TY - THES A1 - Hollmann, Claudia Beate T1 - Einfluss der sauren Sphingomyelinase auf anti-virale T-Zellantworten im Masernvirus-Infektionsmodell T1 - Role of the acid sphingomyelinase in anti-viral T cell responses in a measles virus infection model N2 - Die saure Sphingomyelinase (Asm), ein Enzym des Sphingolipidmetabolismus, spaltet Sphingomyelin zu Ceramid und Phosopocholin. Aktiviert wird die Asm unter anderem durch Stimulation des CD28 Rezeptors. CD28 Signale werden auch für die Aktivierung von konventionellen T-Zellen (Tconv) und für die Kostimulation benötigt und sind essentiell für die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen (Treg) im Thymus und deren Erhalt in der Peripherie. Wir konnten zeigen, dass sich Tconv und Treg Zellen hinsichtlich der Asm unterscheiden. Treg haben eine höhere "basale" Asm Aktivität, widergespiegelt im höheren Ceramidgehalt und haben eine niedrigere Lipidordnung als Tconv Zellen. Die Abwesenheit der Asm in defizienten Mäusen bewirkt einen relativen Anstieg der Treg-Frequenz innerhalb der CD4+ T-Zellen. Außerdem führt die Asm-Defizienz in Treg Zellen zu einer erhöhten Umsatzrate des immunsupprimierenden Moleküls CTLA-4 und zu einer verstärkten Suppressivität von Treg Zellen aus Asm-/- Mäusen gegenüber Wildtyp Zellen. Ein Anstieg in der Treg-Frequenz, äquivalent zur genetischen Defizienz, kann auch durch Inhibition der Asm, d. h. durch Wirkstoffe wie Amitriptylin und Desipramin erreicht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibitorbehandlung die absolute Anzahl der Tconv Zellen selektiv verringert, da Treg Zellen gegenüber dem Asm Inhibitor-induzierten Zelltod resistenter sind. Mechanistisch erklärbar sind die Unterschiede gegenüber den proapoptotischen Inhibitoreffekten zwischen Tconv und Treg Zellen dadurch, dass Treg Zellen durch die Anwesenheit von IL-2 geschützt sind. In Abwesenheit von IL-2 sterben die Treg Zellen ebenfalls. Die gezielte Veränderung des Verhältnisses von Treg zu Tconv durch den Einsatz von Asm-inhibitorischen Medikamenten kann hilfreich bei der therapeutischen Behandlung von inflammatorischen- und Autoimmunerkrankungen sein. Inwiefern die Asm für die Funktion von T-Zellen in der anti-viralen Immunantwort entscheidend ist, wurde im Masernvirus-Infektionsmodell näher untersucht. In Asm-/- Mäusen und Amitriptylin-behandelten Mäusen konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit der Asm die Kontrolle der Masernvirusinfektion verschlechtert ist. Treg sind auch hier von entscheidender Bedeutung, da die Asm-abhängige, verstärkte Masernvirusinfektion bei Fehlen der Asm nur in Gegenwart von Treg auftritt. In der akuten Phase gibt es in Asm-/- Mäusen weniger masernvirusspezifische T-Zellen und dadurch eine verringerte Beseitigung der Viruslast. In der chronischen Phase ist die Anzahl masernvirusspezifischer T-Zellen zwischen WT und Asm-/- Mäusen vergleichbar. In Letzteren ist allerdings die Anzahl und Frequenz von T-Zellen im Gehirn infizierter Mäuse noch deutlich erhöht, was die verstärkte Maserninfektion widerspiegelt. Zusammenfassend zeigt sich, dass die Asm die Funktion von Treg moduliert und einen Einfluss auf das Verhältnis von Tconv und Treg zueinander hat. Im Masernvirus-Infektionsmodell kann die Veränderung des Tconv zu Treg Verhältnisses in Abwesenheit der Asm ursächlich für die verringerte Viruskontrolle sein. Die Asm Inhibitor-induzierte Treg-Aktivierung und die Beeinflussung des Treg zu Tconv Verhältnisses können wiederum für therapeutische Zwecke genutzt werden, wie beispielsweise bei Multipler Sklerose und Rheumatoider Arthritis. N2 - The acid sphingomyelinase (Asm), an enzyme of the sphingolipid metabolism, hydrolyses sphingomyelin into ceramide and phosphocholine. Besides other stimuli the Asm is activated by ligation of the costimulatory molecule CD28. CD28 signaling is necessary to activate conventional T-cells (Tconv) and is crucial for the differentiation and maintenance of thymus-derived regulatory T-cells (Treg). We could demonstrate that Tconv and Treg cells differ with respect to Asm activity. Treg cells have an increased "basal" Asm activity resulting in an elevated level of ceramide and show a decreased lipid order compared to Tconv cells. The absence of Asm leads to a relative increase in Treg frequency among CD4+ T-cells in Asmdeficient mice. Furthermore, the Asm deficiency results in an increased turnover rate of the immunosuppressive molecule CTLA-4 and strengthens the suppressive capacity of Treg cells from Asm-/- mice compared to wild type Treg cells. An increase of the Treg cell frequency, equivalent to that seen with genetic deficiency, can be achieved by drugs like amitriptyline and desipramine too. The inhibitor treatment selectively decreases the absolute numbers of Tconv cells as Treg cells are more resistant towards Asm inhibitor induced cell death. The mechanistic explanation for the difference concerning the proapotptotic effects of Asm inhibitors between Treg and Tconv cells is that Treg cells are protected by IL-2. In the absence of IL-2 Treg cells die too. Therapeutically shifting the balance of Treg and Tconv cells by Asminhibiting drugs can be beneficial in inflammatory and autoimmune diseases. Whether the Asm is necessary for the function of T-cells during anti-viral immune responses was investigated in a measles virus infection model. In Asm-/- mice and amitriptyline treated mice control of the measles virus was impaired. Treg cells are of critical relevance as the Asm dependent boost in measles infection was only visible in the presence of Treg cells. During the acute phase of infection less measles virus specific T-cells were present leading to a decreased clearance of virus from the brains of Asm-/- mice. In the chronic phase the number of measles virus specific Tcell was comparable between wt and Asm-/- mice. But in the latter the number and frequency of T-cells in brains of infected mice was increased, which mirrors the enhanced measles virus infection. In conclusion, the Asm modulates the function of Treg cells and influences the Treg- Tconv ratio. The changed Treg-Tconv ratio in the absence of Asm expression might be responsible for the reduced virus control in the measles virus infection model. Additionally, the Asm inhibitor induced Treg cell activation and its effects on the Treg- Tconv ratio can be used for therapeutical approaches in diseases like multiple sclerosis or rheumatoid arthritis. KW - saure Sphingomyelinase KW - Treg KW - Masernvirus KW - Sphingomyelin KW - Ceramid KW - acid sphingomyelinase KW - regulatory t cells KW - measles virus KW - ceramide Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153807 ER - TY - JOUR A1 - Vendelova, Emilia A1 - de Lima, Jeferson Camargo A1 - Lorenzatto, Karina Rodrigues A1 - Monteiro, Karina Mariante A1 - Mueller, Thomas A1 - Veepaschit, Jyotishman A1 - Grimm, Clemens A1 - Brehm, Klaus A1 - Hrčková, Gabriela A1 - Lutz, Manfred B. A1 - Ferreira, Henrique B. A1 - Nono, Justin Komguep T1 - Proteomic Analysis of Excretory-Secretory Products of Mesocestoides corti Metacestodes Reveals Potential Suppressors of Dendritic Cell Functions JF - PLoS Neglected Tropical Diseases N2 - Accumulating evidences have assigned a central role to parasite-derived proteins in immunomodulation. Here, we report on the proteomic identification and characterization of immunomodulatory excretory-secretory (ES) products from the metacestode larva (tetrathyridium) of the tapeworm Mesocestoides corti (syn. M. vogae). We demonstrate that ES products but not larval homogenates inhibit the stimuli-driven release of the pro-inflammatory, Th1-inducing cytokine IL-12p70 by murine bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs). Within the ES fraction, we biochemically narrowed down the immunosuppressive activity to glycoproteins since active components were lipid-free, but sensitive to heat- and carbohydrate-treatment. Finally, using bioassay-guided chromatographic analyses assisted by comparative proteomics of active and inactive fractions of the ES products, we defined a comprehensive list of candidate proteins released by M. corti tetrathyridia as potential suppressors of DC functions. Our study provides a comprehensive library of somatic and ES products and highlight some candidate parasite factors that might drive the subversion of DC functions to facilitate the persistence of M. corti tetrathyridia in their hosts. KW - proteomic analysis KW - excretory-secretory KW - Mesocestoides corti Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166742 VL - 10 IS - 10 ER - TY - THES A1 - Lother, Jasmin T1 - Interaktion dendritischer Zell-Subtypen mit dem human pathogenen Schimmelpilz \(Aspergillus fumigatus\) T1 - Interaction of dendritic cell subtypes with the human pathogenic mould fungus \(Aspergillus fumigatus\) N2 - Die invasive Aspergillose (IA) z¨ ahlt zu den seltenen, bei immunsupprimierten Patienten jedoch mit einer hohen Letalit¨ at verbundenen Infektionskrankheiten. Sie wird, wie alle Aspergillosen, durch den humanpathogenen Schimmelpilz Aspergillus fumigatus ausgel¨ ost. Bis heute ist die oft nicht effektive Therapie einer IA mit hohen Nebenwirkungen und Kosten verbunden. Die Entwicklung von Pathogen-spezifischen Immuntherapien soll durch die Forschung im Bereich der immunologischen Infektionsbiologie vorangetrieben werden. Fur neuen Erkenntnisse wird die Interaktion von humanen Immunzellen mit ¨ A. fumigatus analysiert. In der vorliegenden Studie wurde mit dendritischen Zellen (DCs) gearbeitet, da diese Pilzmorphologien von A. fumigatus phagozytieren k¨ onnen und uber Antigenpr ¨ ¨ asentation das adaptive Immunsystem aktivieren. Es wurden aus humanen Monozyten differenzierte DCs (moDCs) verwendet, mit welchen viele Forschergruppen aufgrund ihrer verfugbar ¨ großen Anzahl arbeiten. Allerdings dauert die Generierung von moDCs funf Tage. Aus ¨ dem peripheren Blut entstammende CD1c-positive myeloide DCs (mDCs) oder CD303- positive plasmazytoide DCs (pDCs) k¨ onnen dagegen direkt nach der Isolation verwendet werden. Die beiden DC-Populationen werden aus verschiedenen Vorl¨ auferzellen des h¨ amatopoetischen Systems im Knochenmark gebildet. Ihr Ph¨ anotyp und ihre Immunfunktionen unterscheiden sich untereinander und auch von denen der moDCs. In Interaktionsstudien konnte analysiert werden, dass die drei verwendeten DC-Subtypen (moDCs, mDCs, pDCs) unterschiedlich auf A. fumigatus reagieren. moDCs und mDCs reiften in direktem Kontakt zu Aspergillus, sie sekretierten ein relativ ¨ ahnliches Zytokinprofil und exprimierten die bekannten Aspergillus-Rezeptoren Dectin-1, TLR2 und TLR4. Im Kontrast dazu verblieben pDCs trotz Aspergillus-Kontakt unreif und sekretierten nahezu keine Zytokine. Da moDCs und mDCs eine Immunreaktion auf den Pilz zeigten, wurden sie mit verschiedenen Aspergillus-Antigenen beladen und n¨ aher untersucht. Bevor verschiedene Aspergillus-Antigene zur Beladung der DCs eingesetzt werden konnten, wurden diese analysiert und aufgereinigt. Hierfur wurde ein routinierter Arbeitsprozess ¨ etabliert. Zwei der vier verfugbaren Proteinantigene waren mit Endotoxin kontaminiert. ¨ Da schon geringe Mengen an Endotoxinen auf DCs einen stimulatorischen Effekt ausubten, ¨ wurden die Proteine mittels Affinit¨ atschromatografie von den verunreinigenden Endotoxinen befreit. In den Stimulationsexperimenten wirkten die beiden Proteinantigene CcpA und SHMT immunogen auf moDCs und mDCs. CcpA induzierte eine st¨ arkere Maturierung und Zytokinfreisetzung als SHMT. Auff¨ allig war, dass mDCs im Vergleich zu moDCs die Expression von MHC Klasse II st¨ arker erh¨ ohten und mehr IL18 freisetzten. Die mit CcpA oder SHMT beladenen moDCs und mDCs aktivierten autologe T-Zellen zur IFNg Sekretion und zur Proliferation. Zudem wurden durch die beiden Proteine Aspergillus-spezifische, CD154- positive T-Zellen induziert. Diese Aspergillus-spezifische Immunogenit¨ at von CcpA und SHMT macht die beiden Proteine zu interessanten Kandidaten fur einen Vakzinierungs- ¨ Cocktail einer DC-Immuntherapie. Aspergillus Lysat induzierte als weiteres Antigen eine T-Zell Immunantwort mit CD154-positiven T-Zellen. Zudem war die Proliferation und IFNg Sekretion von T-Zellen induziert, obwohl moDCs und mDCs nicht reiften und nur wenige Zytokine sekretierten. Die beiden Aspergillus-Proteine CpcB und fg-gap induzierten die Reifung und Zytokinsekretion von moDCs und mDCs nicht. Demzufolge sind CpcB und fg-gap fur eine DC-Immuntherapie nicht empfehlenswert. ¨ Ein Vakzinierungs-Cocktail enth¨ alt in der Regel Adjuvantien, welche die Immunreaktion verst¨ arken. Adjuvante Effekte auf moDCs konnten die getesteten Aspergillus-RezeptorLiganden Zymosan, Pam3CSK4, LPS ultrapur und R848 ausl¨ osen. Hyalurons¨ aure konnte keine Verbesserung der Reifung oder Vitalit¨ at von moDCs und mDCs bewirken. Die Antigen-bedingte Reifung der DCs fur n ¨ ¨ otige Restimulationen w¨ ahrend der Therapie konnte mittels einer tiefgekuhlten Lagerung in CryoStor Einfriermedium stabil beibehalten ¨ werden. Die beiden immunogenen Aspergillus-Proteine, die adjuvanten Rezeptor-Agonisten und die stabile Lagerung in CryoStor k¨ onnen als elementare Grundsteine fur einen Vakzinierungs- ¨ Cocktail einer anti-fungalen DC-Immuntherapie mit moDCs oder mDCs angesehen werden. N2 - Invasive aspergillosis (IA) is one of the rare infectious diseases associated with a high mortality rate that occurs in immunocompromised patients. Like all aspergillosis, it is caused by the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus. No effective therapy of IA is known to date and the current therapy is associated with high side effects and costs. More in-depth research is needed in the field of immunological infection biology, such as the interactions of human immune cells with A. fumigatus, for the development of pathogen-specific immunotherapies. In the present study dendritic cells (DCs) are investigated due to their ability to phago- cytose fungal morphologies of A. fumigatus and activate the adaptive immune system via antigen presentation. Monocytes which differentiate into DCs (moDCs) are used by many research groups due to their large numbers; however, their total generation time lasts five days. CD1c-positive myeloid DCs (mDCs) and CD303-positive plasmacytoid DCs (pDCs) found in the peripheral blood can be used directly after isolation. The two DC populations are formed from different precursor cells of the hematopoietic system in the bone marrow and therefore their phenotype and immune functions differ from each other and also from those of moDCs. ... KW - Dendritische Zellen KW - Aspergillus KW - Untertyp Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140940 ER - TY - THES A1 - Sbiera, Silviu T1 - Interaction of Human Polyomavirus JC with cells of the hematopoietic system in the periphery T1 - Interaktion zwischen Human Polyomavirus JC mit Zellen des haematopoietischen Systems in der Peripherie N2 - Primary contact with human polyomaviruses is followed by lifelong asymptomatic persistence of viral DNA. Under severe immunosuppression JCV activation may lead to unrestricted virus growth in the CNS followed by development of progressive multifocal leukoencephalopathy (PML). Besides the kidney and the brain, target cells of persistent infection were also found in the hematopoietic system. This included the presence of JCV genomes in peripheral blood cells (PBCs). In the attempt to understand the role of PBCs for the JCV infection in humans, we asked for the type of cells affected as well as for virus interaction with PBCs. Analysis of separated subpopulations by highly sensitive and specific polymerase chain reaction and Southern blot hybridization revealed the presence of JCV DNA mostly in circulating granulocytes. These cells have important functions in innate immunity and are professional phagocytes. This suggested that PCR amplified DNA might be the result of an extranuclear association of the virus due to membrane attachment or phagocytosis rather than JCV infection with presence of viral DNA in the nucleus. In the attempt to answer this question JCV DNA was subcellularly localized in the blood of 22 healthy donors by JCV specific fluorescence in situ hybridization (FISH). Granulocytes and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were separated by Percoll gradient centrifugation. Intracellular JCV DNA was hybridized with Digoxigenin-labeled JCV specific DNA probes covering half of the viral genome. As the sensitivity of the anti-digoxigenin antibody system was lower than the PCR detection level, a chemical amplification step was included consisting of peroxidase labeled secondary antibody precipitating biotinylated tyramide followed by detection with streptavidin-Texas-Red and fluorescence microscopy. Comparison of the number of cells affected in healthy individuals with 15 HIV-1 infected patients with and without PML revealed that the rate of affected PBMCs was comparable in both groups (2.5±0.4 and 14.5±0.9 per 1000). In contrast, the rate of JCV positive granulocytes in the immunosuppressed group was 92.6±1.7% compared to 4±1.4% in healthy donors thus confirming that granulocytes are the major group of circulating cells affected by JCV and that HIV-1 associated immune impairment has an important effect on the virus-cell association. Localization revealed that JCV DNA was predominantly located within the cytoplasm, although hybridizing signals occasionally covered the nuclear compartment. The fluorescent glow of chemical amplification combined with classical fluorescence microscopy did not allow an unequivocal localization of viral DNA. However, confocal microscopy of 24 sections through single cells combined with FISH without chemical amplification confirmed cytoplasmic localization of JCV DNA in a large number of cells. Additionally, it clearly demonstrated that JCV DNA was also located in the nucleus and nuclear localization directly correlated with the number of cells affected. Calculation of the virus load in subcellular compartments revealed that up to 50% of the JCV genomes were located in the nucleus thus pointing to viral infection at least in the granulocytes of HIV-1 infected patients. This may contribute to the distribution of the virus from sites of peripheral infection to the CNS and may promote the development of active PML in the severely immune impaired patients. N2 - Primärer Kontakt mit dem humanen Polyomavirus JC führt zu lebenslanger asymptomatischer Persistenz der viralen DNA in den Zielorganen der Infektion insbesondere der Niere und dem ZNS. Unter schwerer Immunsuppression kann die Aktivierung des JCV zu uneingeschränkter Vermehrung des Virus im ZNS und zur Entwicklung einer zentralnervösen Erkrankung, der progressiven multifokalen Leukoenzephalopathie (PML) führen Neuerdings wurde JCV DNA auch in Zellen des blutbildenden Systems insbesondere in peripheren Blutzellen (PBCs) beschrieben. Um die Rolle der PBCs für die JCV-Infektion beim Menschen besser zu verstehen, sollte der virus-assoziierte Zelltyp bestimmt und die Virus-Zell Interaktion näher untersucht werden. Die Analyse von isolierten Blutzellsubpopulationen durch eine sensitive und spezifische Polymerase-Kettenreaktion mit folgender Southern Blot-Hybridisierung ergab die Präsenz von JCV-DNA zumeist in zirkulierenden Granulozyten. Diese Zellen haben eine wichtige Funktion in der angeborenen Immunität und sind professionelle Phagozyten. Dies legte nahe, dass die PCR-amplifizierte DNA eher das Ergebnis einer extranukleären Assoziation des Virus durch Membranassoziation oder Phagozytose als einer JCV-Infektion ist, die durch Virus-DNA im Kern charakterisiert ist. Bei dem Versuch, diese Frage zu klären, wurde JCV-DNA in Blutzellen von gesunden Spendern mittels JCV-spezifischer Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) subzellulär lokalisiert. Granulozyten und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden isoliert und intrazelluläre JCV-DNA mit Digoxigenin-markierten JCV DNA-Sonden, die die Hälfte des viralen Genoms representierten, hybridisiert. Da die Empfindlichkeit des Anti-Digoxigenin-Antikörper-Systems niedriger war als die PCR-Nachweisgrenze, wurde ein chemischer Amplifikationsschritt benutzt, das sogenannte Tyramidsystem, um die Sensitivität der FISH in Kombination mit der klassischen Fluoreszenzmikroskopie zu erhöhen. Der Vergleich der Anzahl von JCV betroffenen Zellen in gesunden Individuen mit Zellen von HIV-1-infizierten Patienten mit und ohne PML zeigte, dass die Rate der betroffenen PBMCs in beiden Gruppen (2,5 ± 0,4 und 14,5 ± 0,9 pro 1000) vergleichbar war. Im Gegensatz dazu war die Rate der JCV positiven Granulozyten in der immunsupprimierten Gruppe, 92,6 ± 1,7%, im Vergleich zu denen bei gesunden Spendern 4 ± 1,4% deutlich höher. Dies bestätigte, dass mit den Granulozyten die größte Gruppe von zirkulierenden Zellen von JCV betroffen sind und dass die schwere Beeinträchtigung der immunologischen Kompetenz durch die HIV-1 Infektion einen bedeutenden Einfluss auf auf die Virus-Zell Interaktion hat. Die intrazelluläre Lokalisation der viralen DNA ergab, dass die Signale überwiegend im Zytoplasma lokalisiert waren, wenngleich gelegentlich auch nukleäre Kompartimente betroffen waren. Durch die chemischen Verstärkung der Fluoreszenzsignale in Kombination mit klassischer Fluoreszenzmikroskopie war es jedoch nicht möglich eine eindeutige Lokalisierung der viraler DNA zu erreichen. Erst die Anwendung der konfokalen Mikroskopie bestätigte die predominant zytoplasmatische Lokalisierung von JCV-DNA in einer großen Anzahl von Zellen und hat eindeutig gezeigt, dass JCV-DNA zusätzlich im Kern lokalisiert ist. Die Kern Lokalisation korreliert direkt mit der Anzahl der betroffenen Zellen. Berechnung der Viruslast in subzellulären Kompartimenten hat gezeigt, dass bis zu 50% der JCV Genome im Kern von Granulozyten von HIV-1 Patienten lokalisiert waren. Dies deutet auf eine virale Infektion der Granulozyten hin und lässt vermuten, dass sie unter der HIV-1 Infektion an der Disseminierung des JC Virus aus den Organen der peripheren Infektion in das ZNS beteiligt sind und in der Konsequenz auch bei der Entwicklung der PML eine wesentliche Rolle spielen könnten. KW - Polyomaviren KW - Persistenz KW - Blutbildendes Gewebe KW - persistierende Infektion KW - Polyomavirus JC Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74183 ER - TY - THES A1 - Weber, Conrad T1 - Charakterisierung von Foamyvirus-Adenovirus-Hybridvektoren zur Gentherapie bei der Rheumatoiden Arthritis T1 - Characterisation of foamy virus-adenovirus hybrid vectors for gene therapy of the arthritides N2 - Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische, progressive und systemische Autoimmunerkrankung, in deren Zentrum das dauerhaft entzündete Synovialgewebe der Gelenke steht. Aufgrund vielfältiger Knochen- und Knorpel-destruierender Prozesse kommt es zu irreversiblen Funktionalitätsverlusten der betroffenen Gelenke. Eine tragende Rolle bei der Ausprägung der klinischen Manifestationen wird dabei der exzessiven Synthese des proinflammatorischen Cytokins IL-1 zugesprochen. Dessen Aktivität kann durch kompetitive Blockade des IL-1 Rezeptors Typ I mit dem natürlich vorkommenden, antiinflammatorischen IL-1 Rezeptorantagonisten (IL-1Ra) inhibiert werden. Der Cytokin-blockierende Therapieansatz mit Anakinra, einem rekombinant hergestellten IL-1Ra, konnte die pharmakologischen Behandlungsmöglichkeiten der RA seit 2001 wesentlich erweitern. Gleichwohl erfordern die geringen Halbwertszeiten von IL-1Ra regelmäßige subkutane Injektionen, um hinreichende therapeutische Wirkstoffspiegel im Patienten aufrecht zu erhalten. Vor diesem Hintergrund bieten somatische Gentherapiekonzepte eine vielversprechende Alternative zu den konventionellen Behandlungsstrategien bei der RA-Therapie. Ein IL-1Ra-Gentransfer ins Gelenk soll die persistierende, lokale, endogene Synthese des therapeutischen IL-1Ra-Proteins ermöglichen und lässt in dieser Hinsicht eine nachhaltige Verbesserung der klinischen Symptomatik erwarten. In dieser Arbeit wurden dafür gentherapeutische Foamyvirus-Adenovirus-Hybridvektoren (FAD) zur Expression des IL-1Ra entwickelt und die Funktionalität der Konstrukte evaluiert. Die Vektoren sollten die effizienten adenoviralen Transduktionsmechanismen mit dem Potential der foamyviralen somatischen Integration für einen direkten in vivo Gentransfer kombinieren. Das System besteht aus einem adenoviralen Hochkapazitätsvektor vom Serotyp 5, der eine selbstinaktivierende PFV-Vektorkassette unter Kontrolle des Reversen Tetracyclin Transaktivator Systems (Tet-On) enthält. In FAD-transduzierten Zellen wurde die funktionelle Induzierbarkeit der PFV-Vektorexpression nachgewiesen und die Kinetik der PFV-Partikelfreisetzung charakterisiert. Nach Induktion der PFV-Vektorkassette konnte in FAD-transduzierten Zellen ein langfristig-stabiler IL-1Ra-Gentransfer gezeigt werden. Ferner konnten protektive Effekte eines FAD-vermittelten IL-1Ra-Gentransfers im Zellkulturmodell nachgewiesen werden. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten eine erfolgreiche Transduktion von Synovialzellen nach intraartikulärer Applikation von FAD-Vektoren. Das Tetracyclin-regulierbare Hybridvektorsystem zur Expression des IL-1Ra, das in der vorliegenden Arbeit geschaffen wurde, könnte zukünftig die Basis für ein effektives Werkzeug zum intraartikulären Gentransfer in der klinischen Praxis bieten. N2 - Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, progressive and systemic autoimmune disease, characterized by invasive synovial hyperplasia. Several inflammatory cartilage- and bone- destroying processes lead to an irreversible loss of joint functionality. The excessive synthesis of the pro-inflammatory cytokine IL-1 has been implicated as a primary mediator of pathology in RA. The activity of IL-1 is initiated upon binding to the IL-1 receptor type I and can be inhibited by the naturally occurring anti-inflammatory IL-1 receptor antagonist (IL1-Ra) protein. The cytokine-blocking therapeutic approach with anakinra, a recombinant form of IL-1Ra, has significantly improved the pharmacological treatment of RA since 2001. Nevertheless, due to the short half-life of IL-1Ra, repeated subcutaneous injections are required to maintain therapeutic concentrations in the patient. Thus, somatic gene therapy may offer a promising alternative to conventional therapeutic strategies for treating RA. Following gene delivery of IL-1Ra, it may be expected that a sustained improvement of clinical symptoms is achievable due to the endogenous cellular synthesis and local secretion of the therapeutic IL-1Ra protein. In this work, foamy virus-adenovirus hybrid vectors (FAD) were developed for the expression of IL-1Ra and the functionality of the constructs was evaluated. The hybrids combine the high transduction efficiency of adenovirus vectors with the integrative potential provided by prototype foamy virus (PFV) vectors, for direct in vivo gene transfer. In the system, a complete expression cassette for self-inactivating PFV vectors, which is under the control of the tetracycline-dependent regulatory system (Tet-On), was inserted into the backbone of a serotype 5-based high-capacity adenoviral vector. In FAD-transduced cells, the induction of the PFV vector cassette was demonstrated and the release of secondary infectious PFV vectors was characterized. After the induction of the PFV vector cassette in FAD-transduced cells, a stable long-term IL1-Ra expression was shown. Furthermore, the anti-inflammatory potential of the FAD-mediated IL-1Ra gene transfer was successfully evaluated in a cell culture model. Animal studies indicated successful transduction of cells in the synovium after intra-articular application of FAD-vectors. The tetracycline-inducible hybrid vector system for the expression of IL-1Ra, which was created in the present work, may provide the future basis for an effective tool for intra-articular gene transfer in clinical settings. KW - Rheumatoide Arthritis KW - Vektor KW - Spumaviren KW - Adenovirus 5 KW - Interleukin 1-beta KW - Gentherapie KW - Chimäre KW - Hybridvektor KW - High-Capacity Adenovirus KW - IL-1RA KW - Interleukin-1 Rezeptorantagonist KW - intraartikulär KW - foamyvirus KW - high-capacity adenovirus KW - hybrid vector KW - gene therapy KW - intraarticular KW - IL1RA Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70345 ER - TY - THES A1 - Pletinckx, Katrien T1 - Dendritic cell maturation and instruction of CD4+ T cell tolerance in vitro T1 - Reifung der dendritischen Zelle und Instruktion der CD4+ T Zell Toleranz in vitro N2 - Effective T cell immunity was believed to occur by mature DC, whereas tolerogenicity was attributed strictly to immature DC phenotypes. However, intermediate DC maturation stages were identified conditioned by inflammatory mediators like TNF. Furthermore, the T cell tolerance mechanisms are dependent on distinct modes and intensities of co-stimulation. Therefore, in this study it was addressed how distinct DC maturation signatures instruct CD4+ T cell tolerance mechanisms. DC acquire antigens from apoptotic cells for self-peptide-MHC presentation and functionally adapt presumed tolerogenic DC phenotypes. Here, immature murine bone-marrow derived DC representing both inflammatory and conventional DC subsets adapted a maturationresistant DC signature upon apoptotic cell recognition but no additional tolerogenic features. Immature DC instruct CD4+ FoxP3+ regulatory T cells in a TGF-β prone micro-environment or generate anergic CD4+ T cells hampered in the TCR-induced proliferation and IL-2 secretion. Secondary stimulation of such anergic CD4+ T cells by immature DC increased primarily IL-10 production and conferred regulatory function. These IL-10+ regulatory T cells expressed high levels of CTLA-4, which is potently induced by immature DC in particular. Data in this work showed that anergic T cells can be re-programmed to become IL-10+ regulatory T cells upon ligation of CTLA-4 and CD28 signalling cascades by B7 costimulatory ligands on immature DC. In contrast, semi-mature DC phenotypes conditioned by the inflammatory mediator TNF prevented autoimmune disorders by induction of IL-10+ Th2 responses as demonstrated previously. Here, it was shown that TNF as an endogenous maturation stimulus and pathogenic Trypanosoma brucei variant-specific surface glycoproteins (VSG) induced highly similar DC gene expression signatures which instructed default effector Th2 responses. Repetitive administration of the differentially conditioned semi-mature DC effectively skewed T cell immunity to IL-10+ Th2 cells, mediating immune deviation and suppression. Collectively, the data presented in this work provide novel insights how immature and partially mature DC phenotypes generate T cell tolerance mechanisms in vitro, which has important implications for the design of effective DC-targeted vaccines. Unravelling the DC maturation signatures is central to the long-standing quest to break tolerance mimicked by malignant tumours or re-establish immune homeostasis in allergic or autoimmune disorders. N2 - Reife DC sind potente Induktoren von T Zell Immunität, wogegen unreife DC Stadien zur Induktion von Immuntoleranz befähigt sind. Zudem sind intermediäre semireife DC Entwicklungsstadien identifiziert worden, wie sie nach Behandlung mit inflammatorischen TNF entstehen. Die bekannten T Zell Toleranzmechanismen sind wiederum abhängig von unterschiedlicher Art und Intensität von Kostimulation. Hier wurde deshalb untersucht wie verschiedene DC Reifungsstadien CD4+ T Zelltoleranz induzieren können. DC nehmen apoptotisches Zellmaterial auf, was als Antigenquelle zur Präsentation von MHC/Selbstpeptid-Komplexen genutzt wird und tolerogene Funktionen in DC hervorrufen kann. Unsere Ergebnisse zeigten dass aus Knochenmark generierte DC der Maus, die sowohl inflammatorische als auch klassische DC Subtypen darstellen, nach Erkennung apoptotischen Zellmaterials reifungsresistent wurden, jedoch unverändert unreif und keine neuen tolerogenen Funktionen erwarben. Unreife DC induzierten in Gegenwart von TGF-β CD4+ FoxP3+ regulatorische T Zellen und in dessen Abwesenheit anergische CD4+ T Zellen. Wiederholte Stimulation anergischer CD4+ T Zellen durch unreife DC, induzierte deren IL-10 Produktion und regulatorische Eigenschaften. Diese IL-10+ regulatorischen T Zellen zeigten keine FoxP3 Expression, jedoch verstärkt CTLA-4, insbesondere nach Interaktion mit unreifen DC. Zusammen zeigten die hier erhaltenen Daten, dass das Reprogrammieren anergischer T Zellen zu IL-10+ regulatorischen T Zellen über CTLA-4 als auch über CD28 Signalkaskaden durch deren B7 Liganden auf der Zelloberfläche unreifer DC gesteuert wird. Frühere Arbeiten zeigten, dass repetitive Injektion semireifer DC, Autoimmunerkrankungen vorbeugen konnten durch die Induktion IL-10+ Th2 Antworten. Hier konnte gezeigt werden dass TNF als endogener Reifungsstimulus sowie pathogene T. brucei Varianten-spezifische Glykoproteine (VSG) sehr ähnliche semireife DC Reifungsqualitäten hervorrufen. Die entsprechend generierten Th2 Effektor Zellen unterschieden sich lediglich geringfügig in deren Zytokinproduktion. Repetitive Injektionen dieser semireifen DC induzierten ebenfalls IL-10+ Th2 Differenzierung und effektive Immundeviation in vivo. Insgesamt hat die vorliegende Arbeit wichtige Erkenntnisse ergeben, wie unreife und semireife DC die Generierung unterschiedlicher T Zell Toleranzmechanismen in vitro unterstützen. Diese Erkenntnisse sind ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung effektiver DC-basierter Immunvakzinen. Die Definition der verschiedenen DC Reifungsstadien ist von großer Bedeutung bei der Optimierung von Behandlungsverfahren gegen infektiöse Erreger, Krebs oder Autoimmunerkrankungen. KW - Dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Immuntoleranz KW - Toleranz KW - Dendritic cell KW - tolerance Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67375 ER - TY - THES A1 - Oberländer, Uwe T1 - Untersuchung der immunstimulatorischen Effekte von Neuromelanin (NM) auf dendritische Zellen und deren Bedeutung in der Pathogenese von Morbus Parkinson T1 - Investigation of immunostimulatory effects of Neuromelanin on dendritic cells and relevance for Parkinsons disease N2 - Hintergrund: Das Absterben Neuromelanin (NM)-haltiger Zellen in der substantia nigra (SN), und die daraus resultierende Erniedrigung des Dopaminspiegels im striatum, ist ein pathologisches Hauptmerkmal der Parkinsonschen Krankheit. Ein neuerlicher Nachweis von Anti-Melanin-Antikörpern gibt Anlass zur Vermutung, dass NM ein Autoantigen sein könnte. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass NM tatsächlich von dendritischen Zellen (DZ), die in vivo hauptverantwortlich für die Auslösung von T- und B-Zellantworten sind, erkannt wird. Die Erkennung von NM durch DZ ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Einleitung einer adaptiven Immunantwort. Methoden: Murine dendritische Zellen (mDZ) wurden aus Knochenmarkszellen generiert und mit NM aus humaner SN oder synthetischem Dopaminmelanin (DAM) behandelt, nachdem beide Melanine endotoxinfrei getestet wurden. Die Phagozytose von NM wurde mittels konfokaler Mikroskopie dokumentiert. Die Expression von MHC II und CD86 wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS) analysiert. Zytokinkonzentrationen von TNF- und dem Interleukin IL-6 wurden mit ELISA-Assays bestimmt. Abschließend wurde die Funktion der durch NM aktivierten DZ mit einer allogenen mixed lymphocyte reaction (MLR) überprüft. Ergebnisse: NM wurde von den mDZ effektiv phagozytiert, woraufhin die mDZ einen reifen Phenotyp (CD86high/MHC IIhigh) zeigten. Zusätzlich sekretierten durch NM aktivierte mDZ die Zytokine IL-6 and TNF-. Schließlich ließen die mDZ T-Zellen in einer MLR proliferieren, und beweisen so ihre Funktionalität und die Fähigkeit eine primäre T-Zellantwort auszulösen. Im Gegenteil dazu konnte DAM, dem die Protein- und Lipidkomponenten von NM fehlen und nur das Melaninrückrat mit NM gemeinsam hat, nur einen kleinen Effekt bei den mDZ hervorrufen. Diskussion: NM wird von DZ in vitro erkannt und bewirkt deren Reifung. Sollte der Vorgang auch in vivo stattfinden, besteht die Möglichkeit, dass SN-Antigene dem adaptiven Immunsystem präsentiert werden, was in einzelnen Fällen zur Einleitung einer adaptiven Immunantwort führen könnte. NM könnte also der Auslöser für einen autoimmunen Pathomechanismus in der parkinsonschen Krankheit sein. N2 - Background: The degeneration of neuromelanin (NM)-containing dopaminergic cells in the substantia nigra (SN) and a resulting reduction in striatal dopamine is a key feature in Parkinsons´s Disease (PD). Increased anti-melanin antibodies in sera of Parkinson patients had been shown recently, suggesting that NM may act as an autoantigen in PD. In this work it was asserted that NM is being recognized by dendritic cells (DCs), the major cell type for inducing T- and B-cell responses in vivo. This recognition of NM by DCs is a prerequisite to trigger an autoimmune response directed against NM-associated structures. Methods: Murine dendritic cells (mDC), generated from bone marrow, were treated with NM of SN from human subjects or with synthetic dopamine melanin (DAM) after both melanins were tested free of endotoxin contamination. Phagocytosis was documented with confocal microscopy. The expression of MHC II and CD86 was analyzed by flow cytometry. Concentrations of inflammatory cytokines TNF- and interleukin IL-6 were determined by ELISA. Finally the function of activated mDCs was tested by allogeneic mixed lymphocyte reaction (MLR). Results: NM was phagocytized effectively by mDCs, which subsequently developed a mature phenotype (CD86high/MHC IIhigh). In addition, NM-activated mDCs secreted the proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-. Finally, they potently triggered T cell proliferation in a mixed lymphocyte reaction, showing that mDC activation was functional to induce a primary T cell response. On the contrary, DAM, which lacks the protein and lipid components of NM but mimics the dopamine-melanin backbone of NM, had only very little effect on mDC phenotype and function. Discussion: NM is recognized by DCs in vitro and triggers their maturation. If this process occurs in vivo, it would allow DCs to transport and present SN antigens to the adaptive immune system, thus leading to autoimmmunity in susceptible individuals. This finding offers a rationale for an autoimmune-based pathomechanism of PD with NM as the initial trigger. KW - Parkinson-Krankheit KW - Melanin KW - dendritische Zellen KW - Autoimmunität KW - Parkinson KW - Neuromelanin KW - dendritische Zellen KW - Autoimmunität KW - Parkinsons Disease KW - Neuromelanin KW - dendritic cells KW - Autoimmunity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73684 ER - TY - THES A1 - Gassert, Evelyn T1 - Die Bedeutung von Ceramiden für die Reorganisation des Zytoskeletts in T-Zellen, die Ausbildung einer immunologischen Synapse und die T-Zell-Aktivierung T1 - Impact of ceramide accumulation on T lymphocyte cytoskeletal reorganisation,immune synapse formation and activation N2 - Ceramide sind biologisch aktive Sphingolipide, die verschiedene zelluläre Signalwege regulieren, meist im Zusammenhang mit der Induktion von Apoptose oder der Regulation des Zellzyklus. Darüber hinaus wurde in der Literatur beschrieben, dass Ceramide die Zytoskelettdynamik unterschiedlicher Zelltypen beeinflussen, die Bedeutung von Ceramiden für die Funktion von T-Zellen wurde allerdings bisher wenig untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die exogene Akkumulation von Ceramiden ebenso wie die Generierung von Ceramiden durch bSMase die Adhärenz von T-Zellen an FN bzw. ICAM-1 beeinträchtigt. Des Weiteren konnte eine verminderte T-Zell-Polarisierung auf FN sowie eine reduzierte Chemotaxis und Motilität ceramidmodifizierter T-Zellen in Antwort auf SDF-1 nachgewiesen werden. In Übereinstimmung mit der Unfähigkeit ceramidmodifizierter Zellen morphologisch zu polarisieren wird ferner die Relokalisation von Oberflächenmolekülen und intrazellulärer Proteine durch die Akkumulation von Ceramiden gestört. Überdies konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide mit dem Aktivierungsstatus von Akt und ERM-Proteinen interferieren, da eine verminderte stimulationsabhängige Phosphorylierung von Akt und ERM-Proteinen in ceramidmodifizierten Zellen nachgewiesen wurde. Ein wesentlicher Schritt im Verlauf der T-Zell-Aktivierung ist die Ausbildung einer immunologischen Synapse mit dendritischen Zellen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass, obwohl ceramidreiche Membrandomänen von der Kontaktstelle ausgeschlossen werden, Konjugatfrequenz und Architektur der IS durch die Induktion von Ceramiden nicht beeinflusst werden, da eine normale Verteilung von CD3 und des MTOC beobachtet wurde. Allerdings wird die Funktionalität der Konjugate durch die Induktion von Ceramiden beeinträchtigt. Ceramidmodifizierte Zellen waren nur eingeschränkt in der Lage Orai1 und Stim1 zur Kontaktfläche mit DCs zu translozieren. In Übereinstimmung mit diesen Befunden wurde auch ein verminderter Calcium-Einstrom sowie eine verminderte Proliferation infolge der Akkumulation von Ceramiden detektiert. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide wesentliche Prozesse im Verlauf der T-Zell-Aktivierung beeinflussen, so dass die pathogeninduzierte Generierung von Ceramiden einen möglichen Mechanismus darstellt, die Funktion von T-Zellen zu beeinträchtigen. N2 - Ceramides are sphingolipids regulating various signalling pathways mainly associated with the induction of apoptosis and cell cycle arrest. Besides their established role in these processes several lines of evidence suggest that ceramides also regulate cytoskeletal dynamics in non-hematopoietic cells, but their role in T lymphocyte function has not yet been addressed. In this study we show that accumulation of membrane ceramides affects several processes required for accurate T cell function. Treatment of T cells with bSMase or exogenously added ceramides interfered with T cell adhesion to FN and ICAM-1 as well as T cell polarisation, chemotaxis and motility in response to SDF-1. In line with the impairment to morphologically polarise, relocation of surface receptors as well as intracellular signalling molecules was also impaired upon ceramide treatment of T cells. Moreover, increase in cellular ceramide levels interfered with cellular signalling pathways as revealed by reduced phosphorylation levels of Akt and ERM proteins. T cell activation requires the formation of an IS with DCs. In this study we could show, that ceramides, although excluded from the DC/T cell interface, do not interfere with conjugate frequency or synapse organisation, since a normal distribution of CD3 and the MTOC was observed. Nevertheless, ceramide generation interfered with the translocation of Orai1 and Stim1 to the interface and in line with this observation a reduced calcium-influx in T cells was detected upon bSMase exposure. In addition to the decrease in cytosolic calcium levels ceramides also reduced the ability of T cells to proliferate in response to CD3/CD28 stimulation. Therefore the induction of ceramides by certain pathogens, including MV, might be a possible mechanism to interfere with essential processes required for T cell activation. KW - Ceramide KW - T-Lymphozyt KW - T-Zell-Aktivierung KW - Zytoskelettreorganisation KW - immunologische Synapse KW - Masernvirus KW - ceramide KW - T cell activation KW - cytoskeletal reorganisation KW - immunological synapse KW - measles virus Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65123 ER - TY - THES A1 - Köthe, Susanne T1 - Masernvirus-Infektion von Dendritischen Zellen und Virus-Transmission an T-Zellen T1 - Measles virus infection of dendritic cells and virus transmission to T cells N2 - Dendritische Zellen (DCs) sind Antigen-präsentierende Zellen, die Pathogene erkennen und nach erfolgreicher Reifung spezifische adaptive Immunität induzieren. Die Infektion unreifer DCs durch Masernviren (MV) erfolgt CD150-abhängig und DC-SIGN-unterstützt. Infizierte DCs vermitteln wahrscheinlich den MV-Transport vom Respirationstrakt in sekundäre lym-phatische Gewebe, wo die MV-spezifische Immunität und die generalisierte Immunsuppressi-on initiiert werden sowie die MV-Transmission an T-Zellen stattfinden kann, die wesentlich für die Dissemination des Virus ist. Die MV-Infektion von iDCs initiierte deren Ausreifung begleitet von der moderaten Hochre-gulierung der CD150-Oberflächenexpression. Die Akkumulation viraler Proteine als auch die Freisetzung viraler Partikel waren in DCs im Vergleich zu Virus-produzierenden B-Zelllinie B95a beeinträchtigt. Diese Arbeit verglich die subzelluläre Verteilung der viralen Proteine in DCs und B95a-Zellen. In DC wiesen Matrix (M)-Proteine eine prominente Assoziation mit den Komponenten des Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexes auf. Die ausgeprägte Relokali-sierung des Tetraspanins CD81 zu Phospho (P)-Protein-Kompartimenten und die Inhibition der räumliche Interaktion der untersuchten Tetraspanine waren spezifisch für B95a-Zellen. Weder in B95a-Zellen noch für DC konnte für MV ein virus-containing compartment (VCC) detektiert werden, das für HIV-1 zuvor beschrieben wurde. Um den zellulären Transport des M-Proteins in infizierten, lebenden DCs untersuchen zu können, wurde das Protein carboxyterminal mit dem Tetracystein (TC)-Tag fusioniert. Das M-TC Fusionsprotein zeigte alle untersuchten biologischen Eigenschaften des Wildtyp-Proteins bezüglich seiner subzellulären Verteilung, der Assoziation mit DRMs sowie der Generierung und Freisetzung von virus-like particles (VPLs). Innerhalb des Viruskontextes interferierte der TC-Tag allerdings stark mit der Virusreplikation bzw. Freisetzung. Durch die Verminderung der Partikelproduktion in DCs wird eine spezielle MV-Transmissionsstruktur für die effiziente Übertragung an T-Zellen benötigt. Die MV-Transmission an autologe T-Zellen basierte vorwiegend auf Infektion von DCs (cis-Infektion) und weniger auf DC-SIGN-gebundenen Virus (trans-Infektion). Die Interaktion zwischen dem MV-Glykoprotein H mit seinem Rezeptor CD150 war wichtig für die Transmission. Die Transmission von MV erfolgte hauptsächlich durch die Bildung von Kontaktflächen, entspre-chend den beschriebenen virologischen Synapsen, wo virale Proteine akkumulierten und CD150 aktinabhängig rekrutiert wurde, und seltener über aktinreiche Filopodien. Die HIV-VS Markerproteine ICAM-1, aktiviertes LFA-1, CD81, DC-SIGN und der phosphorylierte Ezrin / Radixin / Moesin (ERM)-Proteinkomplex polarisierten zur MV-VS. Moesin und der Substanz P Rezeptor (SPR), die Prozesse des MV-Eintritts oder der Aufnahme unterstützen, akkumulierten ebenfalls in den Transmissionsstrukturen. Zusammengefasst zeigte diese Arbeit, dass die gebildete Plattform für MV-Transmission (MV-VS) wichtige Gemeinsamkeiten mit der HIV-VS teilt. In der MV-VS akkumulierten Proteine, die Aktindynamiken regulieren, die die Konjugatstabilität verstärken und die die Membranfusion unterstützen, die einen effizienten Eintritt des MV in T-Zellen ermöglichen. N2 - Dendritic cells (DCs) are antigen-presenting cells (APCs) that recognise pathogens and upon maturation induce specific adaptive immunity. Measles virus (MV) infects human immature DCs in a CD150- and DC-SIGN-dependent manner. Infected DCs possibly mediate MV transport from the respiratory tract to secondary lymphatics where induction of MV-specific immunity, generalized immunosuppression and MV transmission to T lymphocytes occurs, which is essential for viral dissemination. MV infection of DCs was accompanied by DC maturation and moderate upregulation of CD150 surface display. The accumulation of viral proteins and the release of infectious parti-cles were restricted in DCs as compared to the MV producing B cell line B95a. This work compared subcellular distribution of viral proteins in DCs in B95a cells. The association of the matrix (M) protein with components of the ribonucleoprotein (RNP) complex was more prominent in DCs. The distinctive redistribution of CD81 to P protein compartments as well as the inhibition of spatial tetraspanin interaction was confined to B95a cells. A virus contain-ing compartment (VCC) as described for HIV-1 earlier was neither detectable for MV in DCs nor in B95a cells. To monitor intracellular trafficking of de novo synthesised M protein in infected DCs, a tetra-cysteine (TC)-tag was fused to the c-terminus of the M protein. The M-TC fusion protein did not differ from the unmodified protein with regard to all biological properties examined such as intracellular distribution, DRM association and formation and release of virus like particles (VPLs). In the context of virus infection, the tag strongly interfered with virus replication and/or release. Because MV production is restricted in DCs, these require an organized structure for virus transmission to T cells. MV transmission to autologous T cells mainly relied on the DC infec-tion (referred to as cis-infection) while MV trapping by DC-SIGN and subsequent transmis-sion (referred to as trans-infection) played a minor role. Transmission essentially involved interaction between the viral glycoprotein H with its receptor CD150. In addition to rare asso-ciation with actin rich filopodial structures, viral proteins accumulated at DC/T cell contact interfaces consistent with that of the virological synapse (VS) to which also CD150 was re-cruited in an actin dependent manner. The HIV VS marker proteins ICAM-1, activated LFA-1, CD81, DC-SIGN and phosphorylated ezrin / radixin / moesin (ERM) protein complex also redistributed towards the MV VS. Moesin and substance P receptor which were implicated in assisting in MV entry earlier, also accumulated in the transmission structure. Taking together, this work showed that the forming platforms for MV transmission (MV VS) shares similarities with the HIV VS where proteins accumulate that may regulate actin dynamics, enhance conjugate stability and facilitate membrane fusion as required for efficient entry of MV into target T cells. KW - Masernvirus KW - Dendritische Zelle KW - Transmission KW - Masernvirus-Infektion KW - Virologische Synapse KW - Virus-Transmission KW - measles virus infection KW - dendritic cells KW - virological synapse KW - virus transmission Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73108 ER - TY - THES A1 - Schwab, Steffen T1 - Die Rolle regulatorischer T-Zellen bei der Masernviruspathogenese T1 - The role of regulatory T-cells in measles virus pathogenesis N2 - Tregs dienen zur Aufrechterhaltung der Balance im Immunsystem. Die Infektion, Aktivierung oder Induktion von Tregs durch Pathogene kann diese Balance empfindlich stören, eine Immunsuppression zur Folge haben und zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen oder Persistenzen beitragen. Das MV verfügt nicht nur über vielfältige Mechanismen der Immunsuppression, während einer MV-Infektion herrschen zudem Bedingungen vor, welche die Zahl und Aktivität von Tregs beeinflussen könnten. Aufgrund der Expression von Reifungsmarkern auf Trn ist zudem eine präferenzielle Infektion dieser Zellpopulation denkbar. MV-Infektionen können sowohl die akute MV-Enzephalitis, eine Autoimmunerkrankung, nach sich ziehen, als auch die Persistenz SSPE ausbilden. Ob diese Komplikationen mit spezifischen Aberrationen in der Menge und Aktivität von Tregs im Zusammenhang stehen, war bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auf unstimulierten Trn der Reifungsmarker und MV-Rezeptor CD150 exprimiert wird und es in Folge dessen in vitro zu einer präferentiellen nicht produktiven Infektion und Depletion von Trn kommt. Ex vivo ließ sich ein deutlicher Depletionseffekt während der frühen akuten MV-Enzephalitis nachweisen, der nach Vaczinierung eines gesunden Probanden und Challenge eines immunisierten Affen nicht auftrat. Ob dieser Depletionseffekt ursächlich für die Enzephalitis ist, oder es sich um einen Begleiteffekt handelt ließe sich an Modellorganismen durch mitogene Manipulation der Trn während einer MV-Infektion untersuchen. Auch bei SSPE kann es zu einer Depletion von Trn kommen, dies scheint jedoch nicht mit der Progression dieser Erkrankung im Zusammenhang zu stehen. Wahrscheinlich ist dagegen ein Zusammenhang mit der Induktion von Tregs. In MV-stimulierten Proben von SSPE-Patienten wurde im Mittel signifikant mehr IL-10 exprimiert als in den Kontrollen. In Proben seropositiver gesunder Spender wurde IL-10 in den ersten Stunden nach MV-Stimulation fast ausschließlich von induzierten Tregs exprimiert. Weitere Versuche sind nötig, um die Evidenz zu steigern und zu ermitteln, ob auch in Patientenproben die frühe IL-10 Expression nach MV-Stimulation von induzierten Tregs dominiert wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es sowohl bei der MV-Enzephalitis als auch bei SSPE zu signifikanten Wechselwirkungen mit Tregs kommt. Ob sich eine MV-Enzephalitis auch ohne Depletion von Trn ausbilden kann und ob die Ausbildung von SSPE erhöhte IL-10 Expression voraussetzt, werden weitere Untersuchungen ergründen müssen. N2 - Treg are supposed to keep the balance throughout the immune system. Infection, activation and induction of Treg by pathogens can interrupt with this balance. Immunosuppression autoimmunity and viral persistence can result from this interference. MV does not only cause immunosuppression during infection by multifaceted mechanisms, but also effects circumstances known to interfere with the frequency and activity of Treg. Due to the expression of maturity markers on the surface of Trn a preferential infection of this cell population by MV seems possible. MV-infection can involve both, acute MV-encephalitis, an autoimmune disease, and the virus persistence SSPE. It was not investigated until now, if thous complications are associated to specific aberrations in the frequency and activity of Treg. In this paper it was demonstrated that CD150, which is both a maturity marker and a MV-receptor, is expressed on unstimulated Trn. Due to this expression the Trn are infected preferentially and non productively in vitro leading to apoptosis. Ex vivo a noticeable depletion effect was detected during the early acute MV-encephalitis. This effect did not accure after vaccination of a healthy proband, and the challenge of an immunised monkey. Mitogenic manipulation of Trn in model organisms during MV-infection could give advice, if this depletion effect is causal to MV-Encephalitis or rather a concomitant effect. Depletion of Trn can also arise in the presence of SSPE, but this seems not to interfere with the progression of disease. By contrast there is presumable an interrelation of SSPE with the induction of Tregs. In MV-stimulated probes from SSPE-patients the median IL-10 expression was significantly higher than in controls. Probes from seropositive healthy donators were used to identify the IL-10 expressing cells. During the first hours after MV-stimulation IL-10 was mainly expressed by induced Treg. Subsequent investigations are necessary to enhance the evidence and to determine if induced Treg also dominate the early IL-10 expression after MV-stimulation in patient probes. To give a resume you could claim that there are significant interrelations between MV-encephalitis respectively SSPE and Treg. If a depletion of Trn is necessary for the development of MV-encephalitis and if increased levels of IL-10 expression are required for the formation of SSPE has to be examined in further experiments. KW - Masern KW - T-Lymphozyt KW - Pathogenese KW - Immunsuppression KW - Inhibition KW - Encephalitis KW - Interleukin 2 KW - Interleukin 10 KW - Antigen CD25 KW - Persistenz KW - FoxP3 KW - induzierte regulatorische T-Zellen KW - natürliche regulatorische T-Zellen KW - SSPE KW - FoxP3 KW - SSPE KW - regulatory T-cells KW - immunsuppression KW - encephalitis Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72979 ER -