TY - THES A1 - Englert, Anne T1 - Modulation der Immunantwort humaner NK-Zellen nach Stimulation mit steigenden Konzentrationen von Aspergillus fumigatus T1 - Modulation of human NK-cells' immune response after stimulation with different concentrations of Aspergillus fumigatus N2 - Diese Arbeit beschäftigt sich mit den antimykotischen Eigenschaften von NK-Zellen und dient der Charakterisierung der Immunantwort gegenüber A. fumigatus in Abhängigkeit der MOI (Multiplizität der Infektion). Klinisch interessant ist dies bei immunsupprimierten Patienten mit invasiver Aspergillose. Anhand von Oberflächenmarkern konnten eine an die Pilzkonzentration angepasste Bindung und Aktivierung von NK-Zellen demonstriert werden. Daneben kam es zu einer Modulation der Freisetzung ausgewählter Zytokine nach Konfrontation mit steigenden Mengen von A. fumigatus. Besonders deutlich war der Effekt bei den Chemokinen CCL3 und CCL4, deren Zusammenhang mit Pilzinfektionen bereits gezeigt wurde. Die Ergebnisse zum MOI-abhängigen Verhalten von NK-Zellen gegenüber A. fumigatus bestätigen die Relevanz bei der antimykotischen Immunantwort und verdeutlichen, weshalb ihnen zunehmende diagnostische und therapeutische Bedeutung zukommt. N2 - The thesis focuses on the antifungal activity of NK-cells and characterizes the immune response towards A. fumigatus depending on the MOI (multiplicity of infection). This is of clinical interest regarding immunosuppressed patients suffering from invasive aspergillosis. Surface markers were used to demonstrate the binding and activation of NK cells adapted to the fungal concentration. In addition, the release of selected cytokines was modulated after confrontation with increasing amounts of A. fumigatus. The chemokine CCL3 and CCL4 that have already been described to be important during fungal infections showed the most impressive results. This study confirms the role of NK cells within the antifungal immune response and the increasing relevance for diagnosis and therapy. KW - Natürliche Killerzelle KW - Aspergillus fumigatus KW - natural killer cell Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202335 ER - TY - THES A1 - Hell, Dennis T1 - Development of self-adjusting cytokine neutralizer cells as a closed-loop delivery system of anti-inflammatory biologicals T1 - Entwicklung von selbstregulierenden Zytokin-Neutralisierer-Zellen als Closed-Loop Abgabesystem von anti-inflammatorischen Biologikals N2 - The current treatment strategies for diseases are assessed on the basis of diagnosed phenotypic changes due to an accumulation of asymptomatic events in physiological processes. Since a diagnosis can only be established at advanced stages of the disease, mainly due to insufficient early detection possibilities of physiological disorders, doctors are forced to treat diseases rather than prevent them. Therefore, it is desirable to link future therapeutic interventions to the early detection of physiological changes. So-called sensor-effector systems are designed to recognise disease-specific biomarkers and coordinate the production and delivery of therapeutic factors in an autonomous and automated manner. Such approaches and their development are being researched and promoted by the discipline of synthetic biology, among others. Against this background, this paper focuses on the in vitro design of cytokine-neutralizing sensor-effector cells designed for the potential treatment of recurrent autoimmune diseases, especially rheumatoid arthritis. The precise control of inducible gene expression was successfully generated in human cells. At first, a NF-κB-dependent promoter was developed, based on HIV-1 derived DNA-binding motives. The activation of this triggerable promoter was investigated using several inducers including the physiologically important NF-κB inducers tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin 1 beta (IL-1β). The activation strength of the NF-κB-triggered promoter was doubled by integrating a non-coding RNA. The latter combined expressed RNA structures, which mimic DNA by double stranded RNAs and have been demonstrated to bind to p50 or p65 by previous publications. The sensitivity was investigated for TNFα and IL-1β. The detection limit and the EC50 values were in in the lower picomolar range. Besides the sensitivity, the reversibility and dynamic of the inducible system were characterized. Hereby a close correlation between pulse times and expression profile was shown. The optimized NF-κB-dependent promoter was then coupled to established TNFα- and IL-1-blocking biologicals to develop sensor-effector systems with anti-inflammatory activity, and thus potential use against autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis. The biologicals were differentiated between ligand-blocking and receptor-blocking biologicals and different variants were selected: Adalimumab, etanercept and anakinra. The non-coding RNA improved again the activation strength of NF-κB-dependent expressed biologicals, indicating its universal benefit. Furthermore, it was shown that the TNFα-induced expression of NF-κB-regulated TNFα-blocking biologics led to an extracellular negative feedback loop. Interestingly, the integration of the non-coding RNA and this negative feedback loop has increased the dynamics and reversibility of the NF-κB-regulated gene expression. The controllability of drug release can also be extended by the use of inhibitors of classical NF-κB signalling such as TPCA-1. The efficacy of the expressed biologicals was detected through neutralization of the cytokines using different experiments. For future in vivo trials, first alginate encapsulations of the cells were performed. Furthermore, the activation of NF-κB-dependent promoter was demonstrated using co-cultures with human plasma samples or using synovial liquids. With this generated sensor-effector system we have developed self-adjusting cytokine neutralizer cells as a closed-loop delivery system for anit-inflammatory biologics. N2 - Die derzeitig üblichen Behandlungsstrategien von Krankheiten werden auf Basis diagnostizierter phänotypischer Veränderungen erhoben, die auf eine Ansammlung asymptomatischer Ereignisse in physiologischen Vorgängen zurückzuführen sind. Da die Feststellung einer Diagnose bislang erst in fortgeschrittenen Krankheitsstadien, vor allem aufgrund unzureichender Früherkennungsmöglichkeiten von physiologischen Störungen, erfolgen kann, sehen sich Ärzte gezwungen, Krankheiten vornehmlich zu behandeln anstatt ihnen vorzubeugen. Daher ist es erstrebenswert, wenn zukünftige therapeutische Interventionen bereits an die Früherkennung von physiologischen Veränderungen gekoppelt werden könnten. Sogenannte Sensor-Effektor Systeme sollen krankheitsspezifische Biomarker erkennen und die Produktion und Bereitstellung von therapeutischen Faktoren in einer selbstständigen und automatisierten Art und Weise koordinieren. Solche Ansätze und deren Entwicklung werden unter anderem durch die Disziplin der synthetischen Biologie erforscht und vorangetrieben. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich vor diesem Hintergrund auf das in vitro Design von Zytokin-neutralisierenden Sensor-Effektor Zellen, die für die potentielle Behandlung wiederkehrender Autoimmunerkrankungen, insbesondere der rheumatoiden Arthritis, konstruiert wurden. Die gezielte Ansteuerung zur induzierbaren Genexpression konnte in humanen Zellen erfolgreich generiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein NF-κB abhängiger Promoter zur induzierbaren Genexpression auf der Grundlage von HIV-1 abgleitenden DNA-Bindemotiven entwickelt. Die Aktivierbarkeit dieses Promoters wurde durch verschiedene Induktoren, insbesondere auch durch die physiologisch wichtigen NF-κB Aktivatoren Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) und Interleukin 1 beta (IL-1β) überprüft. Die Aktivierungsstärke des NF-κB abhängigen Promoters wurde durch die Integration einer nicht-kodierenden RNA verdoppelt. Diese RNA kombiniert Strukturelemente, die im RNA-Doppelstrang DNA-Strukturen imitieren, und für die in Vorarbeiten die Bindung an p50 oder p65 nachgewiesen werden konnten. Für TNFα und IL-1β lagen das Detektionslimit und die EC50 Werte der NF-κB getriggerten Genexpression im unteren pikomolaren Bereich. Neben der Sensitivität wurde das induzierbare System bezüglich seiner Reversibilität und Dynamik charakterisiert. Dabei konnte eine enge Korrelation zwischen Pulszeiten und Expressionsmustern aufgezeigt werden. Ferner wurde der NF-κB abhängige Promoter an etablierte TNFα- und IL-1-blockierende Biologicals gekoppelt, um Sensor-Effektor Systeme mit anti-entzündlicher Aktivität zu erhalten, die potentiell zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise der rheumatoiden Arthritis, eingesetzt werden könnten. Bei den Biologicals wurde zwischen Ligand-blockierenden und Rezeptor-blockierenden Biologicals differenziert und unterschiedliche Varianten ausgewählt: Adalimumab, Etanercept und Anakinra. Erneut verbesserte die zusätzliche Integration der nicht-kodierenden RNA die Aktivierungsstärke der NF-κB abhängig exprimierten Biologicals, das die universelle Nutzbarkeit des hier entwickelten optimierten NF-κB-Promoters unterstreicht. Ferner wurde gezeigt, dass die TNFα-induzierte Expression von NF-κB-regulierten TNFα-blockierenden Biologika zu einem extrazellulären negativen Feedback Loop führte. Interessanterweise hat die Integration der nicht-kodierender RNA und dieser negative Feedback Loop die Dynamik und Reversibilität der NF-κB-regulierten Genexpression erhöht. Die Kontrollierbarkeit der Wirkstoffabgabe kann zudem durch den Einsatz von Inhibitoren der klassischen NF-κB-Signalisierung wie z.B. TPCA-1 erweitert werden. Die Wirksamkeit der exprimierten Biologicals wurde durch Neutralisation der Zytokine in verschiedenen Experimenten nachgewiesen. Für zukünftige in vivo Versuche konnten erste Alginat-Verkapselungen der Zellen durchgeführt werden. Die Aktivierbarkeit des NF-κB abhängigen Promoters wurde ferner durch Ko-Kultivierung mit humanen Plasmaproben und Synovialflüssigkeiten nachgewiesen. Mit diesem generierten Sensor-Effektor-System haben wir selbstregulierende Zytokin-Neutralisierer-Zellen als Closed-Loop Abgabesystem von anit-inflammatorischen Biologikals entwickelt. KW - cell therapy KW - synthetic biology KW - designer cell KW - suppressor cells KW - closed-loop systems KW - autoimmune disease KW - rheumatoid arthritis KW - gene network KW - adalimumab KW - enbrel KW - etanercept KW - anakinra KW - Biologika KW - Autoaggressionskrankheit KW - Cytokine KW - in vitro Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175381 ER - TY - THES A1 - Kums, Juliane T1 - Entwicklung und Charakterisierung von \(Gaussia\) \(princeps\) Luziferase-Antikörper-Fusionsproteinen T1 - Development and characterization of \(Gaussia\) \(princeps\) luciferase antibody fusion proteins N2 - Antikörper, die Oberflächenantigene erkennen, sind sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie verschiedener Erkrankungen von enormer Bedeutung. Damit Antikörper in diesen Bereichen eingesetzt werden können, ist es sehr wichtig, dass die Interaktion eines Antikörpers oder auch eines Antikörperkonjugats mit seinem Antigen oder Fc-Rezeptoren ausreichend charakterisiert wird. Hierfür werden meist zellfreie Verfahren angewandt, wie die isotherme Titrationskalorimetrie oder die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie. Diese unterliegen verschiedenen Limitationen, beispielsweise der Verfügbarkeit von rekombinantem Antigen. Vor allem aber werden zelluläre Einflüsse, die die Bindungseigenschaften der Antikörper beeinflussen, nicht berücksichtigt. Aber auch die derzeit angewandten Verfahren für zelluläre Bindungsstudien können problematisch sein, da sie meist auf Antikörpern basieren, die biochemisch markiert worden sind, was zu funktionellen Beeinträchtigungen führen kann. Außerdem zeigen solche Antikörper häufig keine einheitliche Stöchiometrie der jeweiligen Reporterstoffe und die Reproduzierbarkeit des Markierungsverfahrens ist in den meisten Fällen nicht gewährleistet. Positionsspezifische Markierungen sind jedoch vergleichsweise sehr aufwendig. Um die genannten Probleme zu umgehen, wurden in der vorliegenden Arbeit am Beispiel des Fn14-spezifischen Antikörpers 18D1 Antikörper-Fusionsproteine hergestellt und charakterisiert, die an verschiedenen Positionen genetisch mit der Gaussia princeps Luziferase (GpL) fusioniert worden sind. Dabei zeigte sich, dass die Positionierung der Luziferase am C-Terminus der leichten Kette des Antikörpers (GpL(CT-LC)) die Bindungseigenschaften der GpL-18D1-IgG1-Fusionsproteine an Fn14 und an die verschiedenen Fcγ-Rezeptoren (FcγR) nicht oder nur in geringem Umfang beeinflusst. Auch die agonistische Aktivität der GpL-18D1-IgG1-Fusionsproteine, welche abhängig ist von der Oligomerisierung über Protein G oder der FcγR-Bindung, wurde durch die GpL-Markierung nicht wesentlich beeinflusst. Diese Ergebnisse ließen sich am Bespiel von 18D1 ebenfalls auf die dimeren Antikörper-Isotypen IgG2, mIgG1 und mIgG2A übertragen. GpL-Fusionsproteine der Antikörper E09-IgG1 (CD95-spezifisch), G28.5-IgG1 (CD40-spezifisch) und BHA10-IgG1 (LTβR-spezifisch) zeigten gleichfalls keine gravierenden Veränderungen der Bindungseigenschaften oder den funktionellen Eigenschaften, was für eine breite Anwendbarkeit von GpL-Antikörper-Fusionsproteinen spricht. Zusammenfassend betrachtet zeigen die hier präsentierten Ergebnisse, dass die genetische Fusion der Gaussia princeps Luziferase an das C-terminale Ende der leichten Antikörperkette eine sehr gute Möglichkeit darstellt, Antigen-Antikörper-Interaktionen zu charakterisieren ohne dabei mit den Eigenschaften des Antikörpers zu interferieren. Dabei besticht dieser Ansatz im Vergleich zu anderen gängigen Verfahren durch seine Reproduzierbarkeit, eine einfache Handhabung, geringe Kosten und eine extrem hohe Sensitivität. Außerdem könnte dieses Antikörper-Fusionsproteinformat zukünftig auch in vielen Bereichen als Tracer eingesetzt werden mit dem Vorteil, dass keinerlei Radioaktivität benötigt werden würde. N2 - Antibodies raised against surface proteins are of enormous importance for diagnosis and therapy of various diseases. In the development of antibodies for these areas there is a high need for detailed characterization of the interactions of an antibody/antibody-conjugate with its antigen and Fc-receptors. Currently this binding properties are mostly evaluated by cell free assays like surface plasmon resonance and isothermal titration calorimetry. These methods have principle limitations, for example the need of recombinantly produced antigens and the fact that cellular factors which can influence the antigen-antibody interaction cannot be considered. However, the presently used methods for binding studies with intact cells have various limitations, too, e.g. the need for labeled antibodies. Biochemical labeling can influence the binding properties of the antibody and also its functional characteristics. Additionally the resulting antibody-populations can be heterogeneous relating to the amount of biochemical-labeling and the position of the labeling. Also the labeling procedure is not very reproducible. Side specific labeling methods on the other side are typically quite elaborate. To overcome these limitations, on the example of the Fn14-specific antibody 18D1-IgG1 antibody fusion protein formats were investigated which were genetically fused with the Gaussia princeps luciferase (GpL) at different sites of the antibody. Binding studies with these variants showed, that the C-terminus of the antibody light chain (e.g. with GpL, GpL(CT-LC)) is the best suited position for genetic antibody labeling, because GpL domain tagging to this position did not or only very weakly influence the binding properties of the antibody to Fn14 and the Fcγ-receptors. Moreover, the agonistic activity of the antibody which requires oligomerization through protein G or Fcγ-receptor binding for full appearance was not affected. Similar results were obtained for the dimeric 18D1 isotypes IgG2, mIgG1 and mIgG2A. Furthermore, GpL fusion proteins of the antibodies E09-IgG1 (CD95-specific), G28.5-IgG1 (CD40-specific) und BHA10-IgG1 (LTβR-specific) showed no big differences neither in their binding properties to their antigen and Fcγ-receptors nor with respect to their functional activities, indicating a broad applicability of GpL antibody fusion proteins. Summing up, the herein presented results reveal that C-terminal GpL-tagging of the antibody light chain is a versatile tool to characterize the binding properties of an antibody to its antigen without influencing the original properties of the antibody. The GpL antibody fusion proteins of this type are very easily manageable, show a high reproducibility, are cost-efficient and allow very sensitive cellular binding studies and could be used as tracer molecules in the future. KW - Luciferasen KW - zelluläre Bindungsstudien KW - 18D1 KW - Antikörper KW - Fn14 KW - TWEAK KW - cellular binding studies KW - Rekombinantes Protein KW - Gaussia princeps Luziferase Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146777 ER - TY - JOUR A1 - Lückerath, Katharina A1 - Lapa, Constantin A1 - Albert, Christa A1 - Herrmann, Ken A1 - Jörg, Gerhard A1 - Samnick, Samuel A1 - Einsele, Herrmann A1 - Knop, Stefan A1 - Buck, Andreas K. T1 - \(^{11}\)C-Methionine-PET: a novel and sensitive tool for monitoring of early response to treatment in multiple myeloma JF - Oncotarget N2 - Multiple myeloma (MM) remains an essentially incurable hematologic malignancy. However, new treatment modalities and novel drugs have been introduced and thus additional tools for therapy monitoring are increasingly needed. Therefore, we evaluated the radiotracers \(^{11}\)C-Methionine (paraprotein-biosynthesis) and \(^{18}\)F-FDG (glucose-utilization) for monitoring response to anti-myeloma-therapy and outcome prediction. Influence of proteasome-inhibition on radiotracer-uptake of different MM cell-lines and patient-derived CD138\(^{+}\) plasma cells was analyzed and related to tumor-biology. Mice xenotransplanted with MM. 1S tumors underwent MET- and FDG-\(\mu\)PET. Tumor-to-background ratios before and after 24 h, 8 and 15 days treatment with bortezomib were correlated to survival. Treatment reduced both MET and FDG uptake; changes in tracer-retention correlated with a switch from high to low CD138-expression. In xenotransplanted mice, MET-uptake significantly decreased by 30-79% as early as 24 h after bortezomib injection. No significant differences were detected thus early with FDG. This finding was confirmed in patient-derived MM cells. Importantly, early reduction of MET-but not FDG-uptake correlated with improved survival and reduced tumor burden in mice. Our results suggest that MET is superior to FDG in very early assessment of response to anti-myeloma-therapy. Early changes in MET-uptake have predictive potential regarding response and survival. MET-PET holds promise to individualize therapies in MM in future. KW - positron emission tomography KW - imaging techniques KW - experience KW - \(^{11}\)C-Methionine-PET KW - treatment response KW - molecular imaging KW - multiple myeloma KW - management KW - \(^{18}\)F-FDG PET/CT KW - bone disease KW - stem-cell transplantation KW - esophagogastric junction Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-148688 VL - 6 IS - 10 ER - TY - JOUR A1 - Seher, Axel A1 - Nickel, Joachim A1 - Mueller, Thomas D. A1 - Kneitz, Susanne A1 - Gebhardt, Susanne A1 - Meyer ter Vehn, Tobias A1 - Schlunck, Guenther A1 - Sebald, Walter T1 - Gene expression profiling of connective tissue growth factor (CTGF) stimulated primary human tenon fibroblasts reveals an inflammatory and wound healing response in vitro JF - Molecular Vision N2 - Purpose: The biologic relevance of human connective tissue growth factor (hCTGF) for primary human tenon fibroblasts (HTFs) was investigated by RNA expression profiling using affymetrix (TM) oligonucleotide array technology to identify genes that are regulated by hCTGF. Methods: Recombinant hCTGF was expressed in HEK293T cells and purified by affinity and gel chromatography. Specificity and biologic activity of hCTGF was confirmed by biosensor interaction analysis and proliferation assays. For RNA expression profiling HTFs were stimulated with hCTGF for 48h and analyzed using affymetrix (TM) oligonucleotide array technology. Results were validated by real time RT-PCR. Results: hCTGF induces various groups of genes responsible for a wound healing and inflammatory response in HTFs. A new subset of CTGF inducible inflammatory genes was discovered (e.g., chemokine [C-X-C motif] ligand 1 [CXCL1], chemokine [C-X-C motif] ligand 6 [CXCL6], interleukin 6 [IL6], and interleukin 8 [IL8]). We also identified genes that can transmit the known biologic functions initiated by CTGF such as proliferation and extracellular matrix remodelling. Of special interest is a group of genes, e.g., osteoglycin (OGN) and osteomodulin (OMD), which are known to play a key role in osteoblast biology. Conclusions: This study specifies the important role of hCTGF for primary tenon fibroblast function. The RNA expression profile yields new insights into the relevance of hCTGF in influencing biologic processes like wound healing, inflammation, proliferation, and extracellular matrix remodelling in vitro via transcriptional regulation of specific genes. The results suggest that CTGF potentially acts as a modulating factor in inflammatory and wound healing response in fibroblasts of the human eye. KW - Bone morphogenetic protein-2 KW - Smooth-muscle-cells KW - Myofibroblast differentiation KW - TGF-beta KW - CYR61 KW - Proliferation KW - Mechanisms KW - Apoptosis KW - Receptor KW - Cancer Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140189 VL - 17 IS - 08. Okt ER - TY - JOUR A1 - Chopra, Martin A1 - Biehl, Marlene A1 - Steinfatt, Tim A1 - Brandl, Andreas A1 - Kums, Juliane A1 - Amich, Jorge A1 - Vaeth, Martin A1 - Kuen, Janina A1 - Holtappels, Rafaela A1 - Podlech, Jürgen A1 - Mottok, Anja A1 - Kraus, Sabrina A1 - Jordán-Garotte, Ana-Laura A1 - Bäuerlein, Carina A. A1 - Brede, Christian A1 - Ribechini, Eliana A1 - Fick, Andrea A1 - Seher, Axel A1 - Polz, Johannes A1 - Ottmueller, Katja J. A1 - Baker, Jeannette A1 - Nishikii, Hidekazu A1 - Ritz, Miriam A1 - Mattenheimer, Katharina A1 - Schwinn, Stefanie A1 - Winter, Thorsten A1 - Schäfer, Viktoria A1 - Krappmann, Sven A1 - Einsele, Hermann A1 - Müller, Thomas D. A1 - Reddehase, Matthias J. A1 - Lutz, Manfred B. A1 - Männel, Daniela N. A1 - Berberich-Siebelt, Friederike A1 - Wajant, Harald A1 - Beilhack, Andreas T1 - Exogenous TNFR2 activation protects from acute GvHD via host T reg cell expansion JF - Journal of Experimental Medicine N2 - Donor CD4\(^+\)Foxp3\(^+\) regulatory T cells (T reg cells) suppress graft-versus-host disease (GvHD) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HCT allo-HCT]). Current clinical study protocols rely on the ex vivo expansion of donor T reg cells and their infusion in high numbers. In this study, we present a novel strategy for inhibiting GvHD that is based on the in vivo expansion of recipient T reg cells before allo-HCT, exploiting the crucial role of tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2) in T reg cell biology. Expanding radiation-resistant host T reg cells in recipient mice using a mouse TNFR2-selective agonist before allo-HCT significantly prolonged survival and reduced GvHD severity in a TNFR2-and T reg cell-dependent manner. The beneficial effects of transplanted T cells against leukemia cells and infectious pathogens remained unaffected. A corresponding human TNFR2-specific agonist expanded human T reg cells in vitro. These observations indicate the potential of our strategy to protect allo-HCT patients from acute GvHD by expanding T reg cells via selective TNFR2 activation in vivo. KW - Tumor-necrosis-factor KW - Regulatory-cells KW - Bone marrow transplantantation KW - Graft-versus-leukemia KW - Rheumatoid arthritis KW - Autoimmune diseases KW - Factor receptor KW - Alpha therapy KW - Expression KW - Suppression Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187640 VL - 213 IS - 9 ER - TY - JOUR A1 - Hefner, Jochen A1 - Berberich, Sara A1 - Lanvers, Elena A1 - Sanning, Maria A1 - Steimer, Ann-Kathrin A1 - Kunzmann, Volker T1 - Patient-doctor relationship and adherence to capecitabine in outpatients of a German comprehensive cancer center JF - Patient Preference and Adherence N2 - Purpose: The prescribing of oral chemotherapy agents has introduced the new challenge of ensuring patients’ adherence to therapy. Aspects of a close patient–doctor relationship are reported to be correlated with adherence to oral anticancer drugs, but data on capecitabine are scarce. Patients and methods: Sixty-four outpatients with a diagnosis of cancer and prescribed capecitabine were recruited from a German Comprehensive Cancer Center. We used the Patient–Doctor Relationship Questionnaire (PDRQ-9), the Medical Adherence Rating Scale (MARS), the Beliefs about Medicines Questionnaire (BMQ), and the Satisfaction with Information about Medicines Scale (SIMS) to assess patients’ perceptions and behavior. Medical data were extracted from the charts. Results: Non-adherence was reported by 20% of the 64 participants. The perceived quality of the patient–doctor relationship was high in general, but it did not emerge as a predictor of adherence in our survey (odds ratio [OR]=0.915, P=0.162, 95% CI=0.808–1.036). However, beliefs about medicine (OR=1.268, P<0.002; 95% CI=1.090–1.475) as well as satisfaction with information about medicine (OR=1.252, P<0.040, 95% CI=1.010–1.551) were predictors of adherence and the quality of the patient–doctor relationship was correlated with both variables (r=0.373, P=0.002 for SIMS sum score; r=0.263, P=0.036 for BMQ necessity/concern difference). Overall, adherence to capecitabine was high with a conviction that the therapy is necessary. However, concerns were expressed regarding the long-term effect of capecitabine use. Patients have unmet information needs regarding interactions of capecitabine with other medicines and the impairment of their intimate life. Conclusions: In order to ensure adherence to capecitabine, our results seem to encourage the default use of modern and perhaps more impersonal means of information brokerage (eg, email, internet). However, the contents of some of patients’ informational needs as well as the associations of patients’ beliefs and satisfaction about the information received suggest a benefit from a trustful patient–doctor relationship. KW - oral anticancer drugs KW - patient-doctor-relationship KW - capecitabine Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-177143 VL - 12 ER - TY - THES A1 - Wyzgol, Agnes T1 - Generierung und Charakterisierung rekombinanter TNF-Liganden T1 - Generation and characterisation of recombinant TNF-ligands N2 - Liganden und Rezeptoren der TNF-Familie regulieren eine Vielzahl zellulärer Prozesse, darunter Apoptose und Immunprozesse. TNF-Liganden kommen in Form löslicher und membranständiger trimerer Moleküle vor, wobei die trimere Organisation durch die konservierte THD vermittelt wird. Im Gegensatz zu den membranständigen Molekülen können lösliche TNF-Liganden nicht immer an ihren TNF-Rezeptor binden oder ihn effektiv aktivieren. Für zwei solcher inaktiven TNF-Liganden, nämlich TRAIL und CD95L, konnte gezeigt werden, dass durch sekundäre Oligomerisierung oder durch artifizielle Herstellung einer Membranständigkeit mittels Antikörperdomänen gegen zelloberflächenexprimierte Proteine hochaktive Ligandenvarianten generiert werden können. Inwieweit sich diese Verfahren auf die T-Zell-kostimulatorischen TNF-Liganden OX40L, 41BBL und CD27L übertragen lassen, wurde in dieser Arbeit untersucht. Lösliche Flag- und Flag-TNC-Varianten von OX40L und 41BBL zeigten eine gute Bindung an die Rezeptoren OX40 und 41BB. Die lösliche Variante Flag-CD27L konnte nicht an ihren Rezeptor CD27 binden. Dies war aber nach Einführung der trimerstabilisierenden TNC-Domäne möglich. Eine effektive Aktivierung ihres Rezeptors, nachgewiesen durch Analyse der IL8-Induktion, bewirkten die löslichen TNF-Ligandenvarianten nur nach sekundärer Oligomerisierung mittels des Flag-spezifischen Antikörpers M2. Eine ähnlich gute TNFR-Aktivierung ließ sich durch Einführung der hexamerisierenden Fc-Domäne erzielen. Fc-Flag-OX40L und Fc-Flag-41BBL induzierten bereits ohne sekundäre Quervernetzung effektiv IL8. Die Hexamerisierung alleine reichte für die lösliche CD27L-Variante nicht aus, hier war zusätzlich zur Fc- wiederum auch die TNC-Domäne erforderlich, um die Bindung an CD27 und eine schwache IL8-Induktion zu erzielen. Für die FAP-bindenden Fusionsproteine antiFAP-Flag- OX40L, antiFAP-Flag-41BBL und antiFAP-Flag-TNC-CD27L war die Bindung an OX40, 41BB und CD27 sowie an FAP nachweisbar. Erst durch die artifizielle Membranständigkeit nach Bindung an FAP konnten diese Fusionsproteine über ihren Rezeptor effektiv IL8 induzieren. Zusammenfassend ließ sich somit zeigen, dass sich schwach oder nicht aktive lösliche Ligandenvarianten von OX40L und 41BBL durch sekundäre Oligomerisierung, durch die Fc-Hexamerisierungsdomäne und durch artifizielle Membranständigkeit in hochaktive Liganden verwandeln lassen. Lösliche CD27L-Varianten benötigen zusätzlich die trimerstabilisierende TNC-Domäne, um CD27 binden und aktivieren zu können. Für das bessere Verständnis der Ligand-Rezeptor-Interaktionen wurden zusätzlich OX40L-, 41BBL- und CD27L-Fusionsproteine mit der hochaktiven Gaussia princeps Luziferase (GpL) generiert, um Gleichgewichtsbindungs-, Dissoziationsstudien und homologe Kompetitionsassays durchführen zu können. Für die Fusionsproteine GpL-Flag-TNC-OX40L, GpL-Flag-TNC-41BBL und GpL-Flag-TNC-CD27L konnte gezeigt werden, dass die IL8-Induktion nicht von der Rezeptorbelegung abhängt, sondern von der sekundären Oligomerisierung, da bei gleicher Rezeptorbelegung durch sekundär quervernetzte TNF-Liganden mehr IL8 induziert wird, die Rezeptoraktivierung also qualitativ besser sein muss. N2 - Ligands and receptors of the TNF family regulate diverse cellular processes such as apoptosis and immune processes. TNF ligands are soluble or membrane-bound molecules with a trimeric organization mediated by the conservative THD. Unlike the membrane-bound molecules soluble TNF ligands may fail in binding or in activating their receptor efficiently. It was shown for two such inactive TNF ligands, namely TRAIL and CD95L that highly active ligand variants could be generated with secondary oligomerization or artificial cell surface immobilization through antibody domains recognizing cell surface expressed proteins. In this work it was examined if these procedures are also applicable to the T cell costimulating TNF ligands OX40L, 41BBL and CD27L. Soluble Flag- and Flag-TNC-variants of OX40L and 41BBL showed good binding to their receptors OX40 and 41BB. The soluble variant Flag-CD27L did not bind its receptor CD27 while that was possible after introduction of the trimer stabilizing TNC-domain. An effective receptor-activation proved by analysis of the induction of IL8 was gained by soluble TNF ligand variants only after secondary oligomerization with the Flag-specific antibody M2. A similar efficient TNFR-activation was achieved by introduction of a hexamerizing Fc-domain. Fc-Flag-OX40L and Fc-Flag-41BBL induced already without secondary cross-linking efficiently IL8. For the soluble CD27L-variant hexamerization alone was not sufficient, but the Fc-domain was necessary in addition to the TNC-domain to enable binding to CD27 and weak induction of IL8. For the FAP-binding fusion proteins antiFAP-Flag-OX40L, antiFAP-Flag-41BBL and antiFAP-Flag-TNC-CD27L binding to OX40, 41BB and CD27 as well as to FAP was detectable. These fusion proteins were able to induce IL8 efficiently via their receptor only as artificial membrane-bound molecules after binding to FAP. In summary, it has been shown that poorly or not active soluble ligand-variants of OX40L and 41BBL can be turned into highly active ligands by secondary oligomerization, by the hexamerizing Fc-domain and by artificial immobilization on the cell surface. Soluble CD27L variants additionally need the trimer-stabilizing TNC-domain to bind and activate CD27. For better understanding of ligand-receptor-interactions additionally OX40L-, 41BBL- and CD27L-fusion proteins with the highly active Gaussia princeps luciferase (GpL) were generated to enable equilibrium binding and dissociation studies as well as homologous competition assays. It was shown here with the fusion proteins GpL-Flag-TNC-OX40L, GpLFlag-TNC-41BBL and GpL-Flag-TNC-CD27L that induction of IL8 is independent of receptor occupancy, but depends on secondary oligomerization. Secondary cross-linked TNF ligands induced more IL8 with equal receptor occupancy. Therefore a qualitative better receptor activation has to be assumed. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Ligand KW - TNF KW - Kostimulatorische Faktoren KW - TNF KW - costimulatory factors Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76449 ER - TY - THES A1 - Rauert-Wunderlich, Hilka T1 - Apoptoseregulation durch TNF im Multiplen Myelom T1 - Regulation of apoptosis via TNF in multiple myeloma N2 - Der Tumornekrosefaktor (TNF) entfaltet seine vielfältigen biologischen Aktivitäten durch die Stimulation der beiden TNF-Rezeptoren TNFR1 und TNFR2. Die TNFR1-vermittelte Signaltransduktion ist in vielen Details gut verstanden, wohingegen die TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bis heute kaum untersucht ist. Mit Hilfe einer in unserer Gruppe entwickelten hochaktiven TNFR2-spezifischen TNF-Variante sowie einer bereits länger bekannten TNFR1-spezifischen TNF-Variante wurde in dieser Arbeit die TNF-Signaltransduktion insbesondere im Mutiplen Myelom untersucht. Mit Hilfe der beiden TNF-Varianten konnte gezeigt werden, dass die alleinige Stimulation des TNFR2 die Aktivierung des alternativen NFkappaB-Signalweges vermittelt, wohingegen TNFR1 nicht dazu in der Lage ist. So zeigte sich im Einklang mit der inhibitorischen Funktion des Adapterproteins TRAF2 in der Signaltransduktion des alternativen NFkappaB-Signalweges, dass die TNFR2-Stimulation in einer TRAF2-Depletion resultiert. Dies führt weiterhin zur Akkumulation von NIK und der Prozessierung von p100 zu seiner aktiven Form p52, den klassischen biochemisch nachweisbaren Ereignissen der Aktivierung des alternativen NFkappaB-Signalweges. Aufgrund der Rolle des NFkappaB-Systems im Multiplen Myelom (MM) und der stimulierenden Wirkung des TNFR1 und TNFR2 auf das NFkappaB-System wurde die Expression und Funktion dieser beiden Rezeptoren auf Myelomzelllinien untersucht. Insbesondere wurde analysiert, welchen Effekt eine spezifische Stimulation der beiden TNF-Rezeptoren auf die apoptotische Sensitivität von Myelomzellen hat. Mit einer Ausnahme wiesen alle untersuchten Myelomzelllinien eine eindeutige TNFR2-Oberflächenexpression auf, die TNFR1-Expression hingegen war heterogen. Die TNFR1-Stimulation in den TNFR1-positiven Zelllinien zeigte keinen wesentlichen Einfluss auf die Zellviabilität. Allerdings resultierte eine Vorstimulation mit TNF in einer gesteigerten Sensitivität für den CD95L-induzierten Zelltod, schützte aber gleichzeitig vor der TRAIL-vermittelten Induktion der Apoptose. Der gegenläufige Effekt der TNF-Vorstimulation auf den CD95L- und TRAIL-induzierten Zelltod konnte auf die Hochregulation der CD95-Oberflächenexpression und der gesteigerten Expression des antiapoptotischen cFLIPLong-Proteins zurückgeführt werden. Beide Effekte basieren auf der TNF-induzierten Aktivierung des klassischen NFkappaB-Signalweges. Im CD95L-induzierten Zelltod überkompensierte die Induktion der CD95-Expression offensichtlich die Hochregulation von cFLIPLong und resultierte in gesteigertem Zelltod. Der TRAIL-induzierte Zelltod hingegen wurde durch die TNF-Vorstimulation abgeschwächt, da hier lediglich die durch den klassischen NFkappaB-Signalweg vermittelte gesteigerte Expression des antiapoptotischen cFLIPLong eine Rolle spielte. Desweiteren zeigten die Analysen in dieser Arbeit, dass die TNFR2-Stimulation zu einer Depletion von TRAF2 und z. B. in JJN3-Zellen zu einer Sensitivierung für den TNFR1-induzierten Zelltod führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten in der Summe somit, dass das TNF-TNFR-Signaling durch verschiedene Mechanismen Einfluss auf den Ausgang der extrinsischen Apoptoseinduktion hat, und dass der Effekt von TNF auf das Überleben von MM-Zellen kontextabhängig ist. N2 - TNF mediates its biological functions by stimulation of the two TNF receptors TNFR1 and TNFR2. TNFR1-mediated signaling has already been studied in detail, whereas TNFR2-mediated signal transduction is poorly understood. In this work a newly developed TNFR2-specific variant and an established TNFR1-specific variant was used to study TNF signaling especially in myeloma cells. With the help of these TNF-variants it is shown here that TNFR2, but not TNFR1, induces activation of the alternative NFkappaB-pathway. Thus in consent with the inhibitory function of TRAF2 in alternative NFkappaB signal transduction, stimulation of TNFR2 resulted in depletion of TRAF2, accumulation of NIK and p100 processing to p52, the biochemical hallmarks of this pathway. Due to the relevance of the NFkappaB-system for multiple myeloma (MM) and the NFkappaB stimulatory activities of TNFR1 and TNFR2, the expression of these two receptors and their effect on apoptotic sensitivity was analyzed in myeloma cell lines. A huge majority of myeloma cell lines express TNFR2 whereas TNFR1 expression is rather restricted. Stimulation of TNFR1 in the TNFR1-positive subset of MM cell lines showed nearly no impact on cellular viability. However, TNF stimulation enhanced CD95L-induced cell death and in parallel reduced the TRAIL-mediated induction of apoptosis. This opposed regulation of TRAIL- and CD95L-induced cell death by TNF based on upregulation of the death receptor CD95 via the classical NFkappaB-pathway and by upregulation of the antiapoptotic protein cFLIPLong via the same pathway. The induction of CD95 expression appeared to overcompensate the upregulation of cFLIPLong and consequently TNF-induced NFkappaB activation resulted, in context of CD95 signaling, in apoptosis enhancement. TRAIL-mediated cell death induction, however, was reduced after TNF prestimulation, due to the fact that here only upregulation of cFLIPLong was relevant. Furthermore the experiments in this study showed that TNFR2-mediated depletion of TRAF2 resulted in a sensitization for TNFR1-induced cell death, for example in JJN3-cells. Taken together, this study revealed that the TNF-TNFR system influenced the outcome of activation of the extrinsic apoptotic pathway in myeloma cells by various mechanisms and the effect of TNF on MM cell survival is thus context dependent. KW - Apoptosis KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Plasmozytom KW - apoptosis KW - TNF KW - multiple myeloma Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73998 ER - TY - THES A1 - Lang, Isabell T1 - Molekulare Mechanismen der CD95-Aktivierung T1 - Molecular mechanisms of CD95 activation N2 - Die Stimulation des CD95-Todesrezeptors durch seinen natürlichen membranständigen Li-ganden CD95L führt zur kontextabhängigen Aktivierung von sowohl apoptotischen als auch nicht-apoptotischen Signalwegen. Durch Proteolyse wird aus dem membranständigen CD95L löslicher trimerer CD95L freigesetzt. Die Bindung von löslichem trimerem CD95L an CD95 ist nicht ausreichend, um die CD95-Signaltransduktion effizient zu stimulieren. Die Fähigkeit von löslichen CD95L-Trimeren CD95-vermittelte Signalwege robust zu aktivieren kann jedoch durch Oligomerisierung und artifizielle Immobilisierung an eine Oberfläche drastisch gesteigert werden. In dieser Arbeit wurde zunächst bestätigt, dass nur oligomere CD95L-Varianten, die z.B. durch Antikörpervernetzung von N-terminal getaggten rekombinanten CD95L-Varianten oder durch eine gentechnisch erzwungene Hexamerisierung von CD95L-Molekülen erhalten wur-den, in der Lage sind, effizient apoptotische und nicht-apoptotische Signalwege zu aktivieren. Ferner zeigte sich dann, dass die Bindung von löslichen CD95L-Trimeren nicht ausreichend ist, um die Translokation von CD95-Molekülen in detergenzunlösliche „Lipid Raft“- Membrandomänen zu stimulieren. Die „Lipid Raft“-Translokation ist ein zentrales Ereignis bei der CD95-Aktivierung und vor allem für die Induktion der Apoptose bedeutsam. Dabei ist ein selbstverstärkender Prozess aus Caspase-8-Aktivierung und „Lipid Raft“-Assoziation des CD95 von Bedeutung. Um die Interaktion von CD95 und CD95L mit Hilfe von hoch sensitiven zellulären Bindungs-studien analysieren zu können, wurden in dieser Arbeit desweiteren CD95L-Fusionsproteine entwickelt und hergestellt, an welche N-terminal eine Gaussia princeps Luziferase (GpL)- Reporterdomäne gekoppelt ist. So konnte mit den GpL-CD95L-Fusionsproteinen gezeigt werden, dass die Oligomerisierung von CD95L-Trimeren keinen Effekt auf die Ligandenbele-gung des CD95 hat. Dies spricht dafür, dass die höhere spezifische Aktivität von oligomeri-sierten CD95L-Trimeren nicht auf einer Aviditäts-vermittelten Zunahme der apparenten Affi-nität beruht, sondern dies deutet darauf hin, dass die sekundäre Aggregation von sich initial bildenden trimeren CD95L-CD95-Komplexen eine entscheidende Rolle in der CD95-Aktivierung spielt. Durch Scatchard-Analysen zeigte sich ferner, dass trimerer CD95L mit mindestens zwei zellulären Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität interagiert. Bindungs-studien mit löslichen monomeren und trimeren GpL-CD95-Rezeptoren an membranständigen CD95L, als auch Inhibitionsstudien ergaben, dass trimerer CD95 weitaus besser an CD95L bindet. Dies legt nahe, dass es sich bei den zuvor beobachteten hoch- und niederaffinen Bindungsstellen für CD95L um monomere bzw. prä-assemblierte CD95-Moleküle handelt. Die GpL-CD95L-Fusionsproteine wurden auch genutzt, um die CD95-Translokation in „Lipid Rafts“ zu analysieren. So wurde trimerer GpL-CD95L als „Tracer“ zur Markierung von inaktiven CD95-Molekülen eingesetzt. Nach Aktivierung der übrigen freien CD95-Moleküle mit hoch aktivem hexameren Fc-CD95L konnte eine Zunahme der inaktiven GpL-CD95L-markierten Rezeptoren in „Lipid Rafts“ beobachtet werden. Offensichtlich stimulieren also aktivierte CD95-Moleküle in „trans“ die Ko-Translokation inaktiver CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts“. Dies bestätigte sich auch in Experimenten mit Transfektanten, die einen chimären CD40-CD95-Rezeptor exprimieren. Letzterer ist nach Stimulation mit CD40L in der Lage, intrazellu-läre CD95-vermittelte Signalwege zu aktivieren. Die Aktivierung von CD95-assoziierten Sig-nalwegen durch Stimulation von endogenem CD95 in CD40-CD95-Transfektanten resultierte nun in der Ko-Translokation von unstimulierten CD40-CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts“. Vice versa zeigte sich die Ko-Translokation von endogenem CD95 nach spezifischer Aktivierung des chimären CD40-CD95-Rezeptors. Schlussendlich erwiesen sich eine funktionsfähige Todesdomäne und die Aktivierung der Caspase-8 als essentiell für die „Lipid Raft“-Assoziation von aktivierten CD95-Molekülen und auch für die durch diese Rezeptorspezies induzierte Ko-Translokation von inaktiven Rezeptoren in „Lipid Rafts“. N2 - Membrane-bound CD95L activates the CD95 death receptor to induce context-dependent apoptotic and non-apoptotic signaling pathways. In contrast, soluble trimeric CD95L, which is released by proteolysis, is not sufficient to stimulate CD95-induced signaling. However, the ability of soluble CD95L trimers to activate robust CD95 mediated signaling pathways can be increased drastically by oligomerization and artificial immobilization on the cell surface. In this work, it has been confirmed that only the oligomeric CD95L-variants, produced by an-tibody crosslinking of N-terminal tagged recombinant CD95L-variants or by genetic engineer-ing-enforced formation of hexamers, are able to efficiently activate both apoptotic and non-apoptotic signaling pathways. Moreover, it has been shown that binding of soluble trimeric CD95L is not sufficient to stimulate translocation of CD95 molecules to the “lipid raft”-containing compartment of the cell membrane. This translocation of CD95 to “lipid rafts” is a pivotal event in CD95 activation and mainly meaningful, especially for induction of apoptosis. Thereby an auto-amplification-loop of caspase-8 activation and association of CD95 with “lipid rafts” is of importance. To analyze CD95-CD95L interactions, highly sensitive cellular binding studies using CD95L fusion proteins linked to the N-terminal Gaussia princeps luciferase (GpL) have been per-formed. With GpL-CD95L fusion proteins it has been demonstrated that oligomerization of CD95L trimers has no major effect on CD95 occupancy. Therefore higher specific activity of oligomerized CD95L trimers is not related to an avidity-driven increase in apparent affinity. This suggests that a process of secondary aggregation of the initially formed trimeric CD95L-CD95 complexes is crucial for CD95 activation. Furthermore, the data obtained from scat-chard analysis showed that trimeric CD95L interacts with at least two binding sites of different affinity. This was further examined by performing binding studies of soluble monomeric and trimeric GpL-CD95 receptors to membrane-bound CD95L and neutralization assays. It was observed that trimeric CD95 receptor can bind to CD95L much better. These results suggest that the high and low affinity binding sites concern to monomeric or rather pre-assembled CD95 molecules. Moreover, GpL-CD95L fusion proteins have been employed to analyze translocation of CD95 to “lipid rafts”. In these experiments, GpL-CD95L trimers were applied to “mark” inactive CD95 molecules. Upon activation of the remaining free CD95 molecules using highly active Fc-CD95L, an increased association of these inactive receptors with “lipid rafts” was observed. Apparently activated CD95 molecules stimulate in “trans” the co-translocation of inactive CD95 receptors to “lipid rafts”. This has also been confirmed in experiments with transfectants expressing chimeric CD40-CD95 receptors. These chimeric receptors are able to activate CD95-mediated signaling pathways after stimulation with CD40L. After stimulation of endogenous CD95 in CD40-CD95 transfectants the unstimulated chimeric CD40-CD95 receptors co-translocated to “lipid rafts”. Conversely, activation of CD95-associated pathways by specific stimulation of chimeric CD40-CD95 receptors resulted in co-translocation of the endogenous CD95. In conclusion, it has been shown that a functional death domain and caspase-8 activation turned out to be essential for both “lipid raft” association of signaling-active CD95 molecules and co-translocation of inactive CD95 receptors induced by active receptor species. KW - Fas-Ligand KW - Apoptosis KW - Antigen CD95 KW - CD95 KW - CD95L KW - Apoptose KW - "Lipid Rafts" KW - FAS KW - CD95 KW - CD95L KW - apoptosis KW - "Lipid Rafts" Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73339 ER - TY - THES A1 - Schaffstein, Stella T1 - Molekulare Mechanismen der nicht-apoptotischen Signaltransduktion des Todesliganden TRAIL (Apo-2 Ligand) T1 - Molecular mechanisms of non-apoptotic signaling of the death-ligand TRAIL (Apo-2 ligand) N2 - TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)/Apo-2 Ligand ist ein Mitglied der TNF (tumor necrosis factor)-Superfamilie, das in den vergangenen Jahren als potentielles Tumortherapeutikum breite Aufmerksamkeit auf sich gezogen hat. Denn über seine korrespondierenden Todesrezeptoren induziert TRAIL vornehmlich in Tumorzellen den apoptotischen Zelltod, während normale Zellen unbeschadet bleiben (Ashkenazi et al., 1999; Walczak et al., 1999; Griffith et al., 1998). Neuere Studien belegen allerdings, dass die TRAIL-Todesrezeptoren neben ihrer herausragenden Funktion als Auslöser der Apoptose zusätzlich die Fähigkeit zur Aktivierung nicht-apoptotischer Signalwege besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurden vornehmlich die nicht-apoptotischen Signalwege wie die MAPK-Kaskaden sowie die NFkappaB-Signalwege in Verbindung mit der Aktivierung von Apoptose sowie der Induktion des Chemokins IL-8 analysiert. Hierfür wurde die humane Pankreasadenokarzinomzellinie Colo 357 verwendet. In den Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass TRAIL die MAP Kinasen JNK, ERK und p38 in Colo 357 Zellen induziert. Die Induktion erfolgte hierbei unabhängig vom apoptotischen Zelltod aber abhängig von der Aktivierung der Caspasen. Desweiteren konnte eine TRAIL-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkappaB in Colo 357 Zellen demonstriert werden. Anhand von ELISA-Experimenten wurde gezeigt, dass sowohl die Aktivierung der MAP Kinasen als auch die Aktivierung von NFkappaB eine essentielle Rolle bei der TRAIL-vermittelten Induktion von IL-8 spielen. Durch die Induktion von IL-8 wiederum kann TRAIL inflammatorische Effekte induzieren. Im Hinblick auf eine potentielle Tumortherapie mit TRAIL legen die Daten dieser Studie die Notwendigkeit von Kombinationstherapien mit TRAIL nahe. So kann durch die Kombination von TRAIL mit anti-inflammatorisch wirkenden Medikamenten eine Reduktion entzündlicher Nebenwirkungen erzielt werden. Andererseits kann durch Verwendung von TRAIL zusammen mit Proteasom-Inhibitoren die Resistenz gegenüber TRAIL-vermittelter Apoptose vermindert werden und gleichzeitig eine anti-inflammatorische und NFkappaB-hemmende Wirkung erzielt werden. N2 - TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), also known as Apo-2 ligand, is one of several members of the TNF (tumor necrosis factor) superfamily that induce apoptosis through engagement of death receptors (Wiley et al., 1995). This protein has generated tremendous excitement as a potential tumor-specific cancer therapeutic because it selectively induces apoptosis in many transformed cells but not in normal cells (Ashkenazi et al., 1999; Walczak et al., 1999; Griffith et al., 1998). Since its discovery in 1995, TRAIL has been predominantly described as a potent inducer of apoptosis with functions in tumor surveillance and immune privilege through binding of its corresponding death receptors. More recent studies however point to additional, apoptosis-independent functions of the TRAIL-death-receptors. The experiments described in this study focused mainly on TRAIL-mediated activation of the non-apoptotic signaling pathways as the MAPK (mitogen-activated protein kinase) cascades and the transcriptional factor NFkappaB in connection with the induction of apoptotic cell death as well as the induction of the chemokine IL-8. For the described project the human pancreatic cancer cell line Colo 357 was predominantely used. The experiments demonstrated that TRAIL induces the activation of the MAPK cascades JNK, ERK and p38 in Colo 357 cells. This induction occured independently of the induction of apoptotic cell death but dependently of the activation of caspases. Furthermore a TRAIL-mediated activation of the transcriptional factor NFkappaB was demonstrated in Colo 357 cells. Both the activation of the MAP kinase JNK and the induction of NFkappaB were shown to play a decisive role in the TRAIL-induced expression of the chemokine IL-8. In correspondance to potential tumor-specific cancer therapy with TRAIL the data of this study suggest the use of combintion therapies of TRAIL, on the one hand combination with anti-inflammatory drugs to avoid side effects arising from the proinflammatory potential of TRAIL and on the other hand combintaion with drugs to overcome resistance against TRAIL-mediated apoptosis such as proteasomal inhibitors which were shown to not only reinforce TRAIL-mediated apoptosis but also have anti-inflammatory and NFkappaB inhibitory effects. KW - Apoptosis KW - TRAIL KW - Apoptose KW - c-Jun N-terminale Kinase KW - NFkappaB KW - Interleukin 8 KW - TRAIL KW - apoptosis KW - c-Jun N-terminal kinase KW - NFkappaB KW - interleukine 8 Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55943 ER - TY - THES A1 - Salzmann, Steffen T1 - Regulation der TNF-Rezeptor Signaltransduktion durch das Zytokin TWEAK T1 - Regulation of the TNF-receptor signaltransduction through the cytokine TWEAK N2 - Das pleiotrope Zytokin TNF (tumor necrosis factor) kann an den TNF-Rezeptor 1 (TNFR1) und den TNF-Rezeptor 2 (TNFR2) binden und mit deren Hilfe seine biologischen Funktionen über verschiedene Signalwege, wie z.B. NFB- und MAPK-Aktivierung bzw. Apop¬toseinduktion, vermitteln. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des TNFR2 zur proteasomalen Degradation des Adaterproteins TRAF2 führt und dadurch die TNFR1-induzierte Apoptose verstärkt wird. TWEAK (tumor necrosis like weak inducer of apoptosis), das ebenfalls der TNF-Ligandenfamilie angehört und die Interaktion mit dessen Rezeptor Fn14 (fibroblast growth factor-inducible 14), der wie der TNFR2 zur Untergruppe der TRAF-bindenden Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie gehört, zeigten in verschiedenen Arbeiten auch eine TRAF2-degradierende Wirkung. In der vorliegenden Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass dies auch im Falle des TWEAK/Fn14-Systems mit einem verstärkenden Effekt auf die TNFR1-vermittelte Apoptose einhergeht. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass TWEAK zusätzlich auch die TNFR1-induzierte Nekrose verstärkt, die den Zelltod durch andere Mechanismen als bei der Apoptose induziert. Von anderen Arbeiten unserer Gruppe war bekannt, dass lösliches TWEAK (sTWEAK) und membranständiges TWEAK (mTWEAK) bezüglich der TRAF2-Depletion wirkungs¬gleich sind. Da der apoptotische Fn14-TNFR1-„crosstalk“ auf der Depletion von TRAF2-Komplexen beruht wurden auch keine signifikanten Unterschiede zwischen sTWEAK und mTWEAK in Bezug auf die Verstärkung der TNFR1-induzierten Apoptose beobachtet. Interessanter¬weise zeigte sich in der vorliegenden Arbeit jedoch, dass sTWEAK den klassischen NFB-Signalweg gar nicht bzw. nur schwach aktiviert, wohingegen mTWEAK diesen stark induziert. Bei der Aktivierung des alternativen NFB-Signalweges hingegen ließen sich keine Unterschiede zwischen sTWEAK und mTWEAK erkennen. Die Aktivierung eines Signalweges wird also durch die Oligomerisierung des Liganden nicht moduliert, demgegenüber aber erwies sich die Aktivierung eines anderen Signalweges als stark abhängig von der Liganden-Oligomerisierung. Vor dem Hintergrund, dass das Adapterprotein TRAF1 (TNF-receptor-associated factor 1) Heterotrimere mit TRAF2 bildet, wurde weiterhin untersucht, ob dieses Molekül einen Einfluss auf die Aktivität der TWEAK-induzierten Signalwege hat. Tatsächlich zeigte sich in TRAF1-exprimie¬renden Zellen eine Verstärkung der TWEAK-induzierten Aktivierung des klassischen NFB-Signalweges Zukünftige Studien müssen nun aufklären, inwieweit die hier gefundenen Mecha-nismen das Zusammenspiel von TNF und TWEAK in vivo bestimmen. N2 - The pleiotropic cytokine TNF (tumor necrosis factor) binds to two receptors, TNF-receptor 1 (TNFR1) and TNF-receptor 2 (TNFR2). TNF elicits its biological functions through different signaling pathways, e.g. NFB- and MAPK-activation and induction of apoptosis. Previous studies revealed that activation of TNFR2 leads to protea¬somal degradation of the adaptor protein TRAF2 and enhanced TNFR1-induced apoptosis. TWEAK (tumor necrosis like weak inducer of apoptosis), a member of the TNF-ligand family and Fn14 which belongs like TNFR2 to the TRAF-binding subgroup of the TNF-receptor family, showed also a TRAF2-degrading effect. In the present thesis it is shown that this is also associated with an enhancement of TNFR1-mediated apoptosis. Furthermore, it was shown that TWEAK also amplifies TNFR1-induced necrosis, a form of cell death that is induced independently and by different mechanisms than apoptosis. In earlier studies in our group it was found that soluble TWEAK (sTWEAK) and membrane bound TWEAK (mTWEAK) have the same TRAF2-depleting effect. Because the apoptotic crosstalk of Fn14 and TNFR1 bases on the depletion of TRAF2-containing complexes, there were no significant differences observed between sTWEAK and mTWEAK concerning the enhancement of TNFR1-induced apoptosis. Interestingly, it was shown in this thesis that sTWEAK can activate the classical NFB pathway not or just weak, whereas mTWEAK can do this very efficiently. However there were no differences between sTWEAK and mTWEAK in the activa¬tion of the alternative NFB pathway. Thus the activation of one type of signaling pathway is therefore not modulated through ligand oligomerisation, but in contrast the activation of another pathway turned out to be strongly dependent of ligand oligomerisation. It is known that the adaptor protein TRAF1 (TNF-receptor-associated factor 1) builds heterotrimers with TRAF2. It was furthermore investiga-ted, whether this molecule has an influence on the activity of TWEAK-induced pathways. Actually there was increased activity in TWEAK-mediated classical NFB signaling observed in TRAF1-expressing cells. Further studies have to clarify to which extend the here found mechanisms affect the TNF-TWEAK interplay in vivo. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Signaltransduktion KW - TNF KW - TWEAK Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52525 ER - TY - THES A1 - Aumüller, Ruth Inge T1 - CD40-restringierte Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren durch bifunktionelle rekombinante Proteine T1 - CD40-restricted activation of TRAIL-death receptors by bifunctional recombinant proteins N2 - Der Ligand TRAIL wurde 1997 aufgrund seiner hohen Sequenzhomolgie ge-genüber dem TNFL CD95L entdeckt (28 %). Allerdings besitzt TRAIL, anders als die Liganden CD95L und TNF, die bemerkenswerte Eigenschaft vor allem in veränderten Zellen Apoptose zu induzieren, während gesunde Zellen davor bewahrt werden. Die TRAIL-induzierte Apoptose wird durch die apoptoseinduzierenden Todesrezeptoren TRAILR1 und TRAILR2 vermittelt. Allerdings bindet und aktiviert lösliches TRAIL hauptsächlich den Todesrezeptor TRAILR1, während membrangebundes TRAIL sowohl TRAILR1 als auch TRAILR2 gut aktiviert. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Bioaktivität löslicher TNFL zu steigern. Hierzu zählen z.B.: Stabilisierung der trimeren Molekülanordnung über die TNC-Domäne, Oligomerisierung des Flag-getaggten Liganden mithilfe des monoklonalen Antikörpers M2, sowie Generierung einer artifiziellen, antigenabhängigen Membranständigkeit. In dieser Arbeit wurde der Oberflächenrezeptor CD40 zur Immobilisierung des generierten Fusionsproteins scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL genutzt. In verschieden Experimenten konnten mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL in CD40-exprimierenden Zellen starke Apoptoseinduktion ermittelt werden. Charakteris-tische Kennzeichen und Spaltprodukte der Apoptose konnten ausschließlich in CD40-positiven Tumorzellen detektiert werden. Dabei wurde in allen Versuchen die für die Apoptoseinduktion benötigte Konzentration des Konstrukts mithilfe des Proteinsyntheseinhibitors CHX um das 10- bis 100-fache verringert. Es konnte auch gezeigt werden, dass in CD40-positiven Zellen, nach Stimulation mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL, nicht-apoptotische Signalwege verstärkt aktiviert werden. Dies war auf die agonistische Aktivität des monoklonalen Antikörperfragments scFv:CD40 zurückzuführen. Die Antikörperdomäne war folglich nicht nur zur effizienten Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren mittels Immobilisierung fähig, sondern konnte zusätzlich zur Stimulation des Immunsystems genutzt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass der lösliche, schwach aktive Ligand TRAIL mittels Oberflächenimmobilisierung über Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen in einen hochaktiven Liganden mit lokal begrenzter Toxizität überführt werden kann. Mithilfe dieses Fusionsproteins ist es somit möglich die selektive Toxizität von TRAIL durch Steigerung seiner Aktivität effizient zu nutzen. Zusätzlich kann durch die Antigenbindung der Wirkungsbereich weiter eingegrenzt werden (CD40-positive Tumoren), wodurch unerwünschte Nebenwirkungen reduziert oder sogar ausgeschaltet werden können. Das in Tumoren oft heruntergefahrene Immunsystem kann CD40-abhängig stimuliert werden, um somit auch Tumorzellen in apoptoseresistenten Stadien zu eliminieren. Basierend auf diesen Ergebnissen können in der Zukunft weitere Studien zur Therapie von TRAIL-resistenten, CD40-exprimierenden Tumoren fortgeführt werden. N2 - TRAIL has been characterized in 1997 based on its high sequence homology towards the TNFL CD95L (28 %). Differing from the ligands CD95L and TNF, TRAIL has the remarkable quality to induce apoptosis in tumor cells, while healthy cells are protected from apoptosis. In this case apoptosis is accomplished by the death receptors TRAILR1 and TRAILR2. However soluble TRAIL binds and activates primarily the death receptor TRAILR1, while membrane-bound TRAIL activates well both TRAILR1 and TRAILR2. In recent years different methods have been generated to raise the bioactivity of soluble TRAIL. To these belong for example: stabilization of the trimeric molecule structure with the TNC-domain, oligomerization of the ligand with the monoclonal antibody M2, generation of an artificial antigen-restricted membrane-bound form. In this work we made use of the surface receptor CD40 for immobilization of the generated fusion protein scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL. With the aid of this fusion protein it is thus possible to use the selective toxicity of TRAIL efficiently by an increase of its activity. Additionally the field of action could be localized further by antigen binding (CD40-positive tumors). As a consequence undesirable side effects can be reduced or even deactivated. The shut down immune system in tumors can be stimulated CD40-dependant, so that tumor cells resistant to apoptosis are also wiped out. Based on these results future studies may be conducted to treat TRAIL-resistant, CD40-expriming tumors. KW - Tumor-Nekrose-Faktor / Rekombinantes Protein KW - Tumorantigen KW - Antigen CD40 KW - Apoptosis KW - TRAIL KW - CD40 KW - Tumortherapie KW - Todesrezeptoren KW - Antikörper KW - TRAIL KW - CD40 KW - death receptors KW - tumor treatment KW - antibody Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106813 ER - TY - JOUR A1 - Karl, I. A1 - Jossberger-Werner, M. A1 - Schmidt, N. A1 - Horn, S. A1 - Goebeler, M. A1 - Leverkus, M. A1 - Wajant, H. A1 - Giner, T. T1 - TRAF2 inhibits TRAIL- and CD95L-induced apoptosis and necroptosis JF - Cell Death & Disease N2 - The relevance of the adaptor protein TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) for signal transduction of the death receptor tumour necrosis factor receptor1 (TNFR1) is well-established. The role of TRAF2 for signalling by CD95 and the TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) DRs, however, is only poorly understood. Here, we observed that knockdown (KD) of TRAF2 sensitised keratinocytes for TRAIL- and CD95L-induced apoptosis. Interestingly, while cell death was fully blocked by the pan-caspase inhibitor benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(OMe)-fluoromethylketone (zVAD-fmk) in control cells, TRAF2-depleted keratinocytes were only partly rescued from TRAIL- and CD95L-induced cell death. In line with the idea that the only partially protective effect of zVAD-fmk on TRAIL- and CD95L-treated TRAF2-depleted keratinocytes is due to the induction of necroptosis, combined treatment with zVAD-fmk and the receptor interacting protein 1 (RIP1) inhibitor necrostatin-1 fully rescued these cells. To better understand the impact of TRAF2 levels on RIP1- and RIP3-dependent necroptosis and RIP3-independent apoptosis, we performed experiments in HeLa cells that lack endogenous RIP3 and HeLa cells stably transfected with RIP3. HeLa cells, in which necroptosis has no role, were markedly sensitised to TRAIL-induced caspase-dependent apoptosis by TRAF2 KD. In RIP3-expressing HeLa transfectants, however, KD of TRAF2 also strongly sensitised for TRAIL-induced necroptosis. Noteworthy, priming of keratinocytes with soluble TWEAK, which depletes the cytosolic pool of TRAF2-containing protein complexes, resulted in strong sensitisation for TRAIL-induced necroptosis but had only a very limited effect on TRAIL-induced apoptosis. The necroptotic TRAIL response was not dependent on endogenously produced TNF and TNFR signalling, since blocking TNF by TNFR2-Fc or anti-TNFα had no effect on necroptosis induction. Taken together, we identified TRAF2 not only as a negative regulator of DR-induced apoptosis but in particular also as an antagonist of TRAIL- and CD95L-induced necroptosis. KW - Nekrose KW - Apoptosis Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119166 SN - 2041-4889 VL - 5 ER - TY - JOUR A1 - Rödel, Mark-Oliver A1 - Brede, Christian A1 - Hirschfeld, Mareike A1 - Schmitt, Thomas A1 - Favreau, Philippe A1 - Stöcklin, Reto A1 - Wunder, Cora A1 - Mebs, Dietrich T1 - Chemical Camouflage - A Frog's Strategy to Co-Exist with Aggressive Ants JF - PLOS ONE N2 - Whereas interspecific associations receive considerable attention in evolutionary, behavioural and ecological literature, the proximate bases for these associations are usually unknown. This in particular applies to associations between vertebrates with invertebrates. The West-African savanna frog Phrynomantis microps lives in the underground nest of ponerine ants (Paltothyreus tarsatus). The ants usually react highly aggressively when disturbed by fiercely stinging, but the frog is not attacked and lives unharmed among the ants. Herein we examined the proximate mechanisms for this unusual association. Experiments with termites and mealworms covered with the skin secretion of the frog revealed that specific chemical compounds seem to prevent the ants from stinging. By HPLC-fractionation of an aqueous solution of the frogs' skin secretion, two peptides of 1,029 and 1,143 Da were isolated and found to inhibit the aggressive behaviour of the ants. By de novo sequencing using tandem mass spectrometry, the amino acid sequence of both peptides consisting of a chain of 9 and 11 residues, respectively, was elucidated. Both peptides were synthesized and tested, and exhibited the same inhibitory properties as the original frog secretions. These novel peptides most likely act as an appeasement allomone and may serve as models for taming insect aggression. KW - amphibian skin secretions KW - antimicrobial peptides KW - paltothyreus tarsatus KW - dendrobates pumilio KW - anurans KW - microhylidae KW - hymenoptera KW - formicidae KW - mutualisms KW - alkaloids Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128181 SN - 1932-6203 VL - 8 IS - 12 ER - TY - JOUR A1 - Carmona Arana, José Antonio A1 - Seher, Axel A1 - Neumann, Manfred A1 - Lang, Isabell A1 - Siegmund, Daniela A1 - Wajant, Harald T1 - TNF Receptor-Associated Factor 1 is a Major Target of Soluble TWEAK JF - Frontiers in Immunology N2 - Soluble tumor necrosis factor (TNF)-like weak inducer of apoptosis (TWEAK), in contrast to membrane TWEAK and TNF, is only a weak activator of the classical NFκB pathway. We observed that soluble TWEAK was regularly more potent than TNF with respect to the induction of TNF receptor-associated factor 1 (TRAF1), a NFκB-controlled signaling protein involved in the regulation of inflammatory signaling pathways. TNF-induced TRAF1 expression was efficiently blocked by inhibition of the classical NFκB pathway using the IKK2 inhibitor, TPCA1. In contrast, in some cell lines, TWEAK-induced TRAF1 production was only partly inhibited by TPCA1. The NEDD8-activating enzyme inhibitor MLN4924, however, which inhibits classical and alternative NFκB signaling, blocked TNF- and TWEAK-induced TRAF1 expression. This suggests that TRAF1 induction by soluble TWEAK is based on the cooperative activity of the two NFκB signaling pathways. We have previously shown that oligomerization of soluble TWEAK results in ligand complexes with membrane TWEAK-like activity. Oligomerization of soluble TWEAK showed no effect on the dose response of TRAF1 induction, but potentiated the ability of soluble TWEAK to trigger production of the classical NFκB-regulated cytokine IL8. Transfectants expressing soluble TWEAK and membrane TWEAK showed similar induction of TRAF1 while only the membrane TWEAK expressing cells robustly stimulated IL8 production. These data indicate that soluble TWEAK may efficiently induce a distinct subset of the membrane TWEAK-targeted genes and argue again for a crucial role of classical NFκB pathway-independent signaling in TWEAK-induced TRAF1 expression. Other TWEAK targets, which can be equally well induced by soluble and membrane TWEAK, remain to be identified and the relevance of the ability of soluble TWEAK to induce such a distinct subset of membrane TWEAK-targeted genes for TWEAK biology will have to be clarified in future studies. KW - RAF1 KW - TWEAK KW - TNF KW - NFκB KW - CD40 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120620 SN - 1664-3224 VL - 5 IS - 63 ER - TY - JOUR A1 - Trebing, J. A1 - El-Mesery, M. A1 - Schäfer, V. A1 - Weisenberger, D. A1 - Siegmund, D. A1 - Silence, K. A1 - Wajant, H. T1 - CD70-restricted specific activation of TRAILR1 or TRAILR2 using scFv-targeted TRAIL mutants JF - Cell Death & Disease N2 - To combine the CD27 stimulation inhibitory effect of blocking CD70 antibodies with an antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC)-independent, cell death-inducing activity for targeting of CD70-expressing tumors, we evaluated here fusion proteins of the apoptosis-inducing TNF family member TRAIL and a single-chain variable fragment (scFv) derived from a high-affinity llama-derived anti-human CD70 antibody (lαhCD70). A fusion protein of scFv:lαhCD70 with TNC-TRAIL, a stabilized form of TRAIL, showed strongly enhanced apoptosis induction upon CD70 binding and furthermore efficiently interfered with CD70-CD27 interaction. Noteworthy, introduction of recently identified mutations that discriminate between TRAILR1 and TRAILR2 binding into the TRAIL part of scFv:lαhCD70-TNC-TRAIL resulted in TRAIL death receptor-specific fusion proteins with CD70-restricted activity. KW - apoptosis KW - CD27 KW - CD70 KW - scFv KW - TRAIL Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120078 VL - 5 ER - TY - THES A1 - Schenkhoff, Felix Stephan T1 - Herstellung und Charakterisierung multifunktioneller Fusionsproteine des membranständigen Fas-Liganden und des membranständigen CD40-Liganden T1 - Development and Characterization of multifunctional fusionproteins of the membranous Fas-ligand and of the membranous CD40-ligand N2 - TNF-Liganden liegen primär in membranständiger Form mit trimerer Struktur vor und die meisten von ihnen können sekundär durch Metalloproteasen in lösliche trimere Liganden prozessiert werden. Während membranständige Formen der TNF-Liganden ihre korrespondierenden Rezeptoren aktivieren können, sind die löslichen Varianten einzelner TNF-Liganden unterschiedlich aktiv beziehungsweise inaktiv an den korrespondierenden Rezeptoren, obwohl sie ebenfalls zur Bindung in der Lage sind. Dies konnte bereits in Studien für TNF und TRAIL gezeigt werden. Die Unterschiede zwischen löslichen Varianten und der membranständigen Form des Liganden betreffen sowohl die Rezeptorselektivität als auch den Aktivierungsgrad am Rezeptor bis hin zu völliger Inaktivität der löslichen Form. Unterschiede finden sich jedoch nicht nur hinsichtlich der Aktivität, sondern auch in der Interaktion des Liganden mit dem Rezeptor. Für die membranständige und die lösliche Form von FasL konnten Unterschiede in der Notwendigkeit intrazellulärer Signalmoleküle bei der Ausbildung Ligand-induzierter Rezeptorsignalcluster gezeigt werden. Für die lösliche und membranständige Form des CD40L werden eine unterschiedliche Rezeptorinternalisierung und eine unterschiedliche Rekrutierung von TRAF-Molekülen angenommen. Bisherige Arbeiten zur Untersuchung der Rezeptor-Ligand-Interaktion stützen sich meist auf lösliche Varianten von TNF-Liganden, die durch artifizielle Multimerisierung oder Antikörper-induzierte Quervernetzung sekundär aktiviert werden müssen. Um für die Untersuchung der Rezeptor-Ligand-Interaktion in Zukunft realitätsnähere Bedingungen zu schaffen, sollten im Rahmen dieser Arbeit multifunktionelle Fusionsproteine des membranständigen FasL und CD40L hergestellt und charakterisiert werden. Die Fusionsproteine wurden im Rahmen der Klonierung so konstruiert, dass von der aminoterminalen Seite beginnend eine GST-Domäne, ein Flag-Tag, ein YFP-Tag und abschließend die vollständige membranständige Form des Liganden (FasL oder CD40L) aneinander gefügt wurden. In FACS-Analysen konnte sowohl die Funktion des YFP-Tag als auch die korrekte Expression des Liganden an der Zelloberfläche durch spezifische Antikörperfärbung nachgewiesen werden. Die funktionelle Aktivität der Liganden wurde durch IL-8-Induktion gezeigt, die eine Aktivierung des NFB-Signalweges durch die GST-Fusionsproteine des membranständigen FasL und des membranständigen CD40L beweist. Im Rahmen von Immunopräzipitationen wurde die Möglichkeit der Detektion der Fusionsproteine über ihr Flag-Tag getestet. Für das in GST-pull-down-Assays genauer untersuchte membranständige GST-Flag-YFP-CD40L-Fusionsprotein gelang eine Koimmunopräzipitation mit dem im Rezeptorkomplex gebundenen TRAF2. Für dieses in der Signaltransduktion des CD40 entscheidende Molekül konnte seine transiente Interaktion mit dem Rezeptorsignalkomplex sowie eine Veränderung in der Assoziation an den Rezeptor durch TNF-abhängige TRAF1-Induktion gezeigt werden. Im Zusammenhang der mit der Rezeptoraktivierung oftmals gleichgesetzten Bildung von Rezeptorsignalclustern durch den entsprechenden TNF-Liganden war die Beobachtung interessant, dass das Konstrukt GST-Flag-YFP-CD40L im Gegensatz zum analog konstruierten GST-Flag-YFP-FasL nicht in der Lage war, Signalcluster des korrespondierenden Rezeptors zu erzeugen, aber dennoch fähig war, eine Rezeptoraktivierung zu bewirken. Hinsichtlich der Untersuchung von Unterschieden in der Rezeptor-Ligand-Interaktion von löslichen und membranständigen Formen sind für FasL und CD40L noch viele Fragen offen, die beispielsweise auch die Stabilität von Rezeptorsignalclustern betreffen. Die in dieser Arbeit erzeugten und charakterisierten multifunktionellen Fusionsproteine sollten helfen, neue Erkenntnisse bezüglich der molekularen Grundlagen der Rezeptor-Ligand-Interaktion zu erzielen. N2 - TNF ligands primary are membranous ligands with a trimeric structure and the most of them can be cleaved to soluble trimeric forms by metalloproteases secondarily. While membranous forms of TNF ligands can activate their corresponding receptors, soluble variants ot some TNF ligands are insufficient for full activity or totally inactive. Nevertheless these variants are able to bind the corresponding receptor properly. This already could be shown in experiments with TNF and TRAIL. The differences between soluble variants and the membranous form of TNF ligands concern their receptor selectivity as well as their degree of activity at the receptor. There also are differences regarding the interaction itself between ligand and receptor. Comparing the membranous and the soluble form of Fas ligand there could be shown differences in terms of dependency for intracellular signaling moleculs regarding the formation of ligand induced clustering of the receptor. The soluble and the membranous form of CD40 ligand are supposed to have differences in receptor internalization and recruting of TRAF molecules. Previous research concentrating on receptor ligand interactions often is based on soluble variants of TNF ligands that have to be activated by artificial multimerization or antibody dependent aggregation. To provide more realistic conditions for the analysis of receptor ligand interactions, multifunctional fusionproteins of the membranous Fas ligand and the membranous CD40 ligand should be developed and characterized in this dissertation. Starting from the N-terminal end the fusionproteins contain a GST-domain, a Flag-tag, a YFP-tag and the complete membranous form of the ligand. In FACS analysis the activity of the YFP-tag as well as the correct expression of the ligand on the cell membrane could be demonstrated by specific antibody staining. The functional activity of the ligand itself has been shown by IL-8-induction, that proves the sucessful activation of the NFB signaling pathway by GST-fusionproteins of the membranous Fas ligand and the membranous CD40 ligand. In the context of immunoprecipitations the possibility of detection of the fusionproteins by Flag-tag has been tested. Concerning the GST-pull-down-assays of the fusionprotein GST-Flag-YFP-CD40L a coimmunoprecipitation with the intracellular adaptor protein TRAF2 could be shown. A transient interaction of TRAF2 with the receptor signaling complex as well as a change of its association with the receptor by TNF-induced TRAF1 upregulation also could be demonstrated. In context with the formation of high molecular receptor clusters that are often equated with receptor activation the observation was interesting that GST-Flag-YFP-CD40L in contrast to the analogous constructed GST-Flag-YFP-FasL could not induce signalling cluster of the corresponding receptor, but still was able to induce receptor activation. Regarding the analysis of differences in receptor ligand interaction between soluble and membranous forms of Fas ligand and CD40 ligand there are still many questions that have to be answered, e.g. in terms of stability of induced receptor clustering. The multifunctional fusionproteins provided by this dissertation shall contribute to gain new findings in respect of molecular fundamentals of the receptor ligand interaction. KW - Tumor-Necrose-Faktor KW - Entzündung KW - Apoptose KW - TNF-Superfamilie KW - CD40-Ligand KW - Fas-Ligand KW - Rezeptorsignalkomplexe KW - TNF superfamily KW - CD40L KW - FasL KW - receptor cluster Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25978 SN - xxx ER - TY - THES A1 - Roos, Claudia T1 - Characterization of tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis (TWEAK)-induced signaling pathways T1 - Charakterisierung TWEAK induzierter Signalwege N2 - TWEAK ist ein typischer Vertreter der TNF Ligandenfamilie. TWEAK wird als Typ II Transmembranprotein exprimiert, kann jedoch durch proteolytische Prozessierung auch als lösliches Protein freigesetzt werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass oligomerisiertes TWEAK in Hinblick auf die Aktivierung des klassischen NFκB Signalweges deutlich aktiver ist als lösliches, trimeres TWEAK. Jedoch sind beide TWEAK-Varianten in der Lage, die Depletion von TRAF2 und die Prozessierung von p100, beides Kennzeichen für die Aktivierung des alternativen NFκB Signalweges, zu induzieren. Ebenso wie andere lösliche TNF-Liganden, die ihren entsprechenden Rezeptor nur schwach aktivieren, erlangt lösliches TWEAK durch Oligomerisierung vergleichbare Aktivität zum membrangebundenen Liganden. TRAF2 spielt eine Schlüsselrolle in der TWEAK-vermittelten NFκB Aktivierung. Durch Depletion oder Degradation von TRAF2 fällt die Entscheidung, ob lediglich der alternative oder beide, der klassische und der alternative NFκB Signalweg aktiviert werden. Die Blockade des TWEAK-Rezeptors Fn14 inhibiert die Aktivierung der NFκB Signalwege, ungeachtet welche Form von TWEAK zur Stimulation genutzt wird. Das weist darauf hin, dass die unterschiedlichen Aktivitäten der beiden TWEAK-Varianten in der Induktion des klassischen und alternativen NFκB Signalweges nicht durch die Nutzung verschiedener Rezeptoren verursacht sind. Damit wird in dieser Arbeit anhand von TWEAK zum ersten mal gezeigt, dass ein TNF Ligand in unterschiedlichen Varianten qualitativ unterschiedliche Aktivitäten des entsprechenden TNF Rezeptors auslöst. N2 - TWEAK is a typical member oft he TNF ligand family. Therefore it is initially expressed as a type II transmembrane protein, but a soluble variant can be released by proteolytic processing. In this work it is shown that oligomerized TWEAK is more competent than soluble, trimeric TWEAK regarding the activation of classical NFκB signaling pathway. However, both TWEAK variants are able to induce depletion of TRAF2 and processing of p100, which are hallmarks for the activation of the noncanonical NFκB pathway. Like other solube TNF ligands with no or poor activity on their corresponding receptor, TWEAK gains high activity upon oligomerization resembling the activity of the transmembrane ligand. TRAF2 has a key role in TWEAK-induced NFκB signaling. Depletion or degradation of TRAF2 is crucial for activation of the noncanonial or both, the classical and the noncanonical NFκB pathway. Blocking the TWEAK receptor Fn14 inhibits the activation of NFκB signaling, irrespective of the TWEAK form used for stimulation. This indicates that the different activities of the two TWEAK variants in activation of classical and noncanonical NFκB signaling are not caused by the use of different receptors. Therefore this study on TWEAK is the first reported case where one TNF ligand in different variants induces qualitatively different activities of the corresponding TNF receptor. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Signaltransduktion KW - Fn14 KW - NFkappaB KW - p100 KW - TRAF2 KW - TWEAK KW - Fn14 KW - NFkappaB KW - p100 KW - TRAF2 KW - TWEAK Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45295 ER - TY - THES A1 - Walter, Franziska T1 - Pharmakologische Postkonditionierung mit dem Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptoragonisten FTY 720 nach myokardialer Ischämie/Reperfusion T1 - Pharmacological pre- and postconditioning with the sphingosine-1-phosphate receptor modulator FTY 720 after myocardial ischemia-reperfusion N2 - Einleitung: Mehrere ex vivo Studien zeigten zuletzt, dass Sphingosin-1-phosphate Schutz gegen myokardiale Ischämie/ Reperfusionsschaden verleihen [19], [20]. Der synthetische Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoragonist FTY 720 war ebenso in der Lage, Entzündungsreaktionen in verschiedenen Krankheitsmodellen zu verringern [8]. Deshalb wollten wir die Hypothese prüfen, dass eine Behandlung mit FTY 720 zu einer Infarktgrößenreduktion nach myokardialer Ischämie/ Reperfusion in vivo führt. Methode: In männlichen Wistar Ratten wurde myokardiale Ischämie dadurch induziert, dass wir die linke Koronararterie für 45 min mittels Fadenligatur verschlossen. Nach 24 h wurde die Infarktgröße bestimmt und die Granulozyteninfiltration im Infarktgebiet festgestellt. Caspase 3 Aktivität und TNF- alpha Konzentration im Myokardgewebe wurden durch ELISA ermittelt. FTY 720 wurde vor Beginn der Reperfusion i. p. appliziert oder 24 h vor Reperfusionsbeginn und nochmals direkt vor Reperfusionsbeginn. Ergebnisse: Die einmalige Gabe von 0,5 mg/kg FTY 720 vor Reperfusion oder die zusätzliche Vorbehandlung der Tiere 24 Stunden vor der operativen Infarzierung reduzierte signifikant die periphere Lymphozytenanzahl. Sie nahm keinen Einfluss auf die Granulozytenanzahl im Blut. FTY 720 reduzierte die Granulozyteninfiltration und die TNF- alpha Konzentration der Borderzone. Es hatte aber keinen Effekt auf die myokardiale Caspase 3 Aktivität. Beide Behandlungsformen, weder die FTY 720- Gabe vor Reperfusionsbeginn noch die zweimalige FTY 720- Gabe waren in der Lage, Infarktgröße am Rattenherz zu reduzieren. FTY 720 erhöhte jedoch die Sterblichkeit der Ratten, wenn es einmalig vor Reperfusionsbeginn gegeben wurde, da es fatale myokardiale Arrhythmien induzierte. Zusammenfassung: Trotz seines antiinflammatorischen Effektes bei einmaliger Gabe von FTY 720 wurde die Sterblichkeit der Tiere durch Arrhythmieinduktion erhöht. Beide Behandlungsregimes konnten die Infarktgröße nicht reduzieren. N2 - Objective: Several recent experiments demonstrated that the Sphingosine-1-phosphate receptor agonist FTY720 improves recovery of function after myocardial ischemia-reperfusion ex vivo. Therefore, we tested the hypothesis that pharmacological postconditioning with FTY720 reduces infarct size after myocardial ischemia-reperfusion in vivo. Methods: Myocardial ischemia was induced in Wistar rats by ligating the left coronary artery for 45 minutes. After 24 hours reperfusion, we determined infarct size by TTC staining and granulocyte infiltration by immunohistochemistry. Serum and myocardial TNF-α concentration was determined by ELISA. FTY720 (0.5 mg/ kg) was applied i.p. either once, with reperfusion, or twice, 24 hours before myocardial ischemia and before reperfusion. Results: In both groups, FTY720 significantly reduced peripheral lymphocyte count in peripheral blood. FTY720 treatment attenuated granulocyte infiltration and TNF-α protein expression in reperfused myocardium. However, both treatment regimens were not able to reduce infarct size. FTY720 increased mortality due to induction of fatal ventricular tachyarrhythmias when administered once with reperfusion, but not when given 24 hours prior to ischemia. Conclusion: Despite anti-inflammatory effects, postconditioning treatment with FTY720 does not reduce infarct size but increases mortality during myocardial ischemia-reperfusion. Pre-treatment with FTY720 before ischemia abrogated the deleterious pro-arrhythmic effects without reducing infarct size KW - FTY 720 KW - Postkonditionierung KW - Ischämie/ Reperfusion KW - FTY 720 KW - Postconditioning KW - Ischemia/ Reperfusion Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46402 ER -