TY - JOUR A1 - Rauschenberger, Vera A1 - Piro, Inken A1 - Kasaragod, Vikram Babu A1 - Hörlin, Verena A1 - Eckes, Anna-Lena A1 - Kluck, Christoph J. A1 - Schindelin, Hermann A1 - Meinck, Hans-Michael A1 - Wickel, Jonathan A1 - Geis, Christian A1 - Tüzün, Erdem A1 - Doppler, Kathrin A1 - Sommer, Claudia A1 - Villmann, Carmen T1 - Glycine receptor autoantibody binding to the extracellular domain is independent from receptor glycosylation JF - Frontiers in Molecular Neuroscience N2 - Glycine receptor (GlyR) autoantibodies are associated with stiff-person syndrome and the life-threatening progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus in children and adults. Patient histories show variability in symptoms and responses to therapeutic treatments. A better understanding of the autoantibody pathology is required to develop improved therapeutic strategies. So far, the underlying molecular pathomechanisms include enhanced receptor internalization and direct receptor blocking altering GlyR function. A common epitope of autoantibodies against the GlyRα1 has been previously defined to residues 1A-33G at the N-terminus of the mature GlyR extracellular domain. However, if other autoantibody binding sites exist or additional GlyR residues are involved in autoantibody binding is yet unknown. The present study investigates the importance of receptor glycosylation for binding of anti-GlyR autoantibodies. The glycine receptor α1 harbors only one glycosylation site at the amino acid residue asparagine 38 localized in close vicinity to the identified common autoantibody epitope. First, non-glycosylated GlyRs were characterized using protein biochemical approaches as well as electrophysiological recordings and molecular modeling. Molecular modeling of non-glycosylated GlyRα1 did not show major structural alterations. Moreover, non-glycosylation of the GlyRα1N38Q did not prevent the receptor from surface expression. At the functional level, the non-glycosylated GlyR demonstrated reduced glycine potency, but patient GlyR autoantibodies still bound to the surface-expressed non-glycosylated receptor protein in living cells. Efficient adsorption of GlyR autoantibodies from patient samples was possible by binding to native glycosylated and non-glycosylated GlyRα1 expressed in living not fixed transfected HEK293 cells. Binding of patient-derived GlyR autoantibodies to the non-glycosylated GlyRα1 offered the possibility to use purified non-glycosylated GlyR extracellular domain constructs coated on ELISA plates and use them as a fast screening readout for the presence of GlyR autoantibodies in patient serum samples. Following successful adsorption of patient autoantibodies by GlyR ECDs, binding to primary motoneurons and transfected cells was absent. Our results indicate that the glycine receptor autoantibody binding is independent of the receptor’s glycosylation state. Purified non-glycosylated receptor domains harbouring the autoantibody epitope thus provide, an additional reliable experimental tool besides binding to native receptors in cell-based assays for detection of autoantibody presence in patient sera. KW - glycine receptor KW - autoantibodies KW - glycosylation KW - extracellular domain KW - adsorption Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-304206 VL - 16 ER - TY - INPR A1 - Brenner, Marian A1 - Zink, Christoph A1 - Witzinger, Linda A1 - Keller, Angelika A1 - Hadamek, Kerstin A1 - Bothe, Sebastian A1 - Neuenschwander, Martin A1 - Villmann, Carmen A1 - von Kries, Jens Peter A1 - Schindelin, Hermann A1 - Jeanclos, Elisabeth A1 - Gohla, Antje T1 - 7,8-Dihydroxyflavone is a direct inhibitor of pyridoxal phosphatase T2 - eLife N2 - Vitamin B6 deficiency has been linked to cognitive impairment in human brain disorders for decades. Still, the molecular mechanisms linking vitamin B6 to these pathologies remain poorly understood, and whether vitamin B6 supplementation improves cognition is unclear as well. Pyridoxal phosphatase (PDXP), an enzyme that controls levels of pyridoxal 5’-phosphate (PLP), the co-enzymatically active form of vitamin B6, may represent an alternative therapeutic entry point into vitamin B6-associated pathologies. However, pharmacological PDXP inhibitors to test this concept are lacking. We now identify a PDXP and age-dependent decline of PLP levels in the murine hippocampus that provides a rationale for the development of PDXP inhibitors. Using a combination of small molecule screening, protein crystallography and biolayer interferometry, we discover and analyze 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) as a direct and potent PDXP inhibitor. 7,8-DHF binds and reversibly inhibits PDXP with low micromolar affinity and sub-micromolar potency. In mouse hippocampal neurons, 7,8-DHF increases PLP in a PDXP-dependent manner. These findings validate PDXP as a druggable target. Of note, 7,8-DHF is a well-studied molecule in brain disorder models, although its mechanism of action is actively debated. Our discovery of 7,8-DHF as a PDXP inhibitor offers novel mechanistic insights into the controversy surrounding 7,8-DHF-mediated effects in the brain. KW - 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) KW - pyridoxal phosphatase (PDXP) KW - vitamin B6 KW - PDXP inhibitors Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350446 ER - TY - THES A1 - Aido, Ahmed T1 - Development of anti-TNF antibody-gold nanoparticles (anti-TNF-AuNPs) T1 - Entwicklung von Anti-TNF-Antikörper-Gold-Nanopartikeln N2 - Gold nanoparticles of diameter ca. 60 nm have been synthesized based on Turkevich and Frens protocols. We have demonstrated that the carboxyl-modified gold nanoparticles can be coupled covalently with antibodies (Ab) of interest using the EDC/NHS coupling procedure. Binding studies with Ab-grafted AuNPs and GpL fusion proteins proved that conjugation of AuNPs with antibodies enables immobilization of antibodies with preservation of a significant antigen binding capacity. More importantly, our findings showed that the conjugation of types of anti-TNF receptors antibodies such as anti-Fn14 antibodies (PDL192 and 5B6) (Aido et al., 2021), anti-CD40, anti-4-1BB and anti-TNFR2 with gold nanoparticles confers them with potent agonism. Thus, our results suggest that AuNPs can be utilized as a platform to immobilize anti-TNFR antibodies which, on the one hand, helps to enhance their agonistic activity in comparison to “free” inactive antibodies by mimicking the effect of cell-anchored antibodies or membrane-bound TNF ligands and, on the other hand, allows to develop new generations of drug delivery systems. These constructs are characterized with their biocompatibility and their tunable synthesis process. In a further work part, we combined the benefits of the established system of Ab-AuNPs with materials used widely in the modern biofabrication approaches such as the photo-crosslinked hydrogels, methacrylate-modified gelatin (GelMA), combined with embedded variants of human cell lines. The acquired results demonstrated clearly that the attaching of proteins like antibodies to gold nanoparticles might reduce their release rate from the crosslinked hydrogels upon the very low diffusion of gold nanoparticles from the solid constructs to the surrounding medium yielding long-term local functioning proteins-attached particles. Moreover, our finding suggests that hydrogel-embedded AuNP-immobilized antibodies, e.g. anti-TNFα-AuNPs or anti-IL1-AuNPs enable local inhibitory functions, To sum up, our results demonstrate that AuNPs can act as a platform to attach anti-TNFR antibodies to enhance their agonistic activity by resembling the output of cell-anchoring or membrane bounding. Gold nanoparticles are considered, thus, as promising tool to develop the next generation of drug delivery systems, which may contribute to cancer therapy. On top of that, the embedding of anti-inflammatory-AuNPs in the biofabricated hydrogel presents new innovative strategy of the treatment of autoinflammatory diseases. N2 - Gold-Nanopartikel mit einem Durchmesser von ca. 60 nm wurden auf Basis der Turkevich- und Frens-Protokolle synthetisiert. Bindungsstudien mit Ab-verankerten AuNPs und GpL-Fusionsproteinen haben gezeigt, dass die Konjugation von AuNPs mit Antikörpern die Immobilisierung von Antikörpern mit Erhaltung einer signifikanten Antigenbindungs-Kapazität ermöglicht. Noch wichtiger ist, dass unsere Ergebnisse zeigen, dass die Konjugation von Typen von Antikörpern gegen TNFRs wie anti-Fn14-Antikörper (PDL192 und 5B6), anti-CD40, anti-4-1BB und anti-TNFR2 mit Gold-Nanopartikeln ihnen eine starke agonistische Wirkung verleiht. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass AuNPs als Plattform genutzt werden können, um Antikörper gegen TNFR zu immobilisieren, was einerseits dazu beiträgt, ihre agonistische Aktivität im Vergleich zu "freien" inaktiven Antikörpern zu erhöhen, indem sie die Wirkung von zellgebundenen Antikörpern oder membranverankerten TNF-Liganden nachahmen und andererseits die Entwicklung neuer Generationen von Wirkstoffabgabe Systemen ermöglicht. Diese Konstrukte zeichnen sich durch ihre Biokompatibilität und ihren einstellbaren Syntheseprozess aus. In einem weiteren Teil der Arbeit haben wir die Vorteile des etablierten Systems von Ab-AuNPs mit Materialien kombiniert, die in modernen Biofabrikationsansätzen weit verbreitet sind, nämlich Hydrogele, z.b. methacrylatmodifiziertes Gelatine (GelMA), kombiniert mit eingebetteten Varianten von menschlichen Zelllinien. Die erzielten Ergebnisse zeigten deutlich, dass die Anbindung von Proteinen wie Antikörpern an Gold-Nanopartikel ihre Freisetzung aus den vernetzten Hydrogelen reduzieren könnte, da die Diffusion von Gold-Nanopartikeln aus den festen Konstrukten in das umgebende Medium sehr gering ist und so langfristig Konstrukte mit lokalem Proteine load - erzeugt werden können. Darüber hinaus legt unser Befund nahe, dass in das Hydrogel eingebettete AuNP-immobilisierte Antikörper wie Anti-TNFα-AuNPs oder Anti-IL1-AuNPs eine lokal Immunsuppression erlauben. Diese können als vielversprechende Ansätze betrachtet werden, um verschiedene Arten von Autoimmunerkrankungen zu behandeln. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass AuNPs als Plattform dienen können, um Anti-TNFR-Antikörper anzubinden und ihre agonistische Aktivität zu erhöhen. Goldnanopartikel werden daher als vielversprechendes Werkzeug zur Entwicklung der nächsten Generation von Wirkstofftransportsystemen angesehen, die zur Krebstherapie beitragen können. Darüber hinaus stellt die Einbettung von entzündungshemmenden-AuNPs in das biofabrizierte Hydrogel eine neue innovative Strategie für die Behandlung von autoinflammatorischen Erkrankungen dar. KW - AuNPs KW - TNF KW - Nanoparticles KW - Antibody KW - Gold Nanoparticles KW - Drug delivery system (DDS) KW - Nanopartikel Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-349212 ER - TY - THES A1 - Peindl, Matthias T1 - Refinement of 3D lung cancer models for automation and patient stratification with mode-of-action studies T1 - Weiterentwicklung von 3D Lungentumormodellen zur Automatisierung und Patienten-Stratifizierung mit Untersuchungen zur Wirkungsweise N2 - Lung cancer is the main cause of cancer-related deaths worldwide. Despite the availability of several targeted therapies and immunotherapies in the clinics, the prognosis for lung cancer remains poor. A major problem for the low benefit of these therapies is intrinsic and acquired resistance, asking for pre-clinical models for closer investigation of predictive biomarkers for refined personalized medicine and testing of possible combination therapies as well as novel therapeutic approaches to break resistances. One third of all lung adenocarcinoma harbor mutations in the KRAS gene, of which 39 % are transitions from glycine to cysteine in codon 12 (KRASG12C). Being considered “undruggable” in previous decades, KRASG12C-inhibitors now paved the way into the standard-of-care for lung adenocarcinoma treatment in the clinics. Still, the overall response rates as well as overall survival of patients treated with KRASG12C-inhibitors are sobering. Therefore, 3D KRASG12C-biomarker in vitro models were developed based on a decellularized porcine jejunum (SISmuc) using commercial and PDX-derived cell lines and characterized in regards of epithelial-mesenchymal-transition (EMT), stemness, proliferation, invasion and c-MYC expression as well as the sensitivity towards KRASG12C-inhibiton. The phenotype of lung tumors harboring KRAS mutations together with a c-MYC overexpression described in the literature regarding invasion and proliferation for in vivo models was well represented in the SISmuc models. A higher resistance towards targeted therapies was validated in the 3D models compared to 2D cultures, while reduced viability after treatment with combination therapies were exclusively observed in the 3D models. In the test system neither EMT, stemness nor the c-MYC expression were directly predictive for drug sensitivity. Testing of a panel of combination therapies, a sensitizing effect of the aurora kinase A (AURKA) inhibitor alisertib for the KRASG12C-inhibitor ARS-1620 directly correlating with the level of c-MYC expression in the corresponding 3D models was observed. Thereby, the capability of SISmuc tumor models as an in vitro test system for patient stratification was demonstrated, holding the possibility to reduce animal experiments. Besides targeted therapies the treatment of NSCLC with oncolytic viruses (OVs) is a promising approach. However, a lack of in vitro models to test novel OVs limits the transfer from bench to bedside. In this study, 3D NSCLC models based on the SISmuc were evaluated for their capability to perform efficacy and risk assessment of oncolytic viruses (OVs) in a pre-clinical setting. Hereby, the infection of cocultures of tumor cells and fibroblasts on the SISmuc with provided viruses demonstrated that in contrast to a wildtype herpes simplex virus 1 (HSV-1) based OV, the attenuated version of the OV exhibited specificity for NSCLC cells with a more advanced and highly proliferative phenotype, while fibroblasts were no longer permissive for infection. This approach introduced SISmuc tumor models as novel test system for in vitro validation of OVs. Finally, a workflow for validating the efficacy of anti-cancer therapies in 3D tumor spheroids was established for the transfer to an automated platform based on a two-arm-robot system. In a proof-of-concept process, H358 spheroids were characterized and treated with the KRASG12C-inhibitor ARS-1620. A time- and dose-dependent reduction of the spheroid area after treatment was defined together with a live/dead-staining as easy-to-perform and cost-effective assays for automated drug testing that can be readily performed in situ in an automated system. N2 - Lungentumoren sind die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle weltweit. Trotz der Verfügbarkeit diverser zielgerichteter Therapien und Immuntherapien im klinischen Alltag ist die Prognose für Lungenkrebs nach wie vor schlecht. Eine Hauptursache hierfür sind intrinsische und erworbene Resistenzen. Hieraus ergibt sich ein Bedarf für präklinische Modelle zur genaueren Untersuchung prädiktiver Biomarker für eine verbesserte personalisierte Medizin und zur Testung von Kombinationstherapien sowie neuartiger therapeutischer Ansätze, um bestehende Resistenzen zu brechen. Ein Drittel aller Lungen-Adenokarzinome weisen Mutationen im KRAS-Gen auf, von denen 39 % Transitionen von Glycin zu Cystein in Codon 12 (KRASG12C) darstellen. Obwohl KRAS in den vergangenen Jahrzehnten als "unbehandelbar" galt, haben sich KRASG12C-Inhibitoren nun den Weg in die klinische Standardbehandlung von Lungen-Adenokarzinomen gebahnt. Jedoch sind die Ansprech- und Überlebensraten von Patienten, die mit KRASG12C-Inhibitoren behandelt werden, ernüchternd. Daher wurden in dieser Arbeit 3D KRASG12C-Biomarker in vitro Modelle basierend auf dezellularisierten Schweinedünndarm (SISmuc) unter Verwendung kommerzieller und PDX-abgeleiteter Zelllinien aufgebaut und hinsichtlich der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT), Stammzell-Eigenschaften, Proliferation, Invasion und c MYC-Expression sowie der Sensitivität gegenüber KRASG12C-Inhibitoren charakterisiert. Der in der Literatur für in vivo Modelle beschriebene Phänotyp von Lungentumoren mit KRAS-Mutationen und c-MYC-Überexpression in Bezug auf Invasion und Proliferation war in den SISmuc-Modellen reproduzierbar. Während in den 3D Modellen erhöhte Resistenz gegenüber zielgerichteten Therapien im Vergleich zu 2D beobachtet wurde, konnte eine verringerte Viabilität nach der Behandlung mit Kombinationstherapien ausschließlich in den 3D Modellen beobachtet werden. Im Test-System zeigten sich weder EMT noch die c-MYC-Expression als direkt prädiktiv für die Sensitivität gegenüber KRASG12C-Inhibitoren. Bei der Prüfung von verschiedenen Kombinationstherapien, wurde eine sensibilisierende Wirkung des Aurora-Kinase A (AURKA)-Inhibitors Alisertib für den KRASG12C-Inhibitor ARS-1620 beobachtet, welche direkt mit dem Grad der c-MYC-Expression in den entsprechenden 3D-Modellen korrelierte. Hierdurch konnte die Eignung von SISmuc Tumor Modellen als in vitro Test-System zur Patienten-Stratifizierung gezeigt werden, welches die Möglichkeit einer Reduktion von Tierversuchen birgt. Neben zielgerichteten Therapien ist die Behandlung von NSCLC mit onkolytischen Viren (OVs) ein vielversprechender Ansatz. Es mangelt jedoch an in vitro Modellen, um neue OVs in einer präklinischen Umgebung zu testen. Hierfür wurden 3D-NSCLC-Modelle auf der Grundlage der SISmuc bezüglich ihrer Eignung zur Durchführung von Wirksamkeits- und Risikobewertungen von OVs untersucht. Dabei zeigte die Infektion von Kokulturen aus Tumorzellen und Fibroblasten auf der SISmuc mit bereitgestellten Viren, dass die abgeschwächte Version des OV im Gegensatz zu einem auf dem Wildtyp des Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) basierenden OV eine Spezifität für NSCLC-Zellen mit einem fortgeschritteneren und stark proliferativen Phänotyp aufwies, während Fibroblasten sich für eine Infektion nicht länger permissiv zeigten. Dieser Ansatz stellt unter Beweis, dass SISmuc-Tumormodelle sich als neues Test-System zur in vitro Prüfung von OVs eignen. Schließlich wurde ein Arbeitsablauf zur Validierung der Wirksamkeit von Krebstherapien in 3D-Tumor-Sphäroiden für die Übertragung auf eine automatisierte Plattform auf der Grundlage eines zweiarmigen Robotersystems entwickelt. In einem Proof-of-Concept-Prozess wurden H358-Sphäroide charakterisiert und mit dem KRASG12C-Inhibitor ARS-1620 behandelt. Eine zeit- und dosisabhängige Reduktion der Sphäroid-Fläche nach der Behandlung wurde zusammen mit einer Lebend/Tot-Färbung als einfach durchzuführender und kostengünstiger Assay für automatisierte Medikamententests definiert, welche in situ in einer automatisierten Umgebung durchgeführt werden können. KW - Krebs KW - Tissue Engineering KW - Tumor models KW - Cancer KW - Targeted therapies KW - Automation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-310693 ER - TY - THES A1 - Nair, Radhika Karal T1 - Structural and biochemical characterization of USP28 inhibition by small molecule inhibitors T1 - Strukturelle und biochemische Charakterisierung der Hemmung von USP28 durch niedermolekulare Inhibitoren N2 - Ubiquitination is an important post-translational modification that maintains cellular homeostasis by regulating various biological processes. Deubiquitinases (DUBs) are enzymes that reverse the ubiquitination process by catalyzing the removal of ubiquitin from a substrate. Abnormal expression or function of DUBs is often associated with the onset and progression of various diseases, including cancer. Ubiquitin specific proteases (USPs), which constitute the largest family of DUBs in humans, have become the center of interest as potential targets in cancer therapy as many of them display increased activity or are overexpressed in a range of malignant tumors or the tumor microenvironment. Two related members of the USP family, USP28 and USP25, share high sequence identities but play diverse biological roles. USP28 regulates cell proliferation, oncogenesis, DNA damage repair and apoptosis, whereas USP25 is involved in the anti-viral response, innate immunity and ER-associated degradation in addition to carcinogenesis. USP28 and USP25 also exhibit different oligomeric states – while USP28 is a constitutively active dimer, USP25 assumes an auto-inhibited tetrameric structure. The catalytic domains of both USP28 and USP25 comprise the canonical, globular USP-domain but contain an additional, extended insertion site called USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID) that mediates oligomerization of the proteins. Disruption of the USP25 tetramer leads to the formation of an activated dimeric protein. However, it is still not clear what triggers its activation. Due to their role in maintaining and stabilizing numerous oncoproteins, USP28 and USP25 have emerged as interesting candidates for anti-cancer therapy. Recent advances in small-molecular inhibitor development have led to the discovery of relatively potent inhibitors of USP28 and USP25. This thesis focuses on the structural elucidation of USP28 and the biochemical characterization of USP28/USP25, both in complex with representatives of three out of the eight compound classes reported as USP28/USP25-specific inhibitors. The crystal structures of USP28 in complex with the AZ compounds, Vismodegib and FT206 reveal that all three inhibitor classes bind into the same allosteric pocket distant from the catalytic center, located between the palm and the thumb subdomains (the S1-site). Intriguingly, this binding pocket is identical to the UCID-tip binding interface in the USP25 tetramer, rendering the protein in a locked, inactive conformation. Formation of the binding pocket in USP28 requires a shift in the helix α5, which induces conformational changes and local distortion of the binding channel that typically accommodates the C-terminal tail of Ubiquitin, thus preventing catalysis and abrogating USP28 activity. The key residues of the USP28-inhibitor binding pocket are highly conserved in USP25. Mutagenesis studies of these residues accompanied by biochemical and biophysical assays confirm the proposed mechanism of inhibition and similar binding to USP25. This work provides valuable insights into the inhibition mechanism of the small molecule compounds specifically for the DUBs USP28 and USP25. The USP28-inhibitor complex structures offer a framework to develop more specific and potent inhibitors. N2 - Ubiquitinierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation, die die zelluläre Homöostase aufrechterhält, indem sie verschiedene biologische Prozesse reguliert. Deubiquitinasen (DUBs) sind Enzyme, die den Ubiquitinierungsprozess umkehren, indem sie die Entfernung von Ubiquitin von einem Substrat katalysieren. Eine abnorme Expression oder Funktion von DUBs wird häufig mit dem Auftreten und Fortschreiten verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht. Ubiquitin-spezifische Proteasen (USPs), die im Menschen die größte Familie der DUBs bilden, sind als potenzielle Ziele in der Krebstherapie von besonderem Interesse, da viele von ihnen in bösartigen Tumoren oder deren Mikroumgebung abnormal aktiv oder überexprimiert sind. Die zwei eng verwandten Mitglieder der USP-Familie, USP28 und USP25, weisen eine hohe Sequenzidentität auf, sind aber an unterschiedlichen biologischen Prozessen beteiligt. USP28 reguliert die Zellproliferation, die Onkogenese, die Reparatur von DNA-Schäden und die Apoptose, während USP25 eine Rolle bei der antiviralen Reaktion, der angeborenen Immunität, dem ER-assoziierten Abbau und der Carcinogenese spielt. USP28 und USP25 weisen auch unterschiedliche oligomere Zustände auf. Während USP28 ein konstitutiv aktives Dimer bildet, tritt USP25 als auto-inhibiertes Tetramer auf. Strukturell bestehen die katalytischen Domänen sowohl von USP28 als auch von USP25 aus der kanonischen globulären USP-Domäne enthalten jedoch eine zusätzliche Insertion, die als „USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID)“ bezeichnet wird und die Oligomerisierung der Proteine vermittelt. Die Dissoziation des USP25 Tetramers in Dimere führt zu einem aktivierten USP25-Protein. Es ist jedoch immer noch nicht klar, was seine Aktivierung auslöst. Aufgrund ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung und Stabilisierung zahlreicher Onkoproteine haben sich USP28 und USP25 als interessante Kandidaten für die Entwicklung von Medikamenten in der Krebstherapie erwiesen. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung von niedermolekularen Inhibitoren haben zur Entdeckung von relativ potenten Inhibitoren von USP28 und USP25 geführt. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Strukturaufklärung von USP28 und die biochemische Charakterisierung von USP28/USP25, beide im Komplex mit Vertretern von drei der acht Verbindungsklassen, die als USP28/USP25-spezifische Inhibitoren bekannt sind. Die Kristallstrukturen von USP28 im Komplex mit den AZ-Verbindungen, Vismodegib und FT206 zeigen, dass alle Inhibitoren in einer ähnlichen Region an USP28 binden - einer allosterischen Tasche, die in der Nähe des katalytischen Zentrums liegt und sich zwischen der Handflächen- und der Daumen-Subdomäne befindet. Diese Bindungstasche ist identisch mit der Position, an der der „UCID-tip“ im USP25-Tetramer bindet und das Protein in eine verschränkte, inaktive Konformation versetzt. Die Bildung der Bindungstasche in USP28 erfordert eine Verschiebung der α5-Helix, die zu Konformationsänderungen und einer lokalen Verzerrung des Bindungskanalsführt, der normalerweise den C-terminus des Ubiquitin-Moleküls bindet und so die Katalyse verhindert und die Aktivität von USP28 hemmt. Die Schlüsselreste der USP28-Inhibitor-Bindungstasche sind in USP25 hoch konserviert. Mutagenese-Studien dieser Aminosäuren, begleitet von biochemischen und biophysikalischen Analysen, bestätigen den vorgeschlagenen Mechanismus der Hemmung und eine ähnliche Bindung der Inhibitoren an USP25. Diese Arbeit liefert wertvolle Einblicke in den Hemmungsmechanismus der Kleinmolekülverbindungen, die spezifisch für die DUBs USP28 und USP25 entwickelt worden sind. Die Strukturen der USP28-Inhibitor-Komplexe bieten eine Grundlage für die zukünftige Entwicklung spezifischerer und wirksamerer Inhibitoren. KW - USP KW - Inhibition KW - enzyme KW - crystallography KW - Unique Selling Proposition KW - Inhibition KW - Enzym KW - Kristallographie Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281742 ER - TY - JOUR A1 - Lu, Yuan A1 - Boswell, Wiliam A1 - Boswell, Mikki A1 - Klotz, Barbara A1 - Kneitz, Susanne A1 - Regneri, Janine A1 - Savage, Markita A1 - Mendoza, Cristina A1 - Postlethwait, John A1 - Warren, Wesley C. A1 - Schartl, Manfred A1 - Walter, Ronald B. T1 - Application of the Transcriptional Disease Signature (TDSs) to Screen Melanoma-Effective Compounds in a Small Fish Model JF - Scientific Reports N2 - Cell culture and protein target-based compound screening strategies, though broadly utilized in selecting candidate compounds, often fail to eliminate candidate compounds with non-target effects and/or safety concerns until late in the drug developmental process. Phenotype screening using intact research animals is attractive because it can help identify small molecule candidate compounds that have a high probability of proceeding to clinical use. Most FDA approved, first-in-class small molecules were identified from phenotypic screening. However, phenotypic screening using rodent models is labor intensive, low-throughput, and very expensive. As a novel alternative for small molecule screening, we have been developing gene expression disease profiles, termed the Transcriptional Disease Signature (TDS), as readout of small molecule screens for therapeutic molecules. In this concept, compounds that can reverse, or otherwise affect known disease-associated gene expression patterns in whole animals may be rapidly identified for more detailed downstream direct testing of their efficacy and mode of action. To establish proof of concept for this screening strategy, we employed a transgenic strain of a small aquarium fish, medaka (Oryzias latipes), that overexpresses the malignant melanoma driver gene xmrk, a mutant egfr gene, that is driven by a pigment cell-specific mitf promoter. In this model, melanoma develops with 100% penetrance. Using the transgenic medaka malignant melanoma model, we established a screening system that employs the NanoString nCounter platform to quantify gene expression within custom sets of TDS gene targets that we had previously shown to exhibit differential transcription among xmrk-transgenic and wild-type medaka. Compound-modulated gene expression was identified using an internet-accessible custom-built data processing pipeline. The effect of a given drug on the entire TDS profile was estimated by comparing compound-modulated genes in the TDS using an activation Z-score and Kolmogorov-Smirnov statistics. TDS gene probes were designed that target common signaling pathways that include proliferation, development, toxicity, immune function, metabolism and detoxification. These pathways may be utilized to evaluate candidate compounds for potential favorable, or unfavorable, effects on melanoma-associated gene expression. Here we present the logistics of using medaka to screen compounds, as well as, the development of a user-friendly NanoString data analysis pipeline to support feasibility of this novel TDS drug-screening strategy. KW - bioinformatics KW - phenotypic screening Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237322 VL - 9 ER - TY - THES A1 - Karwen, Till T1 - Platelets promote insulin secretion of pancreatic β-cells T1 - Thrombozyten fördern die Insulinsekretion von pankreatischen β-Zellen N2 - The pancreas is the key organ for the maintenance of euglycemia. This is regulated in particular by α-cell-derived glucagon and β-cell-derived insulin, which are released in response to nutrient deficiency and elevated glucose levels, respectively. Although glucose is the main regulator of insulin secretion, it is significantly enhanced by various potentiators. Platelets are anucleate cell fragments in the bloodstream that are essential for hemostasis to prevent and stop bleeding events. Besides their classical role, platelets were implemented to be crucial for other physiological and pathophysiological processes, such as cancer progression, immune defense, and angiogenesis. Platelets from diabetic patients often present increased reactivity and basal activation. Interestingly, platelets store and release several substances that have been reported to potentiate insulin secretion by β-cells. For these reasons, the impact of platelets on β-cell functioning was investigated in this thesis. Here it was shown that both glucose and a β-cell-derived substance/s promote platelet activation and binding to collagen. Additionally, platelet adhesion specifically to the microvasculature of pancreatic islets was revealed, supporting the hypothesis of their influence on glucose homeostasis. Genetic or pharmacological ablation of platelet functioning and platelet depletion consistently resulted in reduced insulin secretion and associated glucose intolerance. Further, the platelet-derived lipid fraction was found to enhance glucose-stimulated insulin secretion, with 20-hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE) and possibly also lyso-precursor of platelet-activating factor (lysoPAF) being identified as crucial factors. However, the acute platelet-stimulated insulin secretion was found to decline with age, as did the levels of platelet-derived 20-HETE. In addition to their direct stimulatory effect on insulin secretion, specific defects in platelet activation have also been shown to affect glucose homeostasis by potentially influencing islet vascular development. Taking together, the results of this thesis suggest a direct and indirect mechanism of platelets in the regulation of insulin secretion that ensures glucose homeostasis, especially in young individuals. N2 - Der Pankreas ist das Schlüsselorgan für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase. Diese wird insbesondere durch das von α-Zellen stammende Glukagon und von β-Zellen stammende Insulin reguliert, die als Reaktion auf Nährstoffmangel beziehungsweise erhöhte Glukosespiegel freigesetzt werden. Obwohl Glukose der Hauptregulator der Insulinsekretion ist, wird sie durch verschiedene Potentiatoren erheblich gesteigert. Thrombozyten sind kernlose Zellfragmente im Blutkreislauf, die für die Hämostase unerlässlich sind. Neben ihrer klassischen Funktion sind sie auch an anderen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt, etwa an der Tumorentwicklung, der Immunabwehr und der Angiogenese. Thrombozyten von Diabetikern weisen häufig eine erhöhte Reaktivität und basale Aktivierung auf. Außerdem speichern und sekretieren sie Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie die Insulinsekretion durch β-Zellen verstärken. Aus diesen Gründen wurde in dieser Arbeit der Einfluss von Thrombozyten auf die Funktion von β-Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Glukose als auch eine aus β-Zellen stammende Substanz/en die Thrombozytenaktivierung und die Bindung an Kollagen fördern. Darüber hinaus wurde eine spezifische Thrombozytenadhäsion an der Mikrovaskulatur der pankreatischen Inseln festgestellt, was die Hypothese ihres Einflusses auf die Glukosehomöostase unterstützt. Eine genetische oder pharmakologische Ablation der Thrombozytenfunktion sowie eine Depletion von Thrombozyten führten zu einer verminderten Insulinsekretion und einer damit verbundenen Glukoseintoleranz. Hierbei erwies sich die Lipidfraktion von Thrombozyten als essentieller Potentiator für die glukosestimulierte Insulinsekretion, wobei 20-Hydroxyeicosatetraensäure (20-HETE) und die Lyso-Vorstufe des Plättchen-Aktivierenden Faktors (LysoPAF) als entscheidende Faktoren identifiziert werden konnten. Weiterhin wurde festgestellt, dass sowohl der direkte stimulierende Effekt von Thrombozyten auf die Insulinsekretion, als auch deren 20-HETE Sekretion mit zunehmendem Alter abnimmt. Thrombozyten beeinflussten außerdem die Inselvaskularisierung, welche mutmaßlich zusätzlich zu Glukoseintoleranz führt. Insgesamt deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf einen direkten und indirekten Mechanismus der Thrombozyten bei der Regulierung der Insulinsekretion hin, der die Glukosehomöostase insbesondere bei jungen Menschen gewährleistet. KW - platelet KW - β cell KW - insulin KW - pancreas KW - diabetes KW - Thrombozyt KW - Insulinsekretion Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313933 ER -