TY - THES A1 - Hausmann, Michael Franz Toni T1 - Untersuchungen zum Differenzierungspotential humaner Monozyten / Makrophagen in vitro T1 - A study: The Potential of human monocyte / macrophage-differentiation in vitro N2 - Unter dem Einfluss von M-CSF und GM-CSF entwickeln sich CD14-positive periphere humane Blutmonozyten zu CD68-positiven M-CSF- bzw. GM-CSF-Makrophagen. M-CSF-Makrophagen lassen sich mit INFg und LPS zu klassisch aktivierten M1-Makrophagen, oder mit IL-4 und IL-10 zu alternativ aktivierten M2-Makrophagen differenzieren. Durch GM-CSF werden aus Monozyten GM-CSF-Makrophagen induziert. Im Gegensatz zu M1-Makrophagen sind GM1-Makrophagen bisher noch wenig untersucht. Mit INFg und LPS werden GM-CSF-Makrophagen zu GM1-Makrophagen aktivert. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, wie groß die Übereinstimmung zwischen M-CSF- und M2-Makrophagen sowie zwischen GM-CSF- und M1-Makrophagen / GM1-Makrophagen ist. Im Gegensatz zu M-CSF- und GM-CSF stellt Laktat aber keinen Differenzierungsfaktor für Monozyten dar. Jedoch beeinflusst Laktat den Phänotyp von M2-Makrophagen und hemmt die Ausschüttung von IL-12 und NO durch M1- und GM1-Makrophagen. N2 - In the presence of M-CSF and GM-CSF CD14-positive human blood monocytes develop into CD68-pos M-CSF- or GM-CSF-macrophages. M-CSF-macrophages differentiate when incubated with INFg and LPS to classicly activated M1-marophages, when incubated with IL-4 and IL-10 zu alternativly activated M2-macrophages. Monocytes presented to GM-CSF eventually become GM-CSF-macrophages. There are only few examinations of GM-CSF-macrophages and classicly activated GM1-macrophages compared to M1-macrophages. In this study we focused on comparing the non-activated M-CSF-macrophages to alternativly activated M2-macrophages and non-activated GM-CSF-macrophages to classicly activated GM1-macrophages/M1-macrophages. Furthermore we point out that lactate is not a potential differentiation-signal für monocytes. But lactate does infact interfere with certain macrophage-phenotypes and the secretion of proinflammatory IL-12 and NO-molecules. KW - Differenzierung KW - Makrophage KW - Monozyt KW - Mensch KW - Zellkultur KW - differentiation KW - macrophage KW - monocyte KW - human KW - in-vitro Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77801 ER - TY - THES A1 - Polzin, Silke T1 - Lebensalterschätzung aus biologischem Material anhand der 4.977 bp-Deletion in menschlicher mitochondrialer DNA T1 - Age estimation from biological material based on 4,977 bp-deletion in human mitochondrial DNA N2 - Neben der Frage nach dem Lebensalter als Kriterium zur Identifizierung unbekannter Leichen und menschlicher Überreste, wird der Bedarf einer Altersschätzung an lebenden Personen derzeit immer größer. Hinzu kommt die Hoffnung, aus Spuren Rückschlüsse auf das Alter des Spurenlegers ziehen zu können. Ziel dieser Arbeit war es, aus verschiedenen biologischen Materialien das Alter anhand der 4.977 bp-Deletion in menschlicher mitochondrialer DNA abschätzen zu können, wobei der Schwerpunkt auf Material von lebenden Personen lag. Hierzu wurde mit Hilfe geeigneter DNA-Extraktionsmethoden aus verschiedenen Gewebearten, venösem Vollblut, Mundschleimhautabstrichen und Haarwurzeln ausreichend DNA guter Qualität gewonnen. Die Schwierigkeit dieser Untersuchung lag in der Ermöglichung einer Quantifizierungsmethode zur Erfassung der 4.977 bp-Deletion. Dieses Problem wurde, nach der Wahl optimaler Primer und Amplifizierung spezifischer DNA-Fragmente, für die deletierte und die normale mtDNA unter optimierten PCR-Bedingungen im Multi-plex-Ansatz, mit Hilfe der Kapillarelektrophorese gelöst. Mit ihr konnte der Anteil der 4.977 bp-deletierten und der normalen mtDNA durch die computeranalysierten Peakflächen der beiden Fragmente bestimmt und miteinander in Verhältnis gesetzt werden. Dieses Verhältnis wurde durch den Quotienten IDel/INorm ausgedrückt. Die gewonnenen Ergebnisse wurden anschließend ausgedehnten statistischen Erhebungen unterzogen. Die 4.977 bp-Deletion zeigte in allen untersuchten Materialien eine eindeutige Altersabhängigkeit. Dies wurde an der Zunahme des Quotienten IDel/INorm mit steigendem Alter ersichtlich. Für die verschiedenen Gewebearten war die Abhängigkeit dieser Deletion vom Alter bereits aus der Literatur bekannt. Im Blut wurde diese jedoch erstmalig gezeigt, ebenso wie in den Mundschleimhautabstrichen, die bisher noch nie für Untersuchungen der 4.977 bp-Deletion herangezogen wurden. In den Haarwurzeln konnte die Deletion nicht nachgewiesen werden. Auffällig war hierbei, dass die Altersabhängigkeit von Material zu Material unterschiedlich ausgeprägt war. Der größte Anteil deletierter mtDNA fand sich im Gehirngewebe, gefolgt von Skelettmuskulatur, Herz, Lunge, Milz, Niere Leber und Haut. Für diese unterschiedliche Akkumulierung der 4.977 bp-Deletion finden sich zwei mögliche Erklärungsansätze, die Theorie einer unterschiedlichen Mitoserate und die einer unterschiedlichen Stoffwechselaktivität, die beide die gewonnene Rangfolge bestätigen. Des Weiteren wurde eine Abhängigkeit der 4.977 bp-Deletion von der in die PCR eingesetzten DNA-Menge festgestellt. Dieser Effekt muss im Zusammenhang mit der unterschiedlichen Amplifizierungseffizienz der beiden relevanten DNA-Fragmente gesehen werden, wodurch jedoch die Einschränkungen der angewandten unkontrollierten Multiplex-PCR mit anschließender semi-quantitativer Detektion der Amplifikations- produkte deutlich werden. Unter Berücksichtigung der Einschränkungen gelang anhand von Perzentilentabellen eine Altersschätzung mit der Angabe einer Altersspanne von ungefähr 30 Jahren. Um eine genauere Altersschätzung zu erreichen, wäre eine Optimierung der Methode, z. B. durch Anwendung einer real-time quantitativen PCR, und eine Einbeziehung einer noch größeren Probenzahl nötig. N2 - Not only is age an important criteria for the identification of unknown bodies and human remains, there is also a growing need to estimate the age of living persons. In addition, there is hope that trace evidence will permit conclusions about the age of the individual who left the evidence. The goal of this project was to estimate age from various biological materials based on 4,977 bp-deletion in human mitochondrial DNA, with the majority of materials being provided by living persons. To this end, sufficient amounts of good quality DNA were obtained, using appropriate methods of DNA extraction, from various types of tissue, venous blood, swabs of the mucous membranes in the mouth, and hair roots. The difficult aspect of this study was the determination of a method which would allow for the quantification of 4,977 bp-deletion. After evaluation of optimized primer and multiplex-PCR conditions for amplification of specific DNA fragments for the deleted and the normal mtDNA, this problem was solved using capillary electrophoresis for quantification. This allowed for the determination of the proportions of 4,977 bp-deleted and normal mtDNA through the computer analysis of the peak areas of the two fragments and the calculation of their ratio. This ratio was expressed through the IDel/INorm quotient. Results were subsequently submitted to extensive statistical analyses. 4,977 bp-deletion showed a significant correlation with age in all examined materials. This was made evident by growing IDel/INorm quotients with increasing age. For various tissue types, the association between this deletion and age was known from the research literature. However, this relationship was demonstrated for the first time in blood, as well as in the swabs of the mucous membrane of the mouth, which had never previously been used for the assessment of 4,977 bp-deletion. No deletion was found in hair roots. It was striking that the strength of the association with age differed from material to material. The greatest proportion of deleted mtDNA was found in brain tissue, followed by skeletal muscles, heart, lung, spleen, kidney, liver, and skin. There are two possible explanations for this differential accumulation of 4,977 bp-deletion: (1) the theory of differential mitosis rates and (2) the theory of differential metabolic activity, both of which are consistent with the current findings. Furthermore, a correlation between 4,977 bp-deletion and the amount of DNA used in the PCR was observed. This effect must be considered in the context of the various degrees of efficiency in the amplification of the two relevant DNA fragments, which underscores the limitations of the employed method of uncontrolled multiplex-PCR with subsequent semi-quantitative detection of the amplification products. Considering these limitations, age estimation was accomplished with the use of percentile tables, which allowed a determination of an age range of approximately 30 years. A more accurate estimation of age would require an optimization of the current method, for example, through the application of real-time quantitative PCR, and the inclusion of a larger sample size. KW - mtDNA KW - Lebensalter KW - Mensch KW - 4.977 bp-Deletion KW - Quantifizierung KW - Kapillarelektrophorese KW - Gewebe KW - Blut KW - Mundschleimhautabstrich KW - mtDNA KW - age KW - human KW - 4 KW - 977 bp-deletion KW - quantification KW - capillary electrophoresis KW - tissue KW - blood KW - saliva KW - polymerase chain reaction Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2999 ER - TY - THES A1 - Kreutzfeldt, Simon T1 - Studien zur Expression von Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts 1 (MLC1/Mlc1) in humanen und murinen Geweben T1 - Studies on the expression of megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts 1 (MLC1/Mlc1) in human and murine tissues N2 - Das humane MLC1 (auch als KIAA0027 oder WKL1 benannt) ist ein 377 AS umfassendes Protein, welches vornehmlich in neuralen Geweben exprimiert wird. Aufgrund von Strukturanalysen und Homologievergleichen wurde eine Funktion als Ionenkanal mit acht Transmembrandomänen postuliert. Loss-of-function-Mutationen des MLC1-Gens lassen sich mit dem Auftreten der Megalenzephale Leukenzephalopathie mit subkortikalen Zysten korrelieren. Ferner konnte anhand einer Stammbaumanalyse gezeigt werden, dass die C1121A-Mutation in einer größeren Familie mit dem Auftreten der Periodischen Katatonie nach Leonhardt (PK) kosegregierte, wobei Folgeuntersuchungen zur Assoziation von MLC1-Mutationen und dem Auftreten der PK widersprüchliche Ergebnisse erbrachten. Zur weiteren Aufklärung der biologischen Funktion von MLC1 war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, in zwei experimentellen Ansätzen nähere Kenntnisse zum transkriptionellen Expressionsmuster von MLC1 in vivo zu gewinnen, und anschließend durch Herstellung eines polyklonalen Antikörpers gegen das humane MLC1 den Grundstein für weitergehende Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung von MLC1 zu legen. Mittels In Situ-Hybridisierung humaner und muriner Gewebeschnitte aus Hippocampus und Cerebellum konnte gezeigt werden, dass die MLC1/Mlc1-Transkription in diesen Geweben vornehmlich in den Bergmann-Gliazellen der Purkinjezellschicht des Cerebellums sowie – in schwächerem Umfang – in verstreut liegenden und in der subgranulären Zone des Gyrus dentatus gehäuften Astrozyten des murinen Hippocampus nachweisbar war. Im zweiten Schritt der Analyse wurden humane post-mortem cDNA-Proben aus verschiedenen Gehirnregionen und zusätzlich einigen nicht-neuralen Geweben von zwei Menschen gewonnen, mittels quantitativer Real-time-PCR die Genexpression von MLC1 bestimmt und mithilfe des Expressionsniveaus von ausgewählten Housekeeping-Genen (GAPDH, L13a, β-Aktin, ARP und Cyclophilin) normalisiert. Es zeigte sich, dass in allen getesteten Hirnregionen eine deutliche MLC1-Expression festzustellen war, deren Maxima im Cerebellum und Frontalhirn und deren Minima im Putamen bzw. im nicht-neuralen Plexus chorioideus lagen. Zudem konnte eine nicht-neurale Expression auf sehr geringem Niveau für Lunge und Milz nachgewiesen werden. Zur Gewinnung eines polyklonalen Antikörpers gegen humanes MLC1 wurden mittels computergestützter Verfahren ein 117 AS langes Vakzinierungsprotein entworfen, welches immunogene Abschnitte des N-Terminus (61 AS) und C-Terminus (54 AS) enthielt. Die kodierende Sequenz wurde unter Verwendung des Impact-CN®-Expressionssystems in einen pTYB-Vektor kloniert, in ER2566-Zellen exprimiert, das Protein affinitätschromatographisch über Chitin-Säulen isoliert und aufgereinigt und mittels Bradford-Assay und SDS-Gelelektrophorese nachgewiesen. Leider konnte trotz vielfältiger Variation der Versuchsparameter kein eindeutiger Nachweis einer ausreichenden Expression des MLC1-Proteins in den ER2566-Zellen erbracht werden, die für die anschließende Vakzinierung von Kaninchen zur Gewinnung des polyklonalen Antiserums erforderlich gewesen wäre. Die Gründe hierfür sind unklar, denkbar sind beispielsweise eine suboptimale Codon-Frequenz, eine schlechte Proteinlöslichkeit, intrazelluläre mRNA-Degradation, proteolytische Abbauvorgänge oder eine Hemmung der Proteinbiosynthese durch die biologische Funktion des Proteins. Zusammenfassend konnten die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse einen Beitrag zur Erweiterung des Wissens zur MLC1-Expression leisten. Dabei entsprachen die Befunde zur humanen MLC1-Expression weitgehend den diesbezüglichen Beobachtungen zur regionalen und zellulären Expressionsstärkenverteilung aus dem Mausmodell, welche eine funktionelle Bedeutung von MLC1 im Rahmen von neuralen Schrankenstrukturen nahelegten (vgl. Schmitt et al. 2003). Mittels der zwischenzeitlich von anderen Arbeitsgruppen (über andere experimentelle Verfahren) erzeugten Antikörper gegen MLC1 konnte gezeigt werden, dass funktionelles MLC1 vermutlich als zellmembranständiges Dimer vorliegt und seine biologische Funktion u.a. durch Interaktion mit dem DGC (=Dystrophin-assoziierten Glykoprotein-Komplex) in den Caveolae ausübt. Es bleibt eine Aufgabe für die Zukunft, die genauen molekularen Mechanismen dieser Prozesse und ihre mögliche therapeutische Beeinflussbarkeit zur Behandlung der MLC zu erforschen. Auch die Frage der potenziellen extraneuralen MLC1-Expression, für die in dieser Arbeit Hinweise gefunden wurden, mag ein interessanter Ansatzpunkt für zukünftige Forschungsarbeiten sein. N2 - Studies on the expression of megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts 1 (MLC1/Mlc1) in human and murine tissues KW - MLC1 KW - Schizophrenie KW - MLC KW - Expression KW - Mensch KW - Maus Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90355 ER -