TY - THES A1 - van Alen, Tessa T1 - Vergleichende Proteomanalyse von Biofilmen und planktonischen Zellen bei dem humanen Infektionserreger Neisseria meningitidis T1 - Comparative proteomic analysis of biofilms and planktonic cells of the human pathogen Neisseria meningitidis N2 - Neisseria meningitidis ist ein humaner Infektionserreger, der Meningitis und Sepsis hervorruft. Das asymptomatische Trägertum im Nasenrachenraum ist entscheidend für die Übertragung des Bakteriums und dessen Interaktion mit dem menschlichen Wirt. Frühere Beobachtungen legen die Annahme nahe, dass Meningo¬kokken im Tonsillengewebe in einem biofilmähnlichen Stadium vorliegen. Daher werden in vitro Biofilme als Modell für das Trägertum verwendet. Expressionsunterschiede zwischen Biofilmen und planktonisch gewachsenen pathogenen Neisserien wurden in wenigen Transkriptomanalysen untersucht, während bisher keine Proteomanalysen durchgeführt wurden. Kartierungen des Proteoms und des Immunoproteoms von Meningokokken liegen allerdings vor. In dieser Studie wurde das Biofilmproteom des unbekapselten N. meningitidis Stammes WUE3671 im Vergleich zum Proteom der planktonisch gewachsenen Bakterien untersucht. Dazu wurde ein auf Silikonschläuchen basierendes Biofilmmodell mit kontinuierlichem Fluss etabliert. Es erfolgte eine Anreicherung bakterieller Biomasse über 48 h, wobei die kolonie-bildenden Einheiten bei 24 h ein Plateau erreichten. Licht- und Elektronen¬mikroskopie belegten die deutliche Zunahme der Biomasse über 48 h und zeigten zudem eine Struktur-ierung des 48 h Biofilms in eine apikale Region mit überwiegend vitalen Meningokokken und eine basale Region mit einer verstärkten Anzahl von Bakterien mit avitalem Erscheinungs-bild. Das Proteom von N. meningitidis Biofilmen, die 24 beziehungsweise 48 h gewachsen waren, wurde mit dem einer exponentiell gewachsenen planktonischen Kultur mit 2D-Gelelektro¬phorese verglichen. Unterschiedlich exprimierte Proteine wurden mit Massen-spektrometrie identifiziert und die Ergebnisse mit Spectral Counting und, wenn möglich, mit spezifischen Antikörpern abgesichert. Die Expression von ungefähr 2 % aller Proteinspots im Biofilm unterschied sich von der in planktonischen Zellen wenigstens um das 2-fache. Es wurden Veränderungen beobachtet, die mit einem Nährstoff- und Sauerstoffmangel sowie einer Zunahme von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) in Verbindung gebracht werden können. Die Expression der Proteine SodC und MntC war im Biofilm deutlich erhöht, was mutmaßlich auf ROS im Biofilm zurückzuführen ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MntC in der Tat essentiell für Biofilmwachstum, nicht aber für planktonisches Wachstum ist. Die Daten zu SodC und MntC legen die Hypothese nahe, dass Meningokokken im Biofilm trainiert werden mit Mediatoren des Immunsystems, wie ROS, umzugehen. Zudem wird NMB0573, ein Lrp-Homolog, als wesentlicher globaler Regulator für metabolische Anpassungen im Biofilm postuliert. Es konnte über die Proteomanalyse hinaus gezeigt werden, dass die Adhäsine Opc und Opa, die unter der Kontrolle von NMB0573 stehen, im Biofilm vermindert exprimiert werden. N2 - Neisseria meningitidis is a human pathogen that causes meningitis and sepsis. Asymptomatic nasopharyngeal carriage is crucial for the transmission of the bacterium and its interaction with the human host. Previous observations led to the assumption that meningococci persist in the tonsillar tissue in a biofilm-like state. Therefore in vitro biofilms are used to model carriage. Despite successful mapping of the meningococcal proteome and immuno-proteome, no proteome and only a few transcription analyses investigated the differences between biofilm and planktonic growth in pathogenic Neisseria. This study investigated the biofilm proteome of the unencapsulated N. meningitidis strain WUE3671 in comparison to planktonically grown bacteria. A continuous flow biofilm model based on silicone tubes was established. There was an accumulation of bacterial biomass over 48 h with the number of colony forming units reaching a plateau at 24 h. Light- and electron microscopy confirmed biomass accumulation and revealed a structuring of the 48 h biofilm in an apical region with predominantly vital meningococci and a basal region with increased numbers of bacteria with avital appearance. The proteomes of N. meningitidis biofilms grown for 24 or 48 h, respectively and of exponentially grown planktonic cultures were compared by 2D-gelelectrophoresis. Differentially expressed proteins were identified by mass spectrometry. The results were confirmed by spectral counting and, if available, with specific antibodies. Approximately 2 % of all protein spots in the biofilm were at least 2 fold differentially expressed in comparison to planktonic cells. Changes related to nutrient and oxygen limitation and increase of reactive oxygen species (ROS) were observed. There was an increased expression of SodC and MntC in the biofilm that supposedly is caused by ROS in the biofilm. MntC was specifically required for meningococcal biofilm formation, but not for planktonic growth. Data for SodC and MntC suggest that meningococci in the biofilm are trained to cope with mediators of the immune system like ROS. Moreover, NMB0573, an Lrp-like global regulator, was implicated as a possible mediator of metabolic adaption in the biofilm. Independent of the proteome analysis, the NMB0573-dependent adhesions Opc and Opa were in addition shown to be down-regulated within the biofilm. KW - Biofilm KW - Neisseria meningitidis KW - Proteomanalyse KW - biofilm KW - Neisseria meningitidis KW - Proteom analysis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52463 ER - TY - THES A1 - Saverschek, Nicole T1 - The influence of the symbiotic fungus on foraging decisions in leaf-cutting ants - Individual behavior and collective patterns T1 - Einfluss des symbiontischen Pilzes auf das Furagierverhalten von Blattschneiderameisen - Individuelles Verhalten und kollektive Muster N2 - Foraging behavior is a particularly fascinating topic within the studies of social insects. Decisions made by individuals have effects not only on the individual level, but on the colony level as well. Social information available through foraging in a group modulates individual preferences and shapes the foraging pattern of a colony. Identifying parameters influencing foraging behavior in leaf-cutting ants is especially intriguing because they do not harvest for themselves, but for their symbiotic fungus which in turn influences their plant preferences after the incorporation of the substrate. To learn about the substrates’ unsuitability for the fungus, ants need to be able to identify the incorporated substrate and associate it with detrimental effects on the fungus. Odor is an important plant characteristic known to be used as recognition key outside the nest in the context of foraging. Chapter 1 shows that foragers are able to recall information about the unsuitability of a substrate through odor alone and consequently reject the substrate, which leads to the conclusion that inside the nest, odor might be enough to indentify incorporated substrate. Identification of plant species is a key factor in the foraging success of leaf-cutting ants as they harvest a multitude of different plant species in a diverse environment and host plant availability and suitability changes throughout the year. Fixed plant preferences of individuals through innate tendencies are therefore only one factor influencing foraging decisions. On the individual as well as the colony level, foraging patterns are flexible and a result of an intricate interplay between the different members involved in the harvesting process: foragers, gardeners and the symbiotic fungus. In chapter 2 I identified several conditions necessary for naïve foragers to learn about the unsuitability of substrate inside the nest. In order to exchange of information about the unsuitability of a substrate, the plant in question must be present in the fungus garden. Foragers can learn without own foraging experience and even without experiencing the effects of the substrate on the fungus, solely through the presence of experienced gardeners. The presence of experienced foragers alone on the other hand is not enough to lower the acceptance of substrate by naïve foragers in the presence of naïve gardeners, even if experienced foragers make up the majority of the workforce inside the nest. Experienced foragers are also able to reverse their previous negative experience and start accepting the substrate again. The individual behavior of foragers and gardeners with different experiential backgrounds in the presence of suitable or unsuitable substrate inside the fungus chamber was investigated in chapter 3 to shed some light on possible mechanisms involved in the flow of information about substrate suitability from the fungus to the ants. Gardeners as well as foragers are involved in the leaf processing and treatment of the applied leaf patches on the fungus. If the plant material is unsuitable, significantly more ants treat the plant patches, but foragers are less active overall. Contacts between workers initiated by either gardeners or foragers occur significantly more frequent and last longer if the substrate is unsuitable. Even though experienced gardeners increase naïve foragers’ contact rates and duration with other workers in the presence of suitable plant patches, naïve foragers show no differences in the handling of the plant patches. This suggests that foragers gain information about plant suitability not only indirectly through the gardening workers, but might also be able to directly evaluate the effects of the substrate on the fungus themselves. Outside the nest, foragers influence each other the trail (chapter 4). Foraging in a group and the presence of social information is a decisive factor in the substrate choice of the individual and leads to a distinct and consentaneous colony response when encountering unfamiliar or unsuitable substrates. As leaf-cutting ants harvest different plant species simultaneously on several trails, foragers gain individual experiences concerning potential host plants. Preferences might vary among individuals of the same colony to the degree that foragers on the same trail perceive a certain substrate as either suitable or unsuitable. If the majority of foragers on the trail perceives one of the currently harvested substrates as unsuitable, naïve foragers lower their acceptance within 4 hours. In the absence of a cue in the fungus, naïve foragers harvesting by themselves still eventually (within 6 hours) reject the substrate as they encounter experienced gardeners during visits to the nest within foraging bouts. As foraging trails can be up to 100 m long and foragers spend a considerable amount of time away from the nest, learning indirectly from experienced foragers on the trail accelerates the distribution of information about substrate suitability. The level of rejection of a formerly unsuitable substrate after eight hours of foraging by naïve foragers correlates with the average percentage of unladen experienced foragers active on the trail. This suggests that unladen experienced foragers might actively contact laden naïve workers transmitting information about the unsuitability of the load they carry. Results from experiments were I observed individual laden foragers on their way back to the nest backed up this assumption as individuals were antennated and received bites into the leaf disk they carried. Individuals were contacted significantly more often by nestmates that perceived the carried leaf disk as unsuitable due to previous experience than by nestmates without this experience (chapter 6). Leaf-cutting ants constantly evaluate, learn and re-evaluate the suitability of harvested substrate and adjust their foraging activity accordingly. The importance of the different sources of information within the colony and their effect on the foraging pattern of the colony depend on the presence or absence of each of them as e.g. experienced foragers have a bigger influence on the plant preferences of naïve foragers in the absence of a cue in the fungus garden. N2 - Besonders faszinierend ist das Furagierverhalten sozialer Insekten. Entscheidungen von Individuen haben nicht nur direkte Auswirkungen auf individueller Ebene, sondern auch auf Kolonieebene. Soziale Informationen modulieren individuelle Präferenzen beim Furagieren in der Gruppe und beeinflussen dadurch das Aktivitätsmuster der Kolonie. Die Identifizierung der Faktoren, die das Furagierverhalten beeinflussen, ist bei Blattschneiderameisen komplex, da sie nicht für sich, sondern für ihren symbiotischen Pilz furagieren. Dieser wiederum beeinflusst die Pflanzenwahl der Ameisen nach der Einarbeitung des Pflanzenmaterials in den Pilz. Um zu lernen, dass das eingebaute Substrat für den Pilz ungeeignet ist, müssen die Ameisen in der Lage sein, das bereits eingebaute Substrat zu identifizieren und mit den negativen Effekten auf den Pilz zu assoziieren. Duft ist ein bedeutendes Pflanzencharakteristikum, das außerhalb des Nestes als Identifizierungsmerkmal im Furagierkontext verwendet wird. In Kapitel 1 zeige ich, das Pflanzendüfte alleine ausreichen um Furageuren die Information aus dem Pilzgarten über die des Substrates ins Gedächtnis zu rufen. Furageure lehnen auf Grund des Duftes allein das Substrat bereits ab. Dies lässt den Rückschluss zu, dass Duft möglicherweise als Identifizierungsmerkmal des in den Pilz eingebauten Substrats ausreichend ist. Die Identifizierung von Pflanzenarten ist ein wesentlicher Faktor des Furagiererfolgs bei Blattschneiderameisen, da diese eine Vielzahl unterschiedlicher Pflanzenarten ernten, deren Verfügbarkeit und Eignung sich im Jahresverlauf ändert. Angeborene individuelle Präferenzen sind daher nur einer von mehreren Faktoren, die die Furagierentscheidungen beeinflussen. Sowohl auf individueller als auch auf Kolonieebene sind die beobachteten Muster in der Furagieraktivität flexibel und das Ergebnis eines komplexen Wechselspiels aller Beteiligten im Furagierprozess: die Furageure, die Gärtnerinnen und der symbiotische Pilz. In Kapitel 2 habe ich mehrere Bedingungen identifiziert, die notwendig sind, damit naive Furageure im Nest lernen können, das ein Substrat für den Pilz ungeeignet ist. Um Informationen über die Pflanzenqualität austauschen zu können, ist die Anwesenheit des Substrats im Nest erforderlich. Furageure können allein durch die Anwesenheit erfahrener Gärtnerinnen lernen, ohne eigene Furagiererfahrung und ohne die negativen Effekte des Substrats auf den Pilz erfahren zu haben. Andererseits ist die Anwesenheit erfahrener Furageure allein nicht genug, um die Akzeptanz des Substrats durch naive Furageure zu verringern, wenn die Gärtnerinnen naiv sind, selbst wenn die erfahrenen Furageure die Mehrzeit der Tiere im Nest stellen. Erfahrene Furageure sind auch in der Lage, ihre früheren negativen Erfahrungen zu revidieren und das Substrat wieder zu akzeptieren. Das Individualverhalten von Furageuren und Gärtnerinnen mit unterschiedlichem Erfahrungshintergrund in der Anwesenheit von geeignetem oder ungeeignetem Pflanzenmaterial im Pilz wurde in Kapitel 3 untersucht. Hierbei sollten mögliche Mechanismen des Informationsflusses vom Pilz zu den Ameisen aufgedeckt werden. Sowohl Gärtnerinnen als auch Furageure sind in die Bearbeitung des Blattmaterials involviert. Ist das Blattmaterial ungeeignet, wird es von signifikant mehr Ameisen bearbeitet, aber die allgemeine Aktivität der Furageure ist geringer als bei der Bearbeitung von geeignetem Substrat. Ist das Pflanzenmaterial ungeeignet, finden signifikant mehr und längere Kontakte zwischen den Ameisen statt. Die Anwesenheit erfahrener Gärtnerinnen hat keinen Einfluss auf die Bearbeitungszeit oder Frequenz des geeigneten Blattmaterials durch naive Furageure, sie haben aber einen Einfluss auf die von naiven Furageuren induzierten Kontakte. Diese sind in Anwesenheit von erfahrenen Gärtnerinnen häufiger und länger. Dies lässt vermuten, das Furageure sowohl direkt über den Zustand des Pilzes, als auch indirekt durch Kontakte mit erfahrenen Gärtnerinnen lernen, das ein Substrat für den Pilz ungeeignet ist. Außerhalb des Nestes beeinflussen sich Furageure gegenseitig auf den Erntestraßen (Kapitel 4). Das Furagieren in der Gruppe und die dadurch zur Verfügung stehende soziale Informationen sind ein entscheidender Faktor in der Pflanzenwahl von Individuen und führt zu einer klaren und deutlichen Kolonieantwort bei unbekannten oder ungeeigneten Pflanzenarten. Da Blattschneiderameisen mehrere Pflanzenarten gleichzeitig auf unterschiedlichen Erntestraßen eintragen, unterscheiden sich Furageure in ihren individuellen Erfahrungen. Individuelle Präferenzen innerhalb einer Kolonie können sich so stark voneinander unterscheiden, dass eine Pflanze von unterschiedlichen Furageuren auf derselben Erntestraße sowohl als geeignet als auch als ungeeignet bewertet werden kann. Wenn die Mehrheit der auf der Erntestraße aktiven Furageure negative Erfahrungen mit dem Substrat hat und es als ungeeignet bewertet, dann verringert sich die Akzeptanz dieses Substrates durch naive Furageure ebenfalls signifikant innerhalb von 4 Stunden. Wenn die negativen Effekte im Pilzgarten nicht mehr zu detektieren sind lehnen naive Furageure in Abwesenheit von erfahren Furageuren das Substrat nach ungefähr 6 Stunden ab, da sie bei ihren Nestbesuchen auf erfahrene Gärtnerinnen stoßen. Da Erntestraßen bis zu 100 m lang sein können und Furageure daher lange unterwegs sind, beschleunigt das indirekte Lernen durch erfahrene Furageure auf der Erntestraße die Verbreitung der Information über die Substratqualität innerhalb der Kolonie. Das Maß der Ablehnung des ursprünglich ungeeigneten Substrats durch naive Furageure nach 8 Stunden furagieren korreliert mit dem durchschnittlichen Prozentsatz an unbeladenen, erfahrenen Furageuren auf der Erntestraße. Dies lässt vermuten, dass unbeladene, erfahrene Furageure beladene naive Furageure aktiv kontaktieren und dadurch Informationen über das ungeeignete Substrat übermitteln. Ergebnisse von Individualbeobachtungen unterstützen diese Vermutung. In Kapitel 6 zeige ich, dass beladene Rekruten auf dem Weg zurück zum Nest signifikant häufiger von anderen Furageuren kontaktiert werden, wenn diese negative Erfahrungen mit der vom Rekruten getragenen Pflanzenart haben als wenn die Pflanzenart als geeignet bewertet wird. Blattschneiderameisen bewerten, lernen und bewerten wieder die Qualität geernteten Substrats und passen ihr Furagierverhalten entsprechend an. Die verschiedenen Informationsquellen über die Pflanzenqualität innerhalb der Kolonie haben eine unterschiedliche Gewichtung abhängig von der An- oder Abwesenheit von einer von Ihnen. Zum Beispiel haben erfahrene Furageure in der Abwesenheit von negativen Effekten im Pilzgarten einen deutlich größeren Einfluss auf die Präferenzen naiver Furageure. KW - Blattschneiderameisen KW - Nahrungserwerb KW - Erfahrung KW - Lernen KW - Furagierverhalten KW - kollektive Muster KW - Soziale Insekten KW - Verhaltensforschung KW - social insects KW - leaf-cutting ants KW - learning KW - experience KW - foraging behavior Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52087 ER - TY - THES A1 - Vainshtein, Yevhen T1 - Applying microarray‐based techniques to study gene expression patterns: a bio‐computational approach T1 - Anwendung von Mikroarrayanalysen um Genexpressionsmuster zu untersuchen: Ein bioinformatischer Ansatz N2 - The regulation and maintenance of iron homeostasis is critical to human health. As a constituent of hemoglobin, iron is essential for oxygen transport and significant iron deficiency leads to anemia. Eukaryotic cells require iron for survival and proliferation. Iron is part of hemoproteins, iron-sulfur (Fe-S) proteins, and other proteins with functional groups that require iron as a cofactor. At the cellular level, iron uptake, utilization, storage, and export are regulated at different molecular levels (transcriptional, mRNA stability, translational, and posttranslational). Iron regulatory proteins (IRPs) 1 and 2 post-transcriptionally control mammalian iron homeostasis by binding to iron-responsive elements (IREs), conserved RNA stem-loop structures located in the 5’- or 3‘- untranslated regions of genes involved in iron metabolism (e.g. FTH1, FTL, and TFRC). To identify novel IRE-containing mRNAs, we integrated biochemical, biocomputational, and microarray-based experimental approaches. Gene expression studies greatly contribute to our understanding of complex relationships in gene regulatory networks. However, the complexity of array design, production and manipulations are limiting factors, affecting data quality. The use of customized DNA microarrays improves overall data quality in many situations, however, only if for these specifically designed microarrays analysis tools are available. Methods In this project response to the iron treatment was examined under different conditions using bioinformatical methods. This would improve our understanding of an iron regulatory network. For these purposes we used microarray gene expression data. To identify novel IRE-containing mRNAs biochemical, biocomputational, and microarray-based experimental approaches were integrated. IRP/IRE messenger ribonucleoproteins were immunoselected and their mRNA composition was analysed using an IronChip microarray enriched for genes predicted computationally to contain IRE-like motifs. Analysis of IronChip microarray data requires specialized tool which can use all advantages of a customized microarray platform. Novel decision-tree based algorithm was implemented using Perl in IronChip Evaluation Package (ICEP). Results IRE-like motifs were identified from genomic nucleic acid databases by an algorithm combining primary nucleic acid sequence and RNA structural criteria. Depending on the choice of constraining criteria, such computational screens tend to generate a large number of false positives. To refine the search and reduce the number of false positive hits, additional constraints were introduced. The refined screen yielded 15 IRE-like motifs. A second approach made use of a reported list of 230 IRE-like sequences obtained from screening UTR databases. We selected 6 out of these 230 entries based on the ability of the lower IRE stem to form at least 6 out of 7 bp. Corresponding ESTs were spotted onto the human or mouse versions of the IronChip and the results were analysed using ICEP. Our data show that the immunoselection/microarray strategy is a feasible approach for screening bioinformatically predicted IRE genes and the detection of novel IRE-containing mRNAs. In addition, we identified a novel IRE-containing gene CDC14A (Sanchez M, et al. 2006). The IronChip Evaluation Package (ICEP) is a collection of Perl utilities and an easy to use data evaluation pipeline for the analysis of microarray data with a focus on data quality of custom-designed microarrays. The package has been developed for the statistical and bioinformatical analysis of the custom cDNA microarray IronChip, but can be easily adapted for other cDNA or oligonucleotide-based designed microarray platforms. ICEP uses decision tree-based algorithms to assign quality flags and performs robust analysis based on chip design properties regarding multiple repetitions, ratio cut-off, background and negative controls (Vainshtein Y, et al., 2010). N2 - Die Regulierung und Aufrechterhaltung der Eisen-Homeostase ist bedeutend für die menschliche Gesundheit. Als Bestandteil des Hämoglobins ist es wichtig für den Transport von Sauerstoff, ein Mangel führt zu Blutarmut. Eukaryotische Zellen benötigen Eisen zum Überleben und zum Proliferieren. Eisen ist am Aufbau von Hämo- und Eisenschwefelproteinen (Fe-S) beteiligt und kann als Kofaktor dienen. Die Aufnahme, Nutzung, Speicherung und der Export von Eisen ist zellulär auf verschiedenen molekularen Ebenen reguliert (Transkription, mRNA-Level, Translation, Protein-Level). Die iron regulatory proteins (IRPs) 1 und 2 kontrollieren die Eisen-Homeostase in Säugetieren posttranslational durch die Bindung an Iron-responsive elements (IREs). IREs sind konservierte RNA stem-loop Strukturen in den 5' oder 3' untranslatierten Bereichen von Genen, die im Eisenmetabolismus involviert sind (z.B. FTH1, FTL und TFRC). In dieser Arbeit wurden biochemische und bioinformatische Methoden mit Microarray-Experimenten kombiniert, um neue mRNAs mit IREs zu identifizieren. Genexpressionsstudien verbessern unser Verständnis über die komplexen Zusammenhänge in genregulatorischen Netzwerken. Das komplexe Design von Microarrays, deren Produktion und Manipulation sind dabei die limitierenden Faktoren bezüglich der Datenqualität. Die Verwendung von angepassten DNA Microarrays verbessert häufig die Datenqualität, falls entsprechende Analysemöglichkeiten für diese Arrays existieren. Methoden Um unser Verständnis von eisenregulierten Netzwerken zu verbessern, wurde im Rahmen dieses Projektes die Auswirkung einer Behandlung mit Eisen bzw. von Knockout Mutation unter verschiedenen Bedingungen mittels bioinformatischer Methoden untersucht. Hierfür nutzen wir Expressionsdaten aus Microarray-Experimenten. Durch die Verknüpfung von biochemischen, bioinformatischen und Microarray Ansätzen können neue Proteine mit IREs identifiziert werden. IRP/IRE messenger Ribonucleoproteine wurden immunpräzipitiert. Die Zusammensetzung der enthaltenen mRNAs wurde mittels einem IronChip Microarray analysiert: Für diesen Chip wurden bioinformatisch Gene vorhergesagt, die IRE-like Motive aufweisen. Der Chip wurde mit solchen Oligonucleotiden beschichtet und durch Hybridisierung überprüft, ob die präzipitierten mRNA sich hieran binden. Die Analyse der erhaltenen Daten erfordert ein spezialisiertes Werkzeug um von allen Vorteilen der angepassten Microarrays zu profitieren. Ein neuer Entscheidungsbaum-basierter Algorithmus wurde in Perl im IronChip Evaluation Package (ICEP) implementiert. Ergebnisse Aus großen Sequenz-Datenbanken wurden IRE-like Motive identifiziert. Dazu kombiniert der Algorithmus, insbesondere RNA-Primärsequenz und RNA-Strukturdaten. Solche Datenbankanalysen tendieren dazu, eine große Anzahl falsch positiver Treffer zu generieren. Daher wurden zusätzliche Bedingungen formuliert, um die Suche zu verfeinern und die Anzahl an falsch positiven Treffer zu reduzieren. Die angepassten Suchkriterien ergaben 15 IRE-like Motive. In einem weiteren Ansatz verwendeten wir eine Liste von 230 IRE-like Sequenzen aus UTR-Datenbanken. Daraus wurden 6 Sequenzen ausgewählt, die auch im unteren Teil stabil sind (untere Helix über 6 bp stabil). Die korrespondierenden Expressed Sequence Tags (ESTs) wurden auf die humane oder murine Version des IronChips aufgetragen. Die Microarray Ergebnisse wurden mit dem ICEP Programm ausgewertet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Immunpräzipitation mit anschließender Microarrayanalyse ein nützlicher Ansatz ist, um bioinformatisch vorhergesagte IRE-Gene zu identifizieren. Darüber hinaus ermöglicht uns dieser Ansatz die Detektion neuer mRNAs, die IREs enthalten, wie das von uns gefundene Gen CDC14A (Sanchez et al., 2006). ICEP ist ein optimiertes Programmpaket aus Perl Programmen (Vainshtein et al., BMC Bioinformatics, 2010). Es ermöglicht die einfache Auswertung von Microarray Daten mit dem Fokus auf selbst entwickelten Microarray Designs. ICEP diente für die statistische und bioinformatische Analyse von selbst entwickelten IronChips, kann aber auch leicht an die Analyse von oligonucleotidbasierten oder cDNA Microarrays adaptiert werden. ICEP nutzt einen Entscheidungsbaum-basierten Algorithmus um die Qualität zu bewerten und führt eine robuste Analyse basierend auf Chipeigenschaften, wie mehrfachen Wiederholungen, Signal/Rausch Verhältnis, Hintergrund und Negativkontrollen durch. KW - Microarray KW - Genexpression KW - Bioinformatik KW - geneexpression KW - microarrays KW - IronChip KW - ICEP Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51967 ER - TY - THES A1 - Laisney, Juliette Agnès Geneviève Claire T1 - Characterisation and regulation of the Egfr/Egfr ligand system in fish models for melanoma N2 - Fish of the genus Xiphophorus belong to the oldest animal models in cancer research. The oncogene responsible for the generation of spontaneous aggressive melanoma encodes for a mutated epidermal growth factor receptor (Egfr) and is called xmrk for Xiphophorus melanoma receptor kinase. Xmrk constitutive activation mechanisms and subsequent signaling pathways have already been investigated and charaterized but it is still unknown if Egfr ligands may also play a role in Xmrk-driven melanoma formation. To investigate the potential role of Egfr ligands in Xmrk-driven melanoma, I firstly analyzed the evolution of teleost and tetrapod Egfr/Egfr ligand systems. I especially focused on the analysis on the medaka fish, a closely related species to Xiphophorus, for which the whole genome has been sequenced. I could identify all seven Egfr ligands in medaka and could show that the two teleost-specific Egfr copies of medaka display dissimilar expression patterns in adult tissues together with differential expression of Egfr ligand subsets, arguing for subfunctionalization of receptor functions in this fish. Our phylogenetic and synteny analyses supported the hypothesis that only one gene in the chordate ancestor gave rise to the diversity of Egfr ligands found in vertebrate genomes today. I also could show that the Egfr extracellular subdomains implicated in ligand binding are not evolutionary conserved between tetrapods and teleosts, making the use of heterologous ligands in experiments with fish cells debatable. Despite its well understood and straight-forward process, Xmrk-driven melanomagenesis in Xiphophorus is problematic to further investigate in vivo. Our laboratory recently established a new melanoma animal model by generating transgenic mitf::xmrk medaka fishes, a Xiphophorus closely related species offering many more advantages. These fishes express xmrk under the control of the pigment-cell specific Mitf promoter. During my PhD thesis, I participated in the molecular analysis of the stably transgenic medaka and could show that the Xmrk-induced signaling pathways are similar when comparing Xiphophorus with transgenic mitf::xmrk medaka. These data together with additional RNA expression, protein, and histology analyses showed that Xmrk expression under the control of a pigment cell-specific promoter is sufficient to induce melanoma in the transgenic medaka, which develop very stereotyped tumors, including uveal and extracutaneous melanoma, with early onset during larval stages. To further investigate the potential role of Egfr ligands in Xmrk-driven melanoma, I made use of two model systems. One of them was the above mentioned mitf::xmrk medaka, the other was an in-vitro cell culture system, where the EGF-inducible Xmrk chimera HERmrk is stably expressed in murine melanocytes. Here I could show that HERmrk activation strongly induced expression of amphiregulin (Areg) and heparin-binding EGF-like growth factor (Hbegf) in melanocytes. This regulation was dependent on the MAPK and SRC signaling pathways. Moreover, upregulation of Adam10 and Adam17, the two major sheddases of Egfr ligands, was observed. I also could demonstrate the functionality of the growth factors by invitro analyses. Using the mitf::xmrk medaka model I could also show the upregulation of a subset of ligand genes, namely egf, areg, betacellulin (btc) and epigen (epgn) as well as upregulation of medaka egfrb in tumors from fish with metastatic melanoma. All these results converge to support an Xmrk-induced autocrine Egfr ligand loop. Interestingly, my in-vitro experiments with conditioned supernatant from medaka Egf- and Hbegf-producing cells revealed that not only Xiphophorus Egfrb, but also the pre-activated Xmrk could be further stimulated by the ligands. Altogether, I could show with in-vitro and in-vivo experiments that Xmrk is capable of inducing a functional autocrine Egfr ligand loop. These data confirm the importance of autocrine loops in receptor tyrosine kinase (RTK)-dependent cancer development and show the possibility for a constitutively active RTK to strengthen its oncogenic signaling by ligand binding. N2 - Fische der Gattung Xiphophorus gehören zu den ältesten Tiermodellen für die Krebsforschung. Das im Xiphophorus-System für die Melanomentstehung verantwortliche Onkogen codiert für eine mutierte Version des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (Egfr) und wird xmrk (für “Xiphophorus melanoma receptor kinase”) genannt. Die konstitutiven Aktivierungsmechanismen dieses Rezeptors und die daraus resultierenden aktivierten Signalwege sind bereits gut untersucht und charakterisiert. Dennoch war bisher unbekannt, ob Egfr-Liganden auch eine Rolle bei der Xmrk-vermittelten Melanomentstehung spielen. Um eine potenzielle Rolle dieser Egfr-Liganden im Xmrk-induzierten Melanom zu erforschen, habe ich zunächst die Evolution des Egfr/Egfr-Liganden-Systems in Teleostiern und Tetrapoden untersucht. Hierfür fokussierte ich mich im besonderen auf den Medaka- Fisch, der zum einen eine nahe evolutionäre Verwandtschaft zu Xiphophorus aufweist und zum anderen – im Gegensatz zu Xiphophorus - ein komplett sequenziertes und gut annotiertes Genom besitzt. Ich konnte alle sieben Egfr-Liganden in Medaka identifizieren und konnte weiterhin zeigen, dass die zwei Teleost-spezifischen Egfr-Kopien dieses Fisches ein unterschiedliches Expressionsmuster in adulten Geweben aufweisen, welches außerdem mit unterschiedlicher Egfr-Liganden-Expression einherging. Diese Daten sprechen für eine Subfunktionalisierung der Egfr-Funktionen in Medaka. Unsere phylogenetischen und Syntenie-Analysen unterstützen die Hypothese, dass nur ein einziges Egfr-Liganden-Gen des Chordaten-Vorfahren der genetische Ursprung für die zahlreichen Egfr-Liganden-Gene, die in heutigen Vertrebraten zu finden sind, darstellt. Ich konnte weiterhin zeigen, dass die an der Ligandenbindung beteiligten Domänen des Egfr nicht zwischen Tetrapoden und Teleostiern konserviert sind. Diese Daten sprechen somit gegen die Verwendung heterologer Liganden in Zellkulturexperimenten mit Fischzellen. Trotz der gut verstandenen Konsequenzen einer Xmrk-Expression auf die Pigmentzelle lässt sich die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung in Xiphophorus relativ schwer in vivo untersuchen. In unserem Labor wurde daher kürzlich ein neues Tiermodell für Melanome entwickelt. Dabei handelt es sich um einen mitf::xmrk-transgenen Medaka. Diese Fische exprimieren xmrk unter der Kontrolle des Pigmentzell-spezifischen Mitf-Promoters. Während meiner Doktorarbeit trug ich zur molekularen Analyse der stabil transgenen Tiere bei und konnte zeigen, dass die Xmrk-vermittelte Signalgebung in mitf::xmrk-Medakas der von Xmrk-exprimierenden Xiphophorus-Fischen gleicht. Diese Daten, zusammen mit weiteren RNA-Expressions-, Protein- und histologischen Analysen, zeigten, dass die Expression von xmrk unter der Kontrolle eines Pigmentzellspezifischen Promoters ausreichend für die Melanomentstehung in Medaka ist. Eine Besonderheit dieses Melanommodelles ist die auffallend stereotype Tumorentstehung. Der Beginn der Hyperpigmentierung wird bereits in frühen Larvenstadien sichtbar und führt – je nach Fischlinie – anschließend zuverlässig zu extrakutanen Pigmentzelltumoren oder invasiven bzw. uvealen Melanomen. Um eine potenzielle Funktion der Egfr-Liganden für Xmrk-induzierte Melanome zu untersuchen, machte ich mir zwei Modellsysteme zunutze. Eines der beiden Modelle war der bereits oben erwähnte mitf::xmrk-transgene Medaka, das andere war ein in-vitro- Zellkultursystem, bei dem die EGF-induzierbare Xmrk-Chimäre HERmrk stabil in murinen Melanozyten exprimiert wird. Hier konnte ich zeigen, dass HERmrk-Aktivierung zu einer starken Genexpression der EGFR-Liganden Amphiregulin (Areg) und Heparin-binding EGFlike growth factor (Hbegf) in Melanozyten führte. Diese Regulierung war abhängig von den MAPK- und SRC-Signalwegen. Weiterhin wurde eine Induktion von Adam10 und Adam17, den zwei bedeutsamsten Proteasen zur Freisetzung von EGFR-Liganden (“Sheddasen”), festgestellt. Ich konnte die Funktionalität der so sezernierten Liganden durch in-vitro- Experimente nachweisen. Anhand des mitf::xmrk Medaka-Modelles konnte ich ebenfalls zeigen, dass sowohl mehrere Egfr-Ligandengene, nämlich egf, areg, betacellulin (btc) und epigen (epgn), als auch egfrb in Tumoren von Medaka-Fischen mit metastatischen Melanomen heraufreguliert wurden. All diese Daten lassen auf einen durch Xmrk induzierten autokrinen EGFR-Liganden-Loop schließen. Interessanterweise zeigte sich durch in-vitro- Experimente mit konditioniertem Überstand von Medaka Egf- und Hbegf-produzierenden Zellen, dass nicht nur Xiphophorus Egfrb, sondern auch das bereits aktivierte Xmrk durch beide Liganden weiter stimuliert werden konnte. Zusammengefasst zeigen meine in-vitro- und in-vivo-Daten, dass Xmrk in der Lage ist, einen funktionalen autokrinen Egfr-Liganden-Loop zu induzieren. Dieses Ergebnis unterstreicht die Bedeutung autokriner Loops in Rezeptortyrosinkinasen (RTK)-abhängiger Tumorentstehung und zeigt auf, dass selbst die onkogene Signalgebung prädimerisierter RTKs durch Ligandenbindung verstärkt werden kann. KW - Schwertkärpfling KW - Melanom KW - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor KW - cancer KW - melanoma KW - fish model KW - EGFR Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51369 ER - TY - THES A1 - Vershenya, Stanislav T1 - Quantitative and qualitative analyses of in-paralogs N2 - In our analysis I was interested in the gene duplications, with focus on in-paralogs. In-paralogs are gene duplicates which arose after species split. Here I analysed the in-paralogs quantitatively, as well as qualitatively. For quantitative analysis genomes of 21 species were taken. Most of them have vastly different lifestyles with maximum evolutionary distance between them 1100 million years. Species included mammals, fish, insects and worm, plus some other chordates. All the species were pairwised analysed by the Inparanoid software, and in-paralogs matrix were built representing number of in-paralogs in all vs. all manner. Based on the in-paralogs matrix I tried to reconstruct the evolutionary tree using in-paralog numbers as evolutionary distance. If all 21 species were used the resulting tree was very far from real one: a lot of species were misplaced. However if the number was reduced to 12, all of the species were placed correctly with only difference being wrong insect and fish clusters switched. Then to in-paralogs matrix the neighbour-net algorithm was applied. The resulting "net" tree showed the species with fast or slow duplications rates compared to the others. We could identify species with very high or very low duplications frequencies and it correlates with known occurrences of the whole genome duplications. As the next step I built the graphs for every single species showing the correlation between their in-paralogs number and evolutionary distance. As we have 21 species, graph for every species is built using 20 points. Coordinates of the points are set using the evolutionary distance to that particular species and in-paralogs number. In mammals with increasing the distance from speciation the in-paralogs number also increased, however not in linear fashion. In fish and insects the graph close to zero is just the same in mammals' case. However, after reaching the evolutionary distances more than 800 million years the number of inparalogs is beginning to decrease. We also made a simulation of gene duplications for all 21 species and all the splits according to the fossil and molecular clock data from literature. In our simulation duplication frequency was minimal closer to the past and maximum in the near-present time. Resulting curves had the same shape the experimental data ones. In case of fish and insect for simulation the duplication rate coefficient even had to be set negative in order to repeat experimental curve shape. To the duplication rate coefficient in our simulation contribute 2 criteria: gene duplications and gene losses. As gene duplication is stochastical process it should always be a constant. So the changing in the coefficient should be solely explained by the increasing gene loss of old genes. The processes are explained by the evolution model with high gene duplication and loss ratio. The drop in number of in-paralogs is probably due to the BLAST algorithm. It is observed in comparing highly divergent species and BLAST cannot find the orthologs so precisely anymore. In the second part of my work I concentrated more on the specific function of inparalogs. Because such analysis is time-consuming it could be done on the limited number species. Here I used three insects: Drosophila melanogaster (fruit y), Anopheles gambiae (mosquito) and Apis mellifera (honeybee). After Inparnoid analyses and I listed the cluster of orthologs. Functional analyses of all listed genes were done using GO annotations and also KEGG PATHWAY database. We found, that the gene duplication pattern is unique for each species and that this uniqueness is rejected through the differences in functional classes of duplicated genes. The preferences for some classes reject the evolutionary trends of the last 350 million years and allow assumptions on the role of those genes duplications in the lifestyle of species. Furthermore, the observed gene duplications allowed me to find connections between genomic changes and their phenotypic manifestations. For example I found duplications within carbohydrate metabolism rejecting feed pattern adaptation, within photo- and olfactory-receptors indicating sensing adaptation and within troponin indicating adaptations in the development. Despite these species specific differences, found high correlations between the independently duplicated genes between the species. This might hint for a "pool" of genes preferentially duplicated. Taken together, the observed duplication patterns reject the adaptational process and provide us another link to the field of genomic zoology. N2 - In unserer Analyse untersuchten wir Genduplikationen mit besonderem Fokus auf "Inparalogen". In-paraloge sind Genduplikationen die nach Speziazion enstehen. Diese betrachteten wir hier in einer quantitativen als auch qualitativen Messreihe. Die quantitative Analyse umfasste Genome aus insgesamt 21 Spezies. Der Großteil diese hat verschiedene Lebensgewonheiten mit eine maximalen Evolutionsdistanz von 1100 Millionen Jahren. Die Arten bestanden aus Säugetiere, Fischen, Insekten und Würmern, sowie weiteren Chordaten. Alle Arten wurden mittels der Inparanoid Software paarweise "all against all" analysiert und in in-paralog Matrizen gespeichert. Basierend auf der in-paralog Matrix versuchten wir den evolutionären Baum über die Anzahl der In-paraloge als Maß für die evolutionäre Distanz zu rekonstruiren. Bei der Betrachtung alle 21 Arten würde der Baum jedoch sehr unpräzise: viel Arten wurden falsch plaziert. Durch eine Reduktion der Anzahl auf nur 12 Spezies clusterten jedoch alle Arten richtig, nur Insekten und Fische waren vertauscht. Anschließend wurde auf die In-paralog Matrix der Neighbor-net Algorithmus angewandt. Der daraus resultierende "Netz"-Baum repräsentiert die Spezies mit schneller oder langsamer Duplikationsrate im Vergleich zu den Anderen. Wir konnten Spezies mit sehr niedriger oder sehr hoher Rate identifizieren. Dabei korrelieren die Genome mit der höheren Rate zu der Anzahl der auftauchenden Whole Genome Duplikationen. Im nächsten Schritt erstellten wir Graphen für jede einzelne Spezies die das Verhältnis zwischen der Anzahl ihrer In-paraloger zur evolutionäre Distanz anzeigen. Jeder der 21 Graphen enthält insgesamt 20 Punkte. Die Punktkoordianten repräsentiern die evolutionere Distanz auf der X-Achse zu der Anzahl In-paraloger auf der Y-Achse. Bei Säugertieren wächst mit steigender Distanz auch die Anzahl In-paraloger. Das Verhältnis ist jedoch nicht linear. Bei Fischen und Insekten ist der Graph in der Nähe des Nullpunkts gleich dem von Säugetieren. Beim Erreichen einer Distanz von mehr als 800 Millionen Jahren sinkt jedoch die Anzahl der In-paralogen. Wir haben nun zusätzlich eine Simulation der Genduplikationen für alle 21 Spezies und alle dazu gehörigen Splits durchgeführt. Die Splits wurden aus publizierten Fossilien und "Molecular Clock" Daten entnommen. In unsere Simulation stieg die Duplikationsrate mit Annäherung an die heutige Zeit. In Vergleich zu den Experimentellen Daten haben die simulierten Graphen das gleiche Aussehen. Bei Fischen und Insekten musste der Koeffizient der Duplikationsrate negiert werden um die experimentelle Kurve zu erhalten. Der Koeffizient der Duplikationsrate stützt sich dabei auf folgende 2 Kriterien: Gen-Duplikation und Gen-Verlust. Da Genduplikationen einem stochastischen Prozess folgen sollten sie immer konstant sein. Daher sind die erhöhten Genverluste alter Gene verantwortlich für die Veränderunrg dieses Koeffizienten. Die Erklärung für dieses Verhalten basiert auf dem Evolutionsmodel - mit hohem Gen-Verlust und hoher Gen Duplikation. Der Verlust der In-Paralogen enstehet wahrscheinlich durch den BLAST Algorithmus. Man beobachtet dies besonders bei sehr divergenten Arten bei dennen BLAST die Orthologen nicht mehr so präzise findet. Der zweite Teil meiner Arbeit bezieht sich auf die spezifische Funktion von In-paralogen. Da diese Analyse sehr zeitaufwendig ist konnte sie nur an einer begrenzten Anzahl von Spezies durchgeführt werden. Hier habe ich die folgenden drei Insekten verwendet: Drosophila melanogaster (Fruchtfliege), Anopheles gambiae (Moskito) und Apis mellifera (Honigbiene). Alle durch die Inparanoid-Software entstandenen Cluster wurden mit der GO Annotation und der KEGG Pathway Datenbank analyiert. Wir haben herausgefunden, dass das Gen-Duplikationsmuster für jede Spezies einzigartig ist, und dass diese Einzigartigkeit durch Funktionale Unterschiede in duplizierten Genen entsteht. Die Bevorzugung einiger Gene repräsentiert die Evolutionsgeschichte der letzten 350 Millionen Jahre und erlaubt Annahmen über die Auswirkung der Gen Duplikationen im Leben der Spezies zu treffen. Weiterhin fanden wir durch die beobachteten Genduplikationen Zusammenhänge zwischen der Genomveränderung und ihrer phenotypischen Manifestation. Beispielsweise haben wir Duplikationen innerhalb des Karbohydratestoffwechsels für die Anpassung des Essvehaltens, Photo- und Olifaktorisch Rezeptoren - für Seh- und Geruchsvermögen und Troponin - zuständig für die Muskelentwicklung gefunden. Trotz diese speziesspezifischen Unterschiede haben wir starke Korrelation zwischen unabhängig duplizierten Genen erkannt. Dies könnte ein Indikator für einen "Pool" von bevorzugt duplizierten Genen sein. Zusammengefasst stellen die beobachteten Duplikationsmuster den Evolvierungsprozess dar, und liefern eine weitere Verbindung zur genomischen Zoologie. KW - Duplikation KW - Evolution KW - Genetik KW - In-paralogs KW - Gene duplication KW - Inparanoid Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51358 ER - TY - THES A1 - Börner, Juliane T1 - Charakterisierung der Phosphorylierungsstellen der Guanylyl Cyklase A, dem Rezeptor für das atriale natriuretische Peptid, mittels Massenspektrometrie T1 - Characterization of the phosphorylation sites of Guanylyl cyclase A, the receptor for atrial natriuretic peptide, by mass spectrometry application N2 - Das ANP/GC-A-System spielt durch die Produktion des sekundären Botenstoffs cGMP eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutdruckes und des Blutvolumens. Bei Patienten mit Herzhypertrophie oder Herzinsuffizienz sind die ANP-Plasmakonzentrationen erhöht, aber die GC-A-vermittelten Effekte stark reduziert, was auf einen Defekt des Signalsystems hinweist. Studien an metabolisch markierten GC-A-überexprimierenden HEK 293-Zellen zeigten, dass der GC-A-Rezeptor im basalen Zustand stark phosphoryliert und die homologe bzw. heterologe Desensitisierung wahrscheinlich mit einer Dephosphorylierung verbunden ist. Die Desensitisierung stellt einen Mechanismus dar, der in vivo zu einem Funktionsverlust des Rezeptors beitragen könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels Massenspektrometrie sieben Phosphorylierungsstellen in der Kinasehomologen Domäne aus FLAG-GC-A exprimierenden HEK 293-Zellen detektiert werden: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513. Die massenspektrometrische relative Quantifizierung basierend auf der Multiple-Reaction-Monitoring (MRM)-Methode zeigte bei ANP-induzierter, homologer Desensitisierung eine Dephosphorylierung der Phosphorylierungsstellen Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513, was mit bereits publizierten Daten übereinstimmt, und einen starken Anstieg der Phosphorylierung an Ser487. Nach Inkubation mit Angiotensin II, welches eine heterologe Desensitisierung hervorruft, wurde eine Reduzierung aller Phosphorylierungen verzeichnet, die zudem stärker ausgeprägt war als bei der ANP-abhängigen Desensitisierung. Die Funktion der neu identifizierten Phosphorylierung an Ser487 wurde mittels Mutagenese analysiert. Die Substitution des Serins durch Alanin, welche den unphosphorylierten Zustand nachstellt, resultierte in einer Rezeptoraktivität und desensitisierung vergleichbar zum GC-A Wildtyp-Rezeptor. Wurde hingegen Serin gegen Glutamat getauscht, um den phosphorylierten Zustand zu imitieren, konnte der Rezeptor weder aktiviert noch desensitisiert werden. Diese Ergebnisse bestätigen vorherige Studien, dass die GC-A-Rezeptorantwort auf ANP durch die Phosphorylierungen reguliert wird. Allerdings scheint bei der homologen Desensitisierung die Phosphorylierung an der Position Ser487 eine Rolle zu spielen, da sie die Aktivität des Rezeptors inhibiert. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Phosphorylierungsstelle trägt zum Verständnis des Mechanismus der homologen Desensitierung bei. Zusätzlich konnten einige der beschriebenen Phosphorylierungen in Zellsystemen detektiert werden, die die GC-A endogen exprimieren. Dadurch sind unter physiologischen Bedingungen Analysen der Mechanismen möglich, die bei der Aktivierung und Deaktivierung der GC-A involviert sind und somit wichtige pathophysiologische Konsequenzen haben können. N2 - Atrial natriuretic peptide (ANP), via its guanylyl cyclase A (GC-A) receptor and intracellular guanosine 3’,5’-cyclic monophosphate production, is critically involved in the regulation of blood pressure. In patients with chronic heart failure, the plasma levels of ANP are increased, but the cardiovascular actions are severely blunted, indicating a receptor or postreceptor defect. Studies on metabolically labelled GC-A-overexpressing cells have indicated that GC-A is extensively phosphorylated, and that ANP induced homologous desensitisation of GC-A correlates with receptor dephosphorylation, a mechanism which might contribute to a loss of function in vivo. In this study, tandem MS analysis of the GC-A receptor, expressed in the human embryonic kidney cell line HEK 293, revealed that the intracellular domain of the receptor is phosphorylated at multiple residues: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 and Thr513. MS quantification based on multiple reaction monitoring demonstrated that ANP-provoked homologous desensitisation was accompanied by a complex pattern of receptor phosphorylation and dephosphorylation. The population of completely phosphorylated GC-A was diminished which is in agreement with published data. However, the phosphorylation of GC-A at Ser487 was selectively enhanced after exposure to ANP. In contrast, the Angiotensin II-provoked heterologous desensitisation resulted in a complete reduction of phosphorylation, which was even more intensive than after ANP-dependend desensitisation. The functional relevance of the newly identified phosphorylation site at serin 487 was analysed by site-directed mutagenesis. The substitution of Ser487 by alanine which mimics dephosphorylation resulted in a receptor which could be activated and desensitised like the GC-A wild-type receptor. However, the substitution by glutamate (which mimics phosphorylation) blunted the activation of the GC-A receptor by ANP, but prevented further desensitisation. These data corroborate previous studies suggesting that the responsiveness of GC-A to ANP is regulated by phosphorylation. However, in addition to the dephosphorylation of the previously postulated sites (Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510), homologous desensitisation seems to involve the phosphorylation of GC-A at Ser487. Identification and characterisation of this phosphorylation site therefore contribute to the understanding of homologous desensitisation. Additionally, some of the detected phosphorylated residues were detected in cells endogenously expressing the GC-A receptor. Therefore future analyses of the mechanisms which are involved in the activation and desensitisation under pathophysiological conditions might be possible. KW - Guanylatcyclase KW - Phosphorylierung KW - Atriales natriuretisches Hormon KW - Massenspektrometrie KW - Guanylyl cyclase A KW - phosphorylation sites KW - atrial natriuretic peptide KW - mass spectrometry Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51914 ER - TY - THES A1 - Choi, Soon Won T1 - Analyse des neuralen Differenzierungspotentials androgenetischer muriner embryonaler Stammzellen in vitro und in vivo T1 - Analysis of the neural differentiation potential of androgenetic murine embryonic stem cells in vitro and in vivo N2 - Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) sind aufgrund ihrer Selbsterneuerung- und ihrer Multiliniendifferenzierungs-Fähigkeiten interessante Zelltypen sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die regenerative Medizin. Uniparentale Zygoten mit zwei väterlichen (androgenetisch: AG) oder zwei mütterlichen (gynogenetisch: GG; parthenogenetisch: PG) Genomen sind nicht in der Lage, lebensfähige Nachkommen zu entwickeln. Sie entwickeln sich jedoch erfolgreich bis zu Blastozysten, aus denen pluripotente ES Zellen abgeleitet werden können. Mit uniparentalen ES Zellen können zum Einen parent-of-origin-spezifische Einflüsse auf die Gewebeentwicklung untersucht und zum Anderen histokompatible und somit therapeutisch relevante Zellpopulationen generiert werden. Obwohl viele Aspekte des in vitro und in vivo Differenzierungspotenzials von PG ES Zellen aus mehreren Spezies in den zurückliegenden Jahren untersucht worden sind, ist das volle Differenzierungspotenzial von AG ES Zellen bisher nicht erschöpfend analysiert worden. Zellen der Inneren Zellmasse (ICM) von PG und AG Embryonen zeigten nach Blastozysteninjektion ortsspezifische Kontribution zur Gehirnentwicklung, wobei PG Zellen bevorzugt im Cortex und im Striatum lokalisierten, während sich AG Zellen verstärkt im Hypothalamus nachzuweisen waren. Aus AG und GG ES Zellen konnten zudem in vitro hämatopoetische Stammzellen differenziert werden, die nach Transplantation im Mausmodell tumorfrei das gesamte hämatopoetische System repopulierten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass AG ES Zellen ein mit N ES Zellen vergleichbares in vitro und in vivo Differenzierungspotential in der frühen neuralen Entwicklung besitzen. Das Ziel meiner Arbeit war es zu untersuchen, ob murine AG ES Zellen sich zu verschiedenen neuronalen Subtypen entwickeln können und ob sie tumorfrei neurale Zelltypen nach Transplantation bilden können. In dieser Studie wurden AG ES Zellen im Vergleich zu biparentalen (N) ES Zellen in vitro über Embryoid Bodies (EBs) zunächst zu pan-neuronalen Vorläuferzellen (pNPCs) und weiter zu Neuron- und Glialzell-Marker (ß-III Tubulin (Tuj-1), NeuN, TH und GFAP) positiven Zellen differenziert.. Weiterhin wurde das dopaminerge (DA) Differenzierungspotential von AG ES Zellen näher untersucht, indem sie in einem Ko-Kultursystem mit Stromazellen gerichtet differenziert wurden. Diese DA Neurone wurden durch semiquantitative RT-PCR Analysen und immunhistochemische Färbungen für DA Neuronen-spezifische Marker (TH, PITX3, Nurr1) charakterisiert. Darüber hinaus wurde der Imprinting-Status von neun ausgesuchten Loci in AG und N ES, pNPC und DA Zellkulturen durch real-time RT-PCR Analysen untersucht. Die hier analysierten Gene, die im Gehirn allelspezifisch exprimiert werden, zeigten in pNPCs eine parent-of-origin-spezifische Genexpression mit Ausnahme von Ube3a. Nach Blastozysteninjektion wurde die Bildung von DA Neuronen in AG und N fötalen chimären Gehirnen untersucht. Hier zeigte sich, dass TH- and PITX3-positive AG DA Neurone abgeleitet aus ES Zellen im Mittelhirn von E12.5 und E16.5 Chimären detektiert werden konnten. Diese fötalen chimären Gehirne zeigten eine verbreitete und gleichmäßige Verteilung der AG Donorzellen in den Arealen Cortex, Striatum und Hypothalamus. Stereotaktische Transplantationen von AG und N pNPCs in ein „Traumatic Brain Injury (TBI) Model“ zeigten zudem, dass frühe Differenzierungsstufen von AG und N pNPC-Kulturen häufig Teratome generierten. Durch die Transplantation von langzeitdifferenzierten AG oder N pNPC-Kulturen konnte jedoch ein tumorfreies Anwachsen neuronaler und glialer Zellen erreicht werden. Die immunhistochemische Auswertung von Transplantaten bezüglich der Donorzellkontribution im Gehirn erfolgten bis zu drei Monaten nach der Injektion. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass AG ES Zellen neurales Differenzierungspotential, speziell zur Bildung von DA Neuronen, besitzen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass langzeitdifferenzierte AG und N pNPCs nach Transplantation im traumatisierte Mausgehirnmodell tumorfrei anwachsen und anschließend zu neuralen Zellen differenzieren können. Trotz unbalancierter Genexpression von imprinted Genen lässt sich feststellen, dass AG ES Zellen therapeutisch relevant für zukünftige zelluläre Ersatzstrategien von Nervengewebe sein können. N2 - Pluripotent embryonic stem (ES) cells are interesting cell types both for basic research and for regenerative medicine because of their enormous self-renewal and multi-lineage differentiation capacity. Uniparental zygotes with two paternal (androgenetic: AG) or two maternal (gynogenetic: GG; parthenogenetic: PG) genomes are not able to develop into viable offsprings but develop successfully up to blastocysts, from which ES cells can be derived. Uniparental ES cells can be utilized to study parent-of-origin-specific influences on tissue development and histocompatible, and therapeutically-relevant cell populations could be generated from them. While many aspects of the in vitro and in vivo differentiation potential of PG uniparental ES cells were studied for several species, the capacity of AG ES cells have not been analyzed to the same extent. PG and AG inner cell mass (ICM) cells showed region-specific contribution in brain development following blastocyst injection. While PG cells were preferentially located in the cortex and the striatum, AG cells were most commonly found in the hypothalamus. Hematopoietic cells derived from AG and GG ES cells generated after transplantation long-term repopulating and tumor-free complete hematopoietic engraftments in irradiated transplant recipients. Furthermore, AG and N ES cells also show a comparable in vitro and in vivo neural differentiation potential during early development, The aim of the present study was to investigate whether AG ES cells can develop into specific neuronal subtypes, and whether they can form neural cell types after transplantation, lacking teratoma formation. In this study, AG ES cells and as controls biparental (N) ES cells were differentiated in vitro via embryoid bodies (EBs) into pan-neural progenitor cells (pNPCs) and consequently to cells which expressed a variety of neuron- and glial cell-specific markers, including ß-III tubulin (Tuj-1), NeuN, TH, and GFAP. Furthermore the dopaminergic (DA) differentiation potential of AG ES cells was investigated more closely, by directed neuronal differentiation of AG ES cells in a co-culture system with stromal cells. The resulting neurons were characterized by semi-quantitative RT-PCR analyses and immunohistochemical stainings for DA neuron-specific markers (TH, PITX3, Nurr1). Additionally, the imprinting status of nine selected loci in AG and N ES cell, pNPC and DA cell cultures was studied by real-time RT-PCR analyses. The genes analyzed here, known to be expressed allel-specific in the brain, maintained in pNPCs a parent-of-origin-specific gene expression with the exception of UBE3A.   Following blastocyst injection the formation of DA neurons was studied in the AG and N chimeric fetal brains. TH- and PITX3-positive DA neurons derived from ES AG cells in the midbrain of E12.5 and E16.5 chimeras were detected. These chimeric fetal brains showed a widespread and balanced distribution of AG cells in the brain areas Cortex, Striatum and Hypothalamus. Stereotactic transplantations of AG and N pNPCs in a "Traumatic Brain Injury (TBI) Model" showed that early neural differentiation stages of AG and N pNPC cultures tended to generate teratomas. Importantly, neuronal and glial tumor-free engraftments could be achieved by the transplantation of long-term differentiated AG or N pNPC cultures. The immunohistochemical assessment of the donor cell contribution of individual transplants was performed up to three months post-transplantation. The results presented here show that AG ES cells have DA neuronal differentiation potential, and that long-term differentiated AG and N pNPCs can engraft tumor-free in a brain injury model. In spite of imbalanced imprinted gene expressions my results suggest that AG ES cells could be therapeutically relevant for future cellular replacement strategies of neural tissues. KW - Deutschland / Stammzellgesetz KW - Dopaminerge Nervenzelle KW - Nervenzelle KW - Embryonale Stammzelle KW - Stammzelle KW - Embryonale Stammzelle KW - androgenetisch KW - Differenzierung KW - Imprinting KW - Transplantation KW - embryonic stem cell KW - androgenetic KW - differentiation KW - imprinting KW - transplantation Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48452 ER - TY - THES A1 - Haddad-Weber, Meike T1 - Development of stem cell-based ACL- and tendon reconstruction T1 - Entwicklung Stammzell-basierter Konstrukte für den Kreuzband- und Sehnenersatz N2 - Ruptures of the anterior cruciate ligament (ACL) and defects of the rotator cuff represent the most common ligament and tendon injuries in knee and shoulder. Both injuries represent significant implications for the patients. After an injury, the ACL and the rotator cuff both exhibit poor intrinsic healing capacities. In order to prevent further defects such as arthritis of the knee and fatty infiltration of the rotator cuff, surgical interaction is essential. In both cases, the currently used surgical techniques are far from optimal because even after the therapy many patients report problems ranging from pain and reduced mobility to complete dysfunction of the involved joint and muscles. Tissue engineering may be a possible solution. It is a promising field of regenerative medicine and might be an advantageous alternative for the treatment of musculoskeletal injuries and diseases in the near future. In this thesis, different tissue engineering based approaches were investigated. For the reconstruction of damaged or diseased ligaments and tendons, the use of MSCs and gene therapy with growth factors is especially suitable and possesses a great therapeutic potential. Therefore, the first method studied and tested in this thesis was the development of a biomaterial based construct for the repair of a ruptured ACL. The second approach represents a cell based strategy for the treatment of the fatty infiltration in the rotator cuff. The third approach was a combined cell, biomaterial, and growth factor based strategy for ACL ruptures. Biomaterial based ACL construct The implant is currently tested in a preclinical in vivo study in mini pigs. This proof-of-principle study is performed to validate the functional capability of the collagen fiber based implant under load in vivo and its population with fibroblasts which produce a ligamentogenic matrix. Cell based treatment of the fatty infiltration in the rotator cuff Regarding the treatment of the fatty infiltration of the rotator cuff in a rabbit model, the in vivo results are also promising. The group treated with autologous MSCs (+MSC group) showed a lower fat content than the untreated group (–MSC group) 6 weeks after the treatment. Furthermore, the SSP muscle of the MSC-treated animals revealed macroscopically and microscopically only few differences compared to the healthy control group. The exact underlying mechanisms leading to the positive results of the treatment are not yet fully understood and have therefore to be further investigated in the future. Cell, biomaterial, and growth factor based treatment of ACL ruptures Studies described in current literature show that collagen hydrogel scaffolds are not ideal for a complete ligament or tendon reconstruction, because of their insufficient mechanical stability. Introduced as an alternative and superior therapy, the combined strategy used in this thesis proves that the cultivation of BMP-12, -13, and IGF-1 transduced MSCs and ACL fibroblasts in a collagen hydrogel is successful. The results of the performed in vitro study reveal that the cells exhibit a fibroblastic appearance and produce a ligamentogenic matrix after 3 weeks. Furthermore, the adenoviral transduction of MSCs and ACL fibroblasts showed no negative effects on proliferation or viability of the cells nor was apoptosis caused. Therefore, the application of these cells represents a possible future therapy for a partial ligament and tendon rupture where the mechanical stability of the remaining ligament or tendon is sufficient and the healing can be improved substantially by this therapy. In general, prospective randomized clinical trials still have to prove the postulated positive effect of MSCs for the treatment of various musculoskeletal diseases, but the results obtained here are already very promising. Ideally, the treatment with MSCs is superior compared to the standard surgical procedures. Because of current safety issues the use of genetically modified cells cannot be expected to be applied clinically in the near future. In summary, the different tissue engineering approaches for novel therapies for musculoskeletal injuries and diseases invested in this thesis showed very promising results and will be further developed and tested in preclinical and clinical trials. N2 - 7.2 Zusammenfassung Kreuzbandrupturen und Defekte im Bereich der Rotatorenmanschette stellen die häufigsten Band- und Sehnenverletzungen im Kniegelenk bzw. in der Schulter dar. Beide Verletzungen haben erhebliche Auswirkungen für den Patienten. Sowohl das Kreuzband als auch die Rotatorenmanschette weisen ein sehr schlechtes Heilungspotential nach einer Verletzung auf. Um weiteren Schäden wie einer Kniegelenksarthrose oder einer Verfettung der Rotatorenmanschette vorzubeugen, ist ein operativer Eingriff erforderlich. In beiden Fällen sind die zurzeit verwendeten Behandlungsstandards nicht optimal, da auch nach einer Therapie viele Patienten über Beschwerden klagen, die von Schmerzen und einer eingeschränkten Mobilität bis hin zu einer kompletten Dysfunktion des betroffenen Gelenks und Muskels reichen. Tissue Engineering ist ein zukunftsträchtiges Feld der Regenerativen Medizin und kann ein möglicher Lösungsansatz sein. Vor allem bei der Behandlung von muskuloskelettalen Verletzungen und Erkrankungen kann es zukünftig eine vorteilhafte Behandlungsalternative darstellen. In dieser Doktorarbeit wurden verschiedene Tissue Engineering-basierte Lösungsansätze untersucht. Zur Rekonstruktion von defektem Band- und Sehnengewebe sind sowohl der Einsatz von mesenchymalen Stammzellen (MSZ) als auch die Gentherapie mit Wachstumsfaktoren besonders geeignet und weisen ein großes therapeutisches Potential auf. Deswegen wurde in der vorliegenden Doktorarbeit als erster innovativer Therapieansatz ein Biomaterial-basiertes Konstrukt für den Ersatz eines gerissenen Kreuzbandes entwickelt und getestet. Der zweite Lösungsansatz stellt eine Zell-basierte Therapie zur Behandlung einer fettigen Atrophie der Rotatorenmanschette dar. Die dritte Methode kombiniert Zellen, Biomaterialien und Wachstumsfaktoren zur Therapie von Kreuzbandrupturen. Biomaterial-basiertes Kreuzbandkonstrukt Das Implantat wird zurzeit in einer präklinischen in vivo Studie am Mini Pig getestet. Diese Proof-of-Principle Studie wird durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit der Kollagenfaser-basierten Implantate unter Belastung in vivo zu validieren und ihre Besiedelung mit Fibroblasten, die eine ligamentäre Matrix ausbilden, zu beobachten. Zell-basierte Behandlung der fettig-infiltrieten Rotatorenmanschette Auch bei der Behandlung der fettigen Infiltration der Rotatorenmanschette im Kaninchenmodel, wurden in vivo sehr viel versprechende Ergebnisse erzielt. Die mit autologen MSZ (+MSZ-Gruppe) behandelte Gruppe zeigte nach 6 Wochen einen deutlich geringeren Fettanteil als die unbehandelte Gruppe (-MSZ-Gruppe). Des Weiteren wies der SSP-Muskel aller MSZ-behandelten Tiere sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch nur geringe Unterschiede im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe auf. Der genaue zugrunde liegende Mechanismus dieser erfolgreichen Behandlung konnte bisher noch nicht genau geklärt werden und muss in zukünftigen Studien weiter untersucht werden. Zell-, Biomaterial- und Wachstumsfaktor-basierte Behandlung von Kreuzbandrupturen In der aktuellen Literatur beschriebenen Studien zeigen, dass Kollagenhydrogel-konstrukte aufgrund der fehlenden biomechanischen Stabilität nicht geeignet sind für den kompletten Band- bzw. Sehnenersatz. Als vorteilhafte Behandlungsalternative wurde in der vorliegenden Arbeit eine kombinierte Strategie entwickelt und erfolgreich in vitro getestet: Die Kultivierung von BMP-12-, -13- bzw. IGF-1-transduzierten MSZ und Kreuzbandfibroblasten in einem Kollagenhydrogel verlief sehr viel versprechend und ergab, dass die Zellen nach 3 Wochen im Kollagenhydrogel eine fibroblastäre Morphologie aufweisen und eine ligamentäre Matrix ausbilden. Des Weiteren führte die adenovirale Transduktion der Zellen weder zu negativen Auswirkungen auf das Proliferationsverhalten noch auf die Vitalität der Zellen und löste auch keine Apoptose bei den transduzierten Zellen aus. Zukünftig kann der Einsatz dieser Zellen deswegen ein möglicher Ansatz zur Behandlung von Teilrupturen bei Bändern und Sehnen darstellen, bei denen die biomechanische Stabilität ausreichend ist und die Heilung durch die Therapie wesentlich verbessert wird. Im Allgemeinen müssen prospektive randomisierte klinische Studien zeigen, ob sich der positive Effekt der MSZ bei der Behandlung von Erkrankungen des muskuloskelettalen Systems in der Orthopädie und Unfallchirurgie bewährt, wobei die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse sehr Erfolg versprechend sind. Idealerweise erweist sich die Behandlung mit MSZ als deutlich vorteilhaft gegenüber den bisher etablierten chirurgischen Standardverfahren. Aufgrund der bestehenden Sicherheitsrichtlinien für den Einsatz von gentherapeutischen modifizierten Zellen ist mit deren Verwendung zur Behandlung von Band- und Sehnenerkrankungen in naher Zukunft nicht zu rechnen. Zusammenfassend führte die Untersuchung der unterschiedlichen Tissue Engineering Ansätze, die in dieser Doktorarbeit als neue Therapien zur Behandlung von muskuloskelettalen Verletzungen und Erkrankungen evaluiert wurden, zu sehr viel versprechende Ergebnisse. Diese Therapieansätze sollen weiterentwickelt und in präklinischen und klinischen Studien getestet werden. KW - Kreuzband KW - Sehne KW - Tissue Engineering KW - Mesenchymale Stammzellen KW - Gentherpie KW - Zell-basierte Therapie KW - ACL KW - tendon KW - MSC KW - genetherapy KW - cell-based therapy Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66796 ER - TY - THES A1 - Mumm, Patrick T1 - Elektrophysiologische Untersuchungen der Ionenflüsse und ihrer Regulation in Stomakomplex-bildenden Zellen von Zea mays und Schließzellen von Arabidopsis thaliana T1 - Electrophysiological analysis of ion fluxes and their regulation in stomatal cell of Zea mays and guard cells of Arabidopsis thaliana N2 - 1. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse hinsichtlich des angenomme-nen gerichteten Ionentransports zwischen Schließ- und Nebenzellen von Zea mays gewonnen werden: a. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden in beiden Zelltypen S-Typ-ähnliche Anionenkanäle identifiziert. In Nebenzellen konnten sie durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen gehemmt und durch ABA und zytosolische Alkalisierung stimuliert werden. Die S-Typ-Anionenkanäle der Schließzellen wurden hingegen durch eine Alkalisierung kaum beeinflusst und durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen stimuliert. b. Darüber hinaus konnte an intakten Mais-Pflanzen mit der Einstich-Elektroden-Technik gezeigt werden, dass Nebenzellen eine gegenläufige Polarisation des Membranpotentials während der Licht-/Dunkel-induzierten Stomabewegung aufweisen. Da das Membranpotential der Nebenzellen von Hordeum vulgare ein zu Mais ähnliches Verhalten während der Stomabewegung zeigte und gegenläu-fig zur Membranpolarisation der benachbarten Schließzellen war, ist ein ähnli-ches Verhalten bei Zea mays Schließzellen naheliegend. c. Zudem wurde in intakten Nebenzellen von Zea mays eine zytosolische Alkali-sierung während der Licht-induzierten Stomaöffnung beobachtet, die bei Stomaschluss wieder auf den Ursprungswert zurückkehrte. d. Mit Hilfe rekonstruktierter 3D-Modelle von intakten Mais-Stomakomplexen konnte ein Volumenverhältnis zwischen Schließ- und Nebenzellen von 1:6 bzw. 1:4 bei geöffneten und geschlossenen Stomata ermittelt werden. Unter Einbeziehung der Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten die hier gewon-nenen Erkenntnisse schlüssig in ein Modell zur Beschreibung des Shuttle-Ionentransports zwischen Neben- und Schließzellen während der Licht-induzierten Stomabewegung eingebunden werden. 2. Des Weiteren wurden die S-Typ-Anionenstromantworten von A. thaliana Schließ-zellen in Patch-Clamp-Experimenten näher untersucht. Dabei waren die S-Typ-Anionenströme bei Ca2+- bzw. ABA-Stimulation in CPK23- und OST1-Verlustmutanten im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert. Diese in vivo generierten Daten untermauern die in vitro Ergebnisse der Arbeitsgruppe von Prof. R. Hedrich (Universität Würzburg), dass OST1 und CPK23 Interaktionspartner des S-Typ-Anionenkanals SLAC1 in A. thaliana sind. Das SLAC1-homologe Gen SLAH3 ko-diert für einen Nitrat-permeablen S-Typ-Anionenkanal in Schließzellen, der zudem durch externes Nitrat aktiviert wird. Da in slac1-3 Verlustmutanten S-Typ-ähnliche Anionenströme generiert werden konnten, wenn Nitrat das dominierende Anion dar-stellte oder den Chlorid-basierten Lösungen externes Nitrat zugegeben wurde, scheint SLAH3 unter bestimmten Bedingungen einen alternativen Weg für die Ent-lassung von Anionen aus der Schließzelle darzustellen. 3. Die elektrophysiologische Charakterisierung der R-Typ-Anionenkanäle in A. thaliana Schließzellen belegt, dass dieser Kanal ähnliche Grundcharakteristika aufweist, die schon in Vicia faba beschrieben wurden: eine starke Spannungsab¬hängigkeit, sowie schnelle Aktivierungs- und Deaktivierungskinetiken. Im Gegensatz zu Vicia faba wurde die Spannungsabhängigkeit dieses Kanaltyps in A. thaliana nicht durch externes Malat beeinflusst. Jedoch war unter externen Malatbedingungen die Stromantwort einer almt12-Verlustmutante im Vergleich zu Wildtyp-Schließzellen erheblich reduziert, während unter externen Sulfatbe¬dingungen keine Unterschiede zwischen Wildtyp und almt12-Verlustmutante auszu¬machen waren. ALMT12 scheint demnach für den Malat-aktivierten Teil des R-Typ-Anionenkanals verantwortlich zu sein. N2 - 1. Within this dissertation the following new insights into the coordinated ion transport between guard and subsidiary cells of Zea mays were gained: a. Using the patch clamp technique on subsidiary and guard cell protoplasts, S-type-like anion channels were identified in both cell types. In subsidiary cells they were inhibited by elevated cytosolic calcium con-centrations and stimulated by ABA and cytosolic alkalinization. In con-trast, the S-type-like guard cell anion channels were hardly influenced by alkalinization and stimulated upon a rise in the cytosolic free calcium level. b. Impaling of subsidiary cells in intact Zea mays plants with microeletrodes revealed a reversed membrane polarization during light-/darkness-induced stomatal movement. Since the membrane potential of Hordeum vulgare subsidiary cells showed a similar behavior that was, however, reversed in the surrounding guard cells during stomatal movement, a similar change in the membrane potential of Zea mays guard cells is most likely. c. Furthermore an alkalinization in Zea mays subsidiary cell could be moni-tored during light-induced stomatal opening, which returned to original values after stomatal closure. d. Based on reconstructed 3D-models of intact maize stomatal complexes, a volume ratio between guard cells and subsidiary cells of 1:6 and 1:4 of open and closed stomata, respectively, were estimated. The obtained results could be conclusively embedded in a model that decribes the shuttle transport of ions between guard and subsidiary cells during light-induced stomatal movement. 2. Patch clamp studies on guard cells of A. thaliana CPK23- and OST1-loss-of-function mutants showed strongly reduced S-type anion currents after stimula-tion through Ca2+ or ABA compared to wild type. These in vivo data support the results of the working group of Prof. R. Hedrich (University Würzburg), that OST1 and CPK23 are directly interacting with the S-type anion channel in A. thaliana. The SLAC1-homologue gene SLAH3 is encoding for a nitrate perme-able S-type anion channel in guard cells. Since SLAC1-loss-of-funtion mutants generate S type anion currents when nitrate is the dominating anion or nitrate is present in chloride-based solutions, SLAH3 seems to represent an alternative pathway for anion efflux in guard cells. 3. The R-type anion channels from Arabidopsis thaliana guard cells were electro-physiologically characterized and revealed similar electrical characteristics as those known from Vicia faba guard cells: strong voltage dependence, fast activa-tion- and deactivation kinetics. In contrast to Vicia faba, however, the voltage dependence was not modulated by external malate. But in the presence of exter-nal malate the current response in ALMT12-loss-of-function mutants was strongly reduced, while similar anion currents were monitored in wild type and almt12 mutant plants in the absence of external malate. These results indicate that ALMT12 is likely responsible for the malate-activating component of the R-type anion channel. KW - Schließzelle KW - Spaltöffnung KW - Anionentranslokator KW - Ackerschmalwand KW - Mais KW - Schließzellen KW - Stomata KW - Anionenkanäle KW - Arabidopsis KW - anion channel KW - guard cell KW - maize KW - arabidopsis KW - stomata Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49267 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Kathrin T1 - Identification and Characterization of GAS2L3 as a Novel Mitotic Regulator in Human Cells T1 - Die Identifizierung und Charakterisierung von GAS2L3 als neuer Regulator der Mitose in humanen Zellen N2 - Precise control of mitotic progression is vital for the maintenance of genomic integrity. Since the loss of genomic integrity is known to promote tumorigenesis, the identification of knew G2/M regulatory genes attracts great attention. LINC, a human multiprotein complex, is a transcriptional activator of a set of G2/M specific genes. By depleting LIN9 in MEFs, a core subunit of LINC, Gas2l3 was identified as a novel LINC target gene. The so far uncharacterized Gas2l3 gene encodes for a member of the family of growth arrest specific 2 (GAS2) proteins, which share a highly conserved putative actin binding CH and a putative microtubule binding GAS2 domain. In the present study GAS2L3 was identified as a LINC target gene also in human cells. Gene expression analysis revealed that GAS2L3 transcription, in contrast to all other GAS2 family members, is highly regulated during the cell cycle with highest expression in G2/M. The GAS2L3 protein showed a specific localization pattern during the M phase: In metaphase, GAS2L3 localized to the mitotic spindle, relocated to the spindle midzone microtubules in late anaphase and concentrated at the midbody in telophase where it persisted until the end of cytokinesis. Overexpression of a set of different GAS2L3 deletion mutants demonstrated that the localization to the mitotic microtubule network is dependent on the C-terminus, whereas the midbody localization is dependent on full length GAS2L3 protein. Additionally, exclusive overexpression of the CH domain induced the formation of actin stress fibers, suggesting that the CH domain is an actin binding domain. In contrast, the GAS2 domain was neither needed nor sufficient for microtubule binding, indicating that there must be an additional so far unknown microtubule binding domain in the C-terminus. Interestingly, immunoblot analysis also identified the C-terminus as the domain responsible for GAS2L3 protein instability, partially dependent on proteasomal degradation. Consistent with its specific localization pattern, GAS2L3 depletion by RNAi demonstrated its responsibility for proper mitosis and cytokinesis. GAS2L3 depletion in HeLa cells resulted in the accumulation of multinucleated cells, an indicator for chromosome mis-segregation during mitosis. Also the amount of cells in cytokinesis was enriched, indicating failures in completing the last step of cytokinesis, the abscission. Strikingly, treatment with microtubule poisons that lead to the activation of the spindle assembly checkpoint (SAC) indicated that the SAC was weakened in GAS2L3 depleted cells. Although the exact molecular mechanism is still unknown, fist experiments support the hypothesis that GAS2L3 might be a regulator of the SAC master kinase BUBR1. In conclusion, this study provides first evidence for GAS2L3 as a novel regulator of mitosis and cytokinesis and it might therefore be an important guardian against tumorigenesis. N2 - Der korrekte Verlauf durch die Mitose des Zellzyklus trägt entscheidend zur Aufrechterhaltung der genomischen Integrität bei. Da ein Verlust der genomischen Integrität die Tumorentstehung begünstigt, ist die Identifizierung neuer G2/M regulatorischer Gene ein Forschungsbereich, der großes Interesse weckt. Der humane Multiproteinkomplex LINC ist für die transkriptionelle Aktivierung einer Vielzahl G2/M spezifischer Gene verantwortlich. Durch die Depletion von LIN9 in MEFs, einer Kernkomponente von LINC, wurde Gas2l3 als ein neues Zielgen von LINC identifiziert. Das bisher uncharakterisierte Gas2l3 Gen codiert für ein der GAS2 (growth arrest specific 2) Familie zugehöriges Protein, deren Mitglieder sich durch eine hoch konservierte putative Aktin-bindende Domäne (CH) und eine putative Mikrotubuli-bindende Domäne (GAS2) auszeichnen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass GAS2L3 auch in humanen Zellen ein Zielgen von LINC ist. Die Transkription von GAS2L3 wies, im Gegensatz zu allen anderen GAS2 Familienmitgliedern, eine starke Regulation während des Zellzyklus auf, wobei die höchste Genexpression in der G2/M Phase vorlag. Das GAS2L3 Protein zeigte eine spezifische Lokalisation während der M Phase: In der Metaphase findet sich GAS2L3 an der mitotischen Spindel, wandert von dort an die Mikrotubuli der zentralen Spindel der Anaphase und konzentriert sich in der Telophase am Midbody, wo es bis zum Ende der Zytokinese verweilt. Der Einsatz unterschiedlicher Deletionsmutanten demonstrierte, dass die Lokalisation an die mitotischen Mikrotubuli vom C-Terminus abhängig ist, wohingegen die Lokalisation am Midbody von der gesamten Proteinsequenz abhängt. Die Ausbildung von Aktin-Streß-Filamenten nach alleiniger Überexpression der CH Domäne deutete darauf hin, dass die CH Domäne eine Aktin-bindende Domäne ist. Die GAS2 Domäne hingegen wurde weder für die Interaktion mit Mikrotubuli gebraucht, noch war sie alleine für diese ausreichend. Alle Daten weisen darauf hin, dass GAS2L3 eine bisher unbekannte Mikrotubuli-bindende Domäne im C-Terminus trägt. Interessanterweise ist der C-Terminus auch für die hohe Instabilität des GAS2L3 Proteins, die teilweise durch den Abbau im Proteasom verursacht wird, verantwortlich. Entsprechend der spezifischen Lokalisation zeigte die Depletion von GAS2L3 durch siRNA Transfektion dessen Wichtigkeit für den korrekten Verlauf der M Phase. GAS2L3 depletierte HeLa Zellen zeigten eine Anreicherung von multinukleären Zellen, welche ein Indikator für die fehlerhafte Verteilung der Chromosomen in der Mitose sind. Ein Hinweis auf Probleme im Beenden der Zytokinese stellte die erhöhte Anzahl von Zellen dar, die sich in der Zytokinese befanden. Eines der auffallendsten Merkmale war ein geschwächter mitotischer Spindelkontrollpunkt, den GAS2L3 depletierte Zellen nach der Behandlung mit den Kontrollpunkt aktivierenden Mikrotubuli-Giften aufwiesen. Auch wenn der exakte molekulare Mechanismus hierbei noch unbekannt ist, deuten erste Experimente darauf hin, dass GAS2L3 die Aktivität von BUBR1, einer essentiellen Kinase des mitotischen Spindelkontrollpunkts, beeinflusst. Alle Daten dieser Arbeit verdeutlichen die Wichtigkeit von GAS2L3 als einen neuen Regulator der Mitose und Zytokinese. Somit ist anzunehmen, dass die korrekte Funktion von GAS2L3 entscheidend zum Schutz vor Tumorentstehung beiträgt. KW - Mensch KW - Zelle KW - Mitose KW - Kernspindel KW - Kontrolle KW - Genregulation KW - Spindelkontrollpunkt KW - Zytokinese KW - Midbody KW - GAS2L3 KW - LIN9 KW - Zellzyklus KW - LIN9 KW - GAS2L3 KW - mitosis KW - cytokinesis KW - spindle assembly checkpoint Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52704 ER - TY - THES A1 - Duraphe, Prashant T1 - Identification and characterization of AUM, a novel human tyrosine phosphatase T1 - Identifizierung und Charakterisierung von AUM, einer neuen humanen Tyrosin-Phosphatase N2 - Protein Phosphatasen werden aufgrund der Aminosäuresequenzen ihrer aktiven Zentren in drei große Familien unterteilt. In einer neu entdeckten Familie von Phosphatasen ist das aktive Zentrum durch die Sequenz DXDX(T/V) charakterisiert. Diese Aspartat-abhängigen Phosphatasen gehören zu der Superfamilie der Hydrolasen vom Haloazid Dehalogenase(HAD)-Typ, einer evolutionär konservierten und ubiquitär verbreiteten Enzymfamilie. Bislang konnten 58 menschliche HAD Enzyme durch Datenbankanalysen identifiziert werden. Ihre Funktionen sind jedoch nach wie vor nur rudimentär verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst das Komplement aller menschlichen HAD Phosphatasen durch Datenbank-Recherchen erfasst. Zusammen mit phylogenetischen Analysen gelang es, eine zum damaligen Zeitpunkt unbekannte, putative Phosphatase zu identifizieren, die eine vergleichsweise hohe Sequenz-Homologie zu der Zytoskelettregulierenden HAD Phosphatase Chronophin aufweist. Dieses neuartige Enzym wurde kloniert und mit biochemischen und zellbiologischen Methoden charakterisiert. Auf der Basis dieser Befunde bezeichnen wir dieses neuartige Protein als AUM (actin remodeling, ubiquitously expressed, magnesium-dependent HAD phosphatase).Mittels Northern blot, real-time PCR und Western blot Analysen konnte gezeigt werden, dass AUM in allen untersuchten menschlichen und murinen Geweben exprimiert wird. Die höchste Expression konnte in Hodengewebe nachgewiesen werden. Durch immunohistochemische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass AUM spezifisch in reifenden Keimzellen mit einem Expressionsmaximum zum Zeitpunkt der Spermiogenese exprimiert wird. Um die Substratpräferenz von AUM zu charakterisieren, wurde zunächst ein peptidbasierter in vitro Phosphatase-Substrat-Screen durchgeführt. Hierbei wurden 720 aus menschlichen Phosphoproteinen abgeleitete Phosphopeptide untersucht. Interessanterweise dephosphorylierte AUM ausschließlich Phosphotyrosin (pTyr)-enthaltende Peptide. Nur 17 pTyr-Peptide (~2% aller untersuchten Peptide) fungierten als AUM-Substrate. Diese Daten legen eine hohe Substratspezifität von AUM nahe. Zu den putativen AUM Substraten gehören Proteine, die in die Dynamik der Zytoskelett-Reorganisation sowie in Tyrosin Kinasevermittelte Signalwege eingebunden sind. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieses Phosphopeptid-Screens konnte mittels Phosphatase overlay assays sowie in Zellextrakten aus Pervanadat-behandelten HeLa Zellen demonstriert werden, dass AUM eine begrenzte Anzahl Tyrosin-phosphorylierter Proteinen dephosphorylieren kann.In zellulären Untersuchungen wurde die mögliche Rolle von AUM im Rahmen der durch den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ausgelösten Tyrosin-Phosphorylierung in einer Spermatogonien Zelllinie (GC-1 spg-Zellen) analysiert. So konnte nachgewiesen werden, dass die Überexpression von AUM zu einer moderaten Abnahme Tyrosin phosphorylierter Proteine nach EGF-Stimulation führte. Im Gegensatz dazu löste jedoch die durch RNAInterferenz vermittelte Depletion von endogenem AUM einen robusten Anstieg Tyrosinphosphorylierter Proteine aus, zu denen auch der EGF-Rezeptor selbst zählt. Zusätzlich zu dem EGF-Rezeptor wurde die Src-Kinase im Zuge des Phosphopeptid- Screens als mögliches AUM Substrat identifiziert. Daher wurden in vitro Kinase/Phosphatase-Assays mit gereinigtem Src und AUM durchgeführt. Mit diesem Ansatz konnte erstmals gezeigt werden, dass AUM in der Lage ist, die Src-Kinase zu aktivieren, während Src AUM phosphoryliert und die AUM Phosphatase-Aktivität blockiert. Diese Ergebnisse deuten auf eine gekoppelte, wechselseitige Regulation von AUM und Src hin. Obwohl die Details dieser Regulation derzeit noch unklar sind, zeigen unsere initialen Ergebnisse, dass AUM die Src-Aktivität unabhängig von seiner Phosphatase Aktivität steigert, während Src die AUM Phosphatase-Aktivität Kinase-abhängig vermindert. Auf zellulärer Ebene sind AUM-depletierte Zellen durch Veränderungen der Aktin- Zytoskelett-Dynamik und der Zelladhäsion charakterisiert. So weisen AUM-defiziente Zellen stabilisierte Aktin Streßfasern und vergrößerte fokale Adhäsionen auf. Weiterhin sind AUMdepletierte Zellen durch ein beschleunigtes spreading auf Fibronektin gekennzeichnet. Wir haben mit AUM ein bisher nicht beschriebenes Mitglied der Familie Aspartat-abhängiger Phosphatasen entdeckt. In dieser Arbeit ist es gelungen, AUM phylogenetisch, biochemisch und zellbiologisch zu charakterisieren. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass AUM einen wichtigen, neuartigen Regulator der Src-vermittelten Zytoskelett-Dynamik im Rahmen der Zelladhäsion und Migration darstellt. N2 - Protein phosphatases can be classified into at least three major families based on amino acid sequences at their active sites. A newly emerging phosphatase family contains the active site sequence DXDX(T/V), and belongs to the haloacid dehalogenase (HAD) superfamily of hydrolases, a ubiquitous and evolutionarily conserved enzyme family. Although the existence of 58 human HAD enzymes has been predicted by database analysis, our understanding of their biological functions remains rudimentary.By database mining amd phylogenetic analysis of human HAD phosphatases, we have found a marked increase in cell area of spreading cells, as well as accelerated cell spreading onfibronectin. Taken together, we have identified and characterized AUM as a novel member of the emerging family of aspartate-dependent protein tyrosine phosphatases. Our findings implicate AUM as an important regulator of Src-dependent cytoskeletal dynamics during cell adhesion and migration. a previously unidentified enzyme with homology to Chronophin, a cytoskeletal regulatory HAD phosphatase. We have cloned and characterized this novel enzyme and named it AUM,for actin remodeling, ubiquitously expressed, magnesium-dependent HAD phosphatase. By Northern blot, real-time PCR and Western blot analysis, we show that AUM is broadly expressed in all major human and mouse tissues with highest levels found in testis. Using immunohistochemistry, we can show that AUM is specifically expressed in maturing germ cells and that its expression peaks during spermiogenesis. To characterize the substrate preference of AUM, we have conducted an in vitro phosphatase substrate screen with 720 phosphopeptides derived from human phosphorylation sites. AUM exclusively dephosphorylates phosphotyrosine (pTyr)-containing peptides. Furthermore, only 17 pTyr peptides (~2% of all pTyr peptides investigated) acted as AUM substrates, indicating a high degree of substrate specificity. Putative AUM substrates include proteins involved in cytoskeletal dynamics and tyrosine kinase signaling.In accordance with the phosphopeptide screen, phosphatase overlay assays employing whole-cell extracts of pervanadate-treated HeLa cells show that AUM dephosphorylates only a limited number of tyrosyl-phosphorylated proteins.The role of AUM for cellular signaling was investigated in response to epidermal growth factor (EGF) stimulation in a spermatogonial cell line (GC-1 spg). The overexpression of AUM reduces, whereas the RNAi-mediated depletion of endogenous AUM increases EGF inducedtyrosine phosphorylation, including changes in the phosphorylation of the EGF receptor itself. Interestingly, in vitro kinase/phosphatase assays with purified Src and AUM indicate that AUM can activate Src, which in turn phosphorylates and inactivates AUM. Although it is at present unclear how Src and AUM regulate each other, our initial findings suggests that AUM enhances Src kinase activity independently of its phosphatase activity, whereas Src diminishes AUM phosphatase activity in a kinase dependent manner. On a cellular level, AUM-depleted cells are characterized by altered actin cytoskeletal dynamics and adhesion, as indicated by stabilized actin filaments, enlarged focal adhesions,a marked increase in cell area of spreading cells, as well as accelerated cell spreading on fibronectin. Taken together, we have identified and characterized AUM as a novel member of the emerging family of aspartate-dependent protein tyrosine phosphatases. Our findings implicate AUM as an important regulator of Src-dependent cytoskeletal dynamics during cell adhesion and migration. KW - Tyrosin KW - Phosphatase KW - Signal transduction KW - Cell adhesion KW - Actin cytoskeleton KW - Src KW - Spermatogenesis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-44256 ER - TY - THES A1 - Keller, Alexander T1 - Secondary (and tertiary) structure of the ITS2 and its application for phylogenetic tree reconstructions and species identification T1 - Sekundär- und Tertiärstruktur der ITS2 und Anwendung für phylogenetische Baumberechnungen und Arteerkennung N2 - Biodiversity may be investigated and explored by the means of genetic sequence information and molecular phylogenetics. Yet, with ribosomal genes, information for phylogenetic studies may not only be retained from the primary sequence, but also from the secondary structure. Software that is able to cope with two dimensional data and designed to answer taxonomic questions has been recently developed and published as a new scientific pipeline. This thesis is concerned with expanding this pipeline by a tool that facialiates the annotation of a ribosomal region, namely the ITS2. We were also able to show that this states a crucial step for secondary structure phylogenetics and for data allocation of the ITS2-database. This resulting freely available tool determines high quality annotations. In a further study, the complete phylogenetic pipeline has been evaluated on a theoretical basis in a comprehensive simulation study. We were able to show that both, the accuracy and the robustness of phylogenetic trees are largely improved by the approach. The second major part of this thesis concentrates on case studies that applied this pipeline to resolve questions in taxonomy and ecology. We were able to determine several independent phylogenies within the green algae that further corroborate the idea that secondary structures improve the obtainable phylogenetic signal, but now from a biological perspective. This approach was applicable in studies on the species and genus level, but due to the conservation of the secondary structure also for investigations on the deeper level of taxonomy. An additional case study with blue butterflies indicates that this approach is not restricted to plants, but may also be used for metazoan phylogenies. The importance of high quality phylogenetic trees is indicated by two ecological studies that have been conducted. By integrating secondary structure phylogenetics, we were able to answer questions about the evolution of ant-plant interactions and of communities of bacteria residing on different plant tissues. Finally, we speculate how phylogenetic methods with RNA may be further enhanced by integration of the third dimension. This has been a speculative idea that was supplemented with a small phylogenetic example, however it shows that the great potential of structural phylogenetics has not been fully exploited yet. Altogether, this thesis comprises aspects of several different biological disciplines, which are evolutionary biology and biodiversity research, community and invasion ecology as well as molecular and structural biology. Further, it is complemented by statistical approaches and development of informatical software. All these different research areas are combined by the means of bioinformatics as the central connective link into one comprehensive thesis. N2 - Biologische Diversität kann mit Hilfe molekularer Sequenzinformation und phylogenetischen Methoden erforscht und erfasst werden. Bei ribosomalen Genen kann man jedoch wertvolle Information nicht nur aus der Primärsequenz beziehen, sondern auch aus der Sekundärstruktur. In den letzen Jahren wurde Software entwickelt, die solche Daten für taxonomische Fragestellung verwerten kann. Diese Arbeit beschäftigt sich mit einer Erweiterung dieser Methodik durch eine Software-Anwendung, die die Annotation des ribosomalen Genes ITS2 deutlich vereinfacht. Mit dieser Studie konnten wir zeigen, dass dies einen entscheidenden Schritt der Sequenz-Struktur-Phylogenie und der Datenerfassung der ITS2-Datenbank darstellt. Die daraus resultierende und frei verfügbare Anwendung ermöglicht Annotationen von hoher Güte. In einer weiteren Studie wurde mittels Simulationen der gesamte Arbeitsfluß der Sequenz-Struktur Phylogenie auf theoretischer Ebene evaluiert. Dabei zeigte sich, dass sich sowohl die Genauigkeit, als auch die Robustheit von phylogenetischen Stammbäumen durch diesen Ansatz deutlich verbessern. Der zweite große Teil der Arbeit befasst sich mit Fallbeispielen, in denen dieser Arbeitsfluß zur Aufklärung von taxomonischen and ökologischen Fragestellungen Anwendung fand. In diesem Rahmen konnten wir mehrere und voneinander unabhängige Phylogenien ermitteln, welche die theoretischen Ergebnisse einer Verbesserung phylogenetischer Bäume auch von biologischer Seite aus bekräftigen. Der Ansatz war anwendbar in sehr feinskaligen Studien auf Art bzw. Gattungsniveau, aber durch die starke Konservierung der Sekundärstruktur auch an sehr weit von einander entfernten taxonomischen Gruppen. Eine weitere Studie, die sich mit der Phylogenie von Bläulingen befasst, zeigt deutlich, dass dieser Ansatz nicht nur für Fragestellungen bei Pflanzen, sondern auch im Tierreich angewandt werden kann. Die Bedeutung von qualitativ hochwertigen Stammbäumen auch für andere Fachbereiche wird an zwei unserer ökologischen Studien deutlich: Mit Hinzunahme von Sekundärstruktur war es uns möglich Fragestellungen über die Evolution von Ameisen-Pflanzen Interaktionen sowie über ökologische Gemeinschaften von Bakterien auf verschiedenen Pflanzenteilen zu beantworten. Zuletzt gehen wir spekulativ auf die Frage ein, wie Strukturphylogenie um die dritte Dimension erweitert werden kann. Dies bleibt zwar spekulativ und wurde nur um ein kleines Fallbeispiel ergänzt, jedoch zeigt sich deutlich, dass das Potential von Strukturphylogenie noch nicht erschöpft ist. Insgesamt befasst sich diese Arbeit mit Aspekten aus verschiedenen biologischen Disziplinen: Evolutionsbiologie und Biodiversitätsforschung, sowie Gemeinschafts- und Invasionsökologie, aber auch Molekular- und Strukturbiologie. Dies wurde ergänzt durch statistische Ansätze und Entwicklung von informatischer Software. Diese verschiedenen Forschungsrichtungen wurden mit Hilfe der Bioinformatik als zentrales Bindeglied vereint. KW - Phylogenie KW - Evolution KW - Sekundärstruktur KW - DNS-Sequenz KW - Algen KW - Ribosomale RNS KW - rRNA KW - secondary structure KW - phylogeny evolution KW - sequence Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56151 ER - TY - JOUR A1 - Brocher, Jan A1 - Vogel, Benjamin A1 - Hock, Robert T1 - HMGA1 down-regulation is crucial for chromatin composition and a gene expression profile permitting myogenic differentiation N2 - Background: High mobility group A (HMGA) proteins regulate gene transcription through architectural modulation of chromatin and the formation of multi-protein complexes on promoter/enhancer regions. Differential expression of HMGA variants has been found to be important for distinct differentiation processes and deregulated expression was linked to several disorders. Here we used mouse C2C12 myoblasts and C2C12 cells stably over-expressing HMGA1a-eGFP to study the impact of deregulated HMGA1 expression levels on cellular differentiation. Results: We found that induction of the myogenic or osteogenic program of C2C12 cells caused an immediate down-regulation of HMGA1. In contrast to wild type C2C12 cells, an engineered cell line with stable overexpression of HMGA1a-eGFP failed to differentiate into myotubes. Immunolocalization studies demonstrated that sustained HMGA1a-eGFP expression prevented myotube formation and chromatin reorganization that normally accompanies differentiation. Western Blot analyses showed that elevated HMGA1a-eGFP levels affected chromatin composition through either down-regulation of histone H1 or premature expression of MeCP2. RT-PCR analyses further revealed that sustained HMGA1a expression also affected myogenic gene expression and caused either down-regulation of genes such as MyoD, myogenin, Igf1, Igf2, Igfbp1-3 or up-regulation of the transcriptional repressor Msx1. Interestingly, siRNA experiments demonstrated that knock-down of HMGA1a was required and sufficient to reactivate the myogenic program in induced HMGA1a over-expressing cells. Conclusions: Our data demonstrate that HMGA1 down-regulation after induction is required to initiate the myogenic program in C2C12 cells. Sustained HMGA1a expression after induction prevents expression of key myogenic factors. This may be due to specific gene regulation and/or global effects on chromatin. Our data further corroborate that altered HMGA1 levels influence the expression of other chromatin proteins. Thus, HMGA1 is able to establish a specific chromatin composition. This work contributes to the understanding of how differential HMGA1 expression is involved in chromatin organization during cellular differentiation processes and it may help to comprehend effects of HMGA1 over-expression occurring in malign or benign tumours. KW - HMG-Proteine KW - High mobility group Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67914 ER - TY - JOUR A1 - Laisney, Juliette A. G. C. A1 - Braasch, Ingo A1 - Walter, Ronald B. A1 - Meierjohann, Svenja A1 - Schartl, Manfred T1 - Lineage-specific co-evolution of the Egf receptor/ligand signaling system N2 - Background: The epidermal growth factor receptor (Egfr) with its numerous ligands has fundamental roles in development, cell differentiation and physiology. Dysfunction of the receptor-ligand system contributes to many human malignancies. Consistent with such various tasks, the Egfr gene family has expanded during vertebrate evolution as a consequence of several rounds of whole genome duplication. Of particular interest is the effect of the fish-specific whole genome duplication (FSGD) on the ligand-receptor system, as it has supplied this largest group of vertebrates with additional opportunities for sub- and/or neofunctionalization in this signaling system. Results: We identified the predicted components of the Egf receptor-ligand signaling system in teleost fishes (medaka, platyfish, stickleback, pufferfishes and zebrafish). We found two duplicated egfr genes, egfra and egfrb, in all available teleost genomes. Surprisingly only one copy for each of the seven Egfr ligands could be identified in most fishes, with zebrafish hbegf being the only exception. Special focus was put on medaka, for which we more closely investigated all Egf receptors and Egfr ligands. The different expression patterns of egfra, egfrb and their ligands in medaka tissues and embryo stages suggest differences in role and function. Preferential co-expression of different subsets of Egfr ligands corroborates the possible subfunctionalization and specialization of the two receptors in adult tissues. Bioinformatic analyses of the ligand-receptor interface between Egfr and its ligands show a very weak evolutionary conservation within this region. Using in vitro analyses of medaka Egfra, we could show that this receptor is only activated by medaka ligands, but not by human EGF. Altogether, our data suggest a lineage-specific Egfr/Egfr ligand co-evolution. Conclusions: Our data indicate that medaka Egfr signaling occurs via its two copies, Egfra and Egfrb, each of them being preferentially coexpressed with different subsets of Egfr ligands. This fish-specific occurrence of Egf receptor specialization offers unique opportunities to study the functions of different Egf receptor-ligand combinations and their biological outputs in vertebrates. Furthermore, our results strongly support the use of homologous ligands in future studies, as sufficient cross-specificity is very unlikely for this ligand/receptor system. KW - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor KW - epidermal growth factor receptor KW - Egfr KW - teleost fishes Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67922 ER - TY - JOUR A1 - Friedrich, Torben A1 - Rahmann, Sven A1 - Weigel, Wilfried A1 - Rabsch, Wolfgang A1 - Fruth, Angelika A1 - Ron, Eliora A1 - Gunzer, Florian A1 - Dandekar, Thomas A1 - Hacker, Joerg A1 - Mueller, Tobias A1 - Dobrindt, Ulrich T1 - High-throughput microarray technology in diagnostics of enterobacteria based on genome-wide probe selection and regression analysis N2 - The Enterobacteriaceae comprise a large number of clinically relevant species with several individual subspecies. Overlapping virulence-associated gene pools and the high overall genome plasticity often interferes with correct enterobacterial strain typing and risk assessment. Array technology offers a fast, reproducible and standardisable means for bacterial typing and thus provides many advantages for bacterial diagnostics, risk assessment and surveillance. The development of highly discriminative broad-range microbial diagnostic microarrays remains a challenge, because of marked genome plasticity of many bacterial pathogens. Results: We developed a DNA microarray for strain typing and detection of major antimicrobial resistance genes of clinically relevant enterobacteria. For this purpose, we applied a global genome-wide probe selection strategy on 32 available complete enterobacterial genomes combined with a regression model for pathogen classification. The discriminative power of the probe set was further tested in silico on 15 additional complete enterobacterial genome sequences. DNA microarrays based on the selected probes were used to type 92 clinical enterobacterial isolates. Phenotypic tests confirmed the array-based typing results and corroborate that the selected probes allowed correct typing and prediction of major antibiotic resistances of clinically relevant Enterobacteriaceae, including the subspecies level, e.g. the reliable distinction of different E. coli pathotypes. Conclusions: Our results demonstrate that the global probe selection approach based on longest common factor statistics as well as the design of a DNA microarray with a restricted set of discriminative probes enables robust discrimination of different enterobacterial variants and represents a proof of concept that can be adopted for diagnostics of a wide range of microbial pathogens. Our approach circumvents misclassifications arising from the application of virulence markers, which are highly affected by horizontal gene transfer. Moreover, a broad range of pathogens have been covered by an efficient probe set size enabling the design of high-throughput diagnostics. KW - Mikroarray KW - Enterobacteriaceae Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67936 ER - TY - JOUR A1 - Goeb, Eva A1 - Schmitt, Johannes A1 - Benavente, Ricardo A1 - Alsheimer, Manfred T1 - Mammalian Sperm Head Formation Involves Different Polarization of Two Novel LINC Complexes N2 - Background: LINC complexes are nuclear envelope bridging protein structures formed by interaction of SUN and KASH proteins. They physically connect the nucleus with the peripheral cytoskeleton and are critically involved in a variety of dynamic processes, such as nuclear anchorage, movement and positioning and meiotic chromosome dynamics. Moreover, they are shown to be essential for maintaining nuclear shape. Findings: Based on detailed expression analysis and biochemical approaches, we show here that during mouse sperm development, a terminal cell differentiation process characterized by profound morphogenic restructuring, two novel distinctive LINC complexes are established. They consist either of spermiogenesis-specific Sun3 and Nesprin1 or Sun1g, a novel non-nuclear Sun1 isoform, and Nesprin3. We could find that these two LINC complexes specifically polarize to opposite spermatid poles likely linking to sperm-specific cytoskeletal structures. Although, as shown in co-transfection / immunoprecipitation experiments, SUN proteins appear to arbitrarily interact with various KASH partners, our study demonstrates that they actually are able to confine their binding to form distinct LINC complexes. Conclusions: Formation of the mammalian sperm head involves assembly and different polarization of two novel spermiogenesis-specific LINC complexes. Together, our findings suggest that theses LINC complexes connect the differentiating spermatid nucleus to surrounding cytoskeletal structures to enable its well-directed shaping and elongation, which in turn is a critical parameter for male fertility. KW - Sperma KW - LINC complexes Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68449 ER - TY - JOUR A1 - Goetz, Andreas A1 - Eylert, Eva A1 - Eisenreich, Wolfgang A1 - Goebel, Werner T1 - Carbon Metabolism of Enterobacterial Human Pathogens Growing in Epithelial Colorectal Adenocarcinoma (Caco-2) Cells N2 - Analysis of the genome sequences of the major human bacterial pathogens has provided a large amount of information concerning their metabolic potential. However, our knowledge of the actual metabolic pathways and metabolite fluxes occurring in these pathogens under infection conditions is still limited. In this study, we analysed the intracellular carbon metabolism of enteroinvasive Escherichia coli (EIEC HN280 and EIEC 4608-58) and Salmonella enterica Serovar Typhimurium (Stm 14028) replicating in epithelial colorectal adenocarcinoma cells (Caco-2). To this aim, we supplied [U-13C6]glucose to Caco-2 cells infected with the bacterial strains or mutants thereof impaired in the uptake of glucose, mannose and/or glucose 6-phosphate. The 13C-isotopologue patterns of protein-derived amino acids from the bacteria and the host cells were then determined by mass spectrometry. The data showed that EIEC HN280 growing in the cytosol of the host cells, as well as Stm 14028 replicating in the Salmonella-containing vacuole (SCV) utilised glucose, but not glucose 6-phosphate, other phosphorylated carbohydrates, gluconate or fatty acids as major carbon substrates. EIEC 4608-58 used C3-compound(s) in addition to glucose as carbon source. The labelling patterns reflected strain-dependent carbon flux via glycolysis and/or the Entner-Doudoroff pathway, the pentose phosphate pathway, the TCA cycle and anapleurotic reactions between PEP and oxaloacetate. Mutants of all three strains impaired in the uptake of glucose switched to C3-substrate(s) accompanied by an increased uptake of amino acids (and possibly also other anabolic monomers) from the host cell. Surprisingly, the metabolism of the host cells, as judged by the efficiency of 13C-incorporation into host cell amino acids, was not significantly affected by the infection with either of these intracellular pathogens. KW - Metabolismus KW - Carbon Metabolism Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68555 ER - TY - JOUR A1 - Sievers, Claudia A1 - Billig, Gwendolyn A1 - Gottschalk, Kathleen A1 - Rudel, Thomas T1 - Prohibitins Are Required for Cancer Cell Proliferation and Adhesion N2 - Prohibitin 1 (PHB1) is a highly conserved protein that together with its homologue prohibitin 2 (PHB2) mainly localizes to the inner mitochondrial membrane. Although it was originally identified by its ability to inhibit G1/S progression in human fibroblasts, its role as tumor suppressor is debated. To determine the function of prohibitins in maintaining cell homeostasis, we generated cancer cell lines expressing prohibitin-directed shRNAs. We show that prohibitin proteins are necessary for the proliferation of cancer cells. Down-regulation of prohibitin expression drastically reduced the rate of cell division. Furthermore, mitochondrial morphology was not affected, but loss of prohibitins did lead to the degradation of the fusion protein OPA1 and, in certain cancer cell lines, to a reduced capability to exhibit anchorage-independent growth. These cancer cells also exhibited reduced adhesion to the extracellular matrix. Taken together, these observations suggest prohibitins play a crucial role in adhesion processes in the cell and thereby sustaining cancer cell propagation and survival. KW - Krebs Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68548 ER - TY - THES A1 - Niewalda, Thomas T1 - Neurogenetic analyses of pain-relief learning in the fruit fly T1 - Neurogenetische Analyse von pain-relief Lernen in der Fruchtfliege N2 - All animals learn in order to cope with challenges imposed on them by their environment. This is true also for both larval and adult fruit flies as exemplified in pavlovian conditioning. The focus of this Thesis is on various aspects of the fruit flies learning ability. My main project deals with two types of learning which we call punishment-learning and pain-relief learning. Punishment learning happens when fruit flies are exposed to an odour which is followed by electric shock. After such training, flies have learned that that odour signals pain and consequently will avoid it in the future. If the sequence of the two stimuli is reversed such that odour follows shock, flies learn the odour as a signal for relief and will later on approach it. I first report a series of experiments investigating qualitative and parametric features of relief-learning; I find that (i) relief learning does result from true associative conditioning, (ii) it requires a relatively high number of training trials, (iii) context-shock training is ineffective for subsequent shock-odour learning. A further question is whether punishment-learning and pain-relief learning share genetic determinants. In terms of genetics, I test a synapsin mutant strain, which lacks all Synapsin protein, in punishment and relief-learning. Punishment learning is significantly reduced, and relief-learning is abolished. Pan-neuronal RNAi-mediated knock-down of Synapsin results in mutant-like phenotypes, confirming the attribution of the phenotype to lack of Synapsin. Also, a rescue of Synapsin in the mushroom body of syn97 mutants restores both punishment- and relief-learning fully, suggesting the sufficiency of Synapsin in the mushroom body for both these kinds of learning. I also elucidate the relationship between perception and physiology in adult fruit flies. I use odour-shock conditioning experiments to identify degrees of similarity between odours; I find that those similarity measures are consistent across generalization and discrimination tasks of diverse difficulty. Then, as collaborator of T. Völler and A. Fiala, I investigate how such behavioural similarity/dissimilarity is reflected at the physiological level. I combine the behaviour data with calcium imaging data obtained by measuring the activity patterns of those odours in either the sensory neurons or the projection neurons at the antennal lobe. Our interpretation of the results is that the odours perceptual similarity is organized by antennal lobe interneurons. In another project I investigate the effect of gustatory stimuli on reflexive behaviour as well as their role as reinforcer in larval learning. Drosophila larvae greatly alter their behaviour in presence of sodium chloride. Increasing salt concentration modulates choice behaviour from weakly appetitive to strongly aversive. A similar concentration-behaviour function is also found for feeding: larval feeding is slightly enhanced in presence of low salt concentrations, and strongly decreased in the presence of high salt concentrations. Regarding learning, relatively weak salt concentrations function as appetitive reinforcer, whereas high salt concentrations function as aversive reinforcer. Interestingly, the behaviour-concentration curves are shifted towards higher concentrations from reflexive behaviour (choice behaviour, feeding) as compared to associative learning. This dissociation may reflect a different sensitivity in the respective sensory-motor circuitry. N2 - Tiere müssen lernen, damit sie sich in ihrer Umwelt zurechtfinden und die Herausforderungen meistern können, die ihre Umwelt ihnen bietet. Dies gilt auch für Taufliegen im larvalen und erwachsenen Stadium, wie man mit der Pavlovschen Konditionierung zeigen kann. Der Schwerpunkt dieser Doktorarbeit liegt auf verschiedenen Aspekten der Lernfähigkeit von Taufliegen. In meinem Hauptprojekt erforsche ich die Arten von Lernprozessen, die stattfinden, wenn die Fliegen entweder den Beginn oder das Ende eines Elektroschocks mit einem Duft assoziieren. Wenn Taufliegen einen Duft wahrnehmen, der von einem Elektroschock gefolgt wird, lernen sie, dass dieser Duft Schmerz signalisiert, und werden ihn konsequenterweise in Zukunft vermeiden. Man kann die Abfolge dieser beiden Reize so umkehren, dass der Duft auf den Elektroschock folgt. Durch ein solches Training wird der Duft für die Fliegen zu einem Signal für das Ende des schmerzhaften Elektroschocks und sie werden, wenn sie diesen Duft später wieder einmal wahrnehmen, auf ihn zugehen. Ich berichte im ersten Kapitel über Experimente, die qualitative und parametrische Besonderheiten der letzteren Lernform untersuchen. Ich finde heraus, dass (i) das Lernen über das Ende des Elektroschocks echtes assoziatives Lernen ist, (ii) dass es eine relativ hohe Anzahl von Trainingsdurchgängen erfordert, (iii) dass Kontext-Schock-Training unbedeutend für anschließendes Schock-Duft-Lernen ist. Im zweiten Kapitel gehe ich der Frage nach, ob die genannten beiden Typen von Lernvorgängen gemeinsame genetische Determinanten haben. Was die Genetik anbelangt, teste ich die Lernfähigkeit eines Synapsin-Mutantenstammes, dem das Synapsinprotein fehlt. Lernen über den Beginn des Elektroschocks ist stark reduziert, und Lernen über das Ende des Elektroschocks fehlt gänzlich. Die Reduzierung des Synapsinproteins im Fliegengehirn durch RNAi resultiert in mutantenähnlichen Phänotypen. Dieser Befund bestätigt, dass der Lernphänotyp auf einem Mangel an Synapsin beruht. Die Expression von Synapsin im Pilzkörper der Mutante erlaubt der Fliege, wieder normal zu lernen; dies weist auf die Hinlänglichkeit von Synapsin im Pilzkörper für beide Arten von Lernen hin. In einem weiteren Projekt untersuche ich den Zusammenhang zwischen Wahrnehmung und Physiologie in erwachsenen Taufliegen. Ich benutze Duft-Schock-Konditionierungsexperimente, um basierend auf dem Verhalten der Tiere Ähnlichkeitsränge von Düften zu ermitteln, und finde eine einheitliche Rangfolge der untersuchten Düfte für verschiedene Generalisierungs- und Diskriminierungs-Aufgaben von unterschiedlichem Schwierigkeitsgrad. Schließlich erforsche ich in Kooperation mit T. Völler and A. Fiala, wie der Grad der Verhaltensähnlichkeit /-unähnlichkeit von Düften mit der Physiologie der Fliege in Beziehung steht. Ich kombiniere die Verhaltensdaten mit Daten, die mittels funktioneller Bildgebung unter Verwendung genetisch codierter Kalziumsensoren erhalten wurden. Diese Methode erlaubt, Aktivitätsmuster, die von den untersuchten Düften verursacht werden, entweder in den sensorischen Neuronen oder in den Projektionsneuronen des Antennallobus zu messen. Unsere Interpretation der Ergebnisse ist, dass die Verhaltensähnlichkeit der Düfte auf Ebene der Interneuronen im Antennallobus organisiert wird. Weiterhin erforsche ich die Wirkung von Kochsalz (Natriumchlorid) auf das Reflexverhalten und die Rolle von Natriumchlorid als Belohnung oder Bestrafung im Larvenlernen. Larven der Taufliege verändern ihr Reflexverhalten in Gegenwart von Natriumchlorid in hohem Maße. Larven bevorzugen niedrige Salzkonzentrationen gegenüber einem Substrat ohne Salz; erhöht man die Salzkonzentration jedoch, kehrt sich das Wahlverhalten ins Gegenteil um, bis die Tiere das salzhaltige Substrat stark vermeiden. Ein ähnlicher Zusammenhang zwischen Konzentration und Verhalten wird auch für das Fressverhalten gefunden: Larven fressen von einem Substrat mit niedrigen Salzkonzentrationen geringfügig mehr, von einem Substrat mit hohen Salzkonzentrationen jedoch deutlich weniger als von einem Kontrollsubstrat ganz ohne Salz. Was das Lernen betrifft, wirken relativ schwache Salzkonzentrationen als Belohnung, während hohe Salzkonzentrationen als Bestrafung wirken. Interessanterweise ist die Verhaltens-Konzentrations-Kurve von Reflexverhalten (Wahlverhalten, Fressverhalten) verglichen mit assoziativem Lernen in Richtung höherer Konzentrationen verschoben. Diese Dissoziation könnte eine verschiedenartige Sensitivität der Schaltkreise widerspiegeln. KW - Taufliege KW - Assoziatives Gedächtnis KW - Lernverhalten KW - Synapsine KW - Molekulargenetik KW - Drosophila melanogaster KW - olfaction KW - learning KW - memory KW - synapsin Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65035 ER - TY - JOUR A1 - Stoll, Sascha A1 - Feldhaar, Heike A1 - Fraunholz, Martin J. A1 - Gross, Roy T1 - Bacteriocyte dynamics during development of a holometabolous insect, the carpenter ant Camponotus floridanus N2 - Background: The carpenter ant Camponotus floridanus harbors obligate intracellular mutualistic bacteria (Blochmannia floridanus) in specialized cells, the bacteriocytes, intercalated in their midgut tissue. The diffuse distribution of bacteriocytes over the midgut tissue is in contrast to many other insects carrying endosymbionts in specialized tissues which are often connected to the midgut but form a distinct organ, the bacteriome. C.floridanus is a holometabolous insect which undergoes a complete metamorphosis. During pupal stages a complete restructuring of the inner organs including the digestive tract takes place. So far, nothing was known about maintenance of endosymbionts during this life stage of a holometabolous insect. It was shown previously that the number of Blochmannia increases strongly during metamorphosis. This implicates an important function of Blochmannia in this developmental phase during which the animals are metabolically very active but do not have access to external food resources. Previous experiments have shown a nutritional contribution of the bacteria to host metabolism by production of essential amino acids and urease-mediated nitrogen recycling. In adult hosts the symbiosis appears to degenerate with increasing age of the animals. Results: We investigated the distribution and dynamics of endosymbiotic bacteria and bacteriocytes at different stages during development of the animals from larva to imago by confocal laser scanning microscopy. The number of bacteriocytes in relation to symbiont-free midgut cells varied strongly over different developmental stages. Especially during metamorphosis the relative number of bacteria-filled bacteriocytes increased strongly when the larval midgut epithelium is shed. During this developmental stage the midgut itself became a huge symbiotic organ consisting almost exclusively of cells harboring bacteria. In fact, during this phase some bacteria were also found in midgut cells other than bacteriocytes indicating a cell-invasive capacity of Blochmannia. In adult animals the number of bacteriocytes generally decreased. Conclusions: During the life cycle of the animals the distribution of bacteriocytes and of Blochmannia endosymbionts is remarkably dynamic. Our data show how the endosymbiont is retained within the midgut tissue during metamorphosis thereby ensuring the maintenance of the intracellular endosymbiosis despite a massive reorganization of the midgut tissue. The transformation of the entire midgut into a symbiotic organ during pupal stages underscores the important role of Blochmannia for its host in particular during metamorphosis. KW - Camponotus floridanus KW - carpenter ant Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67950 ER - TY - JOUR A1 - Merget, Benjamin A1 - Wolf, Matthias T1 - A molecular phylogeny of Hypnales (Bryophyta) inferred from ITS2 sequence-structure data N2 - Background: Hypnales comprise over 50% of all pleurocarpous mosses. They provide a young radiation complicating phylogenetic analyses. To resolve the hypnalean phylogeny, it is necessary to use a phylogenetic marker providing highly variable features to resolve species on the one hand and conserved features enabling a backbone analysis on the other. Therefore we used highly variable internal transcribed spacer 2 (ITS2) sequences and conserved secondary structures, as deposited with the ITS2 Database, simultaneously. Findings: We built an accurate and in parts robustly resolved large scale phylogeny for 1,634 currently available hypnalean ITS2 sequence-structure pairs. Conclusions: Profile Neighbor-Joining revealed a possible hypnalean backbone, indicating that most of the hypnalean taxa classified as different moss families are polyphyletic assemblages awaiting taxonomic changes. KW - Moose KW - Hypnales KW - Bryophyta Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67997 ER - TY - JOUR A1 - Helmreich, Ernst J. M. T1 - Ways and means of coping with uncertainties of the relationship of the genetic blue print to protein structure and function in the cell N2 - As one of the disciplines of systems biology, proteomics is central to enabling the elucidation of protein function within the cell; furthermore, the question of how to deduce protein structure and function from the genetic readout has gained new significance. This problem is of particular relevance for proteins engaged in cell signalling. In dealing with this question, I shall critically comment on the reliability and predictability of transmission and translation of the genetic blue print into the phenotype, the protein. Based on this information, I will then evaluate the intentions and goals of today’s proteomics and gene-networking and appraise their chances of success. Some of the themes commented on in this publication are explored in greater detail with particular emphasis on the historical roots of concepts and techniques in my forthcoming book, published in German: Von Molekülen zu Zellen. 100 Jahre experimentelle Biologie. Betrachtungen eines Biochemikers KW - Genetik Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68006 ER - TY - JOUR A1 - Pinkert, Stefan A1 - Schultz, Joerg A1 - Reichardt, Joerg T1 - Protein Interaction Networks-More Than Mere Modules N2 - It is widely believed that the modular organization of cellular function is reflected in a modular structure of molecular networks. A common view is that a ‘‘module’’ in a network is a cohesively linked group of nodes, densely connected internally and sparsely interacting with the rest of the network. Many algorithms try to identify functional modules in protein-interaction networks (PIN) by searching for such cohesive groups of proteins. Here, we present an alternative approach independent of any prior definition of what actually constitutes a ‘‘module’’. In a self-consistent manner, proteins are grouped into ‘‘functional roles’’ if they interact in similar ways with other proteins according to their functional roles. Such grouping may well result in cohesive modules again, but only if the network structure actually supports this. We applied our method to the PIN from the Human Protein Reference Database (HPRD) and found that a representation of the network in terms of cohesive modules, at least on a global scale, does not optimally represent the network’s structure because it focuses on finding independent groups of proteins. In contrast, a decomposition into functional roles is able to depict the structure much better as it also takes into account the interdependencies between roles and even allows groupings based on the absence of interactions between proteins in the same functional role. This, for example, is the case for transmembrane proteins, which could never be recognized as a cohesive group of nodes in a PIN. When mapping experimental methods onto the groups, we identified profound differences in the coverage suggesting that our method is able to capture experimental bias in the data, too. For example yeast-two-hybrid data were highly overrepresented in one particular group. Thus, there is more structure in protein-interaction networks than cohesive modules alone and we believe this finding can significantly improve automated function prediction algorithms. KW - Netzwerk KW - protein-interaction networks Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68426 ER - TY - JOUR A1 - Herpin, Amaury A1 - Braasch, Ingo A1 - Kraeussling, Michael A1 - Schmidt, Cornelia A1 - Thoma, Eva C. A1 - Nakamura, Shuhei A1 - Tanaka, Minoru A1 - Schartl, Manfred T1 - Transcriptional Rewiring of the Sex Determining dmrt1 Gene Duplicate by Transposable Elements N2 - Control and coordination of eukaryotic gene expression rely on transcriptional and posttranscriptional regulatory networks. Evolutionary innovations and adaptations often require rapid changes of such networks. It has long been hypothesized that transposable elements (TE) might contribute to the rewiring of regulatory interactions. More recently it emerged that TEs might bring in ready-to-use transcription factor binding sites to create alterations to the promoters by which they were captured. A process where the gene regulatory architecture is of remarkable plasticity is sex determination. While the more downstream components of the sex determination cascades are evolutionary conserved, the master regulators can switch between groups of organisms even on the interspecies level or between populations. In the medaka fish (Oryzias latipes) a duplicated copy of dmrt1, designated dmrt1bY or DMY, on the Y chromosome was shown to be the master regulator of male development, similar to Sry in mammals. We found that the dmrt1bY gene has acquired a new feedback downregulation of its expression. Additionally, the autosomal dmrt1a gene is also able to regulate transcription of its duplicated paralog by binding to a unique target Dmrt1 site nested within the dmrt1bY proximal promoter region. We could trace back this novel regulatory element to a highly conserved sequence within a new type of TE that inserted into the upstream region of dmrt1bY shortly after the duplication event. Our data provide functional evidence for a role of TEs in transcriptional network rewiring for sub- and/or neo-functionalization of duplicated genes. In the particular case of dmrt1bY, this contributed to create new hierarchies of sex-determining genes. KW - Gen KW - dmrt1 KW - sex-determining gene Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68437 ER - TY - THES A1 - Grohmann, Constanze T1 - Termite mediated heterogeneity of soil and vegetation patternsin a semi‐arid savanna ecosystem in Namibia T1 - Einfluss von Termiten auf Vegetations- und Bodenmuster eines semi-ariden Savannenökosystems in Namibia N2 - Termites are the most important soil ecosystem engineers of semi‐arid and arid habitats. They enhance decomposition processes as well as the subsequent mineralisation of nutrients by bacteria and fungi. Through their construction of galleries, nests and mounds, they promote soil turnover and influence the distribution of nutrients and also alter texture and hydrological properties of soils, thereby affecting the heterogeneity of their ecosystem. The main aim of the present thesis was to define the impact of termites on ecosys‐tem functioning in a semi‐arid ecosystem. In a baseline study, I assessed the diversity of termite taxa in relation to the amount of precipitation, the vegetation patterns and the land use systems at several sites in Namibia. Subsequently, I focussed on a species that is highly abundant in many African savannas, the fungus growing and mound building species Macro‐termes michaelseni (Sjöstedt, 1914). I asked how this species influences the spatial hetero‐geneity of soil and vegetation patterns. From repeated samplings at 13 sites in Namibia, I obtained 17 termite taxa of 15 genera. While the type of land use seems to have a minor effect on the termite fauna, the mean annual precipitation explained 96% and the Simpson index of vascular plant diversity 81% of the variation in taxa diversity. The number of termite taxa increased with both of these explanation variables. In contrast to former studies on Macrotermes mounds in several regions of Africa that I reviewed, soil analyses from M. michaelseni mounds in the central Namibian savanna revealed that they contain much higher nitrogen contents when compared to their parent material. Further analyses revealed that nitrate forms a major component of the nitrogen content in termite mounds. As nitrate solves easily in water, evaporation processes are most probably responsible for the transport of solved nitrates to the mound surface and their accumulation there. The analysed mounds in central Namibia contained higher sand propor‐tions compared to the mounds of the former studies. Through the higher percentage of coarse and middle sized pores, water moves more easily in sandy soils compared to more clayey soils. In consequence, evaporation‐driven nitrate accumulation can occur in the studied mounds at high rates. Hochgerechnet auf den Gesamtumfang der Hügel bedeckte das pro Jahr von einem bewohnten Hügel erodierte Material theoretisch einen 1 m breiten Kreisring um den Schwemmkegel des Hügels 2,4 mm hoch. Der entsprechende Wert für unbewohnte Hügel betrug 1,0 mm. To assess the amount of soil that erodes from termite mounds, I fastened four strong, 65 cm wide plastic bags at 14 mounds each and collected the soil that eroded during five rainfall events. Projected to the total mound circumference, the amount of soil eroded covers theoretically a 1 m wide circular ring around the pediment of an inhabited mound up to a height of 2.4 mm per year. For uninhabited mounds, the height of this soil layer would be 1.0 mm. Per hectare, roughly 245 kg eroded per year from the mounds. However, as the erosion rate depends on several factors such as rainfall intensity, soil texture and point of time within the rainy season, this is only a vague estimate. In order to determine up to which distance the soil erosion from the mounds still influences the chemical characteristics of the adjacent topsoil, I took samples from depth of 0–10 cm at 1, 5 and 25 m distances, respectively, from four different mounds and from the mounds themselves. The non‐metric multidimensional scaling of the soil properties showed strong differences between mound and off‐mound samples. Soil characteristics within the samples from the mounds did not differ largely. Similarly, I found no strong differences between the samples taken from the different distances from the mound. From these results I conclude that through the construction of foraging galleries and sheetings (soil constructions with which some termite species cover their food items), the soil eroding from termite mounds is quickly mixed with deeper soil layers. In consequence, mound material does not accumulate in the mound’s vicinity. In order to reveal how plant growth is influenced by termite mound material, we assessed the number of grass and herb individuals as well as the biomass of plants growing in situ on the base of mounds compared to adjacent sites. While the numbers of both grass and herb individuals were significantly lower compared to adjacent sites, the total biomass of plants growing on the base of mounds was significantly higher. Reverse results were obtained by pot experiments with radish (Raphanus sativus subsp. sativus) and sorghum (Sorghum sp.) growth. Both species grew significantly weaker on mound soil compared to adjacent soil. The contradictory results concerning the biomass of in situ and pot experi‐ments are most probably caused by the disturbance of the original soil structure during the potting process. The material was subsequently compacted through watering the plants. In contrast, Macrotermes mounds are pervaded by many macropores which seem to be essential for the plant roots to penetrate the soil. In the last part of this thesis, I posed the question how mounds of M. michaelseni are distributed and what factors might be responsible for this pattern. Former studies showed that mound size is correlated with the size of its inhabiting colony. With several multi‐scale analyses, I revealed that larger inhabited mounds were regularly distributed. Additionally, mounds which were closer together tended to be smaller than on average. This indicates that intraspecific competition controls the distribution and size of colonies and their mounds. Former studies concerning Odontotermes mounds substantiated that they are local hotspots of primary productivity and animal abundance. Based on these findings, simulations revealed that a regular distribution of these mounds leads to a greater ecosystem‐wide productivity compared to a random arrangement. As in the present study, plant biomass was higher at the mounds compared to off‐mound sites, this might hold true for M. michaelseni mounds. From the results of this thesis, I draw the conclusion that through their mound building activities, M. michaelseni strongly influences the distribution patterns of soil nutrients within the central Namibian savanna. These termites create sharp contrasts in nutrient levels and vegetation patterns between mound soils and off‐mound soils and enhance the heterogeneity of their habitats. Former studies revealed that habitat hetero‐geneity is important in generating species diversity and species richness in turn is correlated positively with biomass production and positively affects ecosystem services. In conclusion, the present thesis underlines the importance of M. michaelseni for ecosystem functioning of the central Namibian savanna. N2 - Termiten sind die bedeutendsten Ökosystem‐Ingenieure in den Böden arider und semi‐arider Gebiete. Sie beschleunigen Zersetzungsprozesse und damit auch die nachfolgende Mineralisation von Nährstoffen durch Bakterien und Pilze. Durch den Bau ihrer Galerien, Nester und Hügel fördern sie die Umwälzung des Bodens und beeinflussen die Nährstoffver‐teilung, die Textur sowie die hydrologischen Eigenschaften der Böden. Durch diese Prozesse erhöhen sie die Heterogenität in den von ihnen bewohnten Ökosystemen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich vorrangig mit dem Einfluss von Termiten auf Ökosystemfunktionen eines semi‐ariden Ökosystems. Als Grundlage dazu habe ich die Diver‐sität von Termitentaxa und ihre Abhängigkeit von Niederschlagsmenge, Vegetationsmustern und Landnutzungssystemen auf verschiedenen Untersuchungsflächen in Namibia bestimmt. In dem darauffolgenden Teil der Arbeit habe ich mich auf die pilzzüchtende und hügel bauende Art Macrotermes michaelseni (Sjöstedt, 1914) konzentriert, eine Art, die in vielen afrikanischen Savannen in hoher Abundanz vorkommt. Ich habe mich damit beschäftigt, wie diese Art die räumliche Heterogenität von Böden und Vegetationsmustern beeinflusst. Durch wiederholtes Sammeln an 13 verschiedenen Untersuchungsgebieten in Namibia konnte ich 17 Termitentaxa aus 15 Gattungen erfassen. Während die Landnutzung einen unwesentlichen Einfluss auf die Termitenfauna hatte, konnte die Variation in der Taxa‐diversität zu 96% durch den mittleren jährlichen Niederschlag erklärt werden und zu 81% durch den Simpson‐Diversitäts‐Index der Gefäßpflanzen. Die Anzahl der Termitentaxa nahm mit diesen beiden Variablen zu. Im Gegensatz zu vorherigen Studien an Macrotermes Hügeln in verschiedenen Regionen Afrikas, enthielten Bodenproben der untersuchten Hügel in der zentralen namibi‐schen Savanne viel höhere Stickstoffgehalte im Vergleich zum Ausgangsmaterial. Weitere Analysen ergaben, dass der hohe Stickstoffgehalt in dem Hügelmaterial vor allem auf Nitrat zurückzuführen ist. Da Nitrat leicht wasserlöslich ist, gelangt es wahrscheinlich durch von Evaporation angetriebene Wasserbewegungen an die Hügeloberfläche und reichert sich dort an. Die untersuchten Termitenhügel in Namibia enthielten zudem höhere Sandgehalte im Vergleich zu den Hügeln der von mir ausgewerteten vorherigen Studien. Durch den höheren Anteil von Grob‐ und Mittelporen kann sich Wasser in sandigen Böden schneller bewegen als in tonigen Böden. Dadurch bedingt können in den untersuchten Hügeln Evaporation und Nitratakkumulation in hohen Raten erfolgen. Um die Menge des von den Termitenhügeln erodierenden Materials zu ermitteln, habe ich jeweils vier stabile, 65 cm breite Plastikbeutel an 14 Hügeln befestigt und mit diesen das Bodenmaterial aufgesammelt, das während fünf Regenereignissen von den Hügeln abgeschwemmt wurde. Hochgerechnet auf den Gesamtumfang der Hügel bedeckte das pro Jahr von einem bewohnten Hügel erodierte Material theoretisch einen 1 m breiten Kreisring um den Schwemmkegel des Hügels 2,4 mm hoch. Der entsprechende Wert für unbewohnte Hügel betrug 1,0 mm. Projiziert auf eine Fläche von einen Hektar erodierten insgesamt etwa 245 kg Hügelmaterial pro Jahr. Dabei muss berücksichtigt werden, dass dies nur eine ganz grobe Schätzung ist, da die Erosionsrate von verschiedenen Faktoren wie der Regenintensität, der Körnung des Bodens und des Zeitpunkts innerhalb der Regensaison abhängt. Um zu erfassen, bis zu welcher Distanz der erodierte Boden die chemische Zusammensetzung des Umgebungsbodens beeinflusst, habe ich aus jeweils 0–10 cm Tiefe Proben in 1, 5 und 25 m Entfernung sowie als Kontrolle von den Hügeln selbst genommen. Mit Hilfe nichtmetrischer multidimensionaler Skalierung konnte ich zeigen, dass sich die Bodeneigenschaften des Hügelmaterials stark von denen des Umgebungsbodens unter‐schieden. Innerhalb der Hügelproben variierten die Bodeneigenschaften nur gering. Ebenso konnte ich zwischen den Proben, die aus den drei Entfernungen stammten, keine starken Unterschiede feststellen. Aus diesen Ergebnissen schlussfolgere ich, dass der von den Termitenhügeln erodierende Boden sich durch den Bau von unterirdischen Gängen und „sheetings“ (Konstruktionen aus Bodenmaterial, mit denen einige Termitenarten ihre Nahrungsstücke umziehen) schnell mit tieferen Bodenschichten mischt. Infolgedessen sammelt sich das Hügelmaterial nicht in der näheren Umgebung des Hügels an. Um herauszufinden, wie das Pflanzenwachstum durch Termitenhügelmaterial beein‐flusst wird, haben wir die Anzahl und Biomasse von Gräsern und Kräutern erhoben, die in situ an der Basis von Hügel wuchsen. Während die Individuenzahl der Gräser und die der Kräuter signifikant geringer waren, war die Gesamtbiomasse der Pflanzen, die an der Hügel‐basis wuchsen, signifikant höher im Vergleich zu benachbarten Flächen. Umgekehrte Ergeb‐nisse wurden durch Versuche erzielt, bei denen Radieschen (Raphanus sativus subsp. sativus) und Sorghum (Sorghum sp.) Pflanzen in Folientöpfen herangezogen wurden. Beide Arten wuchsen signifikant schlechter auf Hügelerde im Vergleich zu Umgebungsboden. Die widersprüchlichen Ergebnisse im Bezug auf die Biomasse der in situ‐ und Wachstums‐Experimente werden wahrscheinlich durch die Zerstörung der ursprünglichen Bodenstruktur während des Umfüllens der Erde in die Folientöpfe verursacht. Zudem verstärkte das Gießen der Pflanzen die Verdichtung des Materials. Im Gegensatz dazu sind Macrotermes Hügel von vielen Makroporen durchzogen, die für die Durchwurzelung der komprimierten Böden essentiell zu sein scheinen. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit befasse ich mich mit der Frage, wie M. michaelseni Bauten verteilt sind und welche Faktoren dafür verantwortlich sind. Frühere Stu‐dien haben gezeigt, dass die Hügelgröße mit der Größe der Kolonie korreliert ist, die den jeweiligen Hügel bewohnt. Mit verschiedenen Mehrskalenverfahren konnte ich darlegen, dass größere bewohnte Hügel regulär verteilt waren. Außerdem waren Hügel, die enger zusammen standen, kleiner als der Durchschnitt der Hügel. Dieses deutet darauf hin, dass intraspezifische Konkurrenz die Verteilung und Größe der Hügel und deren Kolonien regu‐liert. Frühere Studien an Odontotermes Hügeln haben gezeigt, dass diese lokale Zentren der Primärproduktion und der Abundanz von Tieren sind. Mit darauf basierenden Simulationen konnte nachgewiesen werden, dass eine reguläre Verteilung von Hügeln im Vergleich zu einer zufälligen Anordnung zu einer größeren Gesamtproduktivität des Ökosystems führt. Da in der vorliegenden Arbeit die Pflanzenbiomasse an den Hügeln höher war als an benachbar‐ten Stellen, könnte dieses auch für M. michaelseni Hügel zutreffen. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit ziehe ich die Schlussfolgerung, dass M. michaelseni durch ihre Hügelbauaktivitäten die Verteilungsmuster von Bodennährstoffen in der zentra‐len namibischen Savanne stark beeinflusst. Die Termiten erzeugen deutliche Kontraste in Bezug auf Nährstoffgehalt und Vegetationsmuster zwischen Hügelboden und benachbarten Stellen und erhöhen so die Heterogenität ihrer Habitate. Von früheren Studien ist bekannt, dass Habitatheterogenität eine hohe Artendiversität erzeugt. Eine hohe Diversität wiederum ist mit der Biomasseproduktion positiv korreliert und hat einen positiven Einfluss auf Öko‐systemdienstleistungen. Schlussendlich unterstreicht die vorliegende Arbeit die Bedeutung von M. michaelseni für Ökosystemfunktionen in der Savanne Zentralnamibias. KW - Termiten KW - Namibia KW - Vegetation KW - Boden KW - Termiten KW - Bodeneigenschaften KW - Bodenheterogenität KW - termites KW - soil heterogeneity KW - Namibia Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54318 ER - TY - THES A1 - Krumbholz, Grit T1 - Untersuchungen zur Struktur, Regulation und Funktion des nichtribosomalen Peptid-Polyketids Colibactin aus E. coli T1 - Examination of structure, regulation, and function of the non-ribosomal peptide-polyketide colibactin in E. coli N2 - Polyketide (PK) und nichtribosomale Peptide (NRP) sind zwei grosse Klassen von Naturstoffen, die eine grosse Vielfalt hinsichtlich ihrer Struktur und Funktion aufweisen. Sie werden von einer Reihe von Bakterien, Pilzen und Pflanzen als Sekundärmetabolite produziert und besitzen eine Vielzahl pharmakologisch wichtiger Aktivitäten, wie z.B. antimikrobielle, antimykotische, antitumorale oder antiparasitische Wirkungen. Ein Grossteil der bakteriellen Produzenten findet sich im Phylum Firmicutes, innerhalb der Gattungen Bacillus, Streptomyces und Mycobacterium. In E. coli sind Polyketide und nichtribosomale Proteine von eher geringer Bedeutung, mit Ausnahme der Siderophore Enterobactin und Yersiniabactin. Unerwartet war daher die Identifizierung eines neuen PKS/ NRPS-Gencluster in verschiedenen E. coli-Stämmen. Das 2006 durch NOUGAYRÈDE et al. zuerst beschriebene Colibactin-Gencluster kodiert für ein hybrides System aus modularen Polyketidsynthasen und nichtribosomalen Peptidsynthetasen sowie für zusätzliche editierende Enzyme und einen möglichen transkriptionellen Regulator (ClbR). Das Produkt der PKS/NRPS-Synthasen, Colibactin, übt in vitro einen zytopathischen Effekt (CPE) auf Säugerzelllinien aus. Die zytopathische Aktivität Colibactins zeichnet sich u.a. durch die Induktion von Doppelstrangbrüchen in der DNA der eukaryotischen Zellen aus. Darüber hinaus kommt es zu einer Unterbrechung des Zellzyklus in der G2-Phase nach einer transienten in vitro Infektion mit Colibactin-positiven Bakterienstämmen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit war besonders die weitere Aufklärung der Struktur des Colibactinclusters sowie die regulatorischen Mechanismen, die die Exression des hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids von Interesse. Eine Transkriptionsanalyse führte zur Identifizierung der Transkriptionsstartpunkte der meisten relevanten Gene des Colibactinclusters. Basierend auf diesen neugewonnenen Informationen war eine Sequenzanalyse der upstream-Bereiche der Gene möglich, in deren Ergebnis neben den Elementen eines Sigma70-abhängigen Promotors, putative Bindestellen für mehrere Transkriptionsfaktoren identifiziert wurden. Untersuchungen zur Regulation der Colibactinsynthese zeigten, dass die Expression der Colibactin-Gene sowohl unter Kontrolle des Transkriptionsfaktors H-NS als auch des Colibactin-spezifischen Regulators ClbR stehen. Neben der Aufklärung der Struktur und Regulation der Colibactin-Gene bestand das Ziel dieser Arbeit in der Optimierung der Synthese des nichtribosomalen Peptid-Polyketids. Hierfür durchgeführte Expressionstudien zeigten einen Einfluss von Fettsäuren und Indol sowie von der Sauerstoffverfügbarkeit auf die Promotoraktivität einzelner Gene des Colibactin-Genclusters. Darüberhinaus konnte das pks-Genclusters erfolgreich in Pseudomonas putida KT2440 transferiert werden sowie der Nachweis der Funktionsfähigkeit Colibactins in diesem Wirtsorganismus nachgewiesen werden. Wenngleich die Stabilität des für diesen Zweck konstruierten Shuttle-Vektors nicht von Dauer ist, konnte gezeigt werden dass Pseudomonas putida prinzipiell als Wirtssystem für die Realisierbarkeit der heterologen Expression von Colibactin, geeignet ist. Zusätzlich zur Strukturanalyse des pks-Clusters und den Studien zur Expression der Colibactin-Gene befasste sich die hier vorliegende Arbeit mit der Fragestellung nach der biologischen Funktion Colibactins. Phänotypische Untersuchungen zeigen sowohl eine Beeinflussung der Eisenaufnahme als auch der Biofilmbildung durch das nichtribosomale Peptid-Polyketid. Dies sind die ersten Hinweise die zur Aufklärung der Funktion Colibactins beitragen könnten. N2 - Polyketides (PK) and nonribosomal peptides (NRP) are two large classes of natural products showing a great variety in structure and function. They are produced as secondary metabolites by a range of bacteria, fungi and plants and exhibit a wealth of pharmacologically important activities, including antimicrobial, antifungal, antitumor or antiparasitic properties. The vast majority of bacterial producers belong to the phylum Firmicutes, especially to the genera Bacillus, Streptomyces and Mycobacterium. With the exception of the siderophores enterobactin and yersiniabactin polyketides and nonribosomal peptides are of minor relevance within E. coli. Therefore unexpected was the identification of a new PKS/ NRPS gene cluster in several E. coli strains. The colibactin gene cluster being described for the first time in 2006 by NOUGAYRÈDE et al. is coding for a hybrid system of modular polyketide synthases and nonribosomal petid synthetases as well as editing enzymes and a putative transcriptional regulator (ClbR). The product of these PKS/ NRPS synthases, termed colibactin, induces in vitro a cytopathic effect (CPE) on mammalian cell lines. The cytopathic activity of colibactin is characterized by the induction of double strand breaks in the DNA of eukaryotic cells as well as the arrest of the cell cycle in G2 phase after transient infection with E. coli strains expressing colibactin. In context of this thesis especially the elucidation of the regulation of clb operon transcription and the organisation of transcriptional units within the colibactin-encoding genomic island were of main interest. A transcriptional analysis led to the identification of the transcriptional starting points of most of the relevant genes within the colibactin cluster. Based on these newly obtained information it was possible to perform a sequence analysis of the upstream regions of the genes resulting in the detection of sigma70 depending promoter elements and several putative transcription factor binding sites. Studies on the regulation of the colibactin synthesis could also demonstrate that the expression of colibactin genes are under control of the transcription factor H-NS as well as the colibactin specific regulator ClbR. Beside the studies concerning the structure and regulation of colibactin genes optimization of the nonribosomal peptid-polyketid was object of this work. Therefor performed expression analysis showed an influence of fatty acids and indole, as well as the oxygen availability on the promoter activities of single genes within the colibactin gencluster. Further investigations belonging the transcriptome and the proteome of the Colibactin expressing strain E. coli Nissle 1917 showed an over all influence of Colibactin synthesis on the amino acid and carbohydrate metabolism of this strain. Further more a successful transfer of the pks gene cluster into Pseudomonas putida KT2440 was carried out as well as the demonstration of functionality of colibactin in this host organism. Even though long term stability of the constructed shuttle vector was not given it was shown that Pseudomonas putida is a suitable host for realizing the heterologous expression of colibactin. Additionally to the structural analysis of the pks cluster and the studies on expression of the colibatin genes this thesis questioned on the biological function of Colibactin. Phenotypical examination showed an influence of the iron upake as well as on biofilm formation due to the nonribosomal peptid – polyketide. These are the first evidences that could contribute the elucidation of Colibactin function. KW - Polyketid-Synthasen KW - Escherichia coli KW - polyketide synthases KW - Escherichia coli Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64789 ER - TY - THES A1 - Salditt, Andreas T1 - Bedeutung des ESCRT-Systems für die Partikelfreisetzung von Masernviren T1 - Impact of the ESCRT-System on Measles virus particle release N2 - Die Matrix-Proteine von Vertretern der Ordnung Mononegavirales sind essentiell für späte Schritte im viralen Lebenszyklus, insbesondere der Knospung und Partikelmorphogenese. Die Abschnürung und Freisetzung umhüllter RNA-Viren ist dabei abhängig von dem Transport des viralen Matrix-Proteins und seiner Interaktion mit Wirtsproteinen wie dem ESCRT-System (endosomal sorting complex required for transport), welches in die Sortierung zellulärer Proteine involviert ist. Im Verlauf der Masernvirus (MV)-Infektion interagiert das M-Protein einerseits mit dem viralen Nukleoproteinkomplex und andererseits mit den viralen Glykoproteinen an der Oberfläche. Die Bedeutung des MV-M-Proteins für die Partikelproduktion und sein intrazellulärer Transport wurden bislang kaum untersucht. Bisher ist nur bekannt, dass das M-Protein oligomerisiert, teilweise monoubiquitiniert vorliegt und in Zellen, wenn alleine exprimiert, die Produktion von Virus-like-particle (VLP) vermittelt (Pohl et al., 2007). In dieser Studie wird gezeigt, dass das MV-M-Protein ähnlich wie das VP40-Protein des Ebolavirus (EBOV) mit Lipid Rafts und TEMs (tetraspanin enriched microdomain) assoziiert ist, wobei aber das M-Protein weniger effizient an der Plasmamembran akkumuliert. Beide Proteine unterscheiden sich nicht wesentlich in ihrer Assoziation mit Kompartimentmarkern. Interessant ist jedoch, dass das VP40-Protein und das M-Protein an der Plasmamembran mit dem Adaptor Protein-3 (AP-3) kolokalisieren. Die Kolokalisation des M-Proteins mit AP-3 wird aber nur in infizierten Zellen und nicht in Zellen, in denen das M-Protein allein exprimiert wird, beobachtet. Im Gegensatz zum VP40-Protein, welches die ESCRT-Komponenten über seine N-terminale L-Domäne rekrutiert und diese für die Partikelproduktion benutzt, geschieht dies beim M-Protein ESCRT-unabhängig, da die Mutation der Motive, die Ähnlichkeiten zu den bekannten L-Domänen zeigen, keine Auswirkungen auf die VLP-Produktion haben. Zudem rekrutierte das M-Protein weder Tsg101, Aip-1 oder Vps4 an die Plasmamembran, noch wird die VLP- oder die Virusproduktion durch dominant negatives Vps4 inhibiert. Der Transfer der VP40 L-Domäne in das MV-M-Protein hatte weder einen Einfluss auf die Assoziation mit Tetraspaninen noch auf die ESCRT-Abhängigkeit der VLP-Produktion. Damit wurde gezeigt, dass die VLP-Freisetzung des MV-M-Proteins ESCRT-unabhängig ist. Die Freisetzung erfolgt beim MV durch einen grundsätzlich anderen Weg, der noch untersucht werden muss. N2 - The matrix proteins of the order Mononegarivales are essential for late steps in the viral life cycle, especially for budding process and viral morphogenesis. Budding and release of enveloped RNA-viruses depend on transport of the viral matrix protein and its interaction with host proteins, which are involved in sorting of cellular proteins, e.g. the ESCRT system. During the course of measles virus infection, the M-protein interacts with the viral nucleocapsid-complex and the viral glycoproteins. The impact of MV-M-protein for the particle production and intracellular transport is barely known yet. So far, it has been shown that the M-protein forms oligomers, is partially mono-ubiquinated and has the capability to promote VLP-production. In this study it could be shown that the MV-M-protein and EBOV-VP40-protein associate with detergent-resistant and tetraspanin-enriched microdomains. However, compared to the VP40-protein the M-protein accumulates less efficiently at the plasma membrane. Both proteins do not essentially vary in their association with compartment markers. Interestingly, VP40- and M-protein, the latter only when expressed in the context of MV infection (but not from plasmid), efficiently co-localised with adaptor protein 3 (AP-3) at the plasma membrane indicating its importance for membrane targeting. In contrast to VP40, which recruits ESCRT components via its N-terminal late (L) domain and exploits them for particle production, M-protein promotes particle production independently of this pathway since 1) ablation of motifs bearing similarity to canonical L domains did not affect VLP production, 2) it did not redistribute Tsg101, AIP-1, or Vps4 to the plasma membrane, and 3) neither VLP nor infectious virus production were sensitive to inhibition by dominant negative Vps4. In addition, transfer of the VP40 L domain into the MV-M-protein did not alter trafficking or ESCRT dependence for VLP production to that of VP40 suggesting that budding activity of MV-M-protein follows an ESCRT independent pathway. KW - Masernvirus KW - Matrixproteine KW - Assembly KW - Matrix-Protein KW - ESCRT-System KW - Measles Virus release KW - ESCRT Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48317 ER - TY - THES A1 - Deuchert, Thomas T1 - Entwicklung eines experimentellen Systems zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierung der Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase T1 - Development of a experimental system for the investigation of the subcellular localisation of alpha-methylacyl-CoA racemase N2 - Entwicklung eines experimentellen Systems zur Untersuchung der subzellulärenLokalisierung der Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase (AMACR) (Methode der retroviralen Transfektion von transformierten, embryonalen Mausfibroblasten) N2 - Development of a experimental system for the investigation of the subcellular localisation of alpha-methylacyl-CoA racemase (amacr) (retroviral transfection of mouse fibroblasts) KW - Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase KW - Peroxisom KW - AMACR KW - Racemase KW - Transfektion KW - localisation KW - amacr KW - racemase Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46495 ER - TY - THES A1 - Worschech, Andrea T1 - Oncolytic Therapy with Vaccinia Virus GLV-1h68 - Comparative Microarray Analysis of Infected Xenografts and Human Tumor Cell Lines - T1 - Onkolytische Therapy mit Vaccinia Virus GLV-1h68 - Vergleichende Mikroarray Analyse von infizierten Xenografts und humanen Tumorzelllinien - N2 - Aim of this thesis was to study the contribution of the hosts immune system during tumor regression. A wild-type rejection model was studied in which tumor regression is mediated through an adaptive, T cell host response (Research article 1). Additionally, the relationship between VACV infection and cancer rejection was assessed by applying organism-specific microarray platforms to infected and non-infected xenografts. It could be shown that tumor rejection in this nude mouse model was orchestrated solely by the hosts innate immune system without help of the adaptive immunity. In a third study the inflammatory baseline status of 75 human cancer cell lines was tested in vitro which was correlated with the susceptibility to VACV and Adenovirus 5 (Ad5) replication of the respective cell line (Manuscript for Research article 3). Although xenografts by themselves lack the ability to signal danger and do not provide sufficient proinflammatory signals to induce acute inflammation, the presence of viral replication in the oncolytic xenograft model provides the "tissue-specific trigger" that activates the immune response and in concordance with the hypothesis, the ICR is activated when chronic inflammation is switched into an acute one. Thus, in conditions in which a switch from a chronic to an acute inflammatory process can be induced by other factors like the immune-stimulation induced by the presence of a virus in the target tissue, adaptive immune responses may not be necessary and immune-mediated rejection can occur without the assistance of T or B cells. However, in the regression study using neu expressing MMC in absence of a stimulus such as a virus and infected cancer cells thereafter, adaptive immunity is needed to provoke the switch into an acute inflammation and initiate tissue rejection. Taken together, this work is supportive of the hypothesis that the mechanisms prompting TSD differ among immune pathologies but the effect phase converges and central molecules can be detected over and over every time TSD occurs. It could be shown that in presence of a trigger such as infection with VACV and functional danger signaling pathways of the infected tumor cells, innate immunity is sufficient to orchestrate rejection of manifested tumors. N2 - Ziel dieser Arbeit war, die Beteiligung des Wirts-eigenen Immunsystems bei der Tumoregression zu analysieren. Mittels eines Wildtyp-Regressionsmodells, wurde der Anteil des adaptiven Immunsystems studiert (Research-Artikel 1). Mit Hilfe von Organismus-spezifischen Mikroarrays und Genexpressionsanalysen konnte in einem Nacktmausmodell gezeigt werden, dass erfolgreiche, durch onkolytische VACV-vermittelte Tumortherapie auch ohne Beteiligung des adaptiven Immunsystems möglich ist (Research Artikel 2). In einer dritten Studie wurden 75 humane Tumorzelllinien auf ihren intrinsischen Entzündungsstatus hin getestet und bezüglich eines Zusammenhanges von diesem mit der Replikationsfähigkeit von VACV und Adenovirus 5 (Ad5) analysiert (Manuskript für den Research-Artikel 3). Obwohl Xenografts allein kein ausreichendes „Gefahrsignal“ geben und durch das Fehlen einer pro-inflammatorischen Stimulierung keine akute Entzündung verursachen können, ist die Infektion mit onkolytischem VACV ausreichend, um den Gewebe-spezifischen „Trigger“ darzustellen. In diesem Fall wird die Immunantwort aktiviert und nach der Hypothese des „Immunologic Constant of Rejection“ (ICR) geschieht dies, wenn eine chronische in eine akute Inflammation verändert wird. In dem beschriebenen onkolytischen Regressionsmodell ist die Präsenz des Virus ausreichend, um das Immunsystem zu aktivieren, d.h. die chronische Entzündung im Tumor in eine akute umzuwandeln. Dabei ist die adaptive Immunität mit T- und B-Zell-Aktivierung nicht notwendig für die Rückbildung des Tumors. In Abwesenheit eines solchen Stimulus, wie in der ersten Studie mit neu-exprimierenden MMCs, wird die Spezifität der adaptiven Immunantwort benötigt, um die akute Inflammation anzustoßen und die Tumorregression voranzutreiben. Zusammengefasst unterstützt diese Arbeit die Hypothese, dass die Mechanismen, die zu „tissue specific destruction“ (TSD) führen, in verschiedenen immunologischen Erkrankungen zwar divergieren, der Effektor-Mechanismus aber stets der Gleiche ist. Es zeigte sich, dass in Anwesenheit eines „triggers“, wie z.B. der VACV-Infektion und intakten „danger signaling pathways“ der Tumorzellen, die angeborene Immunität allein ausreicht, um die Tumorrückbildung zu vermitteln. KW - Tumorimmunologie KW - Tumor KW - Vaccinia-Virus KW - Interferon KW - Interferon Regulator Faktor 1 KW - Tumorregression KW - HT-29 KW - GI-101A KW - tissue-specific destruction Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45338 ER - TY - THES A1 - Mueller, Felicitas T1 - Analysis of the factor XII-driven contact system activation in vivo T1 - Charakterisierung der Faktor XII-vermittelten Aktivierung des Kontaktsystemsin vivo N2 - Platelets play a central role in thrombosis, hemostasis, and inflammation. Here, we show that activated platelets release inorganic polyphosphate (polyP), a polymer of 60- 100 phosphate residues that directly bound to and activated the plasma protease factor XII. PolyP-driven factor XII-activation triggered release of the inflammatory mediator bradykinin by plasma kallikrein-mediated kininogen processing. PolyP increased vascular permeability and induced fluid extravasation in skin microvessels of mice. Mice deficient in factor XII or bradykinin receptors were resistant to polyP-induced leakage. PolyP initiated clotting of plasma via the contact pathway. Ablation of intrinsic coagulation pathway proteases factor XII and factor XI protected mice from polyPtriggered lethal pulmonary embolism. Targeting polyP with phosphatases interfered with procoagulant activity of activated platelets and blocked platelet-induced thrombosis in mice. Infusion of polyP restored defective plasma clotting of Hermansky- Pudlak Syndrome patients, which lack platelet polyP. The data identify polyP as a new class of mediator having fundamental roles in platelet-driven proinflammatory and procoagulant disorders. N2 - Thrombozyten spielen eine zentrale Rolle bei Thrombose, Hämostase und Entzündungsprozessen. Wir zeigen, dass aktivierte Thrombozyten Polyphosphate (polyP) mit einer Kettenlänge von 60-100 Phosphatuntereinheiten sekretieren. PolyP binden und aktivieren die Serinprotease Faktor XII. PolyP-induzierte Faktor XIIAktivierung führt über Kallikrein zur Freisetzung des Entzündungsmediators Bradykinin aus seinem Vorläufermolekül, dem hochmolekularen Kininogen. In einem Ödem- Modell zeigen wir, dass polyP die Gefäßpermeabilität in der Rückenhaut von Wildtyp- Mäusen erhöhen. Faktor XII- oder Bradykinin B2 Rezeptor-defiziente Tiere waren vor polyP-induzierter Ödembildung geschützt. PolyP aktivieren die intrinsische Blutgerinnungskaskade im Plasma. In einem polyP-vermittelten lethalen Lungenemboliemodell waren Faktor XII- und Faktor XI-defiziente Mäuse im Gegensatz zu Wildtyp Tieren geschützt. Behandlung mit Phosphatase hebt die prokoagulante Aktivität stimulierter Thrombozyten auf und blockiert die Plättchen-induzierte Thrombusbildung in Mäusen. PolyP normalisieren die verlängerte Blutgerinnungszeit von Hermansky-Pudlack Patienten. Die Daten zeigen, dass es sich bei polyP um eine neue Klasse von Mediatoren mit prokoagulanten und proinflammtorischen Eigenschaften handelt. KW - Blutstillung KW - Thrombosis KW - Haemostasis KW - Polyphosphate KW - Blutstillung Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46071 ER - TY - THES A1 - von Hayn, Kathrin T1 - Untersuchungen zur Ca2+-abhängigen Regulation von cAMP in intakten vaskulären Myocyten T1 - Analysis of the Ca2+-dependent regulation of cAMP in intact vascular smooth muscle cells N2 - Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben können und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellulären Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgelöst. Durch eine zusätzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten darüber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. Während ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen Rückgang der intrazellulären cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die Überexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivitäts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen Rückgang der Cyclaseaktivität nach Zugabe von 2 und 5 μM freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte Änderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so lässt sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte Rückgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei für die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells könnten in Zukunft cAMP-Änderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, für den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgeführt und agonistinduzierte cAMP-Änderungen beobachtet werden. N2 - Regulation of smooth muscle tone is crucially determined by the antangonistic second messengers cAMP and Ca2+. One aim of this work was to investigate, if these two mediators can also affect each other directly and which enzymes take part in these processes. For observing cAMP signals in living cells with a temporally high resolution, we used the fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based cAMP sensor Epac1-camps. For monitoring changes in intracellular Ca2+, cells were labeled with Fura-2. Rises in intracellular Ca2+ were achieved by activation of on vascular smooth muscle cells (VSMCs) endogenously expressed Gq-coupled P2Y6 receptors with uridine diphosphate (UDP). Additional, in-vitro calibration of the Epac1-camps allowed the calculation of absolute cAMP concentrations in single living cells. An increase of Ca2+ concentrations in non-prestimulated VSMCs did not significantly influence intracellular cAMP concentrations. Activation of purinergic receptors of isoproterenol-prestimulated cells with UDP provoked a clear decrease of intracellular cAMP concentrations. This effect was blocked by the complexation of Ca2+ with BAPTA-AM as well as by overexpression of Ca2+-insensitive AC4. Furthermore, adenylyl cyclase activity assays in the presence of 2 and 5 μM free Ca2+ in VSMC membranes showed a decline in cyclase activity. Inhibition of PDE1, the only Ca2+-dependent phosphodiesterase (PDE), with the selective PDE1 inhibitor 8-methoxymethy-IBMX, in contrast, had no effect on UDP-evoked changes in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. Finally, knockdown of Ca2+-inhibitable AC5 and 6 with siRNA significantly inhibited the UDP-evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. To merge all these results, one can draw the following conclusion: The purinergically evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs is caused by an inhibition of AC5 and 6 which is mediated by Ca2+. This mechanism interlinks two essential antagonistic signaling pathways for the regulation of smooth muscle tone. An additional part of this work was to develop a transgenic mouse model, which expresses smooth-muscle-specifically Epac1-camps. In the future, these animals could provide the possibility to observe cAMP signals in intact tissues or even in living animals. With the help of the Cre-loxP recombination system, we achieved to generate such a smooth-muscle-specific transgene. Afterwards FRET measurements in isolated vascular smooth muscle cells of these animals were possible and we were also able to observe agonist-induced cAMP changes in these isolated cells. KW - Glatte Muskulatur KW - Cyclo-AMP KW - Calcium KW - Calcium KW - cAMP KW - vaskuläre glatte Muskelzellen KW - FRET KW - calcium KW - cAMP KW - vascular smooth muscle cells KW - FRET Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47709 ER - TY - THES A1 - Fischer, Andreas T1 - The Role of Protein-Protein Interactions in the Activation Cycle of RAF Kinases T1 - Die Rolle von Protein-Protein Interaktionen im Aktivierungszyklus der RAF Kinasen N2 - Members of the RAF protein kinase family are key regulators of diverse cellular processes. The need for isoform-specific regulation is reflected by the fact that all RAFs not only display a different degree of activity but also perform isoform-specific functions at diverse cellular compartments. Protein-protein-interactions and phosphorylation events are essential for the signal propagation along the Ras-RAF-MEK-ERK cascade. More than 40 interaction partners of RAF kinases have been described so far. Two of the most important regulators of RAF activity, namely Ras and 14-3-3 proteins, are subject of this work. So far, coupling of RAF with its upstream modulator protein Ras has only been investigated using truncated versions of RAF and regardless of the lipidation status of Ras. We quantitatively analyzed the binding properties of full-length B- and C-RAF to farnesylated H-Ras in presence and absence of membrane lipids. While the isolated Ras-binding domain of RAF exhibit a high binding affinity to both, farnesylated and nonfarnesylated H-Ras, the full-length RAF kinases demonstrate crucial differences in their affinity to Ras. In contrast to C-RAF that requires carboxyterminal farnesylated H-Ras for interaction at the plasma membrane, B-RAF also binds to nonfarnesylated H-Ras in the cytosol. For identification of the potential farnesyl binding site we used several fragments of the regulatory domain of C-RAF and found that the binding of farnesylated H-Ras is considerably increased in the presence of the cysteine-rich domain of RAF. In B-RAF a sequence of 98 amino acids at the extreme N terminus enables binding of Ras independent of its farnesylation status. The deletion of this region altered Ras binding as well as kinase properties of B-RAF to resemble C-RAF. Immunofluorescence studies in mammalian cells revealed essential differences between B- and C-RAF regarding the colocalization with Ras. In conclusion, our data suggest that that B-RAF, in contrast to C-RAF, is also accessible for nonfarnesylated Ras in the cytosolic environment due to its prolonged N terminus. Therefore, the activation of B-RAF may take place both at the plasma membrane and in the cytosolic environment. Furthermore, the interaction of RAF isoforms with Ras at different subcellular sites may also be governed by the complex formation with 14-3-3 proteins. 14-3-3 adapter proteins play a crucial role in the activation of RAF kinases, but so far no information about the selectivity of the seven mammalian isoforms concerning RAF association and activation is available. We analyzed the composition of in vivo RAF/14-3-3 complexes isolated from mammalian cells with mass spectrometry and found that B-RAF associates with a greater variety of 14-3-3 proteins than C- and A-RAF. In vitro binding assays with purified proteins supported this observation since B-RAF showed highest affinity to all seven 14-3-3 isoforms, whereas C-RAF exhibited reduced affinity to some and A-RAF did not bind to the 14-3-3 isoforms epsilon, sigma, and tau. To further examine this isoform specificity we addressed the question of whether both homo- and heterodimeric forms of 14-3-3 proteins participate in RAF signaling. By deleting one of the two 14-3-3 isoforms in Saccharomyces cerevisiae we were able to show that homodimeric 14-3-3 proteins are sufficient for functional activation of B- and C-RAF. In this context, the diverging effect of the internal, inhibiting and the activating C-terminal 14-3-3 binding domain in RAF could be demonstrated. Furthermore, we unveil that prohibitin stimulates C-RAF activity by interfering with 14-3-3 at the internal binding site. This region of C-RAF is also target of phosphorylation as part of a negative feedback loop. Using tandem MS we were able to identify so far unknown phosphorylation sites at serines 296 and 301. Phosphorylation of these sites in vivo, mediated by activated ERK, leads to inhibition of C-RAF kinase activity. The relationship of prohibitin interference with 14-3-3 binding and phosphorylation of adjacent sites has to be further elucidated. Taken together, our results provide important new information on the isoform-specific regulation of RAF kinases by differential interaction with Ras and 14-3-3 proteins and shed more light on the complex mechanism of RAF kinase activation. N2 - RAF Protein Kinasen sind essentielle Regulatoren verschiedener zellulärer Prozesse. Unterschiedlich starke Aktivitäten und Lokalisation der drei RAF Isoformen erfordern eine isoform-spezifische Regulation. Der Einfluss von Protein-Protein Interaktionen und Phosphorylierungen ist dabei mitentscheidend für die Signalweiterleitung entlang der Ras-RAF-MEK-ERK Kaskade. Mehr als 40 Interaktionspartner der RAF Kinasen wurden bereits beschrieben von denen zwei der wichtigsten, Ras und 14-3-3 Proteine, Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind. Die Interaktion von RAF mit seinem vorgeschaltetem Modulatorprotein Ras wurde bislang nur mit verkürzten RAF-Proteinen und ohne Rücksicht auf den Lipidierungsgrad von Ras untersucht. Wir haben die Bindeeigenschaften von B- und C-RAF in voller, nativer Länge zu farnesyliertem H-Ras in Gegenwart und Abwesenheit von Membranlipiden quantifiziert. Während die isolierte Ras-Bindungsdomäne eine hohe Affinität sowohl zu farnesyliertem als auch nicht-farnesyliertem H-Ras aufweist, zeigen die RAF Proteine in voller Länge entscheidende Unterschiede in ihrem Bindeverhalten zu Ras. C-RAF benötigt für eine effiziente Interaktion mit H-Ras dessen C-terminale Farnesylgruppe, wobei B-RAF auch an nicht-farnesyliertes H-Ras im Cytosol bindet. Um die verantwortliche Farnesylbinderegion zu identifizieren haben wir verschiedene Fragmente der regulatorischen Domäne von C-RAF eingesetzt. Dadurch konnten wir zeigen, dass die Affinität zu farnesyliertem Ras in Gegenwart der sogenannten Cystein-reichen Domäne von RAF beträchtlich erhöht war. In B-RAF ist eine Sequenz von 98 Aminosäuren am N-Terminus verantwortlich für die Ras-Bindung unabhängig von dessen Farnesylierungszustand. Die Deletion dieser Sequenz von B-RAF veränderte die Ras-Bindungseigenschaften sowie die Kinaseaktivität vergleichbar mit C-RAF. Durch Immunfluoreszenzversuche in Säugerzellen konnten darüber hinaus Unterschiede in der Kolokalisation von B- und C-RAF mit Ras beobachtet werden. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass B-RAF, im Gegensatz zu C-RAF, aufgrund seines verlängerten N-Terminus in der Lage ist bereits im Cytosol auch mit unfarnesyliertem Ras zu interagieren, wodurch die Aktivierung von B-RAF sowohl im Cytosol als auch an der Plasmamenbran erfolgen kann. Die Interaktion der RAF-Isoformen mit Ras in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten kann aber auch durch die Komplexbildung mit 14-3-3 Proteinen beeinflusst werden. Die 14-3-3 Adapter Proteine spielen eine entscheidende Rolle im Aktivierungszyklus der RAF Proteine. Bislang waren jedoch keine Details bezüglich der Selektivität der sieben 14-3-3 Isoformen aus Säugerzellen hinsichtlich der Assoziation mit und Aktivierung der RAF Kinasen bekannt. Wir haben RAF/14-3-3 Komplexe aus Säugerzellen isoliert und durch Massenspektrometrie analysiert. Dadurch konnten wir zeigen, dass B-RAF mit einer größeren Vielfalt an 14-3-3 Isoformen bindet als C- und A-RAF. In vitro Bindungsversuche mit gereinigten Proteinen bestätigten die höhere Affinität von B-RAF zu allen sieben Säuger-14-3-3 Proteinen. C-RAF dagegen zeigte eine deutlich reduzierte Affinität, während für A-RAF keine Bindung zu den 14-3-3 Isoformen epsilon, sigma, und tau festgestellt wurde. Um diese Isoformspezifität weiter aufzuklären haben wir untersucht, ob sowohl Homo- als auch Heterodimere von 14-3-3 in der Lage sind die RAF-Signaltransduktion zu beeinflussen. Durch die Deletion einer der beiden 14-3-3 Isoformen aus Saccharomyces cerevisiae konnten wir zeigen, dass bereits ein 14-3-3 Homodimer für die korrekte Aktivierung von B- und C-RAF ausreichend ist. In diesem Zusammenhang konnte auch die Rolle der internen, inhibierenden 14-3-3 Bindestelle in RAF gegenüber der C-terminalen, aktivierenden Stelle dargelegt werden. Zusätzlich zeigen wir, dass Prohibitin seinen aktivierenden Einfluss gegenüber C-RAF durch die Beeinträchtigung der 14-3-3 Bindung an der internen Stelle in RAF ausübt. Diese Region in C-RAF ist das Ziel von Phosphorylierungen im Zuge eines negativen Rückkopplungsmechanismus. Durch den Einsatz von Tandem-Massenspektrometrie konnten wir bislang unbekannte Phosphorylierungsstellen an den Serinen 296 und 301 identifizieren deren ERK-vermittelte Phosphorylierung in vivo eine Inaktivierung der C-RAF bewirkt. Der Zusammenhang zwischen der Behinderung der 14-3-3 Anlagerung durch Prohibitin und die Phosphorylierung in unmittelbarer Nachbarschaft bedarf weiterer Untersuchungen. Zusammengefasst liefern unsere Ergebnisse wichtige Informationen bezüglich der isoform-spezifischen Regulation der RAF Kinasen durch die Interaktion mit Ras und 14-3-3 Proteinen und helfen die komplexen Mechanismen der RAF Aktivierung weiter aufzuklären. KW - Signaltransduktion KW - Raf KW - Biochemie KW - Ras KW - H-ras KW - Proteininteraktion KW - signal transduction KW - biochemistry KW - Ras KW - Raf Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48139 N1 - Aus rechtlichen Gründen sind die in der Dissertation abgedruckten, bereits in Zeitschriften veröffentlichten Artikel (Seiten 34 - 80) nicht in der elektronischen Version enthalten. ER - TY - THES A1 - Gruber, Franz Andreas T1 - Untersuchung zur Regulation der Expression des zuckerkonditionierten Verhaltens bei Drosophila melanogaster T1 - Analysing the regulation of the expression of sugar-conditioned behaviour in Drosophila melanogaster N2 - In dieser Doktorarbeit habe ich die Regulation der Expression des zuckerbelohnten Verhaltens durch den Fütterungszustand bei Drosophila melanogaster untersucht. Die Fliegen können während einer Trainingsphase mit Hilfe einer Zuckerbelohnung auf einen bestimmten Duft konditioniert werden. Nach dem Training können die Fliegen dann auf das olfaktorische Gedächtnis getestet werden. Die Bereitschaft das zuckerkonditionierte Gedächtnis im Test zu zeigen wird vom Fütterungszustand kontrolliert, wie ich in Übereinstimmung mit den Ergebnissen früherer Arbeiten demonstrierte (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008). Nur nicht gefütterte Fliegen exprimieren das Gedächtnis, während Fütterungen bis kurz vor dem Test eine reversibel supprimierende Wirkung haben. Einen ähnlichen regulatorischen Einfluss übt der Futterentzug auch auf die Expression anderer futterbezogener Verhaltensweisen, wie z.B. die naive Zuckerpräferenz, aus. Nachdem ich den drastischen Einfluss des Fütterungszustands auf die Ausprägung des zuckerkonditionierten Verhaltens gezeigt bzw. bestätigt hatte, habe ich nach verhaltensregulierenden Faktoren gesucht, die bei einer Fütterung die Gedächtnisexpression unterdrücken. Als mögliche Kandidaten untersuchte ich Parameter, die zum Teil bereits bei verschiedenen futterbezogenen Verhaltensweisen unterschiedlicher Tierarten als „Sättigungssignale“ identifiziert worden waren (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). Dabei stellte sich heraus, dass weder die „ernährende“ Eigenschaft des Futters, noch ein durch Futteraufnahme bedingter Anstieg der internen Glukosekonzentration für die Suppression des zuckerkonditionierten Gedächtnisses notwendig sind. Die Unterdrückung der Gedächtnisexpression kann auch nicht durch Unterschiede in den aufgenommenen Futtermengen, die als verhaltensinhibitorische Dehnungssignale des Verdauungstrakts wirken könnten, oder mit der Stärke des süßen Geschmacks erklärt werden. Die Suppression des zuckerbelohnten Verhaltens folgte den Konzentrationen der gefütterten Substanzen und war unabhängig von deren chemischen Spezifität. Deshalb wird die Osmolarität des aufgenommenen Futters als ein entscheidender Faktor für die Unterdrückung der zuckerkonditionierten Gedächtnisexpression angenommen. Weil nur inkorporierte Substanzen einen Unterdrückungseffekt hatten, wird ein osmolaritätsdetektierender Mechanismus im Körper 67 postuliert, wahrscheinlich im Verdauungstrakt und/oder der Hämolymphe. Die Hämolymphosmolarität ist als „Sättigungssignal“ bei einigen wirbellosen Tieren bereits nachgewiesen worden (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Deshalb habe ich mit Hilfe genetischer Methoden und ohne die Fliegen zu füttern, versucht über einen künstlich induzierten Anstieg der Trehaloseund Lipidkonzentrationen die Osmolarität der Hämolymphe in Drosophila zu erhöhen. Eine solche konzentrationserhöhende Wirkung für Lipide und die Trehalose, dem Hauptblutzucker der Insekten, ist bereits für das adipokinetische Hormon (AKH), das von Zellen der Corpora cardiaca exprimiert wird, nachgewiesen worden (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). Es stellte sich heraus, dass die künstliche Stimulierung AKH-produzierender Neurone das zuckerkonditionierten Verhalten temporär, reversible und selektiv unterdrückt. Gleiche Behandlungen hatten keinen Effekt auf ein aversiv konditioniertes olfaktorisches Gedächtnis oder ein naives Zuckerpräferenzverhalten. Wie aus dieser Arbeit hervorgeht, stellt wahrscheinlich die Osmolarität des Verdauungstrakts und der Hämolymphe oder nur der Hämolymphe ein physiologisches Korrelat zum Fütterungszustand dar und wirkt als unterdrückendes Signal. Dass Fütterungen das zuckerkonditionierte Verhalten und die Zuckerpräferenz supprimieren, die künstliche Stimulation AKH-produzierender Zellen aber selektiv nur die zuckerbelohnte Gedächtnisexpression unterdrückt, deutet auf mindestens zwei unterschiedliche „Sättigungssignalwege“ hin. Außerdem macht es deutlich wie uneinheitlich futterbezogene Verhaltensweisen, wie das zuckerbelohnte Verhalten und die naive Zuckerpräferenz, reguliert werden. N2 - In this work I investigated the regulation of the expression of the sugar conditioned behavior by feeding states in Drosophila melanogaster. During the training flies are able to associate an odor with a sugar reward. During the test these flies have the opportunity to show their odor memory. In accordance with previous findings (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008), I also showed that the readiness to express sugar conditioned memory is controlled by the feeding state. The memory was only displayed by starved flies, whereas feedings of the flies until the test cause a reversible and temporary suppression of conditioned behavior. Feeding states similarly influence the expression of other food-related behaviors like sugar preference. After I have showed/confirmed the drastic influence of feeding state on sugar conditioned behavior, I tried to search for factors which suppress the memory expression of conditioned flies during feeding. Therefore I verified physiological parameters as promising candidates which have already been identified as “satiation-signals” for different food-related behaviors through the animal kingdom (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). As the results revealed, neither the nutritional value of the available food nor an increase of the internal glucose-concentrations were necessary for suppressing conditioned behavior. Furthermore differences in sweet taste and in the amount of the ingested food, which likely serve as volumetric signals of the digestive system, were not critical determinants for inhibition of the memory expression. Because suppression followed the concentration of the substances independent of the chemical specificity, I conclude that the osmolarity of the ingested food is a critical factor for inhibition of sugar conditioned behavior. Only ingested substances were suppressive. Therefore an internal osmolarity-detecting mechanism is postulated, most probably in the digestive system or the hemolymph. Hemolymph-osmolarity has already been shown as a “satiation-signal” for some invertebrates (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Thus I tried to increase the hemolymph-osmolarity by an artificially induced rise of the concentration of lipids and trehalose, the main blood sugar of insects. A concentration-increasing effect such like this has already been shown for the adipokinetic hormone (AKH), which is expressed in cells of the corpora cardiaca (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). I demonstrated that an artificial stimulation of AKH69 producing neurons induces the suppression of sugar conditioned behavior, but leaves aversive conditioned behavior and naïve sugar preference unchanged. This work indicates that the osmolarity of the digestive system and the hemolymph or only of the hemolymph serves as (a) physiological correlate(s), which signals suppression. Feeding induced inhibition of the expression of sugar conditioned behavior and naïve sugar preference, whereas the artificial stimulation of AKH-producing cells selectively inhibited sugar rewarded memory expression alone. Thus I assume at least two separable “satiation”-pathways. Moreover these results demonstrate the non-uniform regulation of different food-related behaviors like sugar conditioned behavior and naïve sugar preference. KW - Taufliege KW - Futterentzug KW - Klassische Konditionierung KW - Konditionierung KW - Gedächtnis KW - Assoziatives Gedächtnis KW - Osmolarität KW - Drosophila melanogaster KW - zuckerkonditioniertes Verhalten KW - klassische Konditionierung KW - Futterentzug KW - Drosophila melanogaster KW - sugar-conditioned behaviour KW - classical conditioning KW - food deprivation KW - starvation Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48802 ER - TY - THES A1 - Bauchart, Philippe Michel Paul T1 - Evaluation of the Zoonotic Risk of Escherichia coli Strains involved in Extraintestinal Infections of Humans and Animals. Characterization of New Virulences Factors in ExPEC T1 - Evaluierung des Zoonotischen Risikos von Escherichia coli Stämmen assoziiert mit Extraintestinalen Infektionen bei Menschen und Tieren. Charakterisierung Neuer Virulenzfaktoren von ExPEC N2 - Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) represent a subset of the so-called extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) pathotype that can cause various extraintestinal infections in humans and animals. APEC are the causative agent of localized colibacillosis or systemic infection in poultry. In this latter case, the syndrome starts as an infection of the upper respiratory tract and develops into a systemic infection. Generally, ExPEC are characterized by a broad variety of virulence-associated factors that may contribute to pathogenesis. Major virulence factors, however, that clearly define this pathotype, have not been identified. Instead, virulence-associated genes of ExPEC and thus also of APEC could be used in a mix-and-match-fashion. Both pathotypes could not be clearly distinguished by molecular epidemiology, and this suggested a hypothetical zoonotic risk caused by APEC. Accordingly, the main scientific question of this study was to characterize common traits as well as differences of APEC and human ExPEC variants that could either support the possible zoonotic risk posed by these pathogenic E. coli strains or indicate factors involved in host specificity. Comparative genomic analysis of selected APEC and human ExPEC isolates of the same serotype indicated that these variants could not be clearly distinguished on the basis of (i) general phenotypes, (ii) phylogeny, (iii) the presence of typical ExPEC virulence genes, and (iv) the presence of pathoadaptive mutations. Allelic variations in genes coding for adhesins such as MatB and CsgA or their regulators MatA and CsgD have been observed, but further studies are required to analyze their impact on pathogenicity. On this background, the second part of this thesis focused on the analysis of differences between human ExPEC and APEC isolates at the gene expression level. The analysis of gene expression of APEC and human ExPEC under growth conditions that mimick their hosts should answer the question whether these bacterial variants may express factors required for their host-specificity. The transcriptomes of APEC strain BEN374 and human ExPEC isolate IHE3034 were compared to decipher whether there was a specific or common behavior of APEC and human ExPEC, in response to the different body temperatures of man (37°C) or poultry (41°C). Only a few genes were induced at 41 °C in each strain relative to growth at 37 °C. The group of down-regulated genes in both strains was markedly bigger and mainly included motility and chemotaxis genes. The results obtained from the transcriptome, genomic as well as phenotypic comparison of human ExPEC and APEC, supports the idea of a potential zoonotic risk of APEC and certain human ExPEC variants. In the third part of the thesis, the focus was set on the characterization of Mat fimbriae, and their potential role during ExPEC infection. Comparison of the mat gene cluster in K-12 strain MG1655 and O18:K1 isolate IHE3034 led to the discovery of differences in (i) DNA sequence, (ii) the presence of transcriptional start and transcription factor binding sites as well as (iii) the structure of the matA upstream region that account for the different regulation of Mat fimbriae expression in these strains. A negative role of the H-NS protein on Mat fimbriae expression was also proven at 20 °C and 37 °C by real-time PCR. A major role of this fimbrial adhesin was demonstrated for biofilm formation, but a significant role of Mat fimbriae for APEC in vivo virulence could not yet be determined. Interestingly, the absence of either a functional matA gene or that of the structural genes matBCDEF independently resulted in upregulation of motility in E. coli strains MG1655 and IHE3034 by a so far unknown mechanism. In conclusion, the results of this thesis indicate a considerable overlap between human and animal ExPEC strains in terms of genome content and phenotypes. It becomes more and more apparent that the presence of a common set of virulence-associated genes among ExPEC strains as well as similar virulence gene expression patterns and phylogenetic backgrounds indicate a significant zoonotic risk of avian-derived E. coli isolates. In addition, new virulence factors identified in human ExPEC may also play a role in the pathogenesis of avian ExPEC. N2 - Vogelpathogene Escherichia coli (APEC) sind eine Untergruppe der sogenannten extraintestinal pathogenen Escherichia coli (ExPEC), welche Infektionen außerhalb des Verdauungstraktes beim Menschen und vielen Tieren verursachen können. ExPEC sind durch eine Vielzahl Virulenz-assoziierter Faktoren charakterisiert, die zur Pathogenese beitragen können. Haupt-Virulenzfaktoren, die eine eindeutige Zuordnung zu diesem Pathotyp erlauben, wurden jedoch noch nicht identifiziert. Die Virulenz bei ExPEC und somit auch bei APEC scheint auf der kombinierten Expression von Virulenzfaktoren zu beruhen. Beide Pathotypen können daher nicht eindeutig aufgrund des Genomgehaltes sowie molekularer Epidemiologie voneinander unterschieden werden. In der vorliegenden Arbeit sollten Gemeinsamkeiten sowie Unterschiede bei ausgewählten APEC- und humanen ExPEC-Isolaten des gleichen Serotyps untersucht werden, um nähere Hinweise auf ein Zoonoserisiko zu erhalten oder um Faktoren zu charakterisieren, die zur Wirtsspezifität beitragen können. Vergleichende Analysen des Genomgehaltes zeigten, dass diese Varianten nicht aufgrund (i) genereller Phänotypen, (ii) ihrer Phylogenie, (iii) der Anwesenheit typischer Virulenz-assoziierter Gene sowie (iv) pathoadaptiver Mutationen voneinander unterschieden werden können. Interessanterweise wurden bei manchen Isolaten Allelvariationen in Genen beobachtet, die für Adhäsine wie MatB und CsgA sowie für ihre Regulatoren (MatA und CsgD) kodieren. Ihre mögliche Bedeutung für die Virulenz muß jedoch weiter analysiert werden. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich eng verwandte Vogel- und humane ExPEC-Isolate hinsichtlich ihrer Genexpression unterscheiden. Um zu untersuchen, ob die Körpertemperatur des Menschen (37 °C) oder von Geflügel (41 °C) einen unterschiedlichen Einfluß auf die bakterielle Genexpression hat und somit zur Wirtsspezifität beitragen kann, wurden die Transkriptome des APEC-Stammes BEN374 und des humanen ExPEC-Stammes IHE3034 nach Anzucht in vitro bei 37 °C bzw. 41 °C miteinander verglichen. Wachstum bei 41 °C führte nur bei wenigen Genen zu einer Induktion der Genexpression, wohingegen die Anzahl der reprimierten Gene bei dieser Temperatur in beiden Stämmen deutlich höher war und vor allem auf eine reduzierte Beweglichkeit und Chemotaxis hindeutete. Die Ergebnisse von vergleichender Genomik, Transkriptomik und Phänotypisierung humaner ExPEC- und APEC-Stämme unterstützen somit die Annahme, dass es ein Zoonoserisiko zwischen manchen APEC- und humanen ExPEC-Isolaten gibt. Im dritten Teil dieser Arbeit stand die Charakterisierung der Mat Fimbrien- Expression in E. coli sowie ihre Rolle bei der Infektion im Mittelpunkt. Der Vergleich der kodierenden matABCDEF Determinanten im E. coli K-12 Stamm MG1655 und im humanen ExPEC O18:K1 Isolat IHE3034 zeigte Unterschiede in (i) der jeweiligen Nukleotidsequenz, (ii) der Anwesenheit von Transkriptionsstartpunkten und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen sowie (iii) der Struktur der „Upstream“-Region des Genclusters auf, die zur unterschiedlichen Fimbrienexpression in beiden Stämmen beitragen können. Eine Repression der Mat Fimbrienexpression durch das H-NS Protein wurde nachgewiesen. Zudem wurde gezeigt, dass Mat Fimbrien signifikant zur Biofilmbildung beitragen, wohingegen ein Beitrag zur in vivo-Virulenz nicht festgestellt wurde. Interessanterweise beeinflusste der MatA Regulator, aber auch die Mat Fimbrien- Strukturgene, die Flagellenexpression: die Abwesenheit von matA bzw. von matBCDEF führte in beiden E. coli Stämmen zu einer Induktion der Flagellenexpression und Motilität. Der zugrundeliegende Mechanismus ist noch unbekannt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass es eine beträchtliche Überlappung des Genomgehaltes und der Phänotypen bei ExPEC-Stämmen, die von Menschen oder Tieren isoliert wurden, gibt. Das Vorhandensein eines gemeinsamen Virulenzgenpools, ihre Phylogenie und ähnliche Genexpressionsprofile legen nahe, dass ein Zoonoserisiko von APEC-Isolaten ausgehen kann. Die Identifizierung bislang unbekannter Virulenzfaktoren humaner ExPEC-Stämme kann sich daher auch auf das Verständnis der Pathogenese von APEC-Isolaten auswirken. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen auch, wie am Beispiel der Mat Fimbrien gezeigt, dass unterschiedliche E. coli-Phänotypen nicht nur auf einen unterschiedlichen Genomgehalt, sondern auch auf die unterschiedliche Regulation konservierter Determinanten zurückgeführt werden kann. KW - Escherichia coli KW - Virulenzfaktor KW - Zoonotisches Risiko KW - APEC KW - ExPEC KW - Mat Fimbrien KW - Biofilm KW - zoonotic risk KW - APEC KW - ExPEC KW - Mat fimbriae Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48848 ER - TY - THES A1 - Derrer, Bianca T1 - Charakterisierung der Vitamin B6 Synthese und des Shikimatsyntheseweges im Malariaerreger Plasmodium ssp. T1 - Characterisation of vitamin B6 synthesis and shikimate pathway in the malaria causing agents Plasmodium ssp. N2 - Malaria ist eine schwerwiegende Krankheit, die jährlich über eine Million Menschen tötet. Die zunehmende Resistenzbildung gegenüber den verwendeten Medikamenten macht die Entwicklung neuer Antimalariamittel dringend notwendig. Daher sind die Vitamin B6 Synthese und der Shikimatweg von besonderem Interesse, da diese beiden Synthesewege nur im Parasiten und nicht im Menschen vorkommen. Unter der Voraussetzung, dass diese essentiell für den Parasiten sind, böten sie ideale Ansatzpunkte zur Entwicklung neuer Antimalariamittel. Voraus gegangene Studien haben gezeigt, dass Plasmodium falciparum in der Lage ist, PLP de novo mittels eines bifunktionalen Enzymkomplex, bestehend aus den Proteinen Pdx1 und Pdx2, zu synthetisieren. Pdx1 stellt dabei die eigentliche Synthase dar, während Pdx2 als Glutaminase-Partner das benötigte Ammoniumion für den heterocyclen Ring bereitstellt. Zusätzlich dazu verfügt der Parasit auch über einen salvage pathway um PLP zu „recyclen“, in dem der Pyridoxalkinase PdxK eine Schlüsselfunktion zufällt. Knockout Studien der pdx1 im Mausmalariasystem P. berghei haben gezeigt, dass PbPdx1 für eine optimale Entwicklung der Blutstadien benötigt wird, nicht jedoch für deren Überleben. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich die Effekte eines pbpdxK(-) Knockouts in demselben System untersucht. Es konnte eine monoklonale Knockoutlinie generiert werden, was zeigte, dass PbPdxK nicht essentiell für das Überleben des Parasiten in den Blutstadien ist. Die Entwicklung während des Blutstadiums war von dem pbpdxK(-) Knockout nicht betroffen. Allerdings zeigte sich im Moskitostadium eine drastische Reduktion der Sporozoitenzahl sowohl in den Mitteldärmen als auch in den Speicheldrüsen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass PbPdxK essentiell für das Überleben der Sporozoiten ist. Daneben wurde versucht, die Gene pfpdx1, pfpdx2 sowie pfpdxK in P. falciparum 3D7 durch Verwendung der single cross over Strategie auszuschalten. Es konnte jedoch für keines der genannten Konstrukte eine Integration in die jeweiligen Genloci anhand von PCR-Analysen nachgewiesen werden. Ebenso scheiterte der Versuch, durch Rekombination eines komplementären Genabschnitts die Funktion des Gens zu rekonstituieren. Daher bleibt es unklar, ob pfpdx1, pfpdx2 und pfpdxK durch Knockout Strategien auszuschalten sind oder nur für Genmanipulationen nicht zugänglich sind. Die Kultivierung von P. falciparum 3D7 Parasiten in Vitamin B6 depletiertem Medium hatte keinen Effekt auf deren Wachstum. Eine anschließende Analyse der Proteinextrakte zeigte eine erhöhte Expression der PfPdxK, während sich das Expressionslevel der PfPdx1 nicht veränderte. Es scheint, dass der Parasit in der Lage ist Vitamin B6 Mangel durch vermehrte Nutzung des salvage pathways vollständig zu kompensieren. Frühere Arbeiten zeigten, dass der C-Terminus der Pdx1 in die Aktivität des PLP Synthasekomplexes involviert ist. Aus diesem Grund wurden verschiedene C-terminale Deletionsmutanten der PfPdx1 konstruiert und dabei bis zu 30 Aminosäuren entfernt. Diese Analysen ergaben, dass der C-Terminus vier verschiedene Funktionen besitzt: das Assembly der Pdx1 Untereinheiten zum Dodekamer, die Bindung des Pentosesubstrats Ribose 5-Phosphat, die Bildung des Intermediats I320 und schließlich die PLP Synthese. Diese unterschiedlichen Funktionen wurden durch verschiedene Deletionsvarianten identifiziert. Darüber hinaus waren alle Deletionsvarianten in der Lage, die Glutaminase Pdx2 zu aktivieren, was zeigt, dass das Dodekamer nicht Vorraussetzung für die Glutaminaseaktivität ist. Aufgrund der geringen PLP Syntheseaktivität in vitro wurde vermutet, dass der PfPdx1/PfPdx2 Komplex durch einen zusätzlichen Faktor aktiviert wird. Daher wurde versucht, mittels Yeast 2-Hybrid, basierend auf einer PCR-amplifizierten P. falciparum 3D7 cDNA-Bibliothek als bait und PfPdx1 als prey, einen Interaktionspartner zu identifizieren. Mehrere Klone wurden gewonnen, die alle einen Bereich des Mal13P1.540, einem putativen Hsp70 Proteins, enthielten. Jedoch scheiterten alle Versuche, die Protein-Protein-Interaktion mit rekombinant exprimierten Protein zu bestätigen. Ebenso war es nicht möglich, das vollständige Mal13P1.540 rekombinant zu exprimieren sowie dessen Lokalisation in vivo zu bestimmen. Daher bleibt die Interaktion von PfPdx1 und Mal13P1.540 ungeklärt. Neben der Vitamin B6 Biosynthese konnten auch einige Gene des Shikimatweges in Plasmodium identifiziert werden. In P. berghei konnten der C-terminale Teil der 3-Dehydroquinatsynthase (2) sowie die Shikimatkinase (5) und die 5-Enoylpyruvylshikimat 3-Phosphatsynthase (6) in einem open reading frame (ORF) identifiziert werden, der dieselbe genetische Organisation aufweisen wie der Arom-Komplex der Hefen. Mit Hilfe eines Komplementationsassay wurde die Funktionalität dieses ORFs überprüft. Dazu wurden S. cerevisiae BY4741Δaro1, ein Hefestamm ohne funktionalen Arom-Komplex, mit dem Pb2_6_5_ABC Fragment transformiert. Die so transformierten Hefen waren nicht in der Lage, auf Mangelplatten ohne aromatische Aminosäuren zu wachsen, was zeigte, dass das Pb2_6_5_ABC Konstrukt den BY4741Δaro1 Phänotyp nicht komplementieren konnte. Der Versuch, mit Hilfe des Baculovirussytems rekombiant exprimiertes Protein zu erhalten, verlief erfolglos. Ebenso war es nicht möglich, Teile des Proteins für Immunisierungen zu exprimieren. Daher bleibt die Funktionalität des Pb2_6_5_ABC Konstruktes ungeklärt. N2 - Malaria is a serious burden of mankind causing over one million deaths a year. In view of the raising number of resistances to common drugs there is an urgent need for the development of new antimalarial drugs. In this respect, the vitamin B6 biosynthesis and the shikimate pathway are of particular interest, since these synthesis pathways are only present in the malarial parasites and not in their human host. Given their essentiality for the parasite, they would represent ideal targets for antimalarial drug development. Previous studies revealed that Plasmodium falciparum is able to produce PLP de novo through a bifunctional enzyme complex composed of the proteins Pdx1 and Pdx2, of which Pdx1 is the actual synthase and Pdx2 the glutaminase partner providing the nitrogen for the ring system. In addition, the parasites possess a salvage pathway for PLP, of which pyridoxal kinase, PdxK, is a key player. Knockout studies of the pdx1 in the rodent malaria system P. berghei showed, that pbpdx1 is required for the optimal development of parasite blood stages but is not essential for parasite survival. Here, I investigated the effect of a pbpdxK(-) knockout in the same system. A monoclonal knockout strain was obtained, indicating that PbPdxK is not essential for the survival of the parasite. Blood stages were not affected by the knockout. However, in the mosquito stages pbpdxK(-) showed a tremendous reduction of sporozoites numbers in the midgut and in the salivary glands, indicating that PbPdxK is essential for the survival of sporozoites. It was then also tried to knockout pfpdx1, pfpdx2 and pfpdxK in the P. falciparum 3D7 strain by using the single cross over strategy. However, no integration of the constructs in the corresponding gene locus could be detected by a PCR approach. Also an approach to complement the loss of endogenous gene function by generating a functional gene copy upon recombination failed. Thus, it remains unclear if pfpdx1, pfpdx2 and pfpdxK can be knocked out or are inaccessible for gene targeting in P. falciparum. Cultivation of P. falciparum 3D7 parasites in medium deficient of vitamin B6 showed no effect on the growth rate of the parasites. Analysis of protein extracts of these parasites revealed an upregulation of PfPdxK expression, whereas the level of PfPdx1 remained stable. Thus it seems that the parasite is fully able to compensate vitamin B6 malnutrition by the increased usage of the salvage pathway. Previous studies on the activity of the PLP synthase complex indicated that the C-terminal end of Pdx1 is involved in PLP formation. Therefore several C-terminal deletion mutants of PfPdx1 were constructed, removing up to 30 amino acids. These analyses revealed that the C-terminus has four distinct functionalities: assembly of the Pdx1 monomers, binding of the pentose substrate (ribose 5-phosphate), formation of the reaction intermediate I320, and finally PLP synthesis. Deletions of distinct C-terminal regions distinguish between these individual functions. All variants were able to activate the glutaminase PfPdx2, indicating that the dodecameric structure is not a prerequisite for Pdx2 activation. Due to the low PLP synthase activity in vitro it was assumed that the PfPdx1/PfPdx2 complex maybe activated by an additional protein. Hence a yeast 2-hybrid assay was performed, using PfPdx1 as prey and a PCR-amplified cDNA-library of P. falciparum 3D7 as bait. Several clones were detected on high stringency plates, containing all a region of Mal13P1.540, a putative Hsp70 protein. Trials to confirm protein-protein interaction with recombinantly produced proteins failed as well as protein expression of full length Mal13P1.540. It was also not possible to determine the localisation of Mal13P1.540 in vivo. Thus, an interaction of PfPdx1 with Mal13P1.540 could so far not be verified. Besides the vitamin B6 biosynthesis, some genes of the shikimate pathway were identified in Plasmodium. In P. berghei, the C-terminal part of the dehydroquinatesynthase (2) as well as the shikimate kinase (5) and 5-enoylpyruvylshikimate 3-phosphatesynthase (6) were found in a single open reading frame having the same organisation as the arom-complex of yeast. To proof the functionality of these genes a complementation assay with S. cerevisiae BY4741Δaro1 with the Pb2_6_5_ABC construct, comprising the above mentioned genes, was performed. However, transformded yeast strains were not able to grow on minimal media without aromatic amino acids, indicating that they were not able to produce chorismate. Recombinant expression of this constructs in the baculovirussystem did not yield any detectable protein. Expression of parts of this protein for immunisation was also not successful. Hence, the functionality of this protein remains to be established. KW - Plasmodium falciparum KW - Shikimisäure KW - Vitamin B6 KW - Biosynthese KW - Shikimatsynthese KW - Plasmodium falciparum KW - Malaria KW - vitamin B6 synthesis KW - shikimate pathway KW - malaria Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51456 ER - TY - THES A1 - Schmid, Benjamin T1 - Computational tools for the segmentation and registration of confocal brain images of Drosophila melanogaster T1 - Software Tools für die Segmentierung und Registrierung konfokaler Gehirnbilder von Drosophila melanogaster N2 - Neuroanatomical data in fly brain research are mostly available as spatial gene expression patterns of genetically distinct fly strains. The Drosophila standard brain, which was developed in the past to provide a reference coordinate system, can be used to integrate these data. Working with the standard brain requires advanced image processing methods, including visualisation, segmentation and registration. The previously published VIB Protocol addressed the problem of image registration. Unfortunately, its usage was severely limited by the necessity of manually labelling a predefined set of neuropils in the brain images at hand. In this work I present novel tools to facilitate the work with the Drosophila standard brain. These tools are integrated in a well-known open-source image processing framework which can potentially serve as a common platform for image analysis in the neuroanatomical research community: ImageJ. In particular, a hardware-accelerated 3D visualisation framework was developed for ImageJ which extends its limited 3D visualisation capabilities. It is used for the development of a novel semi-automatic segmentation method, which implements automatic surface growing based on user-provided seed points. Template surfaces, incorporated with a modified variant of an active surface model, complement the segmentation. An automatic nonrigid warping algorithm is applied, based on point correspondences established through the extracted surfaces. Finally, I show how the individual steps can be fully automated, and demonstrate its application for the successful registration of fly brain images. The new tools are freely available as ImageJ plugins. I compare the results obtained by the introduced methods with the output of the VIB Protocol and conclude that our methods reduce the required effort five to ten fold. Furthermore, reproducibility and accuracy are enhanced using the proposed tools. N2 - Expressionsmuster genetisch manipulierter Fliegenstämme machen den Großteil neuroanatomischer Daten aus, wie sie in der Gehirnforschung der Taufliege Drosophila melanogaster entstehen. Das Drosophila Standardgehirn wurde u.a. entwickelt, um die Integration dieser Daten in ein einheitliches Referenz-Koordinatensystem zu ermöglichen. Die Arbeit mit dem Standardgehirn erfordert hochentwickelte Bildverarbeitungsmethoden, u.a. zur 3D Visualisierung, Segmentierung und Registrierung. Das bereits publizierte "VIB Protocol" stellte bisher eine Möglichkeit für die Registrierung zur Verfügung, die aber duch die Notwendigkeit manueller Segmentierung bestimmter Neuropile nur eingeschränkt verwendbar war. In der vorliegenden Arbeit stelle ich neue Werkzeuge vor, die den Umgang mit dem Standardgehirn erleichtern. Sie sind in ein bekanntes, offenes Bildverarbeitungsprogramm integriert, das potentiell als Standardsoftware in der neuroanatomischen Forschung dienen kann: ImageJ. Im Zuge dieser Arbeit wurde eine hardwarebeschleunigte 3D Visualisierungs-Bibliothek entwickelt, die die Visualisierungsmöglichkeiten von ImageJ ergänzt. Auf Basis dieser Entwicklung wurde anschließend ein neuer halbautomatischer Segmentierungs-Algorithmus erstellt. In diesem Algorithmus werden Neuropil-Oberflächen, ausgehend von ausgewählten Ausgangspunkten, aufgebaut und erweitert. Vorlagen von Neuropil-Oberflächen aus der Segmentierung eines Referenz-Datensatzes, die anhand eines modifizierten "Active Surface" Modells einbezogen werden können, ergänzen die aktuelle Segmentierung. Die so erhaltenen Oberflächen ermöglichen es, korrespondierende Landmarken in den Bildern zu ermitteln, die für eine nicht-rigide Registrierung verwendet werden. Schließlich wird dargelegt, wie die einzelnen Schritte voll automatisiert werden können, um die Bilder der Fliegengehirne aufeinander abzubilden. Die vorgestellten Methoden sind frei als Erweiterungen für ImageJ verfügbar (Plugins). Ein direkter Vergleich mit dem VIB Protokoll zeigt, dass durch die vorgestellten Methoden nicht nur der Benutzeraufwand auf ein Sechstel reduziert, sondern dass gleichzeitig auch die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit erhöht wird. KW - Taufliege KW - Segmentierung KW - Bildverarbeitung KW - Gehirn KW - Drosophila KW - Gehirnanatomie KW - Konfokalmikroskopie KW - Deformable models KW - Drosophila KW - brain anatomy KW - confocal microscopy KW - deformable models Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51490 ER - TY - THES A1 - Leonhardt, Sara Diana T1 - Resin collection and use in stingless bees T1 - Wie stachellose Bienen Pflanzenharze sammeln und nutzen N2 - Harz ist ein klebriges Pflanzenprodukt mit einem oft intensiven aromatischen Geruch. Es wird von Bäumen produziert, um Wunden zu verschließen und schädliche Besucher abzuwehren. Einige Insektenarten haben jedoch die erstaunliche Fähigkeit entwickelt, mit der klebrigen Substanz umzugehen und sie sich gar zu Nutzen zu machen. So verwenden Bienen Harz beispielsweise zum Nestbau und zur Verteidigung ihrer Kolonien. Während allgemein bekannt ist, dass Bienen Pollen und Nektar sammeln, wird der Tatsache, dass sie auch Harz sammlen, allerdings sehr viel weniger Beachtung geschenkt. Ziel meiner Dissertation war es daher, herauszufinden, warum, wie und wo stachellose Bienen in Borneo (sieben untersuchte Bienenarten), Australien (acht Arten) und Costa Rica (27 Arten) Pflanzenharze sammeln und verwerten. Diese Arbeit behandelt somit die enge Beziehung zwischen einer eusozialen Insektengattung und einem chemisch und physiologisch hoch komplexen Pflanzenprodukt, das Bienen nicht nur als Nestmaterial und zur Verteidigung dient, sondern auch eine wesentliche Bedeutung für deren chemische Diversität hat. Stachellose Bienen verhalten sich hochgradig opportunistisch, wenn sie Harz sammeln, d.h. verschiedene Bienenarten sammeln Harz von denselben Baumarten, wobei sie nahezu jede verfügbare Harzquelle nutzen. Dabei finden und erkennen sie Harzquellen anhand einiger charakteristischer Mono- und Sesquiterpene, nutzen jedoch nicht das gesamte Harz-Bouquet. Die Menge an eingetragenem Harz unterscheidet sich zwischen verschiedenen Bienenarten und kolonien und varriert mit verschiedenen Umweltbedingungen. Insbesondere eine Bedrohung durch Fressfeinde (z. B. Ameisen) führt zu einer massiven Steigerung des Harzeintrages; eine manuelle Zerstörung des Nesteinganges hat dagegen relativ wenig Einfluss. Das eingetragene Harz wird zum Nestbau und zur Verteidigung gegen Fressfeinde und Mikroben genutzt. Darüber hinaus dient es als Quelle für Terpene, die von den Bienen in ihre chemischen Oberflächenprofile eingebaut werden (kutikuläre Terpene). Dabei übertragen sie nur einen Bruchteil (8 %) der gewaltigen Menge (>> 1000) an Terpenen, die man im Harz von Bäumen findet, auf ihre Oberfläche. Die übertragenen Terpene bleiben in ihrer Struktur unverändert, allerdings unterscheiden sich die Bienenarten in der Zusammensetzung der Terpenprofile auf ihrer Oberfläche, obwohl alle untersuchten Arten Harz von denselben Bäumen sammeln. Die unterschiedlichen Terpenprofile sowie die Tatsache, dass nur wenige Terpene aus dem Harz aufgenommen werden, deuten auf einen artspezifischen und bisher unbekannten Filterungsmechanismus bei stachellosen Bienen hin. Auch übersteigt durch die Aufnahme von Terpenen die chemische Diversität der Oberflächenprofile von stachellosen Bienen die zahlreicher anderer Hymenopteren. Da Bienen die Terpene aus dem Harz nur „filtern“, sie dabei aber nicht verändern, sind sämtliche Bienenarten aus Borneo, Australien und Costa den charakteristischen Harzprofilen von Bäumen aus ihren Ursprungsgebieten chemisch sehr ähnlich. Da in jeder tropischen Region andere Baumarten vorkommen, varriert die chemische Zusammensetzung der vorkommenden Harze und damit der kutikulären Terpene von dort vorkommenden Bienen. Die meisten Bienenarten mit kutikulären Terpenen findet man in Borneo, wo nahezu 100 % der untersuchten Arten aus Baumharzen gewonnene Terpene in ihre chemischen Profilen einbauen. Im Gegensatz dazu sind es in Costa Rica nur 40 % der untersuchten Arten. Auch sammeln in Borneo gelegentlich 9 von 10 Arbeiterinnen einer Tetragonilla collina Kolonie Harz, wohingegen in Australien maximal 10 % und in Costa Rica maximal 40 % der Arbeiterinnen einer Kolonie Harz sammeln. Das Vorherrschen von Harz und aus Harz gewonnenen Terpenen in der chemischen Ökologie von Bienen auf Borneo spiegelt das Vorherrschen einer bestimmten südostasiatischen Baumfamilie wieder: der Dipterocarpaceen, deren Holz ungewöhnlich harzig ist. Ein solch enger Zusammenhang zwischen der Chemie von Bienen und der von Baumharzen verdeutlicht die enge Beziehung zwischen stachellosen Bienen und den Bäumen in ihrem Habitat. Die kutikulären Terpene schützen ihre Träger vor Angreifern (z.B. Ameisen) und Mikrobenbefall. Dabei variiert eine bestimmte Gruppe – Sesquiterpene – am meisten zwischen den Arten. Diese Terpengruppe manipuliert die natürlichweise auftretende zwischen-artliche Aggression, indem sie letztere bei jenen Arten verringert, die selbst keine Sesquiterpene in ihrem Profil haben. Aggressionsminderung durch chemische Komponenten, welche aus der Umwelt aufgenommen werden, stellt somit einen bisher unbekannten Mechanismus dar, um Toleranz zwischen sonst aggressiven Arten zu erreichen. Eine derarte Herabsetzung von aggressiven Verhalten bei stachellosen Bienen kann darüber hinaus ein entscheidender Faktor für das Entstehen sogenannter Nestaggregationen sein. Dabei nisten Kolonien von Bienenarten mit und Bienenarten ohne Sesquiterpene in ihrem chemischen Profil in unmittelbarer Nachbarschaft, ohne gegeneinander aggressiv zu sein. Im Hinblick auf die zahlreichen Funktionen, die Harze und/oder aus dem Harz gewonnene Substanzen für stachellose Bienen haben, stellt Harz zweifelsohne eine bedeutende Ressource in der Welt der Bienen dar – eine Ressource, die einen direkten Einfluss auf deren chemische Ökologie, Verteidigungsmechanismen und zwischen-artliche Kommunikation ausübt. Wie genau die Bienen ihre artspezifischen Terpenprofile erzeugen, insbesondere, wie es ihnen gelingt, dabei ganze Terpengruppen auszuschließen, muss in zukünftigen Studien genauer untersucht werden. Auch stellt sich die Frage, wie wichtig eine hohe Diversität an Harzquellen und damit Baumarten für die Bienen ist! Es ist durchaus möglich, dass neben einer Vielfalt an Blütenpflanzenarten auch der „Harzreichtum“ für das Wohlergehen der Bienen eine entscheidende Rolle spielt. N2 - Resin, a sticky sap emitting terpenoids and other volatiles, is produced by various plant species to seal wounds and protect themselves against herbivores and microbes. Among several other insects, bees have evolved the surprising ability to handle the repellent plant sap and use it to construct and defend their nests. Whereas the collection of pollen and nectar has been intensively studied in bees, resin collection has received only little attention. The aim of this dissertation was to better understand how the physiological and chemical properties of resin and resin-derived compounds (terpenes) affect the ecology of stingless bees. I therefore asked why, where and how stingless bees of Borneo (seven study-species), Australia (eight) and Costa Rica (27) collect and process plant resins, addressing the importance of a largely neglected resource not only for building and defensive properties, but also for the bees’ chemical diversity. Stingless bees are highly opportunistic resin foragers with all species collecting resin from a similar set of tree species. They locate and/or recognize resin sources on the basis of several volatile mono- and sesquiterpenes. I found that different bee species and even colonies significantly varied in the amount of resin collected. Predator attack (e.g., by ants) had the strongest affect on resin intake, whereas manual nest destruction only slightly increased the number of resin foragers. Resin is used to build, maintain and defend nests, but also as source for chemical compounds (terpenes) which stingless bees include in their surface profiles (chemical profiles). They directly transfer resin-derived compounds to their body surfaces (cuticular terpenes), but only include a subset (8 %) of the large number (>> 1000) of terpenes found in tree resins. This phenomenon can only be explained by a hitherto unknown ability to filter environmentally derived compounds which results in species-specific terpene profiles and thus in an increased chemical heterogeneity among species. Moreover, due to the addition of resin-derived substances the diversity of compounds on the bees’ body surfaces by far exceeds the chemical diversity of profiles in other hymenopterans. Because stingless bees filter but do not modify resin-derived compounds, species from Borneo, Australia and Costa Rica all resemble the characteristic resin of typical trees in their regions of origin. This chemical similarity reveals a strong correlation between the diversity of tree resins and the diversity of cuticular terpenes among stingless bees in a given habitat. Because different tree species are found in different tropical regions, the chemical composition of tree resins varies between tropical regions as does the composition of cuticular terpenes in bee species from these regions. Cuticular terpenes are however most common among stingless from Borneo, with 100 % of species studied having resin-derived terpenes in their chemical profiles. They are least common in Costa Rica, with only 40 % of species having terpenes. Likewise, resin collection was found to be highest in Tetragonilla collina colonies of Borneo where occasionally up to 90 % of foragers collected resin. By contrast, resin collection was only performed by 10 % of foragers of a given colony in Australia and by a maximum of 40 % in Costa Rica. The dominance of resin and resin-derived compounds in the chemical ecology of bees from Borneo may mirror the dominance of a particular Southeast Asian tree family: the highly resinous dipterocarps. Such a correlation between the chemistry of bees and the chemistry of tree resins therefore underlines the close relationship between stingless bees and the trees of their habitat. Cuticular terpenes are assumed to protect bees against predators and/or microbes. Sesquiterpenes, a specific group of terpenes, most vary between species and impair inter-specific aggression by reducing aggressive behavior in species without sesquiterpenes, thereby providing a novel mechanism to achieve interspecific tolerance among insects. Reduced interspecific aggression may also be an important factor enabling the non-aggressive aggregation of nests from stingless bee colonies of up to four different species, because such aggregations frequently comprise both species with and species without sesquiterpenes. Given its various functions, resin represents a highly important resource for stingless bees which directly affects their chemical ecology, defensive properties and inter-specific communication. It remains to be investigated how the bees influence the resin-derived terpene profiles on their body surface and in their nests, particularly how they manage to exclude entire groups of terpenes. Whether bees actually need a high diversity of different resin sources and therefore tree species to maintain the homeostasis of their colonies or whether they would do equally well with a limited amount of resin sources available, should also be addressed in future studies. Answers to this question will directly impair bee and forest management in (sub)tropical regions. KW - stachellose Biene KW - Harze KW - Terpene KW - stachellose Bienen KW - stingless bees KW - resin KW - terpenes Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51588 ER - TY - THES A1 - Gavvovidis, Ioannis T1 - Primäre Mikrozephalie: Einblicke in Expression und Funktion von MCPH1/Microcephalin und seiner Isoformen T1 - Primary microcephaly: insights into expression and function of MCPH1/Microcephalin and their isoforms N2 - Primäre Mikrozephalie (MCPH) ist eine heterogene, autosomal rezessive Störung des Menschen, die durch eine enorme Reduzierung des Hirnvolumens und variable geistige Behinderung ohne zusätzliche neurologische Defizite charakterisiert ist. Fünf einzeln ursächliche Gene sind bislang identifiziert. Zelluläres Merkmal von Patienten mit biallelischen Mutationen im MCPH1-Gen ist die vorzeitige Chromosomenkondensation in der G2-Phase des Zellzyklus sowie die verzögerte Chromosomendekondensation in der darauf folgenden G1-Phase (PCC-Syndrom). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass MCPH1 für zwei Haupttranskripte kodiert: Full-length-MCPH1 und ein Transkript ohne die Sequenz der letzten fünf Exons (MCPH1De9-14). Das vom Full-length-Transkript kodierte Polypeptid enthält eine N-terminale und zwei C-terminale BRCT-Domänen, während der MCPH1De9-14-Isoform die beiden C-terminalen BRCT-Domänen fehlen. Beide Varianten zeigen eine ähnliche Höhe der Gewebe-spezifischen Expression und sind in bestimmten fötalen Organen stärker vertreten als in adulten. Beide Isoformen werden während des Zellzyklus antagonistisch reguliert. Beide sind Zellkern-spezifische Proteine. Drei Kernlokalisierungssequenzen wurden in silico identifiziert. Die funktionelle Untersuchung dieser Signale ergab, dass zwei von ihnen unabhängig voneinander den Kerntransport des Proteins bewerkstelligen können. Die alleinige Expression der jeweiligen Variante ist ausreichend, um die defekte Chromosomenkondensation in MCPH1-defizienten Zellen zu komplementieren. Fehlende Komplementation mit der Deletionsvariante MCPH1De1-7 weist die N-terminale Region von MCPH1 als unentbehrlich zur Verhinderung von PCC aus. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten auf eine redundante Funktion der beiden Isoformen in der Regulierung der Chromosomenkondensation hin. Im Gegensatz dazu verhalten sie sich unterschiedlich im Bezug auf die DNA-Schadensantwort. Während Full-length-MCPH1 in strahlungsinduzierten Reparaturfoci lokalisiert werden kann, wird für MCPH1De9-14 keine Kolokalisierung mit phosphoryliertem H2AX nach DNA-Schadensinduktion beobachtet. Zusammenfassend kann man feststellen, dass das MCPH1-Gen für unterschiedliche Isoformen mit differenzieller Regulation auf RNA-Ebene und verschiedenen Funktionen auf Protein-Ebene kodiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erleichtern das Verständnis der diversen Funktionen von MCPH1 in der Zelle. N2 - Primary microcephaly (MCPH) is a heterogeneous autosomal recessive human disorder characterized by pronounced reduction of brain size and variable mental retardation without additional neurological deficits. To date, biallelic mutations in any of five genes have been identified to cause MCPH. A hallmark of patients with mutations in the MCPH1 gene is a cellular phenotype with premature chromosome condensation in the G2 phase of the cell cycle and delayed decondensation in the subsequent G1 phase (PCC syndrome). Here, we find that MCPH1 encodes two major species of transcripts: full-length MCPH1 and a transcript lacking sequence of the five 3’-exons of the gene (MCPH1De9-14). The polypeptide encoded by the full length transcript contains one N-terminal and two C-terminal BRCT domains, while the protein encoded by the MCPH1De9-14 variant is lacking the tandem C-terminal BRCT domains. Both variants show similar tissue-specific expression patterns, are likewise abundant in many foetal over adult organs, but are regulated antagonistically during cell cycle progression. Both MCPH1 isoforms show nuclear localization. Three nuclear localization signal sequences were identified in silico two of which proved to contribute individually to nuclear targeting. Expression of full-length MCPH1 or MCPH1De9-14 is independently able to complement the defective chromosome condensation in MCPH1-deficient cells. In contrast, attempts to complement with the mutant variant MCPH1De1-7 failed and thus identify the N-terminus of MCPH1 as crucial for the prevention of PCC. The present results suggest a redundant function of full-length and De9-14 MCPH1 in the regulation of chromosome condensation but different behaviour in the DNA damage response: While full-length MCPH1 localizes to nuclear repair foci following ionizing irradiation, MCPH1De9-14 fails to co-localize with phosphorylated H2AX. The results of the present study show that the MCPH1 gene encodes different isoforms that are differentially regulated at the transcript level and have differential functions at the protein level. These findings facilitate a better understanding of the diverse cellular functions claimed to MCPH1. KW - Mikrozephalie KW - DNS-Reparatur KW - PCC-Syndrom KW - Mentale Retardierung KW - Alternatives Spleißen KW - NLS-Sequenz KW - Chromosomenkondensation KW - Primary Microcephaly KW - DNA damage response KW - chromosome condensation KW - alternative splicing Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51816 ER - TY - THES A1 - Matuschek, Anja T1 - Characterization of tolerogenic rat bone marrow-derived dendritic cells and regulatory T cells T1 - Charakterisierung tolerogener dendritischer Knochenmarkszellen und regulatorischer T-Lymphozyten aus der Ratte N2 - Tolerogene Dendritische Zellen (DZ) und regulatorische T-Lymphozyten (Treg) verfügen über die Fähigkeit, destruktive Immunantworten zu verhindern. Die Hoffnung besteht, solche Zellen in naher Zukunft für therapeutische Zwecke einzusetzen, um z. B. Immunantworten nach Transplantation, aber auch bei Autoimmunität und Allergie antigenspezifisch zu supprimieren. Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Generierung solcher Zellen aufwendig und noch nicht für die klinische Routine geeignet. Zudem sind die Mechanismen noch wenig verstanden, wie diese Zellen eine gewünschte Immunhemmung in vivo auszulösen und wie der möglichen Gefahr einer zu starken Immunhemmung zu begegnen ist. Das Kleinnagermodell Ratte ist für die biomedizinische Forschung noch immer von großer Bedeutung, umso überraschender ist es, dass insbesondere tolerogene DZ und Treg in diesem Modell bisher nur unzureichend untersucht wurden. Das Ziel der Arbeit war deshalb, diese Immunzellen umfassend zu charakterisieren und ihre Funktion auf das Immunsystem zu untersuchen. Tolerogene DZ wurden mit GM-CSF und IL-4 aus Knochenmarkvorläuferzellen generiert (= IL-4 DC). Der Anteil an natürlich vorkommenden Treg mit einem Phänotyp CD4posCD25posFoxp3pos umfasst ca. 5-8% der peripheren naiven CD4pos TLymphozyten. Die Charakterisierung der IL-4 DC zeigte im Vergleich zu reifen DZ der Milz eine bis zu 26-fach geringere Expression von Oberflächenmolekülen wie MHC-Klasse II Molekül, CD80, CD86, ICAM-1 und CD25. Diese geringe Expression änderte sich auch nicht, wenn die Zellen verschiedensten Reifungssignalen wie das Replattieren,LPS, TNF-α und CD40L ausgesetzt wurden. IL-4 DC verfügen somit über einen robusten und gegenüber Reifungssignalen überaus resistenten Phänotyp. IL-4 DC nehmen Antigene durch Endozytose auf und sind unfähig, sowohl naive TLymphozyten zu aktivieren, als auch antigenspezifische T-Lymphozyten zu restimulieren. Zudem sind sie in der Lage, die Aktivierung naiver T-Lymphozyten und die Restimulierung antigenspezifischer T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ zu bzw. zu verzögern. Dabei verringerte sich die Proliferation der TLymphozyten um bis zu 95%. Diese Beeinflussung der Proliferation ist nach Zugabe der IL-4 DC bereits innerhalb von 24 Stunden zu messen. Die verringerte Aktivierung geht zu dem mit einer verringerten Zytokinausschüttung (IL-2 um 49% und IFN-γ um 92%) einher. Die inhibitorischen Eigenschaften der IL-4 DC scheinen aber nicht ausschließlich auf der verringerten Expression kostimulatorischer Moleküle zu beruhen. Der Nachweis der beiden inhibitorischen Oberflächenmoleküle PD-L1 und PD-L2 auf IL-4 DC lässt ebenfalls eine Bedeutung dieser Moleküle bei der Vermittlung inhibierender Signale vermuten. Auch die suppressive Wirkung löslicher Faktoren wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt. Überstände einer 24-stündigen Kultur mit einer Million IL-4 DC hemmten die Aktivierung naiver T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ um etwa 90%. Für diese Immunhemmung scheint das in diesen Überständen nachgewiesene Zytokin TGF-β (bis 300 pg/ml) verantwortlich zu sein. Im Vergleich dazu wiesen Überstände reifer Milz-DZ, die nicht die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmten, eine TGF-β Konzentrationen von bis 100 pg/ml auf. Im Gegensatz dazu scheint zelltoxisches Stickstoffmonoxid nur eine geringe Rolle bei der Inhibierung der T-Zellproliferation zu spielen. Die Zugabe des NO Synthase-Inhibitors NMMA verringerte zwar den Anteil an NO um ca. 50%, doch führte dies nicht zu einer Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten. IL-4 DC sind zwar nicht in der Lage, T-Lymphozyten zur Proliferation zu bringen, doch bedeutet dies nicht, dass keinerlei Veränderungen auf molekularer Ebene festzustellen wären. So sind T-Lymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC nicht in der Lage, in Gegenwart von reifen Milz-DZ zu proliferieren. Dieser anergische Zustand wurde nach Zugabe von IL-2 aufgehoben. Zudem können diese TLymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC die Aktivierung naïver TLymphozyten hemmen. Naïve und aktivierte T-Lymphozyten können dies nicht. Diese Beobachtung, die auf eine Induktion von Treg schließen lässt, wurde genauer untersucht. In der Tat zeigten durchflusszytometrische Analysen eine 1,6-fach verstärkte Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten aus natürlich vorkommenden Treg in Gegenwart von IL-4 DC. Dabei erfolgte die Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten unabhängig vom Reifegrad der DZ. So waren auch reife Milz-DZ dazu in der Lage, die Zahl der natürlich vorkommenden Treg zu erhöhen. Doch wiesen diese mit Milz-DZ inkubierten Treg einen verminderten inhibitorischen Effekt auf. Im Gegensatz dazu waren die mit IL-4 DC inkubierten Treg in der Lage die Aktivierung naiver T-Lymphozyten zu hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich das regulatorische Potential von DZ nicht ausschließlich vom Phänotyp bzw. ihrem Reifegrad ableiten lässt, sondern dass hierzu auch ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen sind. Die Induktion von Treg mit suppressiven Eigenschaften durch in vitro generierte tolerogene IL-4 DC könnte ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz darstellen. Vor einer klinischen Umsetzung sind aber noch weitergehende Untersuchungen notwendig, um das Zusammenspiel zwischen tolerogenen DZ und Treg zu verstehen, aber auch um die Auswirkungen eines Transfers großer Mengen regulatorischer Zellen auf das Immunsystem des Empfängers zu untersuchen. N2 - Tolerogenic dendritic cells (DC) and regulatory T (Treg) cells are able to prevent destructive immune responses. There is reason to hope that it may soon be possible to use DC and Treg cells to suppress immune responses antigen-specific, not only after transplantation, but also in the case of autoimmunity and allergy. At the moment, the generation of such cell types is very time-consuming and not suitable for clinical routine. In addition, it is not yet fully understood how these cells elicit a desired protective immune response in vivo and how the risks of an excessive immune suppression can be managed. The rat is one of the most important animal models in biomedical research. It is therefore surprising that tolerogenic DC and Treg cells in particular have not been more thoroughly investigated in this model. Thus, the aim of the present study was to systematically characterize these immune cells and investigate their impact on the immune system. Tolerogenic DC were generated from bone marrow precursors cultured with GM-CSF and IL-4 (= IL-4 DC). The proportion of naturally occurring Treg cells with a CD4posCD25posFoxp3pos phenotype comprises approximately 5-8% of the peripheral CD4pos T cells. The characterization of IL-4 DC revealed an up to 26-fold reduced expression of surface molecules such as MHC class II molecules, CD80, CD86, ICAM-1 and CD25 in comparison to mature splenic DC (S-DC). This low expression did not change when the cells where stimulated with different maturation-inducing signals such as replating, LPS, TNF- α and CD40L. Thus, these cells possess a robust phenotype resistant to maturation-inducing stimuli. IL-4 DC take up antigen via endocytosis and are not able to activate naïve T cells or to restimulate antigen-specific T cells. Furthermore, they are able to inhibit and prolongate mature S-DC induced T cell proliferation as well as mature S-DC induced restimulation of antigen-specific T cells, respectively. Thereby, the T cell proliferation was reduced up to 95%. This strong inhibitory effect was mediated within 24 hours in association with a reduced cytokine production (IL-2 about 49% and IFN-γ about 92%). The inhibitory properties of IL-4 DC don´t seem to be caused exclusively by the reduced expression of co-stimulatory molecules. In this study, the detection of the inhibitory molecules PD-L1 and PD-L2 on IL-4 DC suggests they have an impact on mediating inhibitory signals to the T cells. In addition, a suppressive effect of soluble factors was shown. The supernatant of one million IL-4 DC, collected after a 24 hour culture, suppressed mature S-DC induced proliferation of naïve T cells by about 90%. TGF-β, which was detected in the supernatant (up to 300 pg/ml), appears to be the causing soluble factor for this immune inhibition. By contrast, the supernatants of mature S-DC, which did not inhibit the activation of T cells, showed a TGF-β concentration of only about 100 pg/ml. The cytotoxic nitric oxide does not contribute to the IL-4 DC-mediated inhibition of T cell proliferation. The NO synthase inhibitor NMMA reduced the amount of NO by about 50%, but the decreased NO levels did not influence T cell proliferation. Indeed, IL-4 DC are not able to induce T cell proliferation, but this doesn´t mean that there is no change on the molecular level. For instance, T cells co-cultured with IL-4 DC during a first culture are not able to proliferate in the presence of mature S-DC during a second culture. This anergic-like state, however, could be abolished by adding exogenous IL-2. In addition, T cells co-cultured with IL-4 DC are able to inhibit the activation of naïve T cells. Naïve and activated T cells were not able to inhibit the mature S-DC induced T cell proliferation. This observation suggests the induction of Treg cells and was investigated in more detail. Indeed, flow cytometric analysis showed a 1.6-fold expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells from naturally occurring Treg cells in the presence of IL-4 DC. Thereby, the expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells occurs independently of the maturation state of DC. Both immature IL-4 DC as well as mature S-DC were able to expand the percentage of naturally occurring Treg cells. However, Treg cells pre-incubated with mature S-DC demonstrated a diminished inhibitory effect compared to Treg cells pre-incubated with IL-4 DC. Treg cells pre-incubated with IL-4 DC were able to inhibit the activation of naïve T cells. In this study it was shown that the regulatory potential of DC cannot be deduced solely by their phenotype or maturation state. Other factors, such as functional properties, need to taken into consideration, too. The induction of Treg cells with suppressive properties induced by in vitro generated tolerogenic IL-4 DC might provide an important mechanism for the maintenance of peripheral tolerance. However, for clinical application further investigation is necessary, not only to understand the interactions between tolerogenic DC and Treg cells, but also to investigate the impact of the transfer of a larger quantity of regulatory cells on the immune system of the recipient. KW - Dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Immuntoleranz KW - Allogene Zelle KW - Transforming Growth Factor beta KW - tolerogen KW - Dendritische Zelle KW - regulatorische T-Zellen KW - allogen KW - TGF-ß KW - tolerogenic KW - dendritic cell KW - regulatory T cells KW - allogenic KW - TGF-ß Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51708 ER - TY - THES A1 - Friehs, Gudrun T1 - Genotoxizität von Nikotin in humanem Speicheldrüsengewebe T1 - Genotoxicity of nicotine in human salivary gland tissue N2 - Tumore entstehen in einem mehrstufigen Prozess, der die Tumorinitiation, Promotion und Progression beinhaltet. Dabei spielen exogene Faktoren, wie Fremdstoffe, Umwelteinflüsse, Lebensgewohnheiten, Ernährungsverhalten oder Tabakkonsum eine wichtige Rolle. Für viele Fremdstoffe aus unserer Umwelt, die als Aerosole eingeatmet werden, stellen die Zellen des oberen und unteren Aerodigestivtrakts das primäre Kontaktorgan dar. Der Aerodigestivtrakt ist somit eine der wichtigsten Lokalisationen für Tabak assoziierten Karzinome. Dabei ist Nikotin nicht nur suchterzeugend, sondern spielt eine direkte Rolle bei der Entstehung und dem Wachstum von Tumoren. Um einen Beitrag zur Tumorprävention zu leisten, sollten in vitro Testsysteme etabliert werden, welche die Charakterisierung von Nikotin in seiner tumorinitiierenden und promovierenden Potenz ermöglichen. In dieser Arbeit wurden genotoxische Effekte von Nikotin an frisch isolierten Zellen, primären adhärenten Zellen und Miniorgankulturen der Glandula parotidea untersucht. Die Vitalität und Morphologie der Miniorgankulturen wurden mit histologischen Schnitten überprüft. Zur Charakterisierung der primären adhärenten Zellen wurden immunhistochemische Färbungen mit anti-α-Amylase durchgeführt. Die Erfassung nikotininduzierter DNA-Schäden erfolgte mit Hilfe des Comet Assays, des Mikrokerntests und des Chromosomenaberrationstests. Zur Untersuchung der Apoptoseinduktion durch Nikotin kam der Sandwich-ELISA-Test zum Einsatz. Methylmethansulfonat wurde dabei als Positivkontrolle verwendet. Während des ganzen Kultivierungszeitraums der Miniorgankulturen der Glandula parotidea konnten keine Anzeichen von Apoptosen oder Nekrosen festgestellt werden. Die Morphologie der Miniorgankulturen blieb während der Kultivierung intakt. Bei der Färbung der histologischen Schnitte gegen α-Amylase zeigte sich während der Kultivierung der Miniorgankulturen die typische α-Amylase im Zytoplasma der Zellen. Die immunhistochemische Färbung der primären adhärenten Zelllinie der Glandula parotidea zeigte die typische α-Amylase im Zytoplasma der Zellen. Im Comet Assay zeigte sich bei den frisch isolierten und den primären adhärenten Zellen der Glandula parotidea eine dosisabhängige DNA-Schädigung im einstündigen Inkubationsversuch durch Nikotin. Diese Schädigung war ab einer Konzentration von 0,25 mM Nikotin bei den frisch isolierten und ab 0,1 mM Nikotin bei den primären adhärenten Zellen signifikant. Im Mikrokerntest und im Chromosomenaberrationstest zeigten sich ein dosisabhängiger Anstieg der Mikrokerne, der sich ab 0,1 mM Nikotin als signifikant erwies, bzw. ein signifikanter Anstieg der Chromosomenaberrationen ab 0,001 mM Nikotin. Eine abfallende Apoptoserate war bei steigender Nikotinkonzentration im Sandwich-ELISA-Test zu beobachten. Ein signifikanter DNA-Schaden konnte nach ein- und dreistündiger Exposition mit Nikotin bei den Miniorgankulturen der Glandula parotidea nachgewiesen werden. Es zeigte sich weder ein signifikanter DNA-Schaden über die dreimalige Exposition mit Nikotin bei den Miniorgankulturen, noch konnte eine Reparatur der nikotininduzierten DNA-Schäden nachgewiesen werden. Bei der repetitiven Exposition mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat bei den Miniorgankulturen zeigte sich ein signifikanter Anstieg der OTM-Werte. Diese erhöhte Migration konnte nach einer 24-stündigen Regenerationsphase nicht nachgewiesen werden. Das Modell der Miniorgankulturen der Glandula parotidea erweist sich für genotoxikologische Untersuchungen als gut geeignet. Durch die Möglichkeit der mehrfachen Exposition mit anschließenden Regenerationsphasen ist eine Annäherung an reale Lebensbedingungen möglich. Ebenfalls konnten mit der Etablierung der primären adhärenten Zelllinie weitere Testsysteme, wie beispielsweise der Mikrokerntest, der Chromosomenaberrationstest und der Sandwich-ELISA-Test, zur Analyse der Genotoxizität von Nikotin angewendet werden. In der Zusammenschau dieser Testsysteme konnte ein Überblick der Genotoxizität von Nikotin gewonnen werden. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Nikotin eine entscheidende Rolle bei der Initiation von tabakassoziierten Tumoren im Aerodigestivtrakt spielen kann. Zum Verständnis der intrazellulären Schädigungswege von Nikotin, insbesondere im Hinblick auf eine direkte DNA-Schädigung, sind weitere Untersuchungen notwendig. Dabei werden spezifische nikotinerge Acetylcholinrezeptor Ago-nisten wie Epibatidin oder Mecamylamin verwendet. N2 - Tumor development is a multilevel process including initiation, promotion, and progression. It may be influenced by a multitude of exogenous factors, such as contact with foreign materials, various environmental conditions, lifestyle, diet, and the consumption of alcohol and tobacco. Cells of the upper aerodigestive tract represent the primary contact region for inhaled aerosols or harmful particles from the environment and are thus highly susceptible to the development of tobacco-induced malignancies. In this context, nicotine, which is known to be an addictive component in tobacco smoke, seems to play a crucial role in the initiation and progression of tumors. As an initial step towards effective tumor prevention, appropriate in vitro test systems must be established to allow for a detailed characterization of the cyto- and genotoxic properties of nicotine. In this study, we examined toxic effects of nicotine in freshly isolated cells in a primary developed salivary gland cell line as well as in mini organ cultures of human parotid gland tissue. Histological evaluations of mini organ cultures were performed to analyze the vitality and morphology of mini organ cultures during cultivation. Immunohistological staining using monoclonal antibodies against α-amylase were performed in order to functionally characterize the cultivated cells. DNA damage was assessed by the alkaline single cell microgel electrophoresis (comet) assay, the micronucleus test and the chromosomal aber-ration test. The sandwich ELISA test was also performed in order to analyze the expression of caspase 3 as a marker for apoptosis. Methylmethanesulphonate, a well-known genotoxic agent, served as an appropriate positive control. No apoptosis or necrosis was seen by histological examination of the mini organ cultures during the entire cell culture phase. In addition, immunohistological staining with anti-α-amylase showed the typical α-amylase in the cytoplasm of the mini organ cultures throughout the cultivation period. Moreover, α-amylase was detected immunohistologically in the primary parotid gland cell line. A dose-dependent increase in nicotine-induced DNA migration was demonstrated by the comet assay in freshly isolated parotid gland cells as well as in primary adherent cells of the parotid gland in a one-hour exposure experiment. A significant enhancement of DNA migration was observed at a nicotine concentration of 0.25 mM in freshly isolated cells, whereas significant effects were also seen at a concentration of 0.1 mM in primary adherent cells in comparison to the control. A dose-dependent increase in micronulei was induced at a concentration of 0.1 mM and chromosomal aberrations were observed at 0.001 mM nicotine. Regarding the induction of apoptosis, a decrease in caspase 3 activity was shown for increasing nicotine concentrations. Significant DNA migration could be seen after one- and three-hour exposures to nicotine. Neither significant DNA migration over time nor repair of the nicotine-induced DNA damage as expressed by a reduction of the DNA migration could be seen. In contrast, repetitive exposure to methylmethanesulphonate was shown to induce an enhanced DNA migration in mini organ cultures compared to a single exposure. This DNA migration was reduced after a 24-hour period of regeneration signalling DNA repair. The model of using miniorgans of the glandula parotidea seems to be suitable for genotoxicological analyses. The option of administering repetitive exposure and allowing for subsequent phases of DNA repair and regeneration provides a realistic comparison to the real life condition. Furthermore, the establishment of primary adherent cell lines allows for additional analyses to be performed with a variety of different test systems such as the micronucleus test, chromosomal aberration test and the sandwich ELISA test in order to better characterize the genotoxic potential of nicotine. The combined results of these various tests provide a comprehensive overview as to the genotoxicity of nicotine. Our data indicate that nicotine appears to play an essential role in the induction of tobacco-associated malignancies of the upper aerodigestive tract. However, to more clearly understand the processes involved in the intracellular damaging pathways, particularly with respect to direct DNA damage, further investigations are necessary. Future studies should clearly include the analysis of specific nicotinic acetylcholine receptor agonists such as epibatidine and mecamylamine. KW - Speicheldrüse KW - Nicotin KW - Tumorinduktion KW - nicotine KW - salivary gland Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51875 ER - TY - THES A1 - Nuwal, Nidhi T1 - Optogenetic investigation of nervous system functions using walking behavior and genome wide transcript analysis of Synapsin and Sap47 mutants of Drosophila N2 - PART I Animals need to constantly evaluate their external environment in order to survive. In some cases the internal state of the animal changes to cope with it’s surrounding. In our study we wanted to investigate the role of amines in modulating internal states of Drosophila. We have designed a behavioral paradigm where the flies are fixed in space but can walk on a small styrofoam ball suspended by a gentle stream of air. The walking activity of flies was used as behavioral readout. PART I Animals need to constantly evaluate their external environment in order to survive. In some cases the internal state of the animal changes to cope with it’s surrounding. In our study we wanted to investigate the role of amines in modulating internal states of Drosophila. We have designed a behavioral paradigm where the flies are fixed in space but can walk on a small styrofoam ball suspended by a gentle stream of air. The walking activity of flies was used as behavioral readout. An operant training paradigm was established by coupling one of the walking directions to incidence of heat punishment. We observed that animals quickly realized the contingency of punishment with walking direction and avoided walking in the punished direction in the presence of punishment, but did not continue walking in the unpunished direction in the absence of the punishment. This would indicate that the flies do not form a memory for the punished direction or rapidly erase it under new conditions. On having established the paradigm with heat punishment we have attempted to activate selected subsets of neuronal populations of Drosophila while they were walking on the ball. The selective activation of neurons was achieved by expressing the light-activated ion channel channelrhodopsin-2 (ChR2) using the Gal4-UAS system and coupling the unidirectional walking of the animals on the ball with the incidence of blue light required to activate the channels and depolarize the neurons. The feasibility of this approach was tested by light-activating sugar sensitive gustatory receptor neurons expressing ChR2, we found that when the light was actuated the flies preferred to turn in one direction the optically “rewarded” direction. Next we similarly activated different subsets of aminergic neurons. We observed that in our setup animals avoided to turn in the direction which was coupled to activation of dopaminergic neurons indicating that release of dopamine is disliked by the animals. This is in accordance with associative learning experiments where dopamine is believed to underlie the formation of an association between a neutral conditioned stimulus with the aversive unconditioned stimulus. However, when we activated tyraminergic/octopaminergic neurons we did not observe any directional preference. The activation of dopaminergic and tyraminergic/octopaminergic neurons led to arousal of the animals indicating that we were indeed successful in activating those neurons. Also, the activation of serotonergic neurons did not have any effect on directional preference of the animals. With this newly established paradigm it will be interesting to find out if in insects like in mammals a reward mediating system exists and to test subsets of aminergic or peptidergic neurons that could possibly be involved in a reward signaling system which has not been detected in our study. Also, it would be interesting to localize neuropile regions that would be involved in mediating choice behavior in our paradigm. PART II In collaboration with S. Kneitz (IZKF Wuerzburg) and T. Nuwal we performed genome-wide expression analysis of two pre-synaptic mutants - Synapsin (Syn97) and Synapse associated protein of 47 kDa (Sap47156). The rationale behind these experiments was to identify genes that were up- or down-regulated due to these mutations. The microarray experiments provided us with several candidate genes some of which we have verified by qPCR. From our qPCR analysis we can conclude that out of the verified genes only Cirl transcripts seem to be reproducibly down regulated in Synapsin mutants. The Cirl gene codes for a calcium independent receptor for latrotoxin. Further qPCR experiments need to be performed to verify other candidate genes. The molecular interactions between CIRL and SYN or their genes should now be investigated in detail. N2 - Teil I Lebewesen müssen beständig ihre äußere Umgebung auswerten, um überleben zu können. Manchmal ändern sich innere Zustände der Tiere, damit sie sich der Außenwelt anpassen. In unseren Untersuchungen wollten wir die Rolle von Aminen untersuchen, die für die Modulation von inneren Zuständen bei Drosophila notwendig sind. Wir haben ein Verhaltensparadigma entwickelt, bei dem die Fliege räumlich fixiert ist, aber auf einem Styroporball laufen kann, der auf einem Luftpolster schwebt. Die Laufaktivität der Fliege wird durch die Ballbewegungen anzeigt. Mit diesem Versuchsaufbau wurde ein operantes Lernparadigma etabliert, bei dem eine Laufrichtung mit Bestrafung durch Hitze gekoppelt wird. Wir konnten feststellen, dass die Tiere schnell den Zusammenhang zwischen dem Auftreten der Bestrafung und der Laufrichtung realisieren und die bestrafte Seite vermeiden. Wurde die eine Laufrichtung nicht mehr bestraft, so vermieden die Fliegen sie nicht mehr. Dies zeigt dass die Fliegen kein Gedächtnis für die bestrafte Richtung ausbilden oder es bei veränderten Bedingungen rasch löschen . Nachdem sich der Versuchsaufbau mit Hitzebestrafung bewährt hatte, wurde versucht, bestimmte Sub-population von Neuronen von Drosophila zu aktivieren, während die Fliege auf dem Ball läuft. Die selektive Aktivierung von Neuronen wurde durch die Expression des lichtaktivierten Jonenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR-2) mit Hilfe des Gal4-UAS-System und Beleuchtung der Fliege mit Blaulicht erreicht, das die Kanäle aktiviert. Nun erfolgte eine Kopplung einer Laufrichtung auf dem Ball mit dem Auftreten von blauem Licht. Die Durchführbarkeit derartiger Experimente wurde durch die Aktivierung von zuckersensitiven gustatorischen Rezeptorneuronen getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Tiere bevorzugt die Richtung wählen, welche die Zuckerrezeptorneurone aktiviert. Anschließend aktivierten wir verschiedene Untergruppen von Neuronen des aminergen Systems. In diesem Versuchsaufbau beobachteten wir, dass die Tiere die Laufrichtung vermieden, die gekoppelt war mit der Aktivierung dopaminerger Neurone. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit Versuchen zum assoziativen Lernen, bei dem Dopamin wahrscheinlich notwendig ist für die Assoziation zwischen dem neutralen Konditionierungsstimulus und dem aversiven unkonditionierten Stimulus. Wenn wir jedoch die tyraminergen/oktopaminergen Neurone aktivierten, konnte keine gerichtete Präferenz nachgewiesen werden. Die Aktivierung dopaminerger und tyraminger/oktopaminerger Neurone führte jedoch zur Aktivitätssteigerung der Tiere, wodurch die erfolgreiche der Aktivierung der Neurone belegt wurde. Die Aktivierung serotonerger Neurone führte ebenfalls zu keinem Effekt in der Präferenz der Tiere. In zukünftigen Experimenten mit dem neu entwickelten Paradigma wäre es interessant, herauszufinden, ob in Insekten auch ein belohnungsabhängiges System existiert, vergleichbar dem von Säugern. So wäre die Identifizierung von Subpopulationen aminerger oder peptiderger Neurone des Belohnungssystems bei Insekten wichtig, da dies nicht in unseren Experimenten entdeckt wurde. Eine weitere interessante Fragestellung wäre, welche Gehirnstruktur die Richtungswahl auf dem Ball vermittelt. Teil II In Zussamenarbeit mit S. Kneitz (IZKF, Würzburg) und T. Nuwal wurde in der vorliegenden Arbeit die genomweite Genexpression einer Synapsin-Mutante (Syn97) und einer Mutante für das Synapsen-assoziierte-Protein von 47kDa (Sap47156) untersucht. Bei beiden Proteinen handelt es sich um präsynaptische Proteine von Drosophila. Ziel dieses Experiments war es, Gene zu identifizieren die aufgrund dieser Mutationen hoch bzw. herunterreguliert vorliegen. Durch das Microarray-Experiment wurden mehrere Kandidatengene entdeckt, wovon einige dieser Gene per qPCR-Versuchen verifiziert wurden. Aufgrund der qPCR-Analysen lässt sich schlussfolgern, dass nur das Cirl-Transkript in den Synapsin-Mutanten reproduzierbar herunterreguliert vorliegt. Das Cirl gene kodiert für einen Calcium independent receptor for Latrotoxin Weitere qPCR-Experimente sind notwendig, um die anderen Kandidatengene zu bestätigen. Die molekularen Interaktionen zwichen CIRL und Synapsin oder ihren Genen müssen nun im Detail untersucht werden. KW - Taufliege KW - Nervensystem KW - Amine KW - Synapsine KW - Optogenetik KW - Oktopamin KW - Dopamin KW - Channelrhodopsin KW - Synapsin KW - Sap47 KW - Cirl KW - Optogenetic KW - Channelrhodopsin KW - Dopamine KW - Octopamine KW - Synapsin KW - Sap47 KW - Cirl Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51694 ER - TY - THES A1 - Nuwal, Tulip T1 - Characterization of Synapsin, Tubulin-Binding Chaperone E-like, And Their Putative Interactions With Synapse Associated Protein Of 47 kDa In Drosophila melanogaster N2 - In this thesis we have used Drosophila melanogaster as a model organism to investigate proteins and their putative interacting partners that are directly or indirectly involved in the release of neurotransmitters at the synapse. We have used molecular techniques to investigate conserved synaptic proteins, synapsin and synapse associated protein of 47 kD (SAP47), and a putative interaction partner of SAP47, tubulin binding chaperone E-like (TBCEL). SAP47 and synapsins are highly conserved synaptic vesicle associated proteins in Drosophila melanogaster. To further investigate the role and function of Sap47 and Syn genes, we had earlier generated the null mutants by P-element mutagenesis (Funk et al., 2004; Godenschwege et al., 2004). Western blots and ELISA of brain homogenates from Sap47156 null mutants showed the presence of up-regulated phospho-synapsin in comparison to wild-type (CS) and the presence of up-regulated phospho-synapsin was partially abolished when a pan-neuronal rescue of SAP47 was performed by the Gal4- UAS technique. Thus, the results suggest a qualitative and quantitative modulation of synapsin by SAP47. At the transcript level, we did not observe any difference in content of Syn transcript in Sap47156 and wild-type CS flies. The question of a direct molecular interaction between SAP47 and synapsin was investigated by co-immunoprecipitation (Co-IP) experiments and we did not find any stable interactions under the several IP conditions we tested. The possibility of Sap47 as a modifier of Syn at the genetic level was investigated by generating and testing homozygous double null mutants of Sap47 and Syn. The Syn97, Sap47156 double mutants are viable but have a reduced life span and decreased locomotion when compared to CS. In 2D-PAGE analysis of synapsins we identified trains of spots corresponding to synapsins, suggesting that synapsin has several isoforms and each one of them is posttranslationally modified. In an analysis by Blue native-SDS-PAGE (BN-SDS-2D- PAGE) and Western blot we observed synapsin and SAP47 signals to be present at 700-900 kDa and 200-250 kDa, respectively, suggesting that they are part of large but different complexes. We also report the possibility of Drosophila synapsin forming homo- and heteromultimers, which has also been reported for synapsins of vertebrates. In parallel to the above experiments, phosphorylation of synapsins in Drosophila was studied by IP techniques followed by 1D-SDS gel electrophoresis and mass spectrometry (in collaboration with S. Heo and G. Lubec). We identified and verified 5 unique phosphorylation sites in Drosophila synapsin from our MS analysis. Apart from phosphorylation modifications we identified several other PTMs which have not been verified. The significance of these phosphorylations and other identified PTMs needs to be investigated further and their implications for synapsin function and Drosophila behavior has to be elucidated by further experiments. In a collaborative project with S. Kneitz and N. Nuwal, we investigated the effects of Sap156 and Syn97 mutations by performing a whole Drosophila transcriptome microarray analysis of the individual null mutants and the double mutants (V2 and V3). We obtained several candidates which were significantly altered in the mutants. These genes need to be investigated further to elucidate their interactions with Sap47 and Syn. In another project, we investigated the role and function of Drosophila tubulin- binding chaperone E-like (Tbcel, CG12214). The TBCEL protein has high homology to vertebrate TBCE-like (or E-like) which has high sequence similarity to tubulin-binding chaperone E (TBCE) (hence the name TBCE-Like). We generated an anti-TBCEL polyclonal antiserum (in collaboration with G. Krohne). According to flybase, the Tbcel gene has only one exon and codes for two different transcripts by alternative transcription start sites. The longer transcript RB is present only in males whereas the shorter transcript RA is present only in females. In order to study the gene function we performed P- element jump-out mutagenesis to generate deletion mutants. We used the NP4786 (NP) stock which has a P(GawB) insertion in the 5’ UTR of the Tbcel gene. NP4786 flies are homozygous lethal due to a second-site lethality as the flies are viable over a deficiency (Df) chromosome (a deletion of genomic region spanning the Tbcel gene and other upstream and downstream genes). We performed the P-element mutagenesis twice. In the first trial we obtained only revertants and the second experiment is still in progress. In the second attempt, jump-out was performed over the deficiency chromosome to prevent homologous chromosome mediated double stranded DNA repair. During the second mutagenesis an insertion stock G18151 became available. These flies had a P-element insertion in the open reading frame (ORF) of the Tbcel gene but was homozygous viable. Western blots of fresh tissue homogenates of NP/Df and G18151 flies probed with anti-TBCEL antiserum showed no TBCEL signal, suggesting that these flies are Tbcel null mutants. We used these flies for further immunohistochemical analyses and found that TBCEL is specifically expressed in the cytoplasm of cyst cells of the testes and is associated with the tubulin of spermatid tails in wild-type CS, whereas in NP/Df and G18151 flies the TBCEL staining in the cyst cells was absent and there was a disruption of actin investment cones. We also found enrichment of TBCEL staining around the actin investment cone. These results are also supported by the observation that the enhancer trap expression of the NP4786 line is localised to the cyst cells, similar to TBCEL expression. Also, male fertility of NP/Df and G18151 flies was tested and they were found to be sterile with few escapers. Thus, these results suggest that TBCEL is involved in Drosophila spermatogenesis with a possible role in the spermatid elongation and individualisation process. N2 - In dieser Arbeit benutzte ich Drosophila melanogaster als Modellorganismus für die Untersuchung von Proteinen und ihren möglichen Interaktionspartnern, die direkt oder indirekt an der Freisetzung von Neurotransmittern an der Synapse beteiligt sind. Für die Untersuchung der konservierten synaptischen Proteine Synapsin (SYN) und Synapsen-assoziertes Protein von 47 kDa (SAP47), sowie ihrer möglichen Interaktionspartner, bediente ich mich molekularer Methoden. SAP47 und SYN sind hoch konservierte Proteine von Drosophila melanogaster, die mit synaptischen Vesikeln assoziert sind. Um die Rolle und Funktion der Sap47- und Syn-Gene näher zu beleuchten, wurden bereits früher mit Hilfe von P-Element Mutagenesen Null Mutanten generiert (Funk et al., 2004; Godenschwege et al., 2004). Western Blots und ELISA der Gehirnhomogenate der Sap47156 Nullmutanten zeigten im Vergleich zum Wildtyp (CS) das Vorhandensein von hochreguliertem phospho-Synapsin. Dieser Effekt ließ sich durch ein panneuronales Rescue wieder partiell rückgängig machen. Diese Ergebnisse lassen eine qualitative sowie quantitative Modulation von SYN druch SAP47 vermuten. Auf der Transkriptebene konnte ich keinen Unterschied im Gehalt von Syn Transkript zwischen den Sap47156 und wildtypischen CS Fliegen feststellen. Das Vorhandensein einer direkten molekularen Interaktion zwischen SAP47 und SYN wurde in Co-Immunopräzipitations-Experimenten (CO-IP) untersucht. Ich konnte unter diversen getesteten IP Bedingungen keine stabilen Interaktionen finden. Die Möglichkeit, dass Sap47 auf der molekularen Ebene modifizierend auf das Syn-Gen wirkt, wurde durch das Erzeugen und Testen homozygoter doppelter Nullmutanten für Sap47 und Syn untersucht. Syn97, Sap47156 Doppelmutanten sind lebensfähig, zeigen jedoch eine im Vergleich zu CS reduzierte Lebensspanne und Lokomotion. In einer 2D-SDS-PAGE Analyse der Synapsine identifizierte ich Reihen von Synapsin-Signalen, die darauf schließen ließen, dass Synapsin über mehrere Isoformen verfügt, von denen jede mehrfach posttranslational modifiziert ist. In einer Blue native-SDS-PAGE (BN-SDS-2D-PAGE) mit anschließendem Western Blot konnte ich Synapsin und SAP47 Signale bei 700-900 kDa beziehungsweise 200-250 kDa feststellen, was darauf schließen ließ, dass sie als Komponenten von unterschiedlichen größeren Komplexen fungieren. Ich zeigte außerdem die Möglichkeit auf, dass Drosophila Synapsin Homo- und Heteromultimere bilden kann, was bereits für Synapsine von Wirbeltieren gezeigt wurde. Gleichzeitig mit den obigen Experimenten untersuchte ich durch IP Methoden, gefolgt von 1D SDS Gelelektrophorese und Massenspektroskopie (in Zusammenarbeit mit S. Heo und G. Lubec), die Phosphorylierung der Synapsine in Drosophila. In der MS Analyse konnte ich 5 distinkte Phosphorylierungs-Stellen des Drosophila Synapsins identifizieren und verifizieren. Zusätzlich zu den Modifikationen durch Phosphorylierung konnte ich einige andere posttranslationale Modifikationen zeigen, die jedoch nicht verifiziert wurden. Die Bedeutung dieser Phosphorylierung, sowie anderer identifizierter Modifikationen, sollte durch weitere Experimente beleuchtet werden. In einem Kollaborationsprojekt mit S. Kneitz und N. Nuwal untersuchte ich die Auswirkungen der Sap47156 und Syn97 Mutationen mithilfe einer Microarray Analyse des gesamten Drosophila Transkriptoms der individuellen Nullmutanten sowie Doppelmutanten (V2 und V3). Es wurden einige Kandidaten gefunden, die in den Mutanten signifikante Änderungen aufweisen. Diese Gene sollten weiterhin auf ihre Interaktionen mit Sap47 und Syn untersucht werden. In einem weiteren Projekt untersuchte ich die Rolle und Funktion des Drosophila tubulin binding chaperon E-like-Gens(Tbcel, CG12214). Das TBCEL Protein weist eine hohe Homologie zum Vertebraten TBCE-like (oder E-like) auf, welches über eine namensgebende hohe Sequenzähnlichkeit zum Tubulin bindenden Chaperon E (TBCE) verfügt. Ich erzeugte ein polyklonales anti-TBCEL Antiserum (in Kollaboration mit G. Krohne). Laut Flybase besitzt das Tbcel-Gen nur ein Exon und kodiert für zwei unterschiedliche Transkripte durch alternative Orte des Transkriptionsstarts. Das längere Traskript RB ist nur in Männchen vorhanden, während das kürzere Transkript RA sich nur in Weibchen finden lässt. Um eine Untersuchung der Genfunktion zu ermöglichen, führte ich eine P-Element jump-out-Mutagenese durch, mit der Deletions-Mutanten generiert werden sollten. Ich benutzte dazu den Stamm NP4786 (NP), welches eine P(GawB) Insertion in der 5´ UTR des Tbcel-Gens aufweist. NP4786 Fliegen sind aufgrund einer second-site Lethalität homozygot letal, da sie über einer chromosomalen Defizienz (Df) (einer Deletion der genomischen Region, die das Tbcel-Gen sowie benachbarte Gene umfasst) lebensfähig sind. Die P-Element jump-out-Mutagenese wurde von mir zweimal durchgeführt, wobei ich beim ersten Mal nur Revertanten erhielt, während der zweite Durchgang sich momentan noch in Arbeit befindet. Beim zweiten Versuch wurde der jump-out über dem Defizienz-Chromosom durchgeführt, um eine doppelsträngige DNA Reparatur durch das homologe Chromosom zu verhindern. Während der zweiten Mutagenese wurde ein Stamm G18151 verfügbar, bei welchem die P-Element Insertion im offenen Leseraster (Open reading frame: ORF) des Tbcel-Gens erfolgt war. Western Blots von frischem Gewebehomogenat der NP/Df und G18151 Fliegen zeigten nach dem Testen mit anti-TBCEL Antiserum kein Signal, was darauf schließen lässt, dass diese Fliegen Tbcel Nullmutanten sind. Ich verwendete diese Fliegen für weitere immunhistochemische Analysen und fand heraus, dass TBCEL im Wildtyp spezifisch im Zytoplasma der Cysten-Zellen der Hoden exprimiert wird, sowie mit dem Tubulin der Spermatidenschwänze assoziert ist, während es in den NP/Df und G18151 Fliegen keine TBCEL-Färbung der Cysten-Zellen gab. Des weiteren konnte eine Störung der Actin Kegel und eine Anreicherung von TBCEL um diese herum gezeigt werden. Diese Ergebnisse werden zusätzlich durch die Beobachtung unterstützt, dass die Enhancer-trap Expression der NP4786 Linie analog zu dem TBCEL in den Cysten-Zellen lokalisiert ist. Zusätzlich wurde die Fertilität der NP/Df und G18151 Männchen getestet und gezeigt, dass diese Tiere nahezu vollständig steril sind. Die Ergebnisse lassen daher vermuten, dass TBCEL an der Spermatogenese bei Drosophila beteiligt ist, sowie eine mögliche Rolle bei der Elongation und Individualisierung der Spermatiden spielt. KW - Taufliege KW - Synapsine KW - Molekularbiologie KW - synaptisch protein KW - synapsin KW - tubulin binding chaperone E-like KW - SAP47 KW - Massenspektrometrie KW - synaptic proteins KW - synapsin KW - tubulin binding chaperone E-like KW - SAP47 KW - mass spectrometry Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51683 ER - TY - THES A1 - Matthes, Daniel T1 - Molekulare Untersuchungen zum Gag-Protein der Foamyviren T1 - Molecular analysis of the foamyviral Gag protein N2 - Foamyviren (FV) weisen eine Reihe von Merkmalen auf, welche sie von Orthoretroviren unterscheidet, die sie jedoch gleichzeitig mit den Hepadnaviren teilen. Dies betrifft neben der Genomorganisation, der Proteinexpression sowie dem Replikationsverhalten auch die Partikelmorphogenese. Die zentrale Komponente in diesem Prozeß stellt das Gag-Protein dar. FV benötigen im Gegensatz zu Orthoretroviren und vergleichbar den Hepadnaviren die Koexpression des homologen Glykoproteins für den zellulären Partikelexport. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde mittels eines chimären Konstruktes aus den Gag-Proteinen von MPMV und PFV versucht, ein Env-interagierendes Motiv sowie die für die Interaktion mit dem Glykoprotein essentiellen As in PFV Gag zu identifizieren. Dabei wiesen die chimären Gag-Proteine Gemeinsamkeiten mit PFV Gag auf, wie eine perinukleäre Akkumulation, eine Vorraussetzung für das Assembly sowohl von PFV als auch MPMV. Desweiteren waren die Gag-Chimären für einen zellulären Export auf die Koexpression des homologen Glykoproteins angewiesen. Dies deutete auf die Integrität und Funktionalität des dafür notwendigen PFV Gag N-Terminus hin. Die chimären Gag-Moleküle multimerisierten jedoch nicht zu Kapsiden oder vergleichbaren partikulären Strukturen, vermutlich aufgrund massiver sterischer Zwänge infolge der Beteiligung heterologer Proteindomänen, weswegen sie kein geeignetes System zur funktionellen Analyse der PFV Gag-Env-Interaktion darstellten. Eine weitere Besonderheit foamyviraler Gag-Proteine ist ihr äußerst geringer Lysinanteil. Im Gegensatz zu den Gag-Proteinen der Orthoretroviren wird der überwiegende Anteil basischer Aminosäuren (As) durch Arginin vertreten. Da über 60 % der Arginin-spezifizierenden Kodons über eine Einzelmutation aus Lysin-Kodons hervorgegangen sein könnten, ist es wahrscheinlich, daß im Verlauf der foamyviralen Evolution eine positive Selektionierung von Gag-Mutanten mit einer Lysin-zu-Arginin-Substitution stattfand. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde anhand der Beispiele von PFV sowie FFV der Frage nachgegangen, welche Funktionen Arginine in foamyviralen Gag-Proteinen während der Replikation übernehmen. Dazu wurde in infektiösen PFV- sowie FFV-Klonen eine Reihe von Argininen gegen Lysine substituiert. Zusätzlich wurde das singuläre Lysin in PFV Gag gegen Arginin substituiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß sämtliche PFV- sowie FFV-Mutanten replikationskompetent waren. Das singuläre Lysin in PFV Gag war für dessen Replikation in immortalisierten Zellen entbehrlich, in einer primären Zellinie wies die entsprechende Mutante jedoch eine stark eingeschränkte Replikationsfähigkeit auf. Eine PFV-Substitutionsmutante (M141) induzierte in transfizierten 293T-Zellkulturen einen CPE, ein Hinweis auf eine Beteiligung dieses Gag-Abschnittes an der Interaktion mit dem PFV Glykoprotein. Nach zehnmaliger Zellkultur-Passagierung der PFV Gag-Mutanten traten weder Revertanten noch Pseudorevertanten auf, was jedoch aufgrund der kurzen Zeitspanne des Experimentes nur eine begrenzte Aussagekraft bezüglich der genetischen Stabilität der Mutanten zuließ. Mittels der Applikation von AZT, eines Inhibitors der foamyviralen reversen Transkription, entweder auf die virusproduzierenden Zellen oder die zur Infektion verwendeten Zielzellen konnte gezeigt werden, daß sich die PFV Gag-Lysinmutanten hinsichtlich ihrer Replikationsstrategie nicht von WT-Viren unterscheiden und ihre genomische RNA größtenteils noch in der Produktionszelle revers transkribieren. Desweiteren konnte mittels quantitativer real-time PCR nachgewiesen werden, daß die PFV- und FFV-Mutanten wie für FV üblich sowohl DNA als auch RNA in ihre Partikel verpacken. Die infektiöse Natur foamyviraler genomischer DNA konnte bereits in früheren Veröffentlichungen gezeigt werden. Auch in dieser Arbeit konnte nach Transfektion von Zellen mit aufgereinigter Virionen-DNA und anschließendem Überstandtransfer ein CPE in den infizierten Indikatorzellen induziert werden, was die Produktion infektiöser Viruspartikel bewies. Die -Aminogruppe von Lysin fungiert als potentieller Ubiquitinakzeptor. Für das singuläre Lysin im WT Gag-Protein von PFV konnte wie in früheren Veröffentlichungen keine Ubiquitinierung festgestellt werden, im Gegensatz dazu wurde bei vier der fünf PFV Substitutionsmutanten eine Ubiquitinierung der neu eingeführten Lysine detektiert. Diese kovalente Modifikation hatte jedoch keinen Einfluß auf die Env-Restriktion des PFV-Kapsidexportes aus der Zelle. Für FFV konnte sowohl für den WT als auch die Substitutionsmutanten weder eine LP- noch eine Gag-Ubiquitinierung festgestellt werden. Als wahrscheinliche Ursache dafür kommen Unterschiede in den Komponenten der Ubiquitinierungsmaschinerie zwischen humanen Zellen und Katzenzellen in Frage, weshalb die Analyse einer möglichen Ubiquitinierung der neu in FFV Gag eingeführten Lysine in Katzenzellen als Produktionszellen durchgeführt werden sollte. Die Replikationsfähigkeit mehrerer Substitutionsmutanten der Gegenwart von IFN- und - war im Vergleich zum WT stark eingeschränkt. Dies deutete darauf hin, daß IFN-vermittelte Abwehrmechanismen eine Rolle während der positiven Selektion der Lysin-zu-Arginin-Substitutionsmutanten gespielt haben könnten. Die in dieser Arbeit erzielten Resultate zeigten, daß sich die PFV- sowie FFV-Lysinmutanten in ihrem Replikationsverhalten nicht von WT-Viren unterscheiden. Im Kontext einer über Millionen von Jahren andauernden Wirts-Erreger-Koevolution stellt jedoch der durch zelluläre Restriktionsfaktoren vermittelte Selektionsdruck auf das Virus einen wichtigen Aspekt dar. Demnach könnte die Substitution von Lysin gegen Arginin beispielsweise über eine veränderte kovalente Modifikation eine Interaktion mit antiretroviralen Restriktionsfaktoren der Wirtszelle modifiziert oder inhibiert haben, wodurch diese Mutanten im Verlauf der foamyviralen Evolution positiv selektioniert wurden. N2 - Foamyviruses (FV) harbour several features which distinguishes them from orthoretroviruses and which they share with the hepadnaviruses. Beside differences in the genomic organization, the protein expression and the replication strategy this referrs to the morphogenesis of viral particles, in which the Gag protein plays the key role. In contrast to orthoretroviruses and like hepadnaviruses, cellular egress of FV capsids depends on the presence of cognate Env protein. In the first part of this work it was tried to identify an Env-interacting motif as well as essential amino acids (aa) involved in the recognition of the glycoprotein in PFV Gag. Therefore a chimeric construct containing parts of the Gag proteins of Mason-Pfizer monkey virus (MPMV) and PFV was constructed. Like PFV Gag, the chimeric Gag proteins showed a perinuclear accumulation, a feature of PFV and MPMV assembly. Additionally, cellular export of the Gag chimerics was PFV Env restricted. This pointed to the integrity and functionality of the PFV Gag N-terminus in the chimeric construct. Nevertheless, chimeric Gag molekules didn´t multimerize to capsids or comparable particle structures. This was probably caused by massive sterical disorders, due to the involvement of heterologous protein domains. Therefore, the Gag chimerics didn´t represent an appropriate system for the functional analysis of the PFV Gag-Env interaction. Another peculiarity of foamyviral Gag proteins is their extremely low lysine content. In contrast to orthoretroviral Gag proteins, the main part of basic aa is represented by arginines. Due to the fact that more than 60 % of the arginine-specifying codons could have evolved out of lysine-specifying codons over a single point mutation, a positive selection of Gag mutants with a lysine-to-arginine substitution in the course of foamyviral evolution is likely. In the second part of this work, functions of arginines in foamyviral Gag proteins during replication were studied by using infectious molecular clones of PFV and FFV. Therefore several arginines were substituted for lysines. Additionally the single lysine in PFV Gag (K396) was mutated to arginine. All PFV as well as FFV mutants were replication-competent. Additionally, the single lysine in PFV Gag was non-essential for replication in immortalized cell culture, whereas replication was strongly inhibited in a primary cell line. One PFV substitution mutant (M141) induced an CPE in transfected 293T-cell culture, an indication of an involvement of this part of Gag in the interaction with the PFV glycoprotein. Upon ten cell-free passages of PFV Gag mutants in cell culture, neither revertants nor pseudorevertants appeared, indicating genetic stability during a short-term cell culture experiment. By application of AZT, an inhibitor of the foamyviral reverse transcription, on producer cells or target cells it was shown that the reverse transcription of the genomic RNA of the PFV Gag lysine mutants occured mainly in the producer cell and that they therefore didnt differ from wild-type (wt) virus with respect to replication strategy. By quantitative real-time PCR it was shown that PFV and FFV mutants incorporate DNA as well as RNA in particles. Like in recent publications, the infectiousness of foamyviral genomic DNA could be demonstrated in this work. By transfecting cells with extracted virion DNA and following supernatant transfer a CPE could be induced in the infected target cells, showing the production of infectious virus. The -aminogroup of lysine functions as a potential ubiquitin acceptor. Like in recent publications, no ubiquitination of the single lysine in PFV wt Gag could be detected. In contrast, four out of five PFV substitution mutants showed ubiquitination of the introduced lysines. Nevertheless, Gag mutants with this covalent modification didn´t have the ability to generate virus like particles (VLPs) or to be pseudotyped by heterologous Env. For FFV wt and mutants, neither Env leader peptide nor Gag ubiquitination could be detected. Differences in components of the ubiquitinination machinery between human cells and feline cells are a probable reason for this. Therefore the analysis of ubiquitiniation of the newly introduced lysines in FFV Gag should be carried out in feline cells as producer cells. Replication of several substitution mutants was strongly inhibited compared to wt virus in the presence of IFN- and -. These results indicated that IFN mediated defense mechanisms could have played a role in the positive selection of the lysine-to-arginine substitution mutants. These results show that the PFV and FFV mutants didn´t differ from wt viruses with respect to their replication strategy. In the context of the long-term host-pathogen coevolution the selection pressure on the virus mediated by cellular restriction factors represents an important aspect dar. The mutation from lysines to arginines implying an altered covalent modification of Gag could have lead to an modification or inhibition of the interaction with antiretroviral restriction factors of the host cell, leading to a positive selection of these mutants during foamyviral evolution. KW - Spumaviren KW - Gag-Proteine KW - Spumaviruses KW - Gag protein Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52162 ER - TY - THES A1 - Nietzer, Sarah T1 - Gene and environment interactions in serotonin transporter knockout mice – how stress influences gene expression and neuronal morphology T1 - Gen-Umwelt-Interaktionen in Serotonin-Transporter-Knockout-Mäusen - Wie Stress die Genexpression und die neuronale Morphologie beeinflusst N2 - Serotonin (5-HT) is an important modulator of many physiological, behavioural and developmental processes and it plays an important role in stress coping reactions. Anxiety disorders and depression are stress-related disorders and they are associated with a malfunction of the 5-HT system, in which the 5-HT transporter (5-HTT) plays an important role. 5-Htt knockout (KO) mice represent an artificially hyperserotonergic environment, show an increased anxiety-like behaviour and seem to be a good model to investigate the role of the 5-HT system concerning stress reactions and anxiety disorders. As synaptic proteins (SPs) seem to be involved in stress reactions, the effect of acute immobilization stress on the expression of the three SPs Synaptotagmin (Syt) I, Syt IV and Syntaxin (Stx) 1A was studied in the 5-Htt KO mouse model as well as the expression of the two immediate early genes (IEGs) FBJ osteosarcoma oncogene (c-Fos) and fos-like antigen 2 (Fra-2). Additionally, the expression of the corticotrophin releasing hormone (CRH) and its two receptors CRHR1 and CRHR2 was investigated as part of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) stress system. Based on gender- and genotype-dependent differences in corticosterone levels, expression differences in the brain were investigated by performing a quantitative real time-PCR study using primer pairs specific for these SPs and for the IEGs c-Fos and Fra-2 in five different brain regions in 5-Htt KO and 5-Htt wild-type (WT) mice. Mainly gender-dependent differences could be found and weaker stress effects on the expression of SPs could be demonstrated. Regarding the expression of IEGs, stress-, gender- and genotype-dependent differences were found mainly in the hypothalamus. Also in the hypothalamus, gender effects were found concerning the expression of CRH and its both receptors. Additionally, in a second study, male 5-Htt WT and male 5-Htt deficient mice were subjected to a resident-intruder-paradigm which stresses the animals through a loser experience. The morphological changes of neurons were subsequently analyzed in Golgi-Cox-stained sections of limbic brain areas in stressed and unstressed animals of both genotypes using the computer-based microscopy system Neurolucida (Microbrightfield, Inc.). While no differences concerning dendritic length, branching patterns and spine density were found in the hippocampus and no differences concerning dendritic length and branching patterns could be shown in the cingulate cortex (CG), pyramidal neurons in the infralimbic cortex (IL) of stressed 5-Htt WT mice displayed longer dendrites compared to unstressed 5-Htt WT mice. The results indicate that, although in this model drastic alterations of neuronal morphology are absent, subtle changes can be found in specific brain areas involved in stress- and anxiety-related behaviour which may represent neural substrates underlying behavioural phenomena. N2 - Serotonin (5-HT) ist ein wichtiger Modulator vieler physiologischer, verhaltensbiologischer und entwicklungsbiologischer Vorgänge und spielt zudem eine wichtige Rolle bei der Stressbewältigung. Angsterkrankungen und Depression sind stressbedingte Störungen und sie sind mit einer Dysfunktion des serotonergen Systems assoziiert, in dem der Serotonintransporter (5-HTT) eine wichtige Funktion einnimmt. 5-Htt Knockout (KO)-Mäuse haben reduzierte Serotoninkonzentrationen im Gehirn, zeigen erhöhtes Angst-ähnliches Verhalten und scheinen ein gutes Modell für die Erforschung der Rolle des serotonergen Systems in Bezug auf Stress-Reaktionen und Angsterkrankungen darzustellen. Da synaptische Proteine (SPs) in die Stress-Reaktion involviert zu sein scheinen, wurden die Auswirkungen von akutem Immobilizierungsstress auf die Expression der drei SPs Synaptotagmin (Syt) I, Syt IV und Syntaxin (Stx) 1A in diesem 5-Htt KO-Maus-Modell untersucht. Ebenso wurde die Expression der zwei „immediate early genes“ (IEGs) FBJ osteosarcoma oncogene (c-Fos) and fos-like antigen 2 (Fra-2) unter die Lupe genommen. Außerdem wurde die Expression des „Corticotrophin Releasing Hormone“ (CRH) sowie seiner beiden Rezeptoren CRHR1 and CRHR2, als Teil des Hypothalamus- Hypophysen-Nebennieren-(HPA)-Systems, analysiert. Basierend auf Geschlechts- und Genotyp-spezifischen Unterschieden der Kortikosteron-Konzentrationen im Blut der Tiere wurden die Expressionslevel dieser SPs und der beiden IEGs mittels quantitativer Real-Time (qRT)-PCR in fünf verschiedenen Gehirnregionen von 5-Htt KO- und 5-Htt-Mäusen mit wildtypischer (WT) Gen-Konstitution untersucht. Dabei konnten vor allem Geschlechts-spezifische Unterschiede in der Genexpression gezeigt werden und es konnte ein im Vergleich dazu schwächerer Einfluss des akuten Immobilisierungs-Stresses auf die Genexpression nachgewiesen werden. Die Expression der IEGs wurde durch Stress, Geschlecht und Genotyp vor allem im Hypothalamus beeinflusst. Ebenfalls im Hypothalamus konnte der Einfluss des Geschlechts auf die Expression des CRH und seiner beiden Rezeptoren gezeigt werden. In einer zweiten Studie wurden männliche 5-Htt KO-Mäuse sowie 5-Htt WT-Mäuse dem „Resident-Intruder-Paradigma“ unterzogen, in welchem die Tiere mittels einer mehrfachen Verlierer-Erfahrung gestresst wurden. Morphologische Veränderungen von Neuronen limbischer Gehirnareale wurden daraufhin an Golgi-Cox-gefärbten Gehirnschnitten dieser gestressten und ungestressten 5-Htt KO- und 5-Htt WT-Tiere mittels des Computer-gestützten Mikroskop-Systems Neurolucida (Microbrightflield, Inc.) analysiert. Während keine Unterschiede bezüglich der Länge des dendritischen Materials, des Verzweigungsmusters und der Spinedichte im Hippocampus gefunden werden konnten und keine Unterschiede in Länge des dendritischen Materials und des Verzweigungsmusters in der Area cinguli (CG) gezeigt werden konnten, wiesen Pyramidenzellen im infralimbischen Kortex (IL) von gestressten 5-Htt WT-Mäusen längere Dendriten auf als die entsprechenden Zellen in den ungestressten Tieren desselben Genotyps. Diese Ergebnisse zeigen, dass, obwohl in diesen Tieren keine drastischen stressbedingten Änderungen der neuronalen Morphologie vorliegen, doch subtile Änderungen der neuronalen Morphologie stress- und angstinvolvierter Gehirnareale gefunden werden können. Diese Änderungen können die neuronale Basis verschiedenster Verhaltens-Phänomene darstellen. KW - Serotonin KW - Stressreaktion KW - Knockout KW - Genexpression KW - Neuromorphologie KW - Neurolucida KW - Sozialer Stress KW - Stress KW - neuromorphology KW - neurolucida Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54391 ER - TY - THES A1 - Müller, Judith T1 - Die Rolle der HectH9/Mcl1-Interaktion in der Myc-induzierten Apoptose und Auswirkungen der Myc V394D-Mutation auf die von c-Myc gesteuerten Tumorgenese in einem transgenen Mausmodell T1 - Role of the HectH9/Mcl1 interaction in Myc-induced apoptosis and Impact of the Myc V394D mutation in c-Myc-driven murine lymphomagenesis N2 - Während der Entstehung von Tumoren können zwei Mechanismen auftreten, die beide von der Aktivität der Onkogene abhängig sind und die Tumorgenese einschränken. Für das Onkogen Myc ist gezeigt, dass es sowohl Apoptose als auch unter bestimmten Umständen Seneszenz auslösen kann und damit sein eigenes onkogenes Potential limitiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich mich mit diesen Tumor-suppressiven Mechanismen in zwei unabhängigen Teilprojekten beschäftigen. Eine erhöhte Expression von Myc steigert die Proliferation der Zellen, induziert aber gleichzeitig Doppelstrangbrüche an der DNA. Durch den dadurch entstandenen Schaden wird die DNA-Schadensantwort ausgelöst, die zum Beispiel zur Phosphorylierung von H2A.X durch die Kinasen Atm und Atr führt. Ein weiteres putatives Zielprotein dieser Kinasen ist HectH9, das abhängig vom DNA-Schaden das mitochondriale Protein Mcl1 ubiquitiniert und es damit für den proteasomalen Abbau markiert. Im ungestressten Zustand interagiert das in der mitochondrialen Membran lokalisierte Protein Mcl1 mit proapoptotischen Proteinen und hält deren inerten Status aufrecht. Die Reduktion der Mcl1-Mengen ist essentiell, um die proapoptotischen Proteine zu aktivieren, dadurch die Freisetzung von Zytochrom C aus dem Mitochondrium zu veranlassen und damit den Prozess der Apoptose einleiten zu können. Anhand der in dieser Arbeit dokumentierten Daten bietet sich Mcl1 als potentielles Zielprotein für pharmazeutisch Strategien zur Therapie Myc-induzierter Tumore an. Im Idealfall erhöht eine verstärkte Reduktion seiner Proteinmengen die zelluläre Apoptose und verringert somit das Tumorwachstum. Im murinen T-Zell-Lymphom wird die Myc-abhängige Tumorgenese durch eine Mutation der Proteinsequenz von Myc verlangsamt. Diese Mutation unterbindet die Bindung von Myc zu Miz1 und verhindert dadurch die Repression von Zielgenen. Abhängig von der Interaktion von Myc zu Miz1 gelingt die Inhibition der Transkription des Zellzyklusinhibitors p15Ink4b. Die Interaktion von Myc und Miz1 ist essentiell um die TGFbeta-abhängige Seneszenz zu umgehen. Darüber hinaus ist Myc direkt an der Repression von TGFbeta beteiligt. Entgegen der bisher verwendeten Modelle konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Myc unabhängig von Miz1 zu den Promotoren der reprimierten Zielgene rekrutiert wird und die Bindung der beiden Proteine offensichtlich nur für die Transrepression essentiell ist. N2 - Apoptosis and senescence are two distinct mechanisms that are induced by oncogenes to limit their oncogenic potential during tumorigenesis. Their appearance seems to be dependent on the specific oncogene. For a long time it is known that the oncogene Myc is a strong inducer of apoptosis. Latest results revealed, that Myc is also able to induce senescence, to prevent transformed cells from proliferating. Within the framework of my PhD I concentrated on both tumor suppressive mechanisms in two independent particular projects. Increased expression and activity of Myc enhances cell proliferation and thereby induces DNA double strand breaks. This damage activates a DNA damage response which leads to Atm/Atr mediated phosphorylation of H2A.X. A further target of the kinases Atm and Atr is HectH9 which ubiquitinates the mitochondrial protein Mcl1 in a DNA damage dependent manner. The ubiquitination of Mcl1 labels this protein for proteasomal degradation. In unstressed cells Mcl1 is located in the mitochondrial membrane where it interacts with proapoptotic members of the Bcl2 family inhibiting their activity. The reduction of Mcl1 protein is essential for the activation of proapoptotic proteins at the mitochondrium allowing release of cytochrome c as initial step in apoptosis. Myc mediated tumorigenesis is limited by using a mutant form of Myc as driving oncogene. This mutation inhibits interaction of Myc to its binding partner Miz1. The interaction of Myc and Miz1 is required to repress target genes like p21Cip1 and p15Ink4b. In vivo experiments demonstrate that Myc and Miz1 need to bind to each other to bypass TGFbeta-dependent senescence. This process is dependent on elevated levels of Myc consequently reduction to physiological levels of the protein induces apoptosis and senescence in a TGFbetadependent mannerIn addition, there is evidence that Myc is directly involved in the repression of Tgfbeta. In contrast to established models of repression by the Myc/Miz1 complex, it was shown, that Myc is recruited to and binds target DNA independently of Miz1. Therefore, I suggest that interaction of both proteins is essential only at the step of transcriptional initiation. KW - Myc KW - Apoptosis KW - DNS-Schädigung KW - Transforming Growth Factor beta KW - T-Zell-Lymphom KW - Seneszenz KW - Ubiquitinierung KW - Miz1 KW - p15Ink4b KW - senescence KW - ubiquitination KW - Miz1 KW - p15Ink4b Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55789 ER - TY - THES A1 - Hornbach, Anke T1 - Aktivierungsmuster humaner neutrophiler Granulozyten nach Kontakt mit den pathogenen Pilzen Candida albicans und Aspergillus fumigatus T1 - Activation patterns of human neutrophils after contact with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus und Candida albicans N2 - Humane neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr invasiver Infektionen durch die humanpathogenen Pilze Candida albicans und Aspergillus fumigatus. Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit bestand in einer Charakterisierung der Interaktion beider Pilzspezies mit neutrophilen Granulozyten, mit Fokussierung auf die unterschiedlichen Effektormechanismen dieser Zellen. C. albicans exprimiert eine Reihe von Aspartatproteasen, welche mit der Virulenz des Erregers assoziiert sind und zu Adhäsion, Gewebeinvasion und Immunevasion beitragen können. In dieser Arbeit wurde die Rolle der Aspartatproteasen Sap1-6, Sap9 und Sap10 in der Interaktion mit neutrophilen Granulozyten analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass, im Gegensatz zu anderen Aspartatproteasen, das zelloberflächenassoziierte GPI-verankerte Enzym Sap9 einen maßgeblichen Einfluss auf die Erkennung von C. albicans durch neutrophile Granulozyten hat. SAP9-Expression ist erforderlich, um die gerichtete Motilität (Chemotaxis) neutrophiler Granulozyten zu C. albicans-Keimschläuchen hin zu induzieren. Dieser Prozess stellt eine Grundvoraussetzung zur effektiven Aktivierung neutrophiler Granulozyten darstellt. Die Chemotaxis neutrophiler Granulozyten kann durch autologe Sekretion des Zytokins IL-8 verstärkt werden. Es konnte jedoch kein Einfluss von SAP9 auf die IL-8 Sekretion beobachtet werden. Allerdings führte die Deletion von SAP9 zu reduzierter Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species, ROS) in neutrophilen Granulozyten. Die mit der ROS-Generierung in Verbindung stehende und durch C. albicans induzierte Apoptose neutrophiler Granulozyten war ebenfalls vermindert. In Konfrontationsassays war die Abtötung einer SAP9-Deletionsmutante verglichen mit dem Wildtyp reduziert. Die Degranulation stellt neben der Produktion von ROS einen weiteren wichtigen Effektormechanismus zur Abtötung von Mikroben dar, jedoch verlief die Freisetzung von Elastase ebenso unabhängig von SAP9 wie die durch neutrophile Granulozyten ausgelöste Wachstumsinhibition von Keimschläuchen. Die hier präsentierten Daten verbinden die Aktivität der Protease Sap9, der zuvor bereits eine Rolle in der Immunevasion von C. albicans zugeschrieben wurde, mit der Initiation der protektiven angeborenen Immunität. Wie C. albicans stimuliert auch A. fumigatus die Aktivität der neutrophilen Granulozyten. Microarray- Analysen mit Fokus auf dem Zytokinprofil neutrophiler Granulozyten während der Interaktion mit A. fumigatus-Hyphen offenbarten, dass nur wenige Zytokine im Lauf der Infektion hochreguliert wurden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Sap-Granulozyten-Interaktion neue molekulare Mechanismen zur Aktivierung dieser Zellen birgt. Zudem brachten die Microarray Analysen die Erkenntnis, dass die de novo-Zytokinsynthese durch A. fumigatus nur geringfügig beeinflusst wird und eine schnelle Abtötung des Pilzes offenbar im Vordergrund steht. N2 - Human polymorphonuclear neutrophils (PMNs) play a major role in the immune defence against invasive infections caused by the pathogenic fungi Candida albicans and Aspergillus fumigatus. The aim of this work was to further characterize the interaction of both fungi with PMNs with a focus on diverse PMN effector functions. C. albicans expresses a set of aspartic proteases which are associated with virulence and can contribute to adhesion, tissue invasion and immune evasion. Here, the role of the aspartic proteases Sap1-6, Sap9 and Sap10 in the interaction with human neutrophils was analysed. It could be demonstrated that, in contrast to other aspartic proteases, the cell surface associated GPI-anchored enzyme Sap9 has a major impact on recognition of C. albicans by PMNs. SAP9 expression is required for the effective induction of PMN chemotaxis towards C. albicans filaments, an essential prerequisite of effective PMN activation. Targeted motility can be enhanced by autologous secretion of IL-8, but no influence of SAP9 on the process of IL-8 secretion could be observed here. However, deletion of SAP9 led to a mitigated release of reactive oxygen intermediates (ROI) in human PMNs. Likewise, C. albicans induced apoptosis triggered by ROI formation was decreased. In confrontation assays, killing of a SAP9 deletion mutant was reduced in comparison to the wild-type. Beside ROI production, degranulation represents an additional important effector mechanism contributing to microbial killing, however, the release of elastase in response to C. albicans was found to be not dependent on SAP9, as well as the PMN-mediated growth inhibition of germ tubes. The data presented here clearly implicate Sap9 protease activity, which was already attributed to immune evasion before, with the initiation of protective innate immunity. Like C. albicans, A. fumigatus evokes PMN antifungal activity. Custom-made microarray analyses focusing on the cytokine profile of PMNs during interaction with A. fumigatus hyphae revealed that only few cytokines are upregulated during the course of infection. In summary it could be demonstrated that the interaction between Saps and PMNs is revealing novel molecular mechanisms which lead to an activation of these cells. Furthermore, microarray analyses lead to the awareness that de novo cytokine synthesis of PMNs is barely influenced by A. fumigatus, pointing out that instant killing of the fungus might be of higher importance. KW - Neutrophile Granulozyten KW - Aspergillus fumigatus KW - Candida albicans KW - Immunreaktion KW - neutrophile Granulozyten KW - Aspergillus fumigatus KW - Candida albicans KW - neutrophils KW - Aspergillus fumigatus KW - Candida albicans Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53520 ER - TY - THES A1 - Ulbrich, Jannes T1 - Integrierung und biochemische Charakterisierung ektoper BMP Rezeptoren in Zellmembranen T1 - The integration and biochemical characterization of ectopic BMP receptors in cell membranes N2 - BMPs vermitteln ihre zellulären Effekte durch Rekrutierung und Aktivierung von zwei Typen spezifischer, membranständiger Rezeptoren. Die genauen Mechanismen der Rezeptorakivierung und die Komposition eines funktionellen, signalvermittelnden Komplexes auf der Zelloberfläche sind in den letzten Jahren genau untersucht worden. Die dimere Natur aller BMPs, die Promiskuitivität der BMPs sowie der entsprechenden Rezeptoren und die unterschiedlichen Rezeptorkonformationen (PFC, BISC) erschweren jedoch die experimentelle Zugänglichkeit dieser Proteinfamilie. Um den Einfluss der Membranverankerung der Rezeptoren auf deren Affinität zu einzelnen Liganden zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden evaluiert, die eine quantitative Kopplung an Plasmamembranen ermöglichten. Die BMP Rezeptorektodomänen wurden u.a. mittels einer lysin-spezifischen Kopplung lipidiert, oder aber als His6-Ektodomänen an membranintegrierte Chelatlipide gekoppelt. N2 - BMPs elicit their cellular functions via recruitment and activation of specific receptor serin/threonine receptor kinases. The precise mechanisms leading to receptor activation and the composition of a functional signal transducing complex on the cell surface has been investigated intensively over the last decades. The dimeric nature of all BMPs, the promiscuity of both, the ligands and the receptors and the different receptor conformations on the cell surface (PFC, BISC) hamper the experimental accessibility of this protein family. To study the membrane anchorage's influence of the receptors on their affinity towards single ligands, different methods were evaluated that enabled us to couple the receptor ectodomains in a quantitative manner to plasma membranes. The BMP receptor ectodomains were, among other techniques, lipidated in a lysine specific way or coupled as hexahistidine fusion proteins to membrane integrated chelating lipids. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Transforming Growth Factor KW - Transforming Growth Factor beta KW - BMPs KW - BMP Rezeptoren KW - Proteinmodifikationen KW - Protein Lipidierungen KW - NTA Lipide KW - BMP KW - BMP receptos KW - protein modifications KW - protein lipidations KW - NTA lipids Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55462 ER - TY - THES A1 - Reiß, Cora T1 - Einfluss von Defekten des Mismatch Reparatur Proteins MLH1 (Mut L Homolog 1) auf Fertilität und Tumorgenese im Mausmodell T1 - Impact of defects of the mismatch repair protein MLH1 (Mut L Homolog 1) on fertility and tumogenesis in mice N2 - Mutationen im humanen DNA Mismatch-Reparatur (MMR) Gens Mlh1 sind mit dem erblichen, nicht-polypösen Kolonkarzinom (Lynch Syndrom, HNPCC) und einem signifikanten Anteil sporadischer kolorektaler Tumore assoziiert. Zudem konnten MMR Defekte in sporadischen und erblichen Lymphom Erkrankungen beschrieben werden. In Zellen resultiert die Inaktivierung des Mlh1 Gens in der Akkumulation von somatischen Mutationen im Genom und einer erhöhten Resistenz gegenüber den genotoxischen Effekten einer Vielzahl von DNA schädigenden Agenzien. Mäuse, die ein Null Allel für das MMR Gen Mlh1 tragen zeigen einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickeln vorrangig B- und T-Zell Lymphome und mit geringerer Haufigkeit gastrointestinale Tumore. Zusätzlich sind Mlh1-/- Mäuse durch einen meiotischen Phänotyp charakterisiert, der zu Sterilitäten in beiden Geschlechtern führt. Um die Effekte von Mlh1 missense Mutationen auf die Tumoranfälligkeit zu untersuchen, erzeugten wir eine Mauslinie, die die häufig in HNPCC Patienten beschriebene MLH1G67R Mutation tragen, die in einer der ATP Bindungs-Domänen von MLH1 lokalisiert ist. Auch wenn die MLH1G67R Mutation in homozygot mutanten Mäusen in einer DNA Reparatur Defizienz resultierte hatte sie keinen Effekt auf die MMR vermittelte zelluläre Antwort auf DNA Schäden. Hierzu gehörte die apoptotische Antwort von Epithelzellen der intestinalen Mucosa auf Cisplatin, die in Mlh1-/- Mäusen defektiv jedoch in Mlh1G67R/G67R Mäusen normal ausfiel. Mlh1G67R/G67R mutante Mäuse zeigten wie Mlh1-/- Tiere einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickelten jedoch im Vergleich zu Mlh1-/- Tieren signifikant weniger gastrointestinale Tumore, was darauf hinweist, dass Mlh1 missense Mutationen die Tumor supprimierende MMR Funktion in einer Gewebs-spezifischen Weise beeinflussen können. Darüber hinaus sind Mlh1G67R/G67R Mäuse, aufgrund der fehlenden Bindungsfähigkeit des MLH1G67R Proteins an die meiotischen Chromosomen im Pachytän Stadium, steril. Dies zeigt, dass die ATPase Aktivität von MLH1 für die Fertilität in Säugern essentiell ist. Diese Untersuchungen belegen, dass die Mlh1G67R Mutation die biologischen MLH1 Funktionen differentiell mit einem eindeutigen Phänotyp beeinflusst. Um die Rolle von MLH1 für die Lymphomagenese detaillierter untersuchen zu können, generierten wir ein neues Mausmodell mit einem konditionellen Mlh1 Allel (Mlh1flox/flox). Das Einkreuzen von transgenen EIIa-Cre Mausen in die Mlh1flox/flox Mauslinie führte zur konstitutiven Inaktivierung von MLH1. Die resultierende Mlh1Δex4/Δex4 Mauslinie zeichnete sich durch MMR Defizienz und einen zu Mlh1-/- Tieren vergleichbaren Tumorprädispositions Phänotyp aus. Zur T-Zell spezifischen MMR Inaktivierung kombinierten wir das Mlh1flox/flox Allel mit dem Lck-Cre Transgen. In den resultierenden Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist die MLH1 Inaktivierung auf doppelt positive und einzel positive Thymozyten und naïve periphere TZellen beschränkt. Die Entwicklung von T-Zell Lymphomen in Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist im Vergleich zu Mlh1-/- Mäusen signifikant reduziert, was eine wichtige, Lymphom supprimierende MMR Funktion in frühen Stadien der T-Zell Entwicklung oder in lymphoiden Vorläuferzellen impliziert. N2 - Mutations in the human DNA mismatch repair (MMR) gene Mlh1 are associated with hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome, HNPCC) and a significant proportion of sporadic colorectal cancer. Furthermore, MMR defects have also been observed in sporadic and hereditary lymphoid malignancies. In cells the inactivation of MLH1 results in the accumulation of somatic mutations in the genome and an increased resistance to the genotoxic effects of a variety of DNA damaging agents. Mice carrying a null allele for the MMR gene Mlh1 show a strong tumor predisposition phenotype. They are preferentially prone to the development of lymphomas of B- and T-cell origin and to a lesser extent gastrointestinal tumors. Additionally Mlh1-/- mice are characterized by a meiotic phenotype leading to male and female sterility. To study the effect of Mlh1 missense mutations on cancer susceptibility, we generated a mouse line carrying the recurrent MLH1G67R mutation that is located in one of the ATP-binding domains of MLH1. Although the MLH1G67R mutation resulted in DNA repair deficiency in homozygous mutant mice, it did not affect the MMR-mediated cellular response to DNA damage, including the apoptotic response of epithelial cells in the intestinal mucosa to cisplatin, which was defective in Mlh1-/- mice but remained normal in Mlh1G67R/G67R mice. Similar to Mlh1-/- mice, Mlh1G67R/G67R mutant mice displayed a strong cancer predisposition phenotype. However, in contrast to Mlh1-/- mice, Mlh1G67R/G67R mutant mice developed significantly fewer intestinal tumors, indicating that Mlh1 missense mutations can affect MMR tumor suppressor functions in a tissue-specific manner. In addition, Mlh1G67R/G67R mice were sterile because of the inability of the mutant Mlh1G67R protein to interact with meiotic chromosomes at pachynema, demonstrating that the ATPase activity of MLH1 is essential for fertility in mammals. These studies demonstrate that the Mlh1G67R mutation differentially affects the biological functions associated with MLH1 with distinct phenotypic effects. To study the role of MLH1 for lymphomagenesis in more detail, we generated a new mouse model carrying a conditional Mlh1 allele (Mlh1flox/flox). Mating of these mice with EIIa-Cre recombinase transgenic mice allowed the constitutive inactivation of MLH1 and the resulting Mlh1Δex4/Δex4 mouse line displays complete MMR deficiency and a cancer predisposition phenotype similar to Mlh1-/- mice. For T-cell specific MMR inactivation we combined the Mlh1flox/flox allele with the Lck-Cre Transgene. In the resulting Mlh1TΔex4/TΔex4 mice, MLH1 inactivation is limited to double positive and single positive thymocytes and naïve peripheral Tcells. The development of T-cell lymphomas in Mlh1TΔex4/TΔex4 mice is significantly reduced compared to Mlh1-/- mice implicating that MMR functions either at very early stages during Tcell development or even earlier in lymphoid precursor cells to suppress lymphomagenesis. KW - Colonkrebs KW - Genmutation KW - DNS-Reparatur KW - MLH1 KW - HNPCC KW - Mutation KW - Mausmodell KW - Tumor KW - MLH1 KW - HNPCC KW - mutation KW - mousemodell Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53626 ER - TY - THES A1 - Aso, Yoshinori T1 - Dissecting the neuronal circuit for olfactory learning in Drosophila T1 - Die neuronale Schaltung für olfaktorisches Lernen in Drosophila N2 - This thesis consists of three major chapters, each of which has been separately published or under the process for publication. The first chapter is about anatomical characterization of the mushroom body of adult Drosophila melanogaster. The mushroom body is the center for olfactory learning and many other functions in the insect brains. The functions of the mushroom body have been studied by utilizing the GAL4/UAS gene expression system. The present study characterized the expression patterns of the commonly used GAL4 drivers for the mushroom body intrinsic neurons, Kenyon cells. Thereby, we revealed the numerical composition of the different types of Kenyon cells and found one subtype of the Kenyon cells that have not been described. The second and third chapters together demonstrate that the multiple types of dopaminergic neurons mediate the aversive reinforcement signals to the mushroom body. They induce the parallel memory traces that constitute the different temporal domains of the aversive odor memory. In prior to these chapters, “General introduction and discussion” section reviews and discuss about the current understanding of neuronal circuit for olfactory learning in Drosophila. N2 - Diese Dissertation umfasst drei Kapitel. Das erste Kapitel handelt von der anatomischen Charakterisierung des Pilzkörpers in adulten Drosophila melanogaster. Der Pilzkörper ist das Zentrum für olfaktorisches Lernen und viele andere Funktionen im Insektengehirn. Diese wurden mit Hilfe des GAL4/UAS Genexpressionssystems untersucht. Die vorliegende Arbeit charakterisiert die Expressionsmuster der gewöhnlich verwendeten GAL4 Treiberlinien für die Pilzkörperintrinsischen Neurone, den Kenyonzellen. Dabei zeigten ich die zahlenmäßige Zusammensetzung der unterschiedlichen Kenyonzelltypen und fanden einen Kenyonzellsubtyp, welcher bisher noch nicht beschrieben wurde. Das zweite und dritte Kapitel zeigen, dass verschiedene Typen dopaminerger Neurone aversive Verstärkungssignale (Unkonditionierte Stimuli) zum Pilzkörper übermitteln. Sie induzieren parallele Gedächtnisspuren, welche den unterschiedlichen zeitlichen Komponenten von aversivem Duftgedächtnis zugrunde liegen. Vor diesen Kapiteln enthält der Abschnitt „General introduction and discussion” einen Überblick und eine Diskussion über das derzeitige Verständnis des neuronalen Netzwerks, welches olfaktorischem Lernen in Drosophila zugrunde liegt. KW - Taufliege KW - Geruchswahrnehmung KW - Lernverhalten KW - Pilzkörper KW - olfaktorisches Lernen KW - Drosophila KW - olfactory learning KW - Drosophila KW - mushroom body KW - Dopamine Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55483 ER - TY - THES A1 - Arumugam, Manimozhiyan T1 - Comparative metagenomic analysis of the human intestinal microbiota T1 - Vergleichende metagenomische Analyse des menschlichen Darmflora N2 - The human gut is home for thousands of microbes that are important for human life. As most of these cannot be cultivated, metagenomics is an important means to understand this important community. To perform comparative metagenomic analysis of the human gut microbiome, I have developed SMASH (Simple metagenomic analysis shell), a computational pipeline. SMASH can also be used to assemble and analyze single genomes, and has been successfully applied to the bacterium Mycoplasma pneumoniae and the fungus Chaetomium thermophilum. In the context of the MetaHIT (Metagenomics of the human intestinal tract) consortium our group is participating in, I used SMASH to validate the assembly and to estimate the assembly error rate of 576.7 Gb metagenome sequence obtained using Illumina Solexa technology from fecal DNA of 124 European individuals. I also estimated the completeness of the gene catalogue containing 3.3 million open reading frames obtained from these metagenomes. Finally, I used SMASH to analyze human gut metagenomes of 39 individuals from 6 countries encompassing a wide range of host properties such as age, body mass index and disease states. We find that the variation in the gut microbiome is not continuous but stratified into enterotypes. Enterotypes are complex host-microbial symbiotic states that are not explained by host properties, nutritional habits or possible technical biases. The concept of enterotypes might have far reaching implications, for example, to explain different responses to diet or drug intake. We also find several functional markers in the human gut microbiome that correlate with a number of host properties such as body mass index, highlighting the need for functional analysis and raising hopes for the application of microbial markers as diagnostic or even prognostic tools for microbiota-associated human disorders. N2 - Der menschliche Darm beheimatet tausende Mikroben, die für das menschliche Leben wichtig sind. Da die meisten dieser Mikroben nicht kultivierbar sind, ist „Metagenomics“ ein wichtiges Werkzeug zum Verständnis dieser wichtigen mikrobiellen Gemeinschaft. Um vergleichende Metagenomanalysen durchführen zu können, habe ich das Computerprogramm SMASH (Simple metagenomic analysis shell) entwickelt. SMASH kann auch zur Assemblierung und Analyse von Einzelgenomen benutzt werden und wurde erfolgreich auch das Bakterium Mycoplasma pneumoniae und den Pilz Chaetomium thermophilum angewandt. Im Zusammenhang mit der Beteiligung unserer Arbeitsgruppe am MetaHIT (Metagenomics of the human intestinal tract) Konsortium, habe ich SMASH benutzt um die Assemblierung zu validieren und die Fehlerrate der Assemblierung von 576.7 Gb Metagenomsequenzen, die mit der Illumina Solexa Technologie aus der fäkalen DNS von 124 europäischen Personen gewonnen wurde, zu bestimmen. Des Weiteren habe ich die Vollständigkeit des Genkatalogs dieser Metagenome, der 3.3 Millionen offene Leserahmen enthält, geschätzt. Zuletzt habe ich SMASH benutzt um die Darmmetagenome von 39 Personen aus 6 Ländern zu analysieren. Hauptergebnis dieser Analyse war, dass die Variation der Darmmikrobiota nicht kontinuierlich ist. Anstatt dessen fanden wir so genannte Enterotypen. Enterotypen sind komplexe Zustände der Symbiose zwischen Wirt und Mikroben, die sich nicht durch Wirteigenschaften, wie Alter, Body-Mass-Index, Erkrankungen und Ernährungseigenschaften oder ein mögliches technisches Bias erklären lassen. Das Konzept der Enterotypen könnte weitgehende Folgen haben. Diese könnten zum Beispiel die unterschiedlichen Reaktionen auf Diäten oder Medikamenteneinahmen erklären. Weiterhin konnten wir eine Anzahl an Markern im menschlichen Darmmikrobiome finden, die mit unterschiedlichen Wirtseigenschaften wie dem Body-Mass-Index korrelieren. Dies hebt die Wichtigkeit dieser Analysemethode hervor und erweckt Hoffnungen auf Anwendung mikrobieller Marker als diagnostisches oder sogar prognostisches Werkzeug für menschliche Erkrankungen in denen das Mikrobiom eine Rolle spielt. KW - Darmflora KW - Metagenom KW - Bioinformatik KW - human gut microbiome KW - metagenomics KW - comparative metagenomics KW - computational analysis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55903 ER - TY - THES A1 - Barcena Uribarri, Ivan T1 - Porins in the genus Borrelia : Characterization of P66 and P13 T1 - Porins in der Gattung Borrelia : Charakterizierung von P13 und P66 N2 - Die Gattung Borrelia gehört zur Familie der Spirochaetes, welche sich den Gram-negativen Bakterien zuordnen lassen. Für diese Familie charakteristisch ist eine längliche, helikale Form, die Längen von 5 – 250 µm erreichen kann. Den Spirochaeten gehören diverse Pathogene an wie Treponema und Leptospira, die Erreger der Syphillis und der Leptospirose. Borrelien verursachen beim Menschen zwei schwere Krankheiten: Die Lyme-Borreliose (LB) und das Rückfallfieber (RF). Als Pathogen besitzen Borrelien einen Lebenszyclus, in dem sie zwischen Gliederfüßern als Vektoren und Säugetieren (oft kleinen Nagetieren) als Wirt wechseln. Um das Überleben in derart unterschiedlichen Organismen zu sichern und die Immunantwort des Wirtes zu unterdrücken, benötigt ein Organismus mit einem solch komplexen Lebenszyklus eine außergewöhnliche Regulierung der Proteinexpression. Die Lyme-Borelliose stellt eine multisystemische Krankheit dar, die verschiedene Organe, wie Haut, Gelenke und das Nervensystem betreffen kann. Häufig kommt es zu einer sich kreisförmig ausbreitenden Rötung, die erythema migrans genannt wird, die zur klinischen Diagnose genutzt wird. Sie erscheint nach einem Zeckenbiss und kann einen Durchmesser von bis zu 15 cm weit erreichen. Rückfallfieber erkennt man an plötzlich auftretenden Fieberschüben, die von weiteren Symptomen wie Schüttelfrost, Kopfschmerzen, Muskel und Gelenkschmerzen oder Übelkeit begleitet werden. Beide Krankheiten können in frühen Stadien der Infektion leicht mit der Gabe von Antibiotika behandelt werden. Die verschiedenen Arten der Gattung Borrelia besitzen ein relativ kleines Genom. Da außerdem viele der vorhandenen Gene für Virulenzfaktoren und wirtsspezifische Anpassungen codieren, fehlen den Borrelien wichtige Genen für die Biosynthese von Aminosäuren, Fettsäuren oder Nukleotiden. Diese metabolischen Defizite werden durch die Aufnahme von durch den Wirt produzierten Nährstoffen ausgeglichen. Den ersten Schritt der Nährstoffaufnahme übernehmen Porine. Dies sind wassergefüllte Kanäle, die die Aufnahme und den Transport von essentiellen Molekülen über die äußere Membran ermöglichen. P66, P13 und Oms28 wurden bei Borrelia burgdorferi, Oms38 bei Rückfallfieber verursachenden Spirochaeten gefunden. P66 ist ein einzelnes Porin mit einer extrem hohen Leitfähigkeit von 11 nS. P13 ist ein kleines Protein (13kDa) mit einer α helikalen Sekundärstruktur, die keinerlei Ähnlichkeit zu den bisherigen Modellen von bekannten Porinen aufweist. Aufgrund seiner Assoziation mit der periplasmatischen Seite der Membran wurde die Funktion als Porin für Oms28 in letzter Zeit stark angezweifelt. Oms38 ist ein Dicarboxylat-spezifisches Porin mit Homologen bei Lyme-Borreliose verursachenden Arten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war das vorhandene Wissen über P66 und P13 als Porine der Gattung Borrelia zu erweitern. Die beiden Proteine unterscheiden sich strukturell stark von den bisher bekannten Porine Gram-negativer Bakterien und sind daher geeignete Forschungsobjekte, um die speziellen Anforderungen an Borrelienporinen zu erforschen. Das Ziel dieser Arbeit war die Erforschung der beiden in Borrelien beschriebenen Proteine P66 und P13. Gerade weil sich beide in Aufbau und Größe von bekannten Porinen Gram-negativer Bakterien unterscheiden und somit in spezifische Prozesse bei der Gattung Borrelia involviert sein könnten, ist die Forschung auf diesem Gebiet auch weiterhin von höchstem Interesse. Im ersten Projekt dieser Arbeit wurden das Vorkommen und die porenformende Aktivität von P66 in verschiedenen Borrelia-Arten (Lyme-Borreliose und Rückfallfieber) untersucht. Bei P66 handelt es sich um das am besten untersuchte Porin der Borrelien, das eine Doppelfunktion als Porin und als Adhesin besitzt. Da sich alle bisherigen Ergebnisse auf B. burgdorferi beziehen, ist wenig bis gar nichts über homologe Proteine in anderen Borrelien-Arten bekannt. Deswegen wurden jeweils drei Arten, die Lyme-Borreliose und Rückfallfieber verursachen, ausgewählt und an deren P66-Homologe die porenformende Aktivität überprüft. Fünf von sechs zeigten dabei eine ähnliche Einzelkanalleitfähigkeit wie P66, die im Bereich von 9 – 11 nS lagen, bei gleichzeitig kaum vorhandener Selektivität für eine bestimmte Ionensorte. Auch eine Spannungsabhängigkeit, die bei 30 – 70 mV begann, war messbar. Nur im Fall von B. hermsii konnten keine Poren gefunden werden. Dabei ist noch nicht geklärt, ob das Fehlen der porenbildenden Aktivität einem evolutionären Verlust der Funktion als Pore oder einer höheren Anfälligkeit gegenüber den verwendeten Detergenzien geschuldet ist. In einem weiteren Projekt wurde der kontrovers diskutierte Porendurchmesser von P66 aus B.burgdorferi mit empirischen Mitteln analysiert. In früheren theoretischen Studien wurde der Kanaldurchmesser auf 2,6 nm geschätzt. Dieser sehr große Durchmesser würde allerdings die Schutzfunktion der Außenmembran verhindern. Mit Hilfe von ungeladenen Substanzen gelang eine Bestimmung des Innendurchmessers von P66 auf 1,8 nm am Eingang und 0,8 nm an der Engstelle der Pore. Zusätzlich führte eine unerwartete Blockierung der Pore durch einige dieser Substanzen zu der Erkenntnis, dass P66 einen oligomeren (wahrscheinlich oktameren) Aufbau besitzt. Ein solcher Aufbau konnte bisher noch nie nachgewiesen werden und könnte von daher ein einzigartiges Merkmal von Borrelien oder Spirochaeten sein. Das dritte Projekt beschäftigte sich mit der rekombinanten Produktion eines Proteins von B. burgdorferi mit immunogenen Eigenschaften. Dieses könnte dazu verwendet werden, neue Diagnose Tests und Therapien zu entwickeln. P13 kommt in verschiedenen LB- und RF-Arten vor und besitzt kein bekanntes bakterielles Homolog. Diese Fakten machen aus P13 einen geeigneten Kandidaten als therapeutisches Ziel. Aus diesem Grund wurde das P13-Gen in zwei unterschiedliche Organismen kloniert. Zum einen in E. coli, wo zwei verschiedene Konstrukte zur Klärung der Rolle des periplasmatisch verdauten C-Terminus dienen sollten. Zum anderen in Tabakpflanzen über Agrobacterium tumefaciens, mittels eines Virus. Dabei vermehrt sich der Vektor in den Zellen der Pflanze, breitet sich aus und produziert gleichzeitig das gewünschte Protein. Mit Hilfe dieser zweiten Expressionsmethode sollte es möglich sein, große Mengen des rekombinanten Proteins zu erzeugen und gleichzeitig die Kosten und den Zeitbedarf zu senken. Das letzte Projekt beschäftigte sich mit dem Außenmembran-Komplexom von B. burgdorferi und konzentrierte sich dabei auf die Komplexe von P13 und P66. Blue Native PAGE und 2D-SDS PAGE wurden als Techniken ausgewählt. Es konnte gezeigt werden, dass P66 das einzige Protein ist, das am vermutlich oktameren Aufbau der 11 nS Pore beteiligt ist. Zusätzlich gelang es, den Komplex in zwei Hälften zu spalten, die ungefähr das halbe Molekulargewicht bei einer Leifähigkeit von 5,5 nS zeigten. Im Fall des P13-Komplexes konnte eine mögliche Verknüpfung mit OspC entdeckt werden. Die Gelelution des Komplexes und anschließende Tests mit Hilfe der Black-Lipid-Bilayer-Methode ergaben eine Aktivität von 0,6 nS. Dies steht im starken Gegensatz zu der vorher für P13beschriebenen Größe von 3,5 nS. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass P66 ein in vielen Borrelienarten vorkommendes und damit weit verbreitetes Porin mit Homologen in LB- und RF-Spezies ist, die ähnliche Charakteristika besitzen. Der Durchmesser dieser Pore konnte unter Berücksichtigung der Eigenschaften eines molekularen Siebes genauer bestimmt werden. Im Fall von P13 könnte dessen rekombinante Produktion es erlauben, dieses Protein als Hilfsmittel zur Diagnose und zur medizinischen Therapie einzusetzen. Zusätzlich könnte der gefundene Bezug zu OspC dazu beitragen, in Zukunft mehr über die Funktion dieses interessanten Proteins herauszufinden. N2 - The genus Borrelia belongs to the Spirochaetes phylum which is far related to Gram negative bacteria. This phylum possesses a characteristic long helically coiled shape with lengths that vary from 5 to 250 μm. Other pathogens as Treponema and Leptospira which cause syphilis and leptospirosis, also belong to the Spirochaetes. Borrelia itself is the causative agent of two human diseases, the Lyme disease and relapsing fever. Borreliae are pathogenic bacteria which cycle between their arthropod vector, in most cases a tick, and a mammal host, very often small rodents. This complex life cycle requires an extraordinary protein up- and down-regulation in order to survive in such different organisms and avoid their immunologic systems. Lyme disease is a multisystemic disease that can affect different organs like skin, joints and nervous system. A red rash with concentric rings, called erythema migrans is a distinctive manifestation that allows clinical diagnosis. It appears after the bite of an infected tick and spreads out to diameters that can reach 15 cm. Relapsing fever is characterized by sudden recurrent fever peaks accompanied with chills, headache, muscle and joint pain and nausea. Both diseases are easily treated with antibiotics in early infection stages. Borrelia species possess a small genome. Many of their genes are related with virulence and the adaptation to the different hosts. The absence of genes in Borrelia involved in the biosynthesis of amino acids, fatty acids or nucleotide is very remarkable. This metabolic deficiency makes Borrelia species dependent on substances produced by the host. The first step in nutrient uptake is accomplished by porins. Bacterial porins are water-filled channels that facilitate the transport of essential molecules through the outer membrane. Four porins have been described in Borrelia up to this point. P66, P13 and Oms28 have been found in Borrelia burgdorferi while Oms38 was discovered in relapsing fever spirochetes. P66 is a singular porin with an extremely high single channel conductance of 11 nS. P13 is a small protein with an α-helical secondary structure which does not fit into the general porin model. The function of Oms28 as a porin has been questioned recently due to its periplasmic membrane-associated location. Finally, Oms38 is a specific porin for dicarboxilates with homologues in Lyme disease species. The aim of this thesis was to broaden the knowledge of the P66 and P13 porins described in the genus Borrelia. Both differ in structure and size from the general Gram negative porin model and could be highly involved in specific tasks in the genus Borrelia. In the first project of this thesis, the presence and pore forming capacity of P66 was studied in several Borrelia species including members of the relapsing fever group. P66 is the best studied porin in Borrelia with a dual function as porin and adhesin. This knowledge is restricted to B. burgdorferi and little or nothing is known about homologues in other Borrelia species. Therefore, three Lyme disease and three relapsing fever species were chosen as representative agents of the genus and the pore forming activity of their P66 homologues was studied. Five out of the six homologues exhibited a similar single channel conductance in a range from 9 to 11 nS. All of them showed no selectivity for cations or anions, and they were voltage dependent starting at different voltages from 30 to 70 mV. Only in the case of the B. hermsii homologue no pore forming activity could be established. It remains unclear if the lack of activity was due to an evolutionary loss of its porin function or to a higher sensibility to the detergents used for purification. In another project, the controversial P66 pore diameter of B. burgdorferi was analyzed with an empirical method. In a former study, the diameter of the P66 channel was estimated to be 2.6 nm based on theoretical considerations. This diameter is rather large and could impair the outer membrane protective function. Different non-electrolytes were used to study the P66 pore diameter indicating a 1.8 nm entrance diameter and a 0.8 nm inner constriction. In addition, the blockage of the channel with some of those non-electrolytes disclosed an oligomeric organization formed by approximately eight independent channels. Such a structure has not been observed so far in any other living organism and could be exclusive of Borrelia or spirochetes. The third project of this thesis deal with the recombinant production of a B. burgdorferi protein with immunogenic potential. This protein might be used to develop new diagnosis tests and therapeutic treatments. P13 is an outer membrane protein present in LD and RF species and it does not have any other known bacterial homologue. These facts make of P13 a good candidate to be used as a therapeutic target. For such purpose, P13 was cloned in two organisms. First, in Escherichia coli were two different constructs were designed to establish the role of a periplasmic cleaved C-terminus. Second, in a virus based vector delivered by Agrobacterium tumefaciens into tobacco plant cells. The vector replicates inside the plant cells spreading the infection to adjacent cells and at the same time producing the recombinant protein. This second expression method should enable the production of large amounts of the recombinant protein reducing time and costs. The last project of this thesis looked into the outer membrane complexome of B. burgdorferi focusing on the P13 and P66 porin complexes. Blue Native Page and second dimension SDS Page were the technique chosen for this purpose. P66 could be shown to be the only protein involved in the formation of the 11 nS pore which complex is probably formed by eight monomers. It was also possible to divide this complex in two halves with approximately half the molecular weight and a conductance of 5.5 nS. In the case of the P13 complex, a possible association with the lipoprotein OspC was revealed. The gel extraction of the P13 complex and its test with the Back Lipid Bilayer assay exhibited a 0.6 nS activity. This is in high contrast with the 3.5 nS activity previously described for this protein. To sum up, P66 is a porin present in many Borrelia species including not only LD but also RF species and which homologues show similar biophysical properties. The diameter of this pore is smaller than previously thought and it has molecular weight sieving properties. In the case of P13, its recombinant procurement will allow the use of P13 as a diagnostic and therapeutic target. The possible association with OspC could facilitate to unravel in future experiments the function of this intriguing protein. KW - Porins KW - Borrelia KW - Porins KW - Borrelia Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55339 ER - TY - THES A1 - Konradt, Christoph T1 - Cross-talk between Shigella and cells of the adaptive immunity: The TTS effector IpgD inhibits T cell migration T1 - Cross-talk zwischen Shigella und Zellen des Adaptiven Immunsystems: Der TTS Effektor IpgD inhibiert die T Zell Migration N2 - Shigellosis, or bacillary dysentery, is a rectocolitis caused by the gram-negative, enteroinvasive bacteria of the genus Shigella. Shigellosis still remains a major public health burden with an estimated 80 million cases of bloody diarrhoea and 700.000 deaths per year, primarily in children under the age of 5. Shigella disrupts, invades, and causes inflammatory destruction of the colonic epithelium in humans through virulence effectors secreted by the type III secretion apparatus (TTSA). In contrast to the Shigella-induced manipulation of the host innate immune response, the impact of Shigella on the adaptive immunity has been poorly studied thus far. In order to understand why the naturally induced protective humoral response requires several infections to be primed and is of short duration, the work presented here investigates if Shigella is able to directly interact with T cells. Indeed, it has been shown that Shigella was able to invade and proliferate inside T cells. Furthermore, Shigella was able to inhibit T cell migration through a TTSA effector. Moreover, the Shigella effector IpgD, a phosphoinositide 4-phosphatase that specifically dephosphorylates phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PIP2) into phosphatidylinositol-(5)-monophosphate (PI(5)P), was identified as the effector responsible for the observed inhibition. It could be demonstrated that IpgD was responsible for a reduction of intracellular PIP2 levels in T cells. Further experiments showed a reduced level of phosphorylated ezrin, radixin and moesin (ERM) proteins in infected, as well as with IpgD transfected, T cells. The ERM protein family plays an imported role in signal transduction and motility and their activity is closely related to the binding of PIP2. Therefore, the low level of PIP2 leads to a dephosphorylation of the ERM proteins which inhibits T cells response to chemokine stimulation. Indeed, IpgD transfected T cells show a reduced ability to re-localise the ERM proteins upon chemokine stimulation. Targeting T cell motility, via TTSA effectors, could explain the low level of specific T cell priming during Shigella infection. This is the first report of Shigella induced manipulation of T cell function and on the inhibition of T cell migration by a bacterial effector. N2 - Shigellose oder Bakterieruhr ist eine von Bakterien der Gattung Shigella ausgelöste Dysenterie Erkrankung des Dickdarms. Mit jährlich über 80 Millionen Fällen von blutigen Durchfällen und 700000 Todesfällen, hauptsächlich bei Kindern unter 5 Jahren, stellt Shigella immer noch ein ernsthaftes Gesundheitsproblem dar. Shigella destabilisiert das menschliche Dickdarmgewebe und dringt in dieses ein, wo es eine akute Entzündung auslöst, die das Gewebe weiterhin zerstört. Verursacht wird dies durch bakterielle Effektoren, die durch ein Type III Sekretionssytem (TTSA) sekretiert werden. Verglichen mit der Anzahl an Studien über die Manipulation der angeborenen Immunabwehr gibt es nur wenige Studien über die Interaktionen von Shigella mit dem adaptiven Immunsystem. Um zu verstehen, warum für die Entwicklung einer humoralen Immunantwort mehrere Infektionen erforderlich sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht, ob Shigella in der Lage ist, direkt mit TZellen zu interagieren. Es konnte gezeigt werden, dass Shigella in T-Zellen eindringen und sich vermehren kann. Darüber hinaus zeigt sich, dass Shigella in der Lage ist, durch TTSA-Effektoren die T-Zell-Migration zu hemmen. Der Shigella Effektor IpgD konnte als der für die Hemmung verantwortliche Effektor identifiziert werden. Bei IpgD handelt es sich um eine 4-Phosphoinositid-Phosphatase, die Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat (PIP2) zu Phosphatidyl-inositol-(5)- monophosphat (PI(5)P) dephosphoryliert. Es wurde deutlich, dass der Effektor IpgD, neben der Menge an PIP2, auch die Menge an phosphorylierten Ezrin, Radixin und Moesin (ERM) Proteinen in T-Zellen reduziert. Die ERM-Protein-Familie spielt in der Signaltransduktion und bei der Motilität von T-Zellen eine wichtige Rolle und ihre Phosphorylierung ist eng an die Bindung von PIP2 gekoppelt. Daher führt eine geringe Menge an PIP2 zu einer Dephosphorylierung der ERM-Proteine, was eine Stimulierung der T-Zellen durch Chemokine hemmt. In der Tat zeigten IpgDtransfizierte T-Zellen eine verminderte Fähigkeit zur Relokalisierung der ERM-Proteine nach einer Chemokine-Stimulation. In dieser Arbeit konnte erstmals die Manipulation von T-Zell-Funktionen durch Shigella und die Hemmung der T-Zell-Migration, ausgelöst durch einen bakteriellen TTSA-Effektor, gezeigt werden. KW - Medizinische Mikrobiologie KW - Shigella KW - Immunsystem KW - Shigella KW - immune sytem KW - host-pathogen-interaction Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55397 ER - TY - THES A1 - Li, Jian-Qiang T1 - Modulating the expression of enzymes of isoprenoid synthesis: effects on Vgamma9Vdelta2 T cell activation and tumor cell growth T1 - Modulation der Expression von Enzymen der Isoprenoidsynthese: Effekte auf die Vgamma9Vdelta2 T Zellaktivierung und das Tumorzellwachstum N2 - This study focuses on phosphoantigen specific Vg9Vd2 T cells which only exist in human and non-human primates. This population accounts for 1%-5% of peripheral blood T-lymphocytes but their frequency can rise to 50% of total blood T cells upon infection. Vg9Vd2 T cells can be activated by nonpeptide compounds with critical phosphate moieties which are termed as phosphoantigens. These include isopentenyl pyrophosphate (IPP), a key compound of isoprenoid synthesis in all organisms, and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), a direct precursor of IPP in DOXP pathway which only exist in eubacteria, plants, apicomplexaen parasites. Its activity as phosphoantigen is at least 1000 fold higher than that of IPP. However, direct structural evidence of phosphoantigen binding to the TCR is missing so far. Moreover, Vg9Vd2 T cells have potent anti-tumor activity e.g. against the B-cell lymphoma Daudi, whose Vg9Vd2 T cell activating properties have been suggested to result from sensing of abnormal intracellular IPP levels by the Vg9Vd2 TCR or Vg9Vd2 TCR binding to other postulated ligands such as an ectopically expressed F1-ATPase or UL-16 binding protein 4 (ULBP4). Aminobisphosphonates and alkymines were hypothesized to activate Vg9Vd2 T cells indirectly by inhibiting the IPP consuming enzyme farnysyl pyrophosphates synthesis (FPPS) although off target effects of these drugs or a direct interaction with the Vg9Vd2 TCR could not be excluded. This thesis presents new approaches for the mechanistic analysis of Vg9Vd2 T cell activation. By employing retroviral transduction of FPPS specific shRNA, it shows that specific shRNA reduces expression of FPPS and is sufficient to convert hematopoietic and non-hematopoietic tumor cell lines into Vg9Vd2 T cell activators. FPPS knockdown cells activated Vg9Vd2 T cells as measured by increased levels of CD69 and CD107a, kill of FPPS knockdown cells and induction of IFN-γ secretion. The IPP-synthesis-inhibiting drug mevastatin reduced Vg9Vd2 T cell activation by FPPS knockdown cells or aminobisphosphonate treated cells but not activation by the phosphoantigen bromohydrin pyrophosphate (BrHPP). A reduced growth of the FPPS knockdown cells has not been observed which is different to what has been reported for aminobisphosphonate treated cells. Finally, the human B-cell lymphoma RAJI has been transduced with Tetracyclin-inducible FPPS specific shRNA and proven to gain and loose the capacity to activate Vg9Vd2 TCR transductants upon doxycylin provision or removal. Another approach for the analysis of Vg9Vd2 T cell activation is Vg9Vd2 TCR transduced mouse cell lines with specificity for phosphoantigens. In contrast to the previously used Vg9Vd2 TCR transduced Jurkat cells, these cells do not present phosphoantigens, and are therefore specially suited for analysis of phosphoantigen presentation. The response of the new TCR transductants to presumed Vg9Vd2 TCR ligands/activators such as phosphoantigens, aminobisphosphonates or FPPS knockdown cells, depended strongly on the expression of a rat/mouse CD28 molecule by the transductants and its ligation by the (CD80) counter receptor on the ligand-presenting cell. The response is likely to reflect recognition of cognate Vg9Vd2 TCR antigens since mutations in the TCR-δ chain CDR2 and 3 abolished this response but activation by TCR or CD3 specific antibodies. A major difference between TCR transductants and primary gd T cells, was the lacking response of TCR transductants to Daudi or IPP. In addition their sensitivity to other soluble phosphoantigens was about 100 fold weaker than that of primary cells, stimulation of both cell type to CD80 expressing FPPS knock down or aminobisphosphonates was similar. Finally, the transductants have also been used to analyze effects of over-expression or knockdown of enzymes of isoprenoid synthesis such as 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase or HMGR), mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MVD), isopentenyl pyrophosphate isomerase (IDI), geranyl-geranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) but no clear effects have been found. In conclusion, this thesis supports the concept of Vg9Vd2 T cells being sensors of a dysregulated isoprenoid metabolism and established new tools to study ligand recognition and TCR mediated activation of this T cell population. These tools will be most useful to address following questions: 1) How does the dysregulation of isoprenoid metabolism affect tumor growth? 2) What is the correlation between the modulation of IPP levels and the Vg9Vd2 TCR binding or expression of other postulated ligands? 3) Are there any mevalonate pathway enzymes other than FPPS and HMGR, which play an important role in Vg9Vd2 T cells activation? 4) What is/are the putative phosphoantigen-presenting molecule(s)? N2 - Die vorliegende Arbeit widmet sich den phosphoantigenspezifischen Vg9Vd2 T Zellen, die nur im Menschen und nicht-humanen Primaten zu finden ist. Diese Population stellt 1-5% der peripheren Blut T-Zellen aber ihre Frequenz kann bei Infektionen auf bis zu 50% steigen. Vg9Vd2 T Zellen können durch nicht Peptid-Moleküle aktiviert werden, die sich durch eine essentielle Phosphatkomponente auszeichnen. Hierzu gehören das Isopentenyl-pyrophosphat (IPP), ein Schlüsselmolekül der Isoprenoidsynthese aller Organismen, sowie das bezüglich seiner gd T zellaktivierenden Eigenschaften mehr als 1000fach stärkere (E)-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP), dass der direkte Vorläufer des IPP im DOXP Stoffwechselweg ist, der nur bei Eubakterien, Pflanzen und apikomplexen Bakterien zu finden ist. Direkte strukturelle Belege für die Bindung von Phosphoantigenen an den gd TCR stehen jedoch aus. Darüber hinaus besitzen Vg9Vd2 T Zellen eine direkte gegen Tumoren wie das B-Zelllymphom Daudi gerichtete Aktivität, für deren Erklärung ein „Erspüren“ eines abnormal erhöhten intrazellulären IPP Spiegels durch den Vg9Vd2 TCR oder Bindung des Vg9Vd2 TCR an Liganden, wie einer ectopisch exprimierten F1-ATPase oder des UL-16 bindenden Proteins 4 (ULBP4) herangezogen wurde. Die Vg9Vd2 T Zell Aktivierung durch Aminobisphosphonate und Alkylamine wurde hingegen auf die Inhibition des IPP verbrauchenden Enzyms Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS) zurückgeführt, obgleich Wirkungen auf andere Moleküle oder eine direkte Bindung an den TCR nicht ausgeschlossen werden konnten. Die vorgelegte Dissertationsschrift beschreibt neue Ansätze der Analyse der Mechanismen der Vg9Vd2 T Zell Aktivierung. Sie zeigt, dass eine mittels retroviraler Transduktion von shRNA erzielte Reduktion der FPPS Expression ausreicht, um hematopoietische und nicht-hematopoietische Tumorzellen zu Vg9Vd2 T Zellaktivatoren zu machen. Die FPPS knockdown zellvermittelte Aktivierung der Vg9Vd2 T Zellen zeigte sich in erhöhter Expression von CD69, CD107a, Zytotoxizität gegen FPPS knockdown Zellen und Induktion der IFNg Sekretion. Die, die IPP-Synthese inhibierende Substanz Mevastatin, reduzierte die Vg9Vd2 T Zellaktivierung durch FPPS knockdown Zellen oder Aminobisphosphonat behandelte Zellen, aber nicht die Aktivierung durch das Phosphoantigen Bromhydrin Pyrophosphat. Ein vermindertes Wachstum der FPPS knockdown Zellen wurde nicht nachgewiesen was im Gegensatz zur Literatur über Aminobisphosphonat behandelte Zellen steht. Weiterhin wurde ein Tetracyclin-induzierbares FPPS spezifische shRNA kodierendes lentivirales Konstrukt in humane B-Zelllymphom Raji Zellen transduziert, die anschließlich die durch Zugabe bzw. Entfernung von doxycyclin gesteuerte Fähigkeit erhielten, Vg9Vd2 T Zellen zu aktivieren. Ein anderer Ansatz zur Analyse der Vg9Vd2 T-zellvermittelten Aktivierung war die Entwicklung phosphoantigenspezifischer Vg9Vd2 TCR transduzierter Mauszelllinien. Diese Zellen unterscheiden sich von den bisher benutzten humanen Vg9Vd2 TCR transduzierten Jurkat Zellen dadurch, dass sie keine Phosphoantigene präsentieren, und sind daher für Analyse der Phosphoantigenpräsentation besonders geeignet. Die Antwort der neuen TCR Transduktanten auf wahrscheinliche Vg9Vd2 TCR Zellliganden bzw. Vg9Vd2 T-Zellaktivatoren wie Phosphoantigene, Aminobisphosphonate oder FPPS knockdown Zellen hing im hohen Maße von der Expression eines Ratten/Maus CD28 Moleküls auf den Transduktanten und dessen Bindung an den (CD80) Gegenrezeptor auf der antigenpräsentierenden Zelle ab. Höchstwahrscheinlich reflektiert die Antwort auf eine spezifische Antigenerkennung, da Mutationen in den CDR2 und 3 der TCRd Kette die Antwort verschwinden ließen, aber keine Effekte auf die Stimulation durch CD3 oder TCR spezifische Antikörper hatten. Ein gravierender Unterschied der TCR-Transduktanten zu primären gd T Zellen lag auch darin, dass die TCR Transduktanten weder durch Daudi Zellen noch durch IPP stimuliert wurden und ihre Empfindlichkeit gegenüber löslichen Phosphoantigenen ungefähr 1000fach geringer als bei primären Vg9Vd2 T-Zellen war, während sich die Antwort der beiden Zelltypen auf FPPS knockdown oder Aminobisphosphonate-behandelte Zellen ähnelten. Schließlich wurden die Transduktanten verwendet, um Effekte der Überexpression oder des knockdown von Enzymen der Isoprenoidsynthese wie 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reduktase or HMGR), Mevalonat-5-Pyrophosphat decarboxylase (MVD), Isopentenyl Pyrophosphat Isomerase (IDI), Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase (GGPPS) zu analysieren, wobei keine eindeutigen Effekte beobachtet wurden. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die vorgelegte Arbeit die Vorstellung von Vg9Vd2 TCR Zellen als Sensoren eines entgleisten Isoprenoidstoffwechsel unterstützt und neue Werkzeuge zur Analyse der Ligandenerkennung und TCR vermittelten Aktivierung dieser Zellpopulation vorstellt. Diese Werkzeuge sollten bei der Beantwortung folgender Fragen helfen: 1) Wie beeinflusst die Fehlregulation des Isoprenoidstoffwechesle das Tumorwachstum. 2) Welche Korrelation besteht zwischen der Modulation der IPP Spiegel und der Vg9Vd2 TCR vermittelten Aktivierung bzw. der Expression anderer vorgeschlagener Vg9Vd2 Liganden. 3) Gibt es Enzyme außer der FPPS und der HMG-CoA Reduktase, die eine wichtige Rolle bei der Vg9Vd2 T-Zellaktivierung spielen und schließlich 4) Welche(s) Molekül(e) präsentiert bzw. präsentieren Phosphoantigene ? KW - Primaten KW - T-Lymphozyt KW - Tumorwachstum KW - Isoprenoide KW - Synthese KW - Vg9Vd2 T Zellaktivierung KW - Isoprenoidsynthese KW - Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS) KW - Aminobisphosphonat KW - Isopentenyl-pyrophosphat (IPP) KW - Vg9Vd2 T cell KW - Isoprenoid Synthesis KW - Farnesyl Pyrophosphate Synthase KW - Aminobisphosphonate KW - Isopentenyl pyrophosphate (IPP) Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46388 ER - TY - THES A1 - Weidauer, Stella Elisabeth T1 - Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Knochenwachstums-Modulators Sclerostin T1 - Structural and functional characterization of the bone-modulator protein sclerostin N2 - Die Knochenhomöostase erfolgt durch das Zusammenspiel mehrerer Zelltypen. Während die Osteoblasten für den Knochenaufbau verantwortlich sind, resorbieren die Osteoklasten Knochengewebe. Beide Vorgänge werden durch die Osteozyten streng reguliert. Eine Störung im strikt regulierten Gleichgewicht zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau kann daher zu Knochenkrankheiten wie Osteoporose führen. Auf molekularer Ebene erfolgt die Kommunikation zwischen den einzelnen Zelltypen über zwei wichtige Signalwege, den der „Bone Morphogenetic Protein“-Superfamilie (BMPs) und den der Wnt-Proteine. Die Signalübertragung wird hierbei durch sekretierte Faktoren induziert, die an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Deren Aktivierung führt zu einem intrazellulären Signal, welches letztlich die Expression von Zielgenen reguliert. Beide Signalwege werden auf mehreren Ebenen, extrazellulär, membranständig und intrazellulär reguliert. Das 2003 identifizierte Sclerostin ist ein Vertreter der extrazellulären Regulatorproteine und wurde aufgrund seiner Zugehörigkeit zur DAN-Familie zunächst fälschlicherweise als direkter Inhibitor des BMP-Signalwegs eingestuft. Mittlerweile wird allerdings davon ausgegangen, dass Sclerostin den Wnt-Signalweg negativ reguliert, indem es die Wnt Ko-Rezeptoren LRP5 und LRP6 bindet, die beide zu der Familie der „Low-density lipoprotein receptors“ gehören. Über den molekularen Inhibitionsmechanismus von Sclerostin war jedoch zum Startpunkt dieser Dissertationsarbeit wenig bekannt. Daher wurde Sclerostin im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch und biochemisch charakterisiert. Die Aufklärung mittels NMR-Spektroskopie ergab für Sclerostin eine Struktur, die sich in drei Regionen gliedert: den Cystinknoten, sowie einen „Loop“-Bereich und die Fingerregion. Vom zentralen Cystinknoten gehen drei Peptid-Schleifen in zwei entgegengesetzte Richtungen aus. Schleife eins und drei bilden eine definierte ß-Faltblattstruktur und ähneln zwei Fingern einer Hand. Die zweite Schleife, welche vom Cystinknoten isoliert in die entgegengesetzte Richtung verläuft („Loop“), ist wie die beiden langen N- und C-Termini flexibel und unstrukturiert. Die in Zusammenarbeit mit der Firma AbD-Serotec entstandenen Fab-Fragmente ermöglichten die Bestimmung des Bindeepitops der Sclerostin/LRP5-Interaktion im Bereich der unstrukturierten dritten Schleife von Sclerostin. Die Struktur von Sclerostin und die Identifikation des Bindeepitops auf Sclerostinseite geben nun erste Einblicke in den molekularen Mechanismus der Sclerostin/LRP5-Interaktion. Diese Kenntnis kann für die Entwicklung von Kleinmolekülinhibitoren mittels rationalem Drugdesign genutzt werden, welche, wie auch der in Kooperation entwickelte die Sclerostinaktivität neutralisierende Antikörper AbD09097, hochinteressante Ansätze für neuartige anabole Therapien von Krankheiten mit Knochenschwund darstellen. N2 - Different cell types like osteoblasts, osteoclasts and osteocytes maintain bone homeostasis. While osteoblasts build up bone, osteoclasts resorb bone tissue and both actions are tightly regulated by the osteocytes. Imbalance between bone formation and resorption will lead to various bone diseases, e.g. osteoporosis. On a molecular level communication between these cell types occurs through two major signalling pathways, i.e. the bone morphogenetic proteins (BMPs) and the Wnt-factors. In both pathways signal transduction is induced by secreted factors, which bind to cell surface receptors. This activation leads to an intracellular signal that finally regulates expression of target genes. Both pathways are tightly regulated at various cellular levels, extracellular, at the membrane as well as intracellular. Sclerostin, which was identified in 2003, is a member of the extracellular modulator proteins. Initially it was wrongly classified as a direct inhibitor of the BMP-signalling pathway due to its classification as a member of the DAN-family. Meanwhile it became apparent that sclerostin targets the Wnt-pathway by binding to the Wnt co-receptors LRP5 and LRP6, which belong to the family of low-density lipoprotein receptors. At the beginning of this work very little was known about the molecular mechanism how sclerostin inhibits the Wnt-pathway. The structure analysis of sclerostin employing NMR-spectroscopy revealed in a modular architecture, which can be divided into three regions: the central, characteristic cystine knot, the loop-region and the two fingers. From the cystine knot three loops emanate in two opposite directions. Loop one and loop three form defined ß-sheet structures resembling two fingers of a hand. Loop two, which runs into the opposite direction, is unstructured and highly flexible like the long N- and C-termini. Antibody fab-fragments, which were generated in collaboration with AbD-Serotec, facilitated the mapping of the binding-epitop of sclerostin to LRP5/6, highlighting an extended area of the unstructured loop region of sclerostin as the LRP5/6 binding site. The high-resolution structure of sclerostin and the identification of the LRP5-binding-epitop yield first insights into the molecular mechanism of sclerostin-LRP5 interaction. This knowledge can now be used to develop small-molecule inhibitors by rational drug design, which are, like the sclerostin activity neutralising fab-fragment AbD09097, highly interesting targets for new bone-anabolic therapies of diseases characterised by bone loss. KW - Cytokine KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Wnt-Proteine KW - Transforming Growth Factor beta KW - Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie KW - Struktur-Aktivitäts-B KW - LRP5/6 KW - DAN-Modulatorproteine KW - Cystinknotenprotein KW - Knochenhomöostase KW - LRP5/6 KW - DAN modulator proteins KW - cystin knot protein KW - bone homeostasis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46224 ER - TY - THES A1 - Fischer, Matthias T1 - Der Einfluß der Ribosomale S6 Kinase 2 (RSK2) auf das Neuriten- und Synapsenwachstum in vivo und in Zellkultur T1 - Der Einfluß der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf das Neuriten- und Synapsenwachstum in vivo und in Zellkultur N2 - In dieser Arbeit sollte die Funktion der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf neuronaler Ebene untersucht werden. Dahingehend gab es, z.B. auf Grund der Phänotypen von Fliegen und Mäusen mit Mutationen im entsprechenden Gen oder von Patienten mit Coffin-Lowry-Syndrom (CLS) nur Vermutungen. Es bestand letztlich die Hoffnung, einen Beitrag zur Aufklärung der Pathophysiologie des CLS zu leisten. Es stellte sich auf Grund von Experimenten sowohl in vivo als auch in vitro in verschiedenen Modellsystemen in dieser Arbeit heraus, daß RSK2 einen negativen Einfluß auf das Neuriten- und Synapsenwachstum hat. In kultivierten Motoneuronen führte der KO von RSK2 zu längeren Axonen und die Überexpression eines konstitutiv aktiven RSK2-Konstrukts zu kürzeren Axonen. In PC12-Zellen führte die Expression von konstitutiv aktiven RSK2 Konstrukten zur Verkürzung der Neuriten und die Expression eines Kinase-inaktiven RSK2 Konstrukts zu längeren Neuriten. In vivo war die neuromuskuläre Synapse bei RSK2-KO Mäusen vergrößert und hatte bei Drosophila rsk Mutanten mehr Boutons. Das RSK2-Protein ist in Motoneuronen der Maus und in überexprimierter Form in den Boutons der neuromuskulären Synapse bei Drosophila nachweisbar. Damit wurde zum ersten Mal die Funktion von RSK2 auf neuronaler Ebene beschrieben. Bezüglich des Mechanismus, wie RSK2 das Nervenwachstum beeinflußt gab es deutliche Hinweise, die dafür sprechen, daß RSK2 dies über eine in der Literatur schon häufiger beschriebene Hemmung der MAPK ERK1/2 erreicht. Für diese Hypothese spricht die Tatsache, daß die ERK-Phosphorylierung in murinen Motoneuronen und im Rückenmark embryonaler Mäuse der RSK2-Mutante erhöht ist und der Axonwachstumsdefekt durch eine Hemmung von MEK/ERK behoben werden kann. Auch ist die ERK-Phosphorylierung an der murinen Muskel-Endplatte in der Mutante erhöht. Zudem zeigen genetische Epistasis-Experimente in Drosophila, daß RSK die Bouton-Zahl über ERK/RL hemmt. RSK scheint also in Drosophila von der Funktion her der RSK2-Isoform in Wirbeltieren sehr ähnlich zu sein. Ein weiteres wichtiges Ergebnis ist die Beobachtung, daß RSK2 bei Motoneuronen keinen wesentlichen Einfluß auf das Überleben der Zellen in Gegenwart neurotropher Faktoren hat. Möglicherweise spielen hier redundante Funktionen der RSK Familienmitglieder eine Rolle. Ein bislang unerklärter Befund ist die reduzierte Frequenz spontaner Depolarisationen bzw. damit einhergehender Ca2+ Einströme bei RSK2-KO Motoneuronen in Zellkultur. Die Häufigkeit und Dichte von Ca2+-Kanälen und aktive Zonen Proteinen war in Motoneuronen nicht von der Anwesenheit des RSK2-Proteins abhängig. Im Hippocampus konnte außerdem das RSK2-Protein präsynaptisch in den Moosfaser-Boutons der CA3 Region nachgewiesen werden. Es befindet sich auch in den Pyramidenzellen, aber nicht in den Pyramidenzell-Dendriten in CA3. Bezüglich der Bedeutung dieser Befunde für die Aufklärung der Pathologie des CLS ist zu folgern, daß der neuro-psychologische Phänotyp bei CLS Patienten wahrscheinlich nicht durch reduziertes Überleben von Neuronen, sondern eher durch disinhibiertes Axonwachstum oder Synapsenwachstum bedingt ist. Dies kann grob sowohl für die peripheren als auch die zentralen Defekte gelten, denn die Synapsen im ZNS und am Muskel sind in ihrer molekularen Ausstattung z.B. im Bereich der Vesikel, der aktiven Zonen oder der Transmitterausschüttung sehr ähnlich. Weiterhin könnte eine veränderte synaptische Plastizität u.a. an der Moosfaser-Pyramidenzell-Synapse in der CA3 Region des Hippocampus eine Rolle bei den kognitiven und mnestischen Einschränkungen der Patienten spielen. Die Entdeckung, daß aktiviertes ERK bei den beobachteten Effekten eine Rolle spielt kann für die Entwicklung von Therapiestrategien eine wertvolle Erkenntnis sein. N2 - In this thesis the function of the Ribosomal S6 Kinase 2 (RSK2) on the neuronal level should be investigated. Due to the phenotypes of flies and mice with mutations in the respective gene or of Coffin-Lowry-Syndrome (CLS) patients there existed only rough speculations. An aim was to make a contribution to the elucidaton of the pathophysiology of the CLS. In this thesis it could be shown by experiments in vivo as well as in vitro in different model systems, that RSK2 has a negative influence on neurite- and synapse growth. In cultivated motoneurons the KO of RSK2 increased the length of axons and the overexpression of a constitutive acitve RSK2-construct reduced axon length. In PC12 cells expression of constitutive active RSK2-constructs reduced neurite-length and expression of a kinase-dead RSK2-construct increased neurite-length. In vivo the size of the neuromuscular synapse of RSK2-KO mice and the bouton number at the Drosophila neuromuscular junction was increased. The RSK2-Protein could be found in mouse motoneurons and, if overexpressed, in boutons at the Drosophila neuromuscular junction. These results show for the first time, which function RSK2 has on the neuronal level. With respect to the mechanism, how RSK2 influences neurite growth, there was evidence, that RSK2 does this by inhibition of the MAPK ERK1/2. The latter has been described in literature before. Arguments for this are the findings, that ERKphosphorylation in mouse motoneurons and in embryonal spinal cord of the RSK2 mouse mutant is increased and that the axon-growth defect can be rescued by inhibition of MEK/ERK. Besides this, ERK-phosphorylation at the neuosmuscular endplate of RSK2-KO mice is increased. Moreover, genetic epistasis experiments in Drosophila show, that RSK inhibits bouton numbers via ERK/RL. So, Drosophila RSK seems to resemble, according to its function, the vertebrate RSK2-isoform. A further important result is the observation, that RSK2 has no effect on survival of motoneurons in the presence of neurotrophic factors. Possibly redundant functions of RSK family members are responsible for this. A so far unexplained finding is the reduced frequency of spontaneous depolarisations with concomitant Ca2+ Influx in cultured RSK2-KO Motoneurons. The amount and density of Ca2+ channels and active zone proteins was not dependent on the presence of the RSK2-Protein in motoneurons. In the hippocampus the RSK2-Protein could be found presynaptically in mossy-fiber boutons in the CA3 region. Moreover, it is localized in pyramidal cells, but not in the pyramidal cell dendrites in the CA3 region. With respect to the impact of these findings on the understanding of the CLS pathology, it is, according to the results of this thesis, probably not caused by reduced survival of neurons, but by disinhibited axon and synapse growth. This may account roughly for peripheral as well as central defects, because synapses in the central nervous system and at the muscle are very similar with respect to the molecular organization for example of vesicles, the active zone or transmitter release. Furthermore, a change in synaptic plasticity for example at the mossy-fiber pyramidal cell synapse in the CA3 region of the hippocampus could lead to the cognitive and mnestic deficits in CLS patients. The finding that activated ERK plays a role in the observed effects can guide the way for new therapeutic strategies. KW - Ribosom KW - Kinasen KW - Axon KW - Wachstum KW - RSK2 KW - Motoneuron Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48341 ER - TY - THES A1 - Lütkenhaus, Katharina T1 - Tumour development in Raf-driven cancer mouse models T1 - Tumor-Entwicklung in Raf-transgenen Mausmodellen N2 - Metastasis is the cause of death in 90% of cancer-related deaths in men. Melanoma and Non-Small-Cell Lung Cancer (NSCLC) are both tumour types with poor prognosis, lacking appropriate therapeutic possibilities, not least because of their high rate of metastasis. Thus understanding the process of metastasis might unravel therapeutic targets for developing further therapeutic strategies. The generation of a transgenic mouse model expressing B-RafV600E in melanocytes, a mutation that is found in about 60% of all melanoma, would result in an ideal tool to study melanoma progression and metastasis. In this work, a doxycycline-inducible system was constructed for expression of B-RafV600E and transgenic animals were generated, but the expression system has to be improved, since this strategy didn’t give rise to any viable, transgene carrying mice. Furthermore, since it was shown in the work of others that the metastatic behavior of tumour cell lines could be reversed by an embryonic microenvironment and the influence of a tumourigenic microenvironment on melanocytes lead to the acquisition of tumour cell-like characteristics, the question arose, whether B-Raf is as important in melanocyte development as it is in melanoma progression. In this work, the embryonal melanocyte development in B-Raf-deficient and wildtype mouse embryos was examined and there were no differences observed in the localization and number of neural crest stem cells as well as in the localization of the dopachrome-tautomerase positive melanoblasts in the embryos and in cultured neural tube explants. The expression of oncogenic C-Raf in lung epithelial cells has yielded a model for NSCLC giving rise to adenomas lacking spontaneous progression or metastasis. The co-expression of c-Myc in the same cells accelerates the tumour development and gives rise to liver and lymphnode metastases. The expression of c-Myc alone in lung epithelial cells leads to late tumour development with incomplete penetrance. A mutation screen in this work resulted in the observation that a secondary mutation in KRas or LKB1 is necessary for tumour formation in the c-Myc single transgenic animals and suggested metastasis as an early event, since the corresponding metastases of the mutation-prone primary lung tumours were negative for the observed mutations. Furthermore, in this work it was shown that the expression of chicken c-Myc in a non-metastatic NSCLC cell line leads to metastatic clones, showing that c-Myc is sufficient to induce metastasis. Additionally a panel of metastasis markers was identified, that might serve as diagnostic markers in the future. N2 - In 90% der Todesfälle aufgrund von Krebserkrankungen sind Metastasen für den Tod des Patienten verantwortlich. Sowohl Melanom, als auch nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC) sind beides Tumortypen, die eine schlechte Prognose haben und für die sich wenige Therapiemöglichkeiten bieten, nicht zuletzt aufgrund ihrer häufigen Metastasierung. Somit würde ein besseres Verständnis des Metastasierungsprozesses neue therapeutische Angriffspunkte aufdecken und damit die Möglichkeit zur Entwicklung neuer Therapieansätze bieten. Die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, in dem B-RafV600E, eine Mutation die man in 60% der Melanompatienten findet, melanocyten-spezifisch exprimiert wird, würde ein geeignetes Werkzeug ergeben, um die Entstehung und die Metastasierung von Melanom zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Konstrukt zur Doxycyclin-abhängingen Expression von B-RafV600E erzeugt und mit diesem wurden transgene Tiere generiert. Da dieser Ansatz nicht zu lebensfähigen, das Transgen tragenden Linien führte, muss das Expressionssystem weiter verbessert werden. Da in der Arbeit von anderen gezeigt wurde, dass das metastasierende Verhalten von Tumor-Zelllinien durch eine embryonale Mikroumgebung aufgehoben werden konnte, und dass der Einfluss einer tumorähnlichen Mikroumgebung in Melanocyten zur Erlangung von Tumorzell-Charakteristika führte, kam die Frage auf, ob B-Raf eine ähnlich wichtige Rolle in der Entwicklung von Melanocyten wie in der Entstehung von Melanomen spielt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die embryonale Melanocytenentwicklung in B-Raf-defizienten sowie in wildtypischen Mausembryonen untersucht. Es konnten keine Unterschiede in der Lokalisation und Anzahl von Stammzellen des Neuralrohres und in der Lokalisation von Dopachrome-tautomerase positiven Melanoblasten in den Embryonen und in kultivierten Explantaten des Neuralrohres festgestellt werden. Die Expression von oncogenem C-Raf in Lungenepithelzellen von Mäusen ist ein Modell für NSCLC und führt zur Ausbildung von Adenomen ohne spontane Weiterentwicklung oder Metastasen. Die Koexpression von C-Raf mit c-Myc in denselben Zellen beschleunigt die Entwicklung von Tumoren und führt zu Metastasen in Leber und Lymphknoten. Die Expression von c-Myc alleine in Lungenepithelzellen führt zu einer verspäteten Entwicklung von Tumoren mit nicht vollständiger Penetranz. Ein Screening für Mutation im Rahmen dieser Arbeit führte zu der Beobachtung, dass Sekundärmutationen in KRas oder LKB1 für die Tumorentwicklung in den c-Myc transgenen Tieren notwendig sind und dass die Metastasierung ein frühes Ereignis zu seien scheint, da die zugehörigen Metastasen in Leber und Lymphknoten im Gegensatz zum Primärtumor in der Lunge keine Mutationen in diesen Genen trugen. Desweiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Expression von avianem c-Myc in einer nicht-metastasierenden NSCLC Zelllinie zu metastasierenden Klonen führte, was zeigt, dass c-Myc ausreichend ist um Metastasierung auszulösen. Zusätzlich wurde eine Reihe von Markern für Metastasen identifiziert, die in Zukunft als diagnostische Marker Verwendung finden könnten. KW - Raf KW - Melanom KW - Metastase KW - Lungenkrebs KW - Raf KW - Myc KW - NSCLC KW - metastasis KW - Raf KW - Myc Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48332 ER - TY - THES A1 - Brandes, Nicolas T1 - Oxidative Thiol Modifications in Pro- and Eukaryotic Organisms T1 - Oxidative Thiol Modifikationen in Pro- und Eukaryotischen Organismen N2 - Cystein spielt eine wichtige Rolle in der Biochemie vieler Proteine. Aufgrund der Redox-Eigenschaften und der hohen Reaktivität der freien Thiol-Gruppe sowie dessen Fähigkeit Metallionen zu koordinieren, ist Cystein oft Bestandteil von katalytischen Zentren vieler Enzyme. Zudem lassen sich Cysteine durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies leicht reversibel oxidativ modifizieren. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass Proteine redox-bedingte Thiol-Modifikationen nutzen, um Veränderungen ihrer Aktivität zu steuern. Diese redox-regulierten Proteine spielen eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen. Das erste Ziel meiner Arbeit war die Identifizierung von Stickstoffmonoxid (NO)-sensitiven Proteinen in E. coli. Die redox-bedingten Funktionsänderungen solcher Proteine erklären möglicherweise die veränderte Physiologie von E. coli Zellen, die unter NO-Stress leiden. Um E. coli Proteine zu identifizieren, die unter Einwirkung von NO-Stress reversibel Thiol-modifiziert werden, wandte ich eine Kombination aus differentiellem Thiol-Trapping und 2D Gel-Elektrophorese an. Es wurden zehn Proteinen identifiziert, welche NO-sensitive Thiol-Gruppen enthalten. Genetische Studien ergaben, dass Modifikationen an AceF & IlvC mitverantwortlich sind für die NO-induzierte Wachstumshemmung. Bemerkenswert ist es, dass die Mehrheit der identifizierten Proteine speziell nur gegen reaktive Stickstoffspezies empfindlich ist, welches an einem der identifizierten Stickstoffmonoxid-sensitiven Proteinen, der kleinen Untereinheit von Glutamate synthase, getestet wurde. In vivo und in vitro Aktivitätsstudien zeigten, dass es zu einer schnellen Inaktivierung von Glutamate synthase nach NO-Behandlung kommt, das Protein aber resistent gegenüber anderen Oxidationsmittel ist. Diese Resultate implizieren, dass reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies unterschiedliche physiologische Vorgänge in Bakterien beeinflussen. Das zweite Ziel meiner Arbeit war es, redox-sensitive Proteine in S. cerevisiae zu identifizieren und deren Redox-Zustand als in vivo Read-Out zu verwenden, um die Rolle von oxidativen Stress während des Alterungsprozess eukaryotischer Zellen zu analysieren. Zunächst bestimmte ich in Hefezellen mit Hilfe von OxICAT, einer hochsensiblen quantitativen Methode, die Thiol-Trapping mit Massenspektrometrie verbindet, den exakten in vivo Thiol-Status von fast 300 Proteinen. Diese Proteine lassen sich in vier Gruppen einteilen: 1) Proteine, deren Cysteinreste resistent gegen Oxidation sind; 2) Proteine, in denen Cysteinmodifikationen strukturelle Aufgaben übernehmen; 3) Proteine mit oxidationsempfindlichen Cysteinen, die bereits eine gewisse Oxidation in exponentiell wachsenden Hefezellen aufweisen; 4) Proteine, die reduziert sind, aber redox-sensitive Cysteinreste enthalten, die die Funktion der Proteine bei Vorhandensein von oxidativen Stress beeinflussen. Die Sensitivität dieser Proteine gegenüber oxidativen Stress wurde durch Exposition subletaler Konzentrationen von H2O2 oder Superoxid auf Hefezellen nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass die wichtigsten zellulären Angriffspunkte von H2O2- und Superoxid-bedingtem Stress Proteine sind, die an Vorgängen der Translation, Glykolyse, des Citratzyklus und der Aminosäure-Biosynthese beteiligt sind. Diese Zielproteine zeigen, dass Zellen für die Bekämpfung von oxidativen Stress Metabolite schnell in Richtung des Pentosephosphatweges umleiten, um die Produktion des Reduktionsmittels NADPH sicherzustellen. Die hier präsentierten Ergebnisse belegen, dass die quantitative Bestimmung des Oxidationsstatus von Proteinen eine wertvolle Methode ist, um redox-sensitive Cysteinreste zu identifizieren. Die OxICAT Technologie wurde dann verwendet, um das genaue Ausmaß und die Entstehung von oxidativen Stress in chronologisch alternden S. cerevisiae Zellen zu bestimmen. Für diese Bestimmung wurde der Oxidationsstatus von Proteinen in alternden Hefezellen als physiologischer Read-Out verwendet. Ich zeigte, dass die zelluläre Redox-Homöostase in chronologisch alternden Hefezellen global zusammenbricht, wobei es sich dabei um einen Prozess handelt, der dem Zelltod vorausgeht. Der Beginn dieses Zusammenbruchs scheint mit der Lebensdauer der Hefezellen zu korrelieren, da Kalorienrestriktion die Lebensdauer der Hefezellen erhöht und den Zusammenbruch des Redox-Gleichgewichts verzögert. Die Oxidation einer kleinen Anzahl an Proteinen (z.B. Thioredoxin reductase) geht dem Redox-Zusammenbruch deutlich voraus, was maßgeblich zum Verlust der Redox-Homöostase beitragen könnte. Diese Studien an alternden Hefezellen erweitern unser Verständnis, wie sich Veränderungen in der Redox-Homöostase auf die Lebensdauer von Hefezellen auswirken. Zudem bestätigen die hier präsentierten Ergebnisse die Bedeutung von oxidativen Thiol-Modifikationen als eine der wichtigsten posttranslationalen Proteinmodifikationen in pro-und eukaryotischen Organismen N2 - Cysteines play important roles in the biochemistry of many proteins. The high reactivity, redox properties, and ability of the free thiol group to coordinate metal ions designate cysteines as the amino acids of choice to form key catalytic components of many enzymes. Also, cysteines readily react with reactive oxygen and nitrogen species to form reversible oxidative thiol modifications. Over the last few years, an increasing number of proteins have been identified that use redox-mediated thiol modifications to modulate their function, activity, or localization. These redox-regulated proteins are central players in numerous important cellular processes. First aim of this study was to discover nitric oxide (NO) sensitive proteins in E. coli, whose redox-mediated functional changes might explain the physiological alterations observed in E. coli cells suffering from NO-stress. To identify E. coli proteins that undergo reversible thiol modifications upon NO-treatment in vivo, I applied a differential thiol trapping technique combined with two-dimensional gel analysis. 10 proteins were found to contain thiol groups sensitive to NO-treatment. Subsequent genetic studies revealed that the oxidative modifications of AceF & IlvC are, in part, responsible for the observed NO-induced growth inhibition. Noteworthy, the majority of identified protein targets turned out to be specifically sensitive towards reactive nitrogen species. This oxidant specificity was tested on one NO-sensitive protein, the small subunit of glutamate synthase. In vivo and in vitro activity studies demonstrated that glutamate synthase rapidly inactivates upon nitric oxide treatment but is resistant towards other oxidative stressors. These results imply that reactive oxygen and nitrogen species affect distinct physiological processes in bacteria. The second aim of my study was to identify redox-sensitive proteins in S. cerevisiae and to use their redox state as in vivo read-out to assess the role of oxidative stress during the eukaryotic aging process. I first determined the precise in vivo thiol status of almost 300 yeast proteins located in the cytosol and sub-cellular compartments of yeast cells using a highly quantitative mass spectrometry based thiol trapping technique, called OxICAT. The identified proteins can be clustered in four groups: 1) proteins, whose cysteine residues are oxidation resistant; 2) proteins with structurally or functionally important cysteine modifications 3) proteins with highly oxidation-sensitive active site cysteines, which are partially oxidized in exponentially growing yeast cells due to their exquisite sensitivity towards low amounts of ROS; 4) proteins that are reduced in exponentially growing cells but harbor redox-sensitive cysteine(s) that affect the catalytic function of the protein during oxidative stress. These oxidative stress sensitive proteins were identified by exposure of yeast cells to sublethal concentrations of H2O2 or superoxide. It was shown that the major targets of peroxide- and superoxide-mediated stress in the cell are proteins involved in translation, glycolysis, TCA cycle and amino acid biosynthesis. These targets indicate that cells rapidly redirect the metabolic flux and energy towards the pentose phosphate pathway in an attempt to ensure the production of the reducing equivalent NADPH to counterattack oxidative stress. These results reveal that the quantitative assessment of a protein’s oxidation state is a valuable tool to identify catalytically active and redox-sensitive cysteine residues. The OxICAT technology was then used to precisely determine extent and onset of oxidative stress in chronologically aging S. cerevisiae cells by utilizing the redox status of proteins as physiological read-out. I found that chronological aging yeast cells undergo a global collapse of the cellular redox homeostasis, which precedes cell death. The onset of this collapse appears to correlate with the yeast life span, as caloric restriction increases the life span and delays the redox collapse. These results suggest that maintenance of the redox balance might contribute to the life expanding benefits of regulating the caloric intake of yeast. Clustering analysis of all oxidatively modified proteins in chronological aging yeast revealed a subset of proteins whose oxidative thiol modifications significantly precede the general redox collapse. Oxidation of these early target proteins, which most likely results in a loss of their activity, might contribute to or even cause the observed loss of redox homeostasis (i.e., thioredoxin reductase) in chronologically aging yeast. These studies in aging yeast expand our understanding how changes in redox homeostasis affect the life span of yeast cells and confirm the importance of oxidative thiol modifications as key posttranslational modifications in pro- and eukaryotic organisms. KW - Oxidativer Stress KW - Cystein KW - Saccharomyces cerevisiae KW - Escherichia coli KW - Wasserstoffperoxid KW - Hyperoxide KW - Sauerstoffradikal KW - Thiolgruppe KW - Altern KW - Oxidation KW - Biologische Oxidation KW - Oxidative Thiol Modifikationen KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Chronologisches Altern KW - Reversibel KW - Posttranslational KW - oxidative thiol modification KW - chronological aging KW - reactive oxygen species KW - Saccharomyces cerevisiae KW - thioredoxin reductase Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46542 ER -