TY  - THES
A1  - Barcena Uribarri, Ivan
T1  - Porins in the genus Borrelia : Characterization of P66 and P13
T1  - Porins in der Gattung Borrelia : Charakterizierung von P13 und P66
N2  - Die Gattung Borrelia gehört zur Familie der Spirochaetes, welche sich den Gram-negativen Bakterien zuordnen lassen. Für diese Familie charakteristisch ist eine längliche, helikale Form, die Längen von 5 – 250 µm erreichen kann. Den Spirochaeten gehören diverse Pathogene an wie Treponema und Leptospira, die Erreger der Syphillis und der Leptospirose. Borrelien verursachen beim Menschen zwei schwere Krankheiten: Die Lyme-Borreliose (LB) und das Rückfallfieber (RF). Als Pathogen besitzen Borrelien einen Lebenszyclus, in dem sie zwischen Gliederfüßern als Vektoren und Säugetieren (oft kleinen Nagetieren) als Wirt wechseln. Um das Überleben in derart unterschiedlichen Organismen zu sichern und die Immunantwort des Wirtes zu unterdrücken, benötigt ein Organismus mit einem solch komplexen Lebenszyklus eine außergewöhnliche Regulierung der Proteinexpression. Die Lyme-Borelliose stellt eine multisystemische Krankheit dar, die verschiedene Organe, wie Haut, Gelenke und das Nervensystem betreffen kann. Häufig kommt es zu einer sich kreisförmig ausbreitenden Rötung, die erythema migrans genannt wird, die zur klinischen Diagnose genutzt wird. Sie erscheint nach einem Zeckenbiss und kann einen Durchmesser von bis zu 15 cm weit erreichen. Rückfallfieber erkennt man an plötzlich auftretenden Fieberschüben, die von weiteren Symptomen wie Schüttelfrost, Kopfschmerzen, Muskel und Gelenkschmerzen oder Übelkeit begleitet werden. Beide Krankheiten können in frühen Stadien der Infektion leicht mit der Gabe von Antibiotika behandelt werden. Die verschiedenen Arten der Gattung Borrelia besitzen ein relativ kleines Genom. Da außerdem viele der vorhandenen Gene für Virulenzfaktoren und wirtsspezifische Anpassungen codieren, fehlen den Borrelien wichtige Genen für die Biosynthese von Aminosäuren, Fettsäuren oder Nukleotiden. Diese metabolischen Defizite werden durch die Aufnahme von durch den Wirt produzierten Nährstoffen ausgeglichen. Den ersten Schritt der Nährstoffaufnahme übernehmen Porine. Dies sind wassergefüllte Kanäle, die die Aufnahme und den Transport von essentiellen Molekülen über die äußere Membran ermöglichen. P66, P13 und Oms28 wurden bei Borrelia burgdorferi, Oms38 bei Rückfallfieber verursachenden Spirochaeten gefunden. P66 ist ein einzelnes Porin mit einer extrem hohen Leitfähigkeit von 11 nS. P13 ist ein kleines Protein (13kDa) mit einer α helikalen Sekundärstruktur, die keinerlei Ähnlichkeit zu den bisherigen Modellen von bekannten Porinen aufweist. Aufgrund seiner Assoziation mit der periplasmatischen Seite der Membran wurde die Funktion als Porin für Oms28 in letzter Zeit stark angezweifelt. Oms38 ist ein Dicarboxylat-spezifisches Porin mit Homologen bei Lyme-Borreliose verursachenden Arten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war das vorhandene Wissen über P66 und P13 als Porine der Gattung Borrelia zu erweitern. Die beiden Proteine unterscheiden sich strukturell stark von den bisher bekannten Porine Gram-negativer Bakterien und sind daher geeignete Forschungsobjekte, um die speziellen Anforderungen an Borrelienporinen zu erforschen. Das Ziel dieser Arbeit war die Erforschung der beiden in Borrelien beschriebenen Proteine P66 und P13. Gerade weil sich beide in Aufbau und Größe von bekannten Porinen Gram-negativer Bakterien unterscheiden und somit in spezifische Prozesse bei der Gattung Borrelia involviert sein könnten, ist die Forschung auf diesem Gebiet auch weiterhin von höchstem Interesse. Im ersten Projekt dieser Arbeit wurden das Vorkommen und die porenformende Aktivität von P66 in verschiedenen Borrelia-Arten (Lyme-Borreliose und Rückfallfieber) untersucht. Bei P66 handelt es sich um das am besten untersuchte Porin der Borrelien, das eine Doppelfunktion als Porin und als Adhesin besitzt. Da sich alle bisherigen Ergebnisse auf B. burgdorferi beziehen, ist wenig bis gar nichts über homologe Proteine in anderen Borrelien-Arten bekannt. Deswegen wurden jeweils drei Arten, die Lyme-Borreliose und Rückfallfieber verursachen, ausgewählt und an deren P66-Homologe die porenformende Aktivität überprüft. Fünf von sechs zeigten dabei eine ähnliche Einzelkanalleitfähigkeit wie P66, die im Bereich von 9 – 11 nS lagen, bei gleichzeitig kaum vorhandener Selektivität für eine bestimmte Ionensorte. Auch eine Spannungsabhängigkeit, die bei 30 – 70 mV begann, war messbar. Nur im Fall von B. hermsii konnten keine Poren gefunden werden. Dabei ist noch nicht geklärt, ob das Fehlen der porenbildenden Aktivität einem evolutionären Verlust der Funktion als Pore oder einer höheren Anfälligkeit gegenüber den verwendeten Detergenzien geschuldet ist. In einem weiteren Projekt wurde der kontrovers diskutierte Porendurchmesser von P66 aus B.burgdorferi mit empirischen Mitteln analysiert. In früheren theoretischen Studien wurde der Kanaldurchmesser auf 2,6 nm geschätzt. Dieser sehr große Durchmesser würde allerdings die Schutzfunktion der Außenmembran verhindern. Mit Hilfe von ungeladenen Substanzen gelang eine Bestimmung des Innendurchmessers von P66 auf 1,8 nm am Eingang und 0,8 nm an der Engstelle der Pore. Zusätzlich führte eine unerwartete Blockierung der Pore durch einige dieser Substanzen zu der Erkenntnis, dass P66 einen oligomeren (wahrscheinlich oktameren) Aufbau besitzt. Ein solcher Aufbau konnte bisher noch nie nachgewiesen werden und könnte von daher ein einzigartiges Merkmal von Borrelien oder Spirochaeten sein. Das dritte Projekt beschäftigte sich mit der rekombinanten Produktion eines Proteins von B. burgdorferi mit immunogenen Eigenschaften. Dieses könnte dazu verwendet werden, neue Diagnose Tests und Therapien zu entwickeln. P13 kommt in verschiedenen LB- und RF-Arten vor und besitzt kein bekanntes bakterielles Homolog. Diese Fakten machen aus P13 einen geeigneten Kandidaten als therapeutisches Ziel. Aus diesem Grund wurde das P13-Gen in zwei unterschiedliche Organismen kloniert. Zum einen in E. coli, wo zwei verschiedene Konstrukte zur Klärung der Rolle des periplasmatisch verdauten C-Terminus dienen sollten. Zum anderen in Tabakpflanzen über Agrobacterium tumefaciens, mittels eines Virus. Dabei vermehrt sich der Vektor in den Zellen der Pflanze, breitet sich aus und produziert gleichzeitig das gewünschte Protein. Mit Hilfe dieser zweiten Expressionsmethode sollte es möglich sein, große Mengen des rekombinanten Proteins zu erzeugen und gleichzeitig die Kosten und den Zeitbedarf zu senken. Das letzte Projekt beschäftigte sich mit dem Außenmembran-Komplexom von B. burgdorferi und konzentrierte sich dabei auf die Komplexe von P13 und P66. Blue Native PAGE und 2D-SDS PAGE wurden als Techniken ausgewählt. Es konnte gezeigt werden, dass P66 das einzige Protein ist, das am vermutlich oktameren Aufbau der 11 nS Pore beteiligt ist. Zusätzlich gelang es, den Komplex in zwei Hälften zu spalten, die ungefähr das halbe Molekulargewicht bei einer Leifähigkeit von 5,5 nS zeigten. Im Fall des P13-Komplexes konnte eine mögliche Verknüpfung mit OspC entdeckt werden. Die Gelelution des Komplexes und anschließende Tests mit Hilfe der Black-Lipid-Bilayer-Methode ergaben eine Aktivität von 0,6 nS. Dies steht im starken Gegensatz zu der vorher für P13beschriebenen Größe von 3,5 nS. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass P66 ein in vielen Borrelienarten vorkommendes und damit weit verbreitetes Porin mit Homologen in LB- und RF-Spezies ist, die ähnliche Charakteristika besitzen. Der Durchmesser dieser Pore konnte unter Berücksichtigung der Eigenschaften eines molekularen Siebes genauer bestimmt werden. Im Fall von P13 könnte dessen rekombinante Produktion es erlauben, dieses Protein als Hilfsmittel zur Diagnose und zur medizinischen Therapie einzusetzen. Zusätzlich könnte der gefundene Bezug zu OspC dazu beitragen, in Zukunft mehr über die Funktion dieses interessanten Proteins herauszufinden.
N2  - The genus Borrelia belongs to the Spirochaetes phylum which is far related to Gram negative bacteria. This phylum possesses a characteristic long helically coiled shape with lengths that vary from 5 to 250 μm. Other pathogens as Treponema and Leptospira which cause syphilis and leptospirosis, also belong to the Spirochaetes. Borrelia itself is the causative agent of two human diseases, the Lyme disease and relapsing fever. Borreliae are pathogenic bacteria which cycle between their arthropod vector, in most cases a tick, and a mammal host, very often small rodents. This complex life cycle requires an extraordinary protein up- and down-regulation in order to survive in such different organisms and avoid their immunologic systems. Lyme disease is a multisystemic disease that can affect different organs like skin, joints and nervous system. A red rash with concentric rings, called erythema migrans is a distinctive manifestation that allows clinical diagnosis. It appears after the bite of an infected tick and spreads out to diameters that can reach 15 cm. Relapsing fever is characterized by sudden recurrent fever peaks accompanied with chills, headache, muscle and joint pain and nausea. Both diseases are easily treated with antibiotics in early infection stages. Borrelia species possess a small genome. Many of their genes are related with virulence and the adaptation to the different hosts. The absence of genes in Borrelia involved in the biosynthesis of amino acids, fatty acids or nucleotide is very remarkable. This metabolic deficiency makes Borrelia species dependent on substances produced by the host. The first step in nutrient uptake is accomplished by porins. Bacterial porins are water-filled channels that facilitate the transport of essential molecules through the outer membrane. Four porins have been described in Borrelia up to this point. P66, P13 and Oms28 have been found in Borrelia burgdorferi while Oms38 was discovered in relapsing fever spirochetes. P66 is a singular porin with an extremely high single channel conductance of 11 nS. P13 is a small protein with an α-helical secondary structure which does not fit into the general porin model. The function of Oms28 as a porin has been questioned recently due to its periplasmic membrane-associated location. Finally, Oms38 is a specific porin for dicarboxilates with homologues in Lyme disease species. The aim of this thesis was to broaden the knowledge of the P66 and P13 porins described in the genus Borrelia. Both differ in structure and size from the general Gram negative porin model and could be highly involved in specific tasks in the genus Borrelia. In the first project of this thesis, the presence and pore forming capacity of P66 was studied in several Borrelia species including members of the relapsing fever group. P66 is the best studied porin in Borrelia with a dual function as porin and adhesin. This knowledge is restricted to B. burgdorferi and little or nothing is known about homologues in other Borrelia species. Therefore, three Lyme disease and three relapsing fever species were chosen as representative agents of the genus and the pore forming activity of their P66 homologues was studied. Five out of the six homologues exhibited a similar single channel conductance in a range from 9 to 11 nS. All of them showed no selectivity for cations or anions, and they were voltage dependent starting at different voltages from 30 to 70 mV. Only in the case of the B. hermsii homologue no pore forming activity could be established. It remains unclear if the lack of activity was due to an evolutionary loss of its porin function or to a higher sensibility to the detergents used for purification. In another project, the controversial P66 pore diameter of B. burgdorferi was analyzed with an empirical method. In a former study, the diameter of the P66 channel was estimated to be 2.6 nm based on theoretical considerations. This diameter is rather large and could impair the outer membrane protective function. Different non-electrolytes were used to study the P66 pore diameter indicating a 1.8 nm entrance diameter and a 0.8 nm inner constriction. In addition, the blockage of the channel with some of those non-electrolytes disclosed an oligomeric organization formed by approximately eight independent channels. Such a structure has not been observed so far in any other living organism and could be exclusive of Borrelia or spirochetes. The third project of this thesis deal with the recombinant production of a B. burgdorferi protein with immunogenic potential. This protein might be used to develop new diagnosis tests and therapeutic treatments. P13 is an outer membrane protein present in LD and RF species and it does not have any other known bacterial homologue. These facts make of P13 a good candidate to be used as a therapeutic target. For such purpose, P13 was cloned in two organisms. First, in Escherichia coli were two different constructs were designed to establish the role of a periplasmic cleaved C-terminus. Second, in a virus based vector delivered by Agrobacterium tumefaciens into tobacco plant cells. The vector replicates inside the plant cells spreading the infection to adjacent cells and at the same time producing the recombinant protein. This second expression method should enable the production of large amounts of the recombinant protein reducing time and costs. The last project of this thesis looked into the outer membrane complexome of B. burgdorferi focusing on the P13 and P66 porin complexes. Blue Native Page and second dimension SDS Page were the technique chosen for this purpose. P66 could be shown to be the only protein involved in the formation of the 11 nS pore which complex is probably formed by eight monomers. It was also possible to divide this complex in two halves with approximately half the molecular weight and a conductance of 5.5 nS. In the case of the P13 complex, a possible association with the lipoprotein OspC was revealed. The gel extraction of the P13 complex and its test with the Back Lipid Bilayer assay exhibited a 0.6 nS activity. This is in high contrast with the 3.5 nS activity previously described for this protein. To sum up, P66 is a porin present in many Borrelia species including not only LD but also RF species and which homologues show similar biophysical properties. The diameter of this pore is smaller than previously thought and it has molecular weight sieving properties. In the case of P13, its recombinant procurement will allow the use of P13 as a diagnostic and therapeutic target. The possible association with OspC could facilitate to unravel in future experiments the function of this intriguing protein.
KW  - Porins
KW  - Borrelia
KW  - Porins
KW  - Borrelia
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55339
ER  - 
TY  - THES
A1  - Konradt, Christoph
T1  - Cross-talk between Shigella and cells of the adaptive immunity: The TTS effector IpgD inhibits T cell migration
T1  - Cross-talk zwischen Shigella und Zellen des Adaptiven Immunsystems: Der TTS Effektor IpgD inhibiert die T Zell Migration
N2  - Shigellosis, or bacillary dysentery, is a rectocolitis caused by the gram-negative, enteroinvasive bacteria of the genus Shigella. Shigellosis still remains a major public health burden with an estimated 80 million cases of bloody diarrhoea and 700.000 deaths per year, primarily in children under the age of 5. Shigella disrupts, invades, and causes inflammatory destruction of the colonic epithelium in humans through virulence effectors secreted by the type III secretion apparatus (TTSA). In contrast to the Shigella-induced manipulation of the host innate immune response, the impact of Shigella on the adaptive immunity has been poorly studied thus far. In order to understand why the naturally induced protective humoral response requires several infections to be primed and is of short duration, the work presented here investigates if Shigella is able to directly interact with T cells. Indeed, it has been shown that Shigella was able to invade and proliferate inside T cells. Furthermore, Shigella was able to inhibit T cell migration through a TTSA effector. Moreover, the Shigella effector IpgD, a phosphoinositide 4-phosphatase that specifically dephosphorylates phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PIP2) into phosphatidylinositol-(5)-monophosphate (PI(5)P), was identified as the effector responsible for the observed inhibition. It could be demonstrated that IpgD was responsible for a reduction of intracellular PIP2 levels in T cells. Further experiments showed a reduced level of phosphorylated ezrin, radixin and moesin (ERM) proteins in infected, as well as with IpgD transfected, T cells. The ERM protein family plays an imported role in signal transduction and motility and their activity is closely related to the binding of PIP2. Therefore, the low level of PIP2 leads to a dephosphorylation of the ERM proteins which inhibits T cells response to chemokine stimulation. Indeed, IpgD transfected T cells show a reduced ability to re-localise the ERM proteins upon chemokine stimulation. Targeting T cell motility, via TTSA effectors, could explain the low level of specific T cell priming during Shigella infection. This is the first report of Shigella induced manipulation of T cell function and on the inhibition of T cell migration by a bacterial effector.
N2  - Shigellose oder Bakterieruhr ist eine von Bakterien der Gattung Shigella ausgelöste Dysenterie Erkrankung des Dickdarms. Mit jährlich über 80 Millionen Fällen von blutigen Durchfällen und 700000 Todesfällen, hauptsächlich bei Kindern unter 5 Jahren, stellt Shigella immer noch ein ernsthaftes Gesundheitsproblem dar. Shigella destabilisiert das menschliche Dickdarmgewebe und dringt in dieses ein, wo es eine akute Entzündung auslöst, die das Gewebe weiterhin zerstört. Verursacht wird dies durch bakterielle Effektoren, die durch ein Type III Sekretionssytem (TTSA) sekretiert werden. Verglichen mit der Anzahl an Studien über die Manipulation der angeborenen Immunabwehr gibt es nur wenige Studien über die Interaktionen von Shigella mit dem adaptiven Immunsystem. Um zu verstehen, warum für die Entwicklung einer humoralen Immunantwort mehrere Infektionen erforderlich sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht, ob Shigella in der Lage ist, direkt mit TZellen zu interagieren. Es konnte gezeigt werden, dass Shigella in T-Zellen eindringen und sich vermehren kann. Darüber hinaus zeigt sich, dass Shigella in der Lage ist, durch TTSA-Effektoren die T-Zell-Migration zu hemmen. Der Shigella Effektor IpgD konnte als der für die Hemmung verantwortliche Effektor identifiziert werden. Bei IpgD handelt es sich um eine 4-Phosphoinositid-Phosphatase, die Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat (PIP2) zu Phosphatidyl-inositol-(5)- monophosphat (PI(5)P) dephosphoryliert. Es wurde deutlich, dass der Effektor IpgD, neben der Menge an PIP2, auch die Menge an phosphorylierten Ezrin, Radixin und Moesin (ERM) Proteinen in T-Zellen reduziert. Die ERM-Protein-Familie spielt in der Signaltransduktion und bei der Motilität von T-Zellen eine wichtige Rolle und ihre Phosphorylierung ist eng an die Bindung von PIP2 gekoppelt. Daher führt eine geringe Menge an PIP2 zu einer Dephosphorylierung der ERM-Proteine, was eine Stimulierung der T-Zellen durch Chemokine hemmt. In der Tat zeigten IpgDtransfizierte T-Zellen eine verminderte Fähigkeit zur Relokalisierung der ERM-Proteine nach einer Chemokine-Stimulation. In dieser Arbeit konnte erstmals die Manipulation von T-Zell-Funktionen durch Shigella und die Hemmung der T-Zell-Migration, ausgelöst durch einen bakteriellen TTSA-Effektor, gezeigt werden.
KW  - Medizinische Mikrobiologie
KW  - Shigella
KW  - Immunsystem
KW  - Shigella
KW  - immune sytem
KW  - host-pathogen-interaction
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55397
ER  - 
TY  - THES
A1  - Li, Jian-Qiang
T1  - Modulating the expression of enzymes of isoprenoid synthesis: effects on Vgamma9Vdelta2 T cell activation and tumor cell growth
T1  - Modulation der Expression von Enzymen der Isoprenoidsynthese: Effekte auf die Vgamma9Vdelta2 T Zellaktivierung und das Tumorzellwachstum
N2  - This study focuses on phosphoantigen specific Vg9Vd2 T cells which only exist in human and non-human primates. This population accounts for 1%-5% of peripheral blood T-lymphocytes but their frequency can rise to 50% of total blood T cells upon infection. Vg9Vd2 T cells can be activated by nonpeptide compounds with critical phosphate moieties which are termed as phosphoantigens. These include isopentenyl pyrophosphate (IPP), a key compound of isoprenoid synthesis in all organisms, and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), a direct precursor of IPP in DOXP pathway which only exist in eubacteria, plants, apicomplexaen parasites. Its activity as phosphoantigen is at least 1000 fold higher than that of IPP. However, direct structural evidence of phosphoantigen binding to the TCR is missing so far. Moreover, Vg9Vd2 T cells have potent anti-tumor activity e.g. against the B-cell lymphoma Daudi, whose Vg9Vd2 T cell activating properties have been suggested to result from sensing of abnormal intracellular IPP levels by the Vg9Vd2 TCR or Vg9Vd2 TCR binding to other postulated ligands such as an ectopically expressed F1-ATPase or UL-16 binding protein 4 (ULBP4). Aminobisphosphonates and alkymines were hypothesized to activate Vg9Vd2 T cells indirectly by inhibiting the IPP consuming enzyme farnysyl pyrophosphates synthesis (FPPS) although off target effects of these drugs or a direct interaction with the Vg9Vd2 TCR could not be excluded. This thesis presents new approaches for the mechanistic analysis of Vg9Vd2 T cell activation. By employing retroviral transduction of FPPS specific shRNA, it shows that specific shRNA reduces expression of FPPS and is sufficient to convert hematopoietic and non-hematopoietic tumor cell lines into Vg9Vd2 T cell activators. FPPS knockdown cells activated Vg9Vd2 T cells as measured by increased levels of CD69 and CD107a, kill of FPPS knockdown cells and induction of IFN-γ secretion. The IPP-synthesis-inhibiting drug mevastatin reduced Vg9Vd2 T cell activation by FPPS knockdown cells or aminobisphosphonate treated cells but not activation by the phosphoantigen bromohydrin pyrophosphate (BrHPP). A reduced growth of the FPPS knockdown cells has not been observed which is different to what has been reported for aminobisphosphonate treated cells. Finally, the human B-cell lymphoma RAJI has been transduced with Tetracyclin-inducible FPPS specific shRNA and proven to gain and loose the capacity to activate Vg9Vd2 TCR transductants upon doxycylin provision or removal. Another approach for the analysis of Vg9Vd2 T cell activation is Vg9Vd2 TCR transduced mouse cell lines with specificity for phosphoantigens. In contrast to the previously used Vg9Vd2 TCR transduced Jurkat cells, these cells do not present phosphoantigens, and are therefore specially suited for analysis of phosphoantigen presentation. The response of the new TCR transductants to presumed Vg9Vd2 TCR ligands/activators such as phosphoantigens, aminobisphosphonates or FPPS knockdown cells, depended strongly on the expression of a rat/mouse CD28 molecule by the transductants and its ligation by the (CD80) counter receptor on the ligand-presenting cell. The response is likely to reflect recognition of cognate Vg9Vd2 TCR antigens since mutations in the TCR-δ chain CDR2 and 3 abolished this response but activation by TCR or CD3 specific antibodies. A major difference between TCR transductants and primary gd T cells, was the lacking response of TCR transductants to Daudi or IPP. In addition their sensitivity to other soluble phosphoantigens was about 100 fold weaker than that of primary cells, stimulation of both cell type to CD80 expressing FPPS knock down or aminobisphosphonates was similar. Finally, the transductants have also been used to analyze effects of over-expression or knockdown of enzymes of isoprenoid synthesis such as 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase or HMGR), mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MVD), isopentenyl pyrophosphate isomerase (IDI), geranyl-geranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) but no clear effects have been found. In conclusion, this thesis supports the concept of Vg9Vd2 T cells being sensors of a dysregulated isoprenoid metabolism and established new tools to study ligand recognition and TCR mediated activation of this T cell population. These tools will be most useful to address following questions: 1) How does the dysregulation of isoprenoid metabolism affect tumor growth? 2) What is the correlation between the modulation of IPP levels and the Vg9Vd2 TCR binding or expression of other postulated ligands? 3) Are there any mevalonate pathway enzymes other than FPPS and HMGR, which play an important role in Vg9Vd2 T cells activation? 4) What is/are the putative phosphoantigen-presenting molecule(s)?
N2  - Die vorliegende Arbeit widmet sich den phosphoantigenspezifischen Vg9Vd2 T Zellen, die nur im Menschen und nicht-humanen Primaten zu finden ist. Diese Population stellt 1-5% der peripheren Blut T-Zellen aber ihre Frequenz kann bei Infektionen auf bis zu 50% steigen. Vg9Vd2 T Zellen können durch nicht Peptid-Moleküle aktiviert werden, die sich durch eine essentielle Phosphatkomponente auszeichnen. Hierzu gehören das Isopentenyl-pyrophosphat (IPP), ein Schlüsselmolekül der Isoprenoidsynthese aller Organismen, sowie das bezüglich seiner gd T zellaktivierenden Eigenschaften mehr als 1000fach stärkere (E)-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP), dass der direkte Vorläufer des IPP im DOXP Stoffwechselweg ist, der nur bei Eubakterien, Pflanzen und apikomplexen Bakterien zu finden ist. Direkte strukturelle Belege für die Bindung von Phosphoantigenen an den gd TCR stehen jedoch aus. Darüber hinaus besitzen Vg9Vd2 T Zellen eine direkte gegen Tumoren wie das B-Zelllymphom Daudi gerichtete Aktivität, für deren Erklärung ein „Erspüren“ eines abnormal erhöhten intrazellulären IPP Spiegels durch den Vg9Vd2 TCR oder Bindung des Vg9Vd2 TCR an Liganden, wie einer ectopisch exprimierten F1-ATPase oder des UL-16 bindenden Proteins 4 (ULBP4) herangezogen wurde. Die Vg9Vd2 T Zell Aktivierung durch Aminobisphosphonate und Alkylamine wurde hingegen auf die Inhibition des IPP verbrauchenden Enzyms Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS) zurückgeführt, obgleich Wirkungen auf andere Moleküle oder eine direkte Bindung an den TCR nicht ausgeschlossen werden konnten. Die vorgelegte Dissertationsschrift beschreibt neue Ansätze der Analyse der Mechanismen der Vg9Vd2 T Zell Aktivierung. Sie zeigt, dass eine mittels retroviraler Transduktion von shRNA erzielte Reduktion der FPPS Expression ausreicht, um hematopoietische und nicht-hematopoietische Tumorzellen zu Vg9Vd2 T Zellaktivatoren zu machen. Die FPPS knockdown zellvermittelte Aktivierung der Vg9Vd2 T Zellen zeigte sich in erhöhter Expression von CD69, CD107a, Zytotoxizität gegen FPPS knockdown Zellen und Induktion der IFNg Sekretion. Die, die IPP-Synthese inhibierende Substanz Mevastatin, reduzierte die Vg9Vd2 T Zellaktivierung durch FPPS knockdown Zellen oder Aminobisphosphonat behandelte Zellen, aber nicht die Aktivierung durch das Phosphoantigen Bromhydrin Pyrophosphat. Ein vermindertes Wachstum der FPPS knockdown Zellen wurde nicht nachgewiesen was im Gegensatz zur Literatur über Aminobisphosphonat behandelte Zellen steht. Weiterhin wurde ein Tetracyclin-induzierbares FPPS spezifische shRNA kodierendes lentivirales Konstrukt in humane B-Zelllymphom Raji Zellen transduziert, die anschließlich die durch Zugabe bzw. Entfernung von doxycyclin gesteuerte Fähigkeit erhielten, Vg9Vd2 T Zellen zu aktivieren. Ein anderer Ansatz zur Analyse der Vg9Vd2 T-zellvermittelten Aktivierung war die Entwicklung phosphoantigenspezifischer Vg9Vd2 TCR transduzierter Mauszelllinien. Diese Zellen unterscheiden sich von den bisher benutzten humanen Vg9Vd2 TCR transduzierten Jurkat Zellen dadurch, dass sie keine Phosphoantigene präsentieren, und sind daher für Analyse der Phosphoantigenpräsentation besonders geeignet. Die Antwort der neuen TCR Transduktanten auf wahrscheinliche Vg9Vd2 TCR Zellliganden bzw. Vg9Vd2 T-Zellaktivatoren wie Phosphoantigene, Aminobisphosphonate oder FPPS knockdown Zellen hing im hohen Maße von der Expression eines Ratten/Maus CD28 Moleküls auf den Transduktanten und dessen Bindung an den (CD80) Gegenrezeptor auf der antigenpräsentierenden Zelle ab. Höchstwahrscheinlich reflektiert die Antwort auf eine spezifische Antigenerkennung, da Mutationen in den CDR2 und 3 der TCRd Kette die Antwort verschwinden ließen, aber keine Effekte auf die Stimulation durch CD3 oder TCR spezifische Antikörper hatten. Ein gravierender Unterschied der TCR-Transduktanten zu primären gd T Zellen lag auch darin, dass die TCR Transduktanten weder durch Daudi Zellen noch durch IPP stimuliert wurden und ihre Empfindlichkeit gegenüber löslichen Phosphoantigenen ungefähr 1000fach geringer als bei primären Vg9Vd2 T-Zellen war, während sich die Antwort der beiden Zelltypen auf FPPS knockdown oder Aminobisphosphonate-behandelte Zellen ähnelten. Schließlich wurden die Transduktanten verwendet, um Effekte der Überexpression oder des knockdown von Enzymen der Isoprenoidsynthese wie 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reduktase or HMGR), Mevalonat-5-Pyrophosphat decarboxylase (MVD), Isopentenyl Pyrophosphat Isomerase (IDI), Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase (GGPPS) zu analysieren, wobei keine eindeutigen Effekte beobachtet wurden. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die vorgelegte Arbeit die Vorstellung von Vg9Vd2 TCR Zellen als Sensoren eines entgleisten Isoprenoidstoffwechsel unterstützt und neue Werkzeuge zur Analyse der Ligandenerkennung und TCR vermittelten Aktivierung dieser Zellpopulation vorstellt. Diese Werkzeuge sollten bei der Beantwortung folgender Fragen helfen: 1) Wie beeinflusst die Fehlregulation des Isoprenoidstoffwechesle das Tumorwachstum. 2) Welche Korrelation besteht zwischen der Modulation der IPP Spiegel und der Vg9Vd2 TCR vermittelten Aktivierung bzw. der Expression anderer vorgeschlagener Vg9Vd2 Liganden. 3) Gibt es Enzyme außer der FPPS und der HMG-CoA Reduktase, die eine wichtige Rolle bei der Vg9Vd2 T-Zellaktivierung spielen und schließlich 4) Welche(s) Molekül(e) präsentiert bzw. präsentieren Phosphoantigene ?
KW  - Primaten
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Tumorwachstum
KW  - Isoprenoide
KW  - Synthese
KW  - Vg9Vd2 T Zellaktivierung
KW  - Isoprenoidsynthese
KW  - Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS)
KW  - Aminobisphosphonat
KW  - Isopentenyl-pyrophosphat (IPP)
KW  - Vg9Vd2 T cell
KW  - Isoprenoid Synthesis
KW  - Farnesyl Pyrophosphate Synthase
KW  - Aminobisphosphonate
KW  - Isopentenyl pyrophosphate (IPP)
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46388
ER  - 
TY  - THES
A1  - Weidauer, Stella Elisabeth
T1  - Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Knochenwachstums-Modulators Sclerostin
T1  - Structural and functional characterization of the bone-modulator protein sclerostin
N2  - Die Knochenhomöostase erfolgt durch das Zusammenspiel mehrerer Zelltypen. Während die Osteoblasten für den Knochenaufbau verantwortlich sind, resorbieren die Osteoklasten Knochengewebe. Beide Vorgänge werden durch die Osteozyten streng reguliert. Eine Störung im strikt regulierten Gleichgewicht zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau kann daher zu Knochenkrankheiten wie Osteoporose führen. Auf molekularer Ebene erfolgt die Kommunikation zwischen den einzelnen Zelltypen über zwei wichtige Signalwege, den der „Bone Morphogenetic Protein“-Superfamilie (BMPs) und den der Wnt-Proteine. Die Signalübertragung wird hierbei durch sekretierte Faktoren induziert, die an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Deren Aktivierung führt zu einem intrazellulären Signal, welches letztlich die Expression von Zielgenen reguliert. Beide Signalwege werden auf mehreren Ebenen, extrazellulär, membranständig und intrazellulär reguliert. Das 2003 identifizierte Sclerostin ist ein Vertreter der extrazellulären Regulatorproteine und wurde aufgrund seiner Zugehörigkeit zur DAN-Familie zunächst fälschlicherweise als direkter Inhibitor des BMP-Signalwegs eingestuft. Mittlerweile wird allerdings davon ausgegangen, dass Sclerostin den Wnt-Signalweg negativ reguliert, indem es die Wnt Ko-Rezeptoren LRP5 und LRP6 bindet, die beide zu der Familie der „Low-density lipoprotein receptors“ gehören. Über den molekularen Inhibitionsmechanismus von Sclerostin war jedoch zum Startpunkt dieser Dissertationsarbeit wenig bekannt. Daher wurde Sclerostin im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch und biochemisch charakterisiert. Die Aufklärung mittels NMR-Spektroskopie ergab für Sclerostin eine Struktur, die sich in drei Regionen gliedert: den Cystinknoten, sowie einen „Loop“-Bereich und die Fingerregion. Vom zentralen Cystinknoten gehen drei Peptid-Schleifen in zwei entgegengesetzte Richtungen aus. Schleife eins und drei bilden eine definierte ß-Faltblattstruktur und ähneln zwei Fingern einer Hand. Die zweite Schleife, welche vom Cystinknoten isoliert in die entgegengesetzte Richtung verläuft („Loop“), ist wie die beiden langen N- und C-Termini flexibel und unstrukturiert. Die in Zusammenarbeit mit der Firma AbD-Serotec entstandenen Fab-Fragmente ermöglichten die Bestimmung des Bindeepitops der Sclerostin/LRP5-Interaktion im Bereich der unstrukturierten dritten Schleife von Sclerostin. Die Struktur von Sclerostin und die Identifikation des Bindeepitops auf Sclerostinseite geben nun erste Einblicke in den molekularen Mechanismus der Sclerostin/LRP5-Interaktion. Diese Kenntnis kann für die Entwicklung von Kleinmolekülinhibitoren mittels rationalem Drugdesign genutzt werden, welche, wie auch der in Kooperation entwickelte die Sclerostinaktivität neutralisierende Antikörper AbD09097, hochinteressante Ansätze für neuartige anabole Therapien von Krankheiten mit Knochenschwund darstellen.
N2  - Different cell types like osteoblasts, osteoclasts and osteocytes maintain bone homeostasis. While osteoblasts build up bone, osteoclasts resorb bone tissue and both actions are tightly regulated by the osteocytes. Imbalance between bone formation and resorption will lead to various bone diseases, e.g. osteoporosis. On a molecular level communication between these cell types occurs through two major signalling pathways, i.e. the bone morphogenetic proteins (BMPs) and the Wnt-factors. In both pathways signal transduction is induced by secreted factors, which bind to cell surface receptors. This activation leads to an intracellular signal that finally regulates expression of target genes. Both pathways are tightly regulated at various cellular levels, extracellular, at the membrane as well as intracellular. Sclerostin, which was identified in 2003, is a member of the extracellular modulator proteins. Initially it was wrongly classified as a direct inhibitor of the BMP-signalling pathway due to its classification as a member of the DAN-family. Meanwhile it became apparent that sclerostin targets the Wnt-pathway by binding to the Wnt co-receptors LRP5 and LRP6, which belong to the family of low-density lipoprotein receptors. At the beginning of this work very little was known about the molecular mechanism how sclerostin inhibits the Wnt-pathway. The structure analysis of sclerostin employing NMR-spectroscopy revealed in a modular architecture, which can be divided into three regions: the central, characteristic cystine knot, the loop-region and the two fingers. From the cystine knot three loops emanate in two opposite directions. Loop one and loop three form defined ß-sheet structures resembling two fingers of a hand. Loop two, which runs into the opposite direction, is unstructured and highly flexible like the long N- and C-termini. Antibody fab-fragments, which were generated in collaboration with AbD-Serotec, facilitated the mapping of the binding-epitop of sclerostin to LRP5/6, highlighting an extended area of the unstructured loop region of sclerostin as the LRP5/6 binding site. The high-resolution structure of sclerostin and the identification of the LRP5-binding-epitop yield first insights into the molecular mechanism of sclerostin-LRP5 interaction. This knowledge can now be used to develop small-molecule inhibitors by rational drug design, which are, like the sclerostin activity neutralising fab-fragment AbD09097, highly interesting targets for new bone-anabolic therapies of diseases characterised by bone loss.
KW  - Cytokine
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Wnt-Proteine
KW  - Transforming Growth Factor beta
KW  - Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
KW  - Struktur-Aktivitäts-B
KW  - LRP5/6
KW  - DAN-Modulatorproteine
KW  - Cystinknotenprotein
KW  - Knochenhomöostase
KW  - LRP5/6
KW  - DAN modulator proteins
KW  - cystin knot protein
KW  - bone homeostasis
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46224
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fischer, Matthias
T1  - Der Einfluß der Ribosomale S6 Kinase 2 (RSK2) auf das Neuriten- und Synapsenwachstum in vivo und in Zellkultur
T1  - Der Einfluß der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf das Neuriten- und Synapsenwachstum in vivo und in Zellkultur
N2  - In dieser Arbeit sollte die Funktion der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf neuronaler Ebene untersucht werden. Dahingehend gab es, z.B. auf Grund der Phänotypen von Fliegen und Mäusen mit Mutationen im entsprechenden Gen oder von Patienten mit Coffin-Lowry-Syndrom (CLS) nur Vermutungen. Es bestand letztlich die Hoffnung, einen Beitrag zur Aufklärung der Pathophysiologie des CLS zu leisten. Es stellte sich auf Grund von Experimenten sowohl in vivo als auch in vitro in verschiedenen Modellsystemen in dieser Arbeit heraus, daß RSK2 einen negativen Einfluß auf das Neuriten- und Synapsenwachstum hat. In kultivierten Motoneuronen führte der KO von RSK2 zu längeren Axonen und die Überexpression eines konstitutiv aktiven RSK2-Konstrukts zu kürzeren Axonen. In PC12-Zellen führte die Expression von konstitutiv aktiven RSK2 Konstrukten zur Verkürzung der Neuriten und die Expression eines Kinase-inaktiven RSK2 Konstrukts zu längeren Neuriten. In vivo war die neuromuskuläre Synapse bei RSK2-KO Mäusen vergrößert und hatte bei Drosophila rsk Mutanten mehr Boutons. Das RSK2-Protein ist in Motoneuronen der Maus und in überexprimierter Form in den Boutons der neuromuskulären Synapse bei Drosophila nachweisbar. Damit wurde zum ersten Mal die Funktion von RSK2 auf neuronaler Ebene beschrieben. Bezüglich des Mechanismus, wie RSK2 das Nervenwachstum beeinflußt gab es deutliche Hinweise, die dafür sprechen, daß RSK2 dies über eine in der Literatur schon häufiger beschriebene Hemmung der MAPK ERK1/2 erreicht. Für diese Hypothese spricht die Tatsache, daß die ERK-Phosphorylierung in murinen Motoneuronen und im Rückenmark embryonaler Mäuse der RSK2-Mutante erhöht ist und der Axonwachstumsdefekt durch eine Hemmung von MEK/ERK behoben werden kann. Auch ist die ERK-Phosphorylierung an der murinen Muskel-Endplatte in der Mutante erhöht. Zudem zeigen genetische Epistasis-Experimente in Drosophila, daß RSK die Bouton-Zahl über ERK/RL hemmt. RSK scheint also in Drosophila von der Funktion her der RSK2-Isoform in Wirbeltieren sehr ähnlich zu sein. Ein weiteres wichtiges Ergebnis ist die Beobachtung, daß RSK2 bei Motoneuronen keinen wesentlichen Einfluß auf das Überleben der Zellen in Gegenwart neurotropher Faktoren hat. Möglicherweise spielen hier redundante Funktionen der RSK Familienmitglieder eine Rolle. Ein bislang unerklärter Befund ist die reduzierte Frequenz spontaner Depolarisationen bzw. damit einhergehender Ca2+ Einströme bei RSK2-KO Motoneuronen in Zellkultur. Die Häufigkeit und Dichte von Ca2+-Kanälen und aktive Zonen Proteinen war in Motoneuronen nicht von der Anwesenheit des RSK2-Proteins abhängig. Im Hippocampus konnte außerdem das RSK2-Protein präsynaptisch in den Moosfaser-Boutons der CA3 Region nachgewiesen werden. Es befindet sich auch in den Pyramidenzellen, aber nicht in den Pyramidenzell-Dendriten in CA3. Bezüglich der Bedeutung dieser Befunde für die Aufklärung der Pathologie des CLS ist zu folgern, daß der neuro-psychologische Phänotyp bei CLS Patienten wahrscheinlich nicht durch reduziertes Überleben von Neuronen, sondern eher durch disinhibiertes Axonwachstum oder Synapsenwachstum bedingt ist. Dies kann grob sowohl für die peripheren als auch die zentralen Defekte gelten, denn die Synapsen im ZNS und am Muskel sind in ihrer molekularen Ausstattung z.B. im Bereich der Vesikel, der aktiven Zonen oder der Transmitterausschüttung sehr ähnlich. Weiterhin könnte eine veränderte synaptische Plastizität u.a. an der Moosfaser-Pyramidenzell-Synapse in der CA3 Region des Hippocampus eine Rolle bei den kognitiven und mnestischen Einschränkungen der Patienten spielen. Die Entdeckung, daß aktiviertes ERK bei den beobachteten Effekten eine Rolle spielt kann für die Entwicklung von Therapiestrategien eine wertvolle Erkenntnis sein.
N2  - In this thesis the function of the Ribosomal S6 Kinase 2 (RSK2) on the neuronal level should be investigated. Due to the phenotypes of flies and mice with mutations in the respective gene or of Coffin-Lowry-Syndrome (CLS) patients there existed only rough speculations. An aim was to make a contribution to the elucidaton of the pathophysiology of the CLS. In this thesis it could be shown by experiments in vivo as well as in vitro in different model systems, that RSK2 has a negative influence on neurite- and synapse growth. In cultivated motoneurons the KO of RSK2 increased the length of axons and the overexpression of a constitutive acitve RSK2-construct reduced axon length. In PC12 cells expression of constitutive active RSK2-constructs reduced neurite-length and expression of a kinase-dead RSK2-construct increased neurite-length. In vivo the size of the neuromuscular synapse of RSK2-KO mice and the bouton number at the Drosophila neuromuscular junction was increased. The RSK2-Protein could be found in mouse motoneurons and, if overexpressed, in boutons at the Drosophila neuromuscular junction. These results show for the first time, which function RSK2 has on the neuronal level. With respect to the mechanism, how RSK2 influences neurite growth, there was evidence, that RSK2 does this by inhibition of the MAPK ERK1/2. The latter has been described in literature before. Arguments for this are the findings, that ERKphosphorylation in mouse motoneurons and in embryonal spinal cord of the RSK2 mouse mutant is increased and that the axon-growth defect can be rescued by inhibition of MEK/ERK. Besides this, ERK-phosphorylation at the neuosmuscular endplate of RSK2-KO mice is increased. Moreover, genetic epistasis experiments in Drosophila show, that RSK inhibits bouton numbers via ERK/RL. So, Drosophila RSK seems to resemble, according to its function, the vertebrate RSK2-isoform. A further important result is the observation, that RSK2 has no effect on survival of motoneurons in the presence of neurotrophic factors. Possibly redundant functions of RSK family members are responsible for this. A so far unexplained finding is the reduced frequency of spontaneous depolarisations with concomitant Ca2+ Influx in cultured RSK2-KO Motoneurons. The amount and density of Ca2+ channels and active zone proteins was not dependent on the presence of the RSK2-Protein in motoneurons. In the hippocampus the RSK2-Protein could be found presynaptically in mossy-fiber boutons in the CA3 region. Moreover, it is localized in pyramidal cells, but not in the pyramidal cell dendrites in the CA3 region. With respect to the impact of these findings on the understanding of the CLS pathology, it is, according to the results of this thesis, probably not caused by reduced survival of neurons, but by disinhibited axon and synapse growth. This may account roughly for peripheral as well as central defects, because synapses in the central nervous system and at the muscle are very similar with respect to the molecular organization for example of vesicles, the active zone or transmitter release. Furthermore, a change in synaptic plasticity for example at the mossy-fiber pyramidal cell synapse in the CA3 region of the hippocampus could lead to the cognitive and mnestic deficits in CLS patients. The finding that activated ERK plays a role in the observed effects can guide the way for new therapeutic strategies.
KW  - Ribosom
KW  - Kinasen
KW  - Axon
KW  - Wachstum
KW  - RSK2
KW  - Motoneuron
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48341
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lütkenhaus, Katharina
T1  - Tumour development in Raf-driven cancer mouse models
T1  - Tumor-Entwicklung in Raf-transgenen Mausmodellen
N2  - Metastasis is the cause of death in 90% of cancer-related deaths in men. Melanoma and Non-Small-Cell Lung Cancer (NSCLC) are both tumour types with poor prognosis, lacking appropriate therapeutic possibilities, not least because of their high rate of metastasis. Thus understanding the process of metastasis might unravel therapeutic targets for developing further therapeutic strategies. The generation of a transgenic mouse model expressing B-RafV600E in melanocytes, a mutation that is found in about 60% of all melanoma, would result in an ideal tool to study melanoma progression and metastasis. In this work, a doxycycline-inducible system was constructed for expression of B-RafV600E and transgenic animals were generated, but the expression system has to be improved, since this strategy didn’t give rise to any viable, transgene carrying mice. Furthermore, since it was shown in the work of others that the metastatic behavior of tumour cell lines could be reversed by an embryonic microenvironment and the influence of a tumourigenic microenvironment on melanocytes lead to the acquisition of tumour cell-like characteristics, the question arose, whether B-Raf is as important in melanocyte development as it is in melanoma progression. In this work, the embryonal melanocyte development in B-Raf-deficient and wildtype mouse embryos was examined and there were no differences observed in the localization and number of neural crest stem cells as well as in the localization of the dopachrome-tautomerase positive melanoblasts in the embryos and in cultured neural tube explants. The expression of oncogenic C-Raf in lung epithelial cells has yielded a model for NSCLC giving rise to adenomas lacking spontaneous progression or metastasis. The co-expression of c-Myc in the same cells accelerates the tumour development and gives rise to liver and lymphnode metastases. The expression of c-Myc alone in lung epithelial cells leads to late tumour development with incomplete penetrance. A mutation screen in this work resulted in the observation that a secondary mutation in KRas or LKB1 is necessary for tumour formation in the c-Myc single transgenic animals and suggested metastasis as an early event, since the corresponding metastases of the mutation-prone primary lung tumours were negative for the observed mutations. Furthermore, in this work it was shown that the expression of chicken c-Myc in a non-metastatic NSCLC cell line leads to metastatic clones, showing that c-Myc is sufficient to induce metastasis. Additionally a panel of metastasis markers was identified, that might serve as diagnostic markers in the future.
N2  - In 90% der Todesfälle aufgrund von Krebserkrankungen sind Metastasen für den Tod des Patienten verantwortlich. Sowohl Melanom, als auch nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC) sind beides Tumortypen, die eine schlechte Prognose haben und für die sich wenige Therapiemöglichkeiten bieten, nicht zuletzt aufgrund ihrer häufigen Metastasierung. Somit würde ein besseres Verständnis des Metastasierungsprozesses neue therapeutische Angriffspunkte aufdecken und damit die Möglichkeit zur Entwicklung neuer Therapieansätze bieten. Die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, in dem B-RafV600E, eine Mutation die man in 60% der Melanompatienten findet, melanocyten-spezifisch exprimiert wird, würde ein geeignetes Werkzeug ergeben, um die Entstehung und die Metastasierung von Melanom zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Konstrukt zur Doxycyclin-abhängingen Expression von B-RafV600E erzeugt und mit diesem wurden transgene Tiere generiert. Da dieser Ansatz nicht zu lebensfähigen, das Transgen tragenden Linien führte, muss das Expressionssystem weiter verbessert werden. Da in der Arbeit von anderen gezeigt wurde, dass das metastasierende Verhalten von Tumor-Zelllinien durch eine embryonale Mikroumgebung aufgehoben werden konnte, und dass der Einfluss einer tumorähnlichen Mikroumgebung in Melanocyten zur Erlangung von Tumorzell-Charakteristika führte, kam die Frage auf, ob B-Raf eine ähnlich wichtige Rolle in der Entwicklung von Melanocyten wie in der Entstehung von Melanomen spielt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die embryonale Melanocytenentwicklung in B-Raf-defizienten sowie in wildtypischen Mausembryonen untersucht. Es konnten keine Unterschiede in der Lokalisation und Anzahl von Stammzellen des Neuralrohres und in der Lokalisation von Dopachrome-tautomerase positiven Melanoblasten in den Embryonen und in kultivierten Explantaten des Neuralrohres festgestellt werden. Die Expression von oncogenem C-Raf in Lungenepithelzellen von Mäusen ist ein Modell für NSCLC und führt zur Ausbildung von Adenomen ohne spontane Weiterentwicklung oder Metastasen. Die Koexpression von C-Raf mit c-Myc in denselben Zellen beschleunigt die Entwicklung von Tumoren und führt zu Metastasen in Leber und Lymphknoten. Die Expression von c-Myc alleine in Lungenepithelzellen führt zu einer verspäteten Entwicklung von Tumoren mit nicht vollständiger Penetranz. Ein Screening für Mutation im Rahmen dieser Arbeit führte zu der Beobachtung, dass Sekundärmutationen in KRas oder LKB1 für die Tumorentwicklung in den c-Myc transgenen Tieren notwendig sind und dass die Metastasierung ein frühes Ereignis zu seien scheint, da die zugehörigen Metastasen in Leber und Lymphknoten im Gegensatz zum Primärtumor in der Lunge keine Mutationen in diesen Genen trugen. Desweiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Expression von avianem c-Myc in einer nicht-metastasierenden NSCLC Zelllinie zu metastasierenden Klonen führte, was zeigt, dass c-Myc ausreichend ist um Metastasierung auszulösen. Zusätzlich wurde eine Reihe von Markern für Metastasen identifiziert, die in Zukunft als diagnostische Marker Verwendung finden könnten.
KW  - Raf <Biochemie>
KW  - Melanom
KW  - Metastase
KW  - Lungenkrebs
KW  - Raf
KW  - Myc
KW  - NSCLC
KW  - metastasis
KW  - Raf
KW  - Myc
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48332
ER  - 
TY  - THES
A1  - Brandes, Nicolas
T1  - Oxidative Thiol Modifications in Pro- and Eukaryotic Organisms
T1  - Oxidative Thiol Modifikationen in Pro- und Eukaryotischen Organismen
N2  - Cystein spielt eine wichtige Rolle in der Biochemie vieler Proteine. Aufgrund der Redox-Eigenschaften und der hohen Reaktivität der freien Thiol-Gruppe sowie dessen Fähigkeit Metallionen zu koordinieren, ist Cystein oft Bestandteil von katalytischen Zentren vieler Enzyme. Zudem lassen sich Cysteine durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies leicht reversibel oxidativ modifizieren. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass Proteine redox-bedingte Thiol-Modifikationen nutzen, um Veränderungen ihrer Aktivität zu steuern. Diese redox-regulierten Proteine spielen eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen. Das erste Ziel meiner Arbeit war die Identifizierung von Stickstoffmonoxid (NO)-sensitiven Proteinen in E. coli. Die redox-bedingten Funktionsänderungen solcher Proteine erklären möglicherweise die veränderte Physiologie von E. coli Zellen, die unter NO-Stress leiden. Um E. coli Proteine zu identifizieren, die unter Einwirkung von NO-Stress reversibel Thiol-modifiziert werden, wandte ich eine Kombination aus differentiellem Thiol-Trapping und 2D Gel-Elektrophorese an. Es wurden zehn Proteinen identifiziert, welche NO-sensitive Thiol-Gruppen enthalten. Genetische Studien ergaben, dass Modifikationen an AceF & IlvC mitverantwortlich sind für die NO-induzierte Wachstumshemmung. Bemerkenswert ist es, dass die Mehrheit der identifizierten Proteine speziell nur gegen reaktive Stickstoffspezies empfindlich ist, welches an einem der identifizierten Stickstoffmonoxid-sensitiven Proteinen, der kleinen Untereinheit von Glutamate synthase, getestet wurde. In vivo und in vitro Aktivitätsstudien zeigten, dass es zu einer schnellen Inaktivierung von Glutamate synthase nach NO-Behandlung kommt, das Protein aber resistent gegenüber anderen Oxidationsmittel ist. Diese Resultate implizieren, dass reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies unterschiedliche physiologische Vorgänge in Bakterien beeinflussen. Das zweite Ziel meiner Arbeit war es, redox-sensitive Proteine in S. cerevisiae zu identifizieren und deren Redox-Zustand als in vivo Read-Out zu verwenden, um die Rolle von oxidativen Stress während des Alterungsprozess eukaryotischer Zellen zu analysieren. Zunächst bestimmte ich in Hefezellen mit Hilfe von OxICAT, einer hochsensiblen quantitativen Methode, die Thiol-Trapping mit Massenspektrometrie verbindet, den exakten in vivo Thiol-Status von fast 300 Proteinen. Diese Proteine lassen sich in vier Gruppen einteilen: 1) Proteine, deren Cysteinreste resistent gegen Oxidation sind; 2) Proteine, in denen Cysteinmodifikationen strukturelle Aufgaben übernehmen; 3) Proteine mit oxidationsempfindlichen Cysteinen, die bereits eine gewisse Oxidation in exponentiell wachsenden Hefezellen aufweisen; 4) Proteine, die reduziert sind, aber redox-sensitive Cysteinreste enthalten, die die Funktion der Proteine bei Vorhandensein von oxidativen Stress beeinflussen. Die Sensitivität dieser Proteine gegenüber oxidativen Stress wurde durch Exposition subletaler Konzentrationen von H2O2 oder Superoxid auf Hefezellen nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass die wichtigsten zellulären Angriffspunkte von H2O2- und Superoxid-bedingtem Stress Proteine sind, die an Vorgängen der Translation, Glykolyse, des Citratzyklus und der Aminosäure-Biosynthese beteiligt sind. Diese Zielproteine zeigen, dass Zellen für die Bekämpfung von oxidativen Stress Metabolite schnell in Richtung des Pentosephosphatweges umleiten, um die Produktion des Reduktionsmittels NADPH sicherzustellen. Die hier präsentierten Ergebnisse belegen, dass die quantitative Bestimmung des Oxidationsstatus von Proteinen eine wertvolle Methode ist, um redox-sensitive Cysteinreste zu identifizieren. Die OxICAT Technologie wurde dann verwendet, um das genaue Ausmaß und die Entstehung von oxidativen Stress in chronologisch alternden S. cerevisiae Zellen zu bestimmen. Für diese Bestimmung wurde der Oxidationsstatus von Proteinen in alternden Hefezellen als physiologischer Read-Out verwendet. Ich zeigte, dass die zelluläre Redox-Homöostase in chronologisch alternden Hefezellen global zusammenbricht, wobei es sich dabei um einen Prozess handelt, der dem Zelltod vorausgeht. Der Beginn dieses Zusammenbruchs scheint mit der Lebensdauer der Hefezellen zu korrelieren, da Kalorienrestriktion die Lebensdauer der Hefezellen erhöht und den Zusammenbruch des Redox-Gleichgewichts verzögert. Die Oxidation einer kleinen Anzahl an Proteinen (z.B. Thioredoxin reductase) geht dem Redox-Zusammenbruch deutlich voraus, was maßgeblich zum Verlust der Redox-Homöostase beitragen könnte. Diese Studien an alternden Hefezellen erweitern unser Verständnis, wie sich Veränderungen in der Redox-Homöostase auf die Lebensdauer von Hefezellen auswirken. Zudem bestätigen die hier präsentierten Ergebnisse die Bedeutung von oxidativen Thiol-Modifikationen als eine der wichtigsten posttranslationalen Proteinmodifikationen in pro-und eukaryotischen Organismen
N2  - Cysteines play important roles in the biochemistry of many proteins. The high reactivity, redox properties, and ability of the free thiol group to coordinate metal ions designate cysteines as the amino acids of choice to form key catalytic components of many enzymes. Also, cysteines readily react with reactive oxygen and nitrogen species to form reversible oxidative thiol modifications. Over the last few years, an increasing number of proteins have been identified that use redox-mediated thiol modifications to modulate their function, activity, or localization. These redox-regulated proteins are central players in numerous important cellular processes. First aim of this study was to discover nitric oxide (NO) sensitive proteins in E. coli, whose redox-mediated functional changes might explain the physiological alterations observed in E. coli cells suffering from NO-stress. To identify E. coli proteins that undergo reversible thiol modifications upon NO-treatment in vivo, I applied a differential thiol trapping technique combined with two-dimensional gel analysis. 10 proteins were found to contain thiol groups sensitive to NO-treatment. Subsequent genetic studies revealed that the oxidative modifications of AceF & IlvC are, in part, responsible for the observed NO-induced growth inhibition. Noteworthy, the majority of identified protein targets turned out to be specifically sensitive towards reactive nitrogen species. This oxidant specificity was tested on one NO-sensitive protein, the small subunit of glutamate synthase. In vivo and in vitro activity studies demonstrated that glutamate synthase rapidly inactivates upon nitric oxide treatment but is resistant towards other oxidative stressors. These results imply that reactive oxygen and nitrogen species affect distinct physiological processes in bacteria. The second aim of my study was to identify redox-sensitive proteins in S. cerevisiae and to use their redox state as in vivo read-out to assess the role of oxidative stress during the eukaryotic aging process. I first determined the precise in vivo thiol status of almost 300 yeast proteins located in the cytosol and sub-cellular compartments of yeast cells using a highly quantitative mass spectrometry based thiol trapping technique, called OxICAT. The identified proteins can be clustered in four groups: 1) proteins, whose cysteine residues are oxidation resistant; 2) proteins with structurally or functionally important cysteine modifications 3) proteins with highly oxidation-sensitive active site cysteines, which are partially oxidized in exponentially growing yeast cells due to their exquisite sensitivity towards low amounts of ROS; 4) proteins that are reduced in exponentially growing cells but harbor redox-sensitive cysteine(s) that affect the catalytic function of the protein during oxidative stress. These oxidative stress sensitive proteins were identified by exposure of yeast cells to sublethal concentrations of H2O2 or superoxide. It was shown that the major targets of peroxide- and superoxide-mediated stress in the cell are proteins involved in translation, glycolysis, TCA cycle and amino acid biosynthesis. These targets indicate that cells rapidly redirect the metabolic flux and energy towards the pentose phosphate pathway in an attempt to ensure the production of the reducing equivalent NADPH to counterattack oxidative stress. These results reveal that the quantitative assessment of a protein’s oxidation state is a valuable tool to identify catalytically active and redox-sensitive cysteine residues. The OxICAT technology was then used to precisely determine extent and onset of oxidative stress in chronologically aging S. cerevisiae cells by utilizing the redox status of proteins as physiological read-out. I found that chronological aging yeast cells undergo a global collapse of the cellular redox homeostasis, which precedes cell death. The onset of this collapse appears to correlate with the yeast life span, as caloric restriction increases the life span and delays the redox collapse. These results suggest that maintenance of the redox balance might contribute to the life expanding benefits of regulating the caloric intake of yeast. Clustering analysis of all oxidatively modified proteins in chronological aging yeast revealed a subset of proteins whose oxidative thiol modifications significantly precede the general redox collapse. Oxidation of these early target proteins, which most likely results in a loss of their activity, might contribute to or even cause the observed loss of redox homeostasis (i.e., thioredoxin reductase) in chronologically aging yeast. These studies in aging yeast expand our understanding how changes in redox homeostasis affect the life span of yeast cells and confirm the importance of oxidative thiol modifications as key posttranslational modifications in pro- and eukaryotic organisms.
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Cystein
KW  - Saccharomyces cerevisiae
KW  - Escherichia coli
KW  - Wasserstoffperoxid
KW  - Hyperoxide
KW  - Sauerstoffradikal
KW  - Thiolgruppe
KW  - Altern
KW  - Oxidation
KW  - Biologische Oxidation
KW  - Oxidative Thiol Modifikationen
KW  - Reaktive Sauerstoffspezies
KW  - Chronologisches Altern
KW  - Reversibel
KW  - Posttranslational
KW  - oxidative thiol modification
KW  - chronological aging
KW  - reactive oxygen species
KW  - Saccharomyces cerevisiae
KW  - thioredoxin reductase
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46542
ER  -