TY - THES A1 - Lechermeier, Carina T1 - Neuroanatomical and functional evaluation of ADHD candidate genes in the model organism zebrafish (\(Danio\) \(rerio\)) T1 - Neuroanatomische und funktionelle Auswertung von ADHS Kandidatengenen im Modellorganismus Zebrafisch (\(Danio\) \(rerio\)) N2 - Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is one of the most prevalent developmental disorders, affecting 5.9% children and adolescents and 2.5% adults worldwide. The core characteristics are age-inappropriate levels of hyperactivity, impulsivity and inattention, often accompanied by co-morbidities such as mood and conduct disorders as wells as learning deficits. In the majority of cases, ADHD is caused by an interplay of accumulated genetic and environmental risk factors. Twin studies report a very high heritability of 70–80%, however, common genetic variants in the population only explain a third of the heritability. The rest of the genetic predisposition is composed of rare copy number variations (CNVs) and gene x environment interactions including epigenetic alterations. Through genome wide association (GWAS) and linkage studies a number of likely candidate genes were identified. A handful of them play a role in dopamine or noradrenaline neurotransmitter systems, simultaneously those systems are the main targets of common drug treatment approaches. However, for the majority of candidates the biological function in relation to ADHD is unknown. It is crucial to identify those functions in order to gain a deeper understanding of the pathomechanism and genetic networks potentially responsible for the disorder. This work focuses on the three candidate genes GFOD1, SLC2A3 and LBX1 and their role in the healthy organism as well as in case of ADHD. The neuroanatomy was regarded through expression analysis and various behavioural assays of activity were performed to link alterations on the transcript level to phenotypes associated with the neurodevelopmental disorder. Zebrafish orthologues of the human risk genes were identified and extensive temporal and spacial expression characterisation performed via RNA in situ hybridisation. Through morpholino derived knock-down and mRNA overexpression zebrafish models with subsequent behavioural analysis, both hyper- and hypoactive phenotypes were discovered. Additional expression analysis through double in situ hybridisation revealed a co-localisation during zebrafish neurodevelopment of each gfod1 and slc2a3a together with gad1b, a marker for GABAergic neurons. Interestingly, both risk genes have previously been associated with glucose homeostasis and energy metabolism, which when disrupted could lead to alterations in signal transduction and neuron survival. Likewise, Lbx1 plays a pivotal role in GABAergic versus glutamatergic neuron specification during spinal cord and hindbrain development in mice and chicken. Preliminary results of this work suggest a similar role in zebrafish. Taken together, those findings on the one hand represent a sturdy basis to con- tinue studies of the function of the genes and on the other hand open up the opportunity to investigate novel aspects of ADHD research by exploring the role of the GABAergic neurotransmitter system or the connection between energy metabolism and psychiatric disorders. N2 - Die Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) ist eine der am weitesten verbreiteten Entwicklungsstörungen, davon sind 5,9% Kinder und Jugendliche und 2,5% Erwachsene weltweit betroffen. Die Kernsymptome sind altersunangemessene Hyperaktivität, Impulsivität und Unaufmerksamkeit, oft begleitet von Begleiterkrankungen wie emotionale Dysregulation oder Verhal- tensauffälligkeiten sowie Lerndefiziten. In den meisten Fällen wird ADHS durch ein Zusammenspiel von angehäuften genetischen und umweltbedingten Risikofaktoren verursacht. Durch Zwillingsstudien gelang man zu einer errechneten Erblichkeit von 70–80%, jedoch erklären häufig auftretende genetische Varianten in der Bevölkerung nur ein Drittel der Erblichkeit. Der Rest der genetischen Veranlagung setzt sich aus seltenen Kopienzahlvariationen (CNV) und Interaktionen von Gen x Umwelt, einschließlich epigenetischer Veränderungen, zusammen. Durch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) und Kopplungsanalysen wurden eine Reihe von wahrscheinlichen Kandidatengenen identifiziert. Eine Handvoll von ihnen spielen eine Rolle in den Dopamin oder Noradrenalin Neurotransmittersystemen. Diese Systeme sind gleichzeitig die Hauptangriffspunkte der gängigsten Medikamente, die zur Behandlung von ADHS eingesetzt werden. Allerdings ist für die Mehrheit der Kandidatengene die biologische Funktion in Bezug auf ADHS unbekannt. Es ist essentiell diese Funktionen zu identifizieren um ein tieferes Verständnis der Ätiopathogenese und der genetische Netzwerke, die möglicherweise für die Störung verantwortlich sind, zu erlangen. Diese Arbeit konzentriert sich auf die drei Kandidatengene GFOD1, SLC2A3 und LBX1 und ihre Rolle im gesunden Organismus sowie während ADHS. Die Neuroanatomie wurde durch Expressionsanalyse betrachtet und verschiedene aktivitätsbasierte Verhaltensessays wurden durchgeführt, um Veränderungen auf Transkriptebene mit den zugehörigen Phänotypen der neurologischen Entwick- lungsstörung in Verbindung zu bringen. Zebrafischorthologe der menschlichen Kandidatengene wurden identifiziert und umfangreiche zeitliche und räumli- che Expressionsanalysen via RNA in situ Hybridisierung durchgeführt. Durch Morpholino-Knockdown und mRNA-Überexpressions Zebrafischmodelle mit anschließender Verhaltensanalyse wurden sowohl hyper- als auch hypoaktive Phänotypen entdeckt. Eine zusätzliche Expressionsanalyse durch doppelte in situ Hybridisierung ergab eine Kolokalisierung während der Zebrafischneuroentwicklung von jeweils gfod1 und slc2a3a zusammen mit gad1b, einem Marker für GABAerge Neuronen. Interessanterweise wurden beide Risikogene zuvor mit der Glukosehomöostase und dem Energiestoffwechsel in Verbindung gebracht, die, wenn sie gestört werden, zu Veränderungen der Signalübertragung und der Lebensdauer von Neuronen führen können. Desgleichen spielt Lbx1 eine entscheidende Rolle bei der Spezifikation von GABAergen versus glutamatergenen Neuronen während der Entwicklung des Rückenmarks in der Wirbelsäule und im Hinterhirn von Mäusen und Hühnern. Vorläufige Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine ähnliche Rolle beim Zebrafisch hin. Zusammengenommen stellen diese Erkenntnisse einerseits eine solide Grundlage für weitere Untersuchungen zur Funktion der Gene dar, andererseits eröffnet sich daraus die Möglichkeit neue Aspekte der ADHS-Forschung zu untersuchen, bei denen der Fokus auf der Rolle des GABAergen Neurotransmittersystems oder der Beziehung zwischen Energiestoffwechsel und psychiatrischen Erkrankungen liegt. KW - Aufmerksamkeitsdefizit-Syndrom KW - Zebrabärbling KW - ADHD KW - zebrafish KW - genes KW - behaviour KW - ADHS Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371084 ER - TY - THES A1 - Fohmann, Ingo T1 - The Role of Sphingosine 1-phosphate and S1PR1-3 in the Pathophysiology of Meningococcal Meningitis T1 - Die Rolle von Sphingosin 1-Phosphat und S1PR1-3 in der Pathophysiologie der durch Meningokokken ausgelösten Meningitis N2 - Neisseria meningitidis (N. meningitidis) is an obligate human pathogen which causes live-threatening sepsis and meningitis. The fatality rate after meningococcal infection is high and surviving patients often suffer from severe sequelae. To cause meningitis, N. meningitidis must overcome the endothelium of the blood-brain barrier. The bacterium achieves this through the interaction with endothelial surface receptors leading to alternations of the cellular metabolism and signaling, which lastly results in cellular uptake and barrier traversal of N. meningitidis. Sphingosine 1-phosphate (S1P) is a lipid mediator that belongs to the class of sphingolipids and regulates the integrity of the blood-brain barrier through the interaction with its cognate receptors S1P receptors 1-3 (S1PR1-3). In this study, high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS) was used to generate a time-resolved picture of the sphingolipid metabolism in a brain endothelial cell line (hCMEC/D3) upon meningococcal infection. Among various changes, S1P was elevated in the cellular compartment as well as in the supernatant of infected hCMEC/D3s. Analysis of mRNA expression in infected hCMEC/D3s with quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) revealed that the increase in S1P could be attributed to the enhanced expression of the S1P-generating enzyme sphingosine kinase 1 (SphK1). Antibody-based detection of SphK1 protein or phosphorylation at SphK1 residue Serine 225 in hCMEC/D3 plasma membrane fractions via Western Blot revealed that N. meningitidis also induced SphK1 phospho-activation and recruitment to the plasma membrane. Importantly, recruitment of SphK1 to the plasma membrane increases the probability of substrate encounter, thus elevating SphK activity. Enhanced SphK activity was also reflected on a functional level, as detected by a commercially available ATP depletion assay used for measuring the enzymatic activity of SphK. Infection of hCMEC/D3 cells with pilus-deficient mutants resulted in a lower SphK activation compared to the N. meningitidis wild type strain. hCMEC/D3 treatment with pilus-enriched protein fractions showed SphK activation similar to the infection with living bacteria and could be ascribed to pilus interaction with the membrane-proximal domain of cellular surface receptor CD147. Inhibition of SphK1 or SphK2 through pre-treatment with specific inhibitors or RNA interference reduced uptake of N. meningitidis into hCMEC/D3 cells, as measured with Gentamicin protection assays. Released S1P induced the phospho-activation of epidermal growth factor receptor (EGFR) via S1PR2 activation, whose expression was also increasing during infection. Furthermore, S1PR2 blockage had a preventive effect on bacterial invasion into hCMEC/D3 cells. On the contrary, activation of S1PR1+3 also reduced bacterial uptake, indicating an opposing regulatory role of S1PR1+3 and S1PR2 during N. meningitidis uptake. Moreover, SphK2 inhibition prevented inflammatory cytokine expression as well as release of interleukin-8 after N. meningitidis infection. Taken together, this study demonstrates the central role of S1P and its cognate receptors S1PR1-3 in the pathophysiology of meningococcal meningitis. N2 - Neisseria meningitidis (N. meningitidis) ist ein obligat humanpathogenes Bakterium, welches lebensbedrohliche Sepsis und Meningitis auslöst. Die Todesrate nach einer Meningokokkeninfektion ist hoch und überlebende Patienten leiden oft unter gravierenden Folgeschäden. N. meningitidis muss zuerst das Endothel der Blut-Hirn-Schranke überwinden, um Meningitis auslösen zu können. Das Bakterium erzielt dies durch die Interaktion mit endothelialen Rezeptoren, welche den zellulären Metabolismus und die zellulären Signalwege beeinflusst und letztlich zur zellulären Aufnahme von N. meningitidis und zur Überwindung der Barriere führt. Sphingosine 1-phosphat (S1P) ist ein Lipidmediator, der zur Klasse der Sphingolipide gehört und die Integrität der Blut-Hirn-Schranke durch die Interaktion mit den zugehörigen S1P Rezeptoren 1-3 (S1PR1-3s) beeinflusst. In dieser Arbeit wurde Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie (LC-MS/MS) genutzt, um ein zeitlich aufgelöstes Bild des Sphingolipidmetabolismus in einer Hinendothelzelllinie (hCMEC/D3) nach Meningokokkeninfektion zu generieren. Neben zahlreichen Veränderungen zeigte sich ein Anstieg von S1P im zellulären Kompartiment und im Überstand von infizierten hCMEC/D3 Zellen. Die Analyse der mRNA Expression in infizierten hCMEC/D3 Zellen mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) offenbarte, dass der Anstieg von S1P auf eine erhöhte Expression der S1P-bildenden Sphingosinkinase 1 (SphK1) zurückzuführen war. Die ntikörperbasierte Detektion des Proteins SphK1 oder dessen Phosphorylierung an Serin 225 in den Membranfraktionen von hCMEC/D3 Zellen mittels Western Blot zeigte, dass N. meningitidis außerdem die Phospho-Aktivierung und Membrantranslokation von SphK1 induzierte. Die Plasmamembrantranslokation von SphK1 erhöht die Wahrscheinlichkeit auf das Substrat Sphingosine zu treffen und verstärkt somit die SphK-Aktivität. Die erhöhte SphK-Aktivität zeigte sich auch auf funktioneller Ebene, wie mittels eines ATP-Verbrauchs-Assays zur Messung der SphK-Aktivität nachgewiesen werden konnte. Die Infektion von hCMEC/D3 Zellen mit Pilus-defizienten Mutanten resultierte in einer geringeren SphK-Aktivierung im Vergleich zum Wildtypstamm. Die Behandlung von hCMEC/D3 Zellen mit Pilus-aufgereinigten Fraktionen zeigte eine SphK-Aktivierung, die mit der Aktivierung durch lebende Bakterien vergleichbar war und der Interaktion des Pilus mit der membranproximalen Domäne des zellulären Oberflächenrezeptors CD147 zugeordnet werden konnte. Die Inhibition von SphK1 und SphK2 durch die Vorbehandlung mit spezifischen Inhibitoren oder RNA-Interferenz reduzierte die Aufnahme von N. meningitidis in hCMEC/D3 Zellen, wie mittels Gentamicin Protection Assay nachgewiesen wurde. Das freigesetzte S1P induzierte die Phospho-Aktivierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) durch die Aktivierung von S1PR2, welcher während der Infektion vermehrt exprimiert wurde. Die Blockierung von S1PR2 hatte einen präventiven Effekt auf die bakterielle Invasion in hCMEC/D3 Zellen. Im Gegenzug reduzierte die Aktivierung von S1PR1+3 ebenfalls die bakterielle Aufnahme, was auf eine gegensätzliche regulatorische Rolle von S1PR1+3 und S1PR2 während der Aufnahme von N. meningitidis in hCMEC/D3 Zellen hindeutet. Darüber hinaus verhinderte die Inhibition von SphK2 die Expression von inflammatorischen Cytokinen sowie die Freisetzung von Interleukin-8 nach Infektion mit N. meningitidis. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die zentrale Rolle von S1P und den zugehörigen Rezeptoren S1PR1-3 in der Pathophysiologie der durch Meningokokken ausgelösten Meningitis. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Sphingosinkinase KW - Sphingolipide KW - Bakterielle Infektion KW - Sphingosine 1-phosphate KW - Sphingosine 1-phosphate receptor KW - Epidermal growth factor receptor KW - CD147 KW - S1P KW - S1PR KW - Meningococci KW - Basigin KW - EGFR KW - Meningitis cerebrospinalis epidemica KW - Meningitis, Meningococcal Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369764 ER -