TY - THES A1 - Adelfinger, Marion T1 - Präklinische Verwendung verschiedener onkolytischer Vaccinia-Viren zur Therapie von Human- und Hundetumoren T1 - Preclinical application of different oncolytic vaccinia viruses in human and canine tumor therapy N2 - Nach Einschätzung der Weltgesundheitsorganisation WHO wird Krebs im Jahr 2013 die weltweit häufigste Todesursache bei Menschen und Haustieren sein. Diese Situation erfordert die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze. Hauptziel einer Tumortherapie ist es, sowohl den Primärtumor als auch die Metastasen möglichst vollständig zu entfernen. Dabei wird nach Methoden gesucht, die im Gegensatz zu den meisten gegenwärtigen therapeutischen Einsätzen, wie der chirurgischen Entfernung bösartiger Neubildungen, Chemotherapie und Strahlentherapie, selektiv die bösartigen Zellen erkennen und zerstören können. Eine faszinierende Möglichkeit in dieser Hinsicht ist die Verwendung von onkolytischen Viren, die die Fähigkeit besitzen, sich selektiv sowohl in Primärtumoren als auch in Metastasen anzusiedeln und die Krebszellen dort zu zerstören. Das Konzept, dass Viren nützlich für die Bekämpfung von Krebs sein könnten, ist nicht neu. Allerdings konnte erst in den letzten Jahren durch zahlreiche Studien bestätigt werden, dass verschiedene Viren in der Lage sind, eine signifikante Antitumorwirkung in vivo auszuüben. Zu den erfolgversprechenden onkolytischen Viren zählen insbesondere Adenovirus, Herpes simplex Virus, Reovirus und Vaccinia-Virus, die sich bereits in Phase III der klinischen Studien befinden oder kurz davor sind. Die therapeutische Nutzung von tumorspezifischen onkolytischen Viren beim Menschen hat bereits begonnen. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden verschiedene Aspekte der Wirkungsweise von Vaccinia-Virus-Stämmen bei der Therapie verschiedener Tumore aus Mensch und Hund im Xenotransplantat-Mausmodell bearbeitet: die Onkolyse der Krebszellen und Inhibition des Tumorwachstums sowie die Effekte der Virusinfektion auf das Tumormikromilieu und die Mitwirkung des angeborenen Immunsystems bei der Virotherapie. Das Tumormikromilieu (Stroma) setzt sich aus einer Vielzahl verschiedener Zellen und Komponenten der extrazellulären Matrix zusammen. Die Krebszellen bilden unter anderem mit Endothelzellen des Blut- und Lymphsystems und verschiedenen Immunzellen eine komplexe Organ-ähnliche Struktur. Weitere wichtige Bestandteile des Stromas sind Wachstumsfaktoren, Chemokine und Zytokine und die Tumorvaskulatur. Diese ist durch zahlreiche strukturelle und funktionelle Abnormalitäten charakterisiert, wodurch die Effektivität von Strahlen- und Chemotherapie herabgesetzt wird. Weiterhin ist das Tumormikromilieu durch seine Ähnlichkeit mit einer chronischen Entzündungsreaktion gekennzeichnet und wirkt immunsupprimierend auf rekrutierte Leukozyten, die wiederum die Inflammation verstärken und die Angiogenese und das Tumorwachstum weiter fördern. Aufgrund dieser vielen Komponenten ist die Zusammensetzung jedes Tumors einzigartig, weswegen Standardtherapien häufig nicht zu einer Heilung führen. Die Wirkung der Viren bei der Virotherapie beruht vermutlich auf 4 Mechanismen, die einzeln oder in Kombination auftreten können: die direkte Onkolyse der Krebszellen, die Zerstörung des Tumorblutgefäßsystems, die Aktivierung des Immunsystems des Wirts und die Suppression der microRNA-Expression des Wirtes. Zusätzlich kann die Expression therapeutischer Gene die onkolytische Wirkung verstärken. Zum Nachweis der Onkolyse der Krebszellen und Inhibition des Tumorwachstums wurde zuerst das Virus GLV-1h68 in einem autologen humanen Melanomzellpaar, 888-MEL und 1936-MEL, eingesetzt. Das GLV-1h68-Virus wurde auf Basis des Wildtyp Vaccinia-Virus LIVP durch die Insertion von 3 Expressionskassetten in den drei Genloci F14.5L, J2R und A56 genetisch konstruiert. 888-MEL, eine zu einem frühen Zeitpunkt der Krebserkrankung aus einer Metastase isolierte Zelllinie, zeigt nach Infektion mit GLV-1h68 im Mausmodell Tumornekrose („Responder“), während 1936-MEL aus einer späten Metastasierungsphase kaum mit Onkolyse auf eine Virusinfektion reagiert („Poor-Responder“). Die onkolytische Wirkung konnte mittels Durchflusszytometrie in Tumoren beider Zelllinien zu einem frühen Zeitpunkt nach Virusinfektion nachgewiesen werden. In 888-MEL-Tumoren wurde hierbei eine große Zahl infizierter und toter Zellen nach Virusinfektion gefunden. Gleichzeitig wurde eine hohe Zahl an Immunzellen detektiert, die nach Virusinfektion reduziert war. In den schwächer reagierenden 1936-MEL-Tumoren konnte eine Onkolyse bei Infektion mit höherer Virusmenge und zu einem früheren Zeitpunkt demonstriert werden, wodurch mehr Zellen infiziert wurden. Zusätzlich wurde eine Steigerung der nur in geringer Zahl vorhandenen Immunzellen nachgewiesen. Trotz des unterschiedlichen Tumormikromilieus konnte somit ein onkolytischer Effekt in beiden Tumormodellen erzielt werden. ... N2 - The cancer mortality rate is increasing steadily in man and pet animals and it is estimated by the World Health Organisation (WHO) to be number one cause of deaths in 2013. This situation raises the need for developing new therapeutic approaches whereby the main goal of tumor therapy always is the complete elimination of primary tumor and metastases. In contrast to most current therapies, like surgical resection of malignant neoplasia, chemotherapy and radiation, the new cancer treatments should selectively recognize and destroy malignant cells. The application of oncolytic viruses offers fascinating opportunities, because of their ability to selectively colonize primary tumors and metastases and directly destroy cancer cells. The concept of fighting cancer with viruses is not new, but the significant anti-tumoral effect of different viruses in vivo was demonstrated by several studies in the last few years. Promising oncolytic viruses are adenovirus, Herpes simplex virus, reovirus and vaccinia virus. These viruses are currently in or entering phase III clinical trials but the therapeutic use of tumor specific oncolytic viruses for humans has already started. In this work, different aspects of the effects of vaccinia virus strains during therapy of canine and human tumors in mouse xenograft models were analyzed: oncolysis of cancer cells, inhibition of tumor growth, influence of virus infection on the tumor microenvironment and participation of the innate immunity in virotherapy. The tumor microenvironment (stroma) is composed of many different cells and components of the extracellular matrix. Cancer cells form structures similar to organs including endothelial cells of the blood and lymph system, different immune cells and many other cell types. Other important components of the stroma are growth factors, chemokines and cytokines as well as the tumor vasculature that is characterized by numerous structural and functional abnormalities which decrease the efficacy of radiation and chemotherapy. Another hallmark of the tumor microenvironment is its similarity to chronic inflammation and its immunosuppressive effect on recruited leukocytes which in turn increase the inflammation and angiogenesis and promote tumor growth. Due to the many different components the composition of each tumor is unique and that is why standard therapies often do not result in cure. The effects of the viruses in the virotherapy are propably based on four mechanisms working alone or in combination: direct oncolysis of cancer cells, destruction of tumor vasculature, activation of host immune system and suppression of host microRNA expression. Additionally the expression of therapeutic genes can increase the oncolytic effect of the viruses. To analyze the oncolysis of cancer cells and the inhibition of tumor growth first the GLV-1h68 virus was used in an autologous pair of human melanoma 888-MEL and 1936-MEL. GLV-1h68 was genetically constructed on the basis of wild-type vaccinia virus LIVP by insertion of 3 expression cassettes into F14.5L, J2R and A56 gene loci. 888-MEL was isolated from metastases early during cancer disease and exhibits tumor necrosis after infection with GLV-1h68 in mouse xenograft model (responder) whereas 1936-MEL which was isolated in the late phase of metastases formation hardly shows oncolysis following virus treatment (poor-responder). The oncolytic effect was demonstrated by flow cytometric analysis of tumors of both cell lines at an early time after virus infection. In 888-MEL tumors high numbers of infected and dead cells were found after virus infection. Simultaneously, a high number of immune cells were detected which was reduced after infection. In the lower responding 1936-MEL tumors oncolysis was only observed after infection with higher amount of virus at an earlier time whereby the number of infected cells increased. Additionally, the low number of immune cells increased after infection. Despite the different tumor microenvironment an oncolytic effect was achieved in both tumor models. ... KW - Vaccinia-Virus KW - Tumortherapie KW - Tumorimmunologie KW - Hundetumor KW - onkolytisches Virus KW - vaccinia virus KW - tumor therapy KW - tumor immunology KW - canine tumor KW - oncolytic virus KW - Tumor KW - Therapie KW - Onkolyse Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70688 ER - TY - JOUR A1 - Adelfinger, Marion A1 - Bessler, Simon A1 - Cecil, Alexander A1 - Langbein-Laugwitz, Johanna A1 - Frentzen, Alexa A1 - Gentschev, Ivaylo A1 - Szalay, Aladar A. T1 - Preclinical Testing Oncolytic Vaccinia Virus Strain GLV-5b451 Expressing an Anti-VEGF Single-Chain Antibody for Canine Cancer Therapy JF - Viruses N2 - Virotherapy on the basis of oncolytic vaccinia virus (VACV) strains is a novel approach for canine cancer therapy. Here we describe, for the first time, the characterization and the use of VACV strain GLV-5b451 expressing the anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) single-chain antibody (scAb) GLAF-2 as therapeutic agent against different canine cancers. Cell culture data demonstrated that GLV-5b451 efficiently infected and destroyed all four tested canine cancer cell lines including: mammary carcinoma (MTH52c), mammary adenoma (ZMTH3), prostate carcinoma (CT1258), and soft tissue sarcoma (STSA-1). The GLV-5b451 virus-mediated production of GLAF-2 antibody was observed in all four cancer cell lines. In addition, this antibody specifically recognized canine VEGF. Finally, in canine soft tissue sarcoma (CSTS) xenografted mice, a single systemic administration of GLV-5b451 was found to be safe and led to anti-tumor effects resulting in the significant reduction and substantial long-term inhibition of tumor growth. A CD31-based immuno-staining showed significantly decreased neo-angiogenesis in GLV-5b451-treated tumors compared to the controls. In summary, these findings indicate that GLV-5b451 has potential for use as a therapeutic agent in the treatment of CSTS. KW - canine cancer therapy KW - canine soft tissue sarcoma (CSTS) KW - oncolytic virus KW - cancer KW - canine cancer cell lines KW - antibody production KW - angiogenesis Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125705 VL - 7 ER - TY - THES A1 - Amelingmeier, Florian T1 - Identifizierung und Untersuchung TOP-mRNA - bindender Faktoren T1 - Identification and examination of TOP mRNA binding factors N2 - Im Zellkern eukaryotischer Zellen werden Gene in mRNAs transkribiert, welche umfangreich prozessiert und aus dem Zellkern exportiert werden. Im Zytoplasma erfolgt die Translation der mRNAs in Proteine, ein Prozess, welcher viel Energie benötigt und daher mittels vielfältiger Mechanismen streng reguliert wird. Ein Beispiel hierfür stellt die Klasse der TOP-mRNAs dar, eine RNA-Spezies, welche hauptsächlich Transkripte von Genen umfasst, die selbst in die Translation involviert sind. Die prominentesten Vertreter dieser Klasse sind die Proteine der kleinen und großen ribosomalen Untereinheiten. TOP-mRNAs zeichnen sich durch ein gemeinsames Sequenz-Motiv am Anfang Ihrer 5’-UTR aus, welches aus einem Pyrimidinstrang besteht und unmittelbar nach dem Cap mit einem Cytosin beginnt. Dieses allen TOP-RNAs gemeinsame Motiv ermöglicht die zeitgleiche Translationskontrolle dieser RNA-Klasse. So kann die Translation der TOP-mRNAs unter Stressbedingungen wie z.B. Nährstoffmangel koordiniert inhibiert werden, wodurch Energie eingespart wird. Bereits lange wird nach einem Regulator gesucht, der an dieses TOP-Motiv bindet und die koordinierte Regulation ermöglicht. Man kann sich hier einen Inhibitor oder auch einen Aktivator vorstellen. Verschiedene Proteine wurden bereits in Erwägung gezogen. In dieser Arbeit wurde das Protein TIAR mittels Massenspektrometrie als TOP-interagierender Faktor identifiziert und dessen Bindungseigenschaften mit dem TOP-Motiv durch Shift Assays untersucht. Hierbei konnten Minimalkonstrukte verschiedener Organismen sowie RNA-TOP – Sequenzen identifiziert werden, welche sich für Strukturanalysen eignen würden. Als weiterer TOP-interagierender Faktor wurde über verschiedene sequenzielle Reinigungsschritte das Protein 14-3-3ε identifiziert. Weiterhin wurden die TOP-Motiv-bindenden Proteine LARP1 und LARP7 auf Ihre Bindungseigenschaften mit Ihren Zielsequenzen untersucht. Während gezeigt werden konnte, dass LARP1 einen inhibierenden Einfluss auf TOP-RNAs hat, wurde in weiteren Shift-Assays die Bindungseigenschaften von LARP7 mit 7SK untersucht, wobei ebenfalls ein minimales LARP7–Konstrukt sowie 7SK-Konstrukte für Strukturanalysen identifiziert werden konnten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass verschiedene Substanzen wie tRNA und Arginin einen starken Einfluss auf die LARP7-7SK – Interaktion ausüben, welcher in weiteren Studien berücksichtigt werden sollte. N2 - In the nucleus of eucaryotic cells, genes are transcribed into mRNA which are heavily processed and exported into the cytoplasm. There they are translated into proteins, a process requiring large amounts of energy so this process is strongly regulated. One example is the class of TOP RNAs consisting mainly of transcripts encoding for proteins involved in translation. Some well-known examples include the proteins of the large and small ribosomal subunits. TOP RNAs share a common motif at the start of their 5’ UTR comprising a sequence entirely made of Pyrimidines immediately following the cap. This motif common to all TOP RNAs enables translational control of this class of RNAs in a timely coordinated manner. In this way, during conditions of stress like nutrient starvation, translation of TOP RNAs can be inhibited to save energy. The search for a regulator which binds to the TOP motif and enables coordinated regulation started long ago. In principle the regulator could activate or inhibit translation. Different proteins have been considered to be the regulator so far. In this thesis the protein TIAR was identified as TOP interacting factor using mass spectrometry. Its binding properties regarding the TOP motif have been evaluated using EMSA. RNA and proteins of different organisms were evaluated to identify minimal binding partner constructs for further structural analysis. Using different sequential purification approaches, the 14-3-3ε protein was also identified as TOP binding factor. Furthermore, the TOP binding proteins LARP1 and LARP7 and their target RNA sequences have been evaluated in regard to their binding properties. It could be shown that LARP1 has an inhibiting effect on translation of TOP RNAs. Using EMSA, minimal binding constructs of LARP7 and 7SK could be established which can be considered for further structural analysis. Also, it could be shown that certain substances like tRNA and Arginine influence the interaction of LARP7 and 7SK, an observation which should be considered in further experiments. KW - Proteinbiosynthese KW - Messenger-RNS KW - Genexpression KW - Translationskontrolle KW - Terminal Oligopyrimidine Tract KW - Translationsinitiation KW - TIAR KW - TOP mRNA Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289231 ER - TY - JOUR A1 - Ascierto, Maria Libera A1 - Worschech, Andrea A1 - Yu, Zhiya A1 - Adams, Sharon A1 - Reinboth, Jennifer A1 - Chen, Nanhai G A1 - Pos, Zoltan A1 - Roychoudhuri, Rahul A1 - Di Pasquale, Giovanni A1 - Bedognetti, Davide A1 - Uccellini, Lorenzo A1 - Rossano, Fabio A1 - Ascierto, Paolo A A1 - Stroncek, David F A1 - Restifo, Nicholas P A1 - Wang, Ena A1 - Szalay, Aladar A A1 - Marincola, Francesco M T1 - Permissivity of the NCI-60 cancer cell lines to oncolytic Vaccinia Virus GLV-1h68 JF - BMC Cancer N2 - Background: Oncolytic viral therapy represents an alternative therapeutic strategy for the treatment of cancer. We previously described GLV-1h68, a modified Vaccinia Virus with exclusive tropism for tumor cells, and we observed a cell line-specific relationship between the ability of GLV-1h68 to replicate in vitro and its ability to colonize and eliminate tumor in vivo. Methods: In the current study we surveyed the in vitro permissivity to GLV-1h68 replication of the NCI-60 panel of cell lines. Selected cell lines were also tested for permissivity to another Vaccinia Virus and a vesicular stomatitis virus (VSV) strain. In order to identify correlates of permissity to viral infection, we measured transcriptional profiles of the cell lines prior infection. Results: We observed highly heterogeneous permissivity to VACV infection amongst the cell lines. The heterogeneity of permissivity was independent of tissue with the exception of B cell derivation. Cell lines were also tested for permissivity to another Vaccinia Virus and a vesicular stomatitis virus (VSV) strain and a significant correlation was found suggesting a common permissive phenotype. While no clear transcriptional pattern could be identified as predictor of permissivity to infection, some associations were observed suggesting multifactorial basis permissivity to viral infection. Conclusions: Our findings have implications for the design of oncolytic therapies for cancer and offer insights into the nature of permissivity of tumor cells to viral infection. KW - gene-therapy KW - adenovirus KW - receptor KW - identification KW - infection KW - CD9 KW - panel Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141503 VL - 11 IS - 451 ER - TY - THES A1 - Auth, Tanja T1 - Funktionelle Analyse der Interaktion und Lokalisation von Replikationsfaktoren und replikationsrelevanten Proteinen in Mauszellen T1 - Functional analysis of the interaction and localization of replicationfactors and replicationrelevant proteins in murine cells N2 - Zeil dieser Arbeit war die Identifikation von Proteinen, die mit Bestandteilen des für die DNA-Replikation essentiellen präreplikativen Komplexes in der Maus wechselwirken. Hierbei konnten Interkationen des Heterochromatin Proteins 1a mit den Replikationsfaktoren ORC1, ORC2 und CDC6 sowohl in Two Hybrid-Studien als auch in Immunpräzipitationen gezeigt werden. Darüberhinaus konnten signifikante Kolokalisationen dieser Proteine mit HP1a an heterochromatischen Regionen in murinen NIH3T3-Zellen nachgewiesen werden. Ebenfalls konnte hier erstmals eine Lokalisation von HP1a am Centrosom demonstriert werden. Ein siRNA-vermittelter Knock Down von HP1a zeigte jedoch keinen direkten Einfluß auf die Replikation. Es konnte hingegen gezeigt werden, daß ein Knock Down von HP1a in signifikatnen Defekten in der Cytokinese und einer deutlich verlangsamten Zellproliferation resultiert. So konnten häufig multinukleäre Zellen und eine Arretierung in der G1-Phase beobachtet werden. Weiterhin wurde der Einfluß der Phosphorylierung von HP1a durch die Casein Kinase II mithilfe von Phosphorylierungsmutanten untersucht. Im Gegensatz zu Drosophila-Zellen zeigten sich in murinen Zellen jedoch keine Auswirkungen dieser Mutationen auf die Lokalisation von HP1a an Heterochromatin. Wieterhin konnten Interaktionen des Replikationsinhibitors Geminin mit den Replikationsproteinen ORC1, ORC2 und CDC7 sowohl im Two Hybrid-System als auch in Immunpräzipitationen gezeigt werden, die unterschiedliche Zellzyklusabhängigkeiten aufwiesen. In murinen NIH3T3-Zellen zeigte eine Knock Down von Geminin jedoch im Gegensatz zu anderen Zellinien keinen Einfluß auf die Replikation. In weiteren Teilen dieser Arbeit konnten Interaktionen des Retinoblastoma Proteins mit ORC2 und MCM7 sowohl in Two Hybrid- als auch in Immunpräzipitations-Experimenten gezeigt werden. Darüberhinaus wies Pescadillo Interaktionen mit den Replikationsproteinen ORC2, ORC6, MCM2, MCM3, MCM6 und CDC45 im Two Hybrid-System und Interaktionen mit MCM2 und MCM3 in Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten auf. Eine Kolokalisation von Pescadillo und ORC6 in den Nukleoli läßt auf eine Funktion beider Proteinen bei der Ribosomen Biogenese schließen. Es konnten ebenfalls Interaktionen der Untereinheit E1 des humanen Papillomavirus Subtyp 11 mit den Replikationsfaktoren ORC2,3,4,5,6, MCM2, MCM3, MCM6, CDC6, CDC7, CDT1, HP1a, Rb und Pescadillo im Two Hybrid-System beobachtet werden. N2 - The identification of proteins, which interact with members of the for the initiation of DNA replication necessary prereplicative complex in murine cells was of greatest interest for this work. Thereby, interactions of the heterochromatin protein 1a with the replication proteins ORC1, ORC2 and CDC6 were demonstrated in the two-hybrid system as well as in immunoprecipitations. Furthermore, significant colocalisation of these proteins with HP1a could be observed at heterochromatic regions in murine NIH3T3 cells. In NIH3T3 cells HP1a is also localisized on the centrosome. Knock down of HP1a by siRNAs showed however no direct influence on DNA- replication. Though, a knock down of HP1a resulted in significant defects in cytokinesis and reduced cell proliferation. Thus, frequntly cells with several nuclei and an arrest of the cells in G1 phase could be observed. Furthermore, the influence od phosphorylation of HP1a by Casein kinase II was analysed with phosphorylationssite In contrast to Drosophila cells there were no differences of the localization of Hp1a on heterochromatin in murine NIH3T3 cells. Also interactions of the replication inhibitor Geminin with the replication factors ORC1, ORC2 und CDC7 were found in two-hybrid analyses as well as in immunoprecipitations, which showed several cell cycle dependence. However, in murine NIH3T3 cells a knock down of Geminin showed in contrast to several other cell lines no influences on DNA replication. In a furthe part of this work interactions of the Retinoblastoma protein with ORC2 and MCM7 were observed in two-hybrid experiments as well as in immunoprecipitations.Furthermore, Pescadillo showed interaction with the replication proteins ORC2, ORC6, MCM2, MCM3, MCM6 and CDC45 in the two-hybrid system as well as interactions with MCM2 and MCM3 in bioluminescence resonance energytransfer experiments. The coloalization of Pescadillo and ORC6 in nucleoli points to a function of these proteins in ribosome biogenesis. In a further part of this work there were also interactions of the protein E1 of the human Papilloma virus 11 with the replication proteins ORC2,3,4,5,6, MCM2, MCM3, MCM6, CDC6, CDC7, CDT1, HP1a, Rb and Pescadillo observed in two-hybrid screenings. KW - Maus KW - Replikation KW - Proteine KW - Replikation KW - Heterochromatin Protein 1 KW - Geminin KW - Retinoblastoma Protein KW - Pescadillo KW - replication KW - heterochromatin protein 1 KW - Geminin KW - retinobalstoma protein KW - Pescadillo Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13082 ER - TY - THES A1 - Bayer, Tanja T1 - Toxicity and biotransformation of 1,1,1,3,3-Pentafluoropropane, 3,3,3-Trifluoropropionic acid and 1,1,1,3-Tetrachloropropane T1 - Toxizität und Biotransformation von 1,1,1,3,3-Pentafluorpropan, 3,3,3-Trifluorpropionsäure und 1,1,1,3-Tetrachlorpropan N2 - The biotransformation of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane was investigated in rats and in in vitro systems. First, the metabolites were identified in vivo using GC/MS and 19F NMR analysis. The main metabolite was identified as trifluoroacetic acid, the minor metabolite as 3,3,3-trifluoropropionic acid and as a cleavage product, inorganic fluoride was found. As the in vitro system, liver microsomes from rat and human samples and rat liver homogenates were used. Trifluoroacetic acid and 3,3,3 trifluoropropionic acid were confirmed in vitro as metabolic intermediates, following biotransformation of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane by the cytochrome P-450-system. Studies, designed for clarifying the cardiotoxicity of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane were driven by the hypothesis that 3,3,3-trifluoropropionic acid is the toxic agent. This was based on the lethal toxicity, which was observed in previous in vivo experiments. In addition, the point of its structural similarity to toxic agents as for example monofluoroacetic acid or of possible metabolic intermediates like difluoroacrylic acid with known toxicity were considered to support this assumption. However, trifluoroacetic acid was neglected as the sought-after toxic agent because of its different toxic effects, known from literature. Investigations on the biotransformation of 3,3,3-trifluoropropionic acid were performed and resulted in no metabolic activity and in poor elimination of 3,3,3-trifluoropropionic acid in vivo. The histopathological effects on the heart, which were observed in the 90-day oral toxicity study of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane in rats, namely mononuclear inflammatory cell infiltrations and degenerated myocardial fibers, were not observed after a 28 day repeated exposure of up to 10 mg/kg b.w. of 3,3,3-trifluoropropionic acid. However, a single high dose of 3,3,3-trifluoropropionic acid lead to severe toxicological effects. The difference in the observed toxic effects after a single and repeated administration may be due to adaptive mechanisms in rats. The toxicological effects included clinical signs like ataxia, coma and cramps. The conditions of the rats suggested possible inhibition of the energy supply to the organism. Furthermore, the interference of 3,3,3-trifluoropropionic acid in the functionality of the organism was investigated. Experiments were performed in vitro in rat liver and heart mitochondria to investigate effects on the mitochondrial ß-oxidation. However, the transformation of the substrate [U14C] palmitic acid in the ß oxidation pathway was not inhibited by 3,3,3-trifluoropropionic acid. In addition, no cytotoxicity of 3,3,3 trifluoropropionic acid was observed in the cell culture systems. The main effect after a single dose of 3,3,3-trifluoropropionic acid was seen in clinical pathology and metabonomic analysis. The decrease in blood glucose is considered to have the most far-reaching consequences for the toxicity of 3,3,3-trifluoropropionic acid. If considering this change as the primary effect after a single dose, secondary effects, for example, the above-mentioned clinical signs could be explained. In addition, the observed high level of ketone bodies might have been responsible for life-threatening possible ketoacidosis. In general, ketoacidosis occurs after an imbalance between glycolysis, lipolysis, TCA cycle activity and respiratory function. Based on the results, ß-oxidation of fatty acids was not affected, and due to the decrease in glucose levels and the high levels of acetyl CoA, glycolysis was considered not to be impaired. Increased amounts of acetyl CoA might be a result of insufficient activity of the TCA cycle. However, the inhibition of the TCA cycle can be based on the impairment of specific enzymes and/or on the involvement of messenger substrates like insulin. Supporting the first mentioned aspect are decreased levels of TCA cycle intermediates, like α-ketoglutarate or citrate, as seen in 1H-NMR spectra of urine. However, the second aspect would explain the drop in blood glucose with the impairment of glucose transporters or the impairment of the insulin balance. If a single dose of 3,3,3-trifluoropropionic acid had stimulated the insulin release, glycolysis would be activated, and high amounts of acetyl CoA would be produced. In case of impaired use by the TCA cycle, levels of ketone bodies would be increased. Experiments were designed to characterize the direct effect of 3,3,3-trifluoropropionic acid on rat insulinoma-derived INS-1 cells as possible increase in insulin release. Further investigations are necessary to answer in which step of the metabolic pathway 3,3,3-trifluoropropionic acid interferes or finally which specific enzyme is inhibited or activated by 3,3,3-trifluoropropionic acid, leading to the drop in blood glucose and finally in lethal toxicity. N2 - Die Biotransformation von 1,1,1,3,3-Pentafluorpropan wurde in Ratten und in in vitro Systemen untersucht. Die in der Ratte mit dem Urin ausgeschiedenen Metabolite wurden per GC/MS und 19F-NMR identifiziert. Als Hauptmetabolit entstand Trifluoressigsäure, als Nebenmetabolit 3,3,3-Trifluorpropionsäure und als Abspaltungsprodukt Fluorid. Als in in vitro Systeme wurden Ratten- und Humanleber-mikrosomen, sowie Rattenleberhomogenate verwendet. Auch hier wurden Trifluoressigsäure und 3,3,3-Trifluorpropionsäure als metabolische Zwischenprodukte identifiziert. Weitere in vivo Studien wurden durchgeführt um die beobachtete subchronische Kardiotoxizität von 1,1,1,3,3-Pentafluorpropan zu erklären. Da vorangegangene Experimente eine hohe letale Toxizität des Metaboliten 3,3,3-Trifluorpropionsäure zeigten, wurde dieser als das toxische Agens hypothetisiert. Diese Annahme unterstützend, ist dessen strukturelle Ähnlichkeit zu Substanzen mit bekannten toxischen Profilen wie Monofluoressigsäure oder Difluoracrylsäure, ein mögliches entstehendes Intermediat. Der Hauptmetabolit Trifluoressigsäure jedoch, wurde auf Grund seiner bekannten Toxizität als initiierendes Agens der Kardiotoxizität ausgeschlossen. In vivo Untersuchungen mit 3,3,3-Trifluorpropionsäure zeigten jedoch keine weitere metabolische Aktivität und eine geringe renale Ausscheidung an 3,3,3-Trifluorpropionsäure. Nach einer einmalig hohen Dosis von 3,3,3-Trifluorpropionsäure traten markante Symptome wie Ataxie, komatöse Zustände und Krämpfe auf. Dies deutete auf eine Beeinträchtigung des Energiezustandes des Organismus hin. Die histo-pathologischen Veränderungen des Herzens, mononukleäre Infiltrate von Entzündungszellen und degenerierte Myokard-Fasern, die für 1,1,1,3,3-Pentafluorpropan in einer 90-Tages Studie in Nagern beobachtet wurden, konnten jedoch nicht nach 28-tägiger Exposition mit 10 mg/kg Körpergewicht 3,3,3-Trifluorpropionsäure beobachtet werden. Die unterschiedlichen Effekte die nach einmaliger und wiederholter Gabe beobachtet wurden, lassen sich durch mögliche Adaptionsprozesse erklären, die initiale Schädigungen kompensieren. Die folgenden Experimente waren auf die funktionelle Beeinflussung des Organismus durch 3,3,3-Trifluorpropionsäure ausgerichtet. In vitro Untersuchungen in Mitochondrien von Rattenleber und –herz mit dem Umsatz des Modellsubstrates [U14C] Palmitinsäure zeigten jedoch keine Inhibierung der ß-Oxidation durch 3,3,3-Trifluorpropionsäure. Zytotoxizitätsassays wurden im Weiteren in der human-hepatonom Zell-Linie HepG2, und in der kardialen Muskelzell-Linie H9C2 mit folgenden Endpunkten durchgeführt: die Freisetzung von LDH, ein Parameter für die Membranintegrität, die MTT Reduktase Aktivität, ein Parameter für die metabolische Aktivität, und die Messung von Kristallviolett, ein Parameter für die Viabilität von Zellen. Für 3,3,3-Trifluorpropionsäure konnte jedoch keine Zytotoxizität beobachtet werden. Deutliche Effekte wurden hingegen in der klinischen Pathologie und anhand Metabonomics beobachtet. Diese bestanden vor allem in der Abnahme der Glukosekonzentration im Blut, das weitreichende Konsequenzen mit sich führt, und als primärer Effekt die sekundären Effekte wie die beobachtenden klinischen Symptome erklären könnte. Ein weiterer Schlüsselparameter war die Erhöhung von Ketonkörpern in Urin und Serum, welche für eine lebensbedrohliche mögliche Ketoazidosis verantwortlich sein kann und durch ein Ungleichgewicht im Energiehaushalt ausgelöst werden kann. Da eine Beeinträchtigung der ß Oxidation und der Glykolyse ausgeschlossen wurde, könnte das erhöhte Vorkommen von Acetyl-CoA auf eine limitierte Aktivität des Zitronensäurezyklus hindeuten. Grund hierfür kann die Inhibierung von beteiligten Enzymen sein oder auch der Einfluß von Messenger-Substraten wie Insulin. Ersteres wurde untermauert mit der Beobachtung in 1H NMR Spektren von Urin mit erhöhten Mengen an Intermediaten des Zitronensäurezyklus, wie α Ketoglutarate oder Zitrat. Letzteres würde den Abfall der Blutglukose, basierend auf Beeinflussung von Glukosetransportern oder des Insulinhaushaltes, erklären. Wenn 3,3,3-Trifluorpropionsäure die Freisetzung von Insulin stimulieren würde, würde der Abbau von Glukose aktiviert werden und erhöhte Mengen an Acetyl-CoA resultieren. Wenn gleichzeitig eine Beeinträchtigung des Zitronensäurezyklus vorliegt, kann dies zu einer Erhöhung an Ketonkörpern führen. Experimente zur Messung des Insulin- und Glukosespiegels wurden in vivo und in vitro mit der Ratteninsulinoma Zell-Linie INS-1 durchgeführt, um den Effekt von 3,3,3-Trifluorpropionsäure auf die Freisetzung von Insulin zu charakterisieren. Basierend auf diesen Ergebnissen sind weitere Untersuchungen erforderlich um den Metabolismus von 3,3,3-Trifluorpropionsäure, sowie dessen mögliche Interaktion mit Enzymen oder Rezeptoren aufzuklären, und um den raschen Glukoseabfall im Blut zu erklären, der zu einer letalen Toxizität führen kann KW - Fluorkohlenwasserstoffe KW - Biotransformation KW - Biotransformation KW - Fluorkohlenwasserstoffe KW - Metabonomix KW - HFC245fa KW - Trifluorpropionsäure KW - biotransformation KW - hydrofluorocarbons KW - metabonomics KW - HFC245fa KW - trifluoropropionic acid Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15731 ER - TY - THES A1 - Bedenk, Kristina T1 - Biochemische und strukturelle Charakterisierung der Genexpressionsmaschinerie des Vaccinia Virus T1 - The biochemical and structural characterization of the gene expression machinery of the Vaccinia virus N2 - Die Familie der Pockenviren zeichnet sich durch ein komplexes DNA Genom aus und hat großes medizinisches Potential. Am eindrucksvollsten ist dies für das Vaccinia-Virus (VACV) belegt, welches nicht nur als Pocken-Impfstoff eingesetzt wird, sondern auch als onkolytisches Virus in der Tumorbiologie. VACV hat einen außergewöhnlichen Replikationszyklus, welcher ausschließlich im Zytoplasma der Wirtszelle stattfindet. Somit ist die gesamte virale Genexpressionsmaschinerie völlig unabhängig von kernvermittelten Reaktionen des Wirts und somit auch aus Sicht der Grundlagenforschung von größtem Interesse. Die Schlüsselkomponente der viralen Genexpression ist die makromolekulare DNA-abhängige RNA Polymerase (vvRPO), deren Untereinheiten allesamt Virus-kodiert sind. Zwar wurden in den letzten Jahren Protokolle zur biochemischen und funktionellen Charakterisierung der vvRPO etabliert, ein detailliertes Wissen über deren Zusammenlagerung in vivo und die räumlichen und zeitlichen Interaktionen mit den Transkriptions- bzw. Prozessierungsfaktoren sind aber weitgehend unbekannt. Diese Arbeit umfasst Untersuchungen zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung der vvRPO und seiner assoziierten Faktoren. Grundlage hierfür war die Etablierung eines Reinigungsprotokolls mithilfe eines neu konstruierten rekombinanten VACV (GLV-1h439). Diese Strategie erlaubte es hoch-molekulare native vvRPO Komplexe zu isolieren. Ein transkriptions-inaktiver Komplex (Komplex I) mit einer kalkulierten Masse von 575 kDa bestand aus den acht Untereinheiten des vvRPO Holoenzyms und den Polymerase-assoziierten Faktoren RAP94 und D6. Ein zweiter, transkriptionell aktiver Komplex (Komplex II) mit einer Masse von 803 kDa enthielt, neben dem Holoenzym der vvRPO, noch weitere Faktoren, die primär die Erkennung der DNA-Matrize und die Prozessierung der naszierenden RNA vermitteln. Hierbei handelt es sich um RAP94, das virale Capping Enzym bestehend aus den zwei Untereinheiten D1 und D12, A7 und dem Terminationsfaktor NPH I. Interessanterweise enthielt dieser Komplex zusätzlich mit E11 eine bislang unbekannte weitere Protein-Komponente, sowie tRNAGln und tRNAArg. Der isolierte Kompelx II ist daher ein Ribonukleoprotein (RNP). Die Verfügbarkeit von hoch-reinen vvRPO Komplexen erlaubte es erstmals deren strukturelle Architektur zu untersuchen. Hierfür wurden drei experimentelle Ansätze, die klassische Röntgenstrukturanalyse, die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Quervernetzungssstudien miteinander kombiniert. Die Strukturen der Komplexe I und II haben eine Auflösung von 11-12 Å, wobei auffällig war, dass beide eine markante strukturelle Ähnlichkeit zur eukaryotischen RNA Polymerase II aufwiesen. Darüber hinaus gelang es zusätzliche Bereiche im Komplex II zu definieren, welche die Polymerase-assoziierten Prozessierungsfaktoren beherbergen. Zudem konnte die atomare Struktur von E11, mittels Röntgenstrukturanalyse bei einer Auflösung von 1,9 Å, gelöst werden. Das E11 Protein besitzt ein neuartiges Faltungsmuster und weist einen intensiven Dimerisierungskontakt auf, welcher sich über vier ß-Faltblätter ausbildet. Die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten legen die Grundlage für ein detailliertes Verständnis der räumlichen Organisation der viralen Transkriptonsmaschinerie. Darüber hinaus werden sie funktionelle Studien ermöglichen, welche die Rolle der einzelnen Proteine, sowie der tRNAs bei der mRNA Synthese klären helfen. N2 - Poxviruses comprise a diverse family of complex DNA-genome viruses with great medical potenial. This is exemplified by vaccinia virus, which not only served as a vaccine against smallpox but is also used as a promising tool in viral anti-cancer therapies. A key feature that distinguishes the poxvirus family from other DNA viruses is their replication cycle, which is confined to the cytoplasm. This results in a high level of independence from the host cell, which supports transcription and replication events only in the nucleus. Accordingly, virus specific, rather than host cell enzymes mediate most processes including DNA replication and mRNA synthesis. The key component of viral gene expression is the DNA-dependent RNA polymerase (vvRPO), which constitutes the virus-encoded macromolecular machine ensuring viral mRNA synthesis. Although this enzyme has been studied in some details in the past years, neither its mode of assembly in vivo nor its spatio-temporal association with transcription and processing factors has been understood in detail. In this thesis I present work that focuses on the structural and functional characterization of vvRPO and its associated factors. To gain insights into the structure and the assembly of the VACV transcription system we established an efficient purification protocol by generating recombinant virus strains expressing tagged subunits of vvRPO (GLV-1h439). These recombinant virus strains enabled the isolation of high molecular weight vvRPO complexes. Complex I, which was transcriptionally inactive in vitro displayed a calculated mass of about 575 kDa, consisted of eight subunits of the vvRPO holoenzym and two additional polymerase-associated factors termed RAP94 and D6. A second, transcriptionally active complex (complex II) with a mass of 803 kDa, was related to the first one. It consisted apart from the factors of the holoenzyme already found in complex I additional factors that mediate primarily binding of the polymerase to its DNA template and the processing of nascent RNA. These factors comprise the viral capping enzyme (D1, D12), A7 and the termination factor NPH I. Interestingly, complex II contained in addition the viral protein E11, thus far not connected to viral transcription als well as tRNAGln, tRNAArg). Complex II is hence a ribonucleoprotein (RNP). The availability of highly pure vvRPO complexes allowed for the first time to investigate their structure. To this end, three experimental approaches, the classic X-ray crystallography, cryo-electron microscopy (cryo-EM) and chemical crosslinking were combined. Structures of both polymerase complexes were obtained at a resolution of 11-12 Å and revealed a striking structural similarity to eukaryotic RNA polymerase II. Moreover, it was possible to allocate positions in the structure of complex II that are likely to harbour the polymerase-associated processing factors. In addition we were able to solve atomic structure of E11 by X-ray crystallography at a resolution of 1.9 Å. Interestingly, the structure of E11 showed a novel folding pattern that forms a dimer, which is mostly composed of four ß-sheets. These studies provide the basis for a detailed investigation of the architecture of the viral transcriptional machinery. Furthermore, the pave the way for functional studies aimed at elucidating the function of individual proteins and tRNA in the generation of viral mRNA. KW - Vaccinia-Virus KW - Vaccinia-Virus KW - Genexpressionsmaschinerie KW - RNA-Polymerase KW - Struktur KW - Genexpression Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135538 ER - TY - JOUR A1 - Benhalevy, Daniel A1 - Gupta, Sanjay K. A1 - Danan, Charles H. A1 - Ghosal, Suman A1 - Sun, Hong-Wei A1 - Kazemeier, Hinke G. A1 - Paeschke, Katrin A1 - Hafner, Markus A1 - Juranek, Stefan A. T1 - The Human CCHC-type Zinc Finger Nucleic Acid-Binding Protein Binds G-Rich Elements in Target mRNA Coding Sequences and Promotes Translation JF - Cell Reports N2 - The CCHC-type zinc finger nucleic acid-binding protein (CNBP/ZNF9) is conserved in eukaryotes and is essential for embryonic development in mammals. It has been implicated in transcriptional, as well as post-transcriptional, gene regulation; however, its nucleic acid ligands and molecular function remain elusive. Here, we use multiple systems-wide approaches to identify CNBP targets and function. We used photoactivatable ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation (PAR-CLIP) to identify 8,420 CNBP binding sites on 4,178 mRNAs. CNBP preferentially bound G-rich elements in the target mRNA coding sequences, most of which were previously found to form G-quadruplex and other stable structures in vitro. Functional analyses, including RNA sequencing, ribosome profiling, and quantitative mass spectrometry, revealed that CNBP binding did not influence target mRNA abundance but rather increased their translational efficiency. Considering that CNBP binding prevented G-quadruplex structure formation in vitro, we hypothesize that CNBP is supporting translation by resolving stable structures on mRNAs. KW - PAR-CLIP KW - ribosome profiling KW - translational regulation KW - posttranscriptional gene regulation KW - zinc-finger KW - RNA binding protein KW - CLIP-seq Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171122 VL - 18 IS - 12 ER - TY - THES A1 - Benz, Peter Michael T1 - Cytoskeleton assembly at endothelial cell-cell contacts is regulated by Alpha-II-spectrin/vasp complexes T1 - Das Aktin Zytoskelett an endothelialen Zell-Zell-Kontakten wird durch αII-Spektrin/VASP Komplexe reguliert N2 - Directed cortical actin assembly is the driving force for intercellular adhesion. Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) participates in actin-fiber formation and VASP activity is regulated by phosphorylations. We screened for endothelial cell proteins, which bind to VASP dependent on its phosphorylation status. Differential proteomics identified αII-spectrin as novel VASP-interacting protein. αII-spectrin binds to the triple GP5-motif in VASP via its SH3 domain. cAMP-dependent protein kinase-mediated VASP phosphorylation at Ser157 inhibits αII-spectrin/VASP complex formation. VASP becomes dephosphorylated upon formation of cell-cell contacts and in confluent but not in sparse endothelial cells αII-spectrin colocalizes with non-phosphorylated VASP at cell-cell junctions. Ectopic expression of the αII-spectrin SH3 domain fused to claudin-5 translocates VASP to cell-cell contacts and is sufficient to initiate the formation of cortical actin cytoskeletons. αII-spectrin SH3 domain overexpression stabilizes cell-cell contacts and decreases endothelial permeability. Conversely, permeability of VASP-deficient endothelial cells is elevated. In a skin edema model, microvascular leakage is increased in VASP-deficient over wild-type mice. We propose that αII-spectrin/VASP complexes regulate cortical actin cytoskeleton assembly with implications for formation of endothelial cell-cell contacts and regulation of vascular permeability. N2 - Der zielgerichtete Aufbau eines kortikalen Aktin-Zytoskeletts ist die treibende Kraft für die interzelluläre Adhäsion. Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) ist maßgeblich an der Bildung von Aktin-Fasern beteiligt und die VASP Aktivität wird durch seine Phosphorylierung geregelt. Wir haben in einem systematischen Ansatz nach endothelialen Proteinen gesucht, die an VASP, abhängig von seinem Phosphorylierungszustand, binden. Mit Hilfe differenzieller Massenspektrometrie konnte αII-Spektrin als neuer VASP Interaktionspartner identifiziert werden. Dabei bindet die αII-Spektrin SH3 Domäne an die drei GP5-Motive in VASP. Die Phosphorylierung von VASP durch die cAMP-abhängige Protein Kinase hemmt die αII-Spektrin/VASP Komplexbildung. Bei der Bildung von Zell-Zell Kontakten wird VASP dephosphoryliert und in konfluenten - nicht aber in vereinzelten Endothelzellen - kolokalisieren αII-Spektrin und nicht-phosphoryliertes VASP an Zell-Zell Kontakten. Die ektopische Expression der αII-Spektrin SH3 Domäne als Fusionsprotein mit Claudin-5 führt zu einer Translokation von VASP an Zell-Zell Kontakte und ist hinreichend um die Bildung von kortikalen Aktin-Fasern einzuleiten. Funktionell stabilisiert die Überexpression der αII-Spektrin SH3 Domäne Zell-Zell Kontakte und führt zu einer Abnahme der Endothelzellpermeabilität. Dementsprechend ist die Permeabilität von VASP-defizienten Zellen erhöht. In einem Hautödem-Modell zeigt sich nach Bradykinin-Stimulation eine Erhöhung der mikrovaskuläre Permeabilität von VASP-defizienten Mäusen gegenüber wild-typ Tieren. Unsere Forschungsergebnisse legen nahe, dass αII-Spektrin/VASP Komplexe den Aufbau des kortikalen Aktin-Zytoskeletts regulieren und damit für die Bildung von endothelialen Zell-Zell Kontakten und die Regulation der vaskulären Permeabilität eine Rolle spielen. KW - VASP KW - Spektrin KW - Aktin Zytoskelett KW - Endotheliale Zell-Zell-Kontakte KW - VASP KW - Spectrin KW - Cortical Actin Cytoskeleton KW - Endothelial Cell-Cell Contacts Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23802 ER - TY - THES A1 - Brand, Normen T1 - Lokalisation, Regulation und Interaktionen muriner DNA-Replikationsproteine T1 - Localization, regulation and interactions of murine DNA replication proteins N2 - Die DNA-Replikation ist ein entscheidendes Ereignis im eukaryontischen Zellzyklus, das die exakte Duplizierung des Genoms gewährleistet und das geordnete Zusammenspiel einer Vielzahl von Proteinen erfordert. Um diese enorme logistische Herausforderung zu bewerkstelligen ist die DNA-Replikation in mehrere Schritte organisiert, die Initiationsprozesse, Elongation und DNA-Reparatur umfassen. Der Initiationsschritt ist gekennzeichnet durch die Chromatin-Assoziation des hexameren ORC (origin recognition complex), der kontrovers diskutierte DNA-Sequenzen als Origins erkennt und bindet sowie als Landeplattform für weitere Proteinkomponenten dient. Der MCM-Komplex aus den sechs Untereinheiten Mcm2 7 komplettiert in Abhängigkeit von Cdc6 und Cdt1 den prä-replikativen Komplex (pre-RC) und wird vermutlich nach der Initiation vom Origin entfernt, um als DNA-Helikase für die Entwindung der DNA-Doppelhelix zu sorgen. Dies ermöglicht den Proteinen der Elongations-Maschinerie DNA an mikroskopisch sichtbaren Orten, die als Replikationsfoci bezeichnet werden, korrekt zu synthetisieren. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist eine Hauptkomponente der Replikationsfoci und fungiert als Ringklemme, die die DNA-Polymerasen und weitere Replikationsfaktoren an die DNA bindet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von ORC- MCM- und PCNA-Proteinen in murinen L-Fibroblasten durch Dual-Color-Immunfluoreszenz- (IF-) Studien untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine des ORC, des MCM-Komplexes und der Elongations-Maschinerie Positionen für drei verschiedene mechanistische Teil-Prozesse markieren, die an der DNA-Replikation beteiligt sind und an distinkten und räumlich getrennten Orten stattfinden: Initiation, Helikase-Aktivität und Elongation. IF-Studien weisen außerdem darauf hin, dass die Acetylierung von Histonen im Zusammenhang mit der Auswahl der Origins steht. Die Assemblierung des pre-RC steht unter der Kontrolle mehrerer Protein-Kinasen. Um zu untersuchen, ob Protein-Komponenten des pre-RC auch vom Hauptregulator von mitotischen Ereignissen, der POLO-like kinase1 (Plk1), phosphoryliert werden, wurden in vitro-Kinase-Assays mit Wildtyp-Plk1 bzw. der Kinase-defizienten Mutante Plk1 (K82M) als Negativ-Kontrolle und potentiellen Targetproteinen durchgeführt. Orc2, Cdc7 und Cdc45 konnten als in vitro-Substrate für die Plk1-Kinase identifiziert werden. Diese Proteine sind außerdem in der Mitose an den Centrosomen, Cdc7 und Cdc45 an den Mikrotubuli und Orc2 und Cdc45 am Midbody lokalisiert. Diese mitotischen Lokalisations-Muster korrelieren mit denen von Plk1. Die Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen ist für das Verständnis der Vorgänge bei der DNA-Replikation essentiell. Mit der BRET (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer)-Technik konnten direkte Interaktionen zwischen Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 und Plk1 & Dbf4 gezeigt werden. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Histon-Hyperacetylierung und der Depletion von Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) auf die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 untersucht. Orc2 und Orc3 sind sowohl endogen als auch überexprimiert im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert. Um herauszufinden, ob die Kernlokalisation von Orc3 Voraussetzung für die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 ist, wurde ein putatives Kernlokalisationssignal (NLS) in der aminoterminalen Region von Orc3 in einem EGFP-ORC3-Fusionsplasmid deletiert. Die Expression dieser Mutante resultierte in L-Fibroblasten und HEK293T-Zellen in ausschließlich cytoplasmatischer Lokalisation. BRET-Assays, bei denen ORC2-Rluc und die NLS-defiziente EGFP-ORC3-Mutante eingesetzt wurden, lieferten ein BRET ratio, das ununterscheidbar von dem mit Wildtyp EGFP-ORC3 erhaltenen Signal war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 nicht auf den Zellkern beschränkt ist. Mit der erst kürzlich entwickelten BiFC- (bimolecular fluorescence complementation) Technik konnte sowohl die cytoplasmatische als auch die nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 gezeigt werden. FLIP- (fluorescence loss in photobleaching-) Studien mit BiFC-positiven Zellen, die eine ausschließlich nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 aufwiesen, zeigten eine verringerte Mobilität des binären Komplexes Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) im Vergleich zu EGFP-Fusionsproteinen von Orc2 (t ½ = 8 s) und Orc3 (t ½ = 6 s) auf. Dies deutet darauf hin, dass die Assoziation mit dem Bindungspartner zu einer erhöhten Chromatin-Bindung von Orc2 und Orc3 führt. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Punktmutationen auf die subzelluläre Lokalisation und die intranukleäre Dynamik des in Replikationsfoci lokalisierten Cdc6-EGFP-Fusionsproteins untersucht und die Mobilität von promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) und der darin enthaltenen Proteinkomponenten analysiert. N2 - Eukaryotic DNA replication is a crucial event in the cell cycle ensuring precise duplication of the genome by the coordinated action of a multitude of proteins. To cope with this enormous logistical challenge DNA replication is organized in multiple steps comprising initiation processes, elongation and DNA repair. The initiation step is characterized by the chromatin association of the hexameric ORC (origin recognition complex) which selects controversely discussed DNA sequences as replication origins and serves as a landing pad for further protein components. The MCM complex consisting of the six subunits Mcm2-7 accomplishes the pre-RC in a Cdc6- and Cdt1-dependent manner and is supposed to be released from the origin following initiation to act as DNA helicase, triggering the unwinding of the DNA double helix. This allows the proteins of the elongation machinery to accurately synthezise DNA at distinct microscopically visible sites termed replication foci. A major component of replication foci, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) acts as a sliding clamp tethering the DNA polymerases and further replication factors to DNA. Within the scope of this thesis, the distribution of ORC, MCM and PCNA proteins was investigated in murine L fibroblasts by dual-color immunofluorescence (IF) studies. It could be shown that the proteins of the ORC, the MCM complex and the elongating machinery constitute locations for three different mechanistical events involved in DNA replication which occur at distinct and spatially separated sites, i. e. initiation, helicase activity and elongation. Additionally, IF studies suggest, that histone acetylation is involved in the selection of origins and the recruitment of the pre-RC to chromatin. The assembly of the pre-RC begins in mitosis and is regulated by the activity of multiple protein kinases. To test whether the key regulator of mitotic events, POLO-like kinase1 (Plk1), is capable of phosphorylating pre-RC components, in vitro kinase assays were carried out using full-length Plk1 and a kinase-deficient mutant Plk1 (K82M) as a negative control together with bacterially expressed target proteins. Orc2, Cdc7 and Cdc45 were found to be in vitro substrates of the Plk1 kinase. Furthermore, IF studies using specific antibodies against Orc2, Cdc7 and Cdc45 revealed conspicuous staining patterns for the Plk1 substrates in mitosis. While Orc2 was accumulated in the midbody region in telophase, Cdc7 was localized at the centrosomes and micotubules in anaphase. Cdc45 was found at the centrosomes and the microtubules from prometaphase to anaphase, and in the midbody region during telophase, strikingly matching the mitotic localization patterns of Plk1. The detection of protein-protein interactions is crucial for the understanding of the course of events in DNA replication. By using the bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technique interactions among components of the pre-RC were analyzed in living mammalian cells. The BRET studies revealed direct interactions between Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 and Plk1 & Dbf4. Furthermore, the influence of histone hyperacetylation, as well as the depletion of cyclin-dependent kinases (CDK) on the interaction between Orc2 and Orc3 was investigated. Orc2 and Orc3 were found to be localized in the nucleus and the cytoplasm. To investigate, whether nuclear import of Orc3 is a prerequisite for the interaction of Orc2 with Orc3 to occur, a putative nuclear localization signal (NLS) in the aminoterminal region of Orc3 was truncated in an EGFP-ORC3 fusion construct. Expression of this mutant in L fibroblasts and HEK293T cells resulted in exclusive cytoplasmatic localization. BRET assays using ORC2-Rluc and the NLS-deficient EGFP-ORC3 mutant were performed. In this experiment, a BRET signal was obtained which was indistinguishable from that obtained with wild-type EGFP-ORC3. Together, these findings strongly suggest that the interaction between Orc2 and Orc3 is not restricted to the nucleus. The nuclear as well as the cytoplasmatic distribution of the localization between Orc2 and Orc3 could furthermore be confirmed with a recently developed BiFC (bimolecular fluorescence complementation) assay. FLIP (fluorescence loss in photobleaching) studies with BiFC-positive cells showing exclusive nuclear distribution revealed decreased mobility of Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) compared with EGFP fusion proteins of Orc2 (t ½ = 8 s) and Orc3 (t ½ = 6 s), suggesting that the association with its binding partner leads to an enhanced capability of Orc2 and Orc3 to bind to chromatin. Additionally, the influence of point mutations on the subcellular localization and intranuclear dynamics of a Cdc6-EGFP fusion protein, previously shown to be localized in replication foci, was analyzed. Further, the mobility of promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) and PML-associated proteins was investigated. KW - Maus KW - Replikation KW - Proteine KW - Interaktion KW - Regulation KW - DNA-Replikation KW - Zellzyklus-Kontrolle KW - präreplikativer Komplex KW - Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer KW - DNA replication KW - cell cycle control KW - pre-replicative complex KW - bioluminescence resonance energy transfer Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14057 ER - TY - THES A1 - Brosi, Cornelia T1 - Functional characterization of the TTF complex and its role in neurodevelopmental disorders T1 - Funktionelle Charakterisierung des TTF-Komplexes und seine Rolle in neurologischen Entwicklungsstörungen N2 - The eukaryotic gene expression requires extensive regulations to enable the homeostasis of the cell and to allow dynamic responses due to external stimuli. Although many regulatory mechanisms involve the transcription as the first step of the gene expression, intensive regulation occurs also in the post-transcriptional mRNA metabolism. Thereby, the particular composition of the mRNPs plays a central role as the components associated with the mRNA form a specific “mRNP code” which determines the fate of the mRNA. Many proteins which are involved in this regulation and the mRNA metabolism are affected in diseases and especially neurological disorders often result from an aberrant mRNP code which leads to changes in the regulation and expression of mRNPs. The focus of this work was on a trimeric protein complex which is termed TTF complex based on its subunits TDRD3, TOP3β and FMRP. Biochemical investigations revealed that the three components of the TTF complex are nucleo-cytosolic shuttle proteins which localize in the cytoplasm at the steady-state, associate with mRNPs and are presumably connected to the translation. Upon cellular stress conditions, the TTF components concentrate in stress granules. Thus, the TTF complex is part of the mRNP code, however its target RNAs and function are still completely unknown. Since the loss of functional FMRP results in the fragile X syndrome and TOP3β is associated with schizophrenia and intellectual disability, the TTF complex connects these phenotypically related neuro-psychiatric disorders with each other on a molecular level. Therefore, the aim of this work was to biochemically characterize the TTF complex and to define its function in the mRNA metabolism. In this work, evidence was provided that TDRD3 acts as the central unit of the TTF complex and directly binds to FMRP as well as to TOP3β. Thereby, the interaction of TDRD3 and TOP3β is very stable, whereas FMRP is a dynamic component. Interestingly, the TTF complex is not bound directly to mRNA, but is recruited via the exon junction complex (EJC) to mRNPs. This interaction is mediated by a specific binding motif of TDRD3, the EBM. Upon biochemical and biological investigations, it was possible to identify the interactome of the TTF complex and to define the role in the mRNA metabolism. The data revealed that the TTF complex is mainly associated with “early” mRNPs and is probably involved in the pioneer round of translation. Furthermore, TOP3β was found to bind directly to the ribosome and thus, establishes a connection between the EJC and the translation machinery. A reduction of the TTF components resulted in selective changes in the proteome in cultured cells, whereby individual protein subsets seem to be regulated rather than the global protein expression. Moreover, the enzymatic analysis of TOP3β indicated that TOP3β is a type IA topoisomerase which can catalytically attack not only DNA but also RNA. This aspect is particularly interesting with regard to the connection between early mRNPs and the translation which has been revealed in this work. The data obtained in this work suggest that the TTF complex plays a role in regulating the metabolism of an early mRNP subset possibly in the course of the pioneer round of translation. Until now, the link between an RNA topoisomerase and the mRNA metabolism is thereby unique and thus provides a completely new perspective on the steps in the post-transcriptional gene expression and its regulation. N2 - Die eukaryotische Genexpression bedarf einer umfassenden Regulation um die Homöostase der Zelle zu gewährleisten und um dynamische Reaktionen auf externe Einflüsse zu ermöglichen. Obwohl viele der regulatorischen Mechanismen die Transkription als ersten Schritt der Genexpression betreffen, findet auch eine intensive Regulierung auf der Ebene des post-transkriptionellen mRNA-Metabolismus statt. Dabei spielt die jeweilige Zusammensetzung der mRNPs eine zentrale Rolle, da je nachdem, mit welchen Faktoren eine mRNA assoziiert ist, ein sog. „mRNP-Code“ entsteht, der das Schicksal der mRNA bestimmt. Viele der an der Regulierung und dem mRNA-Metabolismus beteiligten Proteine sind in Krankheiten betroffen und gerade neurologische Erkrankungen resultieren häufig von einem fehlerhaften mRNP-Code, der zu Veränderungen in der Regulation und Expression von mRNPs führt. Im Zentrum dieser Arbeit stand ein trimerer Proteinkomplex, der aufgrund seiner Untereinheiten TDRD3, TOP3β und FMRP als TTF-Komplex bezeichnet wird. Biochemische Daten haben gezeigt, dass die drei Komponenten des TTF-Komplexes nucleo-cytoplasmatische „Shuttle“-Proteine sind, die sich im „steady-state“ hauptsächlich im Cytoplasma befinden, mit mRNPs assoziieren und vermutlich mit der Translation in Verbindung stehen. Unter zellulären Stressbedingungen konzentrieren sich die TTF-Komponenten in Stress Granula. Der TTF-Komplex ist damit Teil des mRNP-Codes, dessen zelluläre Ziel-RNAs und Funktion bislang aber völlig unbekannt sind. Da der Verlust von funktionellem FMRP zu der Ausprägung des fragilen X Syndroms (FXS) führt und TOP3β mit Schizophrenie und geistiger Retardation in Verbindung steht, verbindet der TTF-Komplex phänotypisch verwandte neuro-psychiatrische Krankheiten auf molekularer Ebene miteinander. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den TTF-Komplex biochemisch zu charakterisieren und seine Funktion im mRNA-Metabolismus zu definieren. Im Zuge dieser Arbeit gelang der Nachweis, dass TDRD3 als zentrale Einheit des TTF-Komplexes agiert und sowohl FMRP als auch TOP3β direkt bindet. Die Interaktion von TDRD3 und TOP3β ist hierbei sehr stabil, FMRP ist hingegen eine dynamische Komponente. Interessanterweise wird der TTF-Komplex nicht direkt an mRNA gebunden, sondern über den Exon-Junction-Komplex (EJC) an mRNPs rekrutiert. Diese Interaktion wird durch ein spezifisches Bindungsmodul in TDRD3, dem sog. EBM vermittelt. In einer Reihe von biochemischen und systembiologischen Studien konnte das Interaktom des TTF-Komplexes bestimmt und seine Rolle im mRNA-Metabolismus definiert werden. Die Daten offenbarten, dass der TTF-Komplex primär mit „frühen“ mRNPs assoziiert ist und sehr wahrscheinlich an der „pioneer round of translation“ beteiligt ist. Weiterhin zeigte sich, dass TOP3β das Ribosom direkt bindet und somit eine Verbindung des EJC und der Translationsmaschinerie etabliert. Die Reduktion von Komponenten des TTF-Komplexes in kultivierten Zellen führte zu selektiven Änderungen im Proteom, wobei einzelne Proteinteilgruppen, jedoch nicht die globale Expression durch den TTF-Komplex reguliert zu sein scheinen. Die enzymatische Analyse von TOP3β hat darüber hinaus gezeigt, dass es sich um eine Topoisomerase vom Typ IA handelt, die nicht nur DNA sondern auch RNA angreifen kann. Dieser Aspekt ist besonders interessant im Zusammenhang der in dieser Arbeit aufgedeckten Verbindung von frühen mRNPs mit der Translation. Die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten legen nahe, dass der TTF-Komplex eine Rolle bei der Regulation des Metabolismus „früher“ mRNP-Teilgruppen möglicherweise im Zuge der „Pionierrunde“ der Translation spielt. Dabei ist die Verbindung einer RNA-Topoisomerase mit dem mRNA-Metabolismus bisher einzigartig und eröffnet so eine ganz neue Sichtweise auf die post-transkriptionellen Schritte der Genexpression und ihre Regulation. KW - Messenger-RNP KW - Fragiles-X-Syndrom KW - Schizophrenie KW - Translation KW - Gene Expression KW - TTF complex KW - TDRD3 KW - TOP3b KW - FMRP Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157783 ER - TY - JOUR A1 - Buchberger, Alexander A1 - Böhm, Stephanie T1 - The Budding Yeast Cdc48Shp1 Complex Promotes Cell Cycle Progression by Positive Regulation of Protein Phosphatase 1 (Glc7) JF - PLoS One N2 - The conserved, ubiquitin-selective AAA ATPase Cdc48 regulates numerous cellular processes including protein quality control, DNA repair and the cell cycle. Cdc48 function is tightly controlled by a multitude of cofactors mediating substrate specificity and processing. The UBX domain protein Shp1 is a bona fide substrate-recruiting cofactor of Cdc48 in the budding yeast S. cerevisiae. Even though Shp1 has been proposed to be a positive regulator of Glc7, the catalytic subunit of protein phosphatase 1 in S. cerevisiae, its cellular functions in complex with Cdc48 remain largely unknown. Here we show that deletion of the SHP1 gene results in severe growth defects and a cell cycle delay at the metaphase to anaphase transition caused by reduced Glc7 activity. Using an engineered Cdc48 binding-deficient variant of Shp1, we establish the Cdc48Shp1 complex as a critical regulator of mitotic Glc7 activity. We demonstrate that shp1 mutants possess a perturbed balance of Glc7 phosphatase and Ipl1 (Aurora B) kinase activities and show that hyper-phosphorylation of the kinetochore protein Dam1, a key mitotic substrate of Glc7 and Ipl1, is a critical defect in shp1. We also show for the first time a physical interaction between Glc7 and Shp1 in vivo. Whereas loss of Shp1 does not significantly affect Glc7 protein levels or localization, it causes reduced binding of the activator protein Glc8 to Glc7. Our data suggest that the Cdc48Shp1 complex controls Glc7 activity by regulating its interaction with Glc8 and possibly further regulatory subunits. KW - alleles KW - cell cycle KW - immunoprecipitation KW - phosphatases KW - genetic interactions Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96073 ER - TY - THES A1 - Buckel, Lisa T1 - Evaluating the combination of oncolytic vaccinia virus and ionizing radiation in therapy of preclinical glioma models T1 - Evaluierung der Kombination von onkolytischem Vaccinia Virus und ionisierender Strahlung in vorklinischen Gliomamodellen N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) represents the most aggressive form of malignant brain tumors and remains a therapeutically challenge. Intense research in the field has lead to the testing of oncolytic viruses to improve tumor control. Currently, a variety of different oncolytic viruses are being evaluated for their ability to be used in anti-cancer therapy and a few have entered clinical trials. Vaccinia virus, is one of the viruses being studied. GLV-1h68, an oncolytic vaccinia virus engineered by Genelux Corporation, was constructed by insertion of three gene cassettes, RUC-GFP fusion, β-galactosidase and β- glucuronidase into the genome of the LIVP strain. Since focal tumor radiotherapy is a mainstay for cancer treatment, including glioma therapy, it is of clinical relevance to assess how systemically administered oncolytic vaccinia virus could be combined with targeted ionizing radiation for therapeutic gain. In this work we show how focal ionizing radiation (IR) can be combined with multiple systemically delivered oncolytic vaccinia virus strains in murine models of human U-87 glioma. After initial experiments which confirmed that ionizing radiation does not damage viral DNA or alter viral tropism, animal studies were carried out to analyze the interaction of vaccinia virus and ionizing radiation in the in vivo setting. We found that irradiation of the tumor target, prior to systemic administration of oncolytic vaccinia virus GLV-1h68, increased viral replication within the U-87 xenografts as measured by viral reporter gene expression and viral titers. Importantly, while GLV-1h68 alone had minimal effect on U-87 tumor growth delay, IR enhanced GLV-1h68 replication, which translated to increased tumor growth delay and mouse survival in subcutaneous and orthotopic U-87 glioma murine models compared to monotherapy with IR or GLV-1h68. The ability of IR to enhance vaccinia replication was not restricted to the multi-mutated GLV-1h68, but was also seen with the less attenuated oncolytic vaccinia, LIVP 1.1.1. We have demonstrated that in animals treated with combination of ionizing radiation and LIVP 1.1.1 a strong pro-inflammatory tissue response was induced. When IR was given in a more clinically relevant fractionated scheme, we found oncolytic vaccinia virus replication also increased. This indicates that vaccinia virus could be incorporated into either larger hypo-fraction or more conventionally fractionated radiotherapy schemes. The ability of focal IR to mediate selective replication of systemically injected oncolytic vaccinia was demonstrated in a bilateral glioma model. In mice with bilateral U-87 tumors in both hindlimbs, systemically administered oncolytic vaccinia replicated preferentially in the focally irradiated tumor compared to the shielded non- irradiated tumor in the same mouse We demonstrated that tumor control could be further improved when fractionated focal ionizing radiation was combined with a vaccinia virus caring an anti-angiogenic payload targeting vascular endothelial growth factor (VEGF). Our studies showed that following ionizing radiation expression of VEGF is upregulated in U-87 glioma cells in culture. We further showed a concentration dependent increase in radioresistance of human endothelial cells in presence of VEGF. Interestingly, we found effects of vascular endothelial growth factor on endothelial cells were reversible by adding purified GLAF-1 to the cells. GLAF-1 is a single- chain antibody targeting human and murine VEGF and is expressed by oncolytic vaccinia virus GLV-109. In U-87 glioma xenograft murine models the combination of fractionated ionizing radiation with GLV-1h164, a vaccinia virus also targeting VEGF, resulted in the best volumetric tumor response and a drastic decrease in vascular endothelial growth factor. Histological analysis of embedded tumor sections 14 days after viral administration confirmed that blocking VEGF translated into a decrease in vessel number to 30% of vessel number found in control tumors in animals treated with GLV-164 and fractionated IR which was lower than for all other treatment groups. Our experiments with GLV-1h164 and fractionated radiotherapy have shown that in addition to ionizing radiation and viral induced tumor cell destruction we were able to effectively target the tumor vasculature. This was achieved by enhanced viral replication translating in increased levels of GLAF-2 disrupting tumor vessels as well as the radiosensitization of tumor vasculature to IR by blocking VEGF. Our preclinical results have important clinical implications of how focal radiotherapy can be combined with systemic oncolytic viral administration for highly aggressive, locally advanced tumors with the potential, by using a vaccinia virus targeting human vascular endothelial growth factor, to further increase tumor radiation sensitivity by engaging the vascular component in addition to cancer cells. N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) verkörpert die aggressivste Form von bösartigen Gehirntumoren und seine Therapie gestaltet sich schwierig. Weitläufige Forschung hat dazu geführt, dass onkolytische Viren zur Verbesserung der Tumorbehandlung untersucht wurden. Gegenwärtig wird eine Vielzahl an verschiedenen onkolytischen Viren untersucht und einige wenige befinden sich bereits in klinischen Studien. Eines der Viren die untersucht werden, ist das Vaccinia-Virus. GLV-1h68, ein onkolytisches Vaccinia- Virus, wurde durch die Einfügung von drei Genkasseten, RUC-GFP Fusion, β- Galaktosidase und β- Glucuronidase in das Genom des LIVP Stammes hergestellt. Da fokale Bestrahlungstherapie aus der Behandlung von Krebs, nicht nur im Falle von Glioblastomen, nicht wegzudenken ist, ist es klinisch relevant, zu untersuchen, wie ein systemisch verabreichtes Vaccinia-Virus mit gezielter ionisierender Strahlung (IR) kombiniert werden könnte, um Therapiechancen zu verbesseren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, wie gezielte IR mit verschiedenen sytemisch injizierten Vaccinia-Virus Stämmen in einem Mausmodell für humane U-87-Glioma kombiniert wurde. Nachdem einleitende Versuche bestätigten, dass IR die virale Erbinformation nicht beschädigt und auch nicht den viralen Tropismus verändert, wurden Tierstudien durchgeführt, die die Interaktion des Vaccinia-Virus mit Bestrahlungtherapie in vivo untersuchten. Wir konnten zeigen, dass eine vorherige Bestrahlung des Tumors, bevor das GLV-1h68-Virus systemisch injiziert wurde, eine erhöhte viraler Replikation im Tumor zur Folge hatte, wie wir durch gesteigerte virale Titer und Markergenexpression belegen konnten. Von wesentlicher Bedeutung ist, dass eine Verabreichung von ausschliesslich GLV-1h68 einen minimalen Einfluss auf das U-87 Tumorwachstum hatte, während die durch die Bestrahlung ausgelöste erhöhte Vermehrung von Virus im Tumor eine Verzögerung des Tumorwachstums sowie ein verlängertes Überleben von Mäusen mit U-87-Xenografts zur Folge hatte. Die Fähigkeit von IR virale Vermehrung zu erhöhen, wurde auch für das weniger attenuierte LIVP 1.1.1-Virus gezeigt. Wenn die Bestrahlung in einem klinisch relevanten fraktionierten Bestrahlungsschema verabreicht wurde, war virale Replikation ebenfalls erhöht. Dies verdeutlicht, dass das Vaccinia-Virus klinisch entweder in eine Bestrahlung mit einer einzelnen Dosis oder in eine konventionelle fraktionierte Bestrahlung integriert werden kann. Die Fähigkeit von fokaler IR, eine selektive Vermehrung von systemisch injizierten onkolytischen Vaccinia-Viren zu ermöglichen, wurde in einem bilateralen Gliomamausmodell bestätigt. In Mausen mit Tumoren an beiden Hinterbeinen, vermehrte sich das systemisch gespritzte Vaccinia-Virus bevorzugt im bestrahlten Tumor. Wir konnten zeigen, wie die Tumorkontrolle darüber hinaus weiter verbessert werden kann, wenn fraktionierte fokale Bestrahlung mit einem Vaccinia-Virus kombiniert wird, das eine anti-angiogenetische Ladung, die den vaskulaeren endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) inhibiert, exprimiert. Unsere Studien konnten zeigen, dass durch die Bestrahlung von U-87 Gliomazellen eine Hochregulation von VEGF-Expression ausgelöst wurde, die Radioresistenz von Endothelzellen konzentrationsabhängig induzierte. Wir konnten zeigen, dass die durch VEGF verursache Radioresistenz umkehrbar ist, wenn zusätzlich aufgereinigtes GLAF-1, einen Vaccinia Virus exprimierten Antikörper, zu den Zellen gegeben wurde. In einem Mausmodell zeigte die Kombination aus fraktionierter Bestrahlung und GLV-1h164, ein Vaccinia-Virus, das ebenfalls einen VEGF Antikörper mit Ähnlichkeit zu GLAF-1 exprimiert, resultierte in der stärksten volumetrischen Tumorantwort. Es wurde ebenfalls eine drastische Abnahme an VEGF im Tumor bereits 3 Tagen nach Virus- Injektion nachgewiesen. Histologische Analyse bestätigte, dass die Blockade von VEGF eine Erniedrigung der Anzahl von Tumorblutgefäßen, zu 30% von Kontrolltumoren, zur Folge hatte. Dieser Wert war niedriger als in allen anderen Behandlungsgruppen. Unsere Versuche mit fraktionierter Bestrahlung und GLV-1h164 konnten zeigen, dass zusätzlich zu der durch Virus und Bestrahlung ausgelösten Tumorzellzerstörung, eine effiziente Degeneration der Tumorblutgefäße möglich war. Dies wurde durch eine erhöhte Virus-Vermehrung als Folge der Bestrahlung, sowie durch Sensitiveren der tumoralen Endothelzellen durch Blockierung von VEGF-A erreicht. Die Ergebnisse, die in dieser Arbeit zeigen, wie fokale Bestrahlungstherapie mit systemisch verabreichten onkolytische Vaccinia-Viren für aggressive, fortgeschrittene Tumore kombiniert werden kann. Es ist denkbar, dass die Tumortherapie weiter verbessert werden kann, wenn ein Vaccinia-Virus benutzt wird, das sich zusätzlich gegen VEGF richtet, so werden zu den Krebszellen zusätzlich Tumorblutgefäße in die Therapie miteinbezogen, um die Sensitivität von Endothelzellen gegen Bestrahlung weiter zu erhöhen. KW - Gliom KW - Vaccinia-Virus KW - Strahlentherapie KW - Kombinationstherapie KW - onkolytische Virotherapie KW - Glioma KW - vaccinia virus KW - ionizing radiation KW - combination therapy KW - oncolytic virotherapy Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85309 ER - TY - JOUR A1 - Cecil, Alexander A1 - Gentschev, Ivaylo A1 - Adelfinger, Marion A1 - Dandekar, Thomas A1 - Szalay, Aladar A. T1 - Vaccinia virus injected human tumors: oncolytic virus efficiency predicted by antigen profiling analysis fitted boolean models JF - Bioengineered N2 - Virotherapy on the basis of oncolytic vaccinia virus (VACV) strains is a promising approach for cancer therapy. Recently, we showed that the oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 has a therapeutic potential in treating human prostate and hepatocellular carcinomas in xenografted mice. In this study, we describe the use of dynamic boolean modeling for tumor growth prediction of vaccinia virus-injected human tumors. Antigen profiling data of vaccinia virus GLV-1h68-injected human xenografted mice were obtained, analyzed and used to calculate differences in the tumor growth signaling network by tumor type and gender. Our model combines networks for apoptosis, MAPK, p53, WNT, Hedgehog, the T-killer cell mediated cell death, Interferon and Interleukin signaling networks. The in silico findings conform very well with in vivo findings of tumor growth. Similar to a previously published analysis of vaccinia virus-injected canine tumors, we were able to confirm the suitability of our boolean modeling for prediction of human tumor growth after virus infection in the current study as well. In summary, these findings indicate that our boolean models could be a useful tool for testing of the efficacy of VACV-mediated cancer therapy already before its use in human patients. KW - boolean modeling KW - oncolytic virus KW - human xenografted mouse models KW - cancer therapy Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200507 VL - 10 IS - 1 ER - TY - THES A1 - Chari, Ashwin T1 - The Reaction Mechanism of Cellular U snRNP Assembly T1 - Der Reaktionsmechanismus zellulärer U snRNP Zusammenlagerung N2 - Macromolecular complexes, also termed molecular machines, facilitate a large spectrum of biological reactions and tasks crucial to the survival of cells. These complexes are composed of either protein only, or proteins bound to nucleic acids (DNA or RNA). Prominent examples for each class are the proteosome, the nucleosome and the ribosome. How such units are assembled within the context of a living cell is a central question in molecular biology. Earlier studies had indicated that even very large complexes such as ribosomes could be reconstituted from purified constituents in vitro. The structural information required for the formation of macromolecular complexes, hence, lies within the subunits itself and, thus, allow for self- assembly. However, increasing evidence suggests that in vivo many macromolecular complexes do not form spontaneously but require assisting factors (“assembly chaperones”) for their maturation. In this thesis the assembly of RNA-protein (RNP) complexes has been studied by a combination of biochemical and structural approaches. A resourceful model system to study this process is the biogenesis pathway of the uridine-rich small nuclear ribonucleoproteins (U snRNPs) of the spliceosome. This molecular machine catalyzes pre-mRNA splicing, i.e. the removal of non-coding introns and the joining of coding exons to functional mRNA. The composition and architecture of U snRNPs is well defined, also, the nucleo-cytoplasmic transport events enabling the formation of these particles in vivo have been analyzed in some detail. Furthermore, recent studies suggest that the formation of U snRNPs in vivo is mediated by an elaborate assembly machinery consisting of protein arginine methyltransferase (PRMT5)- and survival motor neuron (SMN)-complexes. The elucidation of the reaction mechanism of cellular U snRNP assembly would serve as a paradigm for our understanding of how RNA-protein complexes are formed in the cellular environment. The following key findings were obtained as part of this study: 1) Efforts were made to establish a full inventory of the subunits of the SMN-complex. This was achieved by the biochemical definition and characterization of an atypical component of this complex, the unrip protein. This protein is associated with the SMN-complex exclusively in the cytoplasm and influences its subcellular localization. 2) With a full inventory of the components in hand, the architecture of the SMN-complex was defined on the basis of an interaction map of all subunits. This study elucidated that the proteins SMN, Gemin7 and Gemin8 form a backbone, onto which the remaining subunits adhere in a modular manner. 3) The two studies mentioned above formed the basis to elucidate the reaction mechanism of cellular U snRNP assembly. Initially, an early phase in the SMN-assisted formation of U snRNPs was analyzed. Two subunits of the U7 snRNP (LSm10 and 11) were found to interact with the PRMT5-complex, without being methylated. This report suggests that the stimulatory role of the PRMT5-complex is independent of its methylation activity. 4) Key reaction intermediates in U snRNP assembly were found and characterized by a combination of biochemistry and structural studies. Initially, a precursor to U snRNPs with a sedimentation coefficient of 6S is formed by the pICln subunit of the PRMT5-complex and Sm proteins. This intermediate was shown to constitute a kinetic trap in the U snRNP assembly reaction. Progression towards the assembled U snRNP depends on the activity of the SMN-complex, which acts as a catalyst. The formation of U snRNPs is shown to be structurally similar to the way clamps are deposited onto DNA to tether poorly processive polymerases. 5) The human SMN-complex is composed of several subunits. However, it is unknown whether all subunits of this entity are essential for U snRNP assembly. A combination of bioinformatics and biochemistry was applied to tackle this question. By mining databases containing whole-genome assemblies, the SMN-Gemin2 heterodimer is recognized as the most ancestral form of the SMN-complex. Biochemical purification of the Drosophila melanogaster SMN-complex reveals that this complex is composed of the same two subunits. Furthermore, evidence is provided that the SMN-Gemin2 heterodimer is necessary and sufficient to promote faithful U snRNP assembly. Future studies will adress further details in the reaction mechanism of cellular U snRNP assembly. The results obtained in this thesis suggest that the SMN and Gemin2 subunits are sufficient to promote U snRNP formation. What then is the function of the remaining subunits of the SMN-complex? The reconstitution schemes established in this thesis will be instrumental to address this question. Furthermore, additional mechanistic insights into the U snRNP assembly reaction will require the elucidation of structures of the assembly machinery trapped at various states. The prerequisite for these structural studies, the capability to generate homogenous complexes in sufficient amounts, has been accomplished in this thesis. N2 - Makromolekulare Komplexe, auch molekulare Maschinen genannt, ermöglichen eine grosse Vielfalt biologischer Reaktionen und Aufgaben, die für das Überleben von Organismen kritisch sind. Diese Komplexe bestehen entweder nur aus Protein, oder setzen sich aus Protein und Nukleinsäure (DNA oder RNA) zusammen. Prominente Beispiele für diese Klassen molekularer Maschinen sind das Proteosom, das Nukleosom oder das Ribosom. Wie sich solche Einheiten innerhalb einer Zelle zusammenlagern ist eine grundlegende Frage der Molekularbiologie. Frühere Studien hatten angeduetet, dass es möglich ist sogar sehr grosse Komplexe wie das Ribosom in vitro aus gereinigten Bestandteilen zu einem aktiven Partikel zu rekonstruieren. Die Strukturinformation, die für die Bildung von makromolekularen Komplexen erforderlich ist, liegt also in den Untereinheiten selbst. Im Gegensatz dazu mehren sich heute die Hinweise dafür, dass sich viele makromolekulare Komplexe nicht spontan zusammenlagern, sondern die Aktivität assistierender Faktoren („Assembly Chaperone“) für ihre Reifung benötigen. In dieser Arbeit wurde der Zusammenbau von RNA-Protein (RNP) Partikeln durch eine Kombination aus Biochemie und Strukturbiologie untersucht. Ein ergiebiges System, um diesen Prozess zu studieren, ist die Biogenese der RNPs (U snRNPs) des Spleissosoms. Aufgabe dieser molekularen Maschine ist das Herausschneiden nicht-kodierender Introns und das Zusammenfügen kodiereneder Exons um so funktionelle mRNA zu bilden. Die Zusammensetzung und Architektur von U snRNPs sind gut definiert. Auch ist der Kern- Zytoplasma Transport, der für die Reifung dieser Partikel notwendig sind, detailliert beschrieben worden. Außerdem weisen neueste Studien darauf hin, dass die Bildung von U snRNPs in vivo durch eine komplexe Maschinerie, die aus den Protein-Arginin- Methyltransferase 5 (PRMT5)- und Survival-Motor-Neuron (SMN)- Komplexen besteht, vermittelt wird. Die Entschlüsselung des Reaktionsmechanismus des zellulärem U snRNP Zusammenbaus würde als Musterbeispiel für unser Verständnis dienen, wie RNPs in einer Zelle gebildet werden. Folgende Erkenntnisse wurden in dieser Arbeit gewonnen: 1) Es wurde zunächst versucht eine komplette Bestandsliste der Untereinheiten des SMN-Komplexes zu erstellen. Dies wurde durch die biochemische Definition und Charakterisierung einer atypischen Komponente dieses Komplexes, des Unrip Proteins, erreicht. Dieses Protein bindet ausschliesslich im Zytoplasma an den SMN-Komplex und beeinflusst dessen subzelluläre Lokalisation. 2) Die komplette Inventarisierung des SMN-Komplexes ermöglichte die Untersuchung der Wechselwirkung aller Untereinheiten und somit die Untersuchung seiner Architektur. Diese Studie zeigte, dass die Proteine SMN, Gemin7 und Gemin8 das Rückgrat des SMN-Komplexes bilden auf dem die restlichen Untereinheiten modular angeordnet werden. 3) Die zwei oben erwähnten Studien bildeten die Grundlage, den Reaktionsmechanismus zellulärer U snRNP Zusammenlagerung zu entschlüsseln. Zunächst wurde eine frühe Phase im SMN-vermittelten U snRNP Zusammenbau analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass zwei Untereinheiten des U7 snRNP (LSm10 und 11) mit dem PRMT5-Komplex wechselwirken, ohne methyliert zu werden. Dies deutet darauf hin, dass die unterstützende Rolle des PRMT5-Komplexes von seiner Methylierungsaktivität unabhängig ist. 4) Schlüsselintermediate im Zusammenschluss von U snRNPs wurden identifiziert und durch eine Kombination von Biochemie und Strukturbiologie charakterisiert. In einer ersten Stufe bildet sich ein Vorgänger von U snRNPs mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6S aus. Dieses Intermediat, bestehend aus pICln (einer Untereinheit des PRMT5-Komplexes) und Sm Proteinen, stellt eine kinetische Falle in der U snRNP Zusammenlagerung dar. Das Voranschreiten zum maturen U snRNP hängt von der Aktivität des SMN-Komplexes ab, der als Katalysator wirkt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Ausbildung von U snRNPs strukturell ähnlich zu der Reaktion verläuft, die Polymerasen mit geringer Prozessivität an der DNA verankert und die als „clamp-loading“ bezeichnet wird. 5) Der menschliche SMN-Komplex setzt sich aus mehreren Untereinheiten zusammen. Es ist jedoch unbekannt, ob alle Teile des Komplexes für die Zusammenlagerung von U snRNPs notwendig sind. Diese Frage wurde durch eine Kombination aus Bioinformatik und Biochemie adressiert. Durch Datenbanksuchen in komplett sequenzierten Genomen wurde festgestellt, dass die evolutionär ursprüngliche Form des SMN-Komplexes aus den zwei Proteinen SMN und Gemin2 besteht. Die biochemische Reinigung des Komplexes der Taufliege Drosophila melanogaster offenbarte, dass er auch in diesem Organismus aus denselben zwei Untereinheiten zusammengebaut ist. Außerdem wurde der Beweis erbracht, dass das SMN-Gemin2 heterodimer notwendig und hinreichend ist, um U snRNPs akkurat zusammenzulagern. Zukünftige Studien werden weitere detaillierte Ansichten des Reaktionsmechanismus in der zellulären Zusammenlagerung von U snRNPs liefern. Die Ergebnisse, die in der vorliegenden Arbeit erhalten wurden, deuten darauf hin, dass die Untereinheiten SMN und Gemin2 des SMN-Komplexes für den Zusammenbau von U snRNPs hinreichend sind. Was also ist die Funktion der weiteren Untereinheiten des SMN-Komplexes? Die Rekonstitutionsschemata, die in dieser Arbeit etabliert wurden, werden essentiell für die Beantwortung dieser Frage sein. Darüberhinaus werden weitere mechanistische Einsichten in die Zusammenlagerung von U snRNPs von der Ermittlung von Strukturen der Assembly-Maschinerie in verschiedenen Zuständen abhängen. Die Voraussetzung für diese strukturbiologische Untersuchungen, die Möglichkeit ausreichende Mengen homogener Komplexe herzustellen, ist ebenfalls in dieser Arbeit geschaffen worden. KW - Small nuclear RNP KW - Katalysator KW - Enzym KW - Maschine KW - Biopolymere KW - Makromolekül KW - Biogenese KW - Reaktionsmechanismus KW - Small nuclear RNP KW - Catalyst KW - Enzyme KW - Molecular Machine KW - Chaperone KW - Macromolecular Complex Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40804 ER - TY - THES A1 - Christenn, Marcus T1 - Charakterisierung von Somatostatinrezeptor-Subtyp 4 interagierenden Proteinen in der Ratte (Rattus norvegicus) T1 - Characterisation of somatostatin receptor subtype 4 interacting proteins in the rat (Rattus norvegicus) N2 - Somatostatin ist ein regulatorisches Peptid, das eine Vielzahl von biologischen Prozessen innerhalb des Körpers beeinflußt. Die Wirkung von Somatostatin wird auf zellulärer Ebene über eine Familie von fünf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vermittelt, die entweder in G Protein-abhängiger Weise oder vermutlich auch über andere interagierende intrazelluläre Proteine auf nachgeschaltete Signaltransduktionswege wirken. Der Somatostatinrezeptor Subtyp 4 (SSTR4) wird hauptsächlich im Gehirn exprimiert und wirkt dort inhibierend auf die exzitatorische Signalweiterleitung. Es sind aber auch stimulierende Effekte des SSTR4 bekannt. Um das subtypspezifische Signalverhalten des SSTR4 weiter zu untersuchen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Proteine gesucht, die intrazellulär mit dem SSTR4 interagieren und so seine physiologischen Effekte beeinflussen. In einem ersten Ansatz konnten drei mögli-che Interaktionspartner mit Hilfe des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems identifiziert werden, die aber in nachfolgenden Untersuchungen als unpezifisch eingestuft wurden. Mit Hilfe einer Affinitätschromatografie wurden dann zwei Proteine identifiziert, die spezifisch mit dem SSTR4 interagieren. Sowohl PSD-95 als auch PSD-93 (Postsynaptic density protein of 95 kDa bzw. 93kDa) wurden mit einem immobilisierten Peptid präzipitiert, das die neun C-terminalen Aminosäuren des SSTR4 enthält. Die Interaktion des SSTR4 mit PSD 95 wurde im Weiteren näher charakterisiert. In einem Bindungsexperiment mit rekombinaten Proteinen konnte gezeigt werden, dass die Interaktion durch die 1. und 2. PDZ-Domäne von PSD-95 vermittelt wird. In humanen embryonalen Nieren-Zellen (HEK293), die den SSTR4 stabil exprimieren, konnte PSD-95 mit dem Rezeptor koimmunpräzipitiert werden. Nach Koexpression von PSD-95 und SSTR4 findet man eine partielle Kolokalisierung beider Proteine an der Zellmembran, wobei aber der Großteil des PSD-95 weiterhin eine diffuse zytoplasmatische Verteilung zeigt. Die Interaktion wurde in vivo sowohl immunhistochemisch in kultivierten Hippocampus-Neuronen als auch durch Koimmunpräzipitation beider Proteine aus Rattengehirn-Lysaten nachgewiesen. Die Interaktion von PSD-95 mit dem SSTR4 beeinflußt weder die Agonisten-induzierte Internalisierung des Rezeptors in HEK293-Zellen, noch die Kopplung des Rezeptors an einen G-Protein-gekoppelten einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal in Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. Durch die Interaktion mit PSD-95 wird der SSTR4 in physikalische Nähe zu bestimmten Zielproteinen gebracht, über die nachfolgend die Somatostatineffekte weitervermittelt werden. So ermöglicht die Interaktion vermutlich eine Integration des SSTR4 in den postsynaptischen Komplex aus PSD-95 und Glutamatrezeptoren, wo der SSTR4 die bereits beschrieben regulatorischen Effekte auf die Glutamat-vermittelte exzitatorische Signaltransduktion ausüben kann. N2 - Somatostatin is a regulatory peptid, which affects a multiplicity of biological processes within the body. The effects of Somatostatin are mediated by a family of five G-protein-coupled receptors, which act on several downstream signaltransduction pathways either in a G-protein-dependent way or probably in a G-protein-independent manner via intracellular interacting proteins. The somatostatin receptor subtype 4 (SSTR4) is mainly expressed in brain, where it inhibits the excitatory neurotransmission. In addition, excitatory effects of SSTR4 have also been published. In order to examine the subtype specific signalling of SSTR4, I tried to identify intracellular proteins which interact directly with the SSTR4 and affect its physiological effects. Using the yeast two-hybrid system I identified three possible interaction partners for SSTR4, which were however classified as non-specific in subsequent experiments. In a second approach two proteins which interact with SSTR4 could be identified by affinity-chromatography. Both proteins PSD-95 and PSD-93 (Postsynaptic density protein of 95 kDa and 93kDa) were precipitated specifically with an immobilized peptid that contains the nine C-terminal amino acids of SSTR4. The interaction of the SSTR4 with PSD-95 was further characterized. In a binding experiment with recombinant proteins I could show that the interaction is mediated by the 1st and 2nd PDZ-domain of PSD-95. In human embryonic kidney cells (HEK293) which stably express SSTR4, PSD-95 could be coprecipitated with the receptor. After coexpression of PSD-95 and SSTR4 both proteins are partially colocalized at the plasma membrane. The majority of the PSD-95 however shows a diffuse cytoplasmic distribution. The in vivo interaction was proven by immunohistochemistry on cultivated hippocampal neurons and by coimmunoprecipitation of both proteins from rat brain lysates. The interaction of PSD-95 with SSTR4 affected neither the agonist induced internalisation of the receptor in HEK293 cells, nor the coupling of the receptor to a G-protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel in oocytes obtained from the african clawed frog Xenopus laevis. By the interaction with PSD-95, SSTR4 is brought into physical proximity to certain target proteins which mediate the effects of somatostatin. Thus the interaction probably allows an integration of SSTR4 into the postsynaptic complex of PSD-95 and glutamergic receptors, where SSTR4 could regulate the glutamat-mediated excitatory signaltransduction. KW - Ratte KW - Somatostatin KW - G-Proteine KW - Rezeptor KW - G-Protein-gekoppelter Rezeptor KW - Somatostatinrezeptor Subtyp 4 KW - interagierende Proteine KW - PDZ-Domäne KW - PSD-95 KW - G-protein-coupled receptor KW - somatostatin receptor subtype 4 KW - interacting proteins KW - PDZ-domain KW - PSD-95 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14253 ER - TY - THES A1 - Colnot, Thomas T1 - Beurteilung von Phyto- und Xenoöstrogenen am Beispiel ausgewählter Substanzen T1 - Assessment of Phyto- and Xenoestrogens for Selected Substances N2 - Bei Daidzein und Bisphenol A handelt es sich um zwei Vertreter einer Klasse von Stoffen, die als „Umwelthormone“ (engl. endocrine disrupter) bezeichnet werden. Aus der Gruppe der Phytoöstrogene wurde Daidzein als wichtiger Vertreter, der in hohen Konzentrationen in vielen Nutzpflanzen und Nahrungsmitteln vorkommt, ausgewählt. Sojaprodukte, die den größten Beitrag einer menschlichen Exposition gegen Daidzein liefern, werden in zunehmendem Maße auch in westlichen Ländern konsumiert. Bisphenol A wurde als Vertreter der Xenoöstrogene gewählt, da es - was Weltjahresproduktion und Verwendung angeht - die wohl wichtigste Substanz dieser Gruppe darstellt. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Biotransformation und Toxikokinetik der beiden Verbindungen nach oraler Gabe in der Ratte aufgeklärt. Dabei konnte gezeigt werden, daß die orale Bioverfügbarkeit beider Substanzen in der Ratte sehr gering war. Maximal zehn Prozent der jeweils applizierten Dosis konnten im Urin der Tiere wiedergefunden werden. Als Hauptmetabolit wurden sowohl von Daidzein als auch von Bisphenol A das jeweilige Glucuronid-Konjugat gebildet. Bei Daidzein überwog in der männlichen Ratte zusätzlich das Sulfat-Konjugat. Der Anteil an freier, d.h. unkonjugierter Verbindung betrug im Urin der Tiere zwischen 1 und 3 Prozent der Dosis. Außer den Phase II-Konjugaten, die aufgrund ihrer mangelnden östrogenen Wirksamkeit zu einer Detoxifizierung der beiden Verbindungen führte, konnten nach Gabe von Bisphenol A in der Ratte keine weiteren Metabolite identifiziert werden. Nach Exposition mit Daidzein konnten in den Faeces der Tiere in geringem Umfang die beiden reduktiven Metabolite Equol und O-DMA gefunden werden. Diese wurden wahrscheinlich im Magen-Darm-Trakt durch die Bakterien der Darmflora gebildet. Sowohl Daidzein als auch Bisphenol A wurden bei der Ratte nur unvollständig aus dem Magen-Darm-Trakt resorbiert; der Großteil der gegebenen Dosis wurde als unveränderte Substanz in den Faeces wiedergefunden. Bei Bisphenol A wurde die Ausscheidung zudem durch einen ausgeprägten enterohepatischen Kreislauf verzögert. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zunächst empfindliche GC/MS- und HPLC-Methoden zur Quantifizierung der Verbindungen in humanen Plasma- und Urinproben entwickelt. Danach wurden freiwillige Probanden oral mit jeweils 5 mg Daidzein bzw. d16-Bisphenol A exponiert, um Daten zur Biotransformation und Toxikokinetik der beiden Substanzen im Mensch zu erhalten. Wegen des deutlich meßbaren Hintergrundes an Bisphenol A, das in allen Kontrollproben nachweisbar war, wurde für die Humanstudie die deuterierte Verbindung gegeben, für die kein störender Hintergrund meßbar war. Die Bioverfügbarkeit der Gesamt-Substanz (freie Verbindung + Konjugate) im Menschen war in beiden Fällen deutlich höher als in der Ratte. Von Daidzein wurden 40 Prozent (Ratte 10 Prozent), von Bisphenol A > 95 Prozent (Ratte 13 Prozent) der applizierten Dosis im Urin der Probanden wiedergefunden. Dabei zeigte sich ein sehr effizienter Phase II-Metabolismus; weniger als 1 Prozent der Glucuronid-Konjugatkonzentrationen wurden als unveränderte Substanz gefunden. Das Glucuronid stellte in beiden Fällen den einzigen nachweisbaren Metaboliten dar. Die Elimination von Daidzein und Bisphenol A verlief in den beiden Studien sehr schnell nach einer Kinetik erster Ordnung. Im Gegensatz zu der Ratte konnten auch bei Bisphenol A keine Auffälligkeiten in den Ausscheidungskurven beobachtet werden, Hinweise auf einen enterohepatischen Kreislauf im Menschen wurden nicht gefunden. Im Falle von Bisphenol A wurde fast die komplette applizierte Dosis (> 95 Prozent) in Form des Glucuronides im Urin wiedergefunden. Anhand der erhobenen Daten wurde anschließend eine Beurteilung des Risikos für den Menschen abgegeben. N2 - Daidzein and bisphenol a are two representatives of a class of substances known as endocrine disrupters. A common mark of these compounds is their affinity to at least one of two estrogen receptors in vitro. This leads to speculation on how such compounds may interfere with hormonal regulation in animals and humans. As an important representative of the group of phytoestrogens daidzein has been chosen. Daidzein occurs in high concentrations in plants like soy, thus contributing to a human exposure via food. Bisphenol a has been chosen for this thesis because it probably is the most important industrial chemical suspected of endocrine activity, considering worldwide annual production numbers. Biotransformation and kinetics of the two model substances, daidzein and bisphenol a, have been elucidated. The results showed that oral bioavailability of the two chemicals has been very low. Less than ten percent of the dose given could be recovered from urine of animals. The major metabolite in biotransformation of both daidzein and bisphenol a proved to be the glucuronide of the respective compound. Additionally, after application of daidzein to rats, daidzein sulfate could be identified specifically in male animals only. The percentage of unconjugated parent compound in both studies has been shown to be between one and three percent of the dose given. No further metabolites could be found after oral administration of bpa to rats; after oral administration of daidzein to rats, equol and o-dma could be identified as minor metabolites in feces of animals. In both studies, the major part of the administered dose could be recovered as unchanged parent compound from feces. In the case of BPA, elimination was slowed by the occurence of enterohepatic circulation. This explains why the elimination of BPA and its conjugates was slow and did not follow a first-order kinetics. Furthermore, sensitive analytical methods (HPLC and GC/MS) were developed to allow quantification of low amounts of the two model compounds in human plasma und urine samples. To obtain information on the biotransformation and toxicokinetics in humans, volunteers were given 5 mg of either daidzein or d16-bisphenol a. Because of a rather high background for bisphenol a in control samples, deuterated bisphenol a had been chosen for the human study. Bioavailability of total substance (i.e. unconjugated + conjugated compound) in humans was markedly higher than in rats. After controlled exposure to daidzein 40 per cent (as compared to 10 per cent in rats) could be recovered from urine, in the case of d16-bpa more than 95 per cent (as compared to 13 per cent in rats) could be recovered. Less than 1 per cent of the concentration of the conjugated compound could be found as unchanged parent compound. In both cases, the glucuronide has been identified as sole metabolite in human volunteers. Elimination of both substances was quick and followed a first order kinetics. In the case of d16-bisphenol a, all of the given dose could be recovered from urine. With the data gathered, an assessment of the risk posed by these chemicals to humans was given. KW - Phytoöstrogen KW - Bisphenol A KW - Biotransformation KW - Toxikologie KW - Biotransformation KW - Toxikokinetik KW - Phytoöstrogene KW - Xenoöstrogene KW - Daidzein KW - Bisphenol A KW - Metabolismus KW - biotransformation KW - toxicokinetics KW - phytoestrogens KW - xenoestrogens KW - daidzein KW - bisphenol A KW - metabolism Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180438 ER - TY - CHAP A1 - Das, Hirakjyoti A1 - Zografakis, Alexandros A1 - Oeljeklaus, Silke A1 - Warscheid, Bettina T1 - Analysis of Yeast Peroxisomes via Spatial Proteomics T1 - Analyse von Hefeperoxisomen durch Spatial Proteomik T2 - Peroxisomes N2 - Peroxisomes are ubiquitous organelles with essential functions in numerous cellular processes such as lipid metabolism, detoxification of reactive oxygen species and signaling. Knowledge of the peroxisomal proteome including multi-localized proteins and, most importantly, changes of its composition induced by altering cellular conditions or impaired peroxisome biogenesis and function is of paramount importance for a holistic view on peroxisomes and their diverse functions in a cellular context. In this chapter, we provide a spatial proteomics protocol specifically tailored to the analysis of the peroxisomal proteome of baker's yeast that enables the definition of the peroxisomal proteome under distinct conditions and to monitor dynamic changes of the proteome including the relocation of individual proteins to a different cellular compartment. The protocol comprises subcellular fractionation by differential centrifugation followed by Nycodenz density gradient centrifugation of a crude peroxisomal fraction, quantitative mass spectrometric measurements of subcellular and density gradient fractions and advanced computational data analysis, resulting in the establishment of organellar maps on a global scale. KW - peroxisome purification KW - mass spectrometry KW - label-free quantification KW - protein localization KW - spatial proteomics KW - Saccharomyces cerevisiae KW - differential centrifugation KW - density gradient centrifugation KW - organellar mapping Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-327532 PB - Springer ET - accepted version ER - TY - JOUR A1 - De Giorgi, Valeria A1 - Buonaguro, Luigi A1 - Worschech, Andrea A1 - Tornesello, Maria Lina A1 - Izzo, Francesco A1 - Marincola, Francesco M. A1 - Wang, Ena A1 - Buonaguro, Franco M. T1 - Molecular Signatures Associated with HCV-Induced Hepatocellular Carcinoma and Liver Metastasis JF - PLoS ONE N2 - Hepatocellular carcinomas (HCCs) are a heterogeneous group of tumors that differ in risk factors and genetic alterations. In Italy, particularly Southern Italy, chronic hepatitis C virus (HCV) infection represents the main cause of HCC. Using high-density oligoarrays, we identified consistent differences in gene-expression between HCC and normal liver tissue. Expression patterns in HCC were also readily distinguishable from those associated with liver metastases. To characterize molecular events relevant to hepatocarcinogenesis and identify biomarkers for early HCC detection, gene expression profiling of 71 liver biopsies from HCV-related primary HCC and corresponding HCV-positive non-HCC hepatic tissue, as well as gastrointestinal liver metastases paired with the apparently normal peri-tumoral liver tissue, were compared to 6 liver biopsies from healthy individuals. Characteristic gene signatures were identified when normal tissue was compared with HCV-related primary HCC, corresponding HCV-positive non-HCC as well as gastrointestinal liver metastases. Pathway analysis classified the cellular and biological functions of the genes differentially expressed as related to regulation of gene expression and post-translational modification in HCV-related primary HCC; cellular Growth and Proliferation, and Cell-To-Cell Signaling and Interaction in HCV-related non HCC samples; Cellular Growth and Proliferation and Cell Cycle in metastasis. Also characteristic gene signatures were identified of HCV-HCC progression for early HCC diagnosis. Conclusions: A diagnostic molecular signature complementing conventional pathologic assessment was identified. KW - identification KW - hepatitis C virus KW - United States KW - gene expression KW - class I KW - endoplasmic reticulum KW - motile phenotype KW - bladder cancer KW - up-regulation KW - target Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-131155 VL - 8 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Denk, S. A1 - Schmidt, S. A1 - Schurr, Y. A1 - Schwarz, G. A1 - Schote, F. A1 - Diefenbacher, M. A1 - Armendariz, C. A1 - Dejure, F. A1 - Eilers, M. A1 - Wiegering, Armin T1 - CIP2A regulates MYC translation (via its 5′UTR) in colorectal cancer JF - International Journal of Colorectal Disease N2 - Background Deregulated expression of MYC is a driver of colorectal carcinogenesis, suggesting that decreasing MYC expression may have significant therapeutic value. CIP2A is an oncogenic factor that regulates MYC expression. CIP2A is overexpressed in colorectal cancer (CRC), and its expression levels are an independent marker for long-term outcome of CRC. Previous studies suggested that CIP2A controls MYC protein expression on a post-transcriptional level. Methods To determine the mechanism by which CIP2A regulates MYC in CRC, we dissected MYC translation and stability dependent on CIP2A in CRC cell lines. Results Knockdown of CIP2A reduced MYC protein levels without influencing MYC stability in CRC cell lines. Interfering with proteasomal degradation of MYC by usage of FBXW7-deficient cells or treatment with the proteasome inhibitor MG132 did not rescue the effect of CIP2A depletion on MYC protein levels. Whereas CIP2A knockdown had marginal influence on global protein synthesis, we could demonstrate that, by using different reporter constructs and cells expressing MYC mRNA with or without flanking UTR, CIP2A regulates MYC translation. This interaction is mainly conducted by the MYC 5′UTR. Conclusions Thus, instead of targeting MYC protein stability as reported for other tissue types before, CIP2A specifically regulates MYC mRNA translation in CRC but has only slight effects on global mRNA translation. In conclusion, we propose as novel mechanism that CIP2A regulates MYC on a translational level rather than affecting MYC protein stability in CRC. KW - CIP2A KW - MYC KW - translation KW - colon cancer Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-280092 VL - 36 IS - 5 ER -