TY  - JOUR
A1  - Albrecht, Marco
A1  - Sharma, Cynthia M.
A1  - Reinhardt, Richard
A1  - Vogel, Joerg
A1  - Rudel, Thomas
T1  - Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome
N2  - Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogenic bacterium that has been refractory to genetic manipulations. Although the genomes of several strains have been sequenced, very little information is available on the gene structure of these bacteria. We used deep sequencing to define the transcriptome of purified elementary bodies (EB) and reticulate bodies (RB) of C. trachomatis L2b, respectively. Using an RNAseq approach, we have mapped 363 transcriptional start sites (TSS) of annotated genes. Semiquantitative analysis of mapped cDNA reads revealed differences in the RNA levels of 84 genes isolated from EB and RB, respectively. We have identified and in part confirmed 42 genome- and 1 plasmid-derived novel non-coding RNAs. The genome encoded non-coding RNA, ctrR0332 was one of the most abundantly and differentially expressed RNA in EB and RB, implying an important role in the developmental cycle of C. trachomatis. The detailed map of TSS in a thus far unprecedented resolution as a complement to the genome sequence will help to understand the organization, control and function of genes of this important pathogen.
KW  - Biologie
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68389
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Koetschan, Christian
A1  - Foerster, Frank
A1  - Keller, Alexander
A1  - Schleicher, Tina
A1  - Ruderisch, Benjamin
A1  - Schwarz, Roland
A1  - Mueller, Tobias
A1  - Wolf, Matthias
A1  - Schultz, Joerg
T1  - The ITS2 Database III-sequences and structures for phylogeny
N2  - The internal transcribed spacer 2 (ITS2) is a widely used phylogenetic marker. In the past, it has mainly been used for species level classifications. Nowadays, a wider applicability becomes apparent. Here, the conserved structure of the RNA molecule plays a vital role. We have developed the ITS2 Database (http://its2.bioapps .biozentrum.uni-wuerzburg.de) which holds information about sequence, structure and taxonomic classification of all ITS2 in GenBank. In the new version, we use Hidden Markov models (HMMs) for the identification and delineation of the ITS2 resulting in a major redesign of the annotation pipeline. This allowed the identification of more than 160 000 correct full ength and more than 50 000 partial structures. In the web interface, these can now be searched with a modified BLAST considering both sequence and structure, enabling rapid taxon sampling. Novel sequences can be annotated using the HMM based approach and modelled according to multiple template structures. Sequences can be searched for known and newly identified motifs. Together, the database and the web server build an exhaustive resource for ITS2 based phylogenetic analyses.
KW  - Biologie
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68390
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Meierjohann, Svenja
A1  - Hufnagel, Anita
A1  - Wende, Elisabeth
A1  - Kleinschmidt, Markus A.
A1  - Wolf, Katarina
A1  - Friedl, Peter
A1  - Gaubatz, Stefan
A1  - Schartl, Manfred
T1  - MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation
N2  - Background: Melanoma cells are usually characterized by a strong proliferative potential and efficient invasive migration. Among the multiple molecular changes that are recorded during progression of this disease, aberrant activation of receptor tyrosine kinases (RTK) is often observed. Activation of matrix metalloproteases goes along with RTK activation and usually enhances RTK-driven migration. The purpose of this study was to examine RTKdriven three-dimensional migration of melanocytes and the pro-tumorigenic role of matrix metalloproteases for melanocytes and melanoma cells. Results: Using experimental melanocyte dedifferentiation as a model for early melanomagenesis we show that an activated EGF receptor variant potentiates migration through three-dimensional fibrillar collagen. EGFR stimulation also resulted in a strong induction of matrix metalloproteases in a MAPK-dependent manner. However, neither MAPK nor MMP activity were required for migration, as the cells migrated in an entirely amoeboid mode. Instead, MMPs fulfilled a function in cell cycle regulation, as their inhibition resulted in strong growth inhibition of melanocytes. The same effect was observed in the human melanoma cell line A375 after stimulation with FCS. Using sh- and siRNA techniques, we could show that MMP13 is the protease responsible for this effect. Along with decreased proliferation, knockdown of MMP13 strongly enhanced pigmentation of melanocytes. Conclusions: Our data show for the first time that growth stimuli are mediated via MMP13 in melanocytes and melanoma, suggesting an autocrine MMP13-driven loop. Given that MMP13-specific inhibitors are already developed, these results support the evaluation of these inhibitors in the treatment of melanoma.
KW  - Medizin
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68335
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Bollazzi, Martin
A1  - Roces, Flavio
T1  - The thermoregulatory function of thatched nests in the South American grass-cutting ant, Acromyrmex heyeri
N2  - The construction of mound-shaped nests by ants is considered as a behavioral adaptation to low environmental temperatures, i.e., colonies achieve higher and more stables temperatures than those of the environment. Besides the well-known nests of boreal Formica wood-ants, several species of South American leaf-cutting ants of the genus Acromyrmex construct thatched nests. Acromyrmex workers import plant fragments as building material, and arrange them so as to form a thatch covering a central chamber, where the fungus garden is located. Thus, the degree of thermoregulation attained by the fungus garden inside the thatched nest largely depends on how the thatch affects the thermal relations between the fungus and the environment. This work was aimed at studying the thermoregulatory function of the thatched nests built by the grass-cutting ant Acromyrmex heyeri Forel (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae). Nest and environmental temperatures were measured as a function of solar radiation on the long-term. The thermal diffusivity of the nest thatch was measured and compared to that of the surrounding soil, in order to assess the influence of the building material on the nest’s thermoregulatory ability. The results showed that the average core temperature of thatched nests was higher than that of the environment, but remained below values harmful for the fungus. This thermoregulation was brought about by the low thermal diffusivity of the nest thatch built by workers with plant fragments, instead of the readily-available soil particles that have a higher thermal diffusivity. The thatch prevented diurnal nest overheating by the incoming solar radiation, and avoided losses of the accumulated daily heat into the cold air during the night. The adaptive value of thatching behavior in Acromyrmex leaf-cutting ants occurring in the southernmost distribution range is discussed.
KW  - Acromyrmex heyeri
KW  - building behaviour
KW  - thermal biology
KW  - nest material
KW  - heat transfer
KW  - leaf-cutting ants
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68225
ER  - 
TY  - THES
A1  - Förster, Frank
T1  - Making the most of phylogeny: Unique adaptations in tardigrades and 216374 internal transcribed spacer 2 structures
T1  - Einzigartige Anpassungen in Tardigraden und 216374 "internal transcribed spacer 2" Strukturen
N2  - The phylum Tardigrada consists of about 1000 described species to date. The animals live in habitats within marine, freshwater and terrestrial ecosystems allover the world. Tardigrades are polyextremophiles. They are capable to resist extreme temperature, pressure or radiation. In the event of desiccation, tardigrades enter a so-called tun stage. The reason for their great tolerance capabilities against extreme environmental conditions is not discovered yet. Our Funcrypta project aims at finding answers to the question what mechanisms underlie these adaption capabilities particularly with regard to the species Milnesium tardigradum. The first part of this thesis describes the establishment of expressed sequence tags (ESTs) libraries for different stages of M. tardigradum. From proteomics data we bioinformatically identified 144 proteins with a known function and additionally 36 proteins which seemed to be specific for M. tardigradum. The generation of a comprehensive web-based database allows us to merge the proteome and transcriptome data. Therefore we created an annotation pipeline for the functional annotation of the protein and nucleotide sequences. Additionally, we clustered the obtained proteome dataset and identified some tardigrade-specific proteins (TSPs) which did not show homology to known proteins. Moreover, we examined the heat shock proteins of M. tardigradum and their different expression levels depending on the actual state of the animals. In further bioinformatical analyses of the whole data set, we discovered promising proteins and pathways which are described to be correlated with the stress tolerance, e.g. late embryogenesis abundant (LEA) proteins. Besides, we compared the tardigrades with nematodes, rotifers, yeast and man to identify shared and tardigrade specific stress pathways. An analysis of the 50 and 30 untranslated regions (UTRs) demonstrates a strong usage of stabilising motifs like the 15-lipoxygenase differentiation control element (15-LOX-DICE) but also reveals a lack of other common UTR motifs normally used, e.g. AU rich elements. The second part of this thesis focuses on the relatedness between several cryptic species within the tardigrade genus Paramacrobiotus. Therefore for the first time, we used the sequence-structure information of the internal transcribed spacer 2 (ITS2) as a phylogenetic marker in tardigrades. This allowed the description of three new species which were indistinguishable using morphological characters or common molecular markers like the 18S ribosomal ribonucleic acid (rRNA) or the Cytochrome c oxidase subunit I (COI). In a large in silico simulation study we also succeeded to show the benefit for the phylogenetic tree reconstruction by adding structure information to the ITS2 sequence. Next to the genus Paramacrobiotus we used the ITS2 to corroborate a monophyletic DO-group (Sphaeropleales) within the Chlorophyceae. Additionally we redesigned another comprehensive database—the ITS2 database resulting in a doubled number of sequence-structure pairs of the ITS2. In conclusion, this thesis shows the first insights (6 first author publications and 4 coauthor publications) into the reasons for the enormous adaption capabilities of tardigrades and offers a solution to the debate on the phylogenetic relatedness within the tardigrade genus Paramacrobiotus.
N2  - Der Tierstamm Tardigrada besteht aus derzeitig etwa 1000 beschriebenen Arten. Die Tiere leben in Habitaten in marinen, limnischen und terrestrischen Ökosystemen auf der ganzen Welt. Tardigraden sind polyextremophil. Sie können extremer Temperatur, Druck oder Strahlung widerstehen. Beim Austrocknen bilden sie ein so genanntes Tönnchenstadium. Der Grund für die hohe Toleranz gegenüber extremen Umweltbedingungen ist bis jetzt nicht aufgeklärt worden. Unser Funcrypta Projekt versucht Antworten darauf zu finden, was die hinter dieser Anpassungsfähigkeit liegenden Mechanismen sind. Dabei steht die Art Milnesium tardigradum im Mittelpunkt. Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Etablierung einer expressed sequence tags (ESTs) Bibliothek für verschiedene Stadien von M. tardigradum. Aus unseren Proteomansatz konnten wir bislang 144 Proteine bioinformatisch identifizieren, denen eine Funktion zugeordnet werden konnte. Darüber hinaus wurden 36 Proteine gefunden, welche spezifisch für M. tardigradum zu sein scheinen. Die Erstellung einer umfassenden internetbasierenden Datenbank erlaubt uns die Verknüpfung der Proteom und Transkriptomdaten. Dafür wurde eine Annotations-Pipeline erstellt um den Sequenzen Funktionen zuordnen zu können. Außerdem wurden die erhaltenen Proteindaten von uns geclustert. Dabei konnten wir einige Tardigraden-spezifische Proteine (tardigrade-specific protein, TSP) identifizieren die keinerlei Homologie zu bekannten Proteinen zeigen. Außerdem untersuchten wir die Hitze-Schock-Proteine von M. tardigradum und deren differenzielle Expression in Abhängigkeit vom Stadium der Tiere. In weiteren bioinformatischen Analysen konnten wir viel versprechende Proteine und Stoffwechselwege entdecken für die beschrieben ist, dass sie mit Stressreaktionen in Verbindung stehen, beispielsweise late embryogenesis abundant (LEA) Proteine. Des Weiteren verglichen wir Tardigraden mit Nematoden, Rotatorien, Hefe und dem Menschen, um gemeinsame und Tardigraden-spezifische Stoffwechselwege identifizieren zu können. Analysen der 50 und 30 untranslatierten Bereiche zeigen eine verstärkte Nutzung von stabilisierenden Motiven, wie dem 15-lipoxygenase differentiation control element (LEA). Im Gegensatz dazu werden häufig benutzte Motive, wie beispielsweise AU-reiche Bereiche, gar nicht gefunden. Der zweite Teil der Doktorarbeit beschäftigt sich mit den Verwandtschaftsverhältnissen einiger kryptischer Arten in der Tardigradengattung Paramacrobiotus. Hierfür haben wir, zum ersten Mal in Tardigraden, die Sequenz-Struktur-Informationen der internal transcribed spacer 2 Region als phylogenetischen Marker verwendet. Dies erlaubte uns die Beschreibung von drei neuen Arten, welche mit klassischen morphologischen Merkmalen oder anderen molekularen Markern wie 18S ribosomaler RNA oder Cytochrome c oxidase subunit I (COI) nicht unterschieden werden konnten. In einer umfangreichen in silico Simulationsstudie zeigten wir den Vorteil der bei der Rekonstruktion phylogenetischer Bäume unter der Hinzunahme der Strukturinformationen zur Sequenz der ITS2 entsteht. ITS2 Sequenz-Struktur-Informationen wurden außerdem auch dazu benutzt, eine monophyletische DO-Gruppe (Sphaeropleales) in den Chlorophyceae zu bestätigen. Zusätzlich haben wir eine umfassende Datenbank, die ITS2-Datenbank, überarbeitet. Dadurch konnten die Sequenz-Struktur-Informationen verdoppelt werden, die in dieser Datenbank verfügbar sind. Die vorliegende Doktorarbeit zeigt erste Einblicke (6 Erstautor- und 4 Koautor-Publikationen) in die Ursachen für die hervorragende Anpassungsfähigkeit der Tardigraden und beschreibt die erfolgreiche Aufklärung der Verwandtschaftsverhältnisse in der Tardigradengattung Paramacrobiotus.
KW  - Phylogenie
KW  - Bioinformatik
KW  - Würzburg / Universität / Lehrstuhl für Bioinformatik
KW  - Anpassung
KW  - Datenbank
KW  - ITS2
KW  - Marker
KW  - Tardigraden
KW  - Bärtierchen
KW  - ITS2
KW  - Marker
KW  - Tardigrades
KW  - Waterbear
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51466
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Shityakov, Sergey
A1  - Dandekar, Thomas
T1  - Lead expansion and virtual screening of Indinavir derivate HIV-1 protease inhibitors using pharmacophoric - shape similarity scoring function
N2  - Indinavir (Crivaxan®) is a potent inhibitor of the HIV (human immunodeficiency virus) protease. This enzyme has an important role in viral replication and is considered to be very attractive target for new antiretroviral drugs. However, it becomes less effective due to highly resistant new viral strains of HIV, which have multiple mutations in their proteases. For this reason, we used a lead expansion method to create a new set of compounds with a new mode of action to protease binding site. 1300 compounds chemically diverse from the initial hit were generated and screened to determine their ability to interact with protease and establish their QSAR properties. Further computational analyses revealed one unique compound with different protease binding ability from the initial hit and its role for possible new class of protease inhibitors is discussed in this report.
KW  - Proteasen
KW  - protease; Indinavir; lead expansion; docking; pharmacophore
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67824
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Keller, Alexander
A1  - Foerster, Frank
A1  - Mueller, Tobias
A1  - Dandekar, Thomas
A1  - Schultz, Joerg
A1  - Wolf, Matthias
T1  - Including RNA secondary structures improves accuracy and robustness in reconstruction of phylogenetic trees
N2  - Background: In several studies, secondary structures of ribosomal genes have been used to improve the quality of phylogenetic reconstructions. An extensive evaluation of the benefits of secondary structure, however, is lacking. Results: This is the first study to counter this deficiency. We inspected the accuracy and robustness of phylogenetics with individual secondary structures by simulation experiments for artificial tree topologies with up to 18 taxa and for divergency levels in the range of typical phylogenetic studies. We chose the internal transcribed spacer 2 of the ribosomal cistron as an exemplary marker region. Simulation integrated the coevolution process of sequences with secondary structures. Additionally, the phylogenetic power of marker size duplication was investigated and compared with sequence and sequence-structure reconstruction methods. The results clearly show that accuracy and robustness of Neighbor Joining trees are largely improved by structural information in contrast to sequence only data, whereas a doubled marker size only accounts for robustness. Conclusions: Individual secondary structures of ribosomal RNA sequences provide a valuable gain of information content that is useful for phylogenetics. Thus, the usage of ITS2 sequence together with secondary structure for taxonomic inferences is recommended. Other reconstruction methods as maximum likelihood, bayesian inference or maximum parsimony may equally profit from secondary structure inclusion. Reviewers: This article was reviewed by Shamil Sunyaev, Andrea Tanzer (nominated by Frank Eisenhaber) and Eugene V. Koonin. Open peer review: Reviewed by Shamil Sunyaev, Andrea Tanzer (nominated by Frank Eisenhaber) and Eugene V. Koonin. For the full reviews, please go to the Reviewers’ comments section.
KW  - Phylogenie
KW  - phylogenetics
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67832
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heinecke, Kai
T1  - Die Dynamik der primären Erkennungsschritte von BMP-Rezeptoren
T1  - Dynamics of the primary recognition steps of BMP receptors
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden zusammen mit den Activinen, Growth and Differentiation Factors (GDFs) und Transforming Growth Factor β (TGF-β) die Transforming Growth Factor β-Superfamilie von sekretierten Signalproteinen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Erhaltung und Regeneration von Geweben und Organen. Die Signalvermittlung dieser Proteine erfolgt durch die Bindung von zwei verschiedenen Typen von Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren, die als Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren bezeichnet werden. Im ersten Schritt erfolgt die Bindung an den hochaffinen Rezeptor (im Fall von BMP-2 der Typ-I-Rezeptor), im nächsten Schritt wird der niederaffine Rezeptor in den Komplex rekrutiert. Bis heute sind lediglich sieben Typ-I- und fünf Typ-II-Rezeptoren bekannt, was auf eine Promiskuität in der Liganden-Rezeptor-Interaktion schließen lässt. Die Architektur beider Rezeptorsubtypen ist dabei relativ ähnlich. Beide bestehen aus einer ligandenbindenden extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne sowie einer intrazellulären Kinasedomäne. Eine nacheinander ablaufende Transphosphorylierung der intrazellulären Domänen führt zu einer Phosphorylierung von SMAD-Proteinen, die dann als nachgeschaltete Vermittler fungieren und die Transkription regulierter Gene auslösen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die initialen Schritte der Rezeptorkomplexformierung sowie die Mobilität der Rezeptoren mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass für die Bildung eines Signalkomplexes eine bestimmte Schwellenkonzentration des Liganden nötig ist und dass der Mechanismus nach einem Alles-oder-Nichts-Prinzip wie ein Schalter funktioniert. Außerdem konnten Unterschiede in der Nutzung der gleichen Rezeptoren durch verschiedene Liganden festgestellt werden. Die anderen Teile der Arbeit befassen sich mit der Funktionalität der verschiedenen Rezeptordomänen in der Signalübermittlung, der Analyse von hoch- und niederaffinen Ligandenbindestellen auf ganzen Zellen sowie dem Einfluss des SMAD- und des MAPK-Signalwegs auf die Induktion der Alkalischen Phosphatase. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Art der SMAD-Phosphorylierung allein vom Typ der Kinasedomäne abhängig ist, dass auf einer Zelle verschiedene Rezeptorpopulationen existieren, welche von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen angesprochen werden, und dass die Induktion der Alkalischen Phosphatase stark vom zeitlichen Verlauf der SMAD- und MAPK-Aktivierung abhängig ist.
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), together with Activins, Growth and Differentiation Factors (GDFs) and Transforming Growth Factor β (TGFβ), are secreted signalling proteins that belong to the Transforming Growth Factor β superfamily. They play an important role in regulating the development, maintenance and regeneration of tissues and organs. Signalling of TGFβ superfamily members occurs by binding to two types of serine-/threonine kinase receptors termed type I and type II. First, the high affinity receptor (in case of BMP2 the type I receptor) is bound, and then the low affinity receptor is recruited into the signalling complex. The fact that there are only seven type-I and five type-II receptors are known implies a limited promiscuity in ligand-receptor interaction. The architecture of both receptor subtypes is quite similar, with a small extracellular ligand-binding domain, a single transmembrane domain and an intracellular kinase domain. Subsequent transphosphorylation of the intracellular receptor domains leads to phosphorylation of SMAD proteins, which then act as downstream mediators and activate gene transcription. The main part of this work was to analyze the initial steps in receptor complex formation and the mobility of TGFβ-superfamily receptors with fluorescence microscopy techniques. It could be shown that complex formation requires a certain ligand threshold concentration and shows an all-or-nothing switch-like behaviour. Furthermore, differences between different ligands using the same receptors could be visualized. The other parts of this work deal with the functionality of the different receptor domains in signal transduction, the analysis of high- and low-affinity binding sites on whole cells and the influence of the SMAD- and MAPK-pathways on alkaline phosphatase induction. It could be shown that the type of SMAD phosphorylation ist solely dependent on the type of the kinase domain, that there exist different receptor populations on a cell that are addressed by different ligand concentrations and that alkaline phosphatase induction is highly dependent on the time course of SMAD- and MAPK-pathway activation.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Wirkstoff-Rezeptor-Bindung
KW  - Signaltransduktion
KW  - Signalkomplex
KW  - Rezeptormobilität
KW  - Rezeptor-Liganden-Interaktion
KW  - Physiologische Chemie
KW  - Molekulare Biophysik
KW  - Molekularbiologie
KW  - Signaling complex
KW  - receptor mobility
KW  - receptor-ligand-interaction
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49257
ER  - 
TY  - THES
A1  - Götz, Andreas
T1  - Replikation von enteroinvasiven Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium Stämmen in Epithelzellen unter besonderer Betrachtung des Kohlenstoffmetabolismus
T1  - Replication of enteroinvasive Escherichia coli and Salmonella enterica Serovar Typhimurium strains in epithelial cells with particular examination of the carbon metabolism
N2  - Schlagwörter: Salmonella , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium , Salmonellose , Escherichia coli , Shigella , Infektion , Bakterielle Infektion , Zellkultur , HeLa-Zelle , Apoptosis , Metabolismus , Stoffwechsel , Glucose , Glucosetransport , Glucosestoffwechsel , Katabolismus , Kohlenstoff , Kohlenstoffbedarf , Kohlenstoffhaushalt , Kohlenstoffstoffwechsel , Kohlenstoff-13 , Kohlenstoffisotop Salmonella Typhimurium und enteroinvasive E. coli (EIEC) sind fakultativ intrazelluläre Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Während erstere sich nach der Internalisierung durch eukaryotische Zellen normalerweise in einem spezialisierten Phagosom, der Salmonella-enthaltenden Vakuole (SCV), vermehren, replizieren EIEC im Zytoplasma der Wirtszellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst durch Mikroinjektion die Fähigkeit von S. Typhimurium 14028s untersucht, ebenfalls im Zytoplasma von Caco-2-Zellen replizieren zu können. Dabei wurde festgestellt, daß ein früher als S. Typhimurium 14028s WT bezeichneter Stamm eine Insertion eines Desoxythymidins an Position 76 des offenen Leserasters von rfbP trägt, einem Gen, dessen Protein an der LPS-Synthese beteiligt ist. Weiterhin synthetisierte dieser Stamm ein rauhes LPS. Aufgrund von Agglutination konnte der Rauh-Stamm nur mit geringem Erfolg mikroinjiziert werden. Hingegen lag 5 h nach der Mikroinjektion einer nicht invasiven Mutante von Salmonella mit vollständigem LPS der Anteil an Caco-2-Zellen, die mehr als 32 Bakterien enthielten, bei etwa 30 %. Der Anteil war 2-3 mal höher als bei früheren Mikroinjektionen in HeLa-Zellen. Daher wurde das Verhalten von HeLa-Zellen nach einer Infektion durch S. Typhimurium ΔsifA - einer Mutante, die aus der SCV ins Zytoplasma entkommt - untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die sifA-Mutante 10 h nach der Infektion die Aktivität der Caspasen 9 und 3 in HeLa-Zellen, aber nicht in Caco-2-Zellen induziert. In weiteren Versuchen wurde die Bedeutung von Glukose, Glukose-6-phosphat und Mannose als Kohlenstoffquellen für die extra- und intrazelluläre Replikation zweier Isolate enteroinvasiver E. coli und eines S. Typhimurium Stammes analysiert. Zu diesem Zweck wurden zunächst definierte Mutanten in den beiden wichtigsten Phosphoenolpyruvat-abhängigen Phosphotransferasesystemen (PTS) für die Aufnahme von Glukose und Mannose, ptsG und manXYZ, sowie im Antiporter für die Aufnahme von Glukose-6-phosphat, uhpT, konstruiert. Bei Wachstum im Minimalmedium mit Glukose als einziger C-Quelle waren die Generationszeiten aller ΔptsG- und ΔptsG, manXYZ-Mutanten im Vergleich zu den Wildstämmen deutlich verlängert. Ebenso wuchsen ΔmanXYZ-Mutanten bzw. ΔuhpT-Mutanten deutlich langsamer auf Mannose bzw. Glukose-6-phosphat. Jedoch ergaben sich hierbei Stamm-spezifische Unterschiede. So erreichte EIEC 4608-58 ΔuhpT in der stationären Phase eine ähnliche Zelldichte wie der Wildstamm in Gegenwart von Glukose-6-phosphat und eine ΔptsG, manXYZ-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnte immer noch effizient mit Glukose wachsen. Infektionsversuche mit Caco-2-Zellen zeigten weiterhin, daß die Deletion von ptsG zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasivität von EIEC 4608-58 führt, während sich die intrazellulären Generationszeiten aller hier untersuchten Mutanten kaum veränderten. Selbst die ΔptsG, manXYZ, uhpT-Dreifachmutanten der drei hier verwendeten Enterobakterien und die ΔptsG, manXYZ, glk-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnten immer noch in Caco-2-Zellen replizieren, wenn auch mit Stamm-spezifisch verringerten Geschwindigkeiten. 13C-Markierungsexperimente mit [U-13C6]-Glukose als Substrat ergaben jedoch, daß in der Tat alle hier untersuchten enterobakteriellen Wildstämme Glukose während der Replikation in Caco-2-Zellen unter Zellkulturbedingungen verwerten. Glukose-6-phosphat, Glukonat oder Fettsäuren konnten dagegen als wichtigste Kohlenstoffquellen für das intrazelluläre Wachstum ausgeschlossen werden. EIEC 4608-58 metabolisierte Glukose jedoch weniger effizient als EIEC HN280 und schien zudem noch zusätzlich C3-Substrate aus der Wirtszelle aufzunehmen. Das Markierungsmuster zeigte einen Stamm-spezifischen Kohlenstofffluß durch Glykolyse und/oder Entner-Doudoroff-Weg, Pentosephosphatzyklus, Citratzyklus und den anaplerotischen Reaktionen zwischen PEP und Oxalacetat. Mutanten mit Deletionen in ptsG und manXYZ konnten auf alternative C3-Substrate wechseln und glichen dies durch eine erhöhte Aufnahme von Aminosäuren aus den Wirtszellen aus.
N2  - Salmonella Typhimurium and enteroinvasive E. coli (EIEC) are facultative intracellular bacteria belonging to the family of Enterobacteriaceae. After internalisation by eukaryotic cells Salmonella normally resides inside a specialised phagosome called Salmonella-containing vacuole (SCV) whereas EIEC replicates inside the cytosol of host cells. In this study the ability of S. Typhimurium 14028s to replicate inside the cytosol of Caco-2 host cells was investigated by microinjection. It was thereby observed that a formerly used strain also called S. Typhimurium 14028s WT harboured an insertion of one deoxythymidin at position 76 of the rfbP open reading frame, a gene whose protein is involved in the LPS biosynthesis. Furthermore this strain expressed a rough LPS. Due to agglutination the microinjection procedure of the rough strain had only little success. But the percentage of Caco-2 cells that harboured more than 32 bacteria was about 30 % 5 h after injection of a non invasive mutant of Salmonella expressing full-length LPS chains. This was 2-3 times higher than the results observed before using HeLa cells. Therefore, the behaviour of HeLa cells infected by S. Typhimurium ΔsifA - a mutant that escapes from the SCV into the cytosol - was studied. The results showed that the sifA mutant strain induced the activity of caspases 9 and 3 in HeLa cells 10 h after infection but not in Caco-2 cells. In further experiments the contribution of glucose, glucose 6-phosphate and mannose as carbon sources for extra- and intracellular growth of two enteroinvasive E. coli isolates and one S. Typhimurium strain was analysed. Therefore, defined mutants of the most important phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase systems (PTS) taking up glucose or mannose, i.e. ptsG and manXYZ, were constructed as well as mutants carrying a deletion of uhpT the antiporter for uptake of glucose 6-phosphate. During growth of the resulting ΔptsG and ΔptsG, manXYZ mutants in minimal medium with glucose as sole carbon source considerably longer generation times were observed. Likewise, ΔmanXYZ mutants and ΔuhpT mutants grew significantly slower on mannose or glucose 6-phosphate, respectively. But there were also strain specific differences. EIEC 4608-58 ΔuhpT reached a similar cell density as the wild-type strain during stationary phase when grown in the presence of glucose 6-phosphate and S. Typhimurium ΔptsG, manXYZ could still grow efficiently on glucose. Infections of Caco-2 cells showed that the deletion of ptsG increased the ability of EIEC 4608-58 significantly to adhere and invade these cells. But the intracellular generation times of all mutants under study were hardly changed. Even the triple mutants ΔptsG, manXYZ, uhpT of all three enterobacterial strains and the ΔptsG, manXYZ, glk mutant of S. Typhimurium 14028s were still able to replicate in Caco-2 cells, albeit at strain specific lower rates. 13C-Isotopologue profiling using [U-13C6]glucose as precursor revealed that in deed all analysed enterobacterial wild-type strains utilised glucose for their replication in Caco-2 cells under the applied conditions. Glucose 6-phosphate, gluconate and fatty acids could be ruled out as main carbon sources for intracellular growth. EIEC 4608-58 metabolised the applied glucose less efficiently than EIEC HN280 and seemed to take up C3-compounds from the host cells in addition to glucose. The labelling patterns reflected strain specific carbon fluxes via glycolysis and/or Entner-Doudoroff pathway, pentose phosphate pathway, citric acid cycle and the anaplerotic reactions between PEP and oxaloacetate. Mutants carrying deletions in ptsG and manXYZ switched to alternative C3-substrates and counterbalanced this by an increased uptake of amino acids from the host cells.
KW  - Escherichia coli
KW  - Intrazellulärraum
KW  - Salmonella typhimurium
KW  - Vermehrung
KW  - Kohlenstoffstoffwechsel
KW  - Salmonella
KW  - Salmonella enterica
KW  - Salmonella typhimurium
KW  - Salmonellose
KW  - Escherichia coli
KW  - Shigella
KW  - Infektion
KW  - Bakterielle Infektion
KW  - sifA
KW  - enteroinvasive
KW  - CaCo-2 cell
KW  - 13C-isotopologue profiling
KW  - microinjection
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57292
ER  - 
TY  - THES
A1  - Harth, Stefan
T1  - Molecular Recognition in BMP Ligand-Receptor Interactions
T1  - Molekulare Erkennung in BMP Ligand-Rezeptor Interaktionen
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are secreted multifunctional signaling proteins that play an important role during development, maintenance and regeneration of tissues and organs in almost all vertebrates and invertebrates. BMPs transmit their signals by binding to two types of serine-/threonine-kinase receptors. BMPs bind first to their high affinity receptor, thereby recruiting their low affinity receptor into the complex. This receptor assembly starts a Smad (Small mothers against decapentaplegic) protein signaling cascade which regulates the transcription of responsive genes. Up to date, only seven type I and five type II receptors are known for more than 30 ligands. Therefore, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype. Vice versa, receptors can bind to several ligands, indicating a highly promiscuous ligand-receptor interaction. This raises the following questions: (i) How are BMPs able to induce ligand-specific signals, despite forming complexes with identical receptor composition and (ii) how are they able to recognize and bind various binding partners in a highly specific manner. From the ligand’s point of view, heterodimeric BMPs are valuable tools for studying the interplay between different sets of receptors, thereby providing new insights into how the various BMP signals can be generated. This study describes the expression and purification of the heterodimers BMP-2/6 and -2/7 from E.coli cells. BIAcore interaction studies and various in vitro cell activity assays revealed that the generated heterodimers are biologically active. Furthermore, BMP-2/6 and -2/7 exhibit a higher biological activity in most of the cell assays compared to their homodimeric counterparts. In addition, the BMP type I receptor BMPR-IA is involved in heterodimeric BMP signaling. However, the usage of other type I receptor subtypes (e.g. ActR-I) building a heteromeric ligand-receptor type I complex as indicated in previous works could not be determined conclusively. Furthermore, BMP heterodimers seem to require only one type I receptor for signaling. From the receptors’ point of view, the BMP type I receptor BMPR-IA is a prime example for its promiscuous binding to different BMP ligands. The extracellular binding interface of BMPR-IA is mainly unfolded in its unbound form, requiring a large induced fit to adopt the conformation when bound to its ligand BMP-2. In order to unravel whether the binding promiscuity of BMPR-IA is linked to structural plasticity of its binding interface, the interaction of BMPR-IA bound to an antibody Fab fragment was investigated. The Fab fragment was selected because of its ability to recognize the BMP-2 binding epitope on BMPR-IA, thus neutralizing the BMP-2 mediated receptor activation. This study describes the crystal structure of the complex of the extracellular domain of BMPR-IA bound to the antibody Fab fragment AbyD1556. The crystal structure revealed that the contact surface of BMPR-IA overlaps extensively with the contact surface of BMPR-IA for BMP-2 interaction. Although the contact epitopes of BMPR-IA to both binding partners coincide, the three-dimensional structures of BMPR-IA in both complexes differ significantly. In contrast to the structural differences, alanine-scanning mutagenesis of BMPR-IA showed that the functional determinants for binding to both the antibody and BMP-2 are almost identical. Comparing the structures of BMPR-IA bound to BMP-2 or to the Fab AbyD1556 with the structure of unbound BMPR-IA revealed that binding of BMPR-IA to its interaction partners follows a selection fit mechanism, possibly indicating that the ligand promiscuity of BMPR-IA is inherently encoded by structural adaptability.
N2  - „Bone Morphogenetic Proteins” (BMPs) sind sezernierte multifunktionelle Signalproteine, die eine wichtige Rolle während der Entwicklung, Aufrechterhaltung und Regeneration von Geweben und Organen in fast allen Vertebraten und wirbellosen Tieren spielen. Die BMP-Signalgebung wird durch die Bindung an zwei Typen von Serin/Threonin Rezeptorkinasen eingeleitet. Hierbei binden BMPs zuerst an ihren hochaffinen Rezeptor, bevor der niederaffine Rezeptor in den Komplex eingefügt wird. Durch das Zusammenfügen beider Rezeptortypen wird eine von Smad (Small mothers against decapentaplegic)-Proteinen gesteuerte Signalkaskade gestartet, die letztendlich die Transkription responsiver Gene reguliert. Aktuell sind nur sieben Typ I und fünf Typ II Rezeptoren für mehr als 30 Liganden bekannt. Viele BMP-Liganden können demzufolge mehr als einen Rezeptorsubtyp rekrutieren. Umgekehrt jedoch können auch Rezeptoren an unterschiedliche Liganden binden, was auf eine im hohen Maße promiske Ligand-Rezeptor-Interaktion hinweist. Dabei stellen sich folgende Fragen: (i) Wie können BMPs ligandspezifische Signale erzeugen, obwohl sie dafür die gleichen Rezeptoren benutzen? (ii) Und wie können BMPs unterschiedliche Bindungspartner erkennen und trotzdem hochspezifisch an diese binden? Von Blickwinkel der Liganden aus betrachtet stellen heterodimere BMPs wertvolle Hilfsmittel dar, um das Zusammenspiel zwischen den verschiedenen Rezeptortypen zu studieren. Darüber hinaus können sie neue Einblicke in die Entstehung von unterschiedlichen BMP-Signalen gewähren. In dieser Doktorarbeit wird die Expression und Aufreinigung von heterodimeren BMP-2/6 und -2/7 aus E.coli Zellen beschrieben. Mittels BIAcore Interaktionsstudien und in vitro Aktivitätsassays in Säugerzellen konnte gezeigt werden, dass die hergestellten Heterodimere biologisch aktiv sind. Darüber hinaus zeigen BMP-2/6 and -2/7 in den meisten Zellassays eine höhere biologische Aktivität als ihre homodimeren Gegenstücke. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass der BMP Typ I Rezeptor BMPR-IA an der Signalgebung von heterodimeren BMPs involviert ist. Eine Beteiligung weiterer Typ I Rezeptoren (wie z.B. die von ActR-I), die einen heteromeren Ligand-Rezeptor Typ I Signalkomplex bilden, wie es bereits in früheren Studien gezeigt wurde, konnte jedoch experimentell nicht eindeutig belegt werden. Des Weiteren lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass heterodimere BMPs für eine erfolgreiche Signalweiterleitung nur die Präsenz eines einzelnen Typ I Rezeptors benötigen. Von Blickwinkel der Rezeptoren aus betrachtet, ist der BMP Typ I Rezeptor BMPR-IA ein Paradebeispiel für promiskes Bindeverhalten an verschiedene BMP-Liganden. Das extra-zelluläre Kontaktepitop von BMPR-IA ist im Wesentlichen ungefaltet, wenn BMPR-IA in freier ungebundener Form vorliegt. Infolge dessen durchläuft die Binderegion in BMPR-IA weit reichende strukturelle Veränderungen, um die erforderliche Konformation auszubilden, die für die Bindung an BMP-2 essentiell ist. Um herauszufinden, ob das promiske Binde-verhalten von BMPR-IA mit einer strukturellen Plastizität seiner Binderegion einhergeht, wurde die Interaktion zwischen BMPR-IA und einem Antikörper Fab Fragment experimentell untersucht. Das Fab Fragment wurde aufgrund folgender Eigenschaft ausgewählt, nämlich an das BMP-2 Bindeepitop des Rezeptors anzudocken, um so eine BMP-2 vermittelte Rezeptoraktivierung zu verhindern. In dieser Doktorarbeit wird die Kristallstruktur des Komplexes, bestehend aus der extrazellulären Domäne von BMPR-IA und dem Antikörper Fab Fragment AbyD1556 beschrieben. Die Kristallstruktur zeigt, dass die Kontaktoberfläche von BMPR-IA zu einem sehr großen Teil mit der Kontaktoberfläche bei der Interaktion mit BMP-2 übereinstimmt. Obwohl das Kontaktepitop von BMPR-IA zu beiden Bindungspartnern weitestgehend deckungsgleich ist, unterscheiden sich die dreidimensionalen Strukturen von BMPR-IA in beiden Komplexen sehr stark voneinander. Im Gegensatz zu den strukturellen Differenzen zeigt jedoch eine Mutationsanalyse, bei der wichtige Aminosäuren mit Alanin ausgetauscht wurden, dass die funktionellen Determinanten, die die Bindung an den Antikörper und an BMP-2 bestimmen, beinahe die gleichen sind. Wenn man die Strukturen von BMPR-IA, das an BMP-2 bzw. an das Fab Fragment AbyD1556 gebunden ist, mit der Struktur von ungebundenem BMPR-IA vergleicht, so fällt auf, dass die Bindung von BMPR-IA an seine Bindungspartner einem sog. „Selektions-Anpassungsmechanismus“ folgt, was möglicherweise zeigt, dass das promiske Ligand-Bindeverhalten von BMPR-IA von Natur aus durch seine strukturelle Anpassungsfähigkeit festgelegt wird.
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Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52797
ER  -