TY - THES A1 - Paul, Mila Marie T1 - Vesikelverkehr in Aktiven Zonen T1 - Vesicle cycle in active zones N2 - Aktive Zonen (AZs) sind hoch spezialisierte, subzelluläre Kompartimente von Neuronen, die der synaptischen Übertragung dienen. Sie enthalten Gerüstproteine wie RIM (Rab3 interacting molecule) sowie elektronendichte Projektionen bestehend aus Bruchpilot bei Drosophila melanogaster oder Bassoon im Säuger, welche Schlüsselkomponenten des Vesikelverkehrs darstellen. Bei der Fliege sind Anzahl und Verteilung von Bruchpilot-Molekülen in AZs relevant für die funktionelle Differenzierung. Ihre Anordnung wird im Abstand von weniger als einem Mikrometer innerhalb einer präsynaptischen Endigung reguliert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden elektrophysiologische Ableitungen und konfokale sowie höchstauflösende, immunhistochemische Bildgebung mit dem dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) Verfahren an larvalen, neuromuskulären Synapsen von Drosophila durchgeführt. Dabei wurde das genetische Potenzial des Modellorganismus genutzt, um relevante Proteinfunktionen und -interaktionen zu analysieren. RIM als zentrale Komponente Aktiver Zonen ist relevant für synaptische Plastizität. Eine als CORD7 (cone-rod dystrophy type 7) bezeichnete Punktmutation (Arginin zu Histidin) innerhalb der 310 Helix der C2A-Domäne von RIM wurde mit erhöhten kognitiven Fähigkeiten einer Patientengruppe in Verbindung gebracht. Weil die Drosophila C2A-Domäne eine hohe Homologie zur Säugerdomäne aufweist, konnte der Einfluss dieser Mutation auf Struktur und Funktion von Synapsen untersucht werden. Es zeigte sich, dass der Aminosäureaustausch der CORD7-Position und des benachbarten Arginin-Restes die synaptische Organisation und Transmission beeinflussen. In einer Reihe weiterer Experimente wurde das Zusammenspiel von Bruchpilot und Synaptotagmin, dem Calciumsensor der evozierten Transmitterfreisetzung, analysiert. Während AZs ohne Bruchpilot auch ohne Synaptotagmin funktionieren, führt dessen Reduktion zu einer Umverteilung von Bruchpilot-Molekülen innerhalb von AZs und zu dramatischen Änderungen in ihrer Anzahl. Abschließend wurde so ein Beitrag zum Verständnis der molekularen Organisation synaptischer Informationsverarbeitung und Plastizität geleistet, wobei zu klären bleibt, wie die zuverlässige Speicherung von Informationen an AZs erreicht werden kann. N2 - Vesicle cycle in active zones KW - Aktive Zonen KW - active zone KW - Synapse KW - RIM KW - Synaptotagmin KW - synapse Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110791 ER - TY - THES A1 - Mrestani, Achmed T1 - Strukturelle Differenzierung und Plastizität präsynaptischer Aktiver Zonen T1 - Structural differentiation and plasticity of presynaptic active zones N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war die nanoskopische Analyse struktureller Differenzierung und Plastizität präsynaptischer aktiver Zonen (AZs) an der NMJ von Drosophila melanogaster mittels hochauflösender, lichtmikroskopischer Bildgebung von Bruchpilot (Brp). In erster Linie wurde das lokalisationsmikroskopische Verfahren dSTORM angewendet. Es wurden neue Analyse-Algorithmen auf der Basis von HDBSCAN entwickelt, um eine objektive, in weiten Teilen automatisierte Quantifizierung bis auf Ebene der Substruktur der AZ zu ermöglichen. Die Differenzierung wurde am Beispiel phasischer und tonischer Synapsen, die an dieser NMJ durch Is- und Ib-Neurone gebildet werden, untersucht. Phasische Is-Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit zeigten kleinere, kompaktere AZs mit weniger Molekülen und höherer molekularer Dichte mit ebenfalls kleineren, kompakteren Brp-Subclustern. Akute strukturelle Plastizität wurde am Beispiel präsynaptischer Homöostase, bei der es zu einer kompensatorisch erhöhten Neurotransmitterfreisetzung kommt, analysiert. Interessanterweise zeigte sich hier ebenfalls eine kompaktere Konfiguration der AZ, die sich auch auf Ebene der Subcluster widerspiegelte, ohne Rekrutierung von Molekülen. Es konnte demonstriert werden, dass sich eine höhere Moleküldichte in der Lokalisationsmikroskopie in eine höhere Intensität und größere Fläche in der konfokalen Mikroskopie übersetzt, und damit der Zusammenhang zu scheinbar gegensätzlichen Vorbefunden hergestellt werden. Die Verdichtung bzw. Kompaktierung erscheint im Zusammenhang mit der Kopplungsdistanz zwischen VGCCs und präsynaptischen Vesikeln als plausibles Muster der effizienten Anordnung molekularer Komponenten der AZ. Die hier eingeführten Analysewerkzeuge und molekularbiologischen Strategien, basierend auf dem CRISPR/Cas9-System, zur Markierung von AZ-Komponenten können zukünftig zur weiteren Klärung der Bedeutung der molekularen Verdichtung als allgemeines Konzept der AZ-Differenzierung beitragen. N2 - The aim of this work was a nanoscopic analysis of structural differentiation and plasticity of presynaptic active zones (AZs) at the NMJ of Drosophila melanogaster using super-resolution light microscopy of Bruchpilot (Brp). The localization microscopy technique dSTORM was primarily used. New analysis algorithms based on HDBSCAN were developed to ensure objective and largely automatized quantification including the substructure of the AZ. Differentiation was assessed using the model of phasic and tonic neurons that are represented by type Is and type Ib neurons at this NMJ. Phasic Is synapses with higher release probability displayed smaller, more compact AZs with less molecules and an enhanced molecular density with smaller, more compact Brp subclusters. For acute structural plasticity the model of presynaptic homeostasis, which is accompanied by a compensatory increase of neurotransmitter release, was used. Interestingly, this again showed a more compact arrangement of the AZ, that was also found in Brp subclusters, without addition of molecules. It could be demonstrated that a higher molecular density in localization microscopy translates into a higher intensity and area in confocal microscopy and, thus, the apparent discrepancy to earlier studies could be explained. With respect to the coupling distance between VGCCs and presynaptic vesicles compaction appears to be a plausible mechanism for an efficient remodeling of AZ components. The analysis tools and molecular biology strategies, based on the CRISPR/Cas9-System, introduced here will be useful to further clarify the importance of molecular compaction as a general concept of AZ differentiation. KW - Synapse KW - Neuronale Plastizität KW - Taufliege KW - Immunfluoreszenz KW - CRISPR/Cas-Methode KW - Hochauflösende Lichtmikroskopie KW - HDBSCAN KW - Bruchpilot Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235787 ER -