TY - THES A1 - Alonso Cañizal, Maria Consuelo T1 - Detection of ligand dependent Frizzled conformational changes T1 - Nachweis von Liganden-abhängigen Frizzled Konformationsänderungen N2 - Frizzled (FZD) are highly conserved receptors that belong to class F of the G protein-coupled receptor (GPCR) superfamily. They are involved in a great variety of processes during embryonic development, organogenesis, and adult tissue homeostasis. In particular, FZD5 is an important therapeutic target due to its involvement in several pathologies, such as tumorigenesis. Nevertheless, little is known regarding the activation of FZD receptors and the signal initiation, and their GPCR nature has been debated. In order to investigate the activation mechanism of these receptors, FRET (Förster Resonance Energy Transfer)-based biosensors for FZD5 have been developed and characterized. A cyan fluorescent protein (CFP) was fused to the C-terminus of the receptor and the specific FlAsH-binding sequence (CCPGCC) was inserted within the 2nd or the 3rd intracellular loop. Single-cell FRET experiments performed using one of these sensors, V5-mFZD5-FlAsH436-CFP, reported structural rearrangements in FZD5 upon stimulation with the endogenous ligand WNT-5A. These movements are similar to those observed in other GPCRs using the same technique, which suggests an activation mechanism for FZD reminiscent of GPCRs. Furthermore, stimulation of the FZD5 FRET-based sensor with various recombinant WNT proteins in a microplate FRET reader allowed to obtain concentration-response curves for several ligands, being possible to distinguish between full and partial agonists. This technology allowed to address the selectivity between WNTs and FZD5 using a full-length receptor in living cells. In addition, G protein FRET-based sensors revealed that WNT-5A specifically induced Gαq activation mediated by FZD5, but not Gαi activation. Other WNT proteins were also able to induce Gαq activation, but with lower efficacy than WNT-5A. In addition, a dual DAG/calcium sensor further showed that WNT-5A stimulation led to the activation of the Gαq-dependent signaling pathway mediated by FZD5, which outcome was the activation of Protein Kinase C (PKC) and the release of intracellular calcium. Altogether, these data provide evidence that the activation process of FZD5 resembles the general characteristics of class A and B GPCR activation, and this receptor also mediates the activation of the heterotrimeric Gαq protein and its downstream signaling pathway. In addition, the FZD5 receptor FRET-based sensor provides a valuable tool to characterize the pharmacological properties of WNTs and other potential ligands for this receptor. N2 - Frizzled (FZD) sind hochkonservierte Rezeptoren welche zur Klasse F der G- Protein-gekoppelte Rezeptor Superfamilie gehören. Diese haben wichtige Funktionen in verschiedenen physiologischen Prozessen wie zum Beispiel Embryonalentwicklung, Organogenese und adulte Gewebe-homöostase. FZD5 ist aufgrund seiner Beteiligung an verschiedenen pathologischen Prozessen wie der Tumorgenese ein wichtiges therapeutisches Ziel. Jedoch ist über die Aktivierung und Signalauslösung der FZD Rezeptoren sehr wenig bekannt und deren GPCR Eigenschaften sind umstritten. Um den Aktivierungsmechanismus dieser Rezeptoren zu untersuchen, wurden FRET (Förster Resonance Energy Transfer)-basierte FZD5 Biosensoren entwickelt und charakterisiert. Ein cyan fluoreszierendes Protein (CFP) wurde an den C-Terminus des Rezeptors fusioniert und die FlAsH-bindende Sequenz (CCPGCC) wurde im 2. oder 3. intrazellulären Loop eingefügt. Einzel-zell FRET Versuche mit dem Sensor V5-mFZD5-FlAsH436-CFP haben gezeigt, dass Stimulation mit dem endogenen Ligand WNT-5A zur FZD5 Konformationsänderungen führt. Diese Konformationsänderungen sind ähnlich wie bei anderen GPCRs, was darauf hinweist, dass der FZD Aktivierungsmechanismus vergleichbar mit dem von GPCRs ist. Außerdem wurde der FZD5 FRET-basierter Sensor mit verschiedenen rekombinierten WNT Proteinen stimuliert und mit einem FRET-Platten Reader gemessen, was die Erstellung von Konzentrations - Wirkungskurven und die Unterscheidung zwischen Voll- und Partialagonisten ermöglichte. Diese Methode erlaubte es, die Selektivität zwischen WNTs und FZD5 mittels des Volllängenrezeptors in lebenden Zellen zu untersuchen. Zudem haben G-Protein FRET-basierte Sensoren gezeigt, dass WNT-5A die FZD5 vermittelte Gαq Aktivierung jedoch nicht die Gαi Aktivierung spezifisch induziert. Andere WNT Proteine können auch die Gαq Aktivierung induzieren aber mit geringerer Effizienz als WNT-5A. Ein doppelter DAG/Calcium Sensor hat zudem gezeigt, dass WNT-5A Stimulation zu einer durch FZD5 vermittelten Aktivierung der Gαq-abhängigen Signaltransduktionkaskade führt, was zur Aktivierung der Protein Kinase C (PKC) und zur Freisetzung intrazellulären Calciums führt. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit die Ähnlichkeit des FZD5 Rezeptors zur Klasse A und B der GPCRs bezüglich allgemeinen Eigenschaften und Aktivierung verdeutlicht. Zudem vermittelt dieser Rezeptor die Aktivierung der Gαq-abhängigen Signaltransduktionkaskade. Ein FZD5 Rezeptor FRET-basierter Sensor stellt ein wertvolles Werkzeug zur pharmakologischen Charakterisierung der WNTs und anderer potentiellen FZD5 Liganden dar. KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Wnt-Proteine KW - Frizzled 5 KW - WNT KW - FRET Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178335 ER - TY - THES A1 - Stumpf, Anette D. T1 - Development of fluorescent FRET receptor sensors for investigation of conformational changes in adenosine A1 and A2A receptors T1 - Entwicklung fluoreszenter FRET Rezeptor-Sensoren zur Untersuchung von Konformationsänderungen in Adenosin A1 und A2A Rezeptoren N2 - Adenosine receptors that belong to the rhodopsin-like G protein-coupled receptors (GPCRs) are involved in a lot of regulatory processes and are widely distributed throughout the body which makes them an attractive target for drugs. However, pharmacological knowledge of these receptors is still limited. A big advance regarding the structural knowledge of adenosine receptors was the development of the first crystal structure of the adenosine A2A receptor in 2008. The crystal structure revealed the amino acids that form the ligand binding pocket of the receptor and depicted the endpoint of receptor movement in the ligand binding process. Within the scope of this work two members of the adenosine receptor family were investigated, namely the adenosine A1 and the A2A receptor (A1R, A2AR). A1R was generated on base of the previously developed A2AR. Receptors were tagged with fluorophores, with the cyan fluorescent protein (CFP) at the C-terminal end of receptor and the Fluorescein Arsenical Hairpin binder (FlAsH) binding sequence within the third intracellular loop of receptors. Resulting fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were investigated with help of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) measurements within living cells. FRET experiments enable the examination of alteration in the distance of two fluorophores and thus the observation of receptor dynamical movements. For comparison of A1R and A2AR regarding receptor dynamical movement upon ligand binding, fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were superfused with various ligands and the outcomes of FRET experiments were compared regarding signal height of FRET ratio evoked by the distinct ligand that is correlated to the conformational change of receptor upon ligand binding. Beside the different direction of FRET ratio upon ligand binding at A1R and A2AR sensor, there were differences observable when signal height and association and dissociation kinetics of the various ligands investigated were compared to each other. Differences between the adenosine receptor subtypes were especially remarkable for the A1R subtype selective agonist CPA and the A2AR subtype selective agonist CGS 21680. Another part of the project was to investigate the influence of single amino acids in the ligand binding process within the fluorescent A1R sensor. Amino acid positions were derived from the crystal structure of the A2AR forming the ligand binding pocket and these amino acids were mutated in the A1R structure. Investigation of the A1R sensor and its mutants regarding confocal analysis showed involvement of some amino acids in receptor localization. When these amino acids were mutated receptors were not expressed in the plasma membrane of cells. Some amino acids investigated were found to be involved in the ligand binding process in general whereas other amino acids were found to have an influence on the binding of distinct structural groups of the ligands investigated. In a further step, A1R and A2AR were N-terminally tagged with SNAP or CLIP which allowed to label receptor sensors with multiple fluorophores. With this technique receptor distribution in cells could be investigated with help of confocal analysis. Furthermore, ligand binding with fluorescent adenosine receptor ligands and their competition with help of a non-fluorescent antagonist was examined at the SNAP tagged A1R and A2AR. Finally the previously developed receptor sensors were combined to the triple labeled receptor sensors SNAP A1 Fl3 CFP and SNAP A2A Fl3 CFP which were functional regarding FRET experiments and plasma membrane expression was confirmed via confocal analysis. In the future, with the help of this technique, interaction between fluorescent ligand and SNAP tagged receptor can be monitored simultaneously with the receptor movement that is indicated by the distance alteration between FlAsH and CFP. This can lead to a better understanding of receptor function and its dynamical movement upon ligand binding which may contribute to the development of new and more specific drugs for the A1R and A2AR in the future. N2 - Adenosin Rezeptoren, die zur Gruppe der Rhodopsin-ähnlichen G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gehören, sind in eine Vielzahl regulatorischer Prozesse eingebunden und weit im Körper verbreitet. Das macht sie zu einer interessanten Zielstruktur für Arzneistoffe. Das Wissen über die Struktur der Adenosin Rezeptoren ist jedoch noch begrenzt. Ein großer Fortschritt zu mehr strukturellem Wissen war die Entwicklung der ersten Kristallstruktur des Adenosin A2A Rezeptors im Jahr 2008. Mit der Kristallstruktur wurden die Aminosäuren bekannt, die die Ligandenbindetasche dieses Rezeptors formen. Zudem gab die Kristallstruktur Einblick in den Endpunkt der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung. Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden zwei Mitglieder der Adenosin Rezeptor Familie, der Adenosin A1 Rezeptor und der Adenosin A2A Rezeptor (A1R, A2AR), genauer untersucht. Der A1R wurde auf Basis des vor kurzem veröffentlichten A2AR entwickelt. Die Rezeptoren wurden mit Fluorophoren versehen, zum einen mit dem cyan fluoreszierenden Protein (CFP) am C-Terminus des Rezeptors und zum anderen mit der Bindesequenz des kleinen Fluorophors "Fluorescein Arsenical Hairpin binder" (FlAsH) in der dritten intrazellulären Schleife des Rezeptors. Die daraus resultierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP wurden mit Hilfe des Fluoreszenz Resonanz Energie Transfers (FRET) in lebenden Zellen erforscht. FRET Messungen ermöglichen es, eine Änderung der Distanz zwischen den beiden Fluorophoren und damit Rezeptorbewegungen zu untersuchen. Um A1R und A2AR bezüglich dynamischer Rezeptorbewegungen nach Ligandenbindung vergleichen zu können, wurden die fluoreszierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP mit verschiedenen Liganden umspült. Die Ergebnisse der FRET Messungen bezüglich ihrer Höhe des FRET Ratio wurden verglichen, welche mit der Konformationsänderung des Rezeptors nach Ligandenbindung zusammenhängt. Neben der unterschiedlichen Richtung des FRET Ratio nach Ligandenbindung am A1R und A2AR Sensor waren Unterschiede bezüglich der Signalhöhe und der Bindungs- und Dissoziationskinetiken feststellbar, wenn die verschiedenen Liganden miteinander verglichen wurden. Unterschiede zwischen den Adenosin Rezeptor Subtypen waren speziell für den A1R subtypselektiven Agonist CPA und für den A2AR subtypselektiven Agonist CGS 21680 feststellbar. Einen weiteren Punkt in diesem Projekt stellte die Erforschung des Einflusses, den einzelne Aminosäuren im fluoreszierenden A1R Sensor auf den Prozess der Ligandenbindung haben, dar. Die Position der Aminosäuren wurde der Kristallstruktur des A2AR entnommen und entsprechende Aminosäuren im A1R mutiert. Die konfokalmikroskopische Analyse des A1R Sensors und seiner Mutanten ergab, dass einige Aminosäuren direkt an der zellulären Expression des Rezeptors beteiligt waren. Wurden diese Aminosäuren mutiert, wurde der Rezeptor nicht in der Plasmamembran der Zellen exprimiert. Einige Aminosäuren die untersucht wurden,hatten einen generellen Einfluss auf die Bindung der Liganden, andere Aminosäuren hatten mehr Einfluss auf die Bindung bestimmter struktureller Gruppen der untersuchten Liganden. In einem weiteren Schritt wurden A1R und A2AR am N-terminalen Rezeptorende mit SNAP oder CLIP versehen, was eine Markierung der Rezeptoren mit einer Vielzahl an Fluorophoren erlaubt. Mit Hilfe dieser Technik konnte die Verteilung der Rezeptoren in der Zelle mit konfokaler Mikroskopie untersucht werden. Des Weiteren wurde die Bindung von fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Liganden und deren Verdrängung mit einem nicht-fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Antagonist erforscht. Am Ende des Projekts wurden die zuvor beschriebenen fluoreszierenden Rezeptorsensoren zu dreifach fluorophormarkierten Rezeptorsensoren kombiniert, was zu den Sensoren SNAP A1 Fl3 CFP und SNAP A2A Fl3 CFP führte. Beide Rezeptorsensoren waren funktionell bezüglich FRET Experimenten und der Expression in der Plasmamembran der Zellen. In Zukunft können mit dieser Methode gleichzeitig die Bindung von fluoreszierenden Liganden am SNAP-markierten Rezeptor, so wie die Rezeptorbewegung beobachtet werden, die durch eine Distanzänderung zwischen CFP und FlAsH angezeigt wird. Das kann zu einem besseren Verständnis der Rezeptorfunktion und der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung führen, die in Zukunft zur Entwicklung spezifischerer Wirkstoffe am A1R und A2AR beitragen könnte. KW - Adenosinrezeptor KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Adenosine receptors Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125469 ER - TY - THES A1 - Pollinger, Thomas T1 - Spatiotemporale Organisation der Interaktion von Gq Protein-Untereinheiten und der Phospholipase Cβ3 T1 - Spatiotemporal patterns of interaction of Gq protein subunits and phospholipase Cβ3 N2 - Die G-Protein vermittelte Aktivierung der Phospholipase Cβ (PLCβ) stellt einen primären Mechanismus dar, um eine Vielzahl von physiologischen Ereignissen zu regulieren, z.B. die Kontraktion glatter Muskelzellen, Sekretion oder die Modulation der synaptischen Transmission. Sowohl Gαq- als auch Gβγ-Untereinheiten sind dafür bekannt mit PLCβ Enzymen zu interagieren und diese zu aktivieren. Über die Dynamik dieser Interaktion und den relative Beitrag der G-Protein Untereinheiten ist jedoch nur wenig bekannt. Unter Verwendung Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)- basierter Methoden in lebenden Zellen, wurde die Kinetik der Rezeptor-induzierten Interaktion zwischen Gβγ und Gαq Untereinheiten, die Interaktion von sowohl der Gαq als auch der Gβγ-Untereinheit mit der PLCβ3 und die Interaktion des regulator of G-Protein signaling 2 (RGS2) mit Gαq-Untereinheiten untersucht. Um die Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion auf die Zellmembran zu beschränken, wurde die Total-Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie angewandt. Zeitlich hoch auflösendes, ratiometrisches FRET-Imaging offenbarte eine deutlich schnellere Dissoziation von Gαq und PLCβ3 nach Entzug purinerger Agonisten verglichen mit der Deaktivierung von Gq Proteinen in der Abwesenheit der PLCβ3. Dieser offensichtliche Unterschied in der Kinetik kann durch die GTPase-aktivierende Eigenschaft der PLCβ3 in lebenden Zellen erklärt werden. Weiterhin zeigte es sich, dass PLCβ3 die Gq Protein Kinetik in einem ähnlich Ausmaß beeinflusst wie RGS2, welches in vitro deutlich effizienter darin ist, die intrinsische GTPase Aktivität der Gαq-Untereinheit zu beschleunigen. Als Antwort auf die Rezeptorstimulation wurde sowohl eine Interaktion von Gαq-Untereinheiten als auch von Gq-abstammende Gβγ-Untereinheiten mit der PLCβ3 beobachtet. Darüber hinaus zeigte sich auch eine Agonist-abhängige Interaktion von Gαq und RGS2. In Abwesenheit einer Rezeptorstimulation konnte kein spezifisches FRET-Signal zwischen Gq Proteinen und der PLCβ3 oder RGS2 detektiert werden. Zusammengefasst ermöglichte das ratiometrische FRET-Imaging in der TIRF Mikroskopie neue Einsichten in die Dynamik und Interaktionsmuster des Gq-Signalwegs. N2 - G protein-mediated activation of phospholipase Cβ (PLCβ) represents a primary mechanism to regulate many physiological events such induce smooth muscle contraction, secretion and modulation of synaptic transmission. Both Gαq- and Gβγ-subunits are known to interact and activate PLCβ enzymes, however little is known about the dynamics of this interactions and the relative contribution of the G protein subunits in intact cells. Using fluorescence resonance energy transfer- (FRET-) based assays in single intact cells we studies kinetics of receptor-induced interactions between Gβγ- and Gαq-subunits, interactions of both Gαq and Gβγ with PLCβ3 as well as interactions of regulator of G proteins signalling 2 (RGS2) with Gαq- and Gβγ-subunits. In order to restrict the protein/protein interaction studies to the cell membrane we applied total internal reflection (TIRF) microscopy. High temporal resolution ratiometric FRET imaging uncovered a markedly faster dissociation of Gαq and PLC upon withdrawal of purinergic agonists compared to the deactivation of Gq proteins in the absence of PLCβ3. This apparent difference in kinetics could be contributed to the GTPase-activating property of PLCβ3 in living cells. Furthermore we found that PLCβ3 modulated Gq protein kinetics to a similar extent compared to RGS2, which in vitro is about 100 fold more efficient in activating Gq-GTPase activity. We observed that both Gαq subunits and Gq-derived Gβγ-subunits interact with PLCβ3 in response to receptor stimulation. In the absence of receptor stimulation we did neither detect any specific FRET signals between Gq protein subunits and PLCβ3 nor did we detect any interactions between RGS2 and Gαq subunits. Finally we could not detect agonist- dependent FRET between RGS2 and Gβγ-subunits. Taken together, ratiometric FRET-imaging under conditions of TIRF allowed new insights into dynamics and interaction patterns within the Gq signalling pathway. KW - TIRF KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Phospholipase C KW - Gq-Protein KW - RGS2 KW - PLCβ3 KW - TIRF KW - FRET KW - Gq-Protein KW - RGS2 KW - PLCβ3 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71884 ER - TY - THES A1 - Schickinger, Stefanie T1 - Funktionsanalyse alpha2-adrenerger Rezeptoren auf molekularer und transgener Ebene T1 - Analysis of functions of alpha2-adrenergic receptors at molecular and transgenic levels N2 - alpha2-adrenerge Rezeptoren, von denen drei verschiedene Subtypen (alpha2A, alpha2B, alpha2C) kloniert wurden, gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und vermitteln vielfältige physiologische Funktionen der Transmitter Adrenalin und Noradrenalin. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Rezeptorsubtypen, die subzelluläre Lokalisation von Rezeptoren oder der Differenzierungsstatus einer Zelle für die funktionelle Diversität der alpha2-Rezeptor-Effekte in vivo verantwortlich sind. Im ersten Teil des Projektes wurde ein transgenes Mausmodell untersucht, bei dem selektiv alpha2A-Rezeptoren unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase Promotors in adrenergen Neuronen exprimiert wurden. In diesem Modell sollte getestet werden, ob ein einzelner Rezeptorsubtyp in den verschiedenen Neuronen des sympathischen Nervensystems in vivo identische Funktionen hat. Transgene alpha2A-Rezeptoren hemmten in vivo zwar die Freisetzung von Noradrenalin aus sympathischen Nervenfasern nicht aber die Exozytose von Adrenalin aus dem Nebennierenmark. Deshalb stellte sich die Frage, ob die Rezeptorfunktion von der Morphologie, dem Differenzierungsstatus der Zellen oder von der subzellulären Lokalisation der Rezeptoren abhängt. Hierfür wurden alpha2A-Rezeptoren durch Varianten des grün fluoreszierenden Proteins markiert und mittels FRET-Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In PC12 Phäochromozytomzellen, die durch NGF zum Auswachsen neuronaler Fortsätze stimuliert wurden, waren die Agonist-bedingten Konformationsänderungen von alpha2A-Rezeptoren jedoch weder vom Differenzierungsstatus der Zellen noch von deren subzellulärer Lokalisation abhängig. Lediglich in transient transfizierten Zellen waren im Vergleich zu stabil transfizierten Zellen höhere Agonist-Konzentrationen zur Rezeptoraktivierung erforderlich. Diese Befunde zeigen, dass zusätzlich zur Diversität der Rezeptorsubtypen auf Proteinebene der zelluläre Kontext, in dem ein Rezeptor exprimiert wird, eine ganz wesentliche Rolle für dessen Funktion spielt. N2 - alpha2-adrenergic receptors of which three different subtypes were cloned (alpha2A, alpha2B, alpha2C), are part of the family of G-protein coupled receptors and mediate many physiological functions of the transmitters adrenaline and noradrenaline. This study was initiated to determine whether receptor subtypes, their subcellular localization or the status of differentiation of a cell are responsible for the functional diversity of effects of alpha2-adrenergic receptors in vivo. In the first part of this project a transgenic mouse model was characterized, in which alpha2-adrenergic receptors were expressed under control of the dopamine-beta-hydroxylase-promotor in adrenergic neurons selectively. This model was used to test whether a single receptor subtype has identical functions in different neurons of the sympathetic nervous system in vivo. Transgenic alpha2A-adrenergic receptors inhibited the release of noradrenaline from sympathetic nerves in vivo, but not the exocytosis of adrenaline from the adrenal medulla. Therefore the question arose whether the functions of receptors are dependent on cell morphology, the status of differentiation of cells or the subcellular localization of receptors. To address this question, alpha2A-receptors were tagged with variants of the green fluorescent protein and investigated by means of FRET fluorescence microscopy. In PC12 rat pheochromocytoma cells which were stimulated by nerve growth factor to develop neurites, the conformational changes of alpha2A-adrenergic receptors upon agonist activation, however, did not dependent on the status of cellular differentiation or on the subcellular localization of receptors. Only in transiently transfected cells, higher agonist concentrations were necessary for the activation of receptors as determined by FRET microscopy. These findings demonstrate that the cellular context in which receptor subtypes are expressed play an essential role for their function. KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Adrenergisches System KW - Alpha-2-Rezeptor KW - Transgene Tiere KW - Grün fluoreszierendes Protein KW - Sympathikus KW - Noradrenalin KW - Adrenalin KW - G-Protein-gekoppelter-Rezeptor KW - Dopamin-beta-Hydroxylase Promotor KW - Phäochromozytomzellen KW - G-protein coupled receptor KW - dopamine-beta-hydroxylase-promotor KW - pheochromocytoma cells Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31667 ER -