TY - THES A1 - Schmitz, Tobias T1 - Functional coatings by physical vapor deposition (PVD) for biomedical applications T1 - Funktionelle Schichten hergestellt durch physikalische Gasphasenabescheidung für biomedizinische Anwendungen N2 - Metals are the most used materials for implant devices, especially in orthopedics, but despite their long history of application issues such as material failure through wear and corrosion remain unsolved leading to a certain number of revision surgeries. Apart from the problems associated with insufficient material properties, another serious issue is an implant associated infection due to the formation of a biofilm on the surface of the material after implantation. Thus, improvements in implant technology are demanded, especially since there is a projected rise of implants needed in the future. Surface modification methods such as physical vapour deposition (PVD), oxygen diffusion hardening and electrochemical anodization have shown to be efficient methods to improve the surfaces of metallic bulk materials regarding biomedical issues. This thesis was focused on the development of functional PVD coatings that are suitable for further treatment with surface modification techniques originally developed for bulk metals. The aim was to precisely adjust the surface properties of the implant according to the targeted application to prevent possible failure mechanisms such as coating delamination, wear or the occurrence of post-operative infections. Initially,  tantalum layers with approx 5 µm thickness were deposited at elevated substrate temperatures on cp Ti by RF magnetron sputtering. Due to the high affinity of tantalum to oxygen, these coatings are known to provide a self healing capacity since the rapid oxide formation is known to close surface cracks. Here, the work aimed to reduce the abrupt change of mechanical properties between the hard and brittle coating and the ductile substrate by creating an oxygen diffusion zone. It was found that the hardness and adhesion could be significantly increased when the coatings were treated afterwards by oxygen diffusion hardening in a two step process. Firstly, the surface was oxidized at a pressure of 6.7•10-3 mbar at 350 450 °C, followed by 1-2 h annealing in oxygen-free atmosphere at the same temperature leading to a diffusion of oxygen atoms into deeper parts of the substrate as proved by X-ray diffraction (XRD) analysis. The hereby caused mechanical stress in the crystal lattice led to an increase in Vickers hardness of the Ta layers from 570 HV to over 900 HV. Investigations into the adhesion of oxygen diffusion treated samples by Rockwell measurements demonstrated an increase of critical force for coating delamination from 12 N for untreated samples up to 25 N for diffusion treated samples. In a second approach, the development of modular targets aimed to produce functional coatings by metallic doping of titanium with biologically active agents. This was demonstrated by the fabrication of antimicrobial Ti(Ag) coatings using a single magnetron sputtering source equipped with a titanium target containing implemented silver modules under variation of bias voltage and substrate temperature. The deposition of both Ti and Ag was confirmed by X-ray diffraction and a clear correlation between the applied sputtering parameters and the silver content of the coatings was demonstrated by ICP-MS and EDX. Surface-sensitive XPS measurements revealed that higher substrate temperatures led to an accumulation of Ag in the near-surface region, while the application of a bias voltage had the opposite effect. SEM and AFM microscopy revealed that substrate heating during film deposition supported the formation of even and dense surface layers with small roughness values, which could even be enforced by applying a substrate bias voltage. Additional elution measurements using ICP-MS showed that the release kinetics depended on the amount of silver located at the film surface and hence could be tailored by variation of the sputter parameters. In a final step, the applied Ti and Ti(Ag) coatings deposited on cp Ti, stainless steel (316L) and glass substrates were subsequently nanostructured using a self-ordering process induced by electrochemical anodization in aqueous fluoride containing electrolytes. SEM analysis showed that nanotube arrays could be grown from the Ti and Ti(Ag) coatings deposited at elevated temperatures on any substrate, whereby no influence of the substrate on nanotube morphology could be observed. EDX measurements indicated that the anodization process led to the selective etching of Ti from Ti(Ag) coating. Further experiments on coatings deposited on glass surfaces revealed that moderate substrate temperatures during deposition resulting in smooth Ti layers as determined by AFM measurements, are favorable for the generation of highly ordered nanotube arrays. Such arrays exhibited superhydrophilic behavior as proved by contact angle measurements. XRD analysis revealed that the nanostructured coatings were amorphous after anodization but could be crystallized to anatase structure by thermal treatment at temperatures of 450°C. N2 - Metalle sind die am häufigsten verwendeten Werkstoffe für orthopädische Skelettimplantate, wobei trotz der langjährigen Anwendungserfahrung immer noch Probleme wie Verschleiß und Korrosion zum Materialversagen führen können und damit eine Revisionsoperation notwendig machen. Abgesehen von solchen materialbedingten Problemen, sind implantatassoziierte Infektionen aufgrund der Bildung eines Biofilms auf der Werkstoffoberfläche nach der Implantation ebenfalls klinisch von hoher Relevanz. Somit sind Verbesserungen in der Implantattechnologie notwendig, zumal ein Anstieg der Anzahl von eingebrachten Implantaten in der Zukunft prognostiziert wird. Oberflächenmodifizierungsverfahren, wie die physikalische Dampfphasenabscheidung (PVD), Sauerstoffdiffusionshärtung und elektrochemische Anodisierung sind dabei effiziente Methoden, um die Oberflächeneigenschaften von metallischen Werkstoffen für biomedizinische Anwendungen einzustellen. Diese Arbeit ist dabei auf die Entwicklung funktioneller PVD-Beschichtungen gerichtet, wobei deren weiterführende Modifikation mit ursprünglich für Volumenwerkstoffe entwickelten Verfahren erfolgt. Ziel war es, hierdurch die Eigenschaften der Implantatoberflächen noch anwendungsgezielter einzustellen, um möglichen Versagensmechanismen wie Schichtdelamination, Verschleiß oder das Auftreten einer post-operativen Infektion vorbeugen zu können. Zunächst wurden -Tantalschichten mit ca. 5 µm Dicke bei erhöhten Substrattemperaturen auf cp-Titan durch RF-Magnetron-Sputtern abgeschieden. Aufgrund der hohen Affinität von Tantal zu Sauerstoff ist für diese Beschichtungen ein Selbstheilungsmechanismus bekannt, da die schnelle Oxidbildung Oberflächenrisse schließt. Hier hatte die Arbeit es zum Ziel, die abrupte Änderung der mechanischen Eigenschaften zwischen der harten und spröden Beschichtung und dem duktilen Substrat durch die Erzeugung einer Sauerstoffdiffusionszone zu reduzieren. Es wurde gezeigt, dass die Härte und Adhäsion der Schichten durch ein zweistufiges Sauerstoffdiffusionshärten deutlich erhöht werden konnte. Hierzu wurde zunächst die Oberfläche bei einem Druck von 6,7*10-3 mbar bei 350-450 °C oxidiert. Ein nachfolgendes Anlassen in sauerstofffreier Atmosphäre bei gleicher Temperatur für 1-2 h führte dann zu einer Diffusion von Sauerstoffatomen in tiefere Bereiche des metallischen Substrats wie durch Röntgenbeugung (XRD) gezeigt werden konnte. Die hierdurch verursachte mechanische Spannung im Kristallgitter führte zu einem Anstieg der Vickers-Härte der Tantal-Schichten von 570 HV auf 900 HV. Untersuchungen zur Haftung der Sauerstoffdiffusions-behandelten Proben anhand von Rockwell Messungen zeigten einen Anstieg der zur Delamination der Beschichtung notwendigen kritischen Kraft von 12 N für unbehandelte Proben auf bis zu 25 N für die diffusionsgeglühten Proben. Ein zweiter Ansatz war auf die Entwicklung modularer Targets zur Erzeugung funktioneller Titanbeschichtungen mit Dotierungen aus biologisch aktiven Metallionen gerichtet. Dies wurde durch die Herstellung von antimikrobiellen Ti(Ag) Beschichtungen über eine einzelne Titan-Magnetronsputterquelle mit implementierten Silbermodulen unter Variation der Vorspannung und Substrattemperatur erreicht. Die Abscheidung von sowohl Ti und Ag wurde durch Röntgenbeugung gezeigt und es konnte eine valide Korrelation zwischen den angewandten Sputter-Parametern und dem Silbergehalt der Beschichtungen durch ICP-MS und EDX-Messungen bestätigt werden. Oberflächenempfindliche XPS-Messungen zeigten, dass höhere Substrattemperaturen zu einer Anreicherung von Ag im oberflächennahen Bereich, während das Anlegen einer Vorspannung den gegenteiligen Effekt hatte. REM und AFM-mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Aufheizung des Substrats während der Schichtabscheidung die Bildung glatter und dichter Schichten mit geringer Rauhtiefe unterstützt, was durch Anlegen einer Vorspannung nochmals verstärkt werden konnte. Zusätzliche Freisetzungsstudien durch ICP-MS ergaben, dass die Freisetzungskinetik abhängig war von der Menge an Silber im oberflächennahen Bereich und somit über die Variation der Beschichtungsparameter eingestellt werden kann. In einem letzten Schritt wurden auf cp Ti, Edelstahl (316L) und Glassubstrate abgeschiedene Ti und Ti(Ag) Beschichtungen durch eine nachgeschaltete, elektrochemische Anodisierung in einem wässrigen fluoridhaltigen Elektrolyten nanostrukturiert. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass hierdurch nanotubuläre Arrays aus den Beschichtungen bei erhöhter Temperatur unabhängig von der Art des Substrats erhalten werden konnten, wobei kein Einfluss des Substrattyps auf die Morphologie der Nanostrukturen beobachtet werden konnte. EDX-Messungen zeigten, dass die Anodisierung zu einer selektiven Ätzung von Titan in Ti(Ag) Beschichtung führte. Weitere Versuche an Schichtsystemen auf Glasoberflächen ergaben, dass glatte Ti-Schichten durch moderate Substrattemperaturen während der Abscheidung entstanden, und diese sich vorteilhaft auf die Erzeugung hochgeordneter nanotubulärer Arrays auswirkte. Derartige Arrays zeigten in Kontaktwinkelmessungen ein superhydrophiles Verhalten. Röntgendiffraktometrische Analysen ergaben eine initial nach der Anodisierung amorphe Struktur der nanostrukturierten Beschichtungen, wobei durch eine thermische Behandlung bei Temperaturen von 450 °C die Bildung einer Anatas-Struktur beobachtet wurde. KW - PVD-Verfahren KW - Tantal KW - Nanoröhre KW - PVD coatings KW - Oxygen diffusion hardening KW - Ti(Ag) coatings KW - Nanotubular coatings KW - PVD Beschichtung KW - Sauerstoffdiffusionshärtung KW - Ti(Ag) Beschichtungen KW - Nanotubuläre Beschichtungen Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144825 ER - TY - THES A1 - Feineis, Susanne T1 - Thioether-poly(glycidol) as multifunctional coating system for gold nanoparticles T1 - Thioether-Poly(glycidol) als multifunktionales Beschichtungssystem für Gold-Nanopartikel N2 - The aim of this thesis was the development of a multifunctional coating system for AuNPs based on thioether polymers, providing both excellent colloidal stability and a variable possibility to introduce functionalities for biological applications. First, two thioether-polymer systems were synthesised as a systematic investigation into colloidal stabilisation efficacy. Besides commonly used monovalent poly(ethylene glycol) (PEG-SR), its structural analogue linear poly(glycidol) (PG-SR) bearing multiple statistically distributed thioether moieties along the backbone was synthesised. Additionally, respective thiol analogues (PEG-SH and PG-SH) were produced and applied as reference. Successive modification of varyingly large AuNPs with aforementioned thiol- and thioether-polymers was performed via ligand exchange reaction on citrate stabilised AuNPs. An increased stabilisation efficacy of both thioether-polymers against biological and physiological conditions, as well as against freeze-drying compared to thiol analogues was determined. Based on the excellent colloidal stabilisation efficacy and multi-functionalisability of thioether-PG, a plethora of functional groups, such as charged groups, hydrophilic/hydrophobic chains, as well as bio-active moieties namely diazirine and biotin was introduced to the AuNP surface. Moreover, the generic and covalent binding of diazirine-modified PG-SR with biomolecules including peptides and proteins was thoroughly demonstrated. Lastly, diverse applicability and bioactivity of aforementioned modified particles in various studies was displayed, once more verifying the introduction of functionalities. On the one hand the electrostatic interaction of charged AuNPs with hydrogels based on hyaluronic acid was applied to tune the release kinetics of particles from three-dimensional scaffolds. On the other hand the strong complexation of siRNA onto two positively charged AuNPs was proven. The amount of siRNA payload was tuneable by varying the surface charge, ionic strength of the surrounding medium and the N/P ratio. Moreover, the biological activity and selectivity of the biotin-streptavidin conjugation was verified with respectively functionalised particles in controlled agglomeration test and in laser-triggered cell elimination experiments. In the latter, streptavidin-functionalised AuNPs resulted in excellent depletion of biotinylated cells whereas unfunctionalised control particles failed, excluding unspecific binding of these particles to the cell surface. N2 - Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines multifunktionalen Beschichtungssystems für Gold Nanopartikel (AuNP) basierend auf Thioether-Polymeren, das sowohl eine hervorragende kolloidale Stabilität aufweist, als auch eine variable Einbringung von Funktionalitäten für biologische Anwendungen ermöglicht. Um eine Systematik der Untersuchung von kolloidaler Stabilisierungseffizienz zu gewährleisten, wurden zwei Thioether-Polymersysteme synthetisiert. Diese basierten auf dem gebräuchlichen monovalenten Polyethylenglykol (PEG-SR) und dessen Strukturanalog Polyglycidol (PG-SR), das mehrere statistisch verteilte Thioethergruppen an seinem Rückgrat trägt. Zusätzlich wurden entsprechende Thiol-Polymere hergestellt (PEG-SH and PG-SH) und als Referenz eingesetzt. Die anschließende Modifikation von unterschiedlich großen AuNP mit zuvor erwähnten Thiol- und Thioether-Polymeren wurde über eine Liganden-Austausch-Reaktion auf Citrat-stabilisierten AuNP durchgeführt. Für beide Thioether-Polymere wurde eine höhere Stabilisierungseffizienz, insbesondere gegen biologische und physiologische Bedingungen, als auch gegen Gefriertrocknung im Vergleich zu entsprechenden Thiol-Analogen in einer systematischen Studie mit unterschiedlich großen AuNP festgestellt. Basierend auf der exzellenten kolloidalen Stabilisierungseffizienz und der multi-Funktionalisierbarkeit von Thioether-PG, wurde eine Vielzahl an funktioneller Einheiten, wie geladenen Gruppen, hydrophilen/hydrophoben Ketten und bioaktive Einheiten wie Diazirin und Biotin auf die AuNP Oberfläche eingebracht. Des Weiteren wurde die generische und kovalente Bindung zwischen Diazirin-modifiziertem PG-SR und Biomolekülen, wie Peptiden und Proteinen ausführlich aufgezeigt. Zuletzt, wurde die vielfältige Anwendungsmöglichkeit und Bioaktivität der zuvor erwähnten modifizierten Partikel in diversen Studien dargestellt, wodurch nochmals die erfolgreiche Einbringung der Funktionalitäten verifiziert wurde. Zum einen wurde hierbei die elektrostatische Wechselwirkung zwischen geladenen AuNP und Hydrogelen, die auf Hyaluronsäure basierten genutzt, um die Freisetzungskinetik der Partikel aus den drei-dimensionalen Gerüsten zu steuern. Zum anderen wurde die starke Komplexierung von siRNA an zwei unterschiedlich stark positiv geladene AuNP nachgewiesen. Die Menge an komplexierter siRNA konnte über Variation der Oberflächenladung, der Ionenstärke des umgebenden Mediums und des N/P Verhältnisses eingestellt werden. Zudem wurde die biologische Aktivität und Selektivität der Biotin-Streptavidin Konjugation mittels entsprechend funktionalisierter AuNP in kontrollierten Agglomerationstests und in ausführlichen Laser-induzierten Zelleliminationsstudien nachgewiesen. In letzteren Studien riefen Streptavidin-funktionalisierte AuNP exzellente Depletion von biotinylierten-Zellen hervor, wohingegen unfunktionalisierte Kontrollpartikel versagten, was eine unspezifische Bindung dieser Partikel an die Zelloberfläche ausschloss. KW - Nanopartikel KW - Gold-Nanoparticles KW - Thioether-Poly(glycidol) KW - Colloidal Stability KW - Multifunctionalisability Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172902 ER - TY - THES A1 - Stuckensen, Kai T1 - Fabrication of hierarchical cell carrier matrices for tissue regeneration by directional solidification T1 - Herstellung hierarchischer Zellträger-Matrices zur Geweberegeneration mittels gerichteter Erstarrung N2 - The key hypothesis of this work represented the question, if mimicking the zonal composition and structural porosity of musculoskeletal tissues influences invading cells positively and leads to advantageous results for tissue engineering. Conventional approaches in tissue engineering are limited in producing monolithic “scaffolds” that provide locally variating biological key signals and pore architectures, imitating the alignment of collagenous fibres in bone and cartilage tissues, respectively. In order to fill this gap in available tissue engineering strategies, a new fabrication technique was evolved for the production of scaffolds to validate the hypothesis. Therefore, a new solidification based platform procedure was developed. This process comprises the directional solidification of multiple flowable precursors that are “cryostructured” to prepare a controlled anisotropic pore structure. Porous scaffolds are attained through ice crystal removal by lyophilisation. Optionally, electrostatic spinning of polymers may be applied to provide an external mesh on top or around the scaffolds. A consolidation step generates monolithic matrices from multi zonal structures. To serve as matrix for tissue engineering approaches or direct implantation as medical device, the scaffold is sterilized. An Adjustable Cryostructuring Device (ACD) was successively developed; individual parts were conceptualized by computer aided design (CAD) and assembled. During optimisation, a significant performance improvement of the ACDs accessible external temperature gradient was achieved, from (1.3 ± 0.1) K/mm to (9.0 ± 0.1) K/mm. Additionally, four different configurations of the device were made available that enabled the directional solidification of collagenous precursors in a highly controlled manner with various sample sizes and shapes. By using alginate as a model substance the process was systematically evaluated. Cryostructuring diagraphs were analysed yielding solidification parameters, which were associated to pore sizes and alignments that were determined by image processing. Thereby, a precise control over pore size and alignment through electrical regulation of the ACD could be demonstrated. To obtain tissue mimetic scaffolds for the musculoskeletal system, collagens and calcium phosphates had to be prepared to serve as raw materials. Extraction and purification protocols were established to generate collagen I and collagen II, while the calcium phosphates brushite and hydroxyapatite were produced by precipitation reactions. Besides the successive augmentation of the ACD also an optimization of the processing steps was crucial. Firstly, the concentrations and the individual behaviour of respective precursor components had to be screened. Together with the insights gained by videographic examination of solidifying collagen solutions, essential knowledge was gained that facilitated the production of more complex scaffolds. Phenomena of ice crystal growth during cryostructuring were discussed. By evolutionary steps, a cryostructuring of multi-layered precursors with consecutive anisotropic pores could be achieved and successfully transferred from alginate to collagenous precursors. Finally, very smooth interfaces that were hardly detectable by scanning electron microscopy (SEM) could be attained. For the used collagenous systems, a dependency relation between adjustable processing parameters and different resulting solidification morphologies was created. Dehydrothermal-, diisocyanate-, and carbodiimide- based cross linking methods were evaluated, whereby the “zero length” cross linking by carbodiimide was found to be most suitable. Afterwards, a formulation for the cross linking solution was elaborated, which generated favourable outcomes by application inside a reduced pressure apparatus. As a consequence, a pore collapse during wet chemical cross linking could be avoided. Complex monolithic scaffolds featuring continuous pores were fabricated that mimicked structure and respective composition of different areas of native tissues by the presence of biochemical key stimulants. At first, three types of bone scaffolds were produced from collagen I and hydroxyapatite with appropriate sizes to fit critical sized defects in rat femurs. They either featured an isotropic or anisotropic porosity and partly also contained glycosaminoglycans (GAGs). Furthermore, meniscus scaffolds were prepared by processing two precursors with biomimetic contents of collagen I, collagen II and GAGs. Here, the pore structures were created under boundary conditions, which allowed an ice crystal growth that was nearly orthogonal to the external temperature gradient. Thereby, the preferential alignment of collagen fibres in the natural meniscus tissue could be mimicked. Those scaffolds owned appropriate sizes for cell culture in well plates or even an authentic meniscus shape and size. Finally, osteochondral scaffolds, sized to either fit well plates or perfusion reactors for cell culture, were fabricated to mimic the composition of subchondral bone and different cartilage zones. Collagen I and the resorbable calcium phosphate brushite were used for the subchondral zone, whereas the cartilage zones were composed out of collagen I, collagen II and tissue mimetic contents of GAGs. The pore structure corresponded to the one that is dominating the volume of natural osteochondral tissue. Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) and SEM were used to analyse the composition and pore structure of the individual scaffold zones, respectively. The cross section pore diameters were determined to (65 ± 25) µm, (88 ± 35) µm and(93 ± 42) µm for the anisotropic, the isotropic and GAG containing isotropic bone scaffolds. Furthermore, the meniscus scaffolds showed pore diameters of (93 ± 21) µm in the inner meniscus zone and (248 ± 63) µm inside the outer meniscus zone. Pore sizes of (82 ± 25) µm, (83 ± 29) µm and (85 ± 39) µm were present inside the subchondral, the lower chondral and the upper chondral zone of osteochondral scaffolds. Depending on the fabrication parameters, the respective scaffold zones were also found to feature a specific micro- and nanostructure at their inner surfaces. Degradation studies were carried out under physiological conditions and resulted in a mean mass loss of (0.52 ± 0.13) %, (1.56 ± 0.10) % and (0.80 ± 0.10) % per day for bone, meniscus and osteochondral scaffolds, respectively. Rheological measurements were used to determine the viscosity changes upon cooling of different precursors. Micro computer tomography (µ-CT) investigations were applied to characterize the 3D microstructure of osteochondral scaffolds. To obtain an osteochondral scaffold with four zones of tissue mimetic microstructure alignment, a poly (D, L-lactide-co-glycolide) mesh was deposited on the upper chondral zone by electrostatic spinning. In case of the bone scaffolds, the retention / release capacity of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) was evaluated by an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Due to the high presence of attractive BMP binding sites, only less than 0.1 % of the initially loaded cytokine was released. The suitability of combining the cryostructuring process with 3D powder printed calcium phosphate substrates was evaluated with osteochondral scaffolds, but did not appear to yield more preferable results than the non-combined approach. A new custom build confined compression setup was elaborated together with a suitable evaluation procedure for the mechanical characterisation under physiological conditions. For bone and cartilage scaffolds, apparent elastic moduli of (37.6 ± 6.9) kPa and (3.14 ± 0.85) kPa were measured. A similar behaviour of the scaffolds to natural cartilage and bone tissue was demonstrated in terms of elastic energy storage. Under physiological frequencies, less than 1.0 % and 0.8 % of the exerted energy was lost for bone and cartilage scaffolds, respectively. With average relaxation times of (0.613 ± 0.040) sec and (0.815 ± 0.077) sec, measured for the cartilage and bone scaffolds, they respond four orders of magnitude faster than the native tissues. Additionally, all kinds of produced scaffolds were able to withstand cyclic compression at un-physiological frequencies as high as 20 Hz without a loss in structural integrity. With the presented new method, scaffolds could be fabricated whose extent in mimicking of native tissues exceeded the one of scaffolds producible by state of the art methods. This allowed a testing of the key hypothesis: The biological evaluation of an anisotropic pore structure in vivo revealed a higher functionality of immigrated cells and led finally to advantageous healing outcomes. Moreover, the mimicking of local compositions in combination with a consecutive anisotropic porosity that approaches native tissue structures could be demonstrated to induce zone specific matrix remodelling in stem cells in vitro. Additionally, clues for a zone specific chondrogenic stem cell differentiation were attained without the supplementation of growth factors. Thereby, the hypothesis that an increased approximation of the hierarchically compositional and structurally anisotropic properties of musculoskeletal tissues would lead to an improved cellular response and a better healing quality, could be confirmed. With a special focus on cell free in situ tissue engineering approaches, the insights gained within this thesis may be directly transferred to clinical regenerative therapies. N2 - Die Schlüsselhypothese dieser Arbeit bestand darin zu überprüfen, ob eine Nachahmung der zonalen Zusammensetzungen und Porenstruktur muskulo-skelettaler Gewebe einwandernde Zellen beeinflusst und zu vorteilhafteren Ergebnissen im Tissue Engineering führt. Obwohl bereits zahlreiche konventionelle Ansätze existieren, so sind diese in ihrem Vermögen spezielle Zellträgermatrices („Scaffolds“) herzustellen limitiert. Insbesondere können dabei lokal variierende biologische Schlüsselreize nicht mit einer Porenstruktur, welche die Ausrichtung der Kollagenfasern in Knochen- und Knorpelgeweben imitiert, kombiniert werden. Um diese Lücke in den verfügbaren Tissue Engineering Strategien zu schließen, wurde ein neues Verfahren entwickelt. Dieses erlaubte die Herstellung monolithischer Scaffolds, welche eine Validierung der Hypothese ermöglichten. Das neue Plattform-Verfahren basiert auf der gerichteten Erstarrung mehrerer fließfähiger Vorstufen, um somit eine kontrollierte anisotrope Porenstruktur vorzubereiten. Ein Entfernen der erstarrten Lösungsmittel durch Lyophilisation führt zu porösen Scaffolds. Optional besteht die Möglichkeit, Polymere mittels elektrostatischem Verspinnen als umhüllendes Vlies zu inkorporieren. Nach einem Vernetzungsschritt resultieren monolithische Matrices, bestehend aus mehreren Zonen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen. Vor einer Verwendung als Tissue Engineering Matrix oder implantierbares Medizinprodukt erfolgt eine Sterilisation. Hierfür wurde ein “Adjustable Cryostructuring Device“ (ACD) entwickelt, einzelne Bauteile mit Computer Aided Design entworfen und zu einer Apparatur montiert. Die Optimierung der Anlage ermöglichte eine signifikante Erhöhung des verfügbaren externen Temperaturgradienten von (1.3 ± 0.1) K/mm auf (9.0 ± 0.1) K/mm. Außerdem erlauben vier unterschiedliche Konfigurationen des ACD die gerichtete Erstarrung von kollagenen Vorstufen in einer besonders kontrollierten Art und Weise bei einer Vielzahl an Probengrößen und Formen. Die systematische Evaluation des Prozesses erfolgte mit Alginat als Modell-Substanz. Aus den zeitlichen Verläufen der Gefrierstrukturierung resultierten Erstarrungsparameter, die mittels Bildverarbeitung den entstandenen Porengrößen und -ausrichtungen zugeordnet wurden. Dies demonstrierte eine präzise Kontrolle der Ergebnisse durch elektrische Ansteuerung der ACD. Zur Erzeugung von Rohmaterialien war eine Etablierung von Extraktions- und Aufreinigungsprotokollen für Kollagen I und Kollagen II notwendig, während eine Herstellung der Calciumphosphate Bruschit und Hydroxylapatit mittels Präzipitations-Reaktionen verlief. Neben der sukzessiven Verbesserung des ACD, stellte auch die Optimierung einzelner Prozessschritte wichtige Aspekte dar. Die Untersuchung und Diskussion des Verhaltens einzelner Vorstufenkomponenten sowie der Erstarrungs-phänomene von Kollagenlösungen führte zu einem Verständnis welches die Produktion von komplexeren Scaffolds zuließ. Somit war es auch möglich eine Abhängigkeitsrelation der einstellbaren Prozessparameter zu den resultierenden Erstarrungsmorphologien der verwendeten Kollagensysteme abzuleiten. Die Gefrierstrukturierung von mehreren Lagen unterschiedlicher Vorstufen konnte erfolgreich von Alginat- auf Kollagenvorstufen transferiert werden. Nach einer Optimierung der jeweiligen Grenzflächenübergänge, waren diese selbst mittels Rasterelektronenmikroskopie kaum noch zu erkennen. Eine Evaluierung von dehydrothermal-, diisocyanat- und carbodiimid- basierten Quervernetzungs-methoden zeigte die vorteilhaftesten Ergebnisse für die Vernetzung durch Carbodiimide. Zusätzlich wurde eine Zusammensetzung der Vernetzungslösung ermittelt, welche beim Einsatz in einer Unterdruckapparatur einen Porenstrukturkollaps durch nasschemische Vernetzung vermeidet. Eine erweiterte Kontrolle der Gefrierprozesse erlaubte es Struktur und Zusammensetzung verschiedener Zonen nativer Gewebe durch eine monolithische Zellträgermatrix mit durchgängiger Porenstruktur und biochemischen Schlüsselreizen nachzuahmen. Zuerst wurden drei Arten von Knochenscaffolds aus Kollagen I und Hydroxylapatit hergestellt, die Defekten kritischer Größe in Rattenoberschenkel-knochen entsprachen. Diese zeichneten sich durch eine isotrope oder eine anisotrope Porenstruktur aus und enthielten teilweise Glycosaminoglycane (GAGs). Weiterhin erfolgte die Produktion von Meniskusscaffolds aus zwei Vorstufen mit biomimetischen Anteilen an Kollagen I, Kollagen II und GAGs. Dabei verlief die Gefrierstrukturierung unter Grenzbedingungen, welche ein nahezu senkrechtes Eiskristallwachstum zu dem äußeren Temperaturgradienten erlaubten. Somit konnte der bevorzugte Verlauf von Kollagenfasern in nativem Meniskusgewebe nachgeahmt werden. Die Scaffolds waren entweder passend für „Well Plates“ der Zellkultur bemaßt oder besaßen sogar Form und Größe von authentischen Menisken. Zuletzt wurden osteochondrale Scaffolds hergestellt, deren Zusammensetzung den jeweiligen Bereichen von Subchondralzone und verschiedenen Gelenkknorpelzonen entsprach. Kollagen I und die bioresorbierbare Calciumphosphatphase Bruschit fanden Verwendung in der Subchondralzone, während die Knorpelzonen aus Kollagen I, Kollagen II und entsprechenden biomimetischen Anteilen an GAGs bestanden. Außerdem bildete die Scaffoldporenstruktur die Volumendominierende in natürlichem Osteochondralgewebe nach, wobei die Dimensionierungen der Scaffolds Well Plates oder Perfusionsreaktoren der Zellkultur angepasst waren. Mittels energiedispersiver Röntgenspektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie erfolgte die Analyse von Zusammensetzung und Porenstruktur der jeweiligen Scaffoldzonen. Die Größe der Porenquerschnitte betrug (65 ± 25) µm, (88 ± 35) µm und (93 ± 42) µm für die anisotropen, die isotropen und die GAG-haltigen isotropen Knochenscaffolds. Die Meniskusscaffolds besaßen Porendurchmesser von (93 ± 21) µm in der inneren Meniskuszone und (248 ± 63) µm innerhalb der äußeren Meniskuszone. Im Falle der osteochondralen Scaffolds wurden Porengrößen von (82 ± 25) µm, (83 ± 29) µm und (85 ± 39) µm in der subchondralen, der unteren chondralen und der oberen chondralen Zone gemessen. In Abhängigkeit von den Prozessparametern zeigten die inneren Oberflächen der jeweiligen Scaffoldzonen eine spezifische Mikro- und Nanostruktur. Eine Prüfung des Degradationsverhaltens unter physiologischen Bedingungen ergab einen mittleren Massenverlust von (0.52 ± 0.13) %, (1.56 ± 0.10) % und (0.80 ± 0.10) % pro Tag für die Knochen-, Meniskus- und osteochondralen Scaffolds. Die Untersuchung der Viskositätsveränderungen während der Abkühlung unterschiedlicher Vorstufen geschah mit rheologischen Messungen. Weiterhin wurde die 3D Mikrostruktur von osteochondralen Matrices mit Mikro Computer Tomographie charakterisiert. Um einen osteochondralen Scaffold mit vier Zonen gewebeähnlich ausgerichteter Mikrostruktur zu erhalten, konnte die Scaffoldoberfläche durch ein elektroversponnenes Poly (D, L-Lactid-co-Glycolid) Vlies modifiziert werden. Ein „enzyme linked immunosorbent assay“ (ELISA) diente zur Evaluation des Rückhalte- bzw. Freisetzungsverhaltens von „bone morphogenetic protein 2“ (BMP-2) in Knochenscaffolds. Bedingt durch die hohe Präsenz von attraktiven BMP Bindungsstellen betrug die freigesetzte Menge des initial beladenen Zytokins nur weniger als 0.1 %. Die Eignung einer Kombination des Gefrierstrukturierungsprozesses mit 3D gedruckten Calciumphosphatsubstraten wurde anhand von osteochondralen Scaffolds überprüft, aber zeigte keine vorteilhafteren Resultate als die nicht kombinierte Vorgehensweise. Für die mechanische Charakterisierung unter physiologischen Bedingungen konnte ein neues Test-Setup mitsamt Auswertungsverfahren entwickelt werden. Die gemessenen Elastizitätsmoduln betrugen (37.6 ± 6.9) kPa für Knochen- und (3.14 ± 0.85) kPa für Knorpelscaffolds. Da unter physiologischen Frequenzen nur weniger als 1.0 % der eingebrachten Energie verloren ging, entsprach die Fähigkeit der Zellträgermatrices zur elastischen Energiespeicherung dem von natürlichem Knochen- und Knorpelgewebe. Bei mittleren Relaxationszeiten von (0.613 ± 0.040) sec und (0.815 ± 0.077) sec für Knorpel- und Knochenscaffolds reagieren diese vier Größenordnungen schneller als die nativen Gewebe. Außerdem waren alle produzierten Matrices dazu in der Lage zyklischen Kompressionen bei unphysiologisch hohen Frequenzen von 20 Hz zu wiederstehen, ohne an struktureller Integrität zu verlieren. Mit dem vorgestellten neuen Verfahren konnten Scaffolds hergestellt werden, deren Ausmaß in der Nachahmung nativer Gewebe mit etablierten Methoden nicht erreichbar war und welche eine Überprüfung der Schlüsselhypothese erlaubten: Die biologische Evaluation einer anisotropen Porenstruktur in vivo zeigte eine höhere Funktionalität eingewanderter Zellen, was zu vorteilhafteren Heilungsergebnissen führte. Darüber hinaus demonstrierte eine Imitation der lokalen Zusammensetzungen in Kombination mit einer durchgängigen anisotropen Porenstruktur, welche an diejenige in nativen Geweben angenähert ist, eine Induktion von zonenspezifischer Matrixremodellierung von Stammzellen in vitro. Außerdem waren Hinweise auf eine zonale chondrogene Stammzelldifferenzierung ohne eine gesonderte Zugabe von Wachstumsfaktoren zu beobachten. Somit konnte die Hypothese, dass eine verbesserte Nachahmung der hierarchischen Zusammensetzung und anisotroper Struktur von muskuloskelettalen Geweben zu einer optimierten zellulären Reaktion und somit einer besseren Heilungsqualität führt, bestätigt werden. Mit einem speziellen Fokus auf zellfreies in situ Tissue Engineering, könnten die Erkenntnisse dieser Arbeit direkt für klinische Therapien eingesetzt werden. KW - directional solidification KW - collagen KW - cartilage KW - bone KW - scaffold KW - Tissue Engineering KW - Knochen KW - Knorpel KW - Gerichtete Erstarrung Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145510 ER - TY - THES A1 - Schmitz, Michael T1 - Functional hydrophilic polymers for chemoselective coupling T1 - Funktionale, hydrophile Polymere für die chemoselektive Kopplung N2 - Chemoselective poly(oxazolines) (POx) and poly[(oligo ethylene glycol) acrylates] were synthesized. An initiator was produced for the preparation of poly(oxazoline)s capable of participating in click chemistry reactions which allows the functionalization of the polymer at the α terminus which was confirmed by 1H NMR spectroscopy. The initiator was used for the polymerization of hydrophilic 2 methyl 2 oxazoline (MeOx), whereby chemoselective, alkyne functionalized polymers could be prepared for Cu-catalyzed azide–alkyne cycloaddition. The desired molecular weight could be achieved through the living, ring opening cationic polymerization and was confirmed by 1H NMR, SEC and MALDI ToF measurements. Polymers were terminated with piperidine if no further functionalization was needed, or with an ester derivate for enabling amine attachment in a subsequent step. In addition, polymers were functionalized by termination with NaN3 in order to provide the counterpart to the azide–alkyne reaction. IR spectroscopy was suitable for the azide detection. The coupling of polymers showed the reactivity and could be confirmed by SEC, 1H NMR and IR spectroscopy. The composition of cysteine functionalized POx was completed by thiol–ene chemistry. Since the commercially available iso 2 propyl 2 oxazoline is not available for the cationic polymerization, 2 butenyl and 2 decenyl 2 oxazoline (ButenOx and DecenOx) were first prepared. The synthesis of both copolymers, based on MeOx could be confirmed by 1H NMR as well as with SEC, whereby narrow distributions with dispersities of 1.06 could be achieved. The cysteine functionalization of the copolymers was enabled by the creation of a thiazolidine component which could be synthesized by acetal and formyl protection of cysteine and subsequent functionalization with a thiol. The component enabled the reaction with a polymer by thiol–ene reaction which was started by the addition of dimethoxyphenyl-acetophenone and was catalyzed by irradiation with UV light. Both copolymers, with a shorter (polymers with BuenOx) and longer (polymers with DecenOx) hydrophobic sidechain could be functionalized. 1H NMR spectroscopic analysis showed a quantitative reaction with the thiazolidine derivate. After deprotection by acidic workup the desired, cysteine functionalized polymer could be isolated. Quantification of cysteine functions was ensured by a modified TNBSA assay, whereby the thiols were first oxidized in order to confirm an independent measurement of amine functions. Both, the TNBSA assay as well as the NMR measurement showed the desired number of cysteine residues. The cytotoxicity of functionalized polymers with different compositions was tested by a luminescent cell viability assay (LCVA). Both, the amount of cysteine functions (5–10%) in the copolymers as well as the length of the hydrophobic side chain were varied. All polymers did not show cytotoxicity up to concentrations of 10 mg∙mL-1. The cell activity and cell numbers only decreased below 50% and 20% respectively, when copolymers with 5% cysteine and longer sidechains were measured, which was attributed to a contamination of the sample itself. The cooperation partner performed Native Chemical Ligation (NCL) with model peptides and purified the products by HPLC. A sterically non demanding peptide was synthesized, consisting of an aromatic amino acid and four glycine units. The aromatic unit was used for the quantification of the polymer–peptide conjugate in the 1H NMR spectroscopy. A polymer having five cysteine side chains has been fully implemented by NCL to a conjugate of one polymer with five peptides. A sterically more demanding peptide was additionally used and MALDI ToF measurements confirmed the successful conjugation. Furthermore the cysteine functionalized polymer was used for nanogel synthesis. The thiol of the cysteine function was oxidized in an inverse mini-emulsion by H2O2, resulting in nanogels (~500 nm) which could be confirmed by SEM, AFM, DLS and NTA measurements. Besides POx, oligo (ethylene glycol)acrylates (OEGA) were polymerized; by copolymerization with the reactive pentafluorophenyl acrylate (PFPA) reactive and amphiphilic polymers were obtained. The synthesis of PFPA could be confirmed spectroscopically by 1H , 19F NMR, and by FT IR. Copolymers were synthesized by RAFT polymerization with narrow dispersities. Functionalization with an amine functionalized thiazolidine led to a hydrophilic cysteine functionalized polymer after acidic deprotection. Apart from this polymer, a thioester functionalization was successfully performed by reaction of the active polymer with a cyclic amine functionalized thioester which does not release a toxic by product (such as the resulting thiol) during NCL and thus features a very high potential to replace former thioester. N2 - Als hydrophile Polymere wurden chemoselektive Poly(oxazoline) (POx) und Poly(oligoethylenglykol)acrylate synthetisiert. Für die Darstellung von „klickfähigen“ Poly(oxazolinen) wurde ein Initiator synthetisiert, welcher eine Funktionalisierung des Polymers am α Terminus ermöglicht. Die erfolgreiche Darstellung wurde mittels 1H NMR Spektroskopie bewiesen. Der Initiator wurde für die Polymerisation von hydrophilem 2 Methyl 2 oxazoline (MeOx) eingesetzt, wodurch chemoselektive, Alkin funktionalisierte Polymere dargestellt werden konnten. Die gewünschten Molmassen konnten durch die lebende, Polymerisation erreicht werden und durch 1H NMR, GPC und MALDI Messungen bewiesen werden. Die Terminierung der Polymere erfolgte durch Abbruch mit Piperidin oder durch Abbruch mit einem Ester Derivat, um die Anbindung mit Aminen zu ermöglichen. Außerdem wurden Polymere durch die Terminierung mit NaN3 funktionalisiert, um das Pendant zur Azid–Alkin¬-Cycloaddition liefern zu können. Die IR-Spektroskopie eignete sich hierbei für die Azid-Detektion. Die Kopplung beider Polymere, zum Nachweis der Reaktivität, konnte durch die GPC, 1H NMR und IR Spektroskopie bestätigt werden. Die Darstellung von Cystein funktionalisierten POx konnte durch Thiol–en Chemie realisiert werden. Dazu wurde ein Copolymer mit Allylseitenketten synthetisiert. Da das kommerziell erhältliche iso-Propyloxazoline nicht für die kationische Polymerisation zur Verfügung steht, wurden Butenyl und Decenyloxazolin (ButenOx und DecenOx) synthetisiert. Die Darstellung des Copolymers, basierend auf MeOx, konnte mit 1H NMR und der GPC bestätigt werden. Enge Verteilungen bis zu einer Disperistät von 1.06 wurden erreicht. Die Cysteinfunktionalisierung der Copolymere wurde durch die Synthese eines Thiazolidinbausteins ermöglicht. Dieser konnte durch Acetal- und Formylschützung von Cystein und anschließender Funktionalisierung mit einem Thiol dargestellt werden. Der Baustein ermöglichte die Umsetzung des Polymers mit dem geschützten Cysteinderivat. Diese wurde durch Zugabe von Dimethoxyphenyl-acetophenon gestartet und durch Bestrahlung mit UV-Licht katalysiert. Sowohl Copolymere mit einer kürzeren (Einsatz von ButenOx) und langen (Einsatz von DecenOx) hydrophoben Seitenkette konnten mittels Thiol–en Chemie funktionalisiert werden. 1H NMR spektroskopische Analysen zeigten eine quantitative Umsetzung mit dem Thiazolidinderivat. Nach Entschützung konnte das gewünschte, Cystein funktionalisierte Polymer isoliert werden. Die Quantifizierung der Cysteinfunktionen wurde durch einen modifizierten TNBSA assay gewährleistet, wobei die Thiole des Cysteins zunächst oxidiert wurden, damit diese keinen Einfluss auf die Messung haben konnten. Sowohl der TNBSA assay als auch die NMR-spektroskopische Messmethode zeigte die gewünschten Anzahlen von Cysteinresten. Die funktionalisierten Polymere wurden mit unterschiedlichen Zusammensetzungen auf Zelltoxizität geprüft. Der Anteil an Cysteinfunktionen (5 10%) und die Länge der hydrophoben Seitenkette wurden variiert. Alle Polymere waren bis zu einer Konzentration von 10 mg∙mL-1 nicht toxisch. Die Zellaktivität und Zellzahl sank nur beim Copolymer mit 5% Cystein und langer Seitenkette unter einen Wert von 50% bzw. 20%, was auf eine Verunreinigung der Probe zurückgeführt wurde. Der Kooperationspartner führte die Native Chemische Ligation (NCL) mit verschiedenen Modellpeptiden durch und reinigte die Produkte mittels HPLC. Es wurden sterisch unanspruchsvolle Peptide synthetisiert, die aus einer aromatischen Aminosäure und vier Glycineinheiten bestanden. Der Aromat konnte in der 1H NMR Spektroskopie für die Quantifizierung der Polymer–Peptid Konjugate genutzt werden. Ein Polymer mit fünf Cysteinseitenketten wurde vollständig mittels NCL zu einem Konjugat aus einem Polymer mit fünf Peptiden umgesetzt. Ein sterisch anspruchsvolleres Peptid wurde im Nachhinein verwendet, wobei MALDI-ToF Messungen die Konjugation bestätigten. Das cysteinfunktionaliserte Polymer wurde außerdem für die Nanogelsynthese verwendet. Hierbei wurde das Thiol der Cysteinfunktion mittels H2O2 in einer inversen Miniemulsion oxidiert, woraus Nanogele resultierten, die mittels REM, AFM, DLS und NTA bestätigt werden konnten. Neben POx wurden Copolymere aus (Oligoehtylenglykol)acrylate und Pentafluorophenylacrylat synthetisiert und reaktive amphiphile Polymere erhalten. Die Darstellung von Pentafluorophenylacrylat konnte durch 1H und 19F NMR als auch durch FT IR spektroskopisch bestätigt werden. Copolymere wurden mittels RAFT Polymerisation mit engen Dispersitäten und den gewünschten Molmassen synthetisiert. Die Funktionalisierung mit einem aminfunktionalisierten Thiazolidin führte nach saurer Entschützung zu einem hydrophilen cysteinfunktionalisierten Polymer. Neben dieser Komponente konnte eine Thioesterfunktionalisierung durch Reaktion mit einem cyclischen aminfunktionalisierten Thiolacton erfolgreich durchgeführt werden. KW - Konjugate KW - Functional hydrophilic polymers KW - chemoselective KW - native chemical ligation KW - Polyoxazoline KW - Polymer-peptide-conjugate KW - Polyoxazoline KW - hydrophilic polymers KW - chemosensitivity Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145629 ER - TY - THES A1 - Wittmann, Katharina T1 - Adipose Tissue Engineering - Development of Volume-Stable 3-Dimensional Constructs and Approaches Towards Effective Vascularization T1 - Tissue Engineering von Fettgewebe - Generierung volumenstabiler 3-dimensionaler Fettgewebe-Konstrukte und Entwicklung effektiver Vaskularisierungsstrategien N2 - Adipose tissue defects and related pathologies still represent major challenges in reconstructive surgery. Based on to the paradigm ‘replace with alike’, adipose tissue is considered the ideal substitute material for damaged soft tissue [1-3]. Yet the transfer of autologous fat, particularly larger volumes, is confined by deficient and unpredictable long term results, as well as considerable operative morbidity at the donor and recipient site [4-6], calling for innovative treatment options to improve patient care. With the aim to achieve complete regeneration of soft tissue defects, adipose tissue engineering holds great promise to provide functional, biologically active adipose tissue equivalents. Here, especially long-term maintenance of volume and shape, as well as sufficient vascularization of engineered adipose tissue represent critical and unresolved challenges [7-9]. For adipose tissue engineering approaches to be successful, it is thus essential to generate constructs that retain their initial volume in vivo, as well as to ensure their rapid vascularization to support cell survival and differentiation for full tissue regeneration [9,10]. Therefore, it was the ultimate goal of this thesis to develop volume-stable 3D adipose tissue constructs and to identify applicable strategies for sufficient vascularization of engineered constructs. The feasibility of the investigated approaches was verified by translation from in vitro to in vivo as a critical step for the advancement of potential regenerative therapies. For the development of volume-stable constructs, the combination of two biomaterials with complementary properties was successfully implemented. In contrast to previous approaches in the field using mainly non-degradable solid structures for mechanical protection of developing adipose tissue [11-13], the combination of a cell-instructive hydrogel component with a biodegradable porous support structure of adequate texture was shown advantageous for the generation of volume-stable adipose tissue. Specifically, stable fibrin hydrogels previously developed in our group [14] served as cell carrier and supported the adipogenic development of adipose-derived stem cells (ASCs) as reflected by lipid accumulation and leptin secretion. Stable fibrin gels were thereby shown to be equally supportive of adipogenesis compared to commercial TissuCol hydrogels in vitro. Using ASCs as a safe source of autologous cells [15,16] added substantial practicability to the approach. To enhance the mechanical strength of the engineered constructs, porous biodegradable poly(ε caprolactone)-based polyurethane (PU) scaffolds were introduced as support structures and shown to exhibit adequately sized pores to host adipocytes as well as interconnectivity to allow coherent tissue formation and vascularization. Low wettability and impaired cell attachment indicated that PU scaffolds alone were insufficient in retaining cells within the pores, yet cytocompatibility and differentiation of ASCs were adequately demonstrated, rendering the PU scaffolds suitable as support structures for the generation of stable fibrin/PU composite constructs (Chapter 3). Volume-stable adipose tissue constructs were generated by seeding the pre-established stable fibrin/PU composites with ASCs. Investigation of size and weight in vitro revealed that composite constructs featured enhanced stability relative to stable fibrin gels alone. Comparing stable fibrin gels and TissuCol as hydrogel components, it was found that TissuCol gels were less resilient to degradation and contraction. Composite constructs were fully characterized, showing good cell viability of ASCs and strong adipogenic development as indicated by functional analysis via histological Oil Red O staining of lipid vacuoles, qRT-PCR analysis of prominent adipogenic markers (PPARγ, C/EBPα, GLUT4, aP2) and quantification of leptin secretion. In a pilot study in vivo, investigating the suitability of the constructs for transplantation, stable fibrin/PU composites provided with a vascular pedicle gave rise to areas of well-vascularized adipose tissue, contrasted by insufficient capillary formation and adipogenesis in constructs implanted without pedicle. The biomaterial combination of stable fibrin gels and porous biodegradable PU scaffolds was thereby shown highly suitable for the generation of volume-stable adipose tissue constructs in vivo, and in addition, the effectiveness of immediate vascularization upon implantation to support adipose tissue formation was demonstrated (Chapter 4). Further pursuing the objective to investigate adequate vascularization strategies for engineered adipose tissue, hypoxic preconditioning was conducted as a possible approach for in vitro prevascularization. In 2D culture experiments, analysis on the cellular level illustrated that the adipogenic potential of ASCs was reduced under hypoxic conditions when applied in the differentiation phase, irrespective of the oxygen tension encountered by the cells during expansion. Hypoxic treatment of ASCs in 3D constructs prepared from stable fibrin gels similarly resulted in reduced adipogenesis, whereas endothelial CD31 expression as well as enhanced leptin and vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion indicated that hypoxic treatment indeed resulted in a pro-angiogenic response of ASCs. Especially the observed profound regulation of leptin production by hypoxia and the dual role of leptin as adipokine and angiogenic modulator were considered an interesting connection advocating further study. Having confirmed the hypothesis that hypoxia may generate a pro-angiogenic milieu inside ASC-seeded constructs, faster vessel ingrowth and improved vascularization as well as an enhanced tolerance of hypoxia-treated ASCs towards ischemic conditions upon implanatation may be expected, but remain to be verified in rodent models in vivo (Chapter 5). Having previously been utilized for bone and cartilage engineering [17-19], as well as for revascularization and wound healing applications [20-22], stromal-vascular fraction (SVF) cells were investigated as a novel cell source for adipose tissue engineering. Providing cells with adipogenic differentiation as well as vascularization potential, the SVF was applied with the specific aim to promote adipogenesis and vascularization in engineered constructs in vivo. With only basic in vitro investigations by Lin et al. addressing the SVF for adipose repair to date [23], the present work thoroughly investigated SVF cells for adipose tissue construct generation in vitro, and in particular, pioneered the application of these cells for adipose tissue engineering in vivo. Initial in vitro experiments compared SVF- and ASC-seeded stable fibrin constructs in different medium compositions employing preadipocyte (PGM-2) and endothelial cell culture medium (EGM-2). It was found that a 1:1 mixture of PGM-2 and EGM-2, as previously established for co-culture models of adipogenesis [24], efficiently maintained cells with adipogenic and endothelial potential in SVF-seeded constructs in short and long-term culture setups. Observations on the cellular level were supported by analysis of mRNA expression of characteristic adipogenic and endothelial markers. In preparation of the evaluation of SVF-seeded constructs under in vivo conditions, a whole mount staining (WMS) method, facilitating the 3D visualization of adipocytes and blood vessels, was successfully established and optimized using native adipose tissue as template (Chapter 6). In a subcutaneous nude mouse model, SVF cells were, for the first time in vivo, elucidated for their potential to support the functional assembly of vascularized adipose tissue. Investigating the effect of adipogenic precultivation of SVF-seeded stable fibrin constructs in vitro prior to implantation on the in vivo outcome, hormonal induction was shown beneficial in terms of adipocyte development, whereas a strong vascularization potential was observed when no adipogenic inducers were added. Via histological analysis, it was proven that the developed structures were of human origin and derived from the implanted cells. Applying SVF cells without precultivation in vitro but comparing two different fibrin carriers, namely stable fibrin and TissuCol gels, revealed that TissuCol profoundly supported adipose formation by SVF cells in vivo. This was contrasted by only minor SVF cell development and a strong reduction of cell numbers in stable fibrin gels implanted without precultivation. Histomorphometric analysis of adipocytes and capillary structures was conducted to verify the qualitative results, concluding that particularly SVF cells in TissuCol were highly suited for adipose regeneration in vivo. Employing the established WMS technique, the close interaction of mature adipocytes and blood vessels in TissuCol constructs was impressively shown and via species-specific human vimentin staining, the expected strong involvement of implanted SVF cells in the formation of coherent adipose tissue was confirmed (Chapter 7). With the development of biodegradable volume-stable adipose tissue constructs, the application of ASCs and SVF cells as two promising cell sources for functional adipose regeneration, as well as the thorough evaluation of strategies for construct vascularization in vitro and in vivo, this thesis provides valuable solutions to current challenges in adipose tissue engineering. The presented findings further open up new perspectives for innovative treatments to cure soft tissue defects and serve as a basis for directed approaches towards the generation of clinically applicable soft tissue substitutes. N2 - In der rekonstruktiven Chirurgie besteht ein ständig wachsender Bedarf an geeigneten Implantaten, um Weichteildefekte nach Tumorresektionen, Traumata, oder aufgrund von kongenitalen Missbildungen adäquat ersetzen zu können [1]. Hierbei stellt körpereigenes Fettgewebe als Weichteilersatz das ideale Substitutionsmaterial dar [2-4]. Derzeit angewandte Wiederherstellungsmethoden verwenden frei transplantierbare und gestielte Lappenplastiken aus autologem Fettgewebe oder greifen auf künstliche Kollagen- und Silikonimplantate zurück [5]. Diese Ansätze sind jedoch zum Teil mit gravierenden Nachteilen behaftet, wie Absorption und Nekrotisierung bei transplantiertem körpereigenem Fettgewebe, sowie Fremdkörperreaktionen und fibrotischen Verkapselungen bei Kollagen und Silikon. Insbesondere die Versorgung großvolumiger Defekte ist mit komplexen chirurgischen Eingriffen verbunden und geht häufig mit Komplikationen wie Infektionen, Narbenbildung und Volumenverlust, sowie Defiziten an der Hebe- und Empfängerstelle einher [1,5-8]. Es besteht daher ein großer Bedarf an innovativen Methoden und der Entwicklung neuer Materialien, die einen dauerhaften körpereigenen Weichteilersatz ermöglichen. Das interdisziplinäre Feld des Tissue Engineerings von Fettgewebe zielt auf die Entwicklung neuer Ansätze zur Regeneration von Weichteildefekten und der Bereitstellung von biologisch äquivalentem Gewebeersatz, vor allem für die Rekonstruktion großvolumiger Defekte. Verringerte Volumenstabilität und unzureichende Blutgefäßversorgung stellen jedoch auch bei durch Tissue Engineering hergestelltem Gewebe zentrale Limitationen dar [5,8,9]. Für die erfolgreiche Substitution von Weichteildefekten mit Methoden des Tissue Engineerings ist es daher essenziell, Gewebekonstrukte mit ausreichender Volumenstabilität bereitzustellen, um auch nach Implantation in vivo langfristig zu bestehen, sowie eine adäquate Blutgefäßversorgung zu gewährleisten, um Zellüberleben und Differenzierung für eine vollständige Geweberegeneration zu garantieren [5,10]. Folglich war es Ziel dieser Arbeit, volumenstabile Fettgewebekonstrukte zu entwickeln und neue Strategien zur Vaskularisierung der generierten Konstrukte zu evaluieren. Als wichtiger Schritt in Bezug auf eine potenzielle klinische Anwendbarkeit wurden außerdem vielversprechende In-vitro-Ansätze auf den In-vivo-Kontext in etablierten Mausmodellen übertragen. Für die Entwicklung volumenstabiler Fettgewebekonstrukte wurde die Kombination zweier Biomaterialien mit komplementären Eigenschaften verfolgt. So wurden für die Konstruktherstellung Fibrinhydrogele als Zellträger mit hochporösen bioabbaubaren Scaffolds als mechanische Schutzstrukturen kombiniert. Im Gegensatz zu bisherigen Ansätzen zur Verbesserung der Volumenstabilität, in denen hauptsächlich nicht abbaubare, rigide Gerüst- oder Hohlkörperstrukturen zum mechanischen Schutz des entstehenden Gewebes appliziert wurden [11-13], wurden hier ausschließlich bioabbaubare und Gewebe kompatible Materialien verwendet. Dabei konnte auf bereits zuvor entwickelte stabile Fibringele [14] zurückgegriffen werden, die in dieser Arbeit erstmals für das Fettgewebe Engineering als Zellträger für mesenchymale Stammzellen aus dem Fettgewebe (adipose-derived stem cells; ASCs) verwendet wurden. Mittels sich ergänzender Analysemethoden auf zellulärer (Oil Red O-Färbung) und molekularer Ebene (Leptin Sekretion; ELISA) konnte erfolgreich die adipogene Differenzierung der in den Fibringelen inkorporierten ASCs nachgewiesen werden. Im Vergleich zu kommerziell erhältlichem Fibrin (TissuCol, Baxter) zeigten ASCs in den stabilen Fibringelen eine mit TissuCol vergleichbare, gute adipogene Differenzierbarkeit. Durch die Verwendung von ASCs als sichere und autologe Zellquelle [15,16] für die Konstruktherstellung wurde zudem die potenzielle klinische Anwendbarkeit der generierten Zell-Biomaterial-Konstrukte erhöht. Zur Verbesserung der Volumenstabilität wurden bioabbaubare Poly(ε caprolacton)-basierte Polyurethan-Scaffolds als zusätzliche Gerüststruktur evaluiert. Aufgrund ihrer hohen Porosität und Interkonnektivität stellten sich die Scaffolds als besonders geeignet für die Differenzierung von Adipozyten sowie für die Generierung von kohärentem Fettgewebe heraus. Bei direkter Besiedelung mit ASCs wiesen die PU-Scaffolds zwar eine geringe Zelladhäsion und inhomogene Zellverteilung auf, die adipogene Differenzierung der Zellen war jedoch nicht beeinträchtigt. Daraufhin wurde die Generierung von Fibrin/PU Kompositkonstrukten durch Kombination der PU-Scaffolds mit den zuvor untersuchten stabilen Fibringelen angestrebt (Kapitel 3). Durch Zusammenführung der stabilen Fibringele als Zellträger für ASCs mit den PU Scaffolds als zusätzlicher Gerüststruktur konnten in folgenden Arbeiten erfolgreich homogene und mechanisch stabile Fettgewebekonstrukte hergestellt werden. Die detaillierte Evaluation von Größe und Gewicht zeigte, dass in den Kompositkonstrukten durch die zusätzliche poröse PU-Scaffoldstruktur eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu den stabilen Fibringelen als alleinigem Zellträger erreicht werden konnte. Der Vergleich der stabilen Fibringele mit TissuCol als Hydrogelkomponente zeigte, dass TissuCol-Gele unter In vitro Kulturbedingungen stärker kontrahierten und schneller abgebaut wurden. Die in den Kompositkonstrukten inkorporierten ASCs zeigten gute Viabilität sowie deutliche adipogene Differenzierung auf histologischer (Oil Red O-Färbung) als auch auf molekularer Ebene (qRT-PCR; ELISA). In einer In-vivo-Pilotstudie wurden die Kompositkonstrukte auf ihre Transplantierbarkeit hin überprüft und durch mikrochirurgische Insertion eines Durchflussgefäßes bei der Implantation unmittelbar vaskularisiert. In stabilen Fibrin/PU Konstrukten mit integriertem Gefäßstiel wurde so die Entwicklung von vaskularisiertem Fettgewebe im Vergleich zu ungestielten Konstrukten entschieden verbessert. Mittels der erfolgreichen In-vivo-Implantation der Kompositkonstrukte konnte die Anwendbarkeit der Biomaterialkombination aus stabilem Fibrin und porösen PU Scaffolds für die Generierung volumenstabiler Fettgewebekonstrukte demonstriert und gleichzeitig der positive Effekt einer direkten Vaskularisierung durch Integration eines Gefäßstiels gezeigt werden (Kapitel 4). Im Rahmen der weiteren Evaluation potenzieller Vaskularisierungsstrategien wurden im Anschluss Ansätze zur Prävaskularisierung in vitro untersucht. Hierbei stellte die hypoxische Vorkultur von mittels Tissue Engineering generierten Fettgewebekonstrukten einen möglichen Ansatz zur Schaffung eines pro-angiogenen, vaskularisierungsfördernden Milieus innerhalb der Konstrukte dar. Ebenso von Interesse waren in diesem Zusammenhang die Auswirkungen von Hypoxie auf die adipogene Differenzierung von ASCs. Erste Versuche im 2D-Kulturformat mit ASCs zeigten, dass das adipogene Potenzial der Zellen unter Hypoxie in der Differenzierungsphase stark vermindert war, wobei der während der Expansionsphase der Zellen bestehende Sauerstoffpartialdruck keinen Einfluss auf die Fettentwicklung hatte. Auch in 3D-Konstrukten basierend auf stabilen Fibringelen konnte eine verringerte adipogene Differenzierung von ASCs unter hypoxischer Kultur nachgewiesen werden, dabei wurden im Gegenzug endotheliale Marker (CD31) und pro angiogene Wachstumsfaktoren, wie z.B. vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), aber auch das Adipokin Leptin, stark hochreguliert. Insbesondere die deutliche Veränderung der Leptinsekretion unter hypoxischen Kulturbedingungen und die duale Rolle von Leptin als adipogener und pro-angiogener Faktor ergeben interessante Perspektiven für weiterführende Untersuchungen. Basierend auf den gezeigten Ergebnissen konnte insgesamt bestätigt werden, dass die hypoxische Vorkultur in vitro zur Entstehung eines pro angiogenen und potenziell vaskularisierungsfördernden Milieus beitragen kann. Es gilt nun in Folgestudien das Potenzial der hypoxischen Vorkultur zur Verbesserung der Vaskularisierung in vivo, sowie eine erhöhte Toleranz der implantierten Zellen gegenüber hypoxischen Bedingungen nach der Implantation in etablierten In-vivo-Mausmodellen zu verifizieren (Kapitel 5). Ein weiterer Ansatz zur Generierung von vaskularisiertem Fettgewebe in vitro und in vivo wurde durch den Einsatz der stromalen-vaskulären Fraktion (SVF) als neue Zellquelle für das Fettgewebe-Engineering verfolgt. Bisher wurde die SVF hauptsächlich für das Tissue Engineering von Knochen- und Knorpelgewebe [17-19] oder für Vaskularisierungs- und Wundheilungsansätze [20-22] untersucht. In der SVF enthalten sind sowohl Fettvorläuferzellen als auch Endothelzellen, Perizyten, Fibroblasten und Immunzellen [8]. Durch Verwendung dieses heterogenen Zellgemisches sollte die simultane Entwicklung von Fettzellen und vaskulären Strukturen erreicht werden, und damit eine schnellere und effizientere Fettgewebeentwicklung in vivo. Da sich bisher nur eine In-vitro-Studie explizit dem Tissue Engineering von Fettgewebe mit SVF-Zellen widmet [23], wurden in dieser Arbeit SVF-besiedelte Fettgewebekonstrukte basierend auf Fibringelen als Zellträger zunächst umfassend in vitro charakterisiert und erstmals die Fettgewebeentwicklung der Zellen im Mausmodell in vivo untersucht. In vorbereitenden In-vitro-Arbeiten wurden SVF-besiedelte stabile Fibringele mit den bisher verwendeten ASC-basierten Konstrukten verglichen. Dabei wurde zunächst die adipogene und endotheliale Differenzierbarkeit der SVF in unterschiedlichen Zellkulturmedien untersucht. Eine 1:1-Mischung aus Präadipozytenmedium (PGM-2) und Endothelzellmedium (EGM-2), die zuvor schon für Kokulturexperimente von ASCs und Endothelzellen verwendet worden war [24], stellte sich als besonders geeignet für die Kurz- und Langzeitkultur der SVF in stabilen Fibringelen heraus. Umfassende histologische Untersuchungen zeigten, dass mit Hilfe dieser Medienkomposition insbesondere das adipogene und endotheliale Differenzierungspotenzial der verschiedenen Zelltypen in der SVF innerhalb der generierten 3D-Konstrukte erhalten werden kann. Die auf zellulärer Ebene gewonnenen Erkenntnisse konnten mittels qRT-PCR-Analyse von adipogenen und endothelialen Markern (PPARγ, aP2, CD31) auf mRNA-Ebene bestätigt werden. Um in Zukunft die In-vivo-Untersuchung der generierten Fettgewebekonstrukte zu erleichtern, sowie eine strukturelle Analyse des Gewebeverbands und insbesondere die Interaktion von Adipozyten und Blutgefäßen zu ermöglichen, wurde zusätzlich eine 3D-Färbetechnik (Whole Mount Staining), zunächst unter Verwendung von nativem humanem Fettgewebe, etabliert (Kapitel 6). In einer anschließenden umfassenden Studie in immundefizienten Nacktmäusen (NMRI Foxn1nu/Foxn1nu) wurden SVF-Zellen zum ersten Mal in vivo für das Engineering von vaskularisiertem Fettgewebe untersucht. Hierbei wurden sowohl der Effekt der In vitro Vorkultur der SVF-basierten Konstrukte als auch der Einfluss des Trägermaterials auf die Gewebeentwicklung in vivo evaluiert. Die adipogene Vorkultur der SVF-besiedelten Konstrukte in vitro über einen Zeitraum von 7 Tagen vor Implantation wirkte sich positiv auf die Fettdifferenzierung in vivo aus, wohingegen die Vorkultur unter nicht-induzierten Bedingungen ohne adipogene Induktion verstärkt zur Bildung von vaskulären Strukturen führte. Durch Spezies-spezifische Färbung gegen humanes Vimentin konnte gezeigt werden, dass die beobachteten Strukturen humanen Ursprungs waren und daher von den implantierten SVF-Zellen stammten. Der Einfluss des Trägermaterials auf die Gewebebildung in vivo wurde durch Besiedelung stabiler Fibringele und TissuCol-Gele mit SVF-Zellen verglichen. Die Konstrukte wurden ohne In-vitro-Vorkultur direkt nach der Herstellung implantiert. Hier zeigte sich in stabilen Fibringelen nach 4 Wochen in vivo keine nennenswerte Gewebeentwicklung, wobei auch der Anteil an humanen Zellen innerhalb der Konstrukte zum Zeitpunkt der Explantation stark verringert war. Im Gegensatz dazu konnte in TissuCol-Gelen die Entwicklung von kohärentem und maturem Fettgewebe nachgewiesen werden von dem große Teile humanen Ursprungs waren. Die histologischen Ergebnisse wurden mittels histomorphometrischer Quantifizierung von Adipozyten und Blutgefäßstrukturen verifiziert, wodurch das herausragende Potenzial der SVF für das Fettgewebe-Engineering in vivo nochmals verdeutlicht wurde. Unter Verwendung der zuvor etablierten 3D-Färbetechnik (Whole Mount Staining) konnten anschließend Adipozyten und Blutgefäße innerhalb des entstandenen kohärenten Gewebeverbands in TissuCol-Gelen visualisiert werden. Mit Hilfe einer humanspezifischen Färbung in 3D konnte zusätzlich die weitreichende Beteiligung der implantierten SVF Zellen bei der Gewebeentwicklung nachgewiesen werden (Kapitel 7). Die in der Dissertation entwickelten bioabbaubaren volumenstabilen Fettgewebekonstrukte, die Untersuchung von ASCs und SVF-Zellen als vielversprechende regenerative Zellquellen für die Generierung funktioneller Konstrukte, sowie die Evaluation unterschiedlicher Vaskularisierungsstrategien in vitro und in vivo leisten einen wichtigen Beitrag zu neuen und innovativen Ansätzen im Bereich des Tissue Engineerings von Fettgewebe. Die Ergebnisse stellen eine Grundlage für die zielgerichtete Entwicklung regenerativer Implantate dar und eröffnen neue Perspektiven für die Generierung klinisch anwendbarer Fettgewebekonstrukte als Weichteilersatz. KW - Tissue Engineering KW - Fettgewebe KW - Tissue Engineering KW - Adipose Tissue KW - Vascularization KW - Fibrin Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107196 ER - TY - THES A1 - Meininger, Markus T1 - Calcium hydroxide as antibacterial implant coating T1 - Calciumhydroxid als antibaterielle Implantatbeschichtung N2 - In modern medicine hip and knee joint replacement are common surgical procedures. However, about 11 % of hip implants and about 7 % of knee implants need re-operations. The comparison of implant registers revealed two major indications for re-operations: aseptic loosening and implant infections, that both severely impact the patients’ health and are an economic burden for the health care system. To address these problems, a calcium hydroxide coating on titanium was investigated in this thesis. Calcium hydroxide is a well-known antibacterial agent and used with success in dentistry. The coatings were applied with electrochemically assisted deposition, a versatile tool that combines easiness of process with the ability to coat complex geometries homogeneously. The pH-gradient during coating was investigated and showed the surface confinement of the coating process. Surface pre-treatment altered the surface morphology and chemistry of the titanium substrates and was shown to affect the morphology of the calcium hydroxide coatings. The influence of the coating parameters stirring speed and current pulsing were examined in various configurations and combinations and could also affect the surface morphology. A change in surface morphology results in a changed adhesion and behavior of cells and bacteria. Thus, the parameters surface pre-treatment, stirring speed and current pulsing presented a toolset for tailoring cellular response and antibacterial properties. Microbiological tests with S. aureus and S. epidermidis were performed to test the time-dependent antibacterial activity of the calcium hydroxide coatings. A reduction of both strains could be achieved for 13 h, which makes calcium hydroxide a promising antibacterial coating. To give insight into biofilm growth, a protocol for biofilm staining was investigated on titanium disks with S. aureus and S. epidermidis. Biofilm growth could be detected after 5 days of bacterial incubation, which was much earlier than the 3 weeks that are currently assumed in medical treatment. Thus, it should be considered to treat infections as if a biofilm were present from day 5 on. The ephemeral antibacterial properties of calcium hydroxide were further enhanced and prolonged with the addition of silver and copper ions. Both ionic modifications significantly enhanced the bactericidal potential. The copper modification showed higher antibacterial effects than the silver modification and had a higher cytocompatibility which was comparable to the pure calcium hydroxide coating. Thus, copper ions are an auspicious option to enhance the antibacterial properties. Calcium hydroxide coatings presented in this thesis have promising antibacterial properties and can easily be applied to complex geometries, thus they are a step in fighting aseptic loosening and implant infections. N2 - Der Fortschritt in der modernen Medizin ist so weit, dass Hüft- und Kniegelenkersatz mit Implantaten heutzutage Standardoperationen sind. Allerdings kommt es in circa 11 % des Hüftgelenkersatzes und 7 % des Kniegelenkersatzes zu nicht zufriedenstellenden Ergebnissen und Revisionen sind nötig. Der Vergleich von Implantationsregistern zeigte zwei Hauptindikatoren für Revisionen: aseptische Lockerung und Implantatinfektionen, welche die Gesundheit der Patienten stark beeinträchtigen und eine wirtschaftliche Belastung für das Gesundheitssystem darstellen. Um diese Probleme anzugehen, wurde Calciumhydroxid auf Titan als Beschichtung aufge- bracht und in dieser Arbeit untersucht. Calciumhydroxid ist ein bekanntes antibakterielles Material und wird erfolgreich in der Zahnheilkunde eingesetzt. Die Beschichtungen wurden mit elektrochemisch gestützter Abscheidung aufgebracht, da diese Methode einen einfachen Prozess mit der Möglichkeit vereint, komplexe Geometrien homogen zu beschichten. In dieser Arbeit wurde der pH-Gradient während der Beschichtung untersucht und zeig- te die Beschränkung des Beschichtungsprozesses auf die direkte Oberfläche der Probe. Eine Vorbehandlung der Titansubstrate veränderte die Morphologie und die Chemie der Oberflä- chen und dadurch auch die Morphologie der Calciumhydroxidbeschichtung. Der Einfluss der Beschichtungsparameter Rührgeschwindigkeit und Pulsen des Stroms wurden in zahlreichen Konfigurationen und Kombinationen getestet und konnte ebenfalls die Oberflächenmorphologie verändern. Die Oberflächenmorphologie wiederum beeinflusst die Adhäsion und das Verhalten von Zellen und Bakterien. Deshalb sind die Parameter Oberflächenvorbehandlung, Rührge- schwindigkeit und Pulsen des Stroms ein Instrument für das Einstellen einer angepassten Zellantwort und der antibakteriellen Eigenschaften. Mikrobiologische Tests mit S. aureus und S. epidermidis wurden unternommen, um die Zeitabhängigkeit der antibakteriellen Aktivität auf Calciumhydroxidbeschichtungen zu bestimmen. Eine Reduktion beider Stämme konnte nach 13 h erreicht werden, was Calciumhydroxid zu einer erfolgversprechenden antibakteriellen Beschichtung macht. Um einen Einblick in das Wachstum von Biofilmen zu geben, wurde ein Protokoll zur Biofilm- Färbung auf Titanplättchen mit S. aureus und S. epidermidis entwickelt. Biofilm-Wachstum konnte nach 5 Tagen Bakterien-Inkubation detektiert werden, was sehr viel früher war als die 3 Wochen, die aktuell bei der Behandlung von Implantatinfektionen angenommen werden. Folglich muss schon nach 5 Tagen darüber nachgedacht werden, Behandlungsmethoden gegen einen Biofilm anzuwenden. Die kurzzeitigen antibakteriellen Eigenschaften von Calciumhydroxid konnten durch den Zusatz von Silber- und Kupferionen weiter verbessert und verlängert werden. Beide Ionen erhöhten die antibakterielle Wirkung signifikant. Die Kupfermodifikation zeigte dabei einen größeren antibakteriellen Effekt als die Silbermodifikation und war gleichzeitig besser zell- verträglich. Die Zytokompatibilität der Kupfermodifikation lag auf dem Niveau der reinen Calciumhydroxidbeschichtungen. Deshalb sind Kupferionen eine vielversprechende Möglichkeit für eine weitere Verbesserung der antibakteriellen Eigenschaften. Die in dieser Arbeit vorgestellten Calciumhydroxidbeschichtungen haben ein großes Potential als antibakterielle Oberflächen und können sehr leicht auch auf komplizierte Geometrien aufgebracht werden. Deshalb können sie ein entscheidender Baustein bei der Vermeidung von aseptischer Lockerung und Implantatinfektionen sein. KW - Calciumhydroxid KW - Implantat KW - Beschichtung KW - antibakteriell KW - antibacterial KW - implant KW - coating KW - calciumhydroxide Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-261122 ER - TY - THES A1 - Shan, Junwen T1 - Tailoring Hyaluronic Acid and Gelatin for Bioprinting T1 - Modifikation von Hyaluronsäure und Gelatine für die Anwendung im Biodruck N2 - In the field of biofabrication, biopolymer-based hydrogels are often used as bulk materials with defined structures or as bioinks. Despite their excellent biocompatibility, biopolymers need chemical modification to fulfill mechanical stability. In this thesis, the primary alcohol of hyaluronic acid was oxidized using TEMPO/TCC oxidation to generate aldehyde groups without ring-opening mechanism of glycol cleavage using sodium periodate. For crosslinking reaction of the aldehyde groups, adipic acid dihydrazide was used as bivalent crosslinker for Schiff Base chemistry. This hydrogel system with fast and reversible crosslinking mechanism was used successfully as bulk hydrogel for chondrogenic differentiation with human mesenchymal stem cells (hMSC). Gelatin was modified with pentenoic acid for crosslinking reaction via light controllable thiol-ene reaction, using thiolated 4-arm sPEG as multivalent crosslinker. Due to preservation of the thermo responsive property of gelatin by avoiding chain degradation during modification reaction, this gelatin-based hydrogel system was successfully processed via 3D printing with low polymer concentration. Good cell viability was achieved using hMSC in various concentrations after 3D bioprinting and chondrogenic differentiation showed promising results. N2 - Im Bereich der Biofabrikation werden Hydrogele auf Biopolymerbasis häufig als Bulkmaterial mit definierten Strukturen oder als Biotinten verwendet. Obwohl Biopolymere eine hervorragende Biokompatibilität aufweisen, müssen sie jedoch chemisch modifiziert werden, um gewisse mechanische Stabilität für den Einsatz in der Biofabrikation zu erreichen. In dieser Arbeit wurde der primäre Alkohol der Hyaluronsäure mit Hilfe der TEMPO/TCC-Oxidation oxidiert, um Aldehydgruppen zu generieren. Dabei findet kein Ringöffnungsmechanismus statt, wie er bei der Glykolspaltung mit Natriumperiodat vorkommt. Für die Vernetzungsreaktion der Aldehydgruppen wurde Adipinsäuredihydrazid als bivalenter Vernetzer für die Bildung der Schiffschen Base verwendet. Dieses Hydrogelsystem mit schnellem und reversiblem Vernetzungsmechanismus wurde erfolgreich als Bulkhydrogel für die chondrogene Differenzierung mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) erfolgreich eingesetzt. Als Mikrogele könnte das System in künftigen Forschungsarbeiten auf seine Verdruckbarkeit getestet werden. Gelatine wurde mit Pentensäure modifiziert, um die Vernetzungsreaktion über eine lichtkontrollierbare Thiol-En-Reaktion durchzuführen, bei der thioliertes 4-armiges sPEG als multivalenter Vernetzer verwendet wurde. Da die thermoresponsive Eigenschaft der Gelatine erhalten blieb, indem der Kettenabbau während der Modifizierungsreaktion vermieden wurde, konnte dieses Hydrogelsystem auf Gelatinebasis erfolgreich im 3D-Druck mit niedriger Polymerkonzentration verarbeitet werden. Mit hMSC in verschiedenen Konzentrationen wurde nach dem 3D-Biodruck eine gute Zellviabilität erreicht und die chondrogene Differenzierung zeigte vielversprechende Ergebnisse. KW - Hydrogel KW - Biomaterial KW - Biofabrication of hydrogels KW - Biomaterial KW - Chemical modification of biopolymers KW - Chondrogenic differentiation Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-298256 ER - TY - THES A1 - Böhm, Christoph T1 - Thermal Stability of the Polyesters PCL and PLGA during Melt Electrowriting T1 - Thermische Stabilität der Polyester PCL und PLGA während des Melt Electrowriting Prozesses N2 - The focus of this thesis was to investigate how PCL and PLGA react to the heat exposure that comes with the MEW process over a defined timespan. To assess the thermal stability of PCL during MEW over 25 d, an automated collection of fibers has been used to determine the CTS on each day of heating for three different temperatures. PCL is exceptionally stable over 25 d at 75 °C, whereas for 85 °C and 95 °C a slight upward trend during the last 10 d could be observed, which is an indication for thermal degradation. Same trend could be observed for diameter of fibers produced at a fixed collector speed. For all temperatures, CTS during the first 5 d decreased due to inhomogeneities of the melt. Physical analysis of the fibers by XRD and mechanical testing showed no significant changes. To investigate the chemical details of the thermal durability, PCL was artificially aged over 25 d at 75 °C, 85 °C and 95 °C. Data from GPC analysis and rheology revealed that PCL is degrading steadily at all three temperatures. Combined with GC-MS analysis, two different mechanisms for degradation could be observed: random chain scission and unzipping. Additional GPC experiment using a mixture of PCL and a fluorescence labelled PCL showed that PCL was undergoing ester interchange reactions, which could explain its thermal stability. PLGA was established successfully as material for MEW. GPC results revealed that PLGA degraded heavily in the one-hour preheating period. To reduce the processing temperature, ATEC was blended with PLGA in three mixtures. This slowed down degradation and a processing window of 6 h could be established. Mechanical testing with fibers produced with PLGA and all three blends was performed. PLGA was very brittle, whereas the blends showed an elastic behavior. This could be explained by ester interchange reactions that formed a loosely crosslinked network with ATEC. N2 - Ziel dieser Arbeit war, die Veränderung von PCL und PLGA während des MEW-Verfahrens bei bestimmten Temperaturen über einen definierten Zeitraum zu untersuchen. Für die Bewertung der thermischen Stabilität von PCL während des MEW-Prozesses über 25 d wurden Fasern in einem vorgegebenen Druckmuster gesammelt, um täglich die CTS für drei verschiedene Temperaturen zu bestimmen. Allgemein war PCL bei 75 °C über 25 d thermisch stabil. Allerdings nahm die CTS bei allen Temperaturen während der ersten 5 d aufgrund von Inhomogenitäten der Schmelze ab. Bei 85 °C und 95 °C wurde in den letzten 10 d ein leichter Anstieg der CTS beobachtet, was auf thermische Degradation hinweist. Dieser Anstieg war ebenfalls im Durchmesser der Fasern zu beobachten, die mit konstanter Kollektorgeschwindigkeit hergestellt wurden. Die physikalische Untersuchung der Fasern mittels XRD und mechanischer Tests ergab keine signifikanten Veränderungen. Um die Chemie der thermischen Beständigkeit zu untersuchen, wurde PCL über 25 d bei 75 °C, 85 °C und 95 °C künstlich gealtert. GPC- und rheologische Analysen zeigten, dass PCL bei allen Temperaturen stetig abbaut. Mit der GC-MS-Analyse konnten zwei Abbaumechanismen beobachtet werden: zufällige Kettenspaltung und Unzipping. GPC-Messungen mit einer Mischung aus PCL und einem fluoreszenzmarkierten PCL zeigten, dass es zu Esteraustauschreaktionen kommt, welche die thermische Stabilität erklären. PLGA wurde erfolgreich als Material für MEW etabliert. Die GPC-Daten zeigten, dass PLGA während der einstündigen Aufheizphase stark abgebaut wurde. Um die Verarbeitungstemperatur zu senken, wurden drei Mischungen mit verschiedenen Verhältnissen von PLGA und ATEC hergestellt. Dadurch verlangsamte sich der Abbau, wodurch ein Verarbeitungsfenster von 6 h erreicht wurde. Mechanische Tests zeigten für PLGA ein sprödes, für die Mischungen ein elastisches Verhalten. Dies kann durch Esteraustauschreaktionen mit ATEC erklärt werden, durch die ein Polymernetzwerk entstehen könnte. KW - Degradation KW - Polylactid-co-Glycolid KW - Polycaprolacton KW - Additive Fertigung KW - polycaprolactone KW - poly(lactic-co-glycolic acid) KW - additive manufacturing KW - degradation KW - Rapid Prototyping KW - PCL KW - PLGA Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-306139 ER - TY - THES A1 - Pinzner, Florian T1 - Vicinal and Double Chemoselective Biofunctionalization of Polyoxazolines T1 - Vicinale und doppelt chemoselektive Biofunktionalisierung von Polyoxazolinen N2 - In this work, a toolbox was provided to create three-component polymer conjugates with a defined architecture, designed to bear different biocomponents that can interact with larger biological systems in biomacromolecular recognition experiments. The target architecture is the attachment of two biomolecule ‘arms’ to the alpha telechelic end point of a polymer and fixating the conjugate to the gold surface of SAW and SPR sensor chips with the polymer’s other omega chain end. This specific design of a conjugate will be implemented by using a strategy to yield novel double alpha as well as omega telechelic functionalized POx and the success of all cascade reaction steps leading to the final conjugation product will be proven through affinity measurements between covalently bound mannose and ConA. All reactions were performed on a low molecular model level first and then transferred to telechelic and also side chain functionalized polymer systems. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden hydrophile Polymere und Biomakromoleküle chemoselektiv und vicinal miteinander an einer Bindungsstelle verknüpft. Die Kombination der Native Chemical Ligation (NCL) mit der Thiol–En-Reaktion stellte hierfür eine geeignete Methode dar. Ein Machbarkeitsbeweis wurde anhand einer niedermolekularen Modellreaktion erbracht und nachfolgend unter der Verwendung von Polyoxazolinen auf makromolekulare Polymersysteme übertragen. Die erfolgreiche Darstellung der Konjugate wurde durch biomakromolekulare Bindungsaffinitäts-Messungen zu dem Lektin ConA bestätigt. KW - Polyoxazoline KW - Polyoxazolines Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229758 ER - TY - THES A1 - Horvat-Csóti [geb. Horvat], Sonja T1 - Development of Nanocarriers for Treatment and Diagnostics of Aspergillosis T1 - Entwicklung von Nanoträgern für die Behandlung und Diagnose von Aspergillosis N2 - This thesis aimed to evaluate the possibility to use nanoparticles as antifungal drug carriers as well as their potential application in screening and diagnostics of invasive aspergillosis. The interaction of nanogels, superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIOs) and gold nanoparticles (GNP) with fungal-specific polysaccharides, cells and biofilms was investigated. Firstly, it was evaluated how the charge of nanogels influence their interaction with fungal cells. Linear poly(glycidol)s (pG) and poly(2-methyl-2-oxazoline) (pMOx) polymers were synthesized and further functionalized with thiol groups for preparation of redox responsive nanogels. Results showed that negatively charged nanogels were internalized by the fungi to a much greater extent than positively charged ones. Furthermore, it was investigated how amphiphilicity of polymers used for preparation of nanogels influences nanogel-fungi interaction. It was concluded that nanogels prepared from polymers with degree of functionalization of 10% had the strongest interaction, regardless the length of the alkyl chain. Moreover, amphotericin B-loaded nanogels had a higher antifungal effect and lower toxicity towards mammalian cells than the free drug. In addition, inverse nanoprecipitation of thiol functionalized pGs was shown to be successful for preparation of nanogels with narrow size distribution. It was also demonstrated that crosslinking of the polymeric coating in hydrogel-like network with thiol functionalized pGs improved the SPIOs imaging performance. Finally, it was investigated whether GNPs could be used as model particles for the assessment of targeting to fungi. Fc dectin-1 was conjugated covalently to GNPs decorated with pGs, and binding affinity towards β-glucans was tested by surface plasmon resonance. In summary, this thesis demonstrated evidence for the potential of pG nanogels and pG coated nanoparticles for antifungal therapy and diagnostics of fungal infections caused by A. fumigatus. N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Evaluation der Eignung von Nanopartikeln für das Screening, die Diagnose und als Wirkstofftransportsysteme für die Behandlung von invasiver Aspergillose. Hierzu wurde die Interaktion von Nanogelen, superparamagnetischen Eisenoxid Nanopartikeln (SPIO) und Gold Nanopartikeln (GNP) mit pilz-spezifischen Polysacchariden, dem Pilz Aspergillus fumigatus sowie Pilz-Biofilmen untersucht. ... KW - Therapeutisches System KW - Nanogels KW - Aspergillosis KW - Iron Oxide Nanoparticles KW - Dectin-1 KW - Poly(glycidol)s KW - Aspergillose KW - Nanopartikel KW - Wirkstoff-Träger-System Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-238218 ER -