TY - JOUR A1 - El Hajj, Nady A1 - Dittrich, Marcus A1 - Böck, Julia A1 - Kraus, Theo F. J. A1 - Nanda, Indrajit A1 - Müller, Tobias A1 - Seidmann, Larissa A1 - Tralau, Tim A1 - Galetzka, Danuta A1 - Schneider, Eberhard A1 - Haaf, Thomas T1 - Epigenetic dysregulation in the developing Down syndrome cortex JF - Epigenetics N2 - Using Illumina 450K arrays, 1.85% of all analyzed CpG sites were significantly hypermethylated and 0.31% hypomethylated in fetal Down syndrome (DS) cortex throughout the genome. The methylation changes on chromosome 21 appeared to be balanced between hypo- and hyper-methylation, whereas, consistent with prior reports, all other chromosomes showed 3-11times more hyper- than hypo-methylated sites. Reduced NRSF/REST expression due to upregulation of DYRK1A (on chromosome 21q22.13) and methylation of REST binding sites during early developmental stages may contribute to this genome-wide excess of hypermethylated sites. Upregulation of DNMT3L (on chromosome 21q22.4) could lead to de novo methylation in neuroprogenitors, which then persists in the fetal DS brain where DNMT3A and DNMT3B become downregulated. The vast majority of differentially methylated promoters and genes was hypermethylated in DS and located outside chromosome 21, including the protocadherin gamma (PCDHG) cluster on chromosome 5q31, which is crucial for neural circuit formation in the developing brain. Bisulfite pyrosequencing and targeted RNA sequencing showed that several genes of PCDHG subfamilies A and B are hypermethylated and transcriptionally downregulated in fetal DS cortex. Decreased PCDHG expression is expected to reduce dendrite arborization and growth in cortical neurons. Since constitutive hypermethylation of PCDHG and other genes affects multiple tissues, including blood, it may provide useful biomarkers for DS brain development and pharmacologic targets for therapeutic interventions. KW - trisomy 21 KW - DNA methylation KW - Down syndrome KW - fetal brain development KW - frontal cortex KW - protocadherin gamma cluster Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-191239 VL - 11 IS - 8 ER - TY - JOUR A1 - Dotterweich, Julia A1 - Schlegelmilch, Katrin A1 - Keller, Alexander A1 - Geyer, Beate A1 - Schneider, Doris A1 - Zeck, Sabine A1 - Tower, Robert J. J. A1 - Ebert, Regina A1 - Jakob, Franz A1 - Schütze, Norbert T1 - Contact of myeloma cells induces a characteristic transcriptome signature in skeletal precursor cells-implications for myeloma bone disease JF - Bone N2 - Physical interaction of skeletal precursors with multiple myeloma cells has been shown to suppress their osteogenic potential while favoring their tumor-promoting features. Although several transcriptome analyses of myeloma patient-derived mesenchymal stem cells have displayed differences compared to their healthy counterparts, these analyses insufficiently reflect the signatures mediated by tumor cell contact, vary due to different methodologies, and lack results in lineage-committed precursors. To determine tumor cell contact-mediated changes on skeletal precursors, we performed transcriptome analyses of mesenchymal stem cells and osteogenic precursor cells cultured in contact with the myeloma cell line INA-6. Comparative analyses confirmed dysregulation of genes which code for known disease-relevant factors and additionally revealed upregulation of genes that are associated with plasma cell homing, adhesion, osteoclastogenesis, and angiogenesis. Osteoclast-derived coupling factors, a dysregulated adipogenic potential, and an imbalance in favor of anti-anabolic factors may play a role in the hampered osteoblast differentiation potential of mesenchymal stem cells. Angiopoietin-Like 4 (ANGPTL4) was selected from a list of differentially expressed genes as a myeloma cell contact-dependent target in skeletal precursor cells which warranted further functional analyses. Adhesion assays with full-length ANGPTL4-coated plates revealed a potential role of this protein in INA6 cell attachment. This study expands knowledge of the myeloma cell contact-induced signature in the stromal compartment of myelomatous bones and thus offers potential targets that may allow detection and treatment of myeloma bone disease at an early stage. KW - marrow stromal cells KW - Endothelial growth-factor KW - precedes multiple-myeloma KW - monoclonial gammopathy KW - in-vitro KW - mesenchymal stem-cells KW - undetermined significance KW - angiogenic cytokines KW - peripheral-blood KW - gene-expression KW - Multiple myeloma KW - Bone disease KW - Angiopoietin-like 4 KW - Gene expression profiling KW - Mesenchymal stem cells KW - Osteogenic precursor cells Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186688 VL - 93 ER - TY - JOUR A1 - Scharaw, Sandra A1 - Iskar, Murat A1 - Ori, Alessandro A1 - Boncompain, Gaelle A1 - Laketa, Vibor A1 - Poser, Ina A1 - Lundberg, Emma A1 - Perez, Franck A1 - Beck, Martin A1 - Bork, Peer A1 - Pepperkok, Rainer T1 - The endosomal transcriptional regulator RNF11 integrates degradation and transport of EGFR JF - Journal of Cell Biology N2 - Stimulation of cells with epidermal growth factor (EGF) induces internalization and partial degradation of the EGF receptor (EGFR) by the endo-lysosomal pathway. For continuous cell functioning, EGFR plasma membrane levels are maintained by transporting newly synthesized EGFRs to the cell surface. The regulation of this process is largely unknown. In this study, we find that EGF stimulation specifically increases the transport efficiency of newly synthesized EGFRs from the endoplasmic reticulum to the plasma membrane. This coincides with an up-regulation of the inner coat protein complex II (COP II) components SEC23B, SEC24B, and SEC24D, which we show to be specifically required for EGFR transport. Up-regulation of these COP II components requires the transcriptional regulator RNF11, which localizes to early endosomes and appears additionally in the cell nucleus upon continuous EGF stimulation. Collectively, our work identifies a new regulatory mechanism that integrates the degradation and transport of EGFR in order to maintain its physiological levels at the plasma membrane. KW - Epidermal growth-factor KW - finger protein 11 KW - receptor tyrosine kinases KW - early secretory pathway KW - breast-cancer KW - brefeldin-a KW - E3 ligase KW - trafficking KW - export KW - endoplasmic-reticulum Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186731 VL - 215 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Seitz, Nicola T1 - Bee demise and bee rise: From honey bee colony losses to finding measures for advancing entire bee communities T1 - Bienenschwund und Bienenaufschwung: Von Honigbienen-Kolonieverlusten zur Förderung von gesamten Bienengemeinschaften N2 - My dissertation comprises three studies: (1) an assessment of honey bee colony losses in the USA between 2014 and 2015, (2) an exploration of the potential of reclaimed sand mines as bee habitat, and (3) an evaluation of native and non-native pollinator friendly plants in regard to their attraction to bees. While the first study focuses on honey bees, the latter two studies primarily take wild bees or entire bee communities in focus. The study on honey bee colony losses was conducted within the framework of the Bee Informed Partnership (BIP, beeinformed.org) and aligns with the annual colony loss surveys which have been conducted in the USA since the winter of 2006/2007. It was the fourth year for which summer and annual losses were calculated in addition to winter losses. Among participants, backyard beekeepers were the largest group (n = 5690), although sideline (n = 169) and commercial (n = 78) beekeepers managed the majority (91.7 %) of the 414 267 surveyed colonies. Overall, 15.1 % of the estimated 2.74 million managed colonies in the USA were included in the study. Total honey bee colony losses (based on the entirety of included colonies) were higher in summer (25.3 %) than in winter (22.3 %) and amounted to 40.6 % for the entire 2014/2015 beekeeping year. Average colony losses per beekeeper or operation were higher in winter (43.7 %) than in summer (14.7 %) and amounted to 49 % for the entire 2014/2015 beekeeping year. Due to the dominance of backyard beekeepers among participants, average losses per operation (or unweighted loss) stronger reflected this smaller type of beekeeper. Backyard beekeepers mainly named colony management issues (e.g., starvation, weak colony in the fall) as causes for mortality, while sideline and commercial beekeepers stronger emphasized parasites or factors outside their control (e.g., varroa, nosema, queen failure). The second study took place at reclaimed sand mines. Sand mines represent anthropogenically impacted habitats found worldwide, which bear potential for bee conservation. Although floral resources can be limited at these habitats, vegetation free patches of open sandy soils and embankments may offer good nesting possibilities for sand restricted and other bees. We compared bee communities as found in three reclaimed sand mines and at adjacent roadside meadows in Maryland, USA, over two years. Both sand mines and roadsides hosted diverse bee communities with 111 and 88 bee species, respectively. Bee abundances as well as richness and Shannon diversity of bee species were higher in sand mines than at roadsides and negatively correlated with the percentage of vegetational ground cover. Species composition also differed significantly between habitats. Sand mines hosted a higher proportion of ground nesters, more uncommon and more ‘sand loving’ bees similar to natural sandy areas of Maryland. Despite the destruction of the original pre-mining habitat, sand mines thus appear to represent a unique habitat for wild bees, particularly when natural vegetation and open sand spots are encouraged. Considering habitat loss, the lack of natural disturbance regimes, and ongoing declines of wild bees, sand mines could add promising opportunities for bee conservation which has hitherto mainly focused on agricultural and urban habitats. The third study was an experimental field study on pollinator friendly plants. Bees rely on the pollen and nectar of plants as their food source. Therefore, pollinator friendly plantings are often used for habitat enhancements in bee conservation. Non-native pollinator friendly plants may aid in bee conservation efforts, but have not been tested and compared with native pollinator friendly plants in a common garden experiment. In this study, we seeded mixes of 20 native and 20 non-native pollinator friendly plants in two separate plots at three sites in Maryland, USA. For two years, we recorded flower visitors to the plants throughout the blooming period and additionally sampled bees with pan traps. A total of 3744 bees (120 species) were sampled in the study. Of these, 1708 bees (72 species) were hand netted directly from flowers for comparisons between native and non-native plants. Depending on the season, bee abundance and species richness was either similar or lower (early season and for richness also late season) at native plots compared to non-native plots. Additionally, the overall bee community composition differed significantly between native and non-native plots. Furthermore, native plants were associated with more specialized plant-bee visitation networks compared to non-native plants. In general, visitation networks were more specialized in the early season than the later seasons. Four species (Bombus impatiens, Halictus poeyi/ligatus, Lasioglossum pilosum, and Xylocopa virginica) out of the five most abundant bee species (also including Apis mellifera) foraged more specialized on native than non-native plants. Our study showed that non-native plants were well accepted by a diverse bee community and had a similar to higher attraction for bees compared to native plants. However, we also demonstrated alterations in foraging behavior, bee community assemblage, and visitation networks. As long as used with caution, non-native plants can be a useful addition to native pollinator friendly plantings. This study gives a first example of a direct comparison between native and non-native pollinator friendly plants. N2 - Meine Dissertation umfasst drei Studien: (1) eine Erfassung von Honigbienen-Kolonieverlusten in den USA zwischen 2014 und 2015, (2) die Erforschung des Potenzials renaturierter Sandminen als Habitat für Bienen und (3) eine Evaluierung nativer sowie standortfremder bestäuberfreundlicher Pflanzen hinsichtlich ihrer Attraktivität für Bienen. Während die erste Studie Honigbienen im Fokus hat, verschiebt sich der Fokus der zwei weiteren Studien hin zu Wildbienen bzw. gesamten Bienengemeinschaften. Die Studie zu Honigbienenkolonieverlusten wurde im Rahmen des Bee Informed Partnerships (BIP, beeinformed.org) durchgeführt und reiht sich ein in die seit dem Winter 2006/2007 jährlich durchgeführten Untersuchungen in den USA. Es ist das vierte Jahr in dem Sommer- und Jahresverluste zusätzlich zu den Winterverlusten kalkuliert wurden. Unter den Teilnehmern bildete die Gruppe der Hobby-Imker den größten Anteil (n = 5690), obwohl nebenberufliche (n = 169) und kommerzielle (n = 78) Imker den Großteil (91,7 %) der 414 267 begutachteten Bienenvölkern bzw. Kolonien hielten. Insgesamt enthielt die Studie 15,1 % der auf 2,74 Mio. geschätzten Gesamtzahl an gehaltenen Bienenvölkern in den USA. Die Gesamtverluste an Honigbienenvölkern (basierend auf der Gesamtheit der erfassten Völker) waren im Sommer mit 25,3 % höher als im Winter mit 22,3 % und bezifferten sich auf 40,6 % für das gesamte Imkerjahr in 2014/2015. Durchschnittliche Kolonieverluste pro Imkerbetrieb waren höher im Winter (43,7 %) als im Sommer (14,7 %) und betrugen 49 % für das gesamte Imkerjahr in 2014/2015. Aufgrund der hohen Anzahl an Hobby-Imkern unter den Teilnehmern reflektieren die durchschnittlichen Kolonieverluste pro Imkerbetrieb (oder ungewichtete Verluste) v.a. die Situation dieser kleineren Imkerbetriebe. Hobby-Imker nannten als Gründe für die Honigbienenmortalität hauptsächlich Probleme des Koloniemanagements (z.B. Verhungerung, schwache Völker im Herbst), während nebenberufliche und kommerzielle Imker stärker Faktoren betonten, die außerhalb ihrer Kontrolle lagen (z.B. Varroamilben, Nosemasporen, Versagen der Königin). Die zweite Studie fand in renaturierten Sandminen statt. Sandminen sind weltweit zu findende anthropogen veränderte Landschaften, die ein Potenzial für Bienenschutz haben. Obwohl florale Ressourcen in diesen Habitaten limitiert sein können, könnten die vegetationsfreien Flecken auf offenen Sandböden und Böschungen gute Nistplätze für auf Sand spezialisierte und andere Bienen bieten. Wir haben Bienengemeinschaften aus drei renaturierten Sandminen sowie jeweils nahe gelegenen bepflanzten Straßenrändern in Maryland, USA verglichen. Sowohl die Sandminen als auch die Straßenränder enthielten vielfältige Bienengemeinschaften mit 111 (Sandminen) und 88 (Straßenränder) Bienenarten. Bienenabundanz, Artenreichtum und Shannon Diversität waren höher in den Sandminen als an den Straßenrändern und korrelierten negativ mit dem Anteil an vorhandener Bodenvegetation. Darüber hinaus unterschied sich die Artzusammensetzung signifikant zwischen den beiden Habitattypen. Sandminen enthielten einen größeren Anteil an Bodennistern, mehr seltene Arten und mehr sandliebende Arten, ähnlich natürlicher sandiger Gebiete in Maryland. Trotz der Zerstörung des ursprünglichen prä-Minen Habitats, scheinen Sandminen daher ein einzigartiges Bienenhabitat für Wildbienen darzustellen, besonders wenn die natürliche Besiedlung von Vegetation und offene Sandflächen gefördert werden. Im Hinblick auf Habitatverluste, auf das Fehlen von natürlichen Landschaftsstörungen und auf den weiterschreitenden Rückgang an Wildbienen, könnten Sandminen eine vielversprechende Möglichkeit für Bienenschutz darstellen, der sich bisher stark auf landwirtschaftliche und urbane Habitate konzentrierte. Bei der dritten Studie handelt es sich um eine experimentelle Feldstudie zu bestäuberfreundlichen Pflanzen. Bienen sind auf Pollen und Nektar von Pflanzen als Nahrungsquelle angewiesen. Aus diesem Grund werden bestäuberfreundliche Pflanzen oft für Habitatverbesserungen im Rahmen von Bienenschutzmaßnahmen gepflanzt. Standortfremde bestäuberfreundliche Pflanzen können dabei die Bienenschutzmaßnahmen unterstützen, wurden aber bisher nicht in einem Common Garden Experiment zusammen mit nativen bestäuberfreundlichen Pflanzen getestet bzw. verglichen. In dieser Studie haben wir Saatgutmischungen mit jeweils 20 nativen und 20 standortfremden Pflanzen in zwei separaten Plots in drei Gebieten in Maryland, USA ausgesät. Zwei Jahre lang protokollierten wir über die gesamten Blühzeiträume hinweg Pflanzenbesucher und sammelten Bienen mit Farbschalen. Insgesamt erfassten wir 3744 Bienen (120 Arten), von denen 1708 Individuen (72 Arten) per Hand direkt von den Blüten gesammelt wurden für die Vergleiche zwischen nativen und standortfremden Pflanzen. Abhängig von der Saison waren Bienenabundanz und Artenreichtum entweder ähnlich oder niedriger (frühe Saison und für Artenreichtum auch späte Saison) in nativen Plots verglichen mit den standortfremden Plots. Zusätzlich unterschied sich die Zusammensetzung der Bienengemeinschaft signifikant zwischen nativen und standortfremnden Pflanzen. Darüber hinaus waren die Bienen-Pflanzen-Besuchs-Netzwerke nativer Pflanzen spezialisierter als die Besuchs-Netzwerke standortfremder Pflanzen. Im Allgemeinen waren die Besuchs-Netzwerke in der frühen Saison spezialisierter als in der späten Saison. Vier Arten (Bombus impatiens, Halictus poeyi/ligatus, Lasioglossum pilosum, und Xylocopa virginica) der fünf am häufigsten vorkommenden Arten (zusätzlich auch Apis mellifera) fouragierten spezialisierter auf nativen Pflanzen als auf standortfremden Pflanzen. Unsere Studie zeigte, dass standortfremde Pflanzen weitläufig von einer artenreichen Bienengemeinschaft angenommen wurden und eine ähnliche bis höhere Attraktivität für Bienen aufwiesen verglichen mit nativen Pflanzen. Allerdings demonstrierten wir auch Änderungen im Fouragierverhalten, in der Zusammensetzung der Bienengemeinschaft und in den Besuchs-Netzwerken. Insgesamt kann ein vorsichtiger Einsatz standortfremder Pflanzen eine sinnvolle Ergänzung zu nativen bestäuberfreundlichen Anpflanzungen sein. Diese Studie stellt ein erstes Beispiel eines direkten Vergleichs von nativen und standortfremden bestäuberfreundlichen Anpflanzungen dar. KW - Biene KW - Wildbienen KW - Renaturierung <Ökologie> KW - Naturschutz KW - Honigbienen KW - exotische Pflanzen KW - Sandminen KW - Pflanzen-Bienen-Netzwerke KW - bestäuberfreundliche Pflanzen KW - wild bees KW - honey bees KW - sand mine KW - pollinator friendly plants KW - plant-bee visitation networks Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184180 ER - TY - JOUR A1 - Kaluza, Benjamin F. A1 - Wallace, Helen A1 - Keller, Alexander A1 - Heard, Tim A. A1 - Jeffers, Bradley A1 - Drescher, Nora A1 - Blüthgen, Nico A1 - Leonhardt, Sara D. T1 - Generalist social bees maximize diversity intake in plant species-rich and resource-abundant environments JF - Ecosphere N2 - Numerous studies revealed a positive relationship between biodiversity and ecosystem functioning, suggesting that biodiverse environments may not only enhance ecosystem processes, but also benefit individual ecosystem members by, for example, providing a higher diversity of resources. Whether and how the number of available resources affects resource collection and subsequently consumers (e.g., through impacting functions associated with resources) have, however, been little investigated, although a better understanding of this relationship may help explain why the abundance and richness of many animal species typically decline with decreasing plant (resource) diversity. Using a social bee species as model (Tetragonula carbonaria), we investigated how plant species richness—recorded for study sites located in different habitats—and associated resource abundance affected the diversity and functionality (here defined as nutritional content and antimicrobial activity) of resources (i.e., pollen, nectar, and resin) collected by a generalist herbivorous consumer. The diversity of both pollen and resin collected strongly increased with increasing plant/tree species richness, while resource abundance was only positively correlated with resin diversity. These findings suggest that bees maximize resource diversity intake in (resource) diverse habitats. Collecting more diverse resources did, however, not increase their functionality, which appeared to be primarily driven by the surrounding (plant) source community in our study. In generalist herbivores, maximizing resource diversity intake may therefore primarily secure collection of sufficient amounts of resources across the entire foraging season, but it also ensures that the allocated resources meet all functional needs. Decreasing available resource diversity may thus impact consumers primarily by reduced resource abundance, but also by reduced resource functionality, particularly when resources of high functionality (e.g., from specific plant species) become scarce. KW - functional complementarity KW - functional redundancy KW - Meliponini KW - nutritional ecology KW - plant–insect interactions KW - pollinator decline Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171155 VL - 8 IS - 3 ER - TY - THES A1 - Redlich, Sarah T1 - Opportunities and obstacles of ecological intensification: Biological pest control in arable cropping systems T1 - Chancen und Hürden Ökologischer Intensivierung: Biologische Schädlingsbekämpfung im Ackerbau N2 - Modern agriculture is the basis of human existence, a blessing, but also a curse. It provides nourishment and well-being to the ever-growing human population, yet destroys biodiversity-mediated processes that underpin productivity: ecosystem services such as water filtration, pollination and biological pest control. Ecological intensification is a promising alternative to conventional farming, and aims to sustain yield and ecosystem health by actively managing biodiversity and essential ecosystem services. Here, I investigate opportunities and obstacles for ecological intensification. My research focuses on 1) the relative importance of soil, management and landscape variables for biodiversity and wheat yield (Chapter II); 2) the influence of multi-scale landscape-level crop diversity on biological pest control in wheat (Chapter III) and 3) on overall and functional bird diversity (Chapter IV). I conclude 4) by introducing a guide that helps scientists to increase research impact by acknowledging the role of stakeholder engagement for the successful implementation of ecological intensification (Chapter V). Ecological intensification relies on the identification of natural pathways that are able to sustain current yields. Here, we crossed an observational field study of arthropod pests and natural enemies in 28 real-life wheat systems with an orthogonal on-field insecticide-fertilizer experiment. Using path analysis, we quantified the effect of 34 factors (soil characteristics, recent and historic crop management, landscape heterogeneity) that directly or indirectly (via predator-prey interactions) contribute to winter wheat yield. Reduced soil preparation and high crop rotation diversity enhanced crop productivity independent of external agrochemical inputs. Concurrently, biological control by arthropod natural enemies could be restored by decreasing average field sizes on the landscape scale, extending crop rotations and reducing soil disturbance. Furthermore, reductions in agrochemical inputs decreased pest abundances, thereby facilitating yield quality. Landscape-level crop diversity is a promising tool for ecological intensification. However, biodiversity enhancement via diversification measures does not always translate into agricultural benefits due to antagonistic species interactions (intraguild predation). Additionally, positive effects of crop diversity on biological control may be masked by inappropriate study scales or correlations with other landscape variables (e.g. seminatural habitat). Therefore, the multiscale and context-dependent impact of crop diversity on biodiversity and ecosystem services is ambiguous. In 18 winter wheat fields along a crop diversity gradient, insect- and bird-mediated pest control was assessed using a natural enemy exclusion experiment with cereal grain aphids. Although birds did not influence the strength of insect-mediated pest control, crop diversity (rather than seminatural habitat cover) enhanced aphid regulation by up to 33%, particularly on small spatial scales. Crop diversification, an important Greening measure in the European Common Agricultural Policy, can improve biological control, and could lower dependence on insecticides, if the functional identity of crops is taken into account. Simple measures such as ‘effective number of crop types’ help in science communication. Although avian pest control did not respond to landscape-level crop diversity, birds may still benefit from increased crop resources in the landscape, depending on their functional grouping (feeding guild, conservation status, habitat preference, nesting behaviour). Observational studies of bird functional diversity on 14 wheat study fields showed that non-crop landscape heterogeneity rather than crop diversity played a key role in determining the richness of all birds. Insect-feeding, non-farmland and non-threatened birds increased across multiple spatial scales (up to 3000 m). Only crop-nesting farmland birds declined in heterogeneous landscapes. Thus, crop diversification may be less suitable for conserving avian diversity, but abundant species benefit from overall habitat heterogeneity. Specialist farmland birds may require more targeted management approaches. Identifying ecological pathways that favour biodiversity and ecosystem services provides opportunities for ecological intensification that increase the likelihood of balancing conservation and productivity goals. However, change towards a more sustainable agriculture will be slow to come if research findings are not implemented on a global scale. During dissemination activities within the EU project Liberation, I gathered information on the advantages and shortcomings of ecological intensification and its implementation. Here, I introduce a guide (‘TREE’) aimed at scientists that want to increase the impact of their research. TREE emphasizes the need to engage with stakeholders throughout the planning and research process, and actively seek and promote science dissemination and knowledge implementation. This idea requires scientists to leave their comfort zone and consider socioeconomic, practical and legal aspects often ignored in classical research. Ecological intensification is a valuable instrument for sustainable agriculture. Here, I identified new pathways that facilitate ecological intensification. Soil quality, disturbance levels and spatial or temporal crop diversification showed strong positive correlations with natural enemies, biological pest control and yield, thereby lowering the dependence on agrochemical inputs. Differences between functional groups caused opposing, scale-specific responses to landscape variables. Opposed to our predictions, birds did not disturb insect-mediated pest control in our study system, nor did avian richness relate to landscape-level crop diversity. However, dominant functional bird groups increased with non-crop landscape heterogeneity. These findings highlight the value of combining different on-field and landscape approaches to ecological intensification. Concurrently, the success of ecological intensification can be increased by involving stakeholders throughout the research process. This increases the quality of science and reduces the chance of experiencing unscalable obstacles to implementation. N2 - Die moderne Landwirtschaft ist die Grundlage menschlichen Lebens, ein Segen, aber auch ein Fluch. Sie stellt Nahrung und Wohlstand für die immerfort wachsende menschliche Bevölkerung bereit, und zerstört gleichzeitig Biodiversitäts-geförderte Prozesse, welche die Produktivität unterstützen: Ökosystemdienstleistungen wie Wasseraufbereitung, Bestäubung und biologische Schädlingsbekämpfung. Ökologische Intensivierung ist eine vielversprechende Alternative zur konventionellen Landwirtschaft, und zielt darauf aus, Erträge und die Gesundheit von Ökosystemen zu erhalten indem Biodiversität und essentielle Ökosystemdienstleistungen aktiv gemanagt werden. In meiner Doktorarbeit untersuche ich die Chancen und Hürden Ökologischer Intensivierung. Das Hauptinteresse meiner Forschung liegt bei 1) der relativen Bedeutung von Boden, Bewirtschaftung und Landschaftsaspekten für Biodiversität und Weizenerträge (Kapitel II); 2) dem Einfluss regionaler Anbauvielfalt auf verschiedenen räumlichen Skalen auf die biologische Schädlingsbekämpfung in Weizen (Kapitel III) und 3) auf die gesamte und funktionelle Artenvielfalt von Vögeln (Kapitel IV). Zum Schluss 4) stelle ich einen Leitfaden vor, der Wissenschaftlern hilft die Wirkung ihrer Forschung zu erhöhen, indem die fundamentale Rolle von Stakeholdern für die Umsetzung Ökologischer Intensivierung besser genutzt wird (Kapitel V). Ökologische Intensivierung bedarf der Identifizierung von natürlichen Prozessen, die zum Erhalt landwirtschaftlicher Erträge beitragen. Zu diesem Zweck verknüpften wir eine Beobachtungsstudie, in der Schädlinge und natürliche Gegenspieler in 28 realen Weizen Anbausystem aufgenommen wurden, mit einem orthogonalen Feldexperiment (Insektizid und mineralische Düngung). Anhand einer Pfadanalyse quantifizierten wir den Einfluss von 34 Faktoren (Bodencharakteristiken, gegenwärtige und vergangene Bewirtschaftung, Landschaftsheterogenität), die direkt oder indirekt (über Räuber-Beute-Interaktionen) Einfluss auf den Winterweizenertrag ausüben. Reduzierte Bodenbearbeitung und vielfältige Fruchtfolgen erhöhten die Erträge unabhängig von der Ausbringung von Agrochemikalien. Gleichzeitig könnte die biologische Schädlingsbekämpfung durch räuberische Insekten wiederhergestellt werden, indem durchschnittliche Schlaggrößen auf der Landschaftsebene verringert, Fruchtfolgen erweitert und die Bodenbearbeitung reduziert wird. Des Weiteren senkte der Verzicht auf Agrochemikalien das Schädlingsaufkommen einiger Arten, und trug zu einer höheren Ertragsqualität bei. Regionale Anbauvielfalt ist ein vielversprechendes Mittel zur Ökologischen Intensivierung. Doch die Erhöhung der Artenvielfalt durch Diversifizierungsmaßnahmen führt nicht immer zu Vorteilen in der Landwirtschaft, vor allem auf Grund antagonistischer Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Arten (intraguild predation). Weiterhin können positive Effekte der Anbauvielfalt durch die Wahl der falschen räumlichen Skala oder durch Korrelationen mit anderen Landschaftsvariablen (z.B. halbnatürliche Habitate) überdeckt werden. Aus diesem Grund bestehen Unklarheiten über die Wirkung von Anbauvielfalt auf Biodiversität und Ökosystemdienstleistungen in unterschiedlichen räumlichen Skalen und Kontexten. Durch Ausschlussexperimente mit Getreideblattläusen untersuchten wir die biologische Schädlingsbekämpfung durch räuberische Insekten und Vögel in 18 Winterweizenfeldern innerhalb eines Landschaftsgradienten der Anbauvielfalt. Vögel hatten keinen Einfluss auf die biologische Schädlingsbekämpfung durch Insekten. Anbauvielfalt (nicht das Vorkommen halbnatürlicher Habitate) erhöhte die Schädlingsbekämpfung um bis zu 33%, vor allem auf kleinen räumlichen Skalen. Somit kann die Steigerung der Anbauvielfalt, eine wichtige Säule der Europäischen Gemeinsamen Agrarpolitik, die biologische Schädlingsbekämpfung verbessern und den Einsatz von Agrochemikalien verringern, solange die funktionelle Gruppe der Anbaupflanzen berücksichtigt wird. Einfache Maßeinheiten wie die ‘effektive Anzahl an Kulturpflanzengruppen‘ helfen in der Kommunikation wissenschaftlicher Ergebnisse. Obwohl die Schädlingsbekämpfung durch Vögel nicht durch regionale Anbauvielfalt beeinflusst wurde, könnten Vögel, abhängig von der Zugehörigkeit zu bestimmten funktionellen Gruppen (Ernährung, Gefährdungsstatus, Lebensraum, Nistplatzwahl), dennoch von erhöhten Ressourcen auf landwirtschaftlichen Flächen profitieren. In einer Beobachtungsstudie wurde die funktionelle Vielfalt von Vögeln auf 14 Winterweizenfeldern aufgenommen. Die Studie zeigte, dass die nicht agrarisch genutzte Landschaftsheterogenität im Vergleich zur regionalen Anbauvielfalt eine übergeordnete Rolle für die Artenvielfalt spielte, vor allem für Insektenfresser, Vögel die außerhalb landwirtschaftlicher Flächen siedeln oder nicht in ihrem Bestand gefährdet sind. Effekte waren auf allen Skalen sichtbar (bis zu 3000m). Nur Acker-nistende Agrarvögel zeigten negative Beziehungen zu Landschaftsheterogenität. Der Nutzen der Anbaudiversifizierung scheint weniger Bedeutung für den Vogelschutz zu haben als die übergeordnete Vielfalt der Landschaft, welche den Artenreichtum häufiger Vogelarten erhöhte. Spezialisierte Vogelarten dagegen bedürfen eines gezielten, angepassten Managements. Um Ökologische Intensivierung voranzutreiben und ein Gleichgewicht zwischen Naturschutz- und Produktivitätszielen zu erreichen, bedarf es der Identifikation ökologischer Prozesse, die zur Steigerung von Biodiversität und Ökosystemdienstleistungen beitragen. Doch der die Wende zu einer nachhaltigeren Landwirtschaft wird nur langsam voran schreiten, wenn Forschungsergebnisse nicht global umgesetzt werden. Während der Öffentlichkeitsarbeit im EU Projekt Liberation konnte ich Informationen über die Vor- und Nachteile Ökologischer Intensivierung und deren Umsetzung sammeln. Hier stelle ich einen Leitfaden (‘TREE’) vor, der Wissenschaftlern helfen soll die Wirkung ihrer Forschung zu erhöhen. TREE verdeutlicht wie wichtig es ist, Stakeholder in den Planungs- und Forschungsprozess eines Projektes mit einzubeziehen, und aktiv die Verbreitung von Wissen und die Umsetzung wissenschaftlicher Ergebnisse voranzutreiben. TREE fordert Wissenschaftler dazu auf, die eigene Komfortzone zu verlassen und sozioökonomische, praktische und rechtliche Aspekte zu berücksichtigen, welche oft in der klassischen Forschung unbeachtet bleiben. Ökologische Intensivierung ist ein bedeutender Schritt in Richtung nachhaltige Landwirtschaft. In dieser Arbeit identifiziere ich neue Wege zur ökologischen Intensivierung. Bodenqualität, Störungsgrad des Bodens und die räumliche oder zeitliche Anbauvielfalt zeigten starke positive Korrelationen mit natürlichen Gegenspielern, biologischer Schädlingsbekämpfung und Erträgen auf, wodurch die Abhängigkeit von Agrochemikalien verringert wird. Unterschiede zwischen funktionellen Gruppen verursachten gegensätzliche Beziehungen zu Landschaftsvariablen auf verschiedenen räumlichen Skalen. Entgegen unserer Erwartungen nahmen Vögel in unserem System keinen Einfluss auf die biologische Schädlingsbekämpfung durch Insekten. Die Vogelvielfalt war außerdem unbeeinflusst von der regionalen Anbauvielfalt. Doch dominante funktionelle Vogelgruppen profitieren von der Vielfalt nicht agrarisch genutzter Landschaftsaspekte. Diese Ergebnisse betonen den Wert einer Mischung aus unterschiedlichen lokalen und landschaftsbezogenen Ansätzen zur Ökologischen Intensivierung. Gleichzeitig kann der Erfolg Ökologischer Intensivierung vor allem dadurch erhöht werden, dass Stakeholder in den Forschungsprozess eingebunden werden. Dies steigert die Qualität der Forschung und reduziert die Wahrscheinlichkeit, während der Umsetzung auf unüberwindbare Hürden zu stoßen. KW - Ökologische Intensivierung KW - Biologische Schädlingsbekämpfung KW - Landwirtschaft KW - Artensterben KW - Ökosystemdienstleistungen KW - Öffentlichkeitsarbeit KW - ecological intensification KW - biological pest control KW - agriculture KW - public outreach KW - ecosystem services KW - sustainable farming Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171228 ER - TY - JOUR A1 - Degen, Tobias A1 - Hovestadt, Thomas A1 - Mitesser, Oliver A1 - Hölker, Franz T1 - Altered sex-specific mortality and female mating success: ecological effects and evolutionary responses JF - Ecosphere N2 - Theory predicts that males and females should often join the mating pool at different times (sexual dimorphism in timing of emergence [SDT]) as the degree of SDT affects female mating success. We utilize an analytical model to explore (1) how important SDT is for female mating success, (2) how mating success might change if either sex's mortality (abruptly) increases, and (3) to what degree evolutionary responses in SDT may be able to mitigate the consequences of such mortality increase. Increasing male pre‐mating mortality has a non‐linear effect on the fraction of females mated: The effect is initially weak, but at some critical level a further increase in male mortality has a stronger effect than a similar increase in female mortality. Such a change is expected to impose selection for reduced SDT. Increasing mortality during the mating season has always a stronger effect on female mating success if the mortality affects the sex that emerges first. This bias results from the fact that enhancing mortality of the earlier emerging sex reduces female–male encounter rates. However, an evolutionary response in SDT may effectively mitigate such consequences. Further, if considered independently for females and males, the predicted evolutionary response in SDT could be quite dissimilar. The difference between female and male evolutionary response in SDT leads to marked differences in the fraction of fertilized females under certain conditions. Our model may provide general guidelines for improving harvesting of populations, conservation management of rare species under altered environmental conditions, or maintaining long‐term efficiency of pest‐control measures. KW - evolutionary response KW - sexual dimorphism in timing KW - sex-specific mortality KW - reproductive asynchrony KW - mating success Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170953 VL - 8 IS - 5 ER - TY - JOUR A1 - Ziegler, Sabrina A1 - Weiss, Esther A1 - Schmitt, Anna-Lena A1 - Schlegel, Jan A1 - Burgert, Anne A1 - Terpitz, Ulrich A1 - Sauer, Markus A1 - Moretta, Lorenzo A1 - Sivori, Simona A1 - Leonhardt, Ines A1 - Kurzai, Oliver A1 - Einsele, Hermann A1 - Loeffler, Juergen T1 - CD56 Is a Pathogen Recognition Receptor on Human Natural Killer Cells JF - Scientific Reports N2 - Aspergillus (A.) fumigatus is an opportunistic fungal mold inducing invasive aspergillosis (IA) in immunocompromised patients. Although antifungal activity of human natural killer (NK) cells was shown in previous studies, the underlying cellular mechanisms and pathogen recognition receptors (PRRs) are still unknown. Using flow cytometry we were able to show that the fluorescence positivity of the surface receptor CD56 significantly decreased upon fungal contact. To visualize the interaction site of NK cells and A. fumigatus we used SEM, CLSM and dSTORM techniques, which clearly demonstrated that NK cells directly interact with A. fumigatus via CD56 and that CD56 is re-organized and accumulated at this interaction site time-dependently. The inhibition of the cytoskeleton showed that the receptor re-organization was an active process dependent on actin re-arrangements. Furthermore, we could show that CD56 plays a role in the fungus mediated NK cell activation, since blocking of CD56 surface receptor reduced fungal mediated NK cell activation and reduced cytokine secretion. These results confirmed the direct interaction of NK cells and A. fumigatus, leading to the conclusion that CD56 is a pathogen recognition receptor. These findings give new insights into the functional role of CD56 in the pathogen recognition during the innate immune response. KW - pattern recognition receptors KW - fungal infection KW - Aspergillus fumigatus KW - natural killer cells Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170637 VL - 7 IS - 6138 ER - TY - JOUR A1 - Kollmannsberger, Philip A1 - Kerschnitzki, Michael A1 - Repp, Felix A1 - Wagermaier, Wolfgang A1 - Weinkamer, Richard A1 - Fratzl, Peter T1 - The small world of osteocytes: connectomics of the lacuno-canalicular network in bone JF - New Journal of Physics N2 - Osteocytes and their cell processes reside in a large, interconnected network of voids pervading the mineralized bone matrix of most vertebrates. This osteocyte lacuno-canalicular network (OLCN) is believed to play important roles in mechanosensing, mineral homeostasis, and for the mechanical properties of bone. While the extracellular matrix structure of bone is extensively studied on ultrastructural and macroscopic scales, there is a lack of quantitative knowledge on how the cellular network is organized. Using a recently introduced imaging and quantification approach, we analyze the OLCN in different bone types from mouse and sheep that exhibit different degrees of structural organization not only of the cell network but also of the fibrous matrix deposited by the cells. We define a number of robust, quantitative measures that are derived from the theory of complex networks. These measures enable us to gain insights into how efficient the network is organized with regard to intercellular transport and communication. Our analysis shows that the cell network in regularly organized, slow-growing bone tissue from sheep is less connected, but more efficiently organized compared to irregular and fast-growing bone tissue from mice. On the level of statistical topological properties (edges per node, edge length and degree distribution), both network types are indistinguishable, highlighting that despite pronounced differences at the tissue level, the topological architecture of the osteocyte canalicular network at the subcellular level may be independent of species and bone type. Our results suggest a universal mechanism underlying the self-organization of individual cells into a large, interconnected network during bone formation and mineralization. KW - bone KW - osteocytes KW - networks KW - biomaterials KW - mechanobiology KW - image analysis Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170662 VL - 19 IS - 073019 ER - TY - JOUR A1 - Memmel, Simon A1 - Sisario, Dmitri A1 - Zöller, Caren A1 - Fiedler, Vanessa A1 - Katzer, Astrid A1 - Heiden, Robin A1 - Becker, Nicholas A1 - Eing, Lorenz A1 - Ferreira, Fábio L.R. A1 - Zimmermann, Heiko A1 - Sauer, Markus A1 - Flentje, Michael A1 - Sukhorukov, Vladimir L. A1 - Djuzenova, Cholpon S. T1 - Migration pattern, actin cytoskeleton organization and response to PI3K-, mTOR-, and Hsp90-inhibition of glioblastoma cells with different invasive capacities JF - Oncotarget N2 - High invasiveness and resistance to chemo- and radiotherapy of glioblastoma multiforme (GBM) make it the most lethal brain tumor. Therefore, new treatment strategies for preventing migration and invasion of GBM cells are needed. Using two different migration assays, Western blotting, conventional and super-resolution (dSTORM) fluorescence microscopy we examine the effects of the dual PI3K/mTOR-inhibitor PI-103 alone and in combination with the Hsp90 inhibitor NVP-AUY922 and/or irradiation on the migration, expression of marker proteins, focal adhesions and F-actin cytoskeleton in two GBM cell lines (DK-MG and SNB19) markedly differing in their invasive capacity. Both lines were found to be strikingly different in morphology and migration behavior. The less invasive DK-MG cells maintained a polarized morphology and migrated in a directionally persistent manner, whereas the highly invasive SNB19 cells showed a multipolar morphology and migrated randomly. Interestingly, a single dose of 2 Gy accelerated wound closure in both cell lines without affecting their migration measured by single-cell tracking. PI-103 inhibited migration of DK-MG (p53 wt, PTEN wt) but not of SNB19 (p53 mut, PTEN mut) cells probably due to aberrant reactivation of the PI3K pathway in SNB19 cells treated with PI-103. In contrast, NVP-AUY922 exerted strong anti-migratory effects in both cell lines. Inhibition of cell migration was associated with massive morphological changes and reorganization of the actin cytoskeleton. Our results showed a cell line-specific response to PI3K/mTOR inhibition in terms of GBM cell motility. We conclude that anti-migratory agents warrant further preclinical investigation as potential therapeutics for treatment of GBM. KW - chemotherapy KW - glioblastoma multiforme KW - migration KW - treatment Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170719 VL - 8 IS - 28 ER - TY - THES A1 - Glogger, Marius T1 - Single-molecule fluorescence microscopy in live \(Trypanosoma\) \(brucei\) and model membranes T1 - Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie in lebenden \(Trypanosoma\) \(brucei\) und Modellmembranen N2 - Der eukaryotische Parasit Trypanosoma brucei hat komplexe Strategien entwickelt um der Immunantwort eines Wirtes zu entkommen und eine persistente Infektion innerhalb dessen aufrechtzuerhalten. Ein zentrales Element seiner Verteidigungsstrategie stützt sich auf die Schutzfunktion seines Proteinmantels auf der Zelloberfläche. Dieser Mantel besteht aus einer dichten Schicht aus identischen, Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerten variablen Oberflächenglykoproteinen (VSG). Der VSG Mantel verhindert die Erkennung der darunterliegenden, invarianten Epitope durch das Immunsystem. Obwohl es notwendig ist die Funktionsweise des VSG Mantels zu verstehen, vor allem um ihn als mögliches Angriffsziel gegen den Parasiten zu verwenden, sind seine biophysikalischen Eigenschaften bisher nur unzureichend verstanden. Dies ist vor allem der Tatsache geschuldet, dass die hohe Motilität der Parasiten mikroskopische Studien in lebenden Zellen bisher weitestgehend verhinderten. In der vorliegenden Arbeit wird nun hochmoderne Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie (EMFM) als Möglichkeit für mikroskopische Untersuchungen im Forschungsbereich der Trypanosomen vorgestellt. Die Arbeit umfasst Untersuchungen der VSG Dynamik unter definierten Bedingungen künstlicher Membransysteme. Es wurde zuerst der Einfluss der lateralen Proteindichte auf die VSG Diffusion untersucht. Experimente mittels Fluoreszenz- Wiederkehr nach irreversiblem Photobleichen und komplementäre Einzelmolekül- Verfolgungs Experimente offenbarten, dass ein molekularer Diffusionsschwellenwert existiert. Über diesem Schwellenwert wurde eine dichteabhänige Reduzierung des Diffusionskoeffizienten gemessen. Eine relative Quantifizierung der rekonstituierten VSGs verdeutlichte, dass der Oberflächenmantel der Trypanosomen sehr nahe an diesem Schwellenwert agiert. Der VSG Mantel ist optimiert um eine hohe Proteindichte bei gleichzeitiger hoher Mobilität der VSGs zu gewährleisten. Des Weiteren wurde der Einfluss der VSG N-Glykosylierung auf die Diffusion des Proteins quantitativ untersucht. Die Messungen ergaben, dass die N-Glykosylierung dazu beiträgt eine hohe Mobilität bei hohen Proteindichten aufrechtzuerhalten. Eine detaillierte Analyse von VSG Trajektorien offenbarte, dass zwei unterschiedliche Populationen frei diffundierender VSGs in der künstlichen Membran vorlagen. Kürzlich wurde entdeckt, dass VSGs zwei strukturell unterschiedliche Konformationen annehmen können. Die Messungen in der Arbeit stimmen mit diesen Beschreibungen überein. Die Ergebnisse der EMFM in künstlichen Membranen wurden durch VSG Einzelmolekül- Verfolgungs Experimente auf lebenden Zellen ergänzt. Es wurde eine hohe Mobilität und Dynamik einzelner VSGs gemessen, was die allgemein dynamische Natur des VSG Mantels verdeutlicht. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass der VSG Mantel auf lebenden Trypanosomen ein dichter und dennoch dynamischer Schutzmantel ist. Die Fähigkeit der VSGs ihre Konformation flexibel anzupassen, unterstützt das Erhalten der Fluidität bei variablen Dichten. Diese Eigenschaften des VSG Mantels sind elementar für die Aufrechterhaltung einer presistenden Infektion eines Wirtes. In dieser Arbeit werden des Weiteren verschiedene, auf Hydrogel basierende Einbettungsmethoden vorgestellt. Diese ermöglichten die Zellimmobilisierung und erlaubten EMFM in lebenden Trypanosomen. Die Hydrogele wiesen eine hohe Zytokompatibilität auf. Die Zellen überlebten in den Gelen für eine Stunde nach Beginn der Immobilisierung. Die Hydrogele erfüllten die Anforderungen der Superresolution Mikroskopie (SRM) da sie eine geringe Autofluoreszenz im Spektralbereich der verwendeten Fluorophore besaßen. Mittels SRM konnte nachgewiesen werden, dass die Hydrogele die Zellen effizient immobilisierten. Als erstes Anwendungsbeispiel der Methode wurde die Organisation der Plasmamembran in lebenden Trypanosomen untersucht. Die Untersuchung eines fluoreszenten Tracers in der inneren Membranschicht ergab, dass dessen Verteilung nicht homogen war. Es wurden spezifische Membrandomänen gefunden, in denen das Molekül entweder vermehrt oder vermindert auftrat. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass diese Verteilung durch eine Interaktion des Tracers mit Proteinen des zellulären Zytoskeletts zustande kam. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse zeigen, dass EMFM erfolgreich für verschiedene biologische Untersuchungen im Forschungsfeld der Trypanosomen angewendet werden kann. Dies gilt zum Beispiel für die Untersuchung von der VSG Dynamik in künstlichen Membransystemen, aber auch für Studien in lebenden Zellen unter Verwendung der auf Hydrogelen basierenden Zelleinbettung. N2 - The eukaryotic parasite Trypanosoma brucei has evolved sophisticated strategies to escape the host immune response and maintain a persistent infection inside a host. One central feature of the parasite’s defense mechanism relies on the shielding function of their surface protein coat. This coat is composed of a dense arrangement of one type of glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored variant surface glycoproteins (VSGs) which impair the identification of epitopes of invariant surface proteins by the immune system. In addition to the importance of understanding the function of the VSG coat and use it as a potential target to efficiently fight the parasite, it is also crucial to study its biophysical properties as it is not yet understood sufficiently. This is due to the fact that microscopic investigations on living trypanosomes are limited to a great extent by the intrinsic motility of the parasite. In the present study, state-of-the-art single-molecule fluorescence microscopy (SMFM) is introduced as a tool for biophysical investigations in the field of trypanosome research. The work encompasses studies of VSG dynamics under the defined conditions of an artificial supported lipid bilayer (SLB). First, the impact of the lateral protein density on VSG diffusion was systematically studied in SLBs. Ensemble fluorescence after photobleaching (FRAP) and complementary single-particle tracking experiments revealed that a molecular crowding threshold (MCT) exists, above which a density dependent decrease of the diffusion coefficient is measured. A relative quantification of reconstituted VSGs illustrated that the VSG coat of living trypanosomes operates very close to its MCT and is optimized for high density while maintaining fluidity. Second, the impact of VSG N-glycosylation on VSG diffusion was quantitatively investigated. N-glycosylation was shown to contribute to preserving protein mobility at high protein concentrations. Third, a detailed analysis of VSG trajectories revealed that two distinct populations of freely diffusing VSGs were present in a SLB, which is in agreement with the recent finding, that VSGs are able to adopt two main structurally distinct conformations. The results from SLBs were further complemented by single-particle tracking experiments of surface VSGs on living trypanosomes. A high mobility and free diffusion were measured on the cell surface, illustrating the overall dynamic nature of the VSG coat. It was concluded that the VSG coat on living trypanosomes is a protective structure that combines density and mobility, which is supported by the conformational flexibility of VSGs. These features are elementary for the persistence of a stable infection in the host. Different hydrogel embedding methods are presented, that facilitated SMFM in immobilized, living trypanosomes. The hydrogels were found to be highly cytocompatible for one hour after cross-linking. They exhibited low autofluorescence properties in the spectral range of the investigations, making them suitable for super-resolution microscopy (SRM). Exemplary SRM on living trypanosomes illustrated that the hydrogels efficiently immobilized the cells on the nanometer lever. Furthermore, the plasma membrane organization was studied in living trypanosomes. A statistical analysis of a tracer molecule inside the inner leaflet of the plasma membrane revealed that specific membrane domains exist, in which the tracer appeared accumulated or diluted. It was suggested that this distribution was caused by the interaction with proteins of the underlying cytoskeleton. In conclusion, SMFM has been successfully introduced as a tool in the field of trypanosome research. Measurements in model membranes facilitated systematic studies of VSG dynamics on the single-molecule level. The implementation of hydrogel immobilization allowed for the study of static structures and dynamic processes with high spatial and temporal resolution in living, embedded trypanosomes for the first time. KW - Single-molecule fluorescence microscopy KW - Trypanosoma brucei KW - Variant surface glycoprotein KW - Trypanosoma brucei KW - Virulenzfaktor KW - Zelloberfläche KW - Glykoproteine KW - Fluoreszenzmikroskopie Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169222 ER - TY - THES A1 - Rost, Isabell T1 - Gezielte Anreicherungs- und neue DNA-Sequenzierungsstrategien für die molekulare Analyse von Fanconi-Anämie-Genen T1 - Targeted enrichment and novel DNA sequencing strategies for the molecular analysis of fanconi anemia genes N2 - Fanconi-Anämie (FA) ist, mit Ausnahme von Mutationen in FANCR/RAD51, eine autosomal-rezessive oder X-chromosomal vererbte Krankheit, die sich durch eine ausgesprochene klinische als auch genetische Heterogenität auszeichnet. Neben einem fortschreitenden Knochenmarksversagen zählen zu den typischen Merkmalen eine Vielzahl an angeborenen Fehlbildungen, wie beispielsweise Radialstrahlanomalien, Minderwuchs oder Pigmentierungsstörungen. Zudem besteht für FA-Patienten ein überdurchschnittlich hohes Risiko bereits in jungen Jahren an akuter myeloischer Leukämie oder soliden Tumoren zu erkranken. Bislang konnten in 21 FA-Genen (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U oder -V) krankheitsverursachende Mutationen identifiziert werden, deren Proteinprodukte maßgeblich an der Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt sind und Komponenten des FA/BRCA-DNA-Reparaturweges darstellen. In der klassischen FA-Mutationsanalyse kommen meist Sanger-Sequenzierungen sowie MLPA- und Immunblot-Analysen zum Einsatz. Da im Wesentlichen keine Genotyp-Phänotyp-Korrelation besteht, gestaltet sich, gerade bei seltenen FA-Komplementationsgruppen, der Nachweis von krankheitsverursachenden Mutationen oftmals sehr zeit- und kostenintensiv. Während der letzten Jahre wurden verschiedene Strategien zur Anreicherung und Sequenzierung entwickelt, welche die parallele Sequenzanalyse einzelner ausgewählter Gene, ganzer Exome oder sogar des gesamten Genoms und somit eine kosten- und zeiteffiziente Mutationsanalyse ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Anreicherungsmethoden mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung auf ihre Anwendbarkeit in der molekulargenetischen FA-Diagnostik getestet, um klassische Mutationsanalyse-Methoden zu ergänzen oder möglicherweise sogar ganz ersetzen zu können. Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der Etablierung eines FA-spezifischen Genpanels zur Genotypisierung von FA-Patienten. Nachdem die Methode zunächst anhand von FA-Patienten mit bekannten Mutationen optimiert werden musste, erwies sie sich als effizienter Ansatz zum Nachweis krankheitsverursachender Mutationen bei FA-Patienten unbekannter Komplementationsgruppe. Durch die FA-Panelanalyse konnten 37 von 47 unklassifizierten Patienten einer FA-Komplementationsgruppe zugeordnet werden, indem deren kausalen Mutationen bestimmt wurden. In einem weiteren Ansatz sollte die Anwendbarkeit eines kommerziellen Anreicherungspanels zur FA-Diagnostik untersucht werden. Auch hier konnte ein Großteil der krankheitsverursachenden Mutationen von fünf bekannten wie auch 13 nicht zugeordneten FA-Patienten detektiert und somit eine molekulargenetische Diagnose bei neun weiteren, zuvor unklassifizierten FA-Patienten, gestellt werden. Ferner wurden sechs ausgewählte Patienten, zusätzlich zur Panelanreicherung, per Exomanalyse untersucht. Zum einen konnten Mutationen in bekannten FA-Genen bestätigt oder neu identifiziert werden. Zum anderen wurden auch potentiell pathogene Mutationen in DNA-Reparaturgenen außerhalb des FA/BRCA-Signalweges bei zwei Patienten mit unbestätigter Verdachtsdiagnose FA verifiziert. So wurde bei mehreren Mitgliedern einer Familie mit unterschiedlichen Tumorerkrankungen eine zuvor unbeschriebene homozygote Nonsense-Mutation in der BER-Glykosylase NTHL1 nachgewiesen, für welche bislang erst zwei pathogene Mutationen als Auslöser eines neuen Krebssyndroms bekannt sind. Bei einem weiteren Patienten wurden compound-heterozygote Mutationen in RPA1 detektiert, ein Gen für das bislang noch kein Krankheitsbild bekannt ist. Mit Hilfe der drei verschiedenen Anreicherungsstrategien konnten insgesamt 47 von 60 unklassifizierten FA-Patienten 13 verschiedenen Komplementationsgruppen eindeutig zugeordnet werden. Es zeigte sich dabei ein breites Spektrum an neuen, bislang unbeschriebenen FA-Mutationen. Den größten Anteil an der Gesamtzahl der nachgewiesenen Mutationen hatten Spleißmutationen, die auf eine Auswirkung auf das kanonische Spleißmuster untersucht wurden, um einen pathogenen Effekt nachweisen zu können. Weiterhin schloss die Arbeit die Charakterisierung einzelner FA-Patienten bzw. Komplementationsgruppen mit ein. Dazu zählen die seltenen Untergruppen FA-T und FA-Q, für die jeweils ein neuer Patient identifiziert werden konnte. Durch die funktionelle Charakterisierung der dritten jemals beschriebenen FA-Q-Patientin konnten Einblicke in das Zusammenspiel der Reparatur von DNA-Quervernetzungen und der Nukleotidexzisionsreparatur gewonnen und die phänotypische Variabilität von FA durch die subjektive als auch zelluläre UV-Sensitivität der Patientin ergänzt werden. Darüber hinaus konnte das Mutationsspektrum in FA-I sowie FA-D2 erweitert werden. Eine genauere Untersuchung der Pseudogenregionen von FANCD2 ermöglichte dabei die gezielte Mutationsanalyse des Gens. Insgesamt konnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, das Mutationsspektrum in FA zu erweitern und durch die Identifizierung und Charakterisierung einzelner Patienten neue Einblicke in verschiedene Komponenten des FA/BRCA-Signalweges zu erhalten. Es zeigte sich, dass neue DNA-Sequenzierungsstrategien in der FA-Diagnostik eingesetzt werden können, um eine effiziente Mutationsanalyse zu gewährleisten und klassische Methoden in Teilbereichen zu ersetzen. N2 - Fanconi anemia (FA) is, with the exception of mutations in FANCR/RAD51, an autosomal recessive or X-linked inherited disease that is characterized by a remarkable clinical and genetic heterogeneity. In addition to progressive bone marrow failure, typical features include a multitude of developmental malformations, such as radial ray anomalies, growth retardation or cutaneous pigment displacement. Additionally, FA patients have a higher risk for developing acute myelogenous leukemia or solid tumors early in life. To date, pathogenic mutations have been identified in 21 FA genes (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U or -V) whose protein products are responsible for maintaining genomic integrity and constitute components of the FA/BRCA DNA repair pathway. Typical methods for FA mutation analysis comprise Sanger sequencing as well as MLPA and immunoblot analyses. As no definite genotype-phenotype correlation exists, pathogenic mutation detection in rare subgroups is often quite time-consuming and cost-intensive. Within the last few years, distinct strategies for both enrichment and sequencing of a subset of genes, whole exomes or even the whole genome have been developed that facilitate a cost-effective and time-saving mutation analysis. In the present work different target-enrichment strategies followed by high-throughput sequencing were tested for their applicability in molecular genetic diagnostics of FA in order to complement or even replace classic strategies for mutation analysis. The first part of this work addressed the establishment of an FA-specific gene panel for genotyping FA patients. After optimizing this method by means of FA patients with known mutations, this proved to be an efficient approach for detecting pathogenic mutations in FA patients of unknown complementation groups. Due to FA gene panel analysis, 37 of 47 unclassified FA patients were assigned to a complementation group based on the identification of their causative mutations. In another approach, a commercial enrichment panel was tested for its application in FA diagnostics. Again, most pathogenic mutations of five classified and 13 unclassified FA patients were detected, enabling a molecular diagnosis for nine previously unclassified FA patients. Moreover, six selected patients were studied by exome analysis in addition to panel enrichment. This allowed for mutations in known FA complementation groups to be confirmed or newly identified. Additionally, potentially pathogenic variants in DNA-repair genes outside the FA/BRCA pathway were verified in two patients with an unconfirmed suspected diagnosis of FA. One previously undescribed homozygous nonsense mutation in the BER glycosylase NTHL1 was detected in several members of one family with various tumors. For this gene, only two distinct pathogenic mutations were previously described to cause a novel cancer syndrome. In another patient, compound heterozygous mutations in RPA1 were detected, a gene for which no disease pattern is yet known. By means of the three different enrichment strategies a total of 47 of 60 unclassified FA patients were definitely assigned to 13 diverse complementation groups. In this context, a broad spectrum of previously undescribed mutations was identified. The majority of all verified mutations were splice mutations that were examined for an effect on the canonical splicing pattern in order to verify a pathogenic effect. Additionally, this work also included the characterization of individual FA patients and complementation groups, respectively. These include the rare subgroups FA-T and FA-Q, for each of which one new patient was identified. Functional characterization of the third ever described FA-Q patient allowed new insights into the interplay of DNA interstrand-crosslink and nucleotide excision repair and broadened the spectrum of phenotypic variability of FA by the subjective and cellular UV sensitivity of this patient. Furthermore, the mutation spectrum in both FA-I and FA-D2 was expanded. Here, a closer investigation of the pseudogene regions of FANCD2 facilitated a precise mutation screening of the gene. Overall, the results of this work broadened the mutation spectrum of FA and allowed new insights into diverse components of the FA/BRCA pathway by identifying and characterizing individual patients. It became apparent that novel strategies for DNA sequencing can be applied in FA diagnostics to ensure an efficient mutation analysis, as well as to replace some parts of classical approaches. KW - Fanconi-Anämie KW - DNS-Reparatur KW - Sequenzdaten KW - Genpanel KW - Next generation sequencing KW - Mutationsanalyse Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151096 ER - TY - THES A1 - Keppler, Sarah T1 - Characterization of Novel Mutations in Receptor-Tyrosine Kinases in Multiple Myeloma T1 - Charakterisierung neuer Mutationen in Rezeptor-Tyrosin Kinasen im Multiplen Myelom N2 - Multiple myeloma (MM) is a disease of terminally differentiated B-cells which accumulate in the bone marrow leading to bone lesions, hematopoietic insufficiency and hypercalcemia. Genetically, MM is characterized by a great heterogeneity. A recent next-generation sequencing approach resulted in the identification of a signaling network with an accumulation of mutations in receptor-tyrosine kinases (RTKs), adhesion molecules and downstream effectors. A deep-sequencing amplicon approach of the coding DNA sequence of the six RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 and NTRK2 was conducted in a patient cohort (75 MM samples and 68 corresponding normal samples) of the “Deutsche Studiengruppe Multiples Myelom (DSMM)” to further elucidate the role of RTKs in MM. As an initial approach the detected mutations were correlated with cytogenetic abnormalities and clinical data in the course of this thesis. RTK mutations were present in 13% of MM patients of the DSMM XI trial and accumulated in the ligand-binding and tyrosine-kinase domain. The newly identified mutations were associated with an adverse patient survival, but not with any cytogenetic abnormality common in MM. Especially rare patient-specific SNPs (single nucleotide polymorphism) had a negative impact on patient survival. For a more comprehensive understanding of the role of rare RTK SNPs in MM, a second amplicon sequencing approach was performed in a patient cohort of the DSMM XII trial that included 75 tumor and 184 normal samples. This approach identified a total of 23 different mutations in the six RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 and NTRK2 affecting 24 patients. These mutations could furthermore be divided into 20 rare SNPs and 3 SNVs (single nucleotide variant). In contrast to the first study, the rare SNPs were significantly associated with the adverse prognostic factor del17p. IGF1R was among the most commonly mutated RTKs in the first amplicon sequencing approach and is known to play an important role in diverse cellular processes such as cell proliferation and survival. To study the role of IGF1R mutations in the hard-to-transfect MM cells, stable IGF1R-knockdown MM cell lines were established. One of the knockdown cell lines (L363-C/C9) as well as a IGF1R-WT MM cell line (AMO1) were subsequently used for the stable overexpression of WT IGF1R and mutant IGF1R (N1129S, D1146N). Overall, an impact on the MAPK and PI3K/AKT signaling pathways was observed upon the IGF1R knockdown as well as upon WT and mutant IGF1R overexpression. The resulting signaling pattern, however, differed between different MM cell lines used in this thesis as well as in a parallel performed master thesis which further demonstrates the great heterogeneity described in MM. Taken together, the conducted sequencing and functional studies illustrate the importance of RTKs and especially of IGF1R and its mutants in the pathogenesis of MM. Moreover, the results support the potential role of IGF1R as a therapeutic target for a subset of MM patients with mutated IGF1R and/or IGF1R overexpression. N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist eine maligne Erkrankung ausdifferenzierter B-Zellen, den sogenannten Plasmazellen, welche sich im Knochenmark anhäufen. Symptome des MM sind, unter anderem, Knochenläsionen, Hyperkalzämie und hämatopoetische Insuffizienz. Zusätzlich ist das MM durch eine große genetische Heterogenität geprägt. In einer kürzlich durchgeführten Next-Generation Sequencing Studie wurde eine Akkumulation von Mutationen in Rezeptortyrosinkinasen (RTK), Adhesionmolekülen und den zugehörigen Effektoren identifiziert. Dies erlaubte die Definition eines inter- und intrazellulären Signalnetzwerkes. Um die Rolle der RTKs im MM genauer zu definieren, wurde die kodierende DNA Sequenz der sechs RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 und NTRK2 in einer einheitlich therapierten Patientenkohorte (75 Patienten) der „Deutschen Studiengruppe Multiples Myelom“ (DSMM) mittels eines Amplikonansatzes sequenziert. Die identifizierten Mutationen wurden im Rahmen dieser Arbeit validiert und anschließend mit zytogenetischen Anomalitäten und klinischen Daten korreliert. RTK Mutationen waren in 13 % der MM Patienten vorhanden und akkumulierten besonders in den Ligandenbindungs- und der Tyrosinkinase- Domänen. Die neu identifizierten RTK Mutationen hatten einen signifikant negativen Einfluss auf das Überleben, jedoch konnte kein Zusammenhang zwischen den Mutationen und zytogenetischen Alterationen festgestellt werden. Besonders seltene, Patienten-spezifische SNPs hatten einen negativen Einfluss auf die Gesamtüberlebenszeit, das ereignisfreie und das progressionsfreie Überleben. Um die Rolle dieser seltenen SNPs im MM besser zu verstehen, wurde ein zweiter Amplikonansatz in einer neuen Patientenkohorte der DSMM XII Studie durchgeführt. Hierbei wurden die sechs RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 und NTRK2 in 75 Tumor und 184 Normalproben sequenziert. Bei diesem Ansatz wurden 23 unterschiedliche Mutationen in 24 Patienten identifiziert. Diese Mutation konnten in 20 seltene SNPs und 3 SNVs (single nuleotide variant) unterteilt werden und waren, im Gegensatz zu Mutationen der ersten Studie, signifikant mit dem negativ prognostischen Faktor del17p assoziiert. IGF1R war bei der initialen Amplikon-Sequenzierstudie unter den am häufigsten mutierten RTKs und spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen, z. B. der Zellproliferation und dem Überleben. Um eine funktionelle Untersuchung der IGF1R Mutation in den schwer-zu-transfizierenden MM-Zellen zu ermöglichen, wurden stabile IGF1R-knockdown MM-Zelllinien etabliert. Eine dieser knockdown Zelllinien (L363-C/C9) sowie eine IGF1R WT MM-Zelllinie (AMO1) wurden anschließend für die stabile Überexpression von IGF1R WT, IGF1R D1146N und IGF1R N1129S verwendet. Funktionelle Analysen zeigten, dass sowohl IGF1R-knockdown als auch die Überexpression von IGF1R WT, IGF1R D1146N und IGF1R N1129S einen Einfluss auf den MAPK und den PI3K/AKT Signalweg haben. Der Einfluss des IGF1R WT, als auch der zwei Mutanten IGF1R D1146N und IGF1R N1129S unterschied sich jedoch in den in dieser Arbeit und in einer parallel durchgeführten Masterarbeit verwendeten Zelllinien. Diese Unterschiede verdeutlichen zusätzlich die große Heterogenität für die das MM bekannt ist. Zusammengenommen verdeutlichen die durchgeführten Sequenzier- und funktionellen Studien die wichtige Rolle der RTKs, besonders von IGF1R, im MM. Darüber hinaus unterstützen die erhaltenen Ergebnisse die potenzielle Rolle von IGF1R als therapeutisches Ziel für MM-Patienten mit mutiertem IGF1R und / oder IGF1R-Überexpression. KW - Plasmozytom KW - Rezeptor-Tyrosinkinasen KW - Multiple Myeloma KW - Amplicon Sequencing KW - Receptor-Tyrosine Kinases KW - IGF1R Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155720 ER - TY - THES A1 - Franke, Christian T1 - Advancing Single-Molecule Localization Microscopy: Quantitative Analyses and Photometric Three-Dimensional Imaging T1 - Weiterentwicklung von Einzel-Molekül Lokalisations-Mikroskopie: Quantitative Analysen und photometrische drei-dimensionale Bildgebung N2 - Since its first experimental implementation in 2005, single-molecule localization microscopy (SMLM) emerged as a versatile and powerful imaging tool for biological structures with nanometer resolution. By now, SMLM has compiled an extensive track-record of novel insights in sub- and inter- cellular organization.\\ Moreover, since all SMLM techniques rely on the analysis of emission patterns from isolated fluorophores, they inherently allocate molecular information $per$ $definitionem$.\\ Consequently, SMLM transitioned from its origin as pure high-resolution imaging instrument towards quantitative microscopy, where the key information medium is no longer the highly resolved image itself, but the raw localization data set.\\ The work presented in this thesis is part of the ongoing effort to translate those $per$ $se$ molecular information gained by SMLM imaging to insights into the structural organization of the targeted protein or even beyond. Although largely consistent in their objectives, the general distinction between global or segmentation clustering approaches on one side and particle averaging or meta-analyses techniques on the other is usually made.\\ During the course of my thesis, I designed, implemented and employed numerous quantitative approaches with varying degrees of complexity and fields of application.\\ \\ In my first major project, I analyzed the localization distribution of the integral protein gp210 of the nuclear pore complex (NPC) with an iterative \textit{k}-means algorithm. Relating the distinct localization statistics of separated gp210 domains to isolated fluorescent signals led, among others, to the conclusion that the anchoring ring of the NPC consists of 8 homo-dimers of gp210.\\ This is of particular significance, both because it answered a decades long standing question about the nature of the gp210 ring and it showcased the possibility to gain structural information well beyond the resolution capabilities of SMLM by crafty quantification approaches.\\ \\ The second major project reported comprises an extensive study of the synaptonemal complex (SNC) and linked cohesin complexes. Here, I employed a multi-level meta-analysis of the localization sets of various SNC proteins to facilitate the compilation of a novel model of the molecular organization of the major SNC components with so far unmatched extend and detail with isotropic three-dimensional resolution.\\ In a second venture, the two murine cohesin components SMC3 and STAG3 connected to the SNC were analyzed. Applying an adapted algorithm, considering the disperse nature of cohesins, led to the realization that there is an apparent polarization of those cohesin complexes in the SNC, as well as a possible sub-structure of STAG3 beyond the resolution capabilities of SMLM.\\ \\ Other minor projects connected to localization quantification included the study of plasma membrane glycans regarding their overall localization distribution and particular homogeneity as well as the investigation of two flotillin proteins in the membrane of bacteria, forming clusters of distinct shapes and sizes.\\ \\ Finally, a novel approach to three-dimensional SMLM is presented, employing the precise quantification of single molecule emitter intensities. This method, named TRABI, relies on the principles of aperture photometry which were improved for SMLM.\\ With TRABI it was shown, that widely used Gaussian fitting based localization software underestimates photon counts significantly. This mismatch was utilized as a $z$-dependent parameter, enabling the conversion of 2D SMLM data to a virtual 3D space. Furthermore it was demonstrated, that TRABI can be combined beneficially with a multi-plane detection scheme, resulting in superior performance regarding axial localization precision and resolution.\\ Additionally, TRABI has been subsequently employed to photometrically characterize a novel dye for SMLM, revealing superior photo-physical properties at the single-molecule level.\\ Following the conclusion of this thesis, the TRABI method and its applications remains subject of diverse ongoing research. N2 - Seit ihrer ersten experimentellen Umsetzung in 2005 hat sich die Einzel-Molekül Lokalisations-Mikroskopie (\textit{engl.} single-molecule localization microscopy (SMLM)) als vielseitig einsetzbares Verfahren in der biologischen Bildgebung etabliert, vor allem aufgrund ihres hohen Auflösungsvermögens im Nanometer Bereich. Bis heute wurde eine Reihe neuer Erkenntnisse bezüglich der sub- und inter- zellulären Organisation durch den Einsatz der SMLM erlangt.\\ Aufgrund der Tatsache, dass alle SMLM Techniken auf dem Prinzip basieren, isolierte Fluorophore zu detektieren und zu analysieren, beinhalten SMLM Daten $per$ $definitionem$ molekulare Informationen.\\ Folgerichtig entwickelte sich das Feld der SMLM vom reinen Bildgebungsinstrument mit Nanometer-Auflösung hin zu quantitativer Mikroskopie, bei welcher der Fokus nicht länger vornehmlich auf dem hochaufgelöstem Bild, sondern vielmehr auf den Lokalisationsdaten liegt.\\ Die vorliegende Arbeit ist als Teil der anhaltenden Bestrebungen zu sehen, aus den $per$ $se$ molekularen Informationen der SMLM weiterführende Erkenntnisse über die strukturelle Organisation der markierten Proteine zu gewinnen. Obwohl mit der gleichen prinzipiellen Zielsetzung versehen, unterscheiden sich hierbei globale oder Segmentierungs- Clusteranalysen von Lokalisations-Meta-Analysen oder so genannten \textit{particle averaging} Ansätzen.\\ Während meiner Doktorarbeit habe ich verschiedene Quantifizierungs Ansätze entworfen, implementiert und angewendet, mit unterschiedlichen Graden an Komplexität und Breite des Anwendungsgebietes.\\ \\ In meinem ersten wesentlichem Projekt analysierte ich mit einem iterativen \textit{k}-means Algorithmus die Lokalisationsverteilung des integralen Proteins gp210, welches Teil des Kernporenkomplexes ist (\textit{engl.} nuclear pore complex (NPC)). Durch den Vergleich der charakteristischen Lokalisations-Statistik von separierten gp210 Domänen mit isolierten Fluoreszenzmarkern konnte unter anderem festgestellt werden, dass der Verankerungsring des NPC aus acht gp210 Homodimeren bestehen muss.\\ Diese Erkenntnis beantwortet zum einen eine jahrzehntealte Frage nach der Zusammensetzung des gp210 Rings und zum anderen liefert sie ein Beispiel dafür, dass durch eine geschickte Analyse der Lokalisationsstatistik strukturelle Informationen erlangt werden können, die jenseits des räumlichen Auflösungsvermögens von SMLM liegen.\\ \\ Das zweite hier vorgestellte wesentliche Projekt beinhaltet eine umfassende Studie des Synaptonemalen Komplexes (\textit{engl.} synaptonemal complex (SNC)) und damit verbundenen Cohesin Komplexen. Um die molekulare Organisation des SNC zu untersuchen, implementierte ich eine multi-level Meta-Analyse der Lokalisationsdaten mehrerer SNC Komponenten. Aus dessen Ergebnissen konnte ein neues drei dimensionales molekulares Modell des SNC erstellt werden.\\ Nachfolgend wurden die beiden murinen Cohesine SMC3 und STAG3 mit adaptierter Methodik untersucht. Hierbei musste die starke intrinsische Dispersion der Cohesin-Signale berücksichtigt werden. Die Analyse ergab deutliche Hinweise auf eine Polarisation der Cohesine innerhalb des SNC. Zudem zeigte sich eine mögliche Substruktur in der Organisation von STAG3, die unterhalb der Auflösungsgrenze von SMLM liegt.\\ \\ Weitere Nebenprojekte im Zusammenhang mit quantitativer Lokalisationsanalyse umfassten die Untersuchung der Lokalisationsverteilung von Plasma-Membran Glykanen, sowie zweier Flotillin Proteine in den Membranen von Bakterien, welche Cluster unterschiedlicher Form und Größe aufzeigten.\\ \\ Schließlich wird ein neuartiger Ansatz für dreidimensionale SMLM vorge-stellt, die auf der genauen Bestimmung von Einzel-Molekül Intensitäten basiert. Diese Methode, genannt TRABI, stützt sich auf die Prinzipien der Apertur Photometrie, welche für die SMLM angepasst und verbessert wurden.\\ Mit TRABI konnte gezeigt werden, dass weit verbreitete Lokalisations-Software, die auf $Gaussian-Fitting$ basiert, die Photonenzahl von Emittern oftmals stark unterschätzt. Diese Diskrepanz kann als $z$-abhängiger Parameter verwendet werden um z.B. einen 2D SMLM Datenatz in einen virtuellen 3D Raum zu überführen. Außerdem wird gezeigt, dass TRABI vorteilhaft mit einem multi-plane Detektionsschema kombiniert werden kann und dabei höhere axiale Lokalisationsgenauigkeiten und Auflösungen er-reicht.\\ Zudem wurde TRABI eingesetzt, um einen neuen Fluoreszenzfarbstoff für SMLM zu charakterisieren und dessen verbesserte photo-physikalische Eigenschaften auf Einzel-Molekül Basis zu demonstrieren.\\ Auch nach Abschluss dieser Arbeit ist die TRABI Methode und deren Anwendung weiterhin Gegenstand diverser Forschungen. KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Quantitative Mikroskopie KW - dSTORM Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156355 ER - TY - THES A1 - Kißner [geb. Stenger], Stefanie Martina T1 - Morphologische Untersuchungen an Myoblasten von Patienten, die an facioscapulohumeraler Muskeldystrophie (FSHD) leiden T1 - Morphological studies on myoblasts of patients with facioscapulohumeral muscular dystrophy N2 - Die autosomal-dominant vererbte facioscapulohumerale Muskeldystrophie (FSHD) ist mit einer Prävalenz von etwa 1:20.000 die dritthäufigste Form der hereditären Myopathien. Erste Beschwerden werden meist in der zweiten Lebensdekade beobachtet. Betroffen sind vor allem die Muskulatur von Gesicht, Schultern, Oberarmen, die Fußhebermuskulatur und die Muskeln des Hüftgürtels. FSHD wird durch einen Gendefekt ausgelöst, der den langen Arm des Chromosoms vier (4q35) betrifft, wobei es zur teilweisen Deletion des polymorphen Abschnitts D4Z4, der für das Protein DUX4 codiert, kommt. Dabei treten unter anderem Störungen in der DUX4-Expression, Veränderungen der myogenen Genexpression, eine Unterdrückung der Muskelzelldifferenzierung und eine Inhibition der Muskelbildung auf. FSHD und eine andere Form der Muskeldystrophie, die Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), zeigen trotz unterschiedlicher genetischer Ursachen phänotypisch Ähnlichkeiten in der Ausprägung der Erkrankungen. In früheren Studien zeigte die Kernhülle von EDMD-Myoblasten morphologische Auffälligkeiten. In anderen Untersuchungen waren morphologische Veränderungen der Mitochondrien von FSHD-Patienten festzustellen. Daher wurden elektronenmikroskopische Untersuchungen der Kernhülle und der Mitochondrien von FSHD-Myoblasten durchgeführt und mit der entsprechenden Kontrolle verglichen. Hierfür wurden drei verschiedene Zelllinien-Paare in unterschiedlichen Passagen, das heißt unterschiedlicher Anzahl an Subkultivierungen, eingesetzt, wobei in den höheren Passagen vermehrt morphologische Atypien beobachtet werden konnten. Die eingesetzten Zelllinien differenzieren sich durch verschiedene Parameter wie beispielsweise Alter und Geschlecht der Patienten. Dabei zeigten sich sowohl zwischen den Kontrollzellen als auch zwischen den FSHD-Myoblasten Unterschiede. Im Rahmen der Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie kamen zwei verschiedene Fixierungsmethoden zum Einsatz: die konventionelle chemische Fixierung, Entwässerung und Flacheinbettung von Kulturzellen und die Hochdruckgefrierung mit anschließender Gefriersubstitution. In Bezug auf die Qualität des Strukturerhalts, die beim Hochdruckgefrieren erreicht wird, wird dieser Art der Fixierung eine Überlegenheit gegenüber allen anderen Verfahren zugeschrieben. Diese allgemeine Aussage kann nicht vollständig auf die Untersuchungen an den Myoblasten übertragen werden. Für die Untersuchung der Kernmembranen sind beide Methoden geeignet, wobei der Abstand zwischen innerer und äußerer Kernmembran nach der HPF-Fixierung schärfer abgebildet wurde. Bei der Darstellung der Mitochondrien zeigten die elektronenmikroskopischen Aufnahmen nach dem Hochdruckgefrieren bessere und schärfere Ergebnisse. Die Kernporen waren bei beiden Fixierungsmethoden gut erkennbar. Beim Vergleich der gesunden und erkrankten Myoblasten wiesen die Kontrollzellen deutlich weniger Auffälligkeiten auf als die Myoblasten von FSHD-Patienten. Innere und äußere Kernmembran verliefen bei den Kontrollzellen meist parallel und die Mitochondrien zeigten in den meisten Fällen eine typische wurmartige, längliche Form mit Cristae. Dies traf sowohl für die konventionelle Fixierung als auch für das Hochdruckgefrieren zu. Die erkrankten Myoblasten wiesen im Vergleich zur Kontrolle bei beiden Fixierungsmethoden deutliche Auffälligkeiten in der Mitochondrien-Morphologie auf. Neben einer oft großen Variationsbreite hinsichtlich Form und Länge war auch das teilweise Fehlen der Cristae festzustellen. Bei Betrachtung der Kernhülle fielen jedoch deutliche Unterschiede zwischen konventioneller und HPF-Fixierung auf. Die äußere Kernmembran der konventionell fixierten FSHD-Myoblasten verlief unregelmäßig und gewellt. Im Gegensatz dazu wies die Kernhülle der HPF-fixierten erkrankten Myoblasten einen erstaunlich parallelen Verlauf auf. Da bei EDMD in vorangegangenen Untersuchungen auch fluoreszenzmikroskopisch Veränderungen der erkrankten Zellen auffällig waren, wurde neben den Methoden der Elektronenmikroskopie das Vorliegen und die Verteilung verschiedener Proteine in FSHD-Myoblasten mittels indirekter Immunfluoreszenz untersucht und mit den Kontrollzellen verglichen. Zur Beurteilung der Kernhülle wurden Antikörper gegen Lamin A/C und Nukleoporine eingesetzt. Die Mitochondrien wurden mithilfe des Antikörpers ANT1/2, der an den Adenin-Nukleotid-Translokator der inneren Mitochondrienmembran bindet, untersucht. Im Gegensatz zu den Untersuchungen an EDMD-Myoblasten waren die Lamine A und C sowie die Kernporen sowohl bei den Myoblasten der FSHD-Patienten als auch bei den Kontrollzellen nachweisbar und gleichmäßig verteilt. Bei der indirekten Immunfluoreszenz mit ANT1/2 zeigten sich Unterschiede zwischen den untersuchten Myoblasten-Paaren. Durch die vorliegenden Ergebnisse ist darauf zu schließen, dass die Myoblasten von FSHD-Patienten Veränderungen Mitochondrien aufweisen. Die Untersuchungen der Kernhülle liefern abhängig von der Fixierungsmethode unterschiedliche Ergebnisse. N2 - The autosomal dominant facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD), with a prevalence of about 1:20,000, is the third most common form of hereditary myopathy. First complaints are usually observed in the second decade of life. Most affected are the muscles of the face, shoulders, upper arms, lower legs and girdle. FSHD is triggered by a gene defect affecting the long arm of chromosome four (4q35), resulting in the partial deletion of polymorphic portion D4Z4 encoding the protein DUX4. This leads to disorders in DUX4 expression, changes in myogenic gene expression, suppression of muscle cell differentiation and inhibition of muscle formation. FSHD and another form of muscular dystrophy, the Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD), show phenotypic similarities in the severity of the disease, despite different genetic causes. In previous studies, the nuclear envelope of EDMD myoblasts showed morphological abnormalities. Other studies revealed morphological changes in the mitochondria of FSHD patients. Therefore, electron micrographs of the nuclear envelope and mitochondria of FSHD myoblasts were performed and compared to the corresponding control. For this purpose, three different pairs of myoblasts were used in different passages, that is, different numbers of subcultures, with increased morphological atypia being observed in the higher passages. The cell lines used differentiate by several parameters such as age and sex of the patients. There were differences between the control cells as well as between the FSHD myoblasts. Two different fixation methods were used in sample preparation for electron microscopy: conventional chemical fixation, drainage and flat embedding of cultured cells and high-pressure freezing with subsequent freeze substitution. In terms of the quality of structure preservation achieved in high pressure freezing, this type of fixation is attributed superiority over all other methods. This general statement cannot be completely applied to the investigations on the myoblasts. For the investigation of the nuclear membranes both methods are suitable, whereby the distance between inner and outer nuclear membrane after the HPF fixation was more sharply mapped. In the representation of mitochondria, the electron micrographs after high pressure freezing showed better and sharper results. The nuclear pores were easily recognizable in both fixation methods. When comparing the healthy and diseased myoblasts, the control cells showed significantly less abnormalities than the myoblasts of FSHD patients. The inner and outer nuclear membrane were mostly parallel in the control cells, and the mitochondria in most cases showed a typical worm-like elongated form with cristae. This was true for both conventional fixation and high pressure freezing. FSHD myoblasts exhibited marked abnormalities in mitochondrial morphology compared to controls in both fixation methods. In addition to an often wide range of variation in shape and length there was also noted the partial absence of cristae. When looking at the nuclear envelope, however, there were clear differences between conventional and HPF fixation. The outer nuclear membrane of the conventionally fixed FSHD myoblasts was irregular and wavy. In contrast, the nuclear envelope of HPF fixed diseased myoblasts showed an astonishingly parallel course. Since in EDMD changes in the diseased cells were also noticeable by fluorescence microscopy, in addition to the methods of electron microscopy, the presence and distribution of various proteins in FSHD myoblasts was examined by indirect immunofluorescence and compared with the control cells. To assess the nuclear envelope, antibodies against lamin A/C and nucleoporins were used. The mitochondria were examined using the antibody ANT1 / 2, which binds to the adenine nucleotide translocator of the inner mitochondrial membrane. In contrast to the studies on EDMD myoblasts, the lamins A and C as well as the nuclear pores were detectable and evenly distributed both in the myoblasts of the FSHD patients and in the control cells. Indirect immunofluorescence with ANT1 / 2 showed differences between the investigated myoblasts. The present results suggest that the myoblasts of FSHD patients have changes in mitochondria. The investigations of the nuclear envelope provide different results depending on the fixation method. KW - Landouzy-Déjerine-Atrophie KW - Facioscapulohumeral muscular dystrophy KW - Myoblast KW - Morphologie KW - FSHD KW - myoblast KW - Myoblasten KW - HPF KW - morphology Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156676 ER - TY - THES A1 - Chen, Jiangtian T1 - Functions of allatostatin A (AstA) and myoinhibitory peptides (MIPs) in the regulation of food intake and sleep in Drosophila T1 - Funktion der Allatostatin A (AstA) und myoinhibitorische Peptide (MIP) in Bezug zu Nahrungsaufnahme und Schlaf bei Drosophila N2 - Neuropeptides and peptide hormones carrying neural or physiological information are intercellular signalling substances. They control most if not all biological processes in vertebrates and invertebrates by acting on specific receptors on the target cell. In mammals, many different neuropeptides and peptide hormones are involved in the regulation of feeding and sleep. In \textit{Drosophila}, allatostatin A (AstA) and myoinhibitory peptides (MIPs) are brain-gut peptides. The AstA receptors are homologues of the mammalian galanin receptors and the amino acid sequences of MIPs are similar to a part of galanin, which has an orexigenic effect and is implicated in the control of sleep behaviour in mammals. I am interested in dissecting pleiotropic functions of AstA and MIPs in the regulation of food intake and sleep in \textit{Drosophila}. \par In the first part of the dissertation the roles of brain-gut peptide allatostatin A are analysed. Due to the genetic and molecular tools available, the fruit fly \textit{Drosophila melanogaster} is chosen to investigate functions of AstA. The aims in this part are to identify pleiotropic functions of AstA and assign specific effects to the activity of certain subsets of AstA expressing cells in \textit{Drosophila} adults. A new and restricted \textit{AstA\textsuperscript{34}-Gal4} line was generated. The confocal imaging result showed that AstA neurons are located in the posterior lateral protocerebrum (PLP), the gnathal ganglia (GNG), the medullae, and thoracic-abdominal ganglion (TAG). AstA producing DLAa neurons in the TAG innervate hindgut and the poterior part of midgut. In addition, AstA are detected in the enteroendocrine cells (EECs).\par Thermogenetic activation and neurogenetic silencing tools with the aid of the \textit{UAS/Gal4} system were employed to manipulate the activity of all or individual subsets of AstA cells and investigate the effects on food intake, locomotor activity and sleep. Our experimental results showed that thermogenetic activation of two pairs of PLP neurons and/or AstA expressing EECs reduced food intake, which can be traced to AstA signalling by using \textit{AstA} mutants. In the locomotor activity, thermogenetic activation of two pairs of PLP neurons and/or AstA expressing EECs resulted in strongly inhibited locomotor activity and promoted sleep without sexual difference, which was most apparent during the morning and evening activity peaks. The experimental and control flies were not impaired in climbing ability. In contrast, conditional silencing of the PLP neurons and/or AstA expressing EECs reduced sleep specifically in the siesta. The arousal experiment was employed to test for the sleep intensity. Thermogenetically activated flies walked significantly slower and a shorter distance than controls for all arousal stimulus intensities. Furthermore, PDF receptor was detected in the PLP neurons and the PLP neurons reacted with an intracellular increase of cAMP upon PDF, only when PDF receptor was present. Constitutive activation of AstA cells by tethered PDF increased sleep and thermogenetic activation of the PDF producing sLNvs promoted sleep specifically in the morning and evening. \par The study shows that the PLP neurons and/or EECs vis AstA signalling subserve an anorexigenic and sleep-regulating function in \textit{Drosophila}. The PLP neurons arborise in the posterior superior protocerebrum, where the sleep relevant dopaminergic neurons are located, and EECs extend themselves to reach the gut lumen. Thus, the PLP neurons are well positioned to regulate sleep and EECs potentially modulate feeding and possibly locomotor activity and sleep during sending the nutritional information from the gut to the brain. The results of imaging, activation of the PDF signalling pathway by tethered PDF and thermoactivation of PDF expressing sLNvs suggest that the PLP neurons are modulated by PDF from sLNv clock neurons and AstA in PLP neurons is the downstream target of the central clock to modulate locomotor activity and sleep. AstA receptors are homologues of galanin receptors and both of them are involved in the regulation of feeding and sleep, which appears to be conserved in evolutionary aspect.\par In the second part of the dissertation, I analysed the role of myoinhibitory peptides. MIPs are brain-gut peptides in insects and polychaeta. Also in \textit{Drosophila}, MIPs are expressed in the CNS and EECs in the gut. Previous studies have demonstrated the functions of MIPs in the regulation of food intake, gut motility and ecdysis in moths and crickets. Yet, the functions of MIPs in the fruit fly are little known. To dissect effects of MIPs regarding feeding, locomotor activity and sleep in \textit{Drosophila melanogater}, I manipulated the activity of MIP\textsuperscript{WÜ} cells by using newly generated \textit{Mip\textsuperscript{WÜ}-Gal4} lines. Thermogenetical activation or genetical silencing of MIP\textsuperscript{WÜ} celles did not affect feeding behaviour and resulted in changes in the sleep status. \par My results are in contradiction to a recent research of Min Soohong and colleagues who demonstrated a role of MIPs in the regulation of food intake and body weight in \textit{Drosophila}. They showed that constitutive silencing of MIP\textsuperscript{KR} cells increased food intake and body weight, whereas thermogenetic activation of MIP\textsuperscript{KR} cells decreased food intake and body weight by using \textit{Mip\textsuperscript{KR}-Gal4} driver. Then I repeated the experiments with the \textit{Mip\textsuperscript{KR}-Gal4} driver, but could not reproduce the results. Interestingly, I just observed the opposite phenotype. When MIP\textsuperscript{KR} cells were silenced by expressing UAS-tetanus toxin (\textit{UAS-TNT}), the \textit{Mip\textsuperscript{KR}$>$TNT} flies showed reduced food intake. The thermogenetic activation of MIP\textsuperscript{KR} cells did not affect food intake. Furthermore, I observed that the thermogenetic activation of MIP\textsuperscript{KR} cells strongly reduced the sleep duration.\par In the third part of the dissertation, I adapted and improved a method for metabolic labelling for \textit{Drosophila} peptides to quantify the relative amount of peptides and the released peptides by mass spectrometry under different physiological and behavioural conditions. qRT-PCR is a practical technique to measure the transcription and the corresponding mRNA level of a given peptide. However, this is not the only way to measure the translation and production of peptides. Although the amount of peptides can be quantified by mass spectrometry, it is not possible to distinguish between peptides stored in vesicles and released peptides in CNS extracts. I construct an approach to assess the released peptides, which can be calculated by comparing the relative amount of peptides between two timepoints in combination with the mRNA levels which can be used as semiquantitative proxy reflecting the production of peptides during this period. \par After optimizing the protocol for metabolic labelling, I carried out a quantitative analysis of peptides before and after eclosion as a test. I was able to show that the EH- and SIFa-related peptides were strongly reduced after eclosion. This is in line with the known function and release of EH during eclosion. Since this test was positive, I next used the metabolic labelling in \textit{Drosophila} adult, which were either fed \textit{ad libitum} or starved for 24 hrs, and analysed the effects on the amount of AstA and MIPs. In the mRNA level, my results showed that in the brain \textit{AstA} mRNA level in the 24 hrs starved flies was increased compared to in the \textit{ad libitum} fed flies, whereas in the gut the \textit{AstA} mRNA level was decreased. Starvation induced the reduction of \textit{Mip} mRNA level in the brain and gut. Unfortunately, due to technical problems I was unable to analyse the metabolic labelled peptides during the course of this thesis.\par N2 - Neuropeptide und Peptidhormone sind interzelluläre Botenstoffe, die neuronale und physiologische Informationen tragen. Sie kontrollieren die meisten - wenn nicht alle - biologische Prozesse in Wirbeltieren und Wirbellosen durch ihre Wirkung auf spezifische Rezeptoren an den Zielzellen. So sind bei Säugetieren z.B. viele unterschiedliche Neuropeptide an der Regulierung des Freßverhaltens und des Schlafs beteiligt. In \textit{Drosophila} sind Allatostatin A (AstA) und myoinhibitorische Peptide (MIP) typische Gehirn-Darm- Peptide. Die AstA-Rezeptoren sind Homologe des Galanin-Rezeptors der Wirbeltiere, und die Aminosäurensequenz von MIP sind ähnlich zu einer Teilsequenz von Galanin, welches einen orexigenischen Effekt hat und mit der Kontrolle des Schlafverhaltens in Säugetieren verbunden ist. Ich bin interessiert an der Identifierung möglicher pleiotroper Funktionen von AstA und MIP in der Regulation von Nahrungsaufnahme und Schlaf in \textit{Drosophila}. \par Im ersten Teil der Dissertation wird die Rolle der Hirn-Darm- Peptide der AstA-Familie analysiert. Aufgrund der verfügbaren genetischen und molekularen Werkzeuge wurde die Taufliege \textit{Drosophila melanogaster} als Modell ausgewählt, um die Funktionen von AstA zu erforschen. Der Fokus lag dabei darauf, die pleiotropen Funktionen von AstA zu identifizieren, und herauszufinden, ob den verschiedenen AstA-exprimierenden Zelltypen jeweils unterschiedliche Funktionen zukommen. Eine neue, eingeschränkte AstA-Gal4-Linie wurde generiert. AstA-exprimierende Neuronen lassen sich im posterio-lateralen Protocerebrum (PLP), dem Gnathalganglion (GNG), der Medulla und dem thorakal-abdominalen Ganglion(TAG) finden. DLAa-Neuronen im TAG innervieren den Enddarm und den vorderen Teil des Mitteldarms. Ausserdem wird AstA auch in enteroendokrinen Zellen (EEC) im Mitteldarm exprimiert.\par Thermogenetische Aktivierung und neurogenetische Stillegung wurden zusammen mithilfe des UAS/Gal4-Systems eingesetzt, um die Aktivität vieler oder einzelner Untergruppen von AstA-Zellen zu manipulieren und die Effekte auf Nahrungsaufnahme, Laufaktivität und Schlaf zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die thermogenetische Aktivierung der zwei Paare von PLP-Neuronen und/oder AstA-exprimierenden EEC Schlaf und Nahrungsaufnahme reduziert, was auf die signalisierende Funktion von AstA zurückzuführen ist. In der Laufaktivität führte die thermogenetische Aktivierung der zwei Paare von PLP-Neuronen und/oder AstA-exprimierende EEC zu starker Hemmung, und förderte Schlaf ohne geschlechtsspezifischen Unterschied, was während der Aktivitätsgipfel am Morgen und Abend am besten zu beobachten war. Die Experimental- sowie die Kontrollfliegen waren im generellen Klettervermögen nicht beeinträchtigt. In Kontrast dazu reduzierte eine konditionale Stillegung von PLP-Neuronen und allen \textit{AstA-Gal4} exprimierenden Neuronen besonders den Siesta-Schlaf. Fliegen mit thermogenetisch aktivierten AstA-Zellen liefen wesentlich langsamer und weniger als die Kontrollgruppe bei allen Erregungsintensitäten. Außerdem wurde der PDF-Rezeptor in den PLP-Neuronen ermittelt. Die PLP-Neuronen reagierten auf PDF-Gabe mit einem intrazellulären Anstieg von cAMP nur dann, wenn der PDF-Rezeptor anwesend war. Konstitutive Aktivierung von AstA-Zellen durch "tethered" PDF steigerte den Schlaf, und thermogenetische Aktivierung von PDF-produzierenden sLNvs förderte Schlaf besonders am Morgen und Abend.\par Die Studie zeigt, dass die PLP-Neuronen und/oder EECs via AstA eine anorexigenische und schlafregulierende Funktion in \text{Drosophila} ausübt. PLP-Neuronen verzweigen im posterio-superioren Protocerebrum, wo die für Schlaf relevanten dopaminergen Neurone lokalisiert sind. Die EECs erstrecken sich bis zum Darmlumen. Daher sind die PLP-Neuronen gut positioniert, um Schlaf zu regulieren, und EECs modulieren potenziell die Verdauung und möglicherweise auch Laufaktivität und Schlaf durch Vermittlung der Nahrungsinformationen vom Darm zum Gehirn. Die Ergebnisse von Imaging, Aktivierung des PDF-wegs durch "tethered" PDF und Thermoaktivierung von PDF-exprimierenden s-LNvs weisen darauf hin, dass die PLP-Neuronen durch PDF aus sLNv-Uhr-Neuronen moduliert werden. AstA in den PLP-Neuronen scheint ein indirektes Ausgangssignal der inneren Uhr das die Laufaktivität und Schlaf modelliert. Die AstA-Rezeptoren sind Homologe der Galanin-Rezeptoren; beide sind an der Regulierung von Ernährung und Schlaf beteiligt, was auf eine evolutionär bewahrte Funktion hindeutet. \par Im zweiten Teil der Dissertation habe ich die Rolle der MIP analysiert. MIP sind Hirn-Darm- Peptide der Insekten und Polychaeta. Auch in \textit{Drosophila} wird MIP durch Neurone im ZNS und durch EEC im Darm exprimiert. Bisherige Studien haben Funktionen von MIP bei der Nahrungsaufnahme, Regulation der Darmbewegung und Häutung in Motten und Grillen demonstriert. Für \textit{Drosophila} waren Funktionen von MIP nicht bekannt. Um mögliche Effekte von MIP bezüglich des Freßverhaltens, Laufaktivität und und Schlaf in \textit{Drosophila melanogaster} zu finden, habe ich die Aktivität von MIP\textsuperscript{WÜ}-Zellen mit Hilfe der neu in unserem Labor hergestellten \textit{Mip\textsuperscript{WÜ} -Gal4}-Linien manipuliert. Dabei konnte ich keinen Effekt auf das Freßverhalten finden, nachdem ich die MIP\textsuperscript{WÜ}–Zellen thermogenetisch aktiviert oder genetisch stillgelegt habe. Allerdings führte dies zu Änderungen des Schlafstatuses. \par Meine Ergebnisse stehen im Widerspruch zu einer neueren Veröffentlichung von Min Soohong und Kollegen, die eine Rolle der MIP in der Regulation von Nahrungsaufnahme und Körpergewicht von \textit{Drosophila} nachweisen konnten. Sie zeigten dass konstitutive Stillegung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen Nahrungsaufnahme und Körpergewicht steigerte, während thermogenetische Aktivierung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen Nahrungsaufnahme und Körpergewicht durch \textit{MIP\textsuperscript{KR}-Gal4}-Treiber verringerte. Ich habe daraufhin die Versuche mit der von Soohong eingesetzen \textit{Mip\textsuperscript{KR}-Gal4}-Treiber wiederholt, konnte aber damit die Ergebnisse nicht bestätigen. Interessanterweise habe ich genau das Gegenteil beobachtet. Wenn ich MIP\textsuperscript{KR}-Zellen durch Expresseion von UAS-Tetanustoxin (UAS-TNT) ausgeschaltet habe, zeigten die \textit{Mip\textsuperscript{KR}$>$TNT}-Fliegen eine reduzierte Nahrungsaufnahme. Eine thermogenetische Aktivierung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen hat die Nahrungsaufnahme nicht beeinflusst. Weiterhin habe ich beobachtet, dass die thermogenetische Aktivierung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen die Schlafdauer stark reduziert.\par Im dritten Teil der Dissertation haben ich eine Methode zur metabolischen Markierung für \textit{Drosophila}-Peptide adaptiert und verbessert, um die relative Menge von Peptiden und die Peptidausschüttung mittels Massenspektrometrie unter verschiedenen physiologischen Bedingungen und Verhaltenskontexten zu quantifizieren. qRT-PCR ist eine praktische Technik um die Transkription und die entsprechende mRNA-Menge für ein gegebenes Peptid zu messen. Dies ist allerdings kein zwingendes Maß für die Translation und Menge eines Peptids. Massenspektrometisch kann die Peptidmenge zwar quantifiziert werden, es kann aber nicht zwischen in Vesikel gespeicherten Peptiden und ausgeschütteten Peptiden in ZNS-Extrakten unterschieden werden. Ich habe nach einem Zugang zu den ausgeschütteten Peptiden gesucht, die durch Vergleich der relativen Menge der Peptide zwischen zwei Zeitpunkten kalkuliert werden können, wenn die mRNA-Menge, welche ein semiquantitatives Proxy der Produktion der Peptide in dieser Periode darstellt, bekannt ist. \par Nachdem ich das Protokoll für die metabolische Markierung optimiert hatte, habe ich als Test eine quantitative Peptidomanalyse vor und nach dem Adultschlupf durchgeführt. Dabei konnte ich zeigen, dass die EH- und SIFa-relatierte Peptide nach dem Schlupf stark reduziert sind. Dies passt gut überein mit der bekannten Funktion und Freisetzung von EH während des Schlupfs. Da dieser Test positiv war, habe ich dann als nächsten Schritt die metabolische Markierung in adulten \textit{Drosophila} eingesetzt, die für 24h entweder \textit{ad libitum} gefüttert oder gehungert wurden, und geschaut, wie sich dies auf die Menge der AstA und MIP auswirkt. Meine Ergebnisse zeigten, dass das \textit{AstA} mRNA-Niveau im Gehirn der Fliegen, die 24 Stunden gehungert haben im Vergleich zu \textit{ad libitum} gefütterten Fliegen steigt, während das \textit{AstA} mRNA-Niveau im Darm sank. Hunger führte zur Reduzierung des \textit{Mip} mRNA-Spiegels in Gehirn und Darm. Wegen technischer Probleme konnte ich die metabolisch markierten Peptide während meiner Forschungsphase leider nicht mehr analysieren. \par KW - AstA KW - MIPs KW - Nahrungsaufnahme KW - Schlaf KW - Taufliege KW - Peptide KW - Drosophila Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156838 ER - TY - THES A1 - Borst, Andreas T1 - Apoptosis & senescence: cell fate determination in inhibitor-treated melanoma cells T1 - Apoptose & Seneszenz: Bestimmung der Zell-spezifischen Reaktion von Melanomzellen auf Inhibitoren N2 - Neoplasms of the skin represent the most frequent tumors worldwide; fortunately, most of them are benign or semi-malignant and well treatable. However, the two most aggressive and deadly forms of malignant skin-neoplasms are melanoma and Merkel cell carcinoma (MCC), being responsible for more than 90% of skin-cancer related deaths. The last decade has yielded enormous progress in melanoma therapy with the advent of targeted therapies, like BRAF or MEK inhibitors, and immune-stimulating therapies, using checkpoint antibodies targeting CTLA- 4, PD-1 or PD-L1. Very recent studies suggest that also MCC patients benefit from a treatment with checkpoint antibodies. Nevertheless, in an advanced metastatic stage, a cure for both of these aggressive malignancies is still hard to achieve: while only a subset of patients experience durable benefit from the immune-based therapies, the widely applicable targeted therapies struggle with development of resistances that inevitably occur in most patients, and finally lead to their death. The four articles included in this thesis addressed current questions concerning therapy and carcinogenesis of melanoma and MCC. Moreover, they are discussed in the light of the up-to-date research regarding targeted and immune-based therapies. In article I we demonstrated that besides apoptosis, MAPK pathway inhibition in BRAF-mutated melanoma cells also induces senescence, a permanent cell cycle arrest. These cells may provide a source for relapse, as even permanently arrested cancer cells can contribute to a pro-tumorigenic milieu. To identify molecular factors determining the differential response, we established M14 melanoma cell line derived single cell clones that either undergo cell death or arrest when treated with BRAF/MEK inhibitors. Using these single cell clones, we demonstrated in article IV that downregulation of the pro-apoptotic BH3-only protein BIK via epigenetic silencing is involved in apoptosis deficiency, which can be overcome by HDAC inhibitors. These observations provide a possible explanation for the lack of a complete and durable response to MAPK inhibitor treatment in melanoma patients, and suggest the application of HDAC inhibitors as a complimentary therapy to MAPK pathway inhibition. Concerning MCC, we scrutinized the interactions between the Merkel cell polyomavirus’ (MCV) T antigens (TA) and the tumor suppressors p53 and Rb in article II and III, respectively. In article III, we demonstrated that the cell cycle master regulator Rb is the crucial target of MCV large T (LT), while it - in contrast to other polyomavirus LTs - exhibits much lower affinity to the related proteins p107 and p130. Knockdown of MCV LT led to proliferation arrest in MCC cells, which can be rescued by knockdown of Rb, but not by knockdown of p107 and p130. Contrary to Rb, restriction of p53 in MCC seems to be independent of the MCV TAs, as we demonstrated in article II. In conclusion, the presented thesis has revealed new molecular details, regarding the response of melanoma cells towards an important treatment modality and the mechanisms of viral carcinogenesis in MCC. N2 - Die häufigsten Tumore weltweit sind Neoplasien der Haut; glücklicherweise sind die meisten dieser benigne oder semi-maligne und gut behandelbar. Die beiden aggressivsten und tödlichsten Formen bösartiger Hauttumoren sind das Melanom und das Merkelzell-Karzinom (MCC), welche verantwortlich für über 90% aller durch Hauttumore verursachten Todesfälle sind. Im letzten Jahrzehnt gab es jedoch erstaunliche Fortschritte in der Therapie des malignen Melanoms, was vor allem durch das Aufkommen der zielgerichteten Therapien wie den BRAF oder MEK Inhibitoren und den immunstimulierenden Therapien, welche Checkpoint-Antikörper gegen CTLA-4, PD-1 oder PD-L1 verwenden, bedingt ist. Neueste Studien legen nahe, dass auch MCC Patienten von diesen Checkpoint-Antikörpern profitieren können. In fortgeschrittenen, metastasierten Stadien ist jedoch für beide Malignitäten eine Heilung immer noch sehr schwer erreichbar: nur eine kleine Gruppe der Patienten erreichen einen dauerhaften Nutzen durch die Immuntherapien, während die breit anwendbaren zielgerichteten Therapien mit der Entwicklung von Resistenzen zu kämpfen haben, welche unausweichlich in den meisten Patienten entstehen und letztendlich zu deren Tod führen. Die vier dieser Dissertation beigefügten Publikationen adressierten aktuelle Fragestellungen bezüglich Therapie und Karzinogenese des Melanoms und des MCCs. Des Weiteren werden diese im Licht des heutigen Forschungsstandes diskutiert, im Besonderen mit Blick auf die zielgerichteten und immunbasierten Therapien. In Publikation I zeigten wir, dass Inhibition des MAPK Signalwegs in BRAF-mutierten Melanom-Zellen neben Apoptose auch zu Seneszenz, einem permanenten Zellzyklusarrest, führen kann. Diese Zellen können der Ursprung der Resistenzbildung sein, da auch permanent arretierte Krebszellen zu einem Tumor-fördernden Milieu beitragen können. Um molekulare Faktoren zu identifizieren, die für diese unterschiedliche Behandlungsreaktion ursächlich sind, haben wir Einzelzellklone aus der M14 Melanom-Zelllinie etabliert, welche entweder mit Zelltod oder Arrest auf die BRAF/MEK Inhibitor Behandlung reagieren. Mit Hilfe dieser Klone zeigten wir in Publikation IV, dass die Herunterregulierung des pro-apoptotischen BH3-only Proteins BIK durch einen epigenetischen Mechanismus zur Apoptose-Resistenz dieser Zellen führt, was durch den Einsatz von HDAC-Inhibitoren umgangen werden kann. Diese Beobachtungen bieten eine mögliche Erklärung für das Ausbleiben eines vollständigen und dauerhaften Ansprechens auf die MAPK-Inhibitor Behandlung der Melanom-Patienten, und legen den Einsatz von HDAC-Inhibitoren als komplementäre Therapieoption nahe. Beim MCC haben wir jeweils die Interaktion zwischen den Merkelzell-Polyomavirus (MCV) T Antigenen (TA) und den Tumor-Suppressoren p53 und Rb in Publikation II und III näher betrachtet. In Publikation III haben wir gezeigt, dass das zentrale, Zellzyklus-regulierende Protein Rb das vorrangige Ziel des MCV large T Antigens (LT) ist, während es - im Gegensatz zu anderen Polyomavirus-LTs - viel weniger Affinität zu den verwandten Proteinen p107 und p 130 aufweist. Der Knockdown des MCV LT führte zu Proliferationsarrest in MCC Zellen, welcher durch Knockdown von Rb aufgehoben werden konnte, nicht jedoch durch Knockdown von p107 und p130. Die Restriktion von p53 scheint im Gegensatz zu Rb im MCC unabhängig von den MCV TAs zu sein, wie wir in Publikation II gezeigt haben. Zusammenfassend gibt diese Dissertation Aufschluss über neue molekulare Zusammenhänge bezüglich der Reaktion von Melanom-Zellen gegenüber einer wichtigen Behandlungsmöglichkeit und den Mechanismen der viralen Karzinogenese des MCC. KW - Melanom KW - Apoptosis KW - MAP-Kinase KW - Senescence KW - BRAF inhibition Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155085 ER - TY - THES A1 - König, Julia Maria T1 - Fungal grass endophytes and their dependence on land-use intensity T1 - Gras-Endophyten und ihre Abhängigkeit von der Landnutzungsintensität N2 - Plant-associated fungi can affect the plants‘ interaction with herbivores and other microorganisms. For example, many common forage grasses are infected with Epichloë endophytes. The endophytes systemically colonize the aerial parts of the plants. They produce bioprotective alkaloids that can negatively affect insects and livestock feeding on the grasses, and interact with other fungal species which living from the plants‘ nutrients. Environmental conditions strongly influence Epichloë endophytes. Endophyte-mediated effects on herbivores are more pronounced under increased temperatures and the endophytes may benefit from land use in managed grasslands. Under the framework of the large-scale German project “Biodiversity Exploratories”, I investigated whether infection rates and alkaloid concentrations of Epichloë festucae var. lolii in Lolium perenne (Chapter I) and Epichloë endophytes (E. uncinata, E. siegelii) in Festuca pratensis (Chapter II) depend on land use and season. Further I analysed, whether foliar fungal assemblages of L. perenne are affected by the presence of Epichloë endophytes (Chapter IV). N2 - Mit Pflanzen assoziierte Pilze können die Interaktionen von Pflanzen und Herbivoren, als auch die Kommunikation mit anderen Mikroorganismen beeinflussen. Viele Futter- und Weidegräser sind beispielsweise mit endophytischen Pilzen der Gattung Epichloë infiziert, die die oberirdischen Pflanzenteile der Gräser systemisch besiedeln. Diese Endophyten produzieren bioaktive Alkaloide, die sich negativ auf Fraßfeinde wie Insekten, aber auch Weidetiere, auswirken, und mit anderen pflanzen-assoziierten Pilzarten interagieren. Epichloë Endophyten werden von ihrer äußeren Umwelt stark beeinflusst. So treten die von den Epichloë Endophyten ausgehende Effekte auf Herbivore meist unter erhöhten Temperaturen auf. In agrar-genutzten Grünflächen profitieren die Endophyten möglicherweise auch von der Landnutzung. Im Rahmen des deutschlandweiten Großprojekts „Biodiversitätsexploratorien“ untersuchte ich die Infektionsfrequenzen und Alkaloidkonzentrationen von Epichloë festucae var. lolii in Lolium perenne (Kapitel II) und den Epichloë Endophyten in Festuca pratensis (Kapitel III) in Abhängigkeit von der Landnutzung und Jahreszeit. Des Weiteren untersuchte ich, ob das Auftreten bzw. die Abwesenheit von Epichloë Endophyten einen Einfluss auf die Zusammensetzung der endophytischen Pilzgemeinschaften in Blättern von L. perenne hat (Kapitel IV). KW - Endophytische Pilze KW - Landnutzung KW - fungal endophytes KW - endophytische Pilze KW - land use KW - alkaloids KW - Epichloe KW - Biodiversity Exploratories KW - Alkaloide KW - Biodiversitätsexploratorien KW - Gräser Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163890 ER - TY - THES A1 - Böck, Julia T1 - Differenzielle Methylierungsanalysen mittels verschiedener Next-Generation Sequencing-basierter Techniken: Die Bedeutung von differenziell methylierten Regionen in der menschlichen Hirnevolution und bei der Krebsentstehung T1 - Differential methylation analysis via various next-generation sequencing technologies: The impact of differentially methylated regions on human brain evolution and cancer development N2 - Die Evolution der Primaten zeigt eine Verbindung zwischen der zunehmenden Komplexität des sozialen Verhaltens und der Vergrößerung des humanen Gehirns, insbesondere des präfrontalen Cortex. Deshalb stellt der präfrontale Cortex bezüglich der Evolution des Menschen eine der interessantesten Strukturen im humanen Gehirn dar. Es wird angenommen, dass nicht allein die Größe, sondern auch die Funktion, vor allem das Zusammenspiel von Neuronen und nicht-neuronalen Zellen, wie z.B. Gliazellen, zur Differenzierung des menschlichen Gehirns von dem rezenter Primaten geführt hat. Daraus lässt sich schließen, dass die Gehirnfunktionen über eine ausgeglichene und gut aufeinander abgestimmte transkriptionelle Landschaft kontrolliert werden, die durch ein zugrundeliegendes genetisches und epigentisches Rückgrat organisiert ist. In dieser Studie wurden das Methylierungsprofil neuronaler und nicht-neuronaler Zellen des präfrontalen Cortex (Brodmann-Areal 10) von drei Menschen und drei Schimpansen miteinander verglichen. Die intra- und interspezifischen differenziell methylierten Regionen (DMRs) waren in bestimmten genomischen Regionen angereichert. Intraspezifische Methylierungsunterschiede zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen konnten dreimal häufiger beobachtet werden als interspezifische Unterschiede in den einzelnen Zelltypen. Rund 90% der humanen intraspezifischen DMRs wiesen eine Hypomethylierung in den neuronalen Zellen im Vergleich zu den nicht-neuronalen Zellen auf. In den intraspezifischen DMRs (Mensch und Schimpanse) waren Gene angereichert, die mit verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert sind. Der Vergleich zwischen Menschen und Schimpanse in den neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen zeigte eine Anreicherung von Genen mit human-spezifischer Histonsignatur. In den nicht-neuronalen Zellen konnten mehr interspezifische DMRs (n=666) detektiert werden als in den neuronalen Zellen (n=96). Ungefähr 95% der nicht-neuronalen interspezifischen DMRs waren im Menschen, im Vergleich zum Schimpansen, hypermethyliert. Daraus ergibt sich der Eindruck, dass mehrere hundert der nicht-neuronalen Gene während der humanen Gehirnevolution einer Methylierungswelle unterlagen. Dies führt zu der Annahme, dass der Einfluss dieser Veränderungen in den nicht-neuronalen Zellen auf die Vergößerung des menschlichen Gehirns bisher stark unterschätzt wurde. Die bekannteste genetische Ursache für erblichen Brust- und Eierstockkrebs sind Mutationen in den Tumorsuppressorgenen (TSG) BRCA1 und BRCA2. Dennoch können nur rund 20-25% der familiären Brustkrebserkrankungen über Keimbahnmutationen in BRCA1/BRCA2 erklärt werden, besonders bei Frauen, deren Erkrankung vor dem vierzigsten Lebensjahr auftritt. Epigenetische Veränderungen, die zu einer aberranten Genexpression führen, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese und der Entwicklung einer Brustkrebserkrankung. Es ist bekannt, dass TSG nicht nur durch den Verlust der Heterozygotie (engl. loss of heterozygosity, LOH) oder homozygote Deletionen, sondern auch durch transkriptionelle Stilllegung via DNA-Methylierung inaktiviert werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde überprüft, welchen Einfluss aberrante Methylierungsmuster im Promotorbereich von TSG auf die Brustkrebskarzinogenese und die Expression der Gene haben. Für die Quantifizierung der Epimutationen wurden die Promotorbereiche von acht TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1, RB1) und des estrogene receptor (ESR1) Gens, welches eine Rolle in der Tumorprogression spielt, mittels Deep Bisulfite Amplicon Sequencing (DBAS) analysiert. Es wurden Blutproben von zwei unabhängigen BRCA1/BRCA2-mutationsnegativen Brustkrebs (BC)-Patientenkohorten, sowie von zwei unabhängigen alters-gematchten, gesunden Kontrollkohorten untersucht. BC-Kohorte 1 beinhaltet early-onset (EO) BC-Patientinnen. Kohorte 2 enthält BC-Patientinnen mit einem Risiko von >95% eine heterozygote Mutation in BRCA1/BRCA2 (high-risk, HR) zu tragen. Allele mit >50% methylierten CpGs werden als funktionell relevante Epimutationen erachtet, da bekannt ist, dass TSG über eine Methylierung im Promotorbereich transkriptionell stillgelegt werden. Im Vergleich zu ESR1 (Ø Methylierung, 3%), welches die Methylierungslevel eines durchschnittlichen Promotors wiederspiegelt, zeigten die TSG sehr geringe durchschnittliche Methylierungswerte von weniger als 1%. Zudem waren die durchschnittlichen Epimutationsraten (EMR; <0,0001-0,1%) der TSG sehr gering. Mit der Ausnahme von BRCA1, welches eine erhöhte EMR in der BC-Kohorte verglichen zu den Kontrollen (0,31% gegen 0,06%) zeigte, gab es keine signifikanten Gruppenunterschiede zwischen BC-Patientinnen und Kontrollen. Eine von 36 HR BC-Patientinnen zeigte im Vergleich zu den restlichen Proben eine stark erhöhte EMR von 14,7% in BRCA1. Rund ein Drittel (15/44) der EO BC-Patientinnen wiesen eine erhöhte Rate an Einzel-CpG Fehlern in mehreren TSG auf. Die nachfolgenden Expressionsanalysen ergaben eine erniedrigte Expression vieler TSG je analysierter Patientin. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass epigenetische Veränderungen in normalen Körperzellen als ein möglicher Indikator für einen gestörten Mechanismus, der für die Aufrechterhaltung des unmethylierten Status und der daraus resultierenden normalen Genexpression zuständig ist, angesehen werden können. Dies kann mit einem erhöhten BC-Risiko assoziiert werden. N2 - The increasing complexity of social behavior along the ascending scale of primates, peaking in human spoken language, is accompanied by an impressive expansion of the human brain, particularly of the prefrontal cortex. Hence, prefrontal cortex appears to be one of the most interesting structures of the human brain, at least from an evolutionary perspective. But not only size but also function, in particular the interplay of neurons and glia cells, are suspected to distinguish the human brain from great apes and other primates. It is plausible to assume that proper brain function is controlled by a coordinated and well balanced transcriptional landscape, orchestrated by the underlying genetic and epigenetic backbone. Using reduced representation bisulfite sequencing (RRBS), we have compared the methylation profiles of neuronal and non-neuronal cells from three human and three chimpanzee prefrontal cortices (Brodmann area 10). Bioinformatic analyses revealed a genome-wide significant enrichment of differentially methylated regions (DMRs) in specific genomic areas. Intraspecific methylation differences between neuronal and non-neuronal cells are about three times more abundant than the interspecific methylation differences. More than 90% of human intraspecific DMRs were hypomethylated in neuronal cells, compared to non-neuronal cells. Intraspecific DMRs showed enrichment of genes associated with different neuropsychiatric disorders. Comparison between humans and chimpanzees yielded enrichments of genes showing human-specific brain histon modification. Interspecific DMRs were much more frequent in non-neuronal cells (n=666) than in neurons (n=96). Approximately 95% of interspecific DMRs in non-neuronal cells were hypermethylated in humans, compared to chimpanzees. It can be assumed that several hundreds of non-neuronal genes underwent a wave of methylation during human brain evolution. The impact of these changes in non-neuronal cells on the extension of the human brain may have been largely underestimated so far. The most prominent genetic cause for inherited breast and ovarian cancer are mutations in the BRCA1 and BRCA2 tumor suppressor genes (TSG). However, BRCA1/BRCA2 germline mutations explain less than 50% of all familial breast cancers, even for women diagnosed before the age of 40 years. It has also been reported that epigenetic abnormalities, which contribute to changes in gene expression, play an important role in carcinogenesis and breast cancer development. To rapidly quantify the number of epimutations in different TSG, in both a qualitative and quantitative manner, we have developed a deep bisulfite sequencing assay targeting the promoter regions of eight TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1 and RB1) and the estrogene receptor (ESR1) gene, which plays a role in tumor progression. We have analyzed blood samples of two independent BRCA1/BRCA2-mutation negative breast cancer (BC) cohorts and two independent age-matched healthy control cohorts. BC cohort 1 represents patients with early-onset BC and BC cohort 2 patients with a high risk to carry a heterozygous mutation. Since it is well known that tumor suppressor genes are transcriptionally silenced by promoter methylation, alleles with >50% methylated CpGs are considered as functionally relevant epimutations. Compared to ESR1, which is representative for an average promoter, TSG exhibited very low (<1%) average methylation levels and also very low mean epimutation rates (EMR; <0.0001% to 0.1%). With exception of BRCA1, which showed an increased EMR in BC (0.31% vs. 0.06%), there was no significant difference between patients and controls detectable. One of 36 HR BC patients showed a dramatically increased EMR (14.7%) in BRCA1. We identified in approximately one third (15 of 44) of EO BC patients increased rates of single CpG methylation errors in multiple TSG. Both EO and HR BC patients exhibited global underexpression of blood TSG. We propose that epigenetic abnormalities in normal body cells are indicative of disturbed mechanisms for maintaining low methylation and appropriate expression levels and may be associated with an increased BC risk. KW - Epigenetik KW - Gehirn KW - Brustkrebs KW - differenzielle Methylierung KW - familiärer Brustkrebs KW - Next-Generation Sequencing KW - Methylierung KW - Evolution KW - menschliche Hirnevolution Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164220 ER - TY - THES A1 - Aufmkolk, Sarah T1 - Super-Resolution Microscopy of Synaptic Proteins T1 - Hochauflösende Mikroskopie von Synaptischen Proteinen N2 - The interaction of synaptic proteins orchestrate the function of one of the most complex organs, the brain. The multitude of molecular elements influencing neurological correlations makes imaging processes complicated since conventional fluorescence microscopy methods are unable to resolve structures beyond the diffraction-limit. The implementation of super-resolution fluorescence microscopy into the field of neuroscience allows the visualisation of the fine details of neural connectivity. The key element of my thesis is the super-resolution technique dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) and its optimisation as a multi-colour approach. Capturing more than one target, I aim to unravel the distribution of synaptic proteins with nanometer precision and set them into a structural and quantitative context with one another. Therefore dSTORM specific protocols are optimized to serve the peculiarities of particular neural samples. In one project the brain derived neurotrophic factor (BDNF) is investigated in primary, hippocampal neurons. With a precision beyond 15 nm, preand post-synaptic sites can be identified by staining the active zone proteins bassoon and homer. As a result, hallmarks of mature synapses can be exhibited. The single molecule sensitivity of dSTORM enables the measurement of endogenous BDNF and locates BDNF granules aligned with glutamatergic pre-synapses. This data proofs that hippocampal neurons are capable of enriching BDNF within the mature glutamatergic pre-synapse, possibly influencing synaptic plasticity. The distribution of the metabotropic glutamate receptor mGlu4 is investigated in physiological brain slices enabling the analysis of the receptor in its natural environment. With dual-colour dSTORM, the spatial arrangement of the mGlu4 receptor in the pre-synaptic sites of parallel fibres in the molecular layer of the mouse cerebellum is visualized, as well as a four to six-fold increase in the density of the receptor in the active zone compared to the nearby environment. Prior functional measurements show that metabotropic glutamate receptors influence voltage-gated calcium channels and proteins that are involved in synaptic vesicle priming. Corresponding dSTORM data indeed suggests that a subset of the mGlu4 receptor is correlated with the voltage-gated calcium channel Cav2.1 on distances around 60 nm. These results are based on the improvement of the direct analysis of localisation data. Tools like coordinated based correlation analysis and nearest neighbour analysis of clusters centroids are used complementary to map protein connections of the synapse. Limits and possible improvements of these tools are discussed to foster the quantitative analysis of single molecule localisation microscopy data. Performing super-resolution microscopy on complex samples like brain slices benefits from a maximised field of view in combination with the visualisation of more than two targets to set the protein of interest in a cellular context. This challenge served as a motivation to establish a workflow for correlated structured illumination microscopy (SIM) and dSTORM. The development of the visualisation software coSIdSTORM promotes the combination of these powerful super-resolution techniques even on separated setups. As an example, synapses in the cerebellum that are affiliated to the parallel fibres and the dendrites of the Purkinje cells are identified by SIM and the protein bassoon of those pre-synapses is visualised threedimensionally with nanoscopic precision by dSTORM. In this work I placed emphasis on the improvement of multi-colour super-resolution imaging and its analysing tools to enable the investigation of synaptic proteins. The unravelling of the structural arrangement of investigated proteins supports the building of a synapse model and therefore helps to understand the relation between structure and function in neural transmission processes. N2 - Das Zusammenspiel von synaptischen Proteinen organisiert präzise die Funktion eines der komplexesten Organe, dem Gehirn. Die Vielfalt der molekularen Bestandteile, die diese neurologischen Beziehungen beeinflussen, verkomplizieren den Bildgebungsprozess, da die konventionellen Fluoreszenzmikroskopiemethoden Strukturen, die kleiner sind als das Beugungslimit, nicht auflösen können. Die Implementierung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in das Gebiet der Neurowissenschaften ermöglicht die Visualisierung feiner Details neurologischer Verbindungen. Die hochauflösende Mikroskopietechnik dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) und dessen Optimierung als Mehrfarbenanwendung sind Schlüsselelemente meiner Doktorarbeit. Mit der Möglichkeit mehr als ein Protein zu messen, ist es mein Ziel die Verteilung synaptischer Proteine mit nanometer Genauigkeit zu entschlüsseln und diese in ein strukturelles und quantitativ Verhältnis zueinander zu setzen. Aus diesem Grund wurden dSTORM spezifische Protokolle den Besonderheiten der jeweiligen neuronalen Proben angepasst und optimiert. In einem Projekt wird der neurotrophe Faktor BDNF (brain derived neurotrophic factor) in primären hippocampalen Neuronen untersucht. Mit einer Auflösungspräzision von unter 15 nm kann durch eine Färbung der Proteine Bassoon und Homer in der aktiven Zone die prä- und postsynaptische Seite identifiziert werden. Daraus resultierend können Kennzeichen für vollentwickelte Synapsen erfasst werden. Die Einzelmolekülsensitivität von dSTORM ermöglicht erstmalig die Messung von endogenem BDNF und zeigt, dass die BDNF Gruppierungen entlang von glutamatergen Präsynapsen verteilt sind. Diese Daten beweisen, dass hippocampale Neuronen die Möglichkeit haben, BDNF in der vollausgebildeten glutamatergen Präsynapse anzureichern und somit möglicherweise synaptische Plastizität beeinflussen. Die Verteilung des metabotropen Glutamatrezeptors mGlu4 wird in physiologischen Gehirnschnitten untersucht. Das ermöglicht den Rezeptor in seiner natürlichen Umgebung zu analysieren. Mit Zweifarben-dSTORM Messungen wird das räumliche Arrangement der mGlu4 Rezeptoren in der Präsynapse der parallelen Fasern der molekularen Schicht des Mauskleinhirns visualisiert und eine vier- bis sechsfache erhöhte Dichte des Rezeptors in der aktiven Zone, verglichen mit dem näheren Umfeld, aufgezeigt. Vorausgegangende funktionale Messungen zeigen, dass metabotrope Glutamatrezeptoren spannungsgesteuerte Calciumkanäle und Proteine, die in synaptische Vesikelgrundierung involviert sind, beeinflussen. Entsprechende dSTORM Daten deuten darauf hin, dass ein Teil der mGlu4 Rezeptoren mit dem spannungsgesteuerten Calciumkanal Cav2.1 auf einer Distanz von circa 60 nm korreliert ist. Diese Ergebnisse basieren auf der Verbesserung der direkten Analyse der Lokalisationsdatensätze. Werkzeuge, wie die Koordinaten basierte Korrelationsanalyse und die Nächste Nachbaranalyse von Clusterschwerpunkten werden sich ergänzend benutzt, um ein umfassendes Bild von Proteinverbindungen in der Synapse zu erzeugen. Die Grenzen und die Verbesserungsmöglichkeiten dieser Werkzeuge werden diskutiert, um die quantitative Analyse von Einzelmoleküldatensätzen voranzubringen. Die Durchführung von hochauflösender Mikroskopie an komplexen Proben, wie Gehirnschnitten, wird begünstigt durch die Maximierung der Aufnahmefläche in Kombination mit der Möglichkeit mehr als zwei Zielstrukturen zu visualisieren, um somit das Protein von primären Interesse in einen zellulären Zusammenhang zu setzen. Diese Herausforderung hat als Motivation gedient, ein Messprotokoll für korrelierte Strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) und dSTORM zu etablieren. Die Entwicklung der Visualisierungssoftware coSIdSTORM erleichtert die Kombination dieser beiden leistungsstarken, hochauflösenden Techniken, sogar wenn diese auf getrennten Mikroskopieaufbauten umgesetzt werden. Als ein Beispiel werden Synapsen, die zwischen den parallelen Fasern in der molekularen Schicht des Cerebellums und den Purkinje-Zellen ausgebildet werden, mit SIM identifiziert und das Protein Bassoon in diesen Präsynapsen wird mit einer nanometergenauen Präzision drei-dimensional mit dSTORM Messungen visualisiert. In meiner Arbeit habe ich den Fokus auf die Weiterentwickelung von hochauflösender Mehrfarbenmikroskopie und die damit verbundenen analytischen Werkzeuge gelegt, sodass die Untersuchung von synaptischen Proteinen ermöglicht wird. Die Herausarbeitung des strukturellen Arrangements der untersuchten synaptischen Proteine unterstützt den Aufbau eines Models der Synapse und erweitert somit das Verständnis des Zusammenhangs von Struktur und Funktion in neuronalen Übertragungsvorgängen. KW - Hochauflösende Mikroskopie KW - correlative methods KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Synaptische Proteine KW - Korrelative Mikroskopie KW - dSTORM KW - SIM KW - fluorescence KW - super-resolution microscopy KW - localization microscopy KW - two-color microscopy KW - synapse KW - synaptic proteins Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151976 ER -