares und standardisierbares Hilfsmittel für bakterielle Typisierung und hat sich in der Bakteriendiagnostik, Risikobewertung und Überwachung bewährt. Das in Kapitel 5 beschriebene Design eines diagnostischen Microarray beruht auf einer großen Anzahl verfügbarer Genomsequenzen von Enterobakterien. Ein hocheffizienter String-Matching-Algorithmus ist die Grundlage einer neuartigen Strategie der Sondenauswahl, die sowohl kodierende als auch nicht-kodierende Bereiche genomischer DNA berücksichtigt. Im Vergleich zu Diagnostika, die ausschließlich auf Virulenz-assoziierten Sonden beruhen, verringert dieses Prinzip das Risiko einer inkorrekten Typisierung. Zusätzliche Sonden erweitern das Anwendungsspektrum auf eine simultane Diagnostik der Antibiotikaresistenz bzw. eine Überwachung der Resistenzausbreitung. Umfangreiche Testhybridisierungen belegen eine überwiegende Zuverlässigkeit der Sonden und vor allem eine robuste Klassifizierung enterobakterieller Stämme entsprechend der Pathogruppen. Die Tests bilden zudem die Grundlage für das Training eines Regressionsmodells zur Klassifizierung der Pathogruppe und zur Vorhersage der Menge hybridisierter DNA. Das Regressionsmodell zeichnet sich durch kontinuierliche Lernfähigkeit und damit durch eine Verbesserung der Vorhersagequalität im Prozess der Anwendung aus. Ein Teil der Sonden repräsentiert intergenische DNA und bestätigt infolgedessen die Relevanz der zugrunde liegenden Strategie. Die Tatsache, dass ein großer Teil der von den Sonden repräsentierten Gene noch nicht annotiert ist, legt die Existenz bisher unentdeckter Faktoren mit Bedeutung für die Ausbildung entsprechender Virulenz-Phänotypen nahe. Ein weiteres Haupteinsatzgebiet von Microarrays ist die Genexpressionsanalyse. Die Größe von Genexpressionsdatenbanken ist in den vergangenen Jahren stark gewachsen. Obwohl sie eine Fülle von Expressionsdaten bieten, sind Ergebnisse aus unterschiedlichen Studien weiterhin schwer in einen übergreifenden Zusammenhang zu bringen. In Kapitel 6 wird die Methodik einer ausschließlich datenbasierten Meta-Analyse für genomweite A. thaliana Genexpressionsdatensätze dargestellt, die neue Erkenntnisse über Funktion und Regulation von Genen verspricht. Die Anwendung von Kernel-basierter Hauptkomponentenanalyse in Kombination mit hierarchischem Clustering identifizierte drei Hauptgruppen von Kontrastexperimenten mit jeweils überlappenden Expressionsmustern. In zwei Gruppen konnten deregulierte Gene wichtigen Funktionen bei Indol-3-Essigsäure (IAA) vermitteltem Pflanzenwachstum und -entwicklung sowie pflanzlicher Pathogenabwehr zugeordnet werden. Bisher funktionell nicht näher charakterisierte Serin-Threonin-Kinasen wurden über die Meta-Analyse mit der Pathogenabwehr assoziiert. Grundsätzlich kann dieser Ansatz versteckte Wechselbeziehungen zwischen Genen aufdecken, die unter verschiedenen Bedingungen reguliert werden. Bei der funktionellen Charakterisierung von Proteinen oder der Vorhersage von Genen in Genomsequenzen werden Hidden-Markov-Modelle (HMMs) eingesetzt. HMMs sind technisch ausgereift und in der computergestützten Biologie vielfach eingesetzt worden. Trotzdem birgt die Methodik das Potential zur Optimierung bezüglich der Modellierung biologischer Daten, die hinsichtlich der Längenverteilung ihrer Sequenzen variieren. Untereinheiten dieser Modelle, die Zustände, repräsentieren über ihre individuelle Verweildauer zugrunde liegende Verteilungen von Sequenzlängen. Kapitel 7 stellt eine Methode zur Anpassung einfacher HMM-Topologien an biologische Daten, die glockenkurvenartige Längenverteilungen zeigen, vor. Die Modellierung solcher Verteilungen wird dabei durch eine serielle Verkettung vervielfältigter Zustände gewährleistet, ohne dass die Klasse herkömmlicher HMMs verlassen wird. Auswertungen der Modellierungsleistung bei unterschiedlich stark optimierten HMM-Topologien unterstreichen die Bedeutung der entwickelten Topologieoptimierung. Zusammenfassend wird hier eine generelle Methodik beschrieben, die die Modelleigenschaften von HMMs über Topologieoptimierungen verbessert. Die Parameter dieser Optimierung werden mit Hilfe von Maximum-Likelihood und einem leicht einzubindenden Momentschätzer bestimmt. In Kapitel 8 wird die Anwendung von HMMs zur Vorhersage von Interaktionsstellen in Proteindomänen beschrieben. Wie bereits gezeigt wurde, sind solche Stellen aufgrund einer variablen Konserviertheit ihrer Position und ihres Typs schwer zu bestimmen. Eine Vorhersage von Interaktionstellen in Proteindomänen wird über die Definition einer neuen HMM-Topologie erreicht, die sowohl Sequenz- als auch Strukturdaten einbindet. Interaktionsstellen werden mit einem Posterior-Decoding-Algorithmus vorhergesagt, der zusätzliche Informationen über die Wahrscheinlichkeit einer Interaktion für alle Sequenzpositionen bereitstellt. Die Implementierung der Interaktionsprofil-HMMs (ipHMMs) basiert auf den etablierten Profil-HMMs und erbt deren Effizienz und Sensitivität. Eine groß angelegte Vorhersage von Interaktionsstellen mit ipHMMs konnte mutationsbedingte Fehlfunktionen in Proteinen erklären, die mit vererbbaren Krankheiten wie unterschiedlichen Tumortypen oder Muskeldystrophie assoziiert sind. Wie Profile-HMMs sind auch ipHMMs für groß angelegte Anwendungen geeignet. Insgesamt verbessert die HMM-gestützte Methode sowohl die Vorhersagequalität für Interaktionsstellen als auch das Verständnis molekularer Hintergründe bei vererbbaren Krankheiten. Im Hinblick auf aktuelle und zukünftige Anforderungen stelle ich in dieser Arbeit Lösungsansätze für eine umfassende Charakterisierung großer Mengen biologischer Daten vor. Alle beschriebenen Methoden zeichnen sich durch gute Übertragbarkeit auf verwandte Probleme aus. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf den Wissenstransfer gelegt, der durch einen stetig wachsenden Fundus biologischer Information ermöglicht wird. Die angewandten und entwickelten statistischen Methoden sind lernfähig und profitieren von diesem Wissenszuwachs, Vorhersagequalität und Zuverlässigkeit der Ergebnisse verbessern sich.
KW  - Genomik
KW  - Hidden-Markov-Modell
KW  - Enterobacteriaceae
KW  - Genexpression
KW  - Microarray
KW  - Sequenzanalyse
KW  - diagnostischer Microarray
KW  - Sequence Analysis
KW  - diagnostic Microarray
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39858
ER  - 
TY  - THES
A1  - Seo, Ean Jeong
T1  - Construction of recombinant E. coli Nissle 1917 (EcN) strains for the expression and secretion of defensins
T1  - Konstruktion von rekombinanten E. coli Nissle 1917 (EcN) Stämmen, die Defensine exprimieren bzw. sekretieren
N2  - Der probiotische Escherichia coli Stamm Nissle 1917 (EcN) ist eines der wenigen Probiotika, die als aktive Komponente eines Medikaments in mehreren Ländern zugelassen sind. Am besten ist die Wirksamkeit des EcN für die Remissionserhaltung von an Colitis Ulcerosa leidenden Patienten dokumentiert. Diese Fähigkeit ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass EcN in der Lage ist die Produktion des humanen beta-Defensins 2 (HBD2) mittels seiner Flagelle zu Induzieren. In dieser Studie wurden rekombinante EcN Stämme konstruiert, die ein Defensin zu produzieren vermögen. Zu diesem Zweck wurden Kodon-optimierte Defensingene in Expressionsplasmidvektoren kloniert, die entweder die Proform mit der Signalsequenz oder die reife Defensinform des humanen -Defensins 5 (HD5) oder des humanen -Defensins 2 (HBD2) unter der Kontrolle des T7-Promotors kodieren. Die Synthese dieser Defensine wurde mittels Western-Blot nach der Induktion der Expression und der Lyse der rekombinanten EcN Stämme demonstriert. Das rekombinante reife HBD2 mit einem N-terminalen His-Tag konnte mittels Ni-Säulen-Chromatographie aufgereinigt werden. Das so gewonnene HBD2 zeigte antimikrobielle Aktivität gegen E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes. In einem zweiten Ansatz wurde der Teil des HBD2-Gens mit dem yebF-Gen fusioniert, der das reife HBD2 kodiert. Das resultierende Fusionsprotein YebFMHBD2 wurde von dem entsprechenden EcN Stamm nach Induktion der Expression sekretiert. Die Präsenz von YebFMHBD2 im Medium war nicht das Ergebnis von Zellyse wie Western-Blots spezifisch für die -Galaktosidase und das Maltose-Bindeprotein mit dem Kulturüberstand zeigten. Dieser Kulturüberstand inhibierte das Wachstum von E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes nach Dialyse und Aufkonzentration sowohl in Agardiffusionsassays als auch in Flüssigcokultur. Damit konnte gezeigt werden, dass EcN ein für die Produktion von bestimmten humanen Defensinen geeignetes Probiotikum darstellt. EcN ist bei der Behandlung von Morbus Crohn Patienten nicht aktiv. Dies ist vermutlich in der genetisch bedingten Unfähigkeit zur ausreichenden Defensinproduktion solcher Individuen begründet. Als ein erster Schritt in der Entwicklung von alternativen Ansätzen zur Behandlung Morbus Crohn Patienten wurden in dieser Arbeit EcN Stämme konstruiert, die in der Lage sind HD5 oder HBD2 zu produzieren.
N2  - The probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) is one of the few probiotics licensed as a medication in several countries. Best documented is its effectiveness in keeping patients suffering from ulcerative colitis (UC) in remission. This might be due to its ability to induce the production of human beta defensin 2 (HBD2) in a flagellin-dependent way in intestinal epithelial cells. In contrast to ulcerative colitis, for Crohn´s disease (CD) convincing evidence is lacking that EcN might be clinically effective, most likely due to the genetically based inability of sufficient defensin production in CD patients. As a first step in the development of an alternative approach for the treatment of CD patients, EcN strains were constructed which were able to produce human alpha-defensin 5 (HD5) or beta-defensin 2 (HBD2). For that purpose codon-optimized defensin genes encoding either the proform with the signal sequence or the mature form of human alpha defensin 5 (HD5) or the gene encoding HBD2 with or without the signal sequence were cloned in an expression vector plasmid under the control of the T7 promoter. Synthesis of the encoded defensins was shown by Western blots after induction of expression and lysis of the recombinant EcN strains. Recombinant mature HBD2 with an N-terminal His-tag could be purified by Ni-column chromatography and showed antimicrobial activity against E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes. In a second approach, that part of the HBD2-gene which encodes mature HBD2 was fused with yebF gene. The resulting fusion protein YebFMHBD2 was secreted from the encoding EcN mutant strain after induction of expression. Presence of YebFMHBD2 in the medium was not the result of leakage from the bacterial cells, as demonstrated in the spent culture supernatant by Western blots specific for ß-galactosidase and maltose-binding protein. The dialyzed and concentrated culture supernatant inhibited the growth of E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes in radial diffusion assays as well as in liquid coculture. This demonstrates EcN to be a suitable probiotic E. coli strain for the production of certain defensins.
KW  - Escherichia coli
KW  - Probiotikum
KW  - Rekombinante DNS
KW  - Genexpression
KW  - Defensine
KW  - Probiotic
KW  - Recombinant defensins
KW  - E. coli Nissle 1917
KW  - HBD2
KW  - HD5
KW  - Antimicrobial activity
KW  - Secretion
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72005
ER  -