TY  - THES
A1  - Lother, Jasmin
T1  - Interaktion dendritischer Zell-Subtypen mit dem human pathogenen Schimmelpilz \(Aspergillus fumigatus\)
T1  - Interaction of dendritic cell subtypes with the human pathogenic mould fungus \(Aspergillus fumigatus\)
N2  - Die invasive Aspergillose (IA) z¨ ahlt zu den seltenen, bei immunsupprimierten Patienten
jedoch mit einer hohen Letalit¨ at verbundenen Infektionskrankheiten. Sie wird, wie alle
Aspergillosen, durch den humanpathogenen Schimmelpilz Aspergillus fumigatus ausgel¨ ost.
Bis heute ist die oft nicht effektive Therapie einer IA mit hohen Nebenwirkungen und
Kosten verbunden. Die Entwicklung von Pathogen-spezifischen Immuntherapien soll durch
die Forschung im Bereich der immunologischen Infektionsbiologie vorangetrieben werden.
Fur neuen Erkenntnisse wird die Interaktion von humanen Immunzellen mit ¨ A. fumigatus
analysiert.
In der vorliegenden Studie wurde mit dendritischen Zellen (DCs) gearbeitet, da diese
Pilzmorphologien von A. fumigatus phagozytieren k¨ onnen und uber Antigenpr ¨ ¨ asentation
das adaptive Immunsystem aktivieren. Es wurden aus humanen Monozyten differenzierte DCs (moDCs) verwendet, mit welchen viele Forschergruppen aufgrund ihrer verfugbar ¨
großen Anzahl arbeiten. Allerdings dauert die Generierung von moDCs funf Tage. Aus ¨
dem peripheren Blut entstammende CD1c-positive myeloide DCs (mDCs) oder CD303-
positive plasmazytoide DCs (pDCs) k¨ onnen dagegen direkt nach der Isolation verwendet
werden. Die beiden DC-Populationen werden aus verschiedenen Vorl¨ auferzellen des h¨ amatopoetischen Systems im Knochenmark gebildet. Ihr Ph¨ anotyp und ihre Immunfunktionen
unterscheiden sich untereinander und auch von denen der moDCs.
In Interaktionsstudien konnte analysiert werden, dass die drei verwendeten DC-Subtypen
(moDCs, mDCs, pDCs) unterschiedlich auf A. fumigatus reagieren. moDCs und mDCs reiften in direktem Kontakt zu Aspergillus, sie sekretierten ein relativ ¨ ahnliches Zytokinprofil
und exprimierten die bekannten Aspergillus-Rezeptoren Dectin-1, TLR2 und TLR4. Im
Kontrast dazu verblieben pDCs trotz Aspergillus-Kontakt unreif und sekretierten nahezu
keine Zytokine. Da moDCs und mDCs eine Immunreaktion auf den Pilz zeigten, wurden
sie mit verschiedenen Aspergillus-Antigenen beladen und n¨ aher untersucht.
Bevor verschiedene Aspergillus-Antigene zur Beladung der DCs eingesetzt werden konnten, wurden diese analysiert und aufgereinigt. Hierfur wurde ein routinierter Arbeitsprozess ¨
etabliert. Zwei der vier verfugbaren Proteinantigene waren mit Endotoxin kontaminiert. ¨
Da schon geringe Mengen an Endotoxinen auf DCs einen stimulatorischen Effekt ausubten, ¨
wurden die Proteine mittels Affinit¨ atschromatografie von den verunreinigenden Endotoxinen befreit.
In den Stimulationsexperimenten wirkten die beiden Proteinantigene CcpA und SHMT
immunogen auf moDCs und mDCs. CcpA induzierte eine st¨ arkere Maturierung und Zytokinfreisetzung als SHMT. Auff¨ allig war, dass mDCs im Vergleich zu moDCs die Expression
von MHC Klasse II st¨ arker erh¨ ohten und mehr IL18 freisetzten. Die mit CcpA oder SHMT
beladenen moDCs und mDCs aktivierten autologe T-Zellen zur IFNg Sekretion und zur
Proliferation. Zudem wurden durch die beiden Proteine Aspergillus-spezifische, CD154-
positive T-Zellen induziert. Diese Aspergillus-spezifische Immunogenit¨ at von CcpA und
SHMT macht die beiden Proteine zu interessanten Kandidaten fur einen Vakzinierungs- ¨
Cocktail einer DC-Immuntherapie. Aspergillus Lysat induzierte als weiteres Antigen eine
T-Zell Immunantwort mit CD154-positiven T-Zellen. Zudem war die Proliferation und
IFNg Sekretion von T-Zellen induziert, obwohl moDCs und mDCs nicht reiften und nur
wenige Zytokine sekretierten. Die beiden Aspergillus-Proteine CpcB und fg-gap induzierten die Reifung und Zytokinsekretion von moDCs und mDCs nicht. Demzufolge sind CpcB
und fg-gap fur eine DC-Immuntherapie nicht empfehlenswert. ¨
Ein Vakzinierungs-Cocktail enth¨ alt in der Regel Adjuvantien, welche die Immunreaktion
verst¨ arken. Adjuvante Effekte auf moDCs konnten die getesteten Aspergillus-RezeptorLiganden Zymosan, Pam3CSK4, LPS ultrapur und R848 ausl¨ osen. Hyalurons¨ aure konnte keine Verbesserung der Reifung oder Vitalit¨ at von moDCs und mDCs bewirken. Die
Antigen-bedingte Reifung der DCs fur n ¨ ¨ otige Restimulationen w¨ ahrend der Therapie konnte mittels einer tiefgekuhlten Lagerung in CryoStor Einfriermedium stabil beibehalten ¨
werden.
Die beiden immunogenen Aspergillus-Proteine, die adjuvanten Rezeptor-Agonisten und
die stabile Lagerung in CryoStor k¨ onnen als elementare Grundsteine fur einen Vakzinierungs- ¨
Cocktail einer anti-fungalen DC-Immuntherapie mit moDCs oder mDCs angesehen werden.
N2  - Invasive aspergillosis (IA) is one of the rare infectious diseases associated with a high
mortality rate that occurs in immunocompromised patients. Like all aspergillosis, it is caused by 
the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus. No effective therapy of IA is known to date and 
the current therapy is associated with high side effects and costs. More in-depth research is 
needed in the field of immunological infection biology, such as the interactions of human immune 
cells with A. fumigatus, for the development of pathogen-specific  immunotherapies.
In the present study dendritic cells (DCs) are investigated due to their ability to phago- cytose 
fungal morphologies of A. fumigatus and activate the adaptive immune system via antigen 
presentation. Monocytes which differentiate into DCs (moDCs) are used by many research groups due 
to their large numbers; however, their total generation time lasts five days. CD1c-positive myeloid 
DCs (mDCs) and CD303-positive plasmacytoid DCs (pDCs) found in the peripheral blood can be used 
directly after isolation. The two DC populations are formed from different precursor cells of the 
hematopoietic system in the bone marrow and therefore their phenotype and immune functions differ 
from each other and also from
those of moDCs. ...
KW  - Dendritische Zellen
KW  - Aspergillus
KW  - Untertyp
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140940
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dagvadorj, Nergui
T1  - Improvement of T-cell response against WT1-overexpressing leukemia by newly developed anti-hDEC205-WT1 antibody fusion proteins
T1  - Verbesserung der T-Zellantwort gegen WT1-überexprimierende Leukämie mit neu entwickelten anti-hDEC205-WT1-Antikörperfusionsproteinen
N2  - Wilms tumor protein 1 (WT1) is a suitable target to develop an immunotherapeutic approach against high risk acute myeloid leukemia (AML), particularly their relapse after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). As an intracellular protein traversing between nucleus and cytoplasm, recombinant expression of WT1 is difficult. Therefore, an induction of WT1-specific T-cell responses is mostly based on peptide vaccination as well as dendritic cell (DC) electroporation with mRNA encoding full-length protein to mount WT1-derived peptide variations presented to T cells. Alternatively, the WT1 peptide presentation could be broadened by forcing receptor-mediated endocytosis of DCs. 
In this study, antibody fusion proteins consisting of an antibody specific to the human DEC205 endocytic receptor and various fragments of WT1 (anti-hDEC205-WT1) were generated for a potential DC-targeted recombinant WT1 vaccine. Anti-hDEC205-WT1 antibody fusion proteins containing full-length or major parts of WT1 were not efficiently expressed and secreted due to their poor solubility and secretory capacity. However, small fragment-containing variants: anti-hDEC205-WT110-35, anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273, and anti-hDEC205-WT1324-371 were obtained in good yields. 
Since three of these fusion proteins contain the most of the known immunogenic epitopes in their sequences, the anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273, and anti-hDEC205-WT1324-371 were tested for their T-cell stimulatory capacities. Mature monocyte-derived DCs loaded with anti-hDEC205-WT191-138 could induce ex vivo T-cell responses in 12 of 16 blood samples collected from either healthy or HSC transplanted individuals compared to included controls (P < 0.01). Furthermore, these T cells could kill WT1-overexpressing THP-1 leukemia cells in vitro after expansion. 
In conclusion, alongside proving the difficulty in expression and purification of intracellular WT1 as a vaccine protein, our results from this work introduce an alternative therapeutic vaccine approach to improve an anti-leukemia immune response in the context of allogeneic HSCT and potentially beyond.
N2  - Für die Entwicklung eines immuntherapeutischen Ansatzes zur Behandlung von hoch Risikopatienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) und insbesondere zur Vorbeugung von Rezidiven nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) stellt das Wilms-Tumor-Protein 1 (WT1) ein geeignetes Angriffsziel dar. Die rekombinante Expression von WT1, welches als Transkriptionsfaktor vom Zytosol in den Zellkern transloziert, gestaltet sich äußerst schwierig. WT1-spezifische T-Zellantworten werden daher hauptsächlich mittels Peptidvakzinierung oder Transfektion dendritischer Zellen (DC) mit mRNA, welche das vollständige WT1-Protein kodiert, herbeigeführt. Letzterer Ansatz bietet den Vorteil, dass passierenden T-Zellen eine größere Vielfalt an WT1-Peptidvarianten präsentiert werden kann. Eine verbesserte Peptidpräsentation kann außerdem über eine Optimierung der Rezeptor-vermittelten Endozytose der DCs erzielt werden.
Ziel der folgenden Arbeit war es, ein rekombinantes DC-gerichtetes WT1-Vakzin zu entwickeln. Dazu wurden anti-hDEC205-WT1-Fusionsproteine,  bestehend aus einem Antikörper gegen den humanen DEC205-Endozytoserezeptor und verschiedenen WT1-Fragmenten, konstruiert. Während sich Fusionsproteine, die das vollständige WT1-Protein oder große Teile dessen beinhalteten, aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit und schwachen Sekretion kaum exprimieren und aufreinigen ließen, lieferte die Produktion der Fusionsproteine mit kürzeren WT1-Fragmenten,  anti-hDEC205-WT110-35, anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273 und anti-hDEC205-WT1324-371, sehr gute Ausbeuten. Da letztere drei Proteine die meisten bislang bekannten immunogenen WT1-Peptide in ihrer Sequenz enthalten, wurde anschließend ihre Fähigkeit zur T-Zellstimulation untersucht. Dabei konnte in 12 von 16 Blutproben, die entweder von gesunden Spendern oder SZT-Patienten stammten, gezeigt werden, dass mit anti-hDEC205-WT191-138 beladene, reife, aus Monozyten generierte DCs ex vivo signifikant stärkere T-Zellantworten auslösen als die jeweils mitgeführten Kontrollen (P < 0.01). 
Nach Expansion waren die so aktivierten WT1-spezifischen T-Zellen sogar in der Lage, die WT1-überexprimierende AML-Zelllinie THP-1 in vitro zu lysieren.
In der vorliegenden Arbeit konnten daher nicht nur die bereits bekannten Schwierigkeiten der WT1-Expression und Aufreinigung bestätigt werden, sondern darüber hinaus konnte eine alternative therapeutische Vakzinierungsmethode zur Optimierung der anti-leukämischen Immunantwort im Rahmen einer allogenen SZT entwickelt werden.
KW  - antileukemia vaccine
KW  - Wilms tumor protein 1
KW  - anti-hDEC205-WT1 antibody fusion protein
KW  - dendritic cell-targeting
KW  - Akute myeloische Leukämie
KW  - Immuntherapie
KW  - Molekularbiologie
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149098
ER  - 
TY  - THES
A1  - Müller-Leisse, Johanna
T1  - Influence of myeloid-derived suppressor cells and neutrophil granulocytes on natural killer cell homeostasis and function
T1  - Einfluss myeloider Suppressorzellen und neutrophiler Granulozyten auf die Homöostase und Funktion natürlicher Killerzellen
N2  - Polymorphonuclear neutrophils (PMNs) are phagocytic cells of the innate immune system that efficiently kill bacteria. However, they also have regulatory effects on other immune cells and contribute to immunosuppression in cancer, which worsens the outcome. In particular, this has been demonstrated for a subset of granulocytic cells called myeloid- derived suppressor cells (MDSCs), but its distinction from PMNs is controversial. Most authors have explored the suppressive effects of MDSCs on T cells, but recent data suggest that NK cells are also affected. NK cells are crucial for the combat of tumor cells, in particular leukemic cells. There is hardly data available on the interaction between NK cells and suppressive granulocytic cells. Therefore, the aim of this thesis was to explore the effects of MDSCs and PMNs on the NK cell function against the leukemia cell line K562.
In co-culture experiments, I demonstrate that granulocytic MDSCs and PMNs had similar effects on NK cell function and homeostasis. On the one hand, they positively influenced the survival and maturation of NK cells. On the other, they inhibited the activation, cytotoxicity and cytokine production of NK cells, both IFNγ and TNFα, in response to K562 target cells. Furthermore, I show a down-regulation of the activating receptor NKp30 on NK cells in the presence of MDSCs or PMNs, which may form part of the underlying suppressive mechanisms.
However, there is also evidence for the involvement of other molecules. Further investigations are needed to confirm a relevant suppression of NK cells by granulocytic cells in cancer patients, and to identify therapeutic targets. The recognition that regular PMNs have similar effects on NK cells as MDSCs could simplify future experiments, since MDSCs are heterogeneous and laborious to isolate and identify.
NKcells and granulocytes are among the first immune cells to reconstitute after hematopoietic stem cell transplantation, and NK cells may be particularly exposed to suppressive effects of granulocytes this scenario. Modulating these suppressive effects of granulocytes on NK cells therapeutically may yield a better NK cell function and an improved cancer prognosis.

N2  - Neutrophile Granulozyten (polymorphonuclear neutrophils, PMNs) sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die insbesondere Bakterien durch Phagozytose unschädlich machen. Zusätzlich haben sie jedoch immunregulatorische und sogar immunsuppressive Eigenschaften. Sie tragen zur Suppression des Immunsystems im Rahmen von Tumorerkrankungen bei, was die Prognose negativ beeinflusst. Dies wurde insbesondere für einen Subtyp von Granulozyten, so genannte myeloide Suppressorzellen (myeloid-derived suppressor cells, MDSCs), gezeigt, wobei deren Unterscheidung von PMNs kontrovers diskutiert wird. Die meisten Autoren untersuchten suppressive Effekte von MDSCs auf T Zellen, doch auch NK Zellen sind betroffen. Eine funktionierende NK Zell Antwort ist entscheidend für die Abwehr von Tumorerkrankungen, insbesondere Leukämie. Über die Interaktion von NK Zellen und MDSCs ist bisher wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von MDSCs und PMNs auf die NK Zell Antwort auf Leukämiezellen zu untersuchen.

In Co-Kultur Experimenten zeige ich, dass granulozytäre MDSCs und PMNs ähnliche Effekte auf die Funktionen und Homöostase von NK Zellen haben. Einerseits wirkten sie sich positiv auf das Überleben und die Reifung der NK Zellen aus, andererseits hemmten sie deren Aktivierung, Zytotoxizität und Zytokinproduktion (sowohl IFNg als auch TNFa) als Antwort auf die Leukämie Zelllinie K562. Ferner war der Aktivierungsrezeptor NKp30 auf NK Zellen unter dem Einfluss der Granulozyten vermindert exprimiert, was mit für die inhibitorische Effekte verantwortlich sein könnte.

In weiteren Experimenten sollte die Relevanz der hier gezeigten Effekte in vivo bestätigt werden und die zugrundeliegenden Mechanismen untersucht werden. Der Hinweis, dass PMNs ähnliche hemmende Effekte auf NK Zellen ausüben wie MDSCs kann zukünftige Experimente vereinfachen, da die Isolierung  der MDSCs aufwändig und uneinheitlich ist.

NK Zellen und neutrophile Granulozyten sind unter den ersten Immunzellen, die sich nach einer hämatopoietischen Stammzelltransplantation erholen. NK Zellen könnten in dieser Situation besonders den hemmenden Einflüssen der Granulozyten unterliegen. Ein therapeutisches Eingreifen in diese Interaktion könnte die NK Zell Antwort stärken und die Prognose von Leukämieerkrankungen verbessern.
KW  - Natürliche Killerzelle
KW  - Neutrophiler Granulozyt
KW  - Neutrophil granulocytes interaction
KW  - Immunsuppression
KW  - MDSC
KW  - NK
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140734
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wallstabe, Lars
T1  - Development and preclinical evaluation of tumour-reactive T cells expressing a chemically programmable chimeric antigen receptor
T1  - Entwicklung und präklinische Evaluierung tumorreaktiver T- Zellen, die einen chemisch programmierbaren chimären Antigenrezeptor exprimieren
N2  - The genetic modification of T cells for the expression a chimeric antigen receptor (CAR) endows them with a new specificity for an antigen. Adoptive immunotherapy with CD19-CAR T cells has achieved high rates of sustained complete remissions in B cell malignancies. However, the downregulation or loss of the targeted antigen after mono-specific CAR T cell therapy, e.g. against CD19 or CD22, has been reported. Targeting multiple antigens on tumour cells, sequentially or simultaneously, could overcome this limitation. Additionally, targeting multiple antigens with CAR T cells could drive the translation from hematologic malignancies to prevalent solid cancers, which often express tumour-associated antigens heterogeneously. We hypothesised that expression of a universal CAR, which can be programmed with hapten-like molecules, could endow T cells with specificities for multiple antigens. 
In this study we introduce a novel chemically programmable CAR (cpCAR) based on monoclonal antibody h38C2. Our data show, that cpCARs form a reversible chemical bond to molecules containing a diketone-group and therefore can be programmed to acquire multiple specificities. We programmed cpCAR T cells with hapten-like compounds against integrins αvβ3 and α4β1 as well as the folate receptor. We observed tumour cell lysis, IFN ɣ and IL-2 production and proliferation of programmed cpCAR T cells against tumour cells expressing the respective target antigen in vitro.
As a reference to cpCARs programmed against αvβ3, we further introduced novel conventional αvβ3-CARs. These CARs, based on humanised variants of monoclonal antibody LM609 (hLM609), directly bind to integrin αvβ3 via their scFv. The four αvβ3-CAR constructs comprised either an scFv with higher affinity (hLM609v7) or lower affinity (hLM609v11) against αvβ3 integrin and either a long (IgG4 hinge, CH2, CH3) or short (IgG4 hinge) extracellular spacer. We selected the hLM609v7-CAR with short spacer, which showed potent anti-tumour reactivity both in vitro and in a murine xenograft model, for comparison with the cpCAR programmed against αvβ3. Our data show specific lysis of αvβ3-positive tumour cells, cytokine production and proliferation of both hLM609-CAR T cells and cpCAR T cells in vitro. However, conventional hLM609-CAR T cells mediated stronger anti-tumour effects compared to cpCAR T cells in the same amount of time. In line with the in vitro data, complete destruction of tumour lesions in a murine melanoma xenograft model was only observed for mice treated with conventional αvβ3-CAR T cells.
Collectively, we introduce a cpCAR, which can be programmed against multiple tumour antigens, and hLM609-CARs specific for the integrin αvβ3. The cpCAR technology bears the potential to counteract current limitations, e.g. antigen loss, of current monospecific CAR T cell therapy. Targeting αvβ3 integrin with CAR T cells could have clinical applications in the treatment of solid malignancies, because αvβ3 is not only expressed on a variety of solid malignancies, but also on tumour-associated vasculature and fibroblast.
N2  - T Zellen können durch genetische Modifizierung zur Expression eines chimären Antigen-Rezeptors (CAR) neue Antigenspezifität erhalten. Durch adoptive Immuntherapie mit CD19-CAR T Zellen können hohe Raten von anhaltenden vollständigen Remissionen bei Patienten mit malignen B-Zell-Erkrankungen erzielt werden. In klinischen Studien mit mono-spezifischen CAR T Zellen wurden allerdings der Verlust oder eine verringerte Expression der Ziel-Antigene, z.B. CD19 oder CD22, auf Tumor-Zellen beobachtet. Außerdem sind bei soliden Krebserkrankungen tumor¬assoziierte Antigene häufig unterschiedlich stark auf Krebszellen exprimiert. Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass CARs, die mit einem hapten-ähnlichen Molekül programmiert werden können, es ermöglichen, mehrere Antigene mit einer T-Zelle anzugreifen.
In dieser Arbeit stellen wir einen neuartigen chemisch programmierbaren CAR (cpCAR) auf Basis des monoklonalen Antikörpers h38C2 vor. Unsere Daten zeigen, dass cpCARs eine reversible chemische Bindung zu Molekülen mit einer Diketongruppe bilden und daher so programmiert werden können, dass sie mehrere Spezifitäten aufweisen. Wir haben cpCAR T Zellen mit hapten-ähnlichen Molekülen gegen die Integrine αvβ3 und α4β1 sowie den Folat-Rezeptor programmiert. In vitro beobachteten wir sowohl die spezifische Lyse von Tumorzellen als auch T-Zell-Proliferation und Sekretion von IFN ɣ und IL-2 durch programmierte cpCAR T Zellen als Reaktion auf Antigen positive Tumorzellen.
Als Referenz zu cpCARs, die gegen αvβ3 programmiert wurden, haben wir in dieser Arbeit zudem neue konventionelle αvβ3-CARs vorgestellt. Diese basieren auf humanisierten Varianten des monoklonalen Antikörpers LM609 (hLM609) und binden mittels ihres scFv direkt an Integrin αvβ3. Die vier αvβ3-CAR-Konstrukte enthielten entweder ein scFv mit höherer Affinität (hLM609v7) oder niedrigerer Affinität (hLM609v11) gegenüber αvβ3 und entweder einem langen (IgG4-Hinge, CH2, CH3) oder einem kurzen (IgG4-Hinge) extrazellulären „Spacer“. Für den Vergleich von konventionellem CAR und cpCAR wählten wir den hLM609v7-CAR mit kurzem „Spacer“. T Zellen, die diesen CAR exprimierten, vermittelten eine starke Anti-Tumor Reaktion sowohl in vitro als auch in einem Maus-Xenograft Modell. Unsere in vitro Daten zeigen spezifische Lyse von αvβ3-positiven Tumorzellen, Sekretion von Zytokinen und Proliferation sowohl durch hLM609-CAR T-Zellen als auch durch cpCAR T-Zellen. Konventionelle hLM609-CAR T Zellen vermittelten jedoch in gleicher Zeit eine stärkere Anti-Tumorwirkung als cpCAR T-Zellen.
Zusammengefasst präsentieren wir in dieser Arbeit einen cpCAR, der gegen mehrere Tumorantigene programmiert werden kann, und hLM609-CARs, die spezifisch für das Integrin αvβ3 sind. Die cpCAR-Technologie birgt das Potenzial, aktuellen Limitationen der mono-spezifischen CAR-T-Zelltherapie, z.B. dem Antigen¬verlust, entgegenzuwirken. Zudem könnte das Integrin αvβ3 klinische Anwendung bei der Behandlung von soliden Tumoren finden, da es nicht nur auf einer Reihe von Tumor-Entitäten, sondern auch auf Tumor-assoziiertem Gewebe zu finden ist.
KW  - Tumorimmunologie
KW  - chimeric antigen receptor
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179071
ER  - 
TY  - THES
A1  - Effenberger, Madlen
T1  - Funktionelle Charakterisierung von YB-1 im Zytoplasma des Multiplen Myeloms
T1  - Functional Characterization of YB-1 in the Cytoplasm of Multiple Myeloma
N2  - Das Y-Box-bindende Protein 1 (YB-1) ist ein Vertreter der hochkonservierten Familie eukaryotischer Kälteschockproteine und ein DNA/RNA-bindendes Protein. In Abhängigkeit von seiner Lokalisation übernimmt es Aufgaben bei der DNA-Transkription oder mRNA-Translation. YB-1 ist ein potentielles Onkogen beim Multiplen Myelom (MM), dass in primären MM-Zellen exprimiert ist. Für die funktionellen Untersuchungen von YB-1 in der vorliegenden Arbeit wurden humane Myelomzelllinien (HMZL) verwendet, die als in vitro Modell dieser malignen B Zell-Erkrankung dienen. Aufgrund der potentiellen Expression von YB-1 im Zellkern und/oder Zytoplasma von HMZL, wurde zunächst die Lokalisation des Proteins bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass YB 1 in den HMZL ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert ist. Eine Translokation von YB-1 in den Nukleus kann durch die Serin-Phosphorylierung (Aminosäure 102) in der Kälteschockdomäne induziert werden. Die analysierten Myelomzelllinien zeigen jedoch kein nukleäres YB 1 und keine S102-Phosphorylierung. Diese Ergebnisse stützen die These, dass die Regulation der mRNA-Translation im Zytoplasma die vorherrschende Funktion von YB-1 beim MM ist. YB-1 könnte über diesen Mechanismus seine anti-apoptotische Wirkung vermitteln und die MM-Zellen vor genotoxischem Stress schützen. Um YB-1-regulierte mRNAs zu identifizieren wurden YB 1-Immunpräzipitationen mit zwei HMZL, einer Maus-Plasmozytomzelllinie und einem primären Maus-Plasmazelltumor durchgeführt. Zu den YB-1-gebundenen mRNAs gehören Translationsfaktoren und ribosomale Proteine, die eine starke Beteiligung von YB-1 beim RNA-Metabolismus bestätigen. In der vorliegenden Arbeit wurden spezifisch zwei mRNA-Kandidaten untersucht, die für den malignen Phänotyp von MM-Zellen wichtig sein können: das translationell kontrollierte Tumorprotein TCTP und MYC. Sowohl TCTP als auch MYC wurden bereits in Zusammenhang mit der Proliferation und Apoptose-Resistenz von malignen Zellen beschrieben. Die immunhistochemische Untersuchung der Knochenmarkbiopsien von MM-Patienten ergab eine gute Ko-Expression von YB-1 und TCTP in intramedullären MM-Zellen, während MYC erst in extramedullärem MM-Tumormaterial verstärkt mit der hohen YB 1-Expression korreliert. Die funktionellen Analysen der Arbeit haben gezeigt, dass YB 1 für die Translation der TCTP- und MYC-mRNA essentiell ist. Es kontrolliert die Verteilung dieser mRNAs zwischen translationell aktiven und inaktiven messenger Ribonukleoprotein-Partikeln. Die shRNA-vermittelte Reduktion von YB-1 führte zur Hemmung der TCTP- und MYC-Translation in der Phase der Initiation. Um den Einfluss der Kandidaten auf das Überleben der HMZL zu untersuchen, wurden proteinspezifische Knockdown-Experimente durchgeführt. Beim shRNA-vermittelten TCTP-Knockdown konnten keine Auswirkungen auf die Proliferation oder Viabilität von MM-Zellen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu ist MYC für das Überleben und Wachstum der HMZL ausschlaggebend, denn der MYC-Knockdown induzierte Apoptose. Wie beim YB 1-Knockdown war ein Anstieg der Caspase-Aktivität und der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials in den HMZL nachweisbar. Da es beim MYC-Knockdown gleichzeitig zur einer Reduktion der YB 1-Protein- und mRNA-Expression kam, wurde der Einfluss von MYC auf die Transkription des YB-1-Gens untersucht. Mit Hilfe von embryonalen Mausfibroblasten, die ein induzierbares MYC als Transgen besitzen, konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von MYC mit einer Zunahme der YB-1-mRNA einher geht. YB-1 ist somit ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors MYC. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben zum ersten Mal ein gegenseitiges regulatorisches Netzwerk aufgezeigt, in dem YB 1 transkriptionell durch MYC reguliert wird und YB-1 für die Translation der MYC-mRNA essentiell ist. Die Ko-Expression beider Proteine trägt zum Wachstum und Überleben von malignen Plasmazellen bei.
N2  - The Y-box binding protein 1 (YB-1) is a member of the highly conserved coldshock-domain protein family and a DNA/RNA-binding protein. Therefore YB-1 can be involved in DNA transcription or mRNA translation depending on its localization in the cell. YB-1 is a potential oncogene in Multiple Myeloma (MM) and is expressed in primary MM cells. Human myeloma cell lines (HMCLs), which serve as the in vitro model for this B-cell malignancy, were used to functionally characterize YB-1 in MM. In this study it was shown that the YB-1 protein is expressed exclusively in the cytoplasm of HMCLs. Its translocation into the nucleus can be induced through the phosphorylation of a serine residue (amino acid 102) in the coldshock-domain of the protein. The analyzed myeloma cell lines are negative for nuclear YB-1 and the S102-phosphorylation. These results support the hypothesis that the regulation of mRNA translation in the cytoplasm is the primary function of YB-1 in MM. Through this mechanism YB-1 could mediate its anti-apoptotic effects and protect MM cells against genotoxic stress. To identify YB-1 regulated mRNAs in the cytoplasm immunoprecipitations of two HMCLs, one mouse plasmacytoma cell line and one primary mouse plasma cell tumor were performed. YB-1 bound mRNAs include translation factors and ribosomal proteins, which confirms the strong participation of YB-1 in the metabolism of RNAs. In the present study two mRNA candidates were specifically investigated which might be important for the malignant phenotype of MM cells: the translationally controlled tumor protein (TCTP) and MYC. Both, TCTP and MYC have been described in conjunction with proliferation and apoptosis-resistance of malignant cells. The immunohistochemical staining of bone marrow biopsies from MM patients revealed a good co-expression of YB-1 and TCTP in intramedullary MM cells, whereas MYC and YB-1 correlate strongly with each other in extramedullary MM tumors. The functional analysis of this study showed, that YB-1 is essential for the translation of TCTP and MYC mRNA. It controls the distribution of these mRNAs between translationally active and inactive messenger ribonucleoprotein particles. The shRNA-mediated reduction of YB-1 expression inhibits TCTP and MYC translation in the initiation phase. To investigate the influence of the candidates for HMCL survival protein-specific knockdown experiments were performed. The TCTP knockdown showed no effect on proliferation or viability of the analyzed MM cells. In contrast, MYC is crucial for MM cell survival and growth, as the knockdown induced apoptosis. Comparable with the performed YB-1 knockdown experiments apoptosis induction was verified here by an increase of activated caspases and disruption of the mitochondrial membrane potential in HMCLs. Interestingly, the knockdown of MYC also reduced YB-1 protein and mRNA expression. To investigate the influence of MYC on YB-1 gene transcription mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from MYC transgenic animals were used. The activation of MYC protein in these cells induced YB-1 mRNA expression, showing that YB-1 is a direct target of the transcription factor MYC. The work presented here revealed for the first time a feed-forward loop of YB-1 and MYC expression in MM cells. In this loop YB-1 is transcribed by MYC and YB-1 is essential for MYC mRNA translation. Consequently, both proteins mutually up-regulate each other via combined transcriptional/translational activity to support cell growth and survival of malignant plasma cells.
KW  - Plasmozytom
KW  - Apoptosis
KW  - RNS-Bindungsproteine
KW  - Myc
KW  - Cytoplasma
KW  - YB-1
KW  - mRNA-Translation
KW  - TCTP
KW  - Multiples Myelom
KW  - Transkription
KW  - YB-1
KW  - mRNA translation
KW  - TCTP
KW  - multiple myeloma
KW  - transcription
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76816
ER  - 
TY  - THES
A1  - Muhammad, Khalid
T1  - Longterm impact of anti-CD20 mediated transient B cell depletion on memory B cells in patients with rheumatoid arthritis
T1  - Langzeitveränderung der Gedächtnis B-Zellen nach Anti-CD20 vermittelter B-Zelldepletion in Patienten mit rheumatoider Arthritis
N2  - B-Lymphozyten leisten unterschiedliche Beiträge zur Pathophysiologie der Rheumatoiden Arthritis. Sie produzieren Autoantikörper, präsentieren Autoantigene und schütten verschiedene Zytokine, die am proinflammatorischen Prozess beteiligt sind, aus. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden in den letzten Jahren Therapien entwickelt, die gezielt B-Lymphozyten ansteuern um direkt oder indirekt in den autoimmunen Krankheitsverlauf einzugreifen. Die zeitlich begrenzte B-Zell-Depletion mit Rituximab (anti CD20-Antikörper) hat dabei in den letzten Jahren einen hohen Stellenwert erlangt und wird im klinischen Alltag insbesondere bei der Behandlung von Patienten mit rheumatoider Arthritis angewandt. Rituximab induziert im peripheren Blut bemerkenswerte Veränderungen in der Homöostase der B-Zell-Subpopulationen. Nach Therapie mit dem anti-CD20 Antikörper Rituximab beginnt die Repletionsphase mit der peripheren Aussaat von transitionalen unreifen B-Zellen. Im weiteren Verlauf kommt es zu einer Normalisierung des naiven B-Zell-Pools. Das B-Zell Gedächtnis und in besonderem Maße die IgD+CD27+ Gedächtniszellen erholen sich nach Therapie nur langsam. In einer prospektiven klinischen Studie hat unsere Arbeitsgruppe gezeigt, dass die Gesamtzahl der Gedächtniszellen gut mit der Dauer der klinischen Antwort auf Rituximab korreliert. Es ist wenig über die speziellen molekularen Veränderungen innerhalb der Gedächtnis B-Zellen nach Rituximab Therapie bekannt. Um die Veränderungen im peripheren Blut zu verstehen untersuchten wir die somatische Mutationsfrequenz und das Muster der Ig-VH3 Gen Rearrangements, indem wir prä- und posttherapeutisch bei 18 Patienten einzelne B-Zellen isolierten und den individuellen B-Zellrezeptor durch eine Einzelzell RT-PCR amplifizierten und sequenzierten. Wir verglichen das Mutationsmuster nach erfolgreicher B-Zelldepletion in den neu rezirkulierenden Gedächtnis B-Zellen mit dem Mutationsmuster von vier Gesunden Blutspendern und sechs nicht-RA Patienten, die eine Hochdosis Chemotherapie mit anschließender autologer oder allogener Stammzelltransplantation erhalten hatten. Zunächst haben wir die Zusammensetzung der Gedächtniszellen im peripheren Blut analysiert. Der Phänotyp der peripheren prä-switch (IgD+CD27+) und post-switch (IgD-CD27+) Gedächtniszellen zeigte keine quantitativen Unterschiede in RA-Patienten im Vergleich zu Gesunden. Bei der direkten Analyse des B-Zell Immunglobulin Rezeptors fanden sich jedoch zwischen klassengeswitchten und ungeswitchten Gedächtnis B-Zellen signifikante Unterschiede in der Anzahl der Mutationen in der variablen Region der Ig Rezeptors. Die Population der IgD+CD27+ Gedächtniszellen beinhaltete sowohl nicht mutierte, wenig mutierte und stark mutierte (Median= 9 Mutationen pro Sequenz) rearrangierte Ig- Rezeptoren, wohingegen die IgD-CD27+ Gedächtniszellen einen durchgehend hoch mutierten (Median = 18 Mutationen pro Sequenz) Rezeptor aufwiesen. Der Unterschied zwischen beiden Gruppen war signifikant (Mutationsfrequenzen 3.83±0.19% vs. 7.1±0.53%; P=0.0001). Grundlegende Veränderungen wurden bei den rezirkulierenden ungeswitchten Gedächtniszellen (IgD+CD27+) nach vorübergehender B-Zell Depletion mit Rituximab festgestellt. Diese Zellen wurden bis 6 Jahre nach Rituximab beobachtet und zeigten eine stark verzögerte Zunahme an Mutationen im Ig-Rezeptor. Ein Jahr nach einmaliger Gabe von Rituximab waren 84% der einzelnen zirkulierenden IgD+/CD27+ B-Zellen unmutiert. Zu diesem Zeitpunkt fanden sich keine stark mutierten Ig-VH3 Gen Rearrangements (P=0.0001). Mit zunehmendem Abstand zur B-Zell depletierenden Therapie konnten in der Repopulationsphase zunehmende Zahlen an Mutationen in den B-Zell Ig Rezeptoren festgestellt werden. Beispielsweise waren während des 2. Jahres der Regeneration (P=0.0001) 7.8%, sowie nach 4 Jahren nur 14% der Ig Rezeptoren mutiert. Sogar 6 Jahre nach Behandlung, waren VH Mutationen in IgD+ Gedächtniszellen noch deutlich vermindert. Selbst nach dieser Zeit fanden sich in der prä-switch Gedächtnispopulation nur 27% hochmutierte Sequenzen während vor der passageren B-Zelldepletion 52% ein hohe Zahl an Mutationen trugen (P=0.0001). Die posttherapeutische Analyse der CDR3 Länge der regenerierten IgD+ Gedächtniszellen ergab eine erhöhte CDR3 Länge, die signifikant mit der Anzahl der nicht mutierten VH Genrearrangements während der Repletionsphase korreliert. Interessanterweise regenerierten Patienten nach Hochdosis Chemotherapie und allogener Stammzelltransplantation ihre IgD+ Gedächtniszellen mit einer deutlich höheren Anzahl an Mutationen. Ein Jahr nach Transplantation zeigten die Ig Rezeptoren schon 22% hoch mutierte und 42% unmutierte VH Rearrangements. Das zeigt, dass eine gegen CD20 gerichtete Behandlung nicht nur eine Verzögerung der Produktion der ungeswitchten Gedächtniszellen zur Folge hat, sondern darüber hinaus einen signifikanten Effekt auf die Mutationsrate im präswitch Gedächtnis B-Zellpool besitzt. Im Gegensatz zum Mutationsmuster der IgD+ Gedächtniszellen regenerierten die klassengeswitchten Gedächtniszellen nach anti-CD20 Depletion im peripheren Blut mit quantitativ normalen Mutationen im Ig Rezeptor. Interessanterweise fand sich allerdings eine Änderung der exprimierten Isotypen mit deutlicher Dominanz IgA exprimierender B Zellen. Weitere Analysen der klassengeswitchten Gedächtnis B-Zellen zeigen außerdem eine Therapie induzierte qualitative Veränderung dieses B-Zellpools. So waren posttherapeutisch die Mutationen in bestimmten T-Zell abhängigen Mutationshotspots, dem RGYW/WRCY Motiv, signifikant vermehrt (Mutationstargeting vor Therapie 27% vs. 43% nach Rituximab, P=0.0003). Dies weist darauf hin, dass die Mechanismen der Affinitätsreifung im klassengeswitchten B-Zellgedächtnis vor und nach B-Zelldepletion unterschiedlich funktionieren. Der Mutationsmechanismus selbst ist allerdings in diesen Zellen quantitativ nicht eingeschränkt. Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit zum erstem mal, dass es nach einer passageren B-Zelldepletion mit anti-CD20 Antikörpern zu einer über Jahre hinweg nachweisbaren ausgeprägten Verzögerung in der Aquisition von somatischen Mutationen in rearrangierten VH Genen der IgD+ Gedächtniszellen kommt. Demgegenüber erholt sich das klassengeswitchte B-Zellgedächtnis mit uneingeschränkter Zahl von Mutationen im Ig Rezeptor. Diese Resultate zeigen, dass anti-CD20 gerichtete Therapien in besonderem Maße IgD+ Gedächtniszellen beeinflussen. Der Selektionsdruck durch Antigene und/oder die Selektion der Ig Rezeptoren erscheint unter diesen Bedingungen speziell bei IgD-Gedächtnis B-Zellen reduziert. Die Daten unterstützen die Hypothese, dass prä-switch Gedächtnis B-Zellen im Vergleich zu post-switch Gedächtnis B-Zellen andere Bedingungen für die Aktivierung der Mutationsmaschinerie benötigen. Die Resultate eröffnen neue Wege für das Verständnis der Pathophysiologie der B-Zell Gedächtnisentwicklung und können helfen neue zielgerichtete Therapien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu konzipieren.
N2  - Diverse roles of B cells in the pathophysiology of rheumatoid arthritis are now well established. B cells contribute to autoimmunity by producing autoantibodies, processing autoantigen and the production of different cytokines which are involved in the inflammatory cascade. Therefore approaches to target B lymphocytes directly or indirectly are developed for clinical practice to treat autoimmune diseases including rheumatoid arthritis. Transient B cell depletion by rituximab (anti-CD20 antibody) has gained prime importance in recent years. Meanwhile anti-CD20 mediated transient B cell depletion therapy is now used with clinical efficiency in the treatment of patients with rheumatoid arthritis. Rituximab induces noteworthy changes in the homeostasis of peripheral B cell subpopulations during the repletion phase with emerging immature B cells in peripheral blood followed by normalization of the naïve B cell pool and a longterm delay in memory B cell subsets in patients with rheumatoid arthritis. Particularly IgD+CD27+ memory B cells repopulate very slowly during B cell regeneration. In a prospective clinical study, our laboratory has shown that the overall number of memory B cells correlates well to the duration of clinical response to rituximab. Little is known about the particular molecular changes in the memory B cell repertoire after rituximab therapy. To better understand peripheral memory B cell subsets, we explored in detail the somatic mutational frequency and pattern of Ig-VH3 gene rearrangements by using a single B cell sorting technique followed by nested PCR before and up to 6 years after rituximab therapy in 18 RA patients. We compared rituximab inflicted dynamics of mutational acquisition to memory B cell repopulation in 4 healthy donors and 6 non RA patients undergoing high dose chemotherapy followed by autologous or allogeneic stem cell transplantation (SCT). Firstly we analyzed the peripheral composition of memory B cell subsets. The phenotypic analysis of peripheral pre-switch (IgD+CD27+) and post-switch (IgD-CD27+) memory B cells did not reveal any quantitative differences in RA patients prior to B cell depletion therapy compared to healthy donors. However extending those studies in directly analysing the B cell immunoglobulin receptor from individual B cells of RA patients and healthy controls brought interesting results. Pre-switched and post-switched memory B cells showed a highly significant difference in the amount of mutations/sequence. The population of IgD+CD27+ memory B cells is comprised of non-mutated, low and highly mutated (median= 9 mutations/ sequence) rearranged Ig receptors whereas the IgD-CD27+ memory B cell compartment shows quite uniformly highly mutated (median 18 mutations/ sequence) sequences indicating a significant difference between these two groups (mutational frequencies 3.83±0.19% vs. 7.1±0.53%; P=0.0001). Profound changes were noted in the re-emerging pre-switch memory B cells (IgD+/ CD27+) after transient B cell depletion with rituximab. These cells showed over a time period of 6 years after treatment with rituximab significantly delayed acquisition of mutations in Ig receptors on the single B cell level. One year after a single course of rituximab 84% of single repopulating IgD+/CD27+ B cells were unmutated and no highly mutated Ig-VH gene rearrangements were found(P=0.0001). Over time increasing numbers of mutations could be detected i-e 7.8% during 2nd year of regeneration (P=0.0001), 14% after 4 years (n=2). Nevertheless even 6 years after rituximab, VH mutations in IgD+ memory B cells were still reduced with 27% highly mutated sequences compared to 52% pre therapy(P=0.0001). Post-therapy analysis of CDR3 length of regenerated IgD+ memory B cells revealed increased CDR3 length which also correlates well with elevated number of non-mutated VH gene rearrangements observed during repletion phase. In comparison patients undergoing high dose chemotherapy followed by allogeneic stem cell transplantation repopulated IgD+ memory cells earlier with higher numbers of mutations in IgD+ memory B cells. One year after transplantation Ig receptors showed already 22% highly mutated and 42 % unmutated VH rearrangements. These findings indicated that anti-CD20 mediated B cell depletion seems not only to delay the production of pre-switch memory B cells but also significantly affects the acquisition of mutations in the IgD+ memory B cell pool. In contrary to the mutational pattern of IgD+ memory B cells after rituximab class switched memory B cells repopulate in the periphery with quantitatively normal mutations in their Ig receptors. Although the numeric replenishment of these recirculating class-switched memory B cells was also reduced after rituximab, we found no delay in quantitative acquisition of mutations also an increased proportion of IgA expressing B cells in this memory B cell subset was detected. Our data showed that post-therapy mutational targeting in RGYW/WRCY motifs were significantly increased as compared with that of pre-treatment (27% before rituximab vs. 43% after therapy, P=0.0003) indicating that affinity maturation may operate differently in class-switched memory B cells before and after B cell depletion. These results indicate a normal development process with an unimpaired mechanism of mutational acquisition in class-switched memory B cells. These data argue for different requirements to undergo somatic hypermutations in IgD+ memory B cells in comparison to class switched memory B cells. To conclude, our work has demonstrated for the first time a delayed acquisition of somatic hypermutations at single Ig receptor VH gene rearrangements of IgD+ memory B cells in comparison to class-switched memory B cells. These results demonstrate that IgD+ memory B cells are particularly susceptible to anti-CD20 treatment in patients with rheumatoid arthritis. In addition antigenic pressure and/or selection are substantially reduced by rituximab therapy which is basically not seen in the class-switched memory compartment. These data are in line with the hypothesis that IgD+ memory B cells have distinct requirements for activating their mutational machinery compared to class-switched memory B cells which recover normal mutations during regeneration phase. The results have implications in understanding the pathophysiology of memory B cell in rheumatoid arthritis and may be helpful in designing new targeted therapies.
KW  - Rheumatoider arthritis
KW  - rheumatoide Arthritis
KW  - B-Zellen
KW  - Rheumatoid arthritis
KW  - memory B cells
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36319
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Bäuerlein, Carina A.
A1  - Riedel, Simone S.
A1  - Baker, Jeanette
A1  - Brede, Christian
A1  - Jordán Garrote, Ana-Laura
A1  - Chopra, Martin
A1  - Ritz, Miriam
A1  - Beilhack, Georg F.
A1  - Schulz, Stephan
A1  - Zeiser, Robert
A1  - Schlegel, Paul G.
A1  - Einsele, Hermann
A1  - Negrin, Robert S.
A1  - Beilhack, Andreas
T1  - A diagnostic window for the treatment of acute graft-versus-host disease prior to visible clinical symptoms in a murine model
JF  - BMC Medicine
N2  - Background

Acute graft-versus-host disease (aGVHD) poses a major limitation for broader therapeutic application of allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). Early diagnosis of aGVHD remains difficult and is based on clinical symptoms and histopathological evaluation of tissue biopsies. Thus, current aGVHD diagnosis is limited to patients with established disease manifestation. Therefore, for improved disease prevention it is important to develop predictive assays to identify patients at risk of developing aGVHD. Here we address whether insights into the timing of the aGVHD initiation and effector phases could allow for the detection of migrating alloreactive T cells before clinical aGVHD onset to permit for efficient therapeutic intervention.

Methods

Murine major histocompatibility complex (MHC) mismatched and minor histocompatibility antigen (miHAg) mismatched allo-HCT models were employed to assess the spatiotemporal distribution of donor T cells with flow cytometry and in vivo bioluminescence imaging (BLI). Daily flow cytometry analysis of peripheral blood mononuclear cells allowed us to identify migrating alloreactive T cells based on homing receptor expression profiles.

Results

We identified a time period of 2 weeks of massive alloreactive donor T cell migration in the blood after miHAg mismatch allo-HCT before clinical aGVHD symptoms appeared. Alloreactive T cells upregulated α4β7 integrin and P-selectin ligand during this migration phase. Consequently, targeted preemptive treatment with rapamycin, starting at the earliest detection time of alloreactive donor T cells in the peripheral blood, prevented lethal aGVHD.

Conclusions

Based on this data we propose a critical time frame prior to the onset of aGVHD symptoms to identify alloreactive T cells in the peripheral blood for timely and effective therapeutic intervention.
KW  - Allogeneic stem cell transplantation
KW  - Graft-versus-host disease
KW  - Minor histocompatibility antigen mismatch transplantation
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96797
UR  - http://www.biomedcentral.com/1741-7015/11/134
ER  - 
TY  - THES
A1  - Riedel, Simone Stefanie
T1  - Characterization of the fluorescence protein FP635 for in vivo imaging and establishment of a murine multiple myeloma model for non-invasive imaging of disease progression and response to therapy
T1  - Charakterisierung des Fluoreszenzproteins FP635 für die in vivo Bildgebung und Etablierung eines Maus Modells für die nicht invasive Bildgebung des Krankheitsverlaufes und Ansprechen auf Therapien imMultiplen Myelom
N2  - Optical in vivo imaging methods have advanced the fields of stem cell transplantation, graft-versus–host disease and graft-versus-tumor responses. Two well known optical methods, based on the transmission of light through the test animal are bioluminescence imaging (BLI) and fluorescence imaging (FLI). Both methods allow whole body in vivo imaging of the same animal over an extended time span where the cell distribution and proliferation can be visualized. BLI has the advantages of producing almost no unspecific background signals and no necessity for external excitation light. Hence, BLI is a highly sensitive and reliable detection method. Yet, the BLI reporter luciferase is not applicable with common microscopy techniques, therefore abolishing this method for cellular resolution imaging. FLI in turn, presents the appealing possibility to use one fluorescent reporter for whole body imaging as well as cellular resolution applying microscopy techniques. The absorption of light occurs mainly due to melanin and hemoglobin in wavelengths up to 650 nm. Therefore, the wavelength range beyond 650 nm may allow sensitive optical imaging even in deep tissues. For this reason, significant efforts are undertaken to isolate or develop genetically enhanced fluorescent proteins (FP) in this spectral range. “Katushka” also called FP635 has an emission close to this favorable spectrum and is reported as one of the brightest far-red FPs. Our experiments also clearly showed the superiority of BLI for whole body imaging over FLI. Based on these results we applied the superior BLI technique for the establishment of a pre-clinical multiple myeloma (MM) mouse model. MM is a B-cell disease, where malignant plasma cells clonally expand in the bone marrow (BM) of older people, causing significant morbidity and mortality. Chromosomal abnormalities, considered a hallmark of MM, are present in nearly all patients and may accumulate or change during disease progression. The diagnosis of MM is based on clinical symptoms, including the CRAB criteria: increased serum calcium levels, renal insufficiency, anemia, and bone lesions (osteolytic lesions or osteoporosis with compression fractures). Other clinical symptoms include hyperviscosity, amyloidosis, and recurrent bacterial infections. Additionally, patients commonly exhibit more than 30% clonal BM plasma cells and the presence of monoclonal protein is detected in serum and/or urine. With current standard therapies, MM remains incurable and patients diagnosed with MM between 2001 and 2007 had a 5-year relative survival rate of only 41%. Therefore, the development of new drugs or immune cell-based therapies is desirable and necessary. To this end we developed the MOPC-315 cell line based syngeneic MM mouse model. MOPC-315 cells were labeled with luciferase for in vivo detection by BLI. We validated the non-invasively obtained BLI data with histopathology, measurement of idiotype IgA serum levels and flow cytometry. All methods affirmed the reliability of the in vivo BLI data for this model. We found that this orthotopic MM model reflects several key features of the human disease. MOPC-315 cells homed efficiently to the BM compartment including subsequent proliferation. Additionally, cells disseminated to distant skeletal parts, leading to the typical multifocal MM growth. Osteolytic lesions and bone remodeling was also detected. We found evidence that the cell line had retained plasticity seen by dynamic receptor expression regulation in different compartments such as the BM and the spleen.
N2  - Optische in vivo bildgebende Verfahren haben die Felder der Stammzelltransplantation, Graft-versus-Host Krankheit und Graft-versus-Tumor Reaktion vorangebracht. Zwei gut bekannte optische Methoden, die auf der transmission von Licht durch das Versuchtier basieren, sind die Biolumineszenz Bildgebung (BLI) und die Fluoreszenz Bildgebung (FLI). Beide Methoden erlauben die in vivo Ganzkörperbildgebung desselben Tieres über lange Zeit wärenddessen die Zellverteilung und Proliferation sichtbar gemacht werden kann. Vorteil der BLI ist, dass beinahe keine unspezifischen Hintergrundsignale erzeugt werden und keine Notwendigkeit für Anregungslicht besteht. Daher ist BLI eine hochsensitive und verlässliche Detektionsmethode. Jedoch erlaubt der BLI Reporter, die Luziferase, keine Anwendung mit gängigen Mikroskopieanwendungen und verhindert daher, dass diese Methode für die Bildgebung auf zellulärer Ebene genutzt werden kann. FLI wiederum bietet die attraktive Möglichkeit einen fluoreszenten Reporter sowohl für die Bildgebung des gesamten Körpers, als auch auf zellulärer Ebene durch die Anwendung von Mikroskopietechniken zu nutzen. Derzeit bestehen noch größere Einschränkungen bei der Arbeit mit fluoreszent markierten Zellen innerhalb eines Tieres. Die allgemeine Autofluoreszenz des umliegenden Gewebes führt zu hohen Hintergrundsignalen. Zusätzlich werden sowohl das Anregungslicht als auch die emittierte Fluoreszenz durch das umliegende Gewebe abgeschwächt. Die Absorption des Lichtes geschieht hauptsächlich durch Melanin und Hämoglobin in Wellenlängen bis zu 650 nm. Daher könnte der Wellenlängenbereich über 650 nm sensitive optische Bildgebung auch in tief liegendem Gewebe ermöglichen. Aus diesem Grund werden erhebliche Anstrenungen unternommen um Fluoreszenzproteine (FP) in diesem spektralen Bereich zu isolieren oder genetisch verbesserte zu entwickeln. „Katushka“ auch FP635 genannt hat eine Emission, die nahe an diesem günstigen Spektrum liegt und wurde als eines der hellsten dunkelroten FPs beschrieben. Wir untersuchten FP635 für die Anwendung als sensitiver Einzelreporter für die Detektion immunologischer Prozesse von der Ganzkörper- bis zur Einzelzellbildgebung. Unsere Experimente zeigten auch deutlich die Überlegenheit der BLI über die FLI für die Ganzkörperbildgebung. Basierend auf diesen Ergebnissen setzten wir die überlegene BLI für die Etablierung eines präklinischen Mausmodells des Multiplen Myeloms (MM) ein. MM ist eine B-Zell Erkrankung wobei maligne Plasmazellen klonal im Knochenmark (BM) älterer Menschen expandieren und erhebliche Morbidität und Sterblichkeit verursacht. Chromosomale Abnormitäten gelten als Kennzeichen des MM, sind bei beinahe allen Patienten vorhanden und können sich während des Krankheitsverlaufes anhäufen oder verändern. Die Diagnose des MM basiert auf klinischen Syptomen inklusive der folgenden Kriterien: erhöhte Serum Kalzium Konzentration, Niereninsuffizienz, Anämie und Knochenläsionen (osteolytische Läsionen oder Osteoporose mit Kompressionsfrakturen). Weitere klinische Symptome beinhalten Hyperviskosität, Amyloidose und wiederkehrende bakterielle Infektionen. Zusätzlich zeigen Patienten verbreitet mehr als 30% klonale BM Plasmazellen und monoklonales Protein ist in Serum und/oder Urin detektierbar. Mit derzeitigen Standardtherapien bleibt MM unheilbar und Patienten, die zwischen 2001 und 2007 mit MM diagnostiziert wurden hatten eine relative 5-jahres Überlebensrate von nur 41%. Daher ist die Entwicklung neuer Medikamente und immunzellbasierten Therapien wünschenswert und notwendig. Zu diesem Zweck entwickelten wir das auf der Zelllinie MOPC-315 basierende syngene MM Mausmodell. Die MOPC-315 Zellen wurden für die in vivo Detektion mittels BLI mit Luziferase markiert. Wir validierten die nichtinvasiv gewonnenen BLI Daten mit Histopathologie, der Messung des idiotypen IgA Spiegels im Serum und Durchflusszytometrie. Alle Methoden bekräftigten die Zuverlässigkeit in vivo BLI Daten für dieses Modell. Wir stellten fest, dass dieses orthotope MM Modell einige Hauptmerkmale der menschlichen Erkrankung widerspiegelt. Die MOPC-315 Zellen wanderten effizient in das BM Kompartiment inklusive darauffolgender Proliferation. Ausserdem, streuten die Zellen in entfernte Teile des Skeletts aus was zum typischen multifokalen MM Wachstum führte. Wir stellten auch osteolytische Läsionen und Knochenumbau fest. Wir fanden Hinweise darauf, dass sich die Zelllinie Plastizität bewahrte was durch die dynamische Regulation der Rezeptorexpression in verschiedenen Kompartimenten, wie dem BM und der Milz, sichtbar wurde.
KW  - Fluoreszenzproteine
KW  - Plasmozytom
KW  - Biolumineszenzmessung
KW  - Maus
KW  - Multiple myeloma
KW  - bioluminescence imaging
KW  - fluorescence imaging
KW  - FP635
KW  - mouse model
KW  - nichtinvasive Bildgebung
KW  - Multiples Myelom
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77894
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heimberger, Tanja
T1  - Der Hitzeschock-Transkriptionsfaktor 1 (HSF1) als neues potenzielles Ziel im Multiplen Myelom
T1  - The heat shock transcription factor 1 (HSF1) as a new potential therapeutic target in multiple myeloma
N2  - Die evolutionär hoch konservierte Hitzeschock-Antwort (heat shock stress response, HSR) ermöglicht Zellen sich an Stresssituationen anzupassen und so dem programmierten Zelltod zu entgehen. Die Regulation der HSR unterliegt dem Hitzeschock-Transkriptionsfaktor 1 (HSF1), der nach einem Stress-Impuls umgehend die Synthese der Hitzeschock-Proteine (HSP) initiiert. Als molekulare Chaperone assistieren die HSP bei der Faltung und den intrazellulären Transport ihrer Klientenproteine und erhalten so die lebensnotwendigen zellulären Funktionen aufrecht. Während das HSF1/HSP-System vorteilhaft für normale Zellen ist, kann es aber auch den Prozess der malignen Transformation unterstützen. In verschiedenen Tumorentitäten wurde eine Abhängigkeit der malignen Zellen von HSP, vereinzelt auch von HSF1, beschrieben. Im multiplen Myelom (MM) stabilisieren HSP u.a. Klientenproteine in einem komplexen onkogenen Signalnetzwerk und erhalten so eine aberrante Signalweiterleitung aufrecht. Wegen dieser wichtigen Funktion ist die Inhibition der HSP (insbesondere HSP90) bereits ein therapeutischer Ansatzpunkt, der jedoch im MM noch nicht zu dem erhofften Erfolg führte. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass es zu einer Induktion der HSP nach einer Behandlung mit neuen, antitumoralen Medikamenten (Proteasom-, HDAC- und HSP90-Inhibitoren) kommt. Diese kompensatorische Hochregulation der HSP ist assoziiert mit einem Resistenzverhalten gegenüber der Therapie und ist somit unerwünscht. Die bisherigen Untersuchungen legen aber auch nahe, dass HSF1 selbst eine wichtige Funktion bei der malignen Transformation einnimmt. So wurde gezeigt, dass der funktionelle Verlust von HSF1 vor der onkogenen Ras oder mutierten Trp53 getriebenen Tumorigenese schützt. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Expression von HSF1, seine Rolle in der HSP-Regulierung und den Beitrag zum Überleben und Resistenzen in MM-Zellen analysiert. Untersuchungen der HSF1-Expression in Knochenmarkbiopsien von Myelompatienten und in Myelomzelllinien zeigten, dass in ca. 50 % der untersuchten Biopsien und Zelllinien eine hohe HSF1-Expression vorhanden ist. Sowohl der shRNA-vermitteltem Knockdown von HSF1 als auch die pharmakologische Inhibition mit Triptolid induzierten Apoptose in MM-Zellen. Durch Microarrayanalysen nach shRNA-vermitteltem Knockdown und der anschließenden Verifikation über Western Blot konnte gezeigt werden, dass nach der HSF1-Depletion zahlreiche HSP (HSP90, HSP70, HSP40 and HSP27) vermindert exprimiert wurden. Einzelne Knockdown Experimente der HSP40 und HSP27 führten zu moderaten Zellsterben, so dass geschlussfolgert werden kann, dass die gleichzeitige Minderung multipler HSP, durch die Depletion von HSF1, zu einem summierten starken apoptotischen Effekt führt. In weiteren Studien stellte sich heraus, dass in MM-Zellen, trotz des deregulierten Systems und der aberrant hohen Expression der HSP, eine Stressantwort ausgelöst werden kann. Dies konnte durch den „klassischen“ Hitzschock und durch die Behandlung mit pharmakologischen Inhibitoren von HSP90 und des Proteasoms erreicht werden. Diese unerwünschte Reaktion auf Therapeutika wird vermutlich durch einen kompensatorischen Zellrettungsmechanismus ausgelöst, der zu Resistenzen gegenüber der Behandlung führen kann. Durch die Inhibition von HSF1 mit Triptolid und durch shRNA-vermitteltem Knockdown, konnte diese zelluläre Antwort unterbunden werden. Darüber hinaus führte die pharmakologische Inhibition von HSF1 in Kombination mit HSP90 (mit NVP-AUY922) oder Proteasom-Inhibition (mit Bortezomib) zu einem verstärkten apoptotischen Effekt in MM-Zellen. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass HSF1 essenziell für die Regulation der HSP im MM ist. Darüber hinaus kann die Inhibition von HSF1, besonders in Kombination mit HSP90- oder Proteasom-Inhibition, eine neue hoffnungsvolle Therapieoption für Myelompatienten darstellen.
N2  - The heat shock stress response (HSR) represents an evolutionarily highly conserved salvage mechanism, which helps cells to cope with situations of stress and thus mediates protection from cell death. This stress response program is regulated by the heat shock transcription factor 1 (HSF1), which regulates expression and activity of heat shock proteins (HSPs). HSPs act as molecular chaperones to restore and maintain normal folding and intracellular trafficking of their cognate client proteins. The HSF1/HSP-controlled stress response can be beneficial in normal cells. However, its activation may also protect malignant cells from cell death induced by oncogene activation during malignant transformation or by drug-induced stress under therapeutic intervention. Various HSPs, as well as HSF1, have already been implicated in the pathogenesis of human cancer. In multiple myeloma (MM) HSPs stabilize components of a complex oncogenic signaling network, sustaining an aberrant signaling. In addition, an up-regulation of HSPs was reported after treatment with some new anti-MM agents, e.g. proteasome-, HDAC- and HSP90-inhibitors, suggesting that HSPs may contribute to drug resistance. For this reason, inhibition of HSPs (especially HSP90) is used as therapeutic approach. However, a clinical Phase I/II trial study showed that treatment with an HSP90 inhibitor as single agent had only limited anti-MM effects. Consequently, research effort is shifted towards blocking the induction of the heat shock stress response. For this purpose, HSF1 is regarded to be a promising target. Recently, it has been demonstrated that HSF1 contributes to malignant transformation in mouse models of tumorigenesis driven by oncogenic Ras or by functional loss of the Trp53 tumor suppressor. In the present study we therefore investigated the expression of HSF1, analyzed its role in the regulation of HSPs and its contribution to the survival and drug resistance in MM cells. We found that HSF1 protein was overexpressed in about half of the analyzed MM patient samples as well as in a majority of MM cell lines, whereas normal and premalignant MGUS plasma cells exhibited no or only weak HSF1 expression in situ. Both shRNA-mediated knockdown and pharmacological inhibition of HSF1 led to induction of apoptosis in MM cell lines and in primary MM cells. These results were affirmed by microarray analysis after shRNA-mediated knockdown and further verified by western blots, which revealed a decrease in numerous HSP (HSP90, HSP70, HSP40 and HSP27) after HSF1 depletion. Furthermore, individual knockdown experiments of HSP40 and HSP27 resulted in moderate cell death, leading to the conclusion that the simultaneous reduction of multiple HSP, by the inhibition of HSF1, achieves an additive strong apoptotic effect in MM cells. To study the stress response system in MM cells, we performed heat shock experiments and applied pharmacological HSP90- and proteasome-inhibitors. Despite the aberrant high expression of HSP in MM cells, both treatments showed an induction of the HSR and a stimulation of the synthesis of HSP. This adverse response to therapeutic agents is probably due to an onset of a compensatory cell rescue mechanism that leads to drug resistance. However, we were able to suppress this cellular response by the inhibition of HSF1 with triptolide and shRNA-mediated knockdown. Moreover, the combination of pharmacological HSF1-inhibition and HSP90 (with NVP AUY922) or HSF1 and proteasome inhibition (with bortezomib) resulted in an increased apoptotic effect in MM cells. In summary, these results suggest an important role for HSF1 in the regulation of major HSPs. Furthermore, the inhibition of HSF1 represents a promising new treatment strategy for MM patients, particularly in combination with HSP90 or proteasome inhibitors.
KW  - Plasmozytom
KW  - Therapie
KW  - Multiples Myelom
KW  - Hitzeschock Proteine
KW  - HSF1
KW  - onkogenes Signalnetzwerk
KW  - therapeutisches Target
KW  - Multiple Myeloma
KW  - heat shock proteins
KW  - HST1
KW  - therapeutic strategy
KW  - oncogenic signalling network
KW  - Hitzeschocktranskriptionsfaktor
KW  - Myelom
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83390
ER  - 
TY  - THES
A1  - Brede, Christian
T1  - Peripheral alloantigen expression directs the organ specific T cell infiltration after hematopoietic cell transplantation
T1  - Die Expression von Alloantigenen im peripheren Gewebe beeinflusst die selektive Organinfiltration durch T Zellen nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation
N2  - In acute graft-versus-host disease (GVHD) alloreactive donor T cells selectively damage skin, liver, and the gastrointestinal tract while other organs are rarely affected. The mechanism of this selective target tissue infiltration is not well understood. We investigated the importance of alloantigen expression for the selective organ manifestation by examining spatiotemporal changes of cellular and molecular events after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). To accomplish this we established a novel multicolor light sheet fluorescence microscopy (LSFM) approach for deciphering immune processes in large tissue specimens on a single-cell level in 3 dimensions. We combined and optimized protocols for antibody penetration, tissue clearing, and triple-color illumination to create a method for analyzing intact mouse and human tissues. This approach allowed us to successfully quantify changes in expression patterns of mucosal vascular addressin cell adhesion molecule–1 (MAdCAM-1) and T cell responses in Peyer’s patches following allo-HCT. In addition, we proofed that LSFM is suitable to map individual T cell subsets after HCT and detected rare cellular events. We employed this versatile technique to study the role of alloantigen expression for the selective organ manifestation after allo-HCT. Therefore, we used a T cell receptor (TCR) transgenic mouse model of GVHD that targets a single peptide antigen and thereby mimics a major histocompatibility complex (MHC)-matched single antigen mismatched (miHAg-mismatched) HCT. We transplanted TCR transgenic (OT-I) T cells into myeloablatively conditioned hosts that either express the peptide antigen ovalbumin ubiquitously (βa-Ova) or selectively in the pancreas (RIP-mOva), an organ that is normally not affected by acute GVHD. Of note, at day+6 after HCT we observed that OT-I T cell infiltration occurred in an alloantigen dependent manner. In βa-Ova recipients, where antigen was ubiquitously expressed, OT-I T cells infiltrated all organs and were not restricted to gastrointestinal tract, liver, and skin. In RIP-mOva recipients, where cognate antigen was only expressed in the pancreas, OT-I T cells selectively infiltrated this organ that is usually spared in acute GVHD. In conditioned RIP-mOva the transfer of 100 OT-I T cells sufficed to effectively infiltrate and destroy pancreatic islets resulting in 100% mortality. By employing intact tissue LSFM in RIP-mOva recipients, we identified very low numbers of initial islet infiltrating T cells on day+4 after HCT followed by a massive T cell migration to the pancreas within the following 24 hours. This suggested an effective mechanism of effector T cell recruitment to the tissue of alloantigen expression after initial antigen specific T cell encounter. In chimeras that either expressed the model antigen ovalbumin selectively in hematopoietic or in parenchymal cells only, transplanted OT-I T cells infiltrated target tissues irrespective of which compartment expressed the alloantigen. As IFN-γ could be detected in the serum of transplanted ovalbumin expressing recipients (βa-Ova, βa-Ova-chimeras and RIP-mOva) at day+6 after HCT, we hypothesized that this cytokine may be functionally involved in antigen specific OT-I T cell mediated pathology. In vitro activated OT-I T cells responded with the production of IFN-γ upon antigen re-encounter suggesting that IFN-γ might be relevant in the alloantigen dependent organ infiltration of antigen specific CD8+ T cell infiltration after HCT. Based on these data we propose that alloantigen expression plays an important role in organ specific T cell infiltration during acute GVHD and that initial alloreactive T cells recognizing the cognate antigen propagate a vicious cycle of enhanced T cell recruitment that subsequently culminates in the exacerbation of tissue restricted GVHD.
N2  - In der akuten Graft-Versus-Host Disease (GVHD) infiltrieren allogene Spender T Zellen Haut, Leber und den Magen-Darm-Trakt des Empfängers und attackieren das Gewebe. Andere Organe sind dagegen interessanterweise nur selten betroffen. Die Mechanismen dieser selektiven Organinfliltration sind bisher weitestgehend unbekannt. In meiner Dissertationsarbeit untersuchte ich den Einfluss der Alloantigenexpression auf die selektive Organmanifestation während der GVHD. Um komplexe Immunprozesse die nach allogener Stammzelltransplantation auftreten, besser zu verstehen, entwickelten wir eine Lichtblattmikroskopietechnik (LSFM) die zelluläre und molekulare Veränderungen im intakten Gewebe detektieren kann. Wir etablierten eine neuartigen mehrfarben LSFM-Methodik, die es ermöglicht, Immunprozesse in großen Gewebsstücken von Maus und Mensch in Einzelzellauflösung dreidimensional darzustellen. Dazu kombinierten und optimierten wir Protokolle, um eine Penetration von Antikörpern tief in das Gewebe sowie die Aufklärung und die dreifache Beleuchtung des Gewebes zu ermöglichen. Diese Methode erlaubte uns die erfolgreiche Quantifizierung der Proteinexpression des Adressins mucosal vascular addressin cell adhesion molecule–1 (MAdCAM-1) als auch die Quantifizierung der T Zell Antwort im intakten Peyer’s Plaque nach allogener hämatopoetischer Transplantation (HCT). Weiterhin konnten wir die Methode zur Untersuchung der Migration unterschiedlicher T Zell-Subpopulationen nach HCT erfolgreich einsetzen und konnten einzelne, organinfiltrierende Zellen detektierten und quantifizieren. Wir benutzten die LSFM Methode um den Einfluss der Alloantigenexpression auf die selektive Organmanifestation zu studieren. Dazu verwendeten wir ein Transplantationsmodell, in dem der Haupthistokompatibilitätskomplex übereinstimmt (MHC-matched) und eine Diskrepanz nur in einem einzelnen Peptid Antigen (miHAG-mismatch) zwischen Spender und Empfänger bestand. Wir transplantierten T Zell Rezeptor (TCR) transgene (OT-I) T Zellen in myeloablativ bestrahlte Empfänger, die das Peptidantigen Ovalbumin entweder in allen Geweben (βa-Ova) oder selektiv in der Bauchspeicheldrüse (RIP-mOva) exprimieren. Die Bauchspeicheldrüse ist ein Organ, das normalerweise nicht von der akuten GVHD betroffen ist. An Tag 6 nach allogener HCT waren alle Organe die das Alloantigen exprimieren auch von Spender T Zellen infiltriert. In myeloablativ bestrahlten RIP-mOva Empfängern reichten bereits 100 transferierte OT-I T Zellen aus, um Alloantigen-exprimierende pankreatische Inselzellen zu zerstören. Dies führte zu einer Mortalität von 100% der Empfänger und spricht für eine sehr effiziente Alloantigendetektion und Gewebsinfiltration durch die Spender T Zellen. Um die Kinetik der Organinfiltration der Spender T Zellen detailliert zu untersuchen, verwendeten wir die neue Lichtblattmikroskopietechnik, welche die Analyse intakter Organe ermöglicht. In RIP-mOva Empfängern identifizierten wir erste wenige Spender T Zellen im Pankreas an Tag 4 nach Transplantation, gefolgt von einer massiven Pankreasinfiltration durch Spender T Zellen innerhalb von 24 Stunden. Dies deutet auf eine gezielte Rekrutierung der Spender T Zellen nach erstem Antigenkontakt in das Gewebe mit Alloantigenexpression. Um zu untersuchen, ob die Alloantigenexpression vom parenchymalen Gewebe oder aber durch hämatopoetische Zellen zur spezifischen Organinfiltration führt, transplantierten wir OT-I T Zellen in chimäre Empfänger, in denen das Alloantigen entweder nur im Gewebsparenchym oder ausschließlich von hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. An Tag 6 nach der allogenen HCT fanden wir Spender T Zellen in allen Geweben, unabhängig davon welches Empfängerzellkompartment das Alloantigen präsentierte. Wir detektierten hohe IFN-γ-Werte im Serum von Ovalbumin exprimierenden Empfänger (βa-Ova, βa- Ova-Chimären und RIP-mOva). Weiterhin fanden wir, dass nach erneutem Kontakt mit dem spezifischen Alloantigen, OT-I T Zellen die in vitro aktiviert wurden, IFN-γ produzierten. Wir schließen aus diesen Beobachtungen, dass für die antigenabhängige Gewebeinfiltration IFN-γ wichtig ist. Zusammenfassend postulieren wir, dass die Alloantigenexpression im Gewebe eine wichtige Rolle in der organspezifischen Infiltration durch Spender T Zellen spielt, und dass T Zellen die Alloantigen spezifisch erkennen, dafür verantwortlich sind, dass weitere Effektor-T Zellen in das Gewebe rekrutiert werden.
KW  - Alloantigen
KW  - Transplantat-Wirt-Reaktion
KW  - Genexpression
KW  - Blutstammzelle
KW  - Graft versus Host Disease
KW  - Hematopoietic Cell Transplantation
KW  - Alloantigen Expression
KW  - Light Sheet Fluorescence Microscopy
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Hämatopoetische Stammzelltransplantation
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85365
ER  -