TY  - JOUR
A1  - Schmidt, Stefanie
A1  - Denk, Sarah
A1  - Wiegering, Armin
T1  - Targeting protein synthesis in colorectal cancer
JF  - Cancers
N2  - Under physiological conditions, protein synthesis controls cell growth and survival and is strictly regulated. Deregulation of protein synthesis is a frequent event in cancer. The majority of mutations found in colorectal cancer (CRC), including alterations in the WNT pathway as well as activation of RAS/MAPK and PI3K/AKT and, subsequently, mTOR signaling, lead to deregulation of the translational machinery. Besides mutations in upstream signaling pathways, deregulation of global protein synthesis occurs through additional mechanisms including altered expression or activity of initiation and elongation factors (e.g., eIF4F, eIF2α/eIF2B, eEF2) as well as upregulation of components involved in ribosome biogenesis and factors that control the adaptation of translation in response to stress (e.g., GCN2). Therefore, influencing mechanisms that control mRNA translation may open a therapeutic window for CRC. Over the last decade, several potential therapeutic strategies targeting these alterations have been investigated and have shown promising results in cell lines, intestinal organoids, and mouse models. Despite these encouraging in vitro results, patients have not clinically benefited from those advances so far. In this review, we outline the mechanisms that lead to deregulated mRNA translation in CRC and highlight recent progress that has been made in developing therapeutic strategies that target these mechanisms for tumor therapy.
KW  - colorectal cancer
KW  - protein synthesis
KW  - translation initiation
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206014
SN  - 2072-6694
VL  - 12
IS  - 5
ER  - 
TY  - THES
A1  - Steinmetzger, Christian
T1  - Fluorogenic Aptamers and Fluorescent Nucleoside Analogs as Probes for RNA Structure and Function
T1  - Fluorogene Aptamere und Fluoreszierende Nukleosid-Analoga als Sonden für RNA-Struktur und -Funktion
N2  - RNA plays a key role in numerous cellular processes beyond the central dogma of molecular biology. Observing and understanding this wealth of functions, discovering new ones and engineering them into purpose-built tools requires a sensitive means of observation. Over the past decade, fluorogenic aptamers have emerged to fill this niche. These short oligonucleotides are generated by in vitro selection to specifically interact with small organic fluorophores and can be utilized as genetically encoded tags for RNAs of interest.
The most versatile class of fluorogenic aptamers is based on derivatives of hydroxybenzylidene imidazolone (HBI), a conditional fluorophore mimicking the chromophore structure found in green and red fluorescent proteins. The respective aptamers are well-known by the “vegetable” nomenclature, including Spinach, Broccoli and Corn, and have found numerous applications for studying RNA function in vitro and in cells.
Their success, however, is somewhat overshadowed by individual shortcomings such as a propensity for misfolding, dependence on unphysiologically high concentrations of magnesium ions or, in the case of Corn, dimerization that might affect the function of the tagged RNA. Moreover, most fluorogenic aptamers exhibit limited ligand promiscuity by design, thereby restricting their potential for spectral tuning to a narrow window of wavelengths.
This thesis details the characterization of a new fluorogenic aptamer system nicknamed Chili. Chili is derived from an aptamer that was originally selected to bind 4-hydroxy-3,5-dimethoxy¬hydroxy-benzylidene imidazolone (DMHBI), resulting in a green fluorescent complex. Unlike other aptamers of its kind, Chili engages in a proton transfer cycle with the bound ligand, resulting in a remarkably large Stokes shift of more than 130 nm.
By means of an empirical ligand optimization approach, several new DMHBI derivatives were found that bind to Chili with high affinity, furnishing complexes up to 7.5 times brighter compared to the parent ligand. In addition, Chili binds to π-extended DMHBI derivatives that confer fluorescence in the yellow–red region of the visible spectrum. The highest affinity and degree of fluorescence turn-on for both green and red fluorogenic ligands were achieved by the incorporation of a unique, positively charged substituent into the HBI scaffold.
Supplemented by NMR spectroscopy, kinetic and thermodynamic studies showed that the binding site of Chili is loosely preorganized in the absence of ligand and likely forms a G-quadruplex upon ligand binding.
To showcase future applications, Chili was incorporated into a FRET sensor for monitoring the cleavage of an RNA substrate by a 10-23 DNAzyme.
Besides aptamers as macromolecular fluorescent complexes, fluorescent nucleobase analogs are powerful small isomorphic components of RNA suitable for studying structure and folding. Here, the highly emissive nucleobase analog 4-cyanoindole (4CI) was developed into a ribonucleoside (r4CI) for this purpose. A new phosphoramidite building block was synthesized to enable site-specific incorporation of 4CI into RNA.
Thermal denaturation experiments confirmed that 4CI behaves as a universal nucleobase, i.e. without bias towards any particular hybridization partner. Photophysical characterization established r4CI as a generally useful fluorescent ribonucleoside analog. In this work, it was employed to gain further insight into the structure of the Chili aptamer. Using several 4CI-modified Chili–HBI complexes, a novel base–ligand FRET assay was established to obtain a set of combined distance and orientation restraints for the tertiary structure of the aptamer.
In addition to their utility for interrogating structure and binding, supramolecular FRET pairs comprising a fluorescent nucleobase analog donor and an innately fluorogenic acceptor hold great promise for the construction of color-switchable RNA aptamer sensor devices.
N2  - Weit über das zentrale Dogma der Molekularbiologie hinaus ist RNA an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt. Um diese Prozesse aufzuklären, sie umfassend zu verstehen und sich zunutze zu machen bedarf es geeigneter Detektionsmethoden für RNA. Innerhalb des letzten Jahrzehnts wurden fluorogene Aptamere als ideales Werkzeug für diesen Zweck erkannt. Dabei handelt es sich um vergleichsweise kurze Oligonukleotide, die mittels in vitro-Selektion zur spezifischen Bindung bestimmter organischer Fluorophore erzeugt werden. Analog zu fluoreszierenden Proteinen können sie zur Fluoreszenzmarkierung von RNA eingesetzt werden.
Die wichtigste Klasse fluorogener Aptamere bindet und aktiviert Derivate des latenten Fluorophors 4-Hydroxybenzylidenimidazolon (HBI), welcher ursprünglich im Kern fluoreszierender Proteine autokatalytisch aus einem Tripeptid-Fragment entsteht und deren spektrale Eigenschaften bestimmt. Vertreter dieser Klasse, namentlich Spinach, Broccoli und Corn, haben sich als alltägliches Werkzeug zur Fluoreszenzmarkierung von RNA etabliert.
Diesem Erfolg gegenüber stehen Unzulänglichkeiten, die das Potential einzelner Aptamere begrenzen. Beispielsweise kann es zur Ausbildung inaktiver Faltungszustände der RNA kommen oder die Fluoreszenzaktivierung erfordert eine hohe Magnesiumkonzentration, welche in Zellen nicht frei verfügbar ist. Im Fall des Corn-Aptamers bildet sich ein Homodimer, was unter Umständen die zu untersuchende RNA beeinträchtigen kann. Darüber hinaus ist, aufgrund der spezifischen Fluorophorbindung, jeweils nur geringes Potenzial zur gezielten Beeinflussung spektraler Eigenschaften vorhanden.
Kern dieser Arbeit ist die umfassende Charakterisierung des neuen Chili-Systems. Chili ist die optimierte Version eines Aptamers, welches einen grün fluoreszierenden Komplex mit 4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzylidenimidazolon (DMHBI) ausbildet. Im Gegensatz zu anderen HBI-bindenden Aptameren vollzieht Chili einen Protonenaustausch mit seinem Liganden, woraus Fluoreszenz-emission mit einer ungewöhnlich hohen Stokes-Verschiebung von über 130 nm resultiert.
Die Struktur des ursprünglichen Liganden wurde im Hinblick auf höhere Affinität und stärkere Fluoreszenzemission optimiert, wobei ein bis zu 7.5-facher Gewinn an Helligkeit erzielt wurde. Als besonders vorteilhaft hat sich dafür die Einführung eines positiv geladenen Substituenten herausgestellt, der in dieser Form ein Alleinstellungsmerkmal von Chili ist. Auch stark modifizierte DMHBI-Derivate, die ein größeres konjugiertes System besitzen, werden von Chili gebunden und fluoreszieren daraufhin im gelben bis roten Bereich des sichtbaren Spektrums.
Studien zur Ligandenbindungskinetik und thermischen Denaturierung des Aptamers legen nahe, dass die zunächst strukturarme Bindungstasche durch die Aufnahme des Liganden einen G-Quadruplex ausbildet, was ebenfalls durch NMR-spektroskopische Daten bestätigt wird.
Als Beispiel für mögliche Anwendungen wurde das Chili-Aptamer eingesetzt, um die Spaltung eines RNA-Substrats durch ein 10-23 DNA-Enzym zu beobachten, wobei FRET zwischen dem Aptamer und einem Fluoreszenzmarker am Substrat als Reporter ausgenutzt wurde.
Neben makromolekularen Aptamer-Komplexen können fluoreszierende Nukleobasenanaloga als isomorphe Einheiten in RNA integriert werden, um deren Faltungszustand zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde das fluoreszierende Nukleobasenanalogon 4-Cyanodinol (4CI) in das entsprechende Ribonukleosid (r4CI) umgewandelt und daraus ein neuer Phosphoramiditbaustein zum Einbau des fluoreszierenden von 4CI in RNA synthetisiert.
Anhand thermischer Denaturierungs¬experimente wurde gezeigt, dass es sich bei 4CI um eine universelle Base handelt, die ungeachtet des Hybridisierungskontexts toleriert wird. Die photophysikalische Charakterisierung von r4CI zeigte, dass das fluoreszierendes Ribonukleosid-Analogon seine nützlichen Eigenschaften nach dem Einbau in Oligonukleotide beibehält, sodass es zur Strukturanalyse des Chili-Aptamers verwendet werden konnte. Mithilfe 4CI-modifizierter Chili–HBI-Komplexe wurden erstmals intramolekulare FRET-Paare dieser Art erzeugt und zur Bestimmung kombinierter Abstands- und Orientierungsparameter genutzt.
Über ihre Verwendung für Struktur- und Bindungsstudien hinaus stellen supramolekulare FRET-Paare aus fluoreszierenden Nukleobasen-Analoga als Donoren und intrinsisch fluorogenen Akzeptoren eine Möglichkeit dar, neue schaltbare Aptamer-basierte Sensoren zu entwickeln, welche auf die Erkennung ihrer Zielspezies mit einem Wechsel der Fluoreszenzemissionswellenlänge reagieren.
KW  - Aptamer
KW  - Nucleosidanaloga
KW  - RNS
KW  - Fluoreszenz
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - RNA
KW  - FRET
KW  - Nucleoside
KW  - Nucleinsäuren
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207604
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kauk, Michael
T1  - Investigating the Molecular Mechanism of Receptor Activation at Muscarinic Receptors by Means of Pathway-Specific Dualsteric Ligands and Partial Agonists
T1  - Molekulare Grundlagen der Rezeptoraktivierung von muskarinergen Acetylcholin Rezeptoren durch dualstere Liganden und Partialagonisten
N2  - G protein-coupled receptors (GPCRs) form the biggest receptor family that is encoded in the human genome and represent the most druggable target structure for modern therapeutics respectively future drug development. Belonging to aminergic class A GPCRs muscarinic Acetylcholine receptors (mAChRs) are already now of clinical relevance and are also seen as promising future drug targets for treating neurodegenerative diseases like Alzheimer or Parkinson. The mAChR family consist of five subtypes showing high sequence identity for the endogenous ligand binding region and thus it is challenging until now to selectively activate a single receptor subtype. A well accepted method to study ligand binding, dynamic receptor activation and downstream signaling is the fluorescence resonance energy transfer (FRET) application. Here, there relative distance between two fluorophores in close proximity (<10 nm) can be monitored in a dynamic manner. The perquisite for that is the spectral overlap of the emission spectrum of the first fluorophore with the excitation spectrum of the second fluorophore. By inserting two fluorophores into the molecular receptor structure receptor FRET sensors can serve as a powerful tool to study dynamic receptor pharmacology.
Dualsteric Ligands consist of two different pharmacophoric entities and are regarded as a promising ligand design for future drug development. The orthosteric part interacts with high affinity with the endogenous ligand binding region whereas the allosteric part binds to a different receptor region mostly located in the extracellular vestibule. Both moieties are covalently linked. Dualsteric ligands exhibit a dynamic ligand binding. The dualsteric binding position is characterized by a simultaneous binding of the orthosteric and allosteric moiety to the receptor and thus by receptor activation. In the purely allosteric binding position no receptor activation can be monitored.
In the present work the first receptor FRET sensor for the muscarinic subtype 1 (M1) was generated and characterized. The M1-I3N-CFP sensor showed an unaltered physiological behavior as well as ligand and concentration dependent responses. The sensor was used to characterize different sets of dualsteric ligands concerning their pharmacological properties like receptor activation. It was shown that the hybrids consisting of the synthetic full agonist iperoxo and the positive allosteric modulator of BQCA type is very promising. Furthermore, it was shown for orthosteric as well as dualsteric ligands that the degree of receptor activation is highly dependent on the length of and the chemical properties of the linker moiety. For dualsteric ligands a bell-shaped activation characteristic was reported for the first time, suggesting that there is an optimal linker length for dualsteric ligands. The gained knowledge about hybrid design was then used to generate and characterize the first photo-switchable dualsteric ligand. The resulting hybrids were characterized with the M1-I3N-CFP sensor and were described as photo-inactivatable and dimmable. In addition to the ligand characterization the ligand application methodology was further developed and improved. Thus, a fragment-based screening approach for dualsteric ligands was reported in this study for the first time. With this approach it is possible to investigate dualsteric ligands in greater detail by applying either single ligand fragments alone or in a mixture of building blocks. These studies revealed the insights that the effect of dualsteric ligands on a GPCR can be rebuild by applying the single building blocks simultaneously. The fragment-based screening provides high potential for the molecular understanding of dualsteric ligands and for future screening approaches. Next, a further development of the standard procedure for measuring FRET by sensitized emission was performed. Under normal conditions single cell FRET is measured on glass coverslips. After coating the coverslips surface with a 20 nm thick gold layer an increased FRET efficiency up to 60 % could be reported. This finding was validated in different approaches und in different configurations. This FRET enhancement by plasmonic surfaces was until yet unreported in the literature for physiological systems and make FRET for future projects even more powerful.
N2  - G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Proteinfamilie, die im humanen Genom verschlüsselt ist. Sie sind nicht nur die Zielstruktur für eine Vielzahl von derzeit gebräuchlichen Medikamenten, sondern gehören auch zu den vielversprechendsten Therapieansätzen für die moderne Medikamentenentwicklung. Muskarinerge Acetylcholin Rezeptoren (mAChRs) gehören zu den aminergen Klasse A GPCRs und sind bereits heute von klinischer Relevanz. Die muskarinerge Rezeptorfamilie wird von fünf Subtypen gebildet, die sich besonders durch eine hohe Sequenzidentität in der endogenen Ligandenbindestelle (orthostere Bindestelle) auszeichnen. Aus diesem Grund ist es mit den herkömmlich verwendeten Medikamenten nicht möglich, einen ganz bestimmten Subtyp zu therapieren, ohne auch andere Subtypen zu beeinflussen und so unerwünschte Nebenwirkungen zu erhalten. Eine Möglichkeit Ligandenbindung, dynamische Rezeptoraktivierung oder Signalweiterleitung von GPCRs nach pharmakologischen Gesichtspunkten zu charakterisieren, stellt der Floreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) dar. Mit Hilfe dieser Methode kann über kleine Entfernungen (<10 nm) die relative Orientierung von zwei Fluorophoren mit überlappenden Spektralbereichen mit hoher zeitlicher Auflösung verfolgt werden. Integriert man das Fluorophorpaar mit Hilfe gentechnischer Methoden in die Molekülstruktur des Rezeptors, kann man dessen Konformationsänderung bzw. Aktivierung infolge einer Ligandenbindung aufzeichnen.
Dualstere Liganden sind eine Substanzklasse von hohem zukünftigen klinischen Potential und zeichnen sich durch die Verknüpfung mehrerer pharmakologisch aktiver Untereinheiten aus. Der orthostere Molekülteil interagiert mit der endogenen Ligandenbindestelle und der allostere Molekülteil interagiert mit einem zweiten Rezeptorabschnitt, der häufig in den extrazellulären Schlaufen des Rezeptors zu finden ist. Diese allosteren Bindestellen zeichnet sich durch eine vergleichsweise geringe Sequenzidentität aus, weswegen allostere Modulatoren auch selektiv an Subtypen binden können. Aufgrund des Aufbaus können dualstere Liganden auf vielfältige Weise mit dem Rezeptor interagieren und dieser Bindemechanismus wurde als dynamische Ligandenbindung beschrieben. Zum einen können beide Molekülteile gleichzeitig mit dem Rezeptor interagieren und ihn aktivieren (dualsterer Bindemodus) und zum anderen findet man einen rein allosteren Bindemodus, der den Rezeptor nicht aktiviert. Der orthostere Molekülteil ist vor allem für die Rezeptoraktivierung zuständig, die sich durch eine hohe Affinität auszeichnet und der allostere Molekülteil kann selektive Rezeptorinteraktionen vermitteln. Da dualstere Moleküle immer Eigenschaften beider Untereinheiten besitzen, werden dualstere Liganden als sehr vielversprechend erachtet, zukünftig subtypselektive Medikamente darzustellen.
In dieser Arbeit wurde der erste Rezeptor FRET Sensor für den muskarinergen Subtyp 1 (M1) beschrieben und es konnte gezeigt werden, dass sich dieser Rezeptorsensor in seiner physiologischen Funktion nicht von dem wild Typ unterscheidet. Des Weiteren können mit Hilfe dieses Sensors liganden- und konzentrationsabhängige Rezeptorantworten aufgezeichnet werden. Der M1-I3N-CFP wurde dazu genutzt verschiedene Reihen dualsterer Liganden zu charakterisieren und auf ihre aktivierenden Eigenschaften bezüglich des M1 zu testen. Es wurde gezeigt, dass die Kombination aus dem synthetischen und hochpotenten Agonisten Iperoxo als Orthoster und dem in der Literatur als M1 selektiven positiven allosteren Modulator beschriebenen BQCA als Alloster sehr vielversprechend ist. Es konnte gezeigt werden, dass die rezeptoraktivierenden Eigenschaften sowohl von orthosteren wie auch von dualsteren Liganden stark von der Linkerlänge abhängig sind. Für dualstere Liganden konnte so ein glockenförmiger Zusammenhang zwischen Linkerlänge und Rezeptoraktivierung herausgearbeitet werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass bestimmte Hybride, die den M1 aktivieren, an anderen Subtypen keine Effekte hervorrufen und somit als subtypselektiv beschrieben werden können. Im Anschluss wurde mit Hilfe des gewonnenen Wissens über Iperoxo/BQCA Hybride, das Moleküldesign der dualsteren Liganden weiterentwickelt. So wurden in dieser Arbeit die ersten photo-schaltbaren bzw. photo-dimmbaren dualsteren Liganden beschrieben und charakterisiert. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die herkömmliche Charakterisierung von dualsteren Liganden weiterentwickelt. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass es möglich ist, die Aktivierung eines Rezeptors durch einen dualsteren Liganden nachzustellen, indem die einzelnen Fragmente des ursprünglichen Liganden gleichzeitig appliziert werden. Diese auf Fragmenten basierende Charakterisierung ist die erste Anwendung dieser Art und birgt großes Potential für die zukünftige Suche nach neuen Wirkstoffen. Neben der Untersuchung von pharmakologischen Schwerpunkten wurde auch die Weiterentwicklung der Rezeptor FRET Methodik beschrieben. Die herkömmliche Anwendung der Rezeptor FRET Sensoren geschieht auf Objektträgern aus Quarzglas. In dieser Arbeit wurde diese Anwendung dahingehend weiterentwickelt, dass die Objektträger mit einer 20 nm dicken Goldschicht beschichtet wurden, um den Einfluss von Plasmonoberflächen auf physiologisch relevante FRET Messungen zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der Goldbeschichtung und in Abhängigkeit des Versuchsaufbaus die Energietransfereffizienz um bis zu 60 % gesteigert werden konnte. Diese Entdeckung zeigt Potential zukünftig die FRET-Reichweite zu erhöhen und so bisher nicht charakterisierbare Sachverhalte aufklären zu können.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Muscarinrezeptor
KW  - Dualsteric Ligands
KW  - Partial Agonists
KW  - Dualstere Liganden
KW  - Partialagonismus
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173729
N1  - Online-Version enthält nicht den Appendix (Volltexte der Originalveröffentlichungen der Zeitschriftenaufsätze)
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rydzek, Julian
T1  - NF-κB/NFAT Reporter Cell Platform for Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Library Screening
T1  - NF-κB/NFAT-Reporterzellplattform für das Screening von Chimären Antigenrezeptor (CAR)-Bibliotheken
N2  - Immunotherapy with engineered T cells expressing a tumor-specific chimeric antigen receptor (CAR) is under intense preclinical and clinical investigation. This involves a rapidly increasing portfolio of novel target antigens and CAR designs that need to be tested in time- and work-intensive screening campaigns in primary T cells. Therefore, we anticipated that a standardized screening platform, similar as in pharmaceutical small molecule and antibody discovery, would facilitate the analysis of CARs by pre-selecting lead candidates from a large pool of constructs that differ in their extracellular and intracellular modules. Because CARs integrate structural elements of the T cell receptor (TCR) complex and engage TCR-associated signaling molecules upon stimulation, we reasoned that the transcription factors nuclear factor-κB (NF-κB) and nuclear factor of activated T cells (NFAT) could serve as surrogate markers for primary T cell function. The nuclear translocation of both transcription factors in primary T cells, which we observed following CAR stimulation, supported our rationale to use NF-κB and NFAT as indicators of CAR-mediated activation in a screening platform.
To enable standardized and convenient analyses, we have established a CAR-screening platform based on the human T cell lymphoma line Jurkat that has been modified to provide rapid detection of NF-κB and NFAT activation. For this purpose, Jurkat cells contained NF-κB  and NFAT-inducible reporter genes that generate a duplex output of cyan fluorescent protein (CFP) and green fluorescent protein (GFP), respectively. Upon stimulation of NF-κB/NFAT reporter cells, the expression of both fluorophores could be readily quantified in high-throughput screening campaigns by flow cytometry.
We modified the reporter cells with CD19-specific and ROR1-specific CARs, and we co-cultured them with antigen-positive stimulator cells to analyze NF-κB and NFAT activation. CAR-induced reporter signals could already be detected after 6 hours. The optimal readout window with high-level reporter activation was set to 24 hours, allowing the CAR-screening platform to deliver results in a rapid turnaround time. A reporter cell-screening campaign of a spacer library with CARs comprising a short, intermediate or long IgG4-Fc domain allowed distinguishing functional from non-functional constructs. Similarly, reporter cell-based analyses identified a ROR1-CAR with 4-1BB domain from a library with different intracellular signal modules due to its ability to confer high NF-κB activation, consistent with data from in vitro and in vivo studies with primary T cells. The results of both CAR screening campaigns were highly reproducible, and the time required for completing each testing campaign was substantially shorter with reporter cells (6 days) compared to primary T cells (21 days). We further challenged the reporter cells in a large-scale screening campaign with a ROR1 CAR library comprising mutations in the VH CDR3 sequence of the R11 scFv. This region is crucial for binding the R11 epitope of ROR1, and we anticipated that mutations here would cause a loss of specificity and affinity for most of the CAR variants. This provided the opportunity to determine whether the CAR screening platform was able to retrieve functional constructs from a large pool of CAR variants. Indeed, using a customized pre enrichment and screening strategy, the reporter cells identified a functional CAR variant that was present with a frequency of only 6 in 1.05x10^6.
As our CAR-screening platform enabled the analysis of activating signal modules, it encouraged us to also evaluate inhibitory signal modules that change the CAR mode of action. Such an inhibitory CAR (iCAR) can be used in logic gates with an activating CAR to interfere with T cell stimulation. By selecting appropriate target antigens for iCAR and CAR, this novel application aims to improve the selectivity towards tumor cells, and it could readily be studied using our screening platform. Accordingly, we tested CD19-specific iCARs with inhibitory PD-1 signal module for their suppressive effect on reporter gene activation. In logic gates with CAR or TCR stimulation, a decrease of NF-κB and NFAT signals was only observed when activating and inhibitory receptors were forced into spatial proximity. These results were further verified by experiments with primary T cells.
In conclusion, our reporter cell system is attractive as a platform technology because it is independent of testing in primary T cells, exportable between laboratories, and scalable to enable small- to large-scale screening campaigns of CAR libraries. The pre-selection of appropriate lead candidates with optimal extracellular and intracellular modules can reduce the number of CAR constructs to be investigated in further in vitro and in vivo studies with primary T cells. We are therefore confident that our CAR-screening platform based on NF-κB/NFAT reporter cells will be useful to accelerate translational research by facilitating the evaluation of CARs with novel design parameters.
N2  - Die Immuntherapie mit modifizierten T-Zellen, die einen tumorspezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, wird präklinisch und klinisch intensiv erforscht. Dies beinhaltet ein rasant anwachsendes Portfolio an neuartigen Zielantigenen und CAR-Designs, die in zeit- und arbeitsintensiven Screenings in primären T-Zellen untersucht werden müssen. Daher haben wir angenommen, dass eine standardisierte Screening-Plattform, ähnlich wie in der pharmazeutischen Kleinmolekül- und Antikörperforschung, die Analyse von CARs erleichtern würde. Die Plattform könnte funktionelle Kandidaten aus einer großen Anzahl von CAR Konstrukten, die sich durch ihre extrazellulären und intrazellulären Module unterscheiden, herausfiltern. Da CARs strukturelle Elemente des T-Zell-Rezeptor Komplexes enthalten und T-Zell-Rezeptor-assoziierte Signalmoleküle nach Stimulation aktivieren, sind wir zu der Annahme gelangt, dass die Transkriptionsfaktoren Nukleärer Faktor κB (NF-κB) und Nukleärer Faktor aktivierter T-Zellen (NFAT) als Surrogatmarker für primäre T Zellfunktionen dienen könnten. Die nukleäre Translokation beider Transkriptionsfaktoren in primären T-Zellen, die wir nach der CAR-Stimulation beobachten konnten, unterstützte unsere Überlegung NF-κB und NFAT als Indikatoren für die CAR-vermittelte Aktivierung in einer Screening-Plattform zu verwenden.
Um standardisierte und benutzerfreundliche Analysen zu ermöglichen, haben wir eine CAR Screening-Plattform basierend auf der humanen T-Zell-Lymphomlinie Jurkat etabliert, die modifiziert wurde, um einen schnellen Nachweis der Aktivierung von NF-κB und NFAT zu gewährleisten. Hierfür enthielten die Jurkat-Zellen NF-κB- und NFAT-induzierbare Reportergene, die mittels dem blauen Fluorophor CFP und dem grünen Fluorophor GFP eine Doppeldetektion erlauben. Bei Stimulation der NF-κB/NFAT-Reporterzellen konnte die Expression beider Fluorophore in Hochdurchsatz-Screenings mithilfe der Durchflusszytometrie schnell quantifiziert werden.
Die Reporterzellen wurden mit CD19-spezifischen und ROR1-spezifischen CARs modifiziert und anschließend mit antigenpositiven Stimulatorzellen kokultiviert, um die Aktivierung von NF-κB und NFAT zu analysieren. CAR-induzierte Reportersignale konnten bereits nach 6 Stunden detektiert werden. Das optimale Zeitfenster zur Auslesung hoher Reporteraktivierung wurde auf 24 Stunden festgelegt, so dass die CAR-Screening-Plattform in kurzer Zeit Ergebnisse liefern kann. Ein Reporterzell-Screening mit einer Spacer-Bibliothek aus CARs, die eine kurze, mittlere oder lange IgG4-Fc-Domäne enthielten, ermöglichte die Unterscheidung zwischen funktionellen und nicht-funktionellen Konstrukten. Ebenso konnten reporterzellgestützte Analysen einen ROR1-CAR mit 4-1BB Domäne aus einer Bibliothek mit verschiedenen intrazellulären Signalmodulen aufgrund seiner hohen NF-κB Aktivierung identifizieren, was im Einklang mit Daten aus in vitro- und in vivo-Studien mit primären T Zellen steht. Die Ergebnisse beider CAR-Screenings waren höchst reproduzierbar und die Zeit, welche für die Durchführung jeder Testung benötigt wurde, war mit Reporterzellen (6 Tage) wesentlich kürzer als mit primären T-Zellen (21 Tage). Des Weiteren haben wir die Reporterzellen für ein groß angelegtes Screening mit einer Bibliothek aus ROR1-CARs verwendet, welche Mutationen in der VH CDR3-Sequenz des R11 scFv enthielten. Diese Region ist entscheidend für die Bindung des R11-Epitops von ROR1 und wir haben erwartetet, dass Mutationen hier zu einem Verlust der Spezifität und Affinität für die Mehrzahl der CAR-Varianten führen würden. Somit wollten wir feststellen, ob die CAR-Screening-Plattform in der Lage war funktionelle Konstrukte aus einer großen Anzahl von CAR-Varianten wiederzufinden. Tatsächlich identifizierten die Reporterzellen mittels einer angepassten Anreicherungs- und Screeningstrategie eine funktionelle CAR-Variante, die mit einer Häufigkeit von nur 6 in 1,05x10^6 vorkam.
Da unsere CAR-Screening-Plattform die Analyse aktivierender Signalmodule ermöglicht hat, veranlasste uns dies auch inhibitorische Signalmodule zu untersuchen, welche die Funktionsweise des CAR verändern. Ein solcher inhibitorischer CAR (iCAR) kann in Kombination mit einem aktivierenden CAR verwendet werden, um die T-Zellstimulation zu stören. Durch die Auswahl geeigneter Zielantigene für iCAR und CAR soll diese neuartige Anwendung die Selektivität gegenüber Tumorzellen verbessern und sie könnte mit unserer Screening-Plattform einfach untersucht werden. Dementsprechend haben wir CD19 spezifische iCARs mit inhibitorischem PD-1-Signalmodul hinsichtlich ihrer hemmenden Wirkung auf die Reportergenaktivierung getestet. In Kombination mit CAR- oder TCR-Stimulation wurde eine Abnahme der NF-κB- und NFAT-Signale nur dann beobachtet, wenn aktivierende und inhibitorische Rezeptoren in räumliche Nähe gebracht wurden. Diese Ergebnisse wurden durch Experimente mit primären T-Zellen weiter verifiziert.
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass unser Reporterzellsystem als Plattformtechnologie von großem Wert ist, da es die Analyse unabhängig von primären T-Zellen erlaubt, zwischen Laboren exportierbar ist und angepasst werden kann, um klein bis groß angelegte Screenings mit CAR Bibliotheken zu ermöglichen. Die Auswahl geeigneter Kandidaten mit optimalen extrazellulären und intrazellulären Modulen kann die Anzahl der zu untersuchenden CAR-Konstrukte in anschließenden in vitro- und in vivo-Studien mit primären T-Zellen reduzieren. Wir sind daher überzeugt, dass unsere CAR-Screening-Plattform basierend auf NF-κB/NFAT-Reporterzellen hilfreich sein wird, um die translationale Forschung zu beschleunigen, indem sie die Untersuchung von neuen Designparametern in CARs erleichtert.
KW  - Antigenrezeptor
KW  - Screening
KW  - Chimeric Antigen Receptor
KW  - Library Screening
KW  - Reporter Cells
KW  - Chimärer Antigenrezeptor
KW  - Reporterzellen
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179187
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kaiser, Sebastian
T1  - A RecQ helicase in disguise: Characterization of the unconventional Structure and Function of the human Genome Caretaker RecQ4
T1  - Die unkonventionelle RecQ Helikase RecQ4: Charakterisierung der ungewöhnlichen Struktur und Funktion eines essentiellen Beschützers des menschlichen Genoms
N2  - From the simplest single-cellular organism to the most complex multicellular life forms, genetic information in form of DNA represents the universal basis for all biological processes and thus for life itself. Maintaining the structural and functional integrity of the genome is therefore of paramount importance for every single cell. DNA itself, as an active and complex macromolecular structure, is both substrate and product of many of these biochemical processes. A cornerstone of DNA maintenance is thus established by the tight regulation of the multitude of reactions in DNA metabolism, repressing adverse side reactions and ensuring the integrity of DNA in sequence and function. The family of RecQ helicases has emerged as a vital class of enzymes that facilitate genomic integrity by operating in a versatile spectrum of nucleic acid metabolism processes, such as DNA replication, repair, recombination, transcription and telomere stability. RecQ helicases are ubiquitously expressed and conserved in all kingdoms of life. Human cells express five different RecQ enzymes, RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 and RecQ5, which all exhibit individual as well as overlapping functions in the maintenance of genomic integrity. Dysfunction of three human RecQ helicases, BLM, WRN and RecQ4, causes different heritable cancer susceptibility syndromes, supporting the theory that genomic instability is a molecular driving force for cancer development. However, based on their inherent DNA protective nature, RecQ helicases represent a double-edged sword in the maintenance of genomic integrity. While their activity in normal cells is essential to prevent cancerogenesis and cellular aging, cancer cells may exploit this DNA protective function by the overexpression of many RecQ helicases, aiding to overcome the disadvantageous results of unchecked DNA replication and simultaneously gaining resistance against chemotherapeutic drugs. Therefore, detailed knowledge how RecQ helicases warrant genomic integrity is required to understand their implication in cancerogenesis and aging, thus setting the stage to develop new strategies towards the treatment of cancer.

The current study presents and discusses the first high-resolution X-ray structure of the human RecQ4 helicase. The structure encompasses the conserved RecQ4 helicase core, including a large fraction of its unique C- terminus. Our structural analysis of the RecQ4 model highlights distinctive differences and unexpected similarities to other, structurally conserved, RecQ helicases and permits to draw conclusions about the functional implications of the unique domains within the RecQ4 C-terminus. The biochemical characterization of various RecQ4 variants provides functional insights into the RecQ4 helicase mechanism, suggesting that RecQ4 might utilize an alternative DNA strand separation technique, compared to other human RecQ family members. Finally, the RecQ4 model permits for the first time the analysis of multiple documented RecQ4 patient mutations at the atomic level and thus provides the possibility for an advanced interpretation of particular structure-function relationships in RecQ4 pathogenesis.
N2  - Vom simpelsten einzelligen Organismus bis hin zu hoch komplexen Lebensformen, genetische Information in Form von DNA repräsentiert die universelle Grundlage aller biologischer Prozesse, und damit die des Lebens selbst. Die Aufrechterhaltung der intakten Struktur und Funktion des Genoms ist daher von höchster Priorität für jede einzelne Zelle. Die DNA selbst, als aktives und komplexes Makromolekül, ist sowohl Substrat als auch Produkt einer Vielzahl dieser biochemischen Prozesse. Ein wesentlicher Aspekt für die Aufrechterhaltung genomischer Integrität besteht daher in der gezielten Regulation aller Prozesse des DNA Metabolismus, um die Konservierung der DNA in Sequenz und Funktion zu gewährleisten und unerwünschte Nebenreaktionen zu verhindern. Die Familie der RecQ Helikasen hat sich als eine essentielle Gruppe von Enzymen etabliert, die diese genomische Integrität gewährleisten, indem sie eine Vielzahl von DNA basierten Prozessen kontrollieren. Dies umfasst die Replikation, Reparatur, Rekombination und Transkription von DNA, sowie Prozesse, die der Stabilisierung der Telomere dienen. RecQ Helikasen werden von allen Zellen exprimiert und können in allen Domänen des Lebens – Bakterien, Archaeen und Eukaryoten nachgewiesen werden. Humane Zellen enthalten fünf verschiedene RecQ Helikasen, RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 und RecQ5, welche sowohl individuelle als auch überlappende Funktionen in der Aufrechterhaltung genomischer Integrität innehaben. Eine Beeinträchtigung der Funktion der humanen RecQ Helikasen BLM, WRN und RecQ4 führt zu Krankheiten die durch eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für die Entstehung von Krebs gekennzeichnet sind. Dies unterstützt die Theorie, dass die genomische Instabilität eine molekulare Grundlage für die Entstehung von Krebs darstellt. Allerdings repräsentiert die den RecQ Helikasen innewohnende Funktion der Aufrechterhaltung genomischer Integrität ein zweischneidiges Schwert. Während ihre Aktivitäten auf der einen Seite für normale Zellen essentiell sind, um Krankheiten und zelluläre Alterungserscheinungen zu verhindern, wird ihre DNA protektive Funktion von Krebszellen genutzt, indem sie verschiedenste RecQ Helikasen überexprimieren und damit den nachteiligen Effekten der unkontrollierten DNA Replikation entgegenwirken. Zudem erlangen Tumorzellen durch die erhöhte Präsenz der RecQ Helikasen Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Chemotherapeutika. Es ist daher von größter Bedeutung zu verstehen, wie genau die einzelnen RecQ Helikasen in der Entstehung von Krebs und dem Alterungsprozess involviert sind, um neue Ansätze in der Krebstherapie zu entwickeln.

Die vorliegende Arbeit präsentiert und diskutiert die erste detaillierte Röntgen-Kristallographische Struktur der humanen RecQ4 Helikase. Die vorgestellte Struktur umfasst den konservierten Kern der RecQ4 Helikase, einschließlich eines großen Teils ihres einzigartigen C-terminus. Eine Analyse des RecQ4 Modells weist sowohl eindeutige Unterschiede als auch unerwartete Gemeinsamkeiten im Vergleich mit anderen, untereinander strukturell und funktional ähnlichen, humanen RecQ Helikasen auf und erlaubt zudem Rückschlüsse auf die Funktion der einzigartigen C-terminalen RecQ4 Domäne. Die biochemische Charakterisierung verschiedener RecQ4 Varianten liefert funktionelle Einblicke in den Mechanismus der DNA Doppelstrangtrennung durch RecQ4 und deutet darauf hin, dass sich dieser in weiten Teilen vom Mechanismus der anderen humanen RecQ Helikasen unterscheidet. Letztlich repräsentiert das hier vorgestellte Modell der RecQ4 Helikase die Grundlage für die Analyse verschiedenster dokumentierter RecQ4 Patientenmutationen und erlaubt damit eine erste Abschätzung von Struktur-und-Funktions-Beziehungen bezüglich der bekannten RecQ4- assoziierten Krankheitsbilder.
KW  - Helikasen
KW  - DNA-Reparatur
KW  - RecQ helicase
KW  - X-ray crystallography
KW  - Rothmund-Thomson-Syndrome
KW  - Genome Instability
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160414
N1  - Zugriff gesperrt bis 16.03.2020
ER  - 
TY  - THES
A1  - Prieto García, Cristian
T1  - USP28 regulates Squamous cell oncogenesis and DNA repair via ΔNp63 deubiquitination
T1  - USP28 reguliert Plattenepithelzell-Onkogenese und DNA-Reparatur über ΔNp63-Deubiquitinierung
N2  - ∆Np63 is a master regulator of squamous cell identity and regulates several signaling pathways that crucially
contribute to the development of squamous cell carcinoma (SCC) tumors. Its contribution to coordinating the
expression of genes involved in oncogenesis, epithelial identity, DNA repair, and genome stability has been
extensively studied and characterized. For SCC, the expression of ∆Np63 is an essential requirement to
maintain the malignant phenotype. Additionally, ∆Np63 functionally contributes to the development of cancer
resistance toward therapies inducing DNA damage.
SCC patients are currently treated with the same conventional Cisplatin therapy as they would have been
treated 30 years ago. In contrast to patients with other tumor entities, the survival of SCC patients is limited,
and the efficacy of the current therapies is rather low. Considering the rising incidences of these tumor entities,
the development of novel SCC therapies is urgently required. Targeting ∆Np63, the transcription factor, is a
potential alternative to improve the therapeutic response and clinical outcomes of SCC patients.
However, ∆Np63 is considered “undruggable.” As is commonly observed in transcription factors, ∆Np63 does
not provide any suitable domains for the binding of small molecule inhibitors. ∆Np63 regulates a plethora of
different pathways and cellular processes, making it difficult to counteract its function by targeting
downstream effectors. As ∆Np63 is strongly regulated by the ubiquitin–proteasome system (UPS), the
development of deubiquitinating enzyme inhibitors has emerged as a promising therapeutic strategy to target
∆Np63 in SCC treatment.
This work involved identifying the first deubiquitinating enzyme that regulates ∆Np63 protein stability. Stateof-the-art SCC models were used to prove that USP28 deubiquitinates ∆Np63, regulates its protein stability,
and affects squamous transcriptional profiles in vivo and ex vivo. Accordingly, SCC depends on USP28 to
maintain essential levels of ∆Np63 protein abundance in tumor formation and maintenance. For the first time,
∆Np63, the transcription factor, was targeted in vivo using a small molecule inhibitor targeting the activity of
USP28. The pharmacological inhibition of USP28 was sufficient to hinder the growth of SCC tumors in
preclinical mouse models.
Finally, this work demonstrated that the combination of Cisplatin with USP28 inhibitors as a novel therapeutic
alternative could expand the limited available portfolio of SCC therapeutics. Collectively, the data presented
within this dissertation demonstrates that the inhibition of USP28 in SCC decreases ∆Np63 protein abundance,
thus downregulating the Fanconi anemia (FA) pathway and recombinational DNA repair. Accordingly, USP28
inhibition reduces the DNA damage response, thereby sensitizing SCC tumors to DNA damage therapies, such
as Cisplatin.
N2  - ∆Np63 ist ein Hauptregulator der Plattenepithelzellidentität und reguliert mehrere Signalwege, die entscheidend zur Entstehung von Plattenepithelkarzinomen (SCC) beitragen. Sein Beitrag zur Koordination der Expression von Genen, die an der Onkogenese, der epithelialen Identität, der DNA-Reparatur und der Genomstabilität beteiligt sind, wurde umfassend untersucht und charakterisiert. Für SCC ist die Expression von ∆Np63 eine wesentliche Voraussetzung, um den malignen Phänotyp zu erhalten. Darüber hinaus trägt ∆Np63 funktionell zur Entwicklung einer Krebsresistenz gegenüber Therapien bei, die DNA-Schäden induzieren.
SCC-Patienten werden derzeit mit der gleichen konventionellen Cisplatin-Therapie behandelt, wie sie vor 30 Jahren behandelt worden wären. Im Gegensatz zu Patienten mit anderen Tumorentitäten ist das Überleben von SCC-Patienten begrenzt und die Wirksamkeit der aktuellen Therapien eher gering. Angesichts der steigenden Inzidenz dieser Tumorentitäten ist die Entwicklung neuer Therapien für das Plattenepithelkarzinom dringend erforderlich. Das Targeting von ∆Np63, dem Transkriptionsfaktor, ist eine potenzielle Alternative zur Verbesserung des therapeutischen Ansprechens und der klinischen Ergebnisse von SCC-Patienten.
∆Np63 gilt jedoch als „nicht medikamentös“. Wie bei Transkriptionsfaktoren häufig beobachtet, bietet ∆Np63 keine geeigneten Domänen für die Bindung von niedermolekularen Inhibitoren. ∆Np63 reguliert eine Vielzahl von verschiedenen Signalwegen und zellulären Prozessen, was es schwierig macht, seiner Funktion entgegenzuwirken, indem es nachgeschaltete Effektoren angreift. Da ∆Np63 stark durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) reguliert wird, hat sich die Entwicklung von deubiquitinierenden Enzyminhibitoren als vielversprechende therapeutische Strategie erwiesen, um ∆Np63 bei der Behandlung von Plattenepithelkarzinomen zu bekämpfen.
Diese Arbeit beinhaltete die Identifizierung des ersten deubiquitinierenden Enzyms, das die Stabilität des ∆Np63-Proteins reguliert. Hochmoderne SCC-Modelle wurden verwendet, um zu beweisen, dass USP28 ∆Np63 deubiquitiniert, seine Proteinstabilität reguliert und Plattenepithel-Transkriptionsprofile in vivo und ex vivo beeinflusst. Dementsprechend hängt SCC von USP28 ab, um wesentliche Mengen des Np63-Proteinüberflusses bei der Tumorbildung und -erhaltung aufrechtzuerhalten. Zum ersten Mal wurde ∆Np63, der Transkriptionsfaktor, in vivo mit einem niedermolekularen Inhibitor gezielt, der auf die Aktivität von USP28 abzielt. Die pharmakologische Hemmung von USP28 war ausreichend, um das Wachstum von SCC-Tumoren in präklinischen Mausmodellen zu verhindern.
Schließlich zeigte diese Arbeit, dass die Kombination von Cisplatin mit USP28-Inhibitoren als neuartige therapeutische Alternative das begrenzt verfügbare Portfolio an SCC-Therapeutika erweitern könnte. Zusammengefasst zeigen die in dieser Dissertation präsentierten Daten, dass die Hemmung von USP28 in SCC die Np63-Proteinhäufigkeit verringert, wodurch der Fanconi-Anämie (FA)-Signalweg und die rekombinatorische DNA-Reparatur herunterreguliert werden. Dementsprechend reduziert die Hemmung von USP28 die Reaktion auf DNA-Schäden und sensibilisiert dadurch SCC- Tumoren für DNA-Schädigungstherapien wie Cisplatin.
KW  - USP28
KW  - Squamous cell carcinoma
KW  - ΔNp63
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-270332
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nelke, Johannes
T1  - Entwicklung multi‐funktioneller TNFRSF Rezeptorspezifischer Antikörper‐Fusionsproteine mit FcγR‐unabhängiger Aktivität
T1  - Development of multi‐functional TNFRSF receptor‐specific antibody fusion proteins with FcγR‐independent activity
N2  - Antikörper, die gegen eine klinisch relevante Gruppe von Rezeptoren innerhalb der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF) gerichtet sind, darunter CD40 und CD95 (Fas/Apo-1), benötigen ebenfalls eine Bindung an Fc-Gamma-Rezeptoren (FcγRs), um eine starke agonistische Wirkung zu entfalten. Diese FcγR-Abhängigkeit beruht weitgehend auf der bloßen zellulären Verankerung durch die Fc-Domäne des Antikörpers und benötigt dabei kein FcγR-Signalling. Ziel dieser Doktorarbeit war es, das agonistische Potenzial von αCD40- und αCD95-Antikörpern unabhängig von der Bindung an FcγRs durch die Verankerung an Myelomzellen zu entfalten. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Antikörpervarianten (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) gegen die TNFRSF-Mitglieder CD40 und CD95 genetisch mit einem einzelkettig kodierten B-Zell-aktivierenden Faktor (scBaff) Trimer als C-terminale myelom-spezifische Verankerungsdomäne fusioniert, welche die Fc-Domäne-vermittelte FcγR-Bindung ersetzt. Diese bispezifischen Antikörper-scBaff-Fusionsproteine wurden in Bindungsstudien und funktionellen Assays mit Tumorzelllinien untersucht, die einen oder mehrere der drei Baff-Rezeptoren exprimieren: BaffR, Transmembran-Aktivator und CAML-Interaktor (TACI) und B-Zell-Reifungsantigen (BCMA). Zelluläre Bindungsstudien zeigten, dass die Bindungseigenschaften der verschiedenen Domänen innerhalb der Antikörper-scBaff-Fusionen gegenüber der Zielantigene vollständig intakt blieben. In Ko-Kulturversuchen von CD40- und CD95-responsiven Zellen mit BaffR-, BCMA- oder TACI-exprimierenden Verankerungszellen zeigten die Antikörper-Fusionsproteine einen starken Agonismus, während in Ko-Kulturen mit Zellen ohne Expression von Baff-interagierenden Rezeptoren nur eine geringe Rezeptorstimulation beobachtet wurde. Die hier vorgestellten αCD40- und αCD95-Antikörper-scBaff-Fusionsproteine zeigen also Myelom-spezifische Aktivität und versprechen im Vergleich zu herkömmlichen CD40- und CD95-Agonisten geringere systemische Nebenwirkungen.
N2  - Antibodies that target a clinically relevant group of receptors within the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF), including CD40 and CD95 (Fas/Apo-1), also require binding to Fc gamma receptors (FcγRs) to elicit a strong agonistic activity. This FcγR dependency largely relies on the mere cellular anchoring through the antibody's Fc domain and does not involve the engagement of FcγR signaling. The aim of this doctoral thesis was to elicit agonistic activity from αCD40 and αCD95 antibodies in a myeloma cell anchoring-controlled FcγR-independent manner. For this purpose, various antibody variants (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) against the TNFRSF members CD40 and CD95 were genetically fused to a single-chain-encoded B-cell activating factor (scBaff) trimer as a C-terminal myeloma-specific anchoring domain substituting for Fc domain-mediated FcγR binding. These bispecific antibody-scBaff fusion proteins were evaluated in binding studies and functional assays using tumor cell lines expressing one or more of the three receptors of Baff: BaffR, transmembrane activator and CAML interactor (TACI) and B-cell maturation antigen (BCMA). Cellular binding studies showed that the binding properties of the different domains within the fusion proteins remained fully intact in the antibody-scBaff fusion proteins. In co-culture assays of CD40- and CD95-responsive cells with BaffR, BCMA or TACI expressing anchoring cells, the antibody fusion proteins displayed strong agonism while only minor receptor stimulation was observed in co-cultures with cells without expression of Baff-interacting receptors. Thus, the herein presented αCD40 and αCD95 antibody fusion proteins display myeloma cell-dependent activity and promise reduced systemic side effects compared to conventional CD40 and CD95 agonists.
KW  - Antigen CD40
KW  - Monoklonaler bispezifischer Antikörper
KW  - Antigen CD95
KW  - Immunreaktion
KW  - B-Zell-Lymphom
KW  - BCMA
KW  - FcgR
KW  - Antikörper
KW  - bispezifisch
KW  - Antibody
KW  - bispecific
KW  - Multiple Myeloma
KW  - Baff
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-279855
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ries, Lena Kerstin
T1  - From recognition to reaction: Mechanistic analysis of the interactions of the HECT ligase E6AP with ubiquitin
T1  - Von der Erkennung bis zur Reaktion: Mechanistische Analyse der Wechselwirkungen der HECT-Ligase E6AP mit Ubiquitin
N2  - The ubiquitination of proteins controls a multitude of physiological processes. This versatility of ubiquitin as a molecular signal arises from the diverse ways by which it can be attached to target proteins. Different ubiquitination patterns are then translated into different downstream consequences. Due to the enormous complexity of possible ubiquitin modifications, the ubiquitination machinery must be highly specific and tightly controlled. Ubiquitination proceeds through an enzymatic cascade, the last step of which is catalyzed by the E3 enzyme family. E3 enzymes are the crucial regulators since they dictate the specificity of substrate selection and modification. 
Deregulation of the HECT-type ubiquitin ligase E6AP (UBE3A) is implicated in human papilloma virus-induced cervical tumorigenesis and several neurodevelopmental disorders. Yet the structural underpinnings of activity, regulation and specificity in this crucial ligase are incompletely understood. 
One aim of this study was to unravel the role of the a1’-helix N-terminal to the HECT domain that was found to be a key element mediating regulation and oligomerization in other HECT ligases. I found that most N-terminally extended HECT domain constructs were insoluble when expressed in E. coli, indicating that additional regions N-terminal to the tested fragments may be essential to protect this highly hydrophobic helix from causing aggregation. 
Another question addressed in this study was how E6AP builds ubiquitin chains. Using single-turnover experiments, I showed that ubiquitin-loaded E6AP is unable to transfer an additional ubiquitin molecule onto a stably linked ubiquitin-E6AP complex. This indicates that E6AP cannot assemble chains on its active site and may instead follow a sequential addition mechanism in which one ubiquitin molecule is transferred at a time to the target protein.
Using NMR spectroscopy and extensive mutational analyses, the determinants of ubiquitin recognition by the C-lobe of E6AP were unraveled and assigned to particular steps in the catalytic cycle. A functionally critical interface was identified that is specifically required during thioester formation between the C-terminus of ubiquitin and the ligase active site. This interface resembles the one utilized by NEDD4-type enzymes, suggesting a conserved ubiquitin binding mode across HECT ligases, independent of their linkage specificities. Moreover, I identified critical surface patches on ubiquitin and in the N- and C-terminal portions of the catalytic domain of E6AP that are important for the subsequent step of isopeptide bond formation. I also uncovered key determinants of the Lys48-linkage specificity of E6AP, both in the E6AP HECT domain and ubiquitin itself. This includes the C-terminal tail of E6AP and a hydrophilic surface region of ubiquitin in proximity to the acceptor site, Lys48. It is thus tempting to speculate that ubiquitin linkage formation by E6AP is substrate-assisted. Taken together, my results improve our mechanistic understanding of the structure-function relationship between E6AP and ubiquitin, thus providing a basis for ultimately manipulating the functions of this HECT ligase for therapeutic applications.
N2  - Die Ubiquitinierung von Proteinen ist an nahezu jedem physiologischen Prozess beteiligt. Die Vielseitigkeit mit der Ubiquitin als molekulares Signal fungiert, rührt von den vielfältigen Möglichkeiten her, wie es an Zielproteine gebunden werden kann. Verschiedene Ubiquitinierungsmuster rufen unterschiedliche biologische Ereignisse hervor. Angesichts der enormen Komplexität möglicher Ubiquitinierungsmodifikationen muss die Ubiquitinierungs-maschinerie hochspezifisch und streng kontrolliert sein. Die Ubiquitinierung erfolgt über eine enzymatische Kaskade. Der letzte Schritt wird hierbei durch die Enzymfamilie der Ubiquitin-Ligasen katalysiert. Ubiquitin-Ligasen sind primär für die Spezifität in Substraterkennung und Ubiquitin-Kettenbildung verantwortlich.
Misregulation der HECT-Ligase E6AP fördert die durch humane Papillomaviren induzierte Tumorentwicklung im Gebärmutterhals und ist mit zwei schweren neurologischen Krankheiten verbunden. Strukturelle Einzelheiten über den Mechanismus, die Regulation und die Spezifität dieser wichtigen Ligase sind jedoch weitgehend unbekannt. 
Für verschiedene HECT-Ligasen wurde gezeigt, dass die a1‘-Helix N-terminal zur HECT-Domäne ein Schlüsselelement für die Regulation und den Oligomerisierungszustand der Enzyme darstellt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Helix eine wichtige Funktion für die Stabilität von E6AP erfüllt. Der Großteil N-terminal verlängerter, in E. coli exprimierter HECT-Domänen-Konstrukte war unlöslich, was darauf hindeutet, dass N-terminal gelegene Regionen hydrophobe Bereiche des Proteins vor Aggregation schützen.
Eine weitere Fragestellung dieser Arbeit befasste sich mit dem Mechanismus der Ubiquitin-Kettenbildung durch E6AP. Mit ‘single-turnover‘-Experimenten konnte gezeigt werden, dass ein über einen Thioester gebundenes Ubiquitin von E6AP nicht auf einen stabil verknüpften Ubiquitin-E6AP-Komplex übertragen werden kann. Dies deutet daraufhin, dass E6AP keine Ketten auf dem katalytischen Cystein aufbauen kann und stattdessen einem sequentiellen Additionsmechanismus der Ubiquitin-Kettenbildung folgt.
Mithilfe von NMR Spektroskopie und umfangreicher Mutagenese-Studien wurde eine Interaktion zwischen dem C-Lobe von E6AP und Ubiquitin gefunden, die während der Thioesterbildung zwischen dem C-Terminus von Ubiquitin und dem aktiven Zentrum von E6AP gebraucht wird. Diese Interaktionsfläche ähnelt derer der NEDD4-Familie, was auf einen konservierten Bindungsmodus der HECT-Ligasen an Ubiquitin im ersten Reaktionsschritt hindeutet, ungeachtet der jeweiligen Kettenspezifitäten. Verschiedene Oberflächen auf Ubiquitin und E6AP, sowohl auf dem C-Lobe als auch auf dem N-Lobe, konnten identifiziert werden, die für die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen zwei Ubiquitin-Molekülen von Bedeutung sind. Neben dem C-Terminus von E6AP wurde eine hydrophile Oberfläche auf Ubiquitin in unmittelbarer Nähe zum Akzeptor Lys48 gefunden, die wichtig für die Lys48-spezifische Ubiquitin-Kettenbildung ist. Der Gedanke liegt nahe, dass die Ubiquitin-Kettenbildung durch E6AP über Substratunterstützte Katalyse verläuft. 
Zusammenfassend erweitern diese Ergebnisse maßgeblich unser Verständnis der Erkennung von Ubiquitin durch die HECT-Ligase E6AP und können möglicherweise dazu beitragen Wirkstoffe zu entwickeln, welche eine Fehlregulierung von E6AP ausgleichen können.
KW  - Ubiquitin
KW  - Ubiquitin-Protein-Ligase
KW  - Ubiquitinierung
KW  - ubiquitin recognition
KW  - ubiquitin chain formation
KW  - ubiquitin linkage specificity
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179609
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kölmel, Wolfgang
T1  - Structural and functional characterization of TFIIH from \(Chaetomium\) \(thermophilum\)
T1  - Strukturelle und funktionale Charakterisierung von TFIIH aus \(Chaetomium\) \(thermophilum\)
N2  - Gene expression and transfer of the genetic information to the next generation forms the basis of cellular life. These processes crucially rely on DNA, thus the preservation, transcription and translation of DNA is of fundamental importance for any living being. The general transcription factor TFIIH is a ten subunit protein complex, which consists of two subcomplexes: XPB, p62, p52, p44, p34, and p8 constitute the TFIIH core, CDK7, CyclinH, and MAT1 constitute the CAK. These two subcomplexes are connected via XPD. TFIIH is a crucial factor involved in both, DNA repair and transcription. The central role of TFIIH is underlined by three severe disorders linked to failure of TFIIH in these processes: xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome, and trichothiodystrophy. Only limited structural and functional data of TFIIH are available so far. Here, the model organism Chaetomium thermophilum was utilized with the aim to structurally and functionally characterize TFIIH. By combining the expression and purification of single TFIIH subunits with the co-expression and co-purification of dual complexes, a unique and powerful modular system of the TFIIH core subunits could be established, encompassing all proteins in high quality and fully functional. This system permits the step-wise assembly of TFIIH core, thereby making it possible to assess the influence of the intricate interaction network within TFIIH core on the overall enzymatic activities of TFIIH, which has not been possible so far. Utilizing the single subunits and dual complexes, a detailed interaction network of TFIIH core was established, revealing the crucial role of the p34 subunit as a central scaffold of TFIIH by linking the two proteins p44 and p52. Our studies also suggest that p62 constitutes the central interface of TFIIH to the environment rather than acting as a scaffold. TFIIH core complexes were assembled and investigated via electron microscopy. Preliminary data indicate that TFIIH adopts different conformational states, which are important to fulfill its functions in transcription and DNA repair. Additionally, a shortened construct of p62 was used to develop an easy-to-use, low cost strategy to overcome the crystallographic phase problem via cesium derivatization.
N2  - Die Expression von Genen und die Weitergabe des Erbguts an die nächste Generation bilden die Grundlage jeden Lebens. Bei diesen Vorgängen spielt die DNA eine entscheidende Rolle. Deshalb sind der Erhalt, die Transkription und die Translation der DNA von fundamentaler Bedeutung für alle Lebewesen. Der generelle Transkriptionsfaktor TFIIH ist ein Multi-Proteinkomplex und umfasst insgesamt zehn Untereinheiten. TFIIH kann in zwei Teilkomplexe unterteilt werden: XPB, p62, p52, p44, p34 und p8 bilden den TFIIH Core Komplex, CDK7, CyclinH und MAT1 bilden den CAK Komplex. Diese beiden Teilkomplexe werden durch XPD verbunden. TFIIH spielt eine entscheidende Rolle sowohl in der DNA Reparatur, als auch in der Transkription. Diese zentrale Rolle wird durch das Auftreten dreier schwerer Krankheiten deutlich, die mit dem Ausfall von TFIIH bei diesen Aufgaben in Verbindung stehen: Xeroderma pigmentosum, Cockayne-Syndrom und Trichothiodystrophie. Daten bezüglich der Struktur und Funktion von TFIIH stehen bisher nur in begrenztem Umfang zur Verfügung. In dieser Arbeit kam der Modellorganismus Chaetomium thermophilum zum Einsatz, mit dem Ziel die Struktur und Funktion von TFIIH näher zu beleuchten. Durch die Kombination der Expression und Aufreinigung einzelner TFIIH Untereinheiten mit der Koexpression und Koaufreinigung von dualen Komplexen konnte ein einmaliges und leistungsfähiges modulares System entwickelt werden, das die Darstellung aller Untereinheiten in hoher Qualität und voller Funktionalität erlaubt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die schrittweise modulare Zusammensetzung von TFIIH Core ermöglicht, was es nun erlaubt den Einfluss der komplexen Wechselwirkungen innerhalb von TFIIH Core auf die enzymatischen Aktivitäten im Ganzen zu untersuchen, was bisher nicht möglich war. Mit Hilfe der Einzelproteine und dualen Komplexe wurde ein detailliertes Netzwerk aus Wechselwirkungen innerhalb TFIIH Core etabliert, welches die entscheidende Rolle der p34 Untereinheit als zentrales Gerüst für TFIIH offenbarte, da sie die Verbindung zwischen p44 und p52 herstellt. Unsere Untersuchungen deuten zudem darauf hin, dass p62 die zentrale Schnittstelle zur Umgebung von TFIIH darstellt, anstatt als Gerüst zu fungieren. Des Weiteren gelang die Assemblierung von TFIIH Core Komplexen, die mittels Elektronenmikroskopie untersucht wurden. Die Strukturen, die daraus hervorgingen, legen das Vorhandensein verschiedener TFIIH Konformationen nahe, welche vermutlich bei den verschiedenen Aufgaben von TFIIH in der Transkription und DNA Reparatur zum Tragen kommen. Außerdem wurde mit Hilfe eines gekürzten p62 Konstrukts eine einfach zu handhabende, kostengünstige Strategie zur Lösung des kristallografischen Phasenproblems mittels Cäsiumderivatisierung entwickelt.
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - DNS-Reparatur
KW  - TFIIH
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161769
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Wanzek, Katharina
A1  - Schwindt, Eike
A1  - Capra, John A.
A1  - Paeschke, Katrin
T1  - Mms1 binds to G-rich regions in Saccharomyces cerevisiae and influences replication and genome stability
JF  - Nucleic Acids Research
N2  - The regulation of replication is essential to preserve genome integrity. Mms1 is part of the E3 ubiquitin ligase complex that is linked to replication fork progression. By identifying Mms1 binding sites genome-wide in Saccharomyces cerevisiae we connected Mms1 function to genome integrity and replication fork progression at particular G-rich motifs. This motif can form G-quadruplex (G4) structures in vitro. G4 are stable DNA structures that are known to impede replication fork progression. In the absence of Mms1, genome stability is at risk at these G-rich/G4 regions as demonstrated by gross chromosomal rearrangement assays. Mms1 binds throughout the cell cycle to these G-rich/G4 regions and supports the binding of Pif1 DNA helicase. Based on these data we propose a mechanistic model in which Mms1 binds to specific G-rich/G4 motif located on the lagging strand template for DNA replication and supports Pif1 function, DNA replication and genome integrity.
KW  - replication
KW  - regulation
KW  - genome integrity
KW  - Saccharomyces cerevisiae
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170577
VL  - 45
IS  - 13
ER  -