TY - THES A1 - Hartmann, Tim T1 - Über die Rolle der Neuroinflammation bei Entstehung und Progression der Demenz vom Alzheimer-Typ T1 - The role of neuroinflammation in the development and progression of Alzheimer´s disease N2 - Die vorliegende Studie bringt neue Erkenntnisse bezüglich der Rolle und Ver-teilung der Mikroglia und der eingewanderten Monozyten im Verlauf der Alz-heimer Erkrankung in postmortem Gehirnen. Im Gegensatz zu Studien an Tiermodellen konnten wir in unserer Kohorte eine nur sehr geringe Beteili-gung myeloischer Monozyten an der AD Pathologie beobachten, so dass man annehmen kann, dass bei Menschen die Immunantwort des Gehirns haupt-sächlich von den hirneigenen Mikrogliazellen getragen wird. Dies wurde an humanem postmortem Hirngewebe bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht unter-sucht. Zudem konnte gezeigt werden, dass die vulnerablen, früh von Tangles und Plaques betroffenen Hirnregionen auch eine frühe Mikrogliareaktion aufwei-sen und insbesondere von proinflammatorischen Zellen besiedelt werden und dass die Reaktion in manchen Regionen im Verlauf zunimmt, während in an-deren eine Abflachung oder sogar Abnahme beobachtet wird. N2 - The present study provides new insights into the role and distribution of microglia and migrated monocytes in the progression of AD in postmortem brains. In contrast to studies using animal models, we observed very little involvement of myeloid monocytes in AD pathology in our cohort, suggesting that in humans the immune response of the brain is mainly carried by the brain's own microglial cells. This has not yet been investigated in human postmortem brain tissue. In addition, it could be shown that the vulnerable brain regions affected early by tangles and plaques also exhibit an early microglial response and are colonized in particular by proinflammatory cells and that the response in some regions increases during the course, while in others a flattening or even decrease is observed. KW - Alzheimerkrankheit KW - Mikroglia KW - Neurodegeneration KW - Neuroinflammation KW - Plaques und Tangels Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-245326 ER - TY - THES A1 - Larsen, Mirjam T1 - Zur genetischen Heterogenität der Muskeldystrophien: alternative genetische Ursachen der Myotonen Dystrophie und FSHD T1 - The genetic heterogeneity of the muscular dystrophies: alternative genetic causes of myotonic dystrophy and FSHD N2 - Die klinische Symptomatik verschiedener erblicher Muskelerkrankungen verläuft oft erstaunlich ähnlich mit Muskelschwäche und -schwund als den hervorstechenden Alltagsproblemen. Dem gegenüber sind die genetischen Grundlagen sehr vielfältig mit > 250 bisher identifizierten Genen (musclegenetable.org). Auch innerhalb eines definierten Krankheitsbildes werden verschiedene genetische Ursachen nebeneinander gefunden, was durch die Verknüpfung in einem gemeinsamen Pathomechanismus begründet sein kann. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit verschiedenen Aspekten dieser genetischen Heterogenität am Beispiel der beiden häufigen Muskelerkrankungen Myotone Dystrophie (DM) und Facioscapulohumerale Muskeldystrophie (FSHD), bei denen alternative genetische Ursachen, sowie anknüpfende Fragestellungen untersucht wurden. Das erste Projekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit Fragestellungen, welche die DM betreffen. Die DM Typ 1 und Typ 2 (DM1 und DM2) bilden zusammen die häufigste Muskelerkrankung im Erwachsenenalter. Sie ist durch die gemeinsamen Symptome Myotonie, Muskelschwäche und Katarakt sowie die Beteiligung weiterer Organsysteme gekennzeichnet, was sie zu einer multisystemischen Erkrankung macht. Die genetische Ursache liegt für beide Formen in einer Repeatexpansion eines Mikrosatelliten in der untranslatierten Region zweier Gene (DMPK in DM1, CNBP in DM2). Dem gemeinsamen Pathomechanismus liegt eine toxische Funktionsgewinn-Mutation des expandierten RNA-Transkripts zugrunde. Die beiden bekannten Formen der DM sind phänotypisch häufig nicht unterscheidbar, weshalb in vielen Fällen beide Erkrankungen molekulargenetisch untersucht werden müssen. Dabei ist die Diagnostik der DM durch die Notwendigkeit des Nachweises von sehr großen Repeatexpansionen recht aufwändig und die Bestimmung der Repeatlänge im Fall der DM2 nur eingeschränkt möglich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Test zum Nachweis der Repeatexpansionen auf der Basis der Methode des Molecular Combing entwickelt, welche den gleichzeitigen Nachweis der beiden Loci von DM1 und DM2 erlaubt und zusätzlich eine direkte Messung der Repeatlänge ermöglicht. Das Molecular Combing ist eine fluoreszenz-mikroskopische Einzelmolekül-Analysemethode, durch die es erstmals möglich wurde, die vermutete somatische Instabilität bei DM2 darzustellen. Das zweite DM-Teilprojekt beschäftigt sich mit der Identifikation möglicher alternativer genetischer Ursachen für die Erkrankung. Dies wurde anhand einer Kohorte von 138 DM1- und DM2-negativen Indexpatienten mit dem typischen DM-Phänotyp untersucht. Ausgehend von dem gemeinsamen Pathomechanismus wurden die primären Krankheitsgene DMPK und CNBP, sowie CELF1 und MBNL1, welche wichtige Rollen auf sekundärer Ebene des Pathomechanismus spielen, mittels Next Generation Sequencing untersucht. Dabei wurde eine auffällige Variante in DMPK gefunden, keine Varianten in CNBP oder CELF1 und drei Varianten in MBNL1, was auf MBNL1 als Kandidatengen einer alternativen Ursache für DM hinweist. MBNL1 ist ein gewebespezifischer Spleißregulator, welcher einen Wechsel von einem fetalen zu einem adulten Spleißmuster im Muskel steuert. Die Pathogenität einer der Varianten wurde in einem RNA-Spleißassay mit MBNL1-Targetgenen untersucht. Dabei konnten keine spezifischen Spleiß-Effekte festgestellt werden, aber eine Verminderung des Expressionsniveaus im Sinne einer Haploinsuffizienz. Die 3D-Modellierung dieser Variante deutet auf Änderungen der Oberflächenladungen in MBNL1 hin. Der Nachweis der Pathogenität der Varianten und somit die Ursächlichkeit von MBNL1-Mutationen für DM konnte hiermit nicht abschließend geklärt werden. Die gefundenen Ergebnisse regen jedoch hoffentlich zu nachfolgenden Studien an. Das zweite Projekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit Fragestellungen um die FSHD. Diese bildet die dritthäufigste Muskelerkrankung, charakterisiert durch eine oft asymmetrische Schwäche der Muskulatur von Gesicht, Schultergürtel und Oberarmen. Genetisch ist die FSHD Typ 1 (FSHD1) mit einer Kontraktion des Makrosatelliten D4Z4 verknüpft, was eine Relaxation der Chromatinstruktur der Region mit sich bringt und damit die ektopische Expression des apoptotisch wirkenden Proteins DUX4 ermöglicht. Die pathogene Ausprägung dieser Funktionsgewinn-Mutation findet dabei nur in Verbindung mit einem FSHD-permissiven Haplotyp statt. Auf der Grundlage des gleichen Pathomechanismus wurde eine zweite Form der FSHD (FSHD2) vorgestellt, bei der die Chromatinrelaxation unabhängig von der Länge von D4Z4 durch einen Defekt in dem an der DNA-Methylierung beteiligten Gen SMCHD1 assoziiert sein soll. Die Vererbung von FSHD2 verläuft digenisch mit Mutationen in SMCHD1 und dem FSHD-permissiven Haplotyp auf zwei unabhängigen Loci. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Kohorte von 55 FSHD1-negativen Patienten mit dem typischen FSHD-Phänotyp untersucht. Dabei wurden der Haplotyp, die Methylierung von D4Z4 sowie das SMCHD1-Gen analysiert. Es konnten neun Patienten mit einem Defekt in SMCHD1 identifiziert werden. In einer zweiten Kohorte von 45 FSHD1-positiven Patienten wurde untersucht, ob SMCHD1-Mutationen auch in Kombination mit einer Kontraktion von D4Z4 vorkommen. Dieser Fall von FSHD1+2 konnte für drei Patienten gezeigt werden, welche außerdem einen auffällig schweren Phänotyp zeigten. SMCHD1 kann also als Modifier-Gen für die Schwere der Erkrankung bei FSHD1 angesehen werden. Damit wurden insgesamt zwölf SMCHD1-Mutationsträger identifiziert, davon sind zehn der Varianten noch nicht beschrieben worden. Für alle erkrankten Mutationsträger konnte eine Methylierung von D4Z4 ≤ 20 % ermittelt werden, was als diagnostisches Kriterium verwendet werden kann. Mit einem Anteil von 16,3 % Mutationsträger in der FSHD1-negetiven Kohorte bildet FSHD2 einen bedeutenden Anteil an dem Krankheitsbild der FSHD, weshalb die entwickelten Analysen in die Routinediagnostik eingegliedert wurden. Das zweite Teilprojekt der FSHD beschäftigt sich mit der Funktion des SMCHD1-Gens bei der X-Inaktivierung (XI). Es ist bekannt, dass SMCHD1 bei weiblichen Mäusen an der Aufrechterhaltung der XI mitwirkt. Die Untersuchung der XI bei FSHD2-Frauen ergab eine extreme Verschiebung der erwarteten XI von 50:50 auf 0:100 oder 100:0 bei sechs von 13 Patientinnen. Die übrigen sieben zeigten eine XI im Normalbereich von > 20:80 oder < 80:20. Der Befund der einseitigen Verschiebung könnte auf einen negativen Selektionsdruck gegenüber Zellen mit unvollständiger XI hindeuten. Es wäre interessant zu untersuchen, ob sich der gleiche Effekt auch in einer größeren Kohorte wiederfindet und ob er sich mit der Art der Mutation korrelieren lässt. N2 - The clinical presentation of many inherited muscular disorders is often remarkably similar with muscle weakness and wasting as the most prominent everyday problems. By contrast, the genetic basis is highly heterogeneous with so far > 250 identified genes (musclegenetable.org). Even within a defined disease group different genetic causes are found side by side which can be explained by linking into a common pathomechanism. The present thesis deals with different aspects of this genetic heterogeneity using the two common muscular disorders myotonic dystrophy (DM) and facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) as examples. It addresses questions on alternative genetic causes and related issues. The first project of this work is focused on issues related to DM. DM type 1 and DM type 2 (DM1 and DM2) together represent the most frequent muscular disorder in adulthood. Clinically, the disease is characterized by the common symptoms myotonia, muscular weakness and cataract as well as multi organ involvement, making it a multisystemic disorder. The genetic cause of both forms is the expansion of a microsatellite repeat in the untranslated regions of two different genes (DMPK in DM1, CNBP in DM2). The common pathogenic mechanism is based on a toxic gain of function mutation of the expanded RNA transcript. The two known forms of DM are phenotypically often not distinguishable which is why in many cases molecular genetic testing for both forms must be performed. In addition, the diagnosis of DM is quite challenging due to the need of detecting very large repeat expansions. Furthermore, an exact determination of repeat length in DM2 has so far not been possible. In this study, a test based on the method Molecular Combing was developed for detection of the repeat expansions, which allows for the simultaneous detection of the two loci of DM1 and DM2 in a single assay and in addition for a direct measurement of the repeat length. The Molecular Combing is a fluorescence microscopic single-molecule method which enables for the first time the visualization of the suspected somatic instability in DM2. The second DM-project deals with the identification of possible alternative genetic causes of the disease. This was investigated by a cohort of 138 DM1- and DM2-negative index patients displaying the typical DM-phenotype. Based on the common pathogenic mechanism, the primary disease genes DMPK and CNBP, as well as CELF1 and MBNL1 which play important roles on a secondary level of the pathomechanism were examined by Next Generation Sequencing. One candidate variant was found in DMPK, no variants in CNBP or CELF1 and three variants in MBNL1, suggesting that MBNL1 is an alternative candidate gene for DM. MBNL1 is a tissue-specific splicing regulator which controls the change from a fetal to an adult splicing pattern in muscle. Pathogenicity of one of the variants was tested in an RNA splicing assay with MBNL1 target genes. No alternative splicing patterns were observed but a reduction in expression levels suggests a haploinsufficiency mechanism. 3D-modelling of this variant suggests a change in surface charge of MBLN1. However, the proof of the pathogenicity of the three variants and thus the causality of MBNL1 mutations as a cause for DM still remains to be confirmed. Hopefully, our observations may foster further studies into this direction. The second project of this thesis deals with the genetic causes of FSHD. This is the third most common muscular disorder, characterized by often asymmetric weakness of the muscles of the face, shoulder girdle and upper arms. Genetically, FSHD type 1 (FSHD1) is associated with a contraction of the macrosatellite repeat D4Z4 which induces a relaxation of the chromatin structure of the region and thus allows ectopic expression of the apoptotic DUX4 protein. Pathogenicity of this gain-of-function mutation is exclusively associated with a permissive FSHD haplotype. Based on the same pathomechanism, a second form of FSHD (FSHD2) has been described in which chromatin relaxation is caused by a defect in the SMCHD1 gen that is involved in DNA methylation - independent of the D4Z4 repeat length. The inheritance of FSHD2 is therefore digenic with mutations in SMCHD1 and a FSHD permissive haplotype, located on two different chromosomes. In this study, a cohort of 55 FSHD1-negative patients displaying the typical FSHD phenotype was studied. The haplotype, methylation of D4Z4 and the SMCHD1 gene were analyzed. A number of nine patients with mutations in SMCHD1 could be identified. In a second cohort 45 FSHD1-positive patients were examined, addressing the question, whether SMCHD1 mutations also occur in combination with a contraction of D4Z4. The condition of FSHD1 + 2 was found in three patients who also showed a strikingly severe phenotype. SMCHD1 therefore can be regarded as a modifier gene for disease severity in FSHD1. In total, twelve SMCHD1 mutation carriers were identified in this study with ten novel variants. For all affected mutation carriers methylation of D4Z4 was found to be ≤ 20 % which can be used as a diagnostic criterion. With a proportion of 16.3 % mutation carriers in the FSHD1-negative cohort FSHD2 represents a significant part of the clinical spectrum of FSHD. Based on these findings, a modified algorithm for routine diagnostics of FSHD is presented. The second FSHD-project deals with the function of the SMCHD1 gene in X-inactivation (XI). It is known that in female mice SMCHD1 is involved in the maintenance of XI. The investigation of XI in FSHD2-women showed an extreme shift of the expected XI of 50:50 to 0:100 or 100:0 in six of 13 patients. The remaining seven patients showed XI in the normal range of > 20:80 or < 80:20. The finding of this one-sided shift could indicate a negative selection pressure against cells with incomplete XI. It would be interesting to investigate whether this effect can be confirmed in a larger cohort and whether it can eventually be correlated with the type of mutation. KW - Humangenetik KW - Myotonische Dystrophie KW - Landouzy-Déjerine-Atrophie KW - Gen Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123431 ER - TY - THES A1 - Lukaszyk, Daniel T1 - Vergleich der Kollagenentwicklung und Differenzierungsfähigkeit humaner Stammzellen des Fettgewebes unter dem Einfluss des Prolyl-4- Hydroxylase-Inhibitors EDHB im 2D und 3D Modell T1 - Comparison of collagen development and differentiation ability of human adipose-derived stem cells under the influence of prolyl-4-hydroxylase inhibitor EDHB in a 2D and 3D Model N2 - Das Tissue Engineering von Fettgewebe befasst sich mit der Herstellung von biologisch äquivalenten Gewebekonstrukten mit dem Ziel, diese in der Regenerativen Medizin zur Deckung von Weichteildefekten einzusetzen. Für die Ausreifung, Funktion und das Überleben von Adipozyten wurde die Bedeutung der Extrazellulärmatrix (EZM) zunehmend deutlich.18-20 Untersuchungen zur EZM und ihrer Einflussnahme auf die Adipogenese wurden bislang hauptsächlich an konventionellen zweidimensionalen Zellkulturen unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark (bone marrow-derived MSC), Präadipozyten der Mauszelllinie 3T3-L1 und intramuskulären Präadipozyten aus Rindern (bovine intramuscular preadipocytes, BIP) vorgenommen.23,56,69,76,115 Ziel dieser Arbeit war es Erkenntnisse über den Einfluss der EZM auf die adipogene Differenzierungsfähigkeit unter Verwendung von humanen mesenchymalen Stammzellen des Fettgewebes (human adipose-derived stem cells, hASC) zu gewinnen. Um in vitro eine natürlichere Mikroumgebung der Zellen zu generieren, wurde neben einer 2D Kultur vergleichend ein 3D Modell bestehend aus multizellulären Sphäroiden verwendet.84,85 Zudem war die Bestimmung eines stabilen Housekeeping-Gens notwendig, um valide Ergebnisse in qPCR-Analysen von Genexpressionsstudien zu gewährleisten. Die Auswertung statistischer Parameter (Standardabweichung und Interquartilsbereich) sowie die Ergebnisse dreier zur Stabilitätsprüfung eingesetzten Softwares identifizierten EF1α als robustestes HKG. Der Zusammenhang zwischen der EZM-Entwicklung und der Adipogenese wurde durch Hemmung der Kollagenentwicklung unter Verwendung von Ethyl-3,4-dihydroxybenzoat (EDHB) untersucht. Bei Betrachtung der Triglyceridsynthese mittels Histologie und quantitativer Analyse (Triglyceridassay) konnte in beiden Kultursystemen eine konzentrationsabhängige Hemmung der Adipogenese festgestellt werden. Im Unterschied zur 2D Kultur konnte der Triglyceridgehalt im 3D Modell annähernd auf das Niveau der nicht-induzierten Kontrolle gesenkt werden und damit ein tendenziell stärkerer negativer Effekt im 3D Modell demonstriert werden. In Untersuchungen zur Genexpression wurde die Expressionsrate der späten adipogenen Marker aP2 und C/EBPα maximal durch Zugabe von 0,05 mM EDHB gesenkt, wobei der Effekt in 3D erneut stärker ausgeprägt war. Bei Betrachtung der Kollagenentwicklung zeigte sich immunhistochemisch zunächst eine Adipogenese-assoziierte Entwicklung der Kollagene I, IV und VI im 2D und 3D Modell. Durch die Zugabe von EDHB ließ sich die Kollagenbildung gleichermaßen in 2D und 3D konzentrationsabhängig inhibieren. Damit konnte ein Rückgang der Synthese von drei für die Adipozyten relevanten Kollagenen zusammen mit der Störung der adipogenen Differenzierung nachgewiesen werden. Auf mRNA-Ebene hingegen war eine unterschiedliche Expression von Kollagen I und IV nachweisbar. Für Kollagen I wurde eine Abnahme der Expression bei Differenzierung der Zellen beobachtet, während die Expressionsrate von Kollagen IV erst mit Beginn der Adipogenese gesteigert wurde. Die Genexpression der untersuchten Kollagene wurde durch EDHB nicht negativ beeinflusst. Insgesamt weisen die Ergebnisse auf einen engen Zusammenhang der Kollagensynthese mit der Adipogenese hin. Inwieweit eine durch Zell-Matrix-Interaktionen ausgelöste Signaltransduktion und regulatorische Mechanismen in den Präadipozyten die Adipogenese beeinflussen, bleibt jedoch Gegenstand zukünftiger Forschung. N2 - Adipose tissue engineering focuses on the generation of biologically equivalent tissue constructs that can be used in regenerative medicine to cover tissue defects. The relevance of the extracellular matrix (ECM) in adipocyte maturation, function, and survival has become increasingly apparent.18-20 Studies on the ECM and its influence on adipogenesis have so far mainly been performed on conventional two-dimensional cell cultures using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (bone marrow-derived MSC), mouse cell line 3T3-L1 preadipocytes, and bovine intramuscular preadipocytes (BIP).23,56,69,76,115 The goal of the study was to gain insights into the role of the ECM on adipogenic differentiation capacity using human adipose-derived stem cells (hASC). To generate a more natural cell microenvironment in vitro, a 3D model consisting of multicellular spheroids was used in comparison to a 2D culture.84,85 Moreover, to ensure valid results in gene expression studies obtained by qPCR analyses, determination of a stable housekeeping gene was necessary. The evaluation of statistical parameters (standard deviation and interquartile range) and the results achieved by three softwares known for stability testing identified EF1α as the most robust HKG. The relationship between ECM development and adipogenesis was investigated by inhibition of collagen development using ethyl-3,4-dihydroxybenzoate (EDHB). Histological staining of lipids and quantitative analysis (triglyceride assay) revealed a concentration-dependent inhibition of adipogenesis in both culture systems. In contrast to the 2D culture, the triglyceride content in the 3D model could be reduced approximately to the level of the non-induced control, demonstrating an overall stronger inhibitory effect in the 3D model. In gene expression studies, the expression levels of the late adipogenic markers aP2 and C/EBPα were maximally decreased by addition of 0.05 mM EDHB, whereby the effect was again more pronounced in 3D. Regarding the collagen development, an adipogenesis-associated development of collagen I, IV, and VI was seen by immunohistochemical analysis in the 2D and 3D models. Addition of EDHB equally inhibited collagen formation in 2D and 3D in a concentration-dependent manner. This demonstrated a decrease in the synthesis of three collagens relevant to adipocytes along with the disruption of adipogenic differentiation. In contrast, a different expression pattern of collagen I and IV was detectable at the mRNA level. For collagen I, a decrease in expression was observed upon differentiation of the cells, whereas the expression level of collagen IV was increased only with the onset of adipogenesis. Both expression patterns were not affected by EDHB. Overall, the results indicate a close relationship of collagen synthesis with adipogenesis. However, the extent to which signal transduction triggered by cell-matrix interactions and regulatory mechanisms in preadipocytes influence adipogenesis remains the subject of future research. KW - Tissue engineering KW - Kollagen KW - Extrazellulärraum KW - Fettgewebe KW - Differenzierung KW - Extrazllulärmatrix KW - Prolyl-4-hydroxylase-Inhibitor KW - EDHB KW - Ethyl-3,4-dihydroxybenzoate Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240912 ER - TY - THES A1 - Rainer, Johannes T1 - Vaskulartoxische Wirkung von Taxanen bei fortgeschrittenen Tumorerkrankungen T1 - Vasculartoxic effect of taxanes in advanced tumour diseases N2 - Taxane (wie Paclitaxel oder Cabazitaxel) sind bewährte Arzneimittel in den systemischen Therapieschemata vieler bösartiger Erkrankungen, einschließlich Brust- und Eierstockkrebs. Sie fördern die Stabilisierung der Mikrotubuli, was zu einem Stillstand des Zellzyklus während der Mitose führt, auf den die Apoptose folgt. Neben dieser antimitotischen Wirkung von Taxanen ist seit einiger Zeit auch eine gefäßverändernde Wirkung von Taxanen bekannt. Kürzlich wurde gezeigt, dass Taxane tatsächlich Störungen in der Gefäßarchitektur verursachen, indem sie den Kalziumeinstrom über TRPC6, einen unselektiven Kationenkanal, auslösen. Der erhöhte intrazelluläre Ca2+-Spiegel bewirkt eine Rundung der Endothelzellen, was zu einer Störung des endothelialen Monolayers, Serumausfluss und Gefäßkollaps führt. In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die Gefäßbetten von peripheren Organen wie dem Herzen oder der Niere in Abhängigkeit vom Tumorstadium und der Taxol-Behandlung. Die Organe wurden mit immunhistochemischen Techniken angefärbt, um Veränderungen in der Architektur und Morphologie der Blutgefäße zu untersuchen. Wir fanden Veränderungen in der Morphologie der Kapillaren des Herzens und darüber hinaus Veränderungen in der Expression endothelialer Antigene in Abhängigkeit vom Tumorstadium, insbesondere eine zunehmende endotheliale Expression von TRPC6 in Abhängigkeit vom Tumorstadium. Diese Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse für das Verständnis der systemischen Auswirkungen maligner Erkrankungen und tragen dazu bei, Folgeerkrankungen bei Patienten mit fortgeschrittenem Krebs zu verhindern. N2 - Taxanes (like Paclitaxel or Cabazitaxel) are well-established drugs in the systemic therapy regimens of many malignancies, including breast and ovarian cancer. They promote the stabilization of microtubules leading to an arrest of the cell cycle during mitosis which is followed by apoptosis. Beside this anti-mitotic action of taxanes, a vascular-directed effect of taxanes has been known for some time. We recently showed that taxanes actually cause vascular disruption by triggering calcium influx via TRPC6. The increased intracellular Ca2+-level causes rounding of endothelial cells, leading to a disruption of the endothelial monolayer, serum efflux, and vascular collapse. In this study, we focused on the vascular beds of peripheral organs like the heart or the kidney in dependency on tumor stage and Taxol-therapy. The organs were stained via immunohistochemical techniques to examine changes in the architecture and morphology of the blood vessels. We found changes in the morphology of the cardiac capillaries and furthermore changes in the expression of endothelial antigens in dependence on the tumor stage, especially an increasing endothelial expression of TRPC6 dependent on the tumor stage. These findings provide new insights for the understanding of the systemic effects of malignant diseases and help to prevent secondary diseases in patients with advanced cancer. KW - Taxane KW - Taxanes KW - Kardioonkologie KW - Mamma-Karzinom KW - Kapillararchitektur KW - Immunhistochemie KW - Brustkrebs KW - Immuncytochemie Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350722 ER - TY - THES A1 - Frank, Benjamin T1 - Untersuchungen zur Autophagieinduktion in Leishmania major-infizierten Knochenmarksmakrophagen T1 - Analyses of autophagy induction in Leishmania major-infected bone marrow-derived macrophages N2 - Die von der WHO zu den 17 wichtigsten NTDs gezählte Leishmaniose wird durch intrazelluläre Parasiten der Gattung Leishmania hervorgerufen. Der Lebenszyklus der Parasiten besteht aus zwei Phasen. Die länglichen und beweglichen Promastigoten kennzeichnen die Phase in der Sandmücke – der Vektor der Leishmaniose. Hingegen ist die Phase im Säugerwirt durch runde unbewegliche Amastigoten charakterisiert. Aufgrund des Mangels an potenten antileishmanialen Therapien wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion zwischen L. m. Parasiten und der Hauptwirtszelle, der Makrophage, v. a. in Hinblick auf autophage Prozesse in den infizierten Makrophagen näher untersucht, um demgemäß neue Erkenntnisse zu gewinnen, welche bei der Herstellung zukünftiger anti-leishmanialer Medikamente helfen könnten. Bei der Autophagie handelt es sich um einen katabolen Prozess, wodurch Zellen bei Nahrungsmangel oder zellulärem Stress ihre Homöostase erhalten können. Durch diesen Prozess können überflüssige oder beschädigte Organellen recycelt werden, um die Funktionen der Zelle aufrechtzuerhalten. Daneben übernimmt Autophagie auch eine essenzielle Rolle bei der Abwehr von ins Zytosol eindringenden Pathogenen. Mittels des neu etablierten totalen Autophagiescore konnte festgestellt werden, dass Autophagie in L. m.-infizierten BMDM induziert wird. Die intrazellulären Amastigoten werden durch Autophagie in den BMDM verdaut. Die erhöhte autophage Aktivität konnte zudem durch Western-Blot-Analysen der autophagierelevanten Proteine ATG5, LC3B und UB bestätigt werden. Die molekulargenetischen Untersuchungen von L. m.-infizier-ten BMDM mithilfe von Affymetrix Microarrays führten zu einem Netzwerk aus autophagierelevanten und infektionsspezifischen Genen, welches als LISA bezeichnet worden ist. Hier hat sich ebenfalls eine starke Verknüpfung von autophagierelevanten Genen und den Genen der Glykolyse, einem zweiten katabolen Prozess, gezeigt. Zudem konnten zwei weitere autophagierelevante und infektionsspezifische Gene außerhalb von LISA identifiziert werden, nämlich Bnip3 und Ctse, welche im Anschluss genauer untersucht worden sind. Bei beiden Genen konnte auf Proteinebene gezeigt werden, dass sie in L. m.-infizierten BMDM signifikant erhöht sind. Durch siRNA-Analysen konnte überdies beobachtet werden, dass beide für die erfolgreiche Elimination der Amastigoten essenziell sind. Somit konnte mit den Proteinen BNIP3 und CTSE zwei potenzielle neue Ansatzpunkte für mögliche zukünftige antileishmaniale Therapien gefunden werden. Auch die in LISA enthaltenen Gene stellen prinzipiell vielversprechende Ziele für künftige Medikamente gegen Leishmaniose dar. Durch all diese Untersuchungen kommt man dem Ziel einer neuen, gezielten und nebenwirkungsärmeren Behandlung der Leishmaniose einen Schritt näher. N2 - Leishmaniasis, listed by the WHO to be one of the 17 most important NTDs, is caused by intracellular parasites of the genus Leishmania. The life cycle of the parasites consists of two stages. The oblong and motile promastigotes characterize the stage in the sand fly, the vector of leishmaniasis. However, the stage in the vertebrate host is characterized by round immotile amastigotes. Due to a lack of capable antileishmanial therapies, the interaction between L. m. parasites and their main host cell, the macrophage, was investigated in the present work, huge focus on autophagic processes in infected macrophages. Our goal was to get new insights for the future production of antileishmanial drugs. Autophagy is a catabolic process whereby cells are able to maintain their homeostasis in times of starvation or cellular stress. During to this process, redundant or damaged organelles are recycled in order to sustain cellular viability. Furthermore, autophagy has an essential role in the defense of pathogens invading the cytosol. The newly established total autophagy score showed an autophagy induction in L. m.-infected BMDM. Intracellular amastigotes are digested by autophagy in BMDM. The increased autophagic activity could also be confirmed by western-blot analyses of the autophagy-relevant proteins ATG5, LC3B, and UB. Molecular genetic investigations of L. m.-infected BMDM by Affymetrix microarrays led to a network of autophagy-relevant and infection-specific genes, which was called LISA. Additionally, it showed a strong connection between autophagy-relevant genes and genes of the glycolysis, a second catabolic process. Moreover, we identified and further characterized two additional autophagy-relevant genes, Bnip3 and Ctse, which were not included in LISA. Both genes were significantly overexpressed on protein level in L. m.-infected BMDM. By siRNA analyses we also demonstrated their importance for successful elimination of amastigotes. Therefore, both proteins, BNIP3 and CTSE, could be new potential targets for possible future antileishmanial therapies. In addition, the genes included in LISA might be promising targets for future drugs against leishmaniasis. Due to all these investigations we are one step closer to our goal of a targeted and safe therapy of leishmaniasis. KW - Autophagie KW - Leishmania major KW - Cathepsin E KW - BNIP3 KW - Elektronenmikroskopie KW - Autophagie KW - Leishmania major KW - Cathepsin E KW - BNIP3 KW - Elektronenmikroskopie KW - Microarray KW - siRNA KW - Autophagiescore Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137277 ER - TY - THES A1 - Maier, Claudia T1 - Untersuchungen zu neuen potenziellen N-Glykosylierungsmotiven in t(14;18)-positiven und t(14;18)-negativen follikulären Lymphomen T1 - Investigations about novel potential N-glycosylation sites in t(14;18)-positive and t(14;18)-negative follicular lymphoma N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde das Vorkommen neu erworbener N-Glykosylierungsmotive in t(14;18)-positiven und -negativen FL der lokalisierten (FL I/II) und fortgeschrittenen Stadien (FL III/IV), sowie zum Zeitpunkt der Primärdiagnose und des Rezidivs untersucht. Dabei wurde der jeweilige Haupttumorklon mit Hilfe von „Next Generation Sequencing“ und unter Verwendung des „LymphoTrack® Assays“ in einer Serie von 68 kryoasservierten FL identifiziert 36 t(14;18)-negative und 32 t(14;18)-positive FL. Die Frequenz neu erworbener N-Glykosylierungsmotive unterschied sich signifikant zwischen t(14;18)-positiven und -negativen PD/R-FL III/IV, während man zwischen t(14;18)-positiven und -negativen PD/R-FL I/II keinen Unterschied beobachten konnte. Des Weiteren zeigten t(14;18)-negative PD/R-FL I-IV im Vergleich zu t(14;18)-positiven PD/R-FL I-IV signifikant häufiger einen Zugewinn neuer N-Glykosylierungsmotive in der FR3 Region des BCL2 Gens, sowie eine vermehrte Nutzung des IGHV4-34 Keimbahngens. Interessanterweise beschränkte sich die Nutzung des IGHV4-34 Gens auf PD-FL und konnte in R-FL nicht nachgewiesen werden. Da sowohl das Vorkommen neu erworbener N-Glykosylierungsmotive in FR3 als auch die Nutzung von IGHV4-34 im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen beschrieben wurden, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Subgruppe der t(14;18)-negativen FL im pathologischen Prozess der Onkogenese mehr auf die Stimulation durch (Auto)-Antigene als durch die Stimulation des B-Zell Rezeptors mit Lektinen (DC-SIGN) angewiesen sein könnte. N2 - This study investigated the occurrence of newly acquired n-glycosylation motifs (NANGS) in a cohort of t(14;18)-positive and t(14;18)-negative FL, including early (I/II) and advanced (III/IV) stage treatment-naive and relapsed tumors. The clonotype was determined by using a next generation sequencing approach in a series of 68 FL with fresh frozen material [36 t(14;18) positive and 32 t(14;18) negative]. The frequency of NANGS differed considerably between t(14;18)-positive and t(14;18)-negative FL stage III/IV, but no difference was observed among t(14;18)-positive and t(14;18)-negative FL stage I/II. The introduction of NANGS in all t(14;18)- negative clinical subgroups occurred significantly more often in the FR3 region. Moreover, t(14;18)-negative treatment-naive FL, specifically those with NANGS, showed a strong bias for IGHV4-34 usage compared with t(14;18)-positive treatment-naive cases with NANGS; IGHV4-34 usage was never recorded in relapsed FL. In conclusion, subgroups of t(14;18)- negative FL might use different mechanisms of B-cell receptor stimulation compared with the lectin-mediated binding described in t(14;18)-positive FL, including responsiveness to autoantigens as indicated by biased IGHV4-34 usage and strong NANGS enrichment in FR3. KW - Glykosylierung KW - Non-Hodgkin-Lymphom KW - B-Zell-Lymphom KW - N-Glykosylierungsmotive KW - N-glycosylation sites KW - Follikuläres Lymphom KW - follicular lymphoma KW - t(14;18)-negative follikuläre Lymphome KW - t(14;18)-negative follicular lymphoma Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-330261 ER - TY - THES A1 - Weber, Tanja T1 - Untersuchung des Einflusses verschiedener Lebenserfahrungen und unterschiedlicher Serotoninhomöostase auf die Neuromorphologie von Pyramidenzellen der CA3-Region des Hippocampus in Mäusen T1 - Investigation of the influence of different life histories and varying serotonin homeostasis on the neuromorphology of pyramidal cells in hippocampal Cornu ammonis sector 3 in mice N2 - Chronischer Stress hat negative Folgen, die sich im Verhalten und auf neuronaler Ebene äußern können. Als besonders stressempfindlich gelten die Neurone der dritten Region des hippocampalen Ammonshorns CA3. Sie reagieren auch im bereits ausgereiften Zustand noch sehr sensibel auf äußere Einflüsse, was als neuronale Plastizität bezeichnet wird. Sie erfahren unter anderem durch Stress und Serotonin morphologische und funktionelle Veränderungen. Serotonin-Transporter wahren das Serotonin-Gleichgewicht, indem sie dessen Wirkung schließlich durch Wiederaufnahme in die Zellen beenden. Polymorphismen, also verschiedene Gen-Varianten, bedingen Unterschiede in der Zahl der verfügbaren Transporter. Dieses Wechselspiel zwischen Gen-Varianten des Serotonin-Transporters und Stress wurde an Serotonin-Transporter-Knockout-Mäusen untersucht. Einige Mäuse erfuhren bereits früh im Leben Stress, der entweder anhielt oder im späteren Leben positiven Erfahrungen wich; weitere Mäuse hingegen machten in frühen Lebensabschnitten positive Erfahrungen, die sich später entweder fortsetzten oder durch Stresserfahrungen ersetzt wurden. Nach Durchführung von Verhaltenstests wurde zudem in deren Golgi-imprägnierten Gehirnen die Morphologie der Apikaldendriten von CA3-Kurzschaft-Pyramidenzellen lichtmikroskopisch untersucht und in 3D-Computermodellen abgebildet. Aufgrund regionaler Eigenheiten innerhalb von CA3 wurden diese Neurone verschiedenen Subpopulationen zugeordnet. Tatsächlich konnten mithilfe der Kombination aus vier verschiedenen Lebensgeschichten und drei unterschiedlichen Serotonin-Transporter-Genotypen Unterschiede in der Morphologie der CA3-Pyramidenzellen zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Ohne Stresserleben zeigten sich die Neurone meist signifikant verzweigter; nach Stresserleben zeigten sich, zumindest in einer bestimmten Subpopulation, signifikante Verminderungen der Spines. Mäuse mit zwei oder einem wildtypischen Serotonin-Transporter-Allel und ausschließlich späten aversiven Erfahrungen hatten signifikant längere Apikaldendriten als die Referenz mit zwei wildtypischen Allelen und ohne Stresserfahrung; homozygot Serotonin-Transporter-defiziente Mäuse der gleichen Lebensgeschichte hatten zur Referenz signifikant verkürzte Apikaldendriten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Stress in Verbindung mit genetisch bedingt geringen Mengen des Serotonin-Transporters durchaus eine erhöhte Vulnerabilität für psychische Erkrankungen bedingen könnte, aber dass ausschließlich späte Stresserfahrungen bei höheren Mengen des Serotonin-Transporters auch protektiv wirken könnten. N2 - Chronic stress has a negative impact on behavior and neuronal networks. The neurons of Cornu ammonis sector 3 (CA3) of the hippocampus are shown to be very susceptible to stress. Even when mature, they still react sensitively to their environment, which is called neuronal plasticity. Stress and serotonin tend to influence the neurons morphologically as well as functionally. Serotonin transporters preserve the serotonin homeostasis by terminating the serotonergic effects on respective receptors through reuptake into the surrounding cells. Polymorphisms, several variants of the human serotonin transporter gene, account for differences in the numbers of available serotonin transporters. This interplay between variants of the serotonin transporter gene and stress has been investigated by using the animal model of serotonin transporter knockout mice. Life history of some of these mice started with stressful events that either persisted or was replaced by positive experiences in their later life; the other mice had a pleasant early life that in their late phase of life either went on or was interrupted and henceforth contained stressful incidents. Behavioral tests took place. Afterwards, the Golgi impregnated mouse brains were light microscopically studied for the morphology of the apical dendrites of CA3 short shaft pyramidal cells, which were then transferred into digital 3D models. Due to regional differences in CA3 associated with a large variance in the morphology of these neurons located there, investigated neurons were subdivided into various subpopulations. With the combination of four different life histories and three different serotonin transporter genotypes, differences in the morphology of the CA3 pyramidal cells between the individual groups could be determined. Without the experience of stress, the neurons mostly had significantly more nodes; after stress, the spines were shown to be significantly reduced in at least one of the subpopulations. Mice with two or one wildtype serotonin transporter allele and experiencing only late aversive events had significantly longer apical dendrites than the reference with two wildtype alleles and experiencing no stress at all; homozygous serotonin transporter knockout mice of the same life history had significantly shorter apical dendrites compared to the reference. According to these findings, it can be supposed that stress in conjunction with genetically caused low amounts of the serotonin transporter can indeed increase the vulnerability for psychological disorders but that only late experiences of stress in combination with higher amounts of the serotonin transporter could also have a protective effect. KW - Ammonshorn KW - Hippocampus KW - Stress KW - Angst KW - Serotoninstoffwechsel KW - Pyramidenzelle KW - CA3 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-283542 ER - TY - THES A1 - Elsner, Clara Dorothea T1 - Ultrastructural analysis of biogenesis and release of endothelial extracellular vesicles T1 - Ultrastrukturelle Analyse der Biogenese und Freisetzung von endothelialen extrazellulären Vesikeln N2 - Extracellular vesicle (EV)-mediated intercellular communication through exosomes, microvesicles (MVs) and apoptotic bodies has been shown to be implicated in various physiological as well as pathological processes such as the development and progression of atherosclerosis. While the cellular machinery controlling EV formation and composition has been studied extensively, little is known about the underlying morphological processes. This study focuses on a detailed ultrastructural analysis of the different steps of EV formation and release in Myocardial Endothelial (MyEnd) and Aortic Endothelial (AoEnd) cells cultured under serum starvation and inflammatory stimulation with TNF-α. Detailed morphological analyses were conducted applying and comparing different high- resolution light and electron microscopic methods. In this study, we could depict all steps of MV biogenesis named in literature. However, during the study of exosome biogenesis, we discovered a yet undescribed process: Instead of a direct fusion with the plasma membrane, multivesicular bodies were incorporated into a new distinct cellular compartment bound by fenestrated endothelium first. This may present a novel step in exosome biogenesis and warrants further study. Regarding the conditions of cell cultivation, we observed that the commonly used serum starvation causes MyEnd cells, but not AoEnd cells, to enter apoptosis after 48 hours. When preparing functional EV studies, we therefore recommend assessing the morphological condition of the serum-starved cells at different cultivation points first. When evaluating MV production, a statistical analysis showed that the more time AoEnd cells spent in cultivation under serum starvation, the higher the percentage of MV producing cells. However, additional TNF-α stimulation induced a significantly higher MV production than serum starvation alone. Lastly, our results show that TNF-α stimulation of AoEnd cells in vitro leads to the upregulation of CD44, an adhesion molecule critical in the early stages of atherosclerosis. CD44 was then depicted on the surface of generated MVs and exosomes. We conclude that under inflammatory conditions, EVs can mediate the transfer of CD44 from endothelial cells to target cells. This could be a novel mechanism by which MVs contribute to the development and progression of atherosclerotic disease and should be clarified by further studies. N2 - Extrazelluläre Vesikel (EV), darunter Exosomen, Mikrovesikel (MV) und apoptotische Körperchen, werden von fast allen Zellen des Körpers freigesetzt, transportieren zellspezifische Informationen und sind von großer Bedeutung in der Zell-Zell-Kommunikation. Sie spielen eine zentrale Rolle in verschiedensten physiologischen sowie pathologischen Vorgängen, wie etwa der Atherosklerose. Während die zellulären Mechanismen hinter der Entstehung und Komposition der EV bereits intensiv erforscht wurden, ist noch wenig über die zugrundeliegenden morphologischen Prozesse bekannt. Diese Arbeit präsentiert eine detaillierte ultrastrukturelle Analyse der Bildung und Freisetzung von EV in myokardialen (MyEnd) und aortalen Endothelzellen (AoEnd), die unter Serumentzug sowie inflammatorischer Stimulation mit TNF-α kultiviert wurden. Dazu wendeten wir verschiedene hochauflösende licht- und elektronenmikroskopische Techniken an. Wir konnten alle in der Literatur beschriebenen Schritte der MV-Biogenese darstellen. Bei der Untersuchung der exosomalen Biogenese entdeckten wir jedoch einen bisher unbekannten Prozess: Anstelle einer direkten Fusion der multivesikulären Körperchen mit der Plasmamembran, wurden diese zunächst in ein neues, von fenestriertem Endothel begrenztes, zelluläres Kompartiment integriert. Ferner stellten wir fest, dass der häufig durchgeführte Serumentzug während der Kultivierung bei MyEnd- – allerdings nicht AoEnd- – Zellen nach 48 Stunden zur Apoptose führte. Daher empfehlen wir, bei funktionellen Studien von EV zunächst eine morphologische Untersuchung der unter Serumentzug kultivierten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten durchzuführen. Eine statistische Analyse der MV-Produktion zeigte, dass die Zellen umso mehr MV produzierten, je länger sie sich unter Serumentzug befanden. Jedoch induzierte eine zusätzliche Stimulation mit TNF-α eine signifikant höhere MV-Produktion als der alleinige Serumentzug. Wir konnten zeigen, dass eine TNF-α Stimulation von AoEnd Zellen in vitro zu einer vermehrten Expression von CD44 führte – einem vor allem in der Frühphase der Atherosklerose bedeutendem Adhäsionsmolekül. CD44 konnte ebenso auf der Oberfläche von produzierten MV und Exosomen nachgewiesen werden. Wir schließen daraus, dass MV unter inflammatorischen Bedingungen den Transfer von CD44 von Endothelzellen zu Zielzellen vermitteln und so zur Entstehung und Progression von Atherosklerose beitragen können. KW - Vesikel KW - Exosom KW - Endothelzelle KW - Zellkommunikation KW - Atherosklerose KW - Extracellular Vesicles KW - Microvesicles KW - Exosomes KW - Cell-cell communication KW - Electron microscopy Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-288526 ER - TY - THES A1 - Schmithausen, Patrick Alexander Gerhard T1 - Three-dimensional fluorescence image analysis of megakaryocytes and vascular structures in intact bone T1 - Dreidimensionale Fluoreszenzbildanalyse von Megakaryozyten und Gefäßstrukturen in intaktem Knochen N2 - The thesis provides insights in reconstruction and analysis pipelines for processing of three-dimensional cell and vessel images of megakaryopoiesis in intact murine bone. The images were captured in a Light Sheet Fluorescence Microscope. The work presented here is part of Collaborative Research Centre (CRC) 688 (project B07) of the University of Würzburg, performed at the Rudolf-Virchow Center. Despite ongoing research within the field of megakaryopoiesis, its spatio-temporal pattern of megakaryopoiesis is largely unknown. Deeper insight to this field is highly desirable to promote development of new therapeutic strategies for conditions related to thrombocytopathy as well as thrombocytopenia. The current concept of megakaryopoiesis is largely based on data from cryosectioning or in vitro studies indicating the existence of spatial niches within the bone marrow where specific stages of megakaryopoiesis take place. Since classic imaging of bone sections is typically limited to selective two-dimensional views and prone to cutting artefacts, imaging of intact murine bone is highly desired. However, this has its own challenges to meet, particularly in image reconstruction. Here, I worked on processing pipelines to account for irregular specimen staining or attenuation as well as the extreme heterogeneity of megakaryocyte morphology. Specific challenges for imaging and image reconstruction are tackled and solution strategies as well as remaining limitations are presented and discussed. Fortunately, modern image processing and segmentation strongly benefits from continuous advances in hardware as well as software-development. This thesis exemplifies how a combined effort in biomedicine, computer vision, data processing and image technology leads to deeper understanding of megakaryopoiesis. Tailored imaging pipelines significantly helped elucidating that the large megakaryocytes are broadly distributed throughout the bone marrow facing a surprisingly dense vessel network. No evidence was found for spatial niches in the bone marrow, eventually resulting in a revised model of megakaryopoiesis. N2 - Im Rahmen dieses Dissertationsvorhabens wurden Segmentierungs- und Auswertepipelines dreidimensionaler Bilder von Zellen und Gefäßen im intakten Mausknochen erarbeitet. Die Bilder entstanden durch Fluoreszenzaufnahmen eines Lichtblattmikroskops. Das Dissertationsvorhaben war Teil des Sonderforschungsbereichs 688 (Teilprojekts B07) der Universität Würzburg und es wurde am Rudolf-Virchow-Zentrum durchgeführt. Trotz einer Vielzahl aktueller Forschungsprojekte auf dem Gebiet der Megakaryopoese sind Erkenntnisse über deren räumlich-zeitliche Zusammenhänge größtenteils unbekannt. Neuere wissenschaftliche Erkenntnisse auf diesem Gebiet wären insbesondere hilfreich für die Weiterentwicklung von Behandlungsstrategien für Patienten, die an Thrombozytopenien oder Thrombozytopathien leiden. Das aktuell vorherrschende Modell zur Erklärung der Megakaryopoese geht von der Existenz räumlicher Nischen im Knochenmark aus, in denen sich die einzelnen Schritte der Megakaryopoese vollziehen. Dieses Modell basiert hauptsächlich auf Auswertungen von Gefrierschnitten sowie in-vitro Experimenten. Da die klassische Bildgebung von Knochenschnitten nur auf eine bestimmte Anzahl zweidimensionaler Schnitte begrenzt ist und deren Qualität unter Schnittartefakten leidet, ist die Bildgebung des intakten Knochens von besonderem Interesse. Dennoch führt dies zu neuen Herausforderungen im Bereich der Bilddatenauswertung. Im vorliegenden Dissertationsvorhaben beschäftige ich mich in diesem Bereich mit der Erarbeitung von Auswerteprotokollen, welche beispielsweise den Einfluss unregelmäßiger Färbungen oder Signalabschwächungen sowie die extreme Heterogenität der Megakaryozytenmorphologie berücksichtigen. Spezifische Herausforderungen für die Bildgebung und Bildrekonstruktion werden in Angriff genommen und Lösungsstrategien sowie verbleibende Einschränkungen werden vorgestellt und diskutiert. Erfreulicherweise profitieren insbesondere die moderne Bildbearbeitung sowie die Objekterkennung in großem Ausmaß von fortlaufenden Entwicklungen aus dem Hard- sowie Softwarebereich. Dieses Dissertationsvorhaben zeigt auf exemplarische Art und Weise auf, wie gemeinsame Forschungsanstrengungen im Bereich der Biomedizin, des Maschinellen Sehens, der Datenverarbeitung sowie der Bildtechnologie zu einem tieferen Verständnis der Megakaryopoese führen. Die maßgeschneiderten Pipelines zur Bilddatenauswertung stützten letztlich die These, dass größere Megakaryozyten im Knochenmark breit verteilt sind und von einem überraschend dichten Gefäßnetz umgeben sind. Beweise für die Existenz räumlicher Nischen im Knochenmark konnten nicht gefunden warden. Dieses führte schließlich zur Vorstellung eines überarbeiteten Modells der Megakaryopoese. KW - Megakaryozytopoese KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Megakaryozyt KW - Lichtscheibenmikroskopie KW - Bildverarbeitung KW - lightsheet microscopy KW - megakaryopoiesis KW - fluorescence microscopy KW - intact bone imaging KW - object segmentation KW - Lichtblattmikroskopie KW - Bildbearbeitung KW - Megakaryopoese KW - Bildgebung intakten Knochens Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178541 ER - TY - THES A1 - Deppermann, Carsten T1 - The role of platelet granules in thrombosis, hemostasis, stroke and inflammation T1 - Zur Rolle der Thrombozytengranula in Thrombose, Hämostase, Schlaganfall und Entzündung N2 - Platelets are small anucleate cell fragments derived from bone marrow megakaryocytes (MKs) and are important players in hemostasis and thrombosis. Platelet granules store factors which are released upon activation. There are three major types of platelet granules: alpha-granules, dense granules and lysosomes. While dense granules contain non-proteinacious factors which support platelet aggregation and adhesion, platelet alpha-granules contain more than 300 different proteins involved in various functions such as inflammation, wound healing and the maintenanceof vascular integrity, however, their functional significance in vivo remains unknown. This thesis summarizes analyses using three mouse models generated to investigate the role of platelet granules in thrombosis, hemostasis, stroke and inflammation. Unc13d-/- mice displayed defective platelet dense granule secretion, which resulted in abrogated thrombosis and hemostasis. Remarkably, Munc13-4-deficient mice were profoundly protected from infarct progression following transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) and this was not associated with increased intracranial bleeding indicating an essential involvementof dense granule secretion in infarct progression but not intracranial hemostasis during acute stroke with obvious therapeutic implications. In the second part of this thesis, the role of platelet alpha-granules was investigated using the Nbeal2-/- mouse. Mutations in NBEAL2 have been linked to the gray platelet syndrome (GPS), a rare inherited bleeding disorder. Nbeal2-/- mice displayed the characteristics of human GPS, with defective alpha-granule biogenesis in MKs and their absence from platelets. Nbeal2-deficiency did not affect MK differentiation and proplatelet formation in vitro or platelet life span in vivo. Nbeal2-/- platelets displayed impaired adhesion, aggregation, and coagulant activity ex vivo that translated into defective arterial thrombus formation and protection from thrombo-inflammatory brain infarction in vivo. In a model of skin wound repair, Nbeal2-/- mice exhibited impaired development of functional granulation tissue due to severely reduced differentiation of myofibroblasts. In the third part, the effects of combined deficiency of alpha- and dense granule secretion were analyzed using Unc13d-/-/Nbeal2-/- mice. Platelets of these mice showed impaired aggregation and adhesion to collagen under flow ex vivo, which translated into infinite tail bleeding times and severely defective arterial thrombus formation in vivo. When subjected to in vivo models of skin or lung inflammation, the double mutant mice showed no signs of hemorrhage. In contrast, lack of platelet granule release resulted in impaired vascular integrity in the ischemic brain following tMCAO leading to increased mortality. This indicates that while defective dense granule secretion or the paucity of alpha-granules alone have no effect on vascular integrity after stroke, the combination of both impairs vascular integrity and causes an increase in mortality. N2 - Thrombozyten sind kleine, kernlose Zellfragmente, die von Megakaryozyten (MKs) im Knochenmark gebildet werden und eine zentrale Rolle in Thrombose und Hämostase spielen. Thrombozytengranula speichern Faktoren, die nach Thrombozytenaktivierung freigesetzt werden. Die drei wichtigsten Thrombozytengranula sind alpha- und dichte Granula, sowie Lysosomen. Während dichte Granula vor allem anorganische Faktoren enthalten, welche die Thrombozytenaktivierung und -aggregation fördern, speichern alpha-Granula mehr als 300 verschiedene Proteine mit einer Vielzahl an Funktionen. Sie sind beispielsweise an Entzündungsprozessen, Wundheilung und der Aufrechterhaltung vaskulärer Integrität beteiligt. Die funktionelle Signifikanz dieser Faktoren, insbesondere in vivo, blieb bisher allerdings ungeklärt. Diese Doktorarbeit beschreibt die Analyse der Rolle von Thrombozytengranula in Thrombose, Hämostase, Schlaganfall und Entzündung unter Verwendung von drei Knockout-Mauslinien. Unc13d-/- Mäuse dienten als Modell, um die Rolle der dichten Granulasekretion in Thrombose, Hämostase, Schlaganfall und der Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität nach Thromboinflammation zu untersuchen. Die fehlende Freisetzung des Inhalts dichter Granula aus Thrombozyten dieser Mäuse führte zu defekter Thrombose und Hämostase. Unc13d-/- Mäuse zeigten deutlich kleinere Infarkte im tMCAO (transient middle cerebral artery occlusion)-Modell des ischämischen Schlaganfalls. Gleichzeitig wurde jedoch keine erhöhte Blutungsneigung im Gehirn nach Schlaganfall festgestellt. Dies deutet auf eine Schlüsselrolle der Sekretion dichter Granula in der Infarktentwicklung hin, die jedoch nicht die intrakranielle H¨amostase w¨ahrend des akuten Schlaganfalls beeinflusst. Der zweite Teil dieser Doktorarbeit behandelt die Rolle von alpha-Granula unter Verwendung der Nbeal2-/- Maus. Vor Kurzem wurde gezeigt, dass Mutationen im NBEAL2-Gen das Gray Platelet Syndrome (GPS) hervorrufen. Das GPS ist eine seltene erbliche Blutungskrankheit mit Makrothrombozytopenie, defekter alpha-Granulabiogenese in MKs und dem Fehlen thrombozytärer alpha-Granula. Nbeal2-Defizienz führte zu unveränderter MK-Differenzierung, Proplättchenbildung in vitro und Thrombozytenlebensdauer in vivo. Nbeal2-defiziente Thrombozyten zeigten jedoch verringerte Adhäsion, Aggregation und Koagulation ex vivo, welche zu einer gestörten arteriellen Thrombusbildung und Schutz vor thromboinflammatorischem Schlaganfall nach zerebraler Ischämie führte. In einem Wundheilungsmodell der Haut zeigte sich bei Nbeal2-defizienten Mäusen eine verringerte Bildung von Granulationsgewebe während des Heilungsvorgangs. Die Ursache hierfür lag in der reduzierten Myofibroblastendifferenzierung aufgrund fehlender alpha-Granulaausschüttung. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass alpha-Granulabestandteile nicht nur für Thrombose und Hämostase, sondern auch für akute thromboinflammatorische Krankheitszust¨ande und Geweberegeneration nach Verletzung essentiell sind. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt einer kombinierten Sekretionsdefizienz von alpha- und dichten Granula mithilfe von Unc13d-/-/Nbeal2-/- Mäusen untersucht. Thrombozyten dieser Mäuse zeigten verringerte Aggregation und Adhäsion an Kollagen unter Flussbedingungen ex vivo, sowie massiv verlängerte Blutungszeiten und defekte Thrombusbildung in vivo. Die defekte Granulafreisetzung in Unc13d-/-/Nbeal2-/- Mäusen führte zum Zusammenbruch der vaskulären Integrität im tMCAO-Modell des ischämischen Schlaganfalls und zu einer erhöhten Mortalitätsrate. Im Gegensatz dazu zeigten die doppeldefizienten Mäuse in in vivo Modellen der Haut- oder Lungenentzündung keine Einblutungen. Dies deutet darauf hin, dass die fehlende Sekretion dichter Granula oder die Abwesenheit von alpha-Granula für sich genommen keinen Einfluss auf die Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität nach Schlaganfall hat. Die Kombination beider Defekte führt jedoch zum Zusammenbruch der zerebrovaskulären Integrität und erhöhter Mortalität nach Schlaganfall. KW - Thrombozyten KW - Schlaganfall KW - Entzündung KW - Platelet granules KW - Thrombosis KW - Hemostasis KW - Stroke KW - Inflammation Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121010 ER -