TY - THES A1 - Gotthardt [geb. Schubert], Sonja T1 - Einfluss von Oncostatin M auf die Pathogenese der Nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung T1 - Influence of Oncostatin M on the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease N2 - Die Nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist eine der häufigsten chronischen Lebererkrankungen der westlichen Welt. Die Pathogenese der Erkrankung ist noch nicht vollständig erforscht und wirksame medikamentöse Therapien sind bisher nicht zugelassen. Wachsende Evidenz zeigt, dass das Interleukin-6-Typ-Zytokin Oncostatin M (OSM) eine wichtige Rolle in der Pathogenese der NAFLD spielt. Die japanische Arbeitsgruppe um Komori et al. zeigte an OSM-Rezeptor-β-defizienten (Osmr-KO-) Mäusen sowie durch OSM-Behandlung von genetisch und ernährungsbedingt adipösen Mäusen, dass OSM vor einer hepatischen Steatose und metabolischer Komorbidität schützen kann. Andere Publikationen suggerieren, dass OSM an NAFLD-Entwicklung und -Progression beteiligt ist, indem es die Expression von Genen der β-Oxidation und Very-Low-Density-Lipoprotein (VLDL-) Sekretion reprimiert und die Expression profibrogenetischer Gene fördert. Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-defiziente- (Ldlr-KO-) Mäuse sind seit Langem als Atherosklerose-Modell etabliert und wurden zuletzt auch als physiologisches Modell für NAFLD identifiziert. Um die Rolle von OSM in der NAFLD-Pathogenese zu beleuchten, wurden Osmr-KO-Mäuse auf Wildtyp- (WT-) und Ldlr-KO-Hintergrund untersucht, die über 12 Wochen eine fett- und cholesterinreiche Western Diet erhielten und anschließend für die Organentnahme geopfert wurden. Im Vorfeld dieser Arbeit wurden Körpergewicht, Blutglukose, Serum-Cholesterin und Lebergewicht der Tiere gemessen. Hierbei zeigte sich ein erhöhtes Körpergewicht, unveränderte Blutglukose, erhöhtes Serum-Cholesterin sowie ein erhöhtes Lebergewicht in Osmr-KO- gegenüber WT-Mäusen. Andersherum waren Körpergewicht, Blutglukose, Serum-Cholesterin und Lebergewicht in Ldlr-Osmr-KO- gegenüber Ldlr-KO-Mäusen vermindert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgte die histologische Untersuchung des Lebergewebes, die Messung von Serum-Triglyzeriden und Fettsäuren sowie die Untersuchung der hepatischen Genexpression. An kultivierten Zellen der humanen Hepatom-Zelllinie HepG2 wurde eine mögliche Regulation der CYP7A1-Genexpression durch OSM untersucht. CYP7A1 ist als Schrittmacherenzym der Gallensäuresynthese an der hepatischen Cholesterin-Clearance beteiligt. Osmr-KO-Mäuse zeigten gegenüber WT-Mäusen histologisch eine verstärkte hepatische Steatose. Bei der Untersuchung der mRNA-Expression von Genen mit Beteiligung an der hepatischen Lipidhomöostase zeigte sich eine Minderexpression von Ldlr in Osmr-KO-Mäusen. Weiterhin zeigte sich eine etwas geringere Expression von Cyp7a1 in Osmr-KO-Mäusen. Die Expression aller anderen untersuchten Gene, die an Fettsäuresynthese, Cholesterintransport und –metabolismus beteiligt sind, lieferten keine Erklärung für eine erhöhte hepatische Lipidakkumulation in Osmr-KO-Mäusen. Ldlr-Osmr-KO-Mäuse hatten gegenüber Ldlr-KO-Mäusen eine geringer ausgeprägte hepatische Steatose. Die mRNA-Expression von Genen der Fettsäuresynthese, der Cholesterinbiosynthese und des Cholesterintransports waren in Ldlr-Osmr-KO- gegenüber Ldlr-KO-Mäusen nicht wesentlich verändert. Allerdings fiel eine deutliche Hochregulation von Cyp7a1 in Ldlr-Osmr-KO-Mäusen auf. Darüber hinaus war Osm in Ldlr-KO-Mäusen gegenüber WT-Mäusen stärker exprimiert. Um eine Regulation von CYP7A1 durch OSM nachzuweisen, wurde die Genexpression in HepG2-Zellen nach Stimulation mit OSM untersucht. Hierbei zeigte sich, dass OSM die mRNA-Expression von CYP7A1 supprimierte. Dieser Effekt war durch die Zugabe von Inhibitoren der Januskinasen (JAK), Mitogen Activated Protein Kinase/ERK-Kinase (MEK) und Extracellular-signal Regulated Kinase ½ (ERK1/2) reversibel. Die CYP7A1-Suppression durch OSM ging mit einer verminderten Expression des Transkriptionsfaktor-Gens HNF4A einher. Osmr-KO-Mäuse zeigten gegenüber WT-Mäusen nach 12 Wochen Western Diet verstärkte Adipositas, Dyslipidämie sowie eine hepatische Steatose. Die Analyse der hepatischen mRNA-Expression legt nahe, dass die Minderexpression von Ldlr in Osmr-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen zur Verstärkung der Dyslipidämie und hepatischen Steatose beigetragen hat. Weiterhin kann die geringere Expression von Cyp7a1 in Osmr-KO-Mäusen durch daraus resultierende Akkumulation von Cholesterin zur erhöhten hepatischen Lipidakkumulation in diesen Mäusen beigetragen haben. Ldlr-KO-Mäuse zeigten nach 12 Wochen Western Diet ebenfalls eine hepatische Steatose. Diese war in Ldlr-Osmr-KO-Mäusen gegenüber Ldlr-KO-Mäusen geringer ausgeprägt. Die erhöhte Expression von Cyp7a1 in Ldlr-Osmr-KO-Mäusen kann die Verbesserung von hepatischer Lipidakkumulation und Dyslipidämie durch erhöhte Cholesterinmetabolisierung zu Gallensäuren erklären. Übereinstimmend mit der Cyp7a1-Regulation in LDLR-defizienten Mäusen zeigte sich in vitro, dass OSM die Expression von CYP7A1 in HepG2-Zellen vermindert und sich so negativ auf die hepatische Lipidhomöostase auswirken kann. Insgesamt implizieren diese Ergebnisse eine divergierende Rolle von OSM bei der Entwicklung einer hepatischen Steatose abhängig vom genetischen Hintergrund. OSM scheint bei WT-Mäusen für die Erhaltung der metabolischen Gesundheit wichtig zu sein. Bei Ldlr-KO-Mäusen hingegen scheint OSM die Entwicklung von Adipositas, Dyslipidämie und hepatischer Steatose zu fördern. Die differenzielle Rolle in WT- und Ldlr-KO-Mäusen könnte durch unterschiedliche Osm-Expressionsspiegel zustande kommen: Während basale OSMRβ-Signaltransduktion durch geringe OSM-Spiegel in WT-Mäusen für die Lipidhomöostase essenziell zu sein scheint, könnte erhöhte oder prolongierte OSMRβ-Signaltransduktion durch höhere OSM-Spiegel in Ldlr-KO-Mäusen das Fortschreiten der hepatischen Steatose fördern. Dies stellt OSM als mögliches NAFLD-Therapeutikum in Frage. Um die Hypothese zu überprüfen, dass OSM abhängig von der Höhe und Kinetik der Spiegel günstige oder ungünstige Effekte auf die NAFLD-Entwicklung hat, sollte in zukünftigen Experimenten der Einfluss kurz- und langfristiger Behandlung von WT-Mäusen mit OSM unterschiedlicher Konzentrationen auf die Entwicklung einer hepatischen Steatose untersucht werden. N2 - Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is among the most common chronic liver diseases in Western societies. Pathogenetic mechanisms are not fully elucidated and to date there is no approved drug therapy available. There is mounting evidence that the Interleukin-6-type-cytokine Oncostatin M (OSM) plays a crucial role in the pathogenesis of NAFLD. The Japanese working group of Komori et al. had shown that OSM has favorable effects on metabolism und protects against hepatic steatosis using OSM-receptor-β-deficient (Osmr-KO-) mice as well as OSM treatment of genetically or diet-induced obese mice. Other publications suggest that OSM contributes to the pathogenesis and progression of NAFLD by reducing the expression of genes involved in β-oxidation and Very-Low-Density-Lipoprotein (VLDL) secretion and inducing the expression of genes involved in fibrogenesis. Recently Low-Density-Lipoprotein-Receptor-deficient (Ldlr-KO-) mice, which are a well-established model for atherosclerosis, have also been considered a physiological model for NAFLD. To further investigate the role of OSM in NAFLD pathogenesis Osmr-KO mice on either wild type- (WT-) or Ldlr-KO-background were fed a high-fat and high-cholesterol Western diet for 12 weeks and were then sacrificed for tissue collection. Prior to the present thesis body weight, blood glucose levels, serum cholesterol and liver weight of the mice were measured. Osmr-KO mice showed increased body weight, serum cholesterol levels and liver weight compared to WT mice, whereas blood glucose levels did not differ. On the contrary, Ldlr-Osmr-KO mice showed decreased values in all parameters compared to Ldlr-KO mice, including body weight, blood glucose levels, serum cholesterol levels and liver weight. In the present thesis a histological examination of the liver tissue was made, serum levels of triglycerides and fatty acids were measured, and hepatic gene expression was analyzed. In cultured cells of the human hepatoma cell line HepG2 a potential regulation of CYP7A1 gene expression by OSM was examined. CYP7A1 is the rate limiting enzyme of bile acid synthesis and is therefore involved in hepatic cholesterol clearance. Osmr-KO mice showed enhanced hepatic steatosis compared to WT mice. Examination of gene expression involved in hepatic lipid homeostasis revealed reduced Ldlr expression levels in Osmr-KO mice. Furthermore, a slightly decreased Cyp7a1 expression was observed. The expression of other genes involved in fatty acid synthesis, cholesterol transport and cholesterol metabolism did not explain the enhanced hepatic lipid accumulation in Osmr-KO mice. In Ldlr-Osmr-KO mice hepatic steatosis was reduced compared to Ldlr-KO mice. The expression of genes involved in fatty acid synthesis, cholesterol synthesis and cholesterol transport was not considerably altered in Ldlr-Osmr-KO compared to Ldlr-KO mice. However, Cyp7a1 was markedly upregulated in Ldlr-Osmr-KO mice. In addition, Osm expression was increased in Ldlr-KO mice compared to WT mice. To prove the regulation of CYP7A1 by OSM, gene expression was determined in OSM-treated HepG2 cells. The results show that OSM attenuated CYP7A1 expression. This effect was reversed by the addition of inhibitors of either januskinases (JAK), mitogen-activated protein kinase/ERK-kinase (MEK) or extracellular-signal regulated kinase 1/2 (ERK1/2). CYP7A1-suppression by OSM was accompanied by reduced expression levels of the transcription factor gene HNF4A. After 12 weeks of Western diet Osmr-KO mice showed enhanced obesity, dyslipidemia and hepatic steatosis compared to WT mice. Determination of hepatic gene expression suggests that decreased expression of Ldlr in Osmr-KO mice compared to WT mice contributes to dyslipidemia and hepatic steatosis. Furthermore, the decreased expression of Cyp7a1 in Osmr-KO mice may contribute to cholesterol accumulation and accordingly to hepatic lipid accumulation in these mice. Ldlr-KO mice also showed hepatic steatosis after 12 weeks of Western diet. In comparison, hepatic steatosis was markedly reduced in Ldlr-Osmr-KO mice. Increased expression levels of Cyp7a1 and hence enhanced metabolization of cholesterol to bile acids in Ldlr-Osmr-KO mice can explain improved hepatic lipid accumulation and dyslipidemia in these mice compared to Ldlr-KO mice. Consistent with the discovered Cyp7a1 regulation in LDLR-deficient mice, OSM decreased the expression of CYP7A1 in HepG2 cells and therefore may have detrimental effects on hepatic lipid homeostasis. Altogether the results implicate a diverging role of OSM in the pathogenesis of hepatic steatosis depending on the genetic background. In WT mice OSM seems to convey protective effects on lipid homeostasis, whereas in Ldlr-KO mice OSM seems to promote the development of obesity, dyslipidemia and hepatic steatosis. The differential role of OSM in WT and Ldlr-KO mice might be caused by diverging Osm expression levels: Basal OSMRβ signal transduction caused by low OSM levels seems to be essential for lipid homeostasis, whereas enhanced or prolonged OSMRβ signal transduction caused by higher OSM levels might foster the progression of hepatic steatosis. These findings question OSM as a putative therapeutic agent for NAFLD. To test the hypothesis that OSM has beneficial or detrimental effects on NAFLD pathogenesis depending on OSM levels and kinetics, future studies should examine the effect of short- and long-term administration of OSM in different concentrations on the development of hepatic steatosis in WT mice. KW - Fettleber KW - Interleukin 6 KW - Leukaemia-inhibitory factor KW - Cholesterinstoffwechsel KW - Fettsäurestoffwechsel KW - NAFLD KW - Oncostatin M KW - Osmr-Knockout KW - Ldlr-Knockout KW - CYP7A1 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281312 ER - TY - THES A1 - Lauruschkat, Chris David T1 - Entwicklung funktioneller Immunassays zur Detektion der humanen Immunantwort auf das opportunistische Pathogen \(Aspergillus\) \(fumigatus\) T1 - Development of functional immunoassays to study human host responses to the opportunistic pathogen \(Aspergillus\) \(fumigatus\) N2 - Aspergillus fumigatus ist ein opportunistisches fungales Humanpathogen, das ein breites Erkrankungsspektrum von der invasiven Aspergillose (IA) in immunkompromittierten Patienten bis zu einer Reihe von Hypersensitivitätserkrankungen in immunkompetenten Individuen hervorrufen kann. Die Diagnostik für A. fumigatus assoziierte Krankheitsbilder beruht auf mehreren diagnostischen Tests, die auch in ihrer Kombination oft zu späten und unzuverlässigen Diagnosen führen, was wiederum zu einer suboptimalen Patientenversorgung, erhöhter Mortalität und gesteigerten Kosten für das Gesundheitssystem führt. Es besteht daher die unbedingte Notwendigkeit, neue und bessere diagnostische Tests zur Detektion von A. fumigatus zu entwickeln. T Zell Assays sind vielversprechende, innovative diagnostische Tests, die bereits für andere Infektionskrankheiten in der Routinediagnostik eingesetzt werden. Erste Versuche wurden bereits unternommen, diese Assays auch für A. fumigatus assoziierte Erkrankungen einzusetzen. Die gängigsten, auf mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC)-basierten T Zell Assays sind der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Enzyme-linked Immuno Spot Assay (ELISPOT) und die Durchflusszytometrie. Das Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung eines klinisch einsetzbaren T-Zell-Assays für A. fumigatus assoziierte Erkrankungen. Die in der Literatur beschriebenen Assays zeigten in unseren Experimenten bei der Anwendung für mykologische Fragestellungen eine hohe Suszeptibilität gegenüber bereits kurzen präanalytischen Lagerzeiten und Krykonservierung, was einen klinischen Einsatz erschwerte. Wir entwickelten deshalb einen Vollblut basierten ELISA (VB-ELISA) mit dualer Kostimulation (α-CD28 und α-CD49d), hoher Reproduzierbarkeit und verbesserter Robustheit gegenüber präanalytischen Einflussfaktoren. Der VB ELISA konnte hohe Differenzen zwischen Typ 1 T Helferzellen (Th1) , Th2 und Th17 Zytokinkonzentrationen bei Patienten mit Aspergillus assoziierten Hypersensitivitätskrankheitsbildern und Kontrollpatienten feststellen. Um zu testen, ob dieser Anstieg auf die Erkrankung zurückzuführen ist oder auch bei hoher Aspergillus-Umweltexposition vorzufinden ist, wurde der Assay in Aspergillus exponierten gesunden ökologischen Landwirten getestet. In dieser Gruppe fanden wir ebenfalls eine erhöhte Th1 und Th2 Expansion und Zytokinsekretion gegenüber gesunden Kontrollspendern, jedoch wurde nur ein geringer Anstieg des Th17 Signalzytokines IL-17 detektiert. Die Detektion von IL-17 im VB-ELISA in Kombination mit anderen Zytokinmarkern ist daher ein vielversprechender Biomarker für die Diagnose von A. fumigatus assoziierten Hypersensitivitätserkrankungen. Neben diesen Hypersensitivitätserkrankungen haben wir den VB-ELISA auch in immunkompromittierten Patienten nach allogener Stammzelltransplantation (alloSZT), einer Hochrisikogruppe für die IA und die durch das humane Cytomegalovirus (HCMV) ausgelöste Zytomegalie, evaluiert. Während in unserer monozentrischen Pilotstudie aufgrund der geringen Inzidenz keine Evaluation an IA-Patienten erfolgen konnte, wurde mittels VB-ELISA eine hohe Konkordanz der HCMV-spezifischen T Zell Antwort mit der HCMV Serologie sowie eine vergleichbare Leistung zum ELISPOT, dem am häufigsten eingestetzen Assay für diese Fragestellung, festgestellt. Zusammenfassend haben wir mit dem VB ELISA einen vielversprechenden und breitflächig im Spektrum A. fumigatus assoziierter Erkrankungen einsetzbaren T Zell Assay entwickelt, der in der Zukunft in großen Studien mit klar definierten Patientenkohorten getestet werden sollte. Auf Grund von Daten aus Folgestudien, die auf dieser Arbeit basieren, ist des Weiteren davon auszugehen, dass der VB-ELISA auf Grund seiner Stärken potenziell in einer Vielzahl von Anwendungsgebieten und Pathogenen (eine Folgestudie mit SARS-CoV-2 wurde vor kurzem veröffentlicht) universell eingesetzt werden kann. Neben der Immundiagnostik für diverse Infektionserkrankungen könnte der Assay außerdem für T Zell Antworten auf Vakzinierungen und Immuntherapien, in vivo Experimente und in vitro Toxizitätstests verwendet werden. N2 - Aspergillus fumigatus is an opportunistic human pathogen, which is the cause of a wide disease spectrum. The spectrum ranges from invasive Aspergillosis (IA) in immunocompromised patients to diverse hypersensitivity diseases in immunocompetent individuals. Diagnostic assays of A. fumigatus have to be combined for efficient detection and still lead to unreliable and late diagnosis, resulting in suboptimal patient care, increased mortality and public health costs. There is, therefore, a great need to develop novel diagnostics for the detection of A. fumigatus. T-cell assays are promising, innovative diagnostic assays, which are used in routine diagnostics for certain infectious diseases. First affords have been made to adapt T-cell assays for the diagnosis of A. fumigatus-associated diseases. The most common T-cell assays are based on the isolation and stimulation of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and relay on Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Enzyme-Linked Immuno Spot Assay (ELISPOT) and flow cytometry as their read-out platforms. The aim of this dissertation was to develop a clinically feasible T-cell assay for A. fumigatus-associated diseases. We were able to demonstrate that all of these assays have high susceptibility towards pre-analytic factors like cryopreservation and shortly extended pre-analytic blood storage periods, hampering clinical feasibility. Thus, we developed a whole blood based ELISA (WB-ELISA) with dual co-stimulation (α-CD28 and α-CD49d), which showed high reproducibility, increased robustness towards pre-analytic factors and increased cytokine read-outs. The WB-ELISA was able to quantify large differences of T helper cell 1 (Th1), Th2 and Th17 cytokine concentrations in patients suffering from Aspergillus-associated hypersensitivity diseases compared to healthy controls. To analyze, whether these increased cytokine concentrations were the result of the pathology or could also be found in heavily Aspergillus-exposed individuals, we examined cytokine concentration in heavily Aspergillus-exposed organic farmers. We quantified increased Th1 and Th2 cytokine concentrations, however, we only found a minimal increase in the Th17 signal cytokine IL-17. Interleukin (IL)-17 (most likely in combination with other cytokines) is therefore a promising potential biomarker for the diagnosis of Aspergillus-associated hypersensitivity diseases. In addition to Aspergillus-associated hypersensitivity diseases, we tested the feasibility of the WB ELISA in immunocompromised patients after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT). These patients are at high-risk for infections like IA as well as cytomegalovirus (CMV) disease, which is caused by CMV. Although, IA-specific evaluation could not be conducted, due to the low IA-incidence in these patients, the WB-ELISA showed high concordance of HCMV-specific T-cell responses with HCMV-serology as well as comparable performance to the ELISPOT, a commonly used T-cell assay for HCMV, in alloSCT patients. In conclusion, the successful development of the WB-ELISA has led to a promising and widely applicable T-cell assay for Aspergillus-associated diseases. In the future, the WB-ELISA should be evaluated in larger, multi-centric studies in well-defined patient cohorts suffering from Aspergillus-associated diseases. Furthermore, the WB-ELISA might be useful for a wide range of areas and pathogens (a follow-up study in COVID-19 patients was recently published). Besides the use in the immune diagnostics of infectious diseases, the WB-ELISA might also be applicable in the quantification of T-cell responses in vaccination- and immune therapy studies, in-vivo experiments and in-vitro toxicity testing. KW - Immunzellassays KW - Immunology KW - Infectious diseases KW - Immune cell assays KW - Immunologie KW - Infektiologie KW - Aspergillus fumigatus Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-319835 ER -