TY  - THES
A1  - Eman, Maher Othman Sholkamy
T1  - In Vitro and In Vivo Analysis of Insulin-Induced Oxidative Stress and DNA Damage
T1  - In vitro und in vivo Untersuchungen von  Insulin-induzierten oxidativen Stress und  DNA-Schäden
N2  - Hyperinsulinemia, a condition with excessively high insulin blood levels, is related to an increased cancer incidence. Diabetes mellitus, metabolic syndrome, obesity and polycystic ovarian syndrome are the most common of several diseases accompanied by hyperinsulinemia. Since an elevated cancer risk especially for colon and kidney cancers, was reported for those patients, we investigated for the first time the induction of genomic damage by insulin mainly in HT29 (human colon cells), LLC-PK1 (pig kidney cells), HK2 (human kidney cells) and peripheral lymphocytes, and to confirm the genotoxicity of insulin in other cells from different tissues. To ascertain that the insulin effects were not only limited to permanent cell lines, rat primary colon, kidney, liver and fatty tissue cells were also studied. To connect the study and the findings to in vivo conditions, two in vivo models for hyperinsulinemia were used; Zucker diabetic fatty rats in a lean and diabetic state infused with different insulin concentrations and peripheral lymphocytes from type 2 diabetes mellitus patients. First, the human colon adenocarcinoma cells (HT29) showed significant elevation of DNA damage using comet assay and micronucleus frequency analysis upon treatment with 5 nM insulin in standard protocols. Extension of the treatment to 6 days lowered the concentration needed to reach significance to 0.5-1 nM. Insulin enhanced the cellular ROS production as examined by the oxidation of the dyes 2´,7´-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) and dihydroethidium (DHE). The FPG modified comet assay and the reduction of damage by the radical scavenger tempol connected the insulin-mediatedDNA damage to ROS production. To investigate the sources of ROS upon insulin stimulation, apocynin and VAS2870 as NADPH oxidase inhibitors and rotenone as mitochondrial inhibitor were applied in combination with insulin and all of them led to a reduction of the genomic damage. Investigation of the signaling pathway started by evaluation of the binding of insulin to its receptor and to the IGF-1 receptor. The results showed the involvement of both receptors in the signaling mechanism. Following the activation of both receptors, PI3K activation occurs leading to phosphorylation of AKT which in turn activates two pathways for ROS production, the first related to mitochondria and the second through activation of Rac1 , resulting in the activation of Nox1. Both pathways could be activated through AKT or through the mitochondrial ROS which in turn could activates Nox1. Studying another human colon cancer cell line, Caco-2 and rat primary colon cells in vitro confirmed the effect of insulin on cellular chromatin. We conclude that pathophysiological levels of insulin can cause DNA damage in colon cells, which may contribute to the induction or progression of colon cancer. Second, in kidney cells, insulin at a concentration of 5 nM caused a significant increase in DNA damage in vitro. This was associated with the formation of reactive oxygen species (ROS). In the presence of antioxidants, blockers of the insulin and IGF-1 receptors, and a phosphatidylinositol 3-kinases (PI3K) inhibitor, the insulin mediated DNA damage was reduced. Phosphorylation of AKT was increased and p53 accumulated. Inhibition of the mitochondrial and NADPH oxidase related ROS production reduced the insulin mediated damage. In primary rat cells insulin also induced genomic damage. HK2 cells were used to investigate the mechanistic pathway in the kidney The signaling is identical to the one in the colon cells untill the activation of the mitochondrial ROS production, because after the activation of PI3K activation of Nox4 occurs at the same time across talk between mitochondria and Nox4 activation has been suggested and might play a role in the observed effects. In the in vivo model, kidneys from healthy, lean ZDF rats, which were infused with insulin to yield normal or high blood insulin levels, while keeping blood glucose levels constant, the amounts of ROS and p53 were elevated in the high insulin group compared to the control level group. ROS and p53 were also elevated in diabetic obese ZDF rats. The treatment of the diabetic rats with metformin reduced the DNA oxidation measured as 8-oxodG as well as the ROS production in that group. HL60 the human premyelocytic cells and cultured lymphocytes as models for the hemopoietic system cells showed a significant induction for DNA damage upon treatment with insulin. The diabetic patients also exhibited an increase in the micronucleus formation over the healthy individuals. In the present study, we showed for the first time that insulin induced oxidative stress resulting in genomic damage in different tissues, and that the source of the produced ROS differs between the tissues. If the same mechanisms are active in patients, hyperinsulinemia might cause genomic damage through the induction of ROS contributing to the increased cancer risk, against which the use of antioxidants as well as mitochondrial and NADPH oxidase inhibitors might exert protective effects with cancer preventive potential under certain conditions. Normal healthy human plasma insulin concentrations are in the order of 0.04 nM after overnight fasting and increase to less than about 0.2 nM after a meal. Pathophysiological levels can reach 1 nM and can stay above 0.2 nM for the majority of the daytime yielding condictions close to the insulin concentrations determined in the present study. Whether the observed effects also occur in vivo and whether they actually initiate or promote tumor formation remains to be determined. However, if proof of that can be obtained, our experiments with inhibitors indicate chances for pharmacological intervention applying antioxidants or enzyme inhibitors. It will not be the aim to reduce ROS in any case or as much as possible because ROS have now been recognized as important signaling molecules and participatants in immune defense, but a reduction to physiological levels instead of pathophysiological levels in the context of a disease associated with ROS overproduction might be beneficial.
N2  - Hyperinsulinämie, ein Zustand mit sehr hohen Blutspiegeln an Insulin, ist mit einer erhöhten Krebsinzidenz verbunden. Diabetes mellitus, das metabolische Syndrom, Adipositas und das polyzystische Ovarialsyndrom sind die häufigsten Krankheiten, die mit Hyperinsulinämie einhergehen. Da ein erhöhtes Krebsrisiko insbesondere für Krebserkrankungen des Dickdarms und der Niere beobachtet wurde, untersuchten wir erstmals die Induktion von Genomschäden durch Insulin in HT29-Zellen (humane Dickdarmzellen), LLC-PK1-Zellen (Nierenzellen vom Schwein), HK2-Zellen (humane Nierenzellen) und peripheren humanen Lymphozyten. Um die Gentoxizität von Insulin zu bestätigen, wurden auch andere Zellen aus unterschiedlichen Geweben untersucht. Um sicherzustellen, dass die Effekte durch Insulin nicht auf permanente Zelllinien beschränkt sind, wurden außerdem primäre Rattenzellen aus Dickdarm, Niere, Leber und Fettgewebe untersucht. Um die Befunde auf die in-vivo-Situation übertragen zu können, kamen zwei Hyperinsulinämie-Modelle zum Einsatz: mit Insulin infundierte ZDF-Ratten (Zucker Diabetic Fatty Rats) und periphere Lymphozyten von Patienten mit Diabetes Typ 2. Zuerst konnte in humanen Adenokarzinomzellen des Dickdarms (HT29) eine signifikante Erhöhung des DNA-Schadens in Standard-Protokollen des Comet Assays und des Mikrokerntests nach Behandlung mit 5 nM Insulin gezeigt werden. Bei Verlängerung der Behandlungszeit auf 6 Tage wurden signifikante Effekte bereits ab 0,5 nM beobachtet. Insulin erhöhte die zelluläre ROS-Produktion, die als Oxidation der Farbstoffe 2‘,7‘-Dichlorodihydrofluoresceindiacetat (H2DCF-DA) und Dihydroethidium (DHE) nachgewiesen wurde. Befunde aus dem FPG-modifizierten Comet Assay und das Ergebnis, dass der Radikalfänger Tempol die Zellen schützte stellen die Verbindung zwischen Insulin-verursachtem DNA-Schaden und ROS produktion her. Um die ROS-Quelle nach Stimulation mit Insulin zu untersuchen, wurden Apocynin und VAS2870 als NADPH-Oxidase-Inhibitoren und Rotenon als Inhibitor der Mitochondrien mit Insulin kombiniert. Alle diese Stoffe reduzierten den Genomschaden. Zur Charakterisierung der Signalwege wurde zunächst die Bindung von Insulin an seinen Rezeptor und an den IGF1-Rezeptor untersucht. Beide Rezeptoren sind an der Signaltransduktion beteiligt. Nach Aktivierung der Rezeptoren wird die PI3K aktiviert, dies führt zur Phosphorylierung von AKT. Dadurch werden zwei Wege zur ROS-Produktion aktiviert, der erste involviert die mitochondriale Atmungskette , der zweite agiert durch Rac1-Aktivierung. Letzteres resultiert in der Aktivierung der NADPH-Oxidase Isoform Nox1. Der Effekt von Insulin auf zelluläres Chromatin konnte in einer weiteren humanen Dickdarmkrebs-Zelllinie und in primären Dickdarmzellen der Ratte in vitro bestätigt werden. Wir schlussfolgern aus diesen Ergebnissen, dass pathophysiologische Insulin-Blutspiegel DNA-Schäden im Dickdarm verursachen können. Dies könnte zur Induktion oder Progression von Dickdarmkrebs beitragen. Weiterhin verursachte Insulin bei einer Konzentration von 5 nM einen signifikanten Anstieg von DNA-Schäden in vitro. Dies war verbunden mit der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Bei Anwesenheit von Antioxidantien, von Inhibitoren des Insulin-Rezeptors bzw. des IGF-1-Rezeptors und eines Phosphatidylinositol-3-Kinase(PI3K)-Inhibitors war der Insulin-vermittelte DNA-Schaden reduziert. Phosphorylierung von AKT war erhöht und das Protein P53 akkumulierte. Inhibierung der ROS-Produktion der Mitochondrien bzw. der NADPH-Oxidase reduzierte den Insulin-vermittelten Schaden. In primären Rattenzellen induzierte Insulin ebenfalls Genomschaden. HK2-Zellen wurden zur Untersuchung der mechanistischen Signalwege in der Niere eingesetzt. Die Signalwege entsprechen denen der Dickdarmzellen bis zur Aktivierung der ROS-Produktion in den Mitochondrien. Als Folge der Aktivierung von PI3K wird Nox4 aktiviert. Eine Verbindung zwischen Mitochondrien und Nox4-Aktivierung wird vorgeschlagen. Als in-vivo-Modell wurden gesunde ZDF-Ratten mit Insulin infundiert, um normale bzw. erhöhte Insulin-Blutspiegel bei konstanten Glukose-Blutspiegeln zu erreichen. In den Nieren war der Gehalt an ROS und an P53 in der Gruppe mit erhöhten Insulin-Blutspiegeln im Vergleich zur Kontrolle erhöht. ROS und P53 waren ebenfalls in den diabetischen und adipösen ZDF-Ratten erhöht. Die Behandlung der diabetischen Ratten mit Metformin reduzierte die DNA-Oxidation, die in Form von 8-oxodG bestimmt wurde, und die ROS-Produktion in dieser Gruppe. HL60-Zellen und kultivierte Lymphozyten als Modelle für das hämatopoetische System zeigten eine signifikante Induktion von DNA-Schäden nach Behandlung mit Insulin. Diabetes-Patienten zeigten eine erhöhte Mikrokern-Bildung im Vergleich zu gesunden Probanden. In der vorliegenden Studie konnten wir erstmals zeigen, dass Insulin-induzierter oxidativer Stress zu Genomschaden führt, und dass in unterschiedlichen Geweben ROS aus verschiedenen Quellen stammten. Falls diese Mechanismen auch in Patienten auftreten, könnte Hyperinsulinämie durch ROS-Induktion zu Genomschaden führen und damit zu einem erhöhten Krebsrisiko beitragen. Unter bestimmten Bedingungen könnten Antioxidantien bzw. Inhibitoren der Mitochondrien oder der NADPH-Oxidase protektive Effekte ausüben.
KW  - Insulin
KW  - Oxidativer Stress
KW  - DNS-Schädigung
KW  - oxidativer Stress
KW  - DNA Schaden
KW  - Insulin
KW  - Insulin
KW  - Oxidative Stress
KW  - DNA Damage
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69274
ER  - 
TY  - THES
A1  - Engelhardt, Stefan
T1  - Transgene Mausmodelle zur Charakterisierung der Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren
T1  - Characterization of cardiac beta-adrenergic receptors through the use of transgenic mouse models
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren mit Hilfe einer Kombination aus transgenen Mausmodellen und physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Durch gezielte Überexpression des humanen beta1-adrenergen Rezeptors im Herzen transgener Mäuse konnte gezeigt werden, daß die chronische Aktivierung dieses Rezeptors eine trophische Wirkung auf die Herzmuskelzellen hat. Über einen Zeitraum von mehreren Monaten führte dies zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. In der menschlichen Herzinsuffizienz kommt es zu einem ähnlichen Phänomen: Durch deutlich erhöhte Freisetzung von endogenen Katecholaminen kommt es zu einer chronischen Dauerstimulation kardialer beta1-adrenerger Rezeptoren. Daß diese schädlich ist belegen das hier beschriebene Mausmodell und zudem einige neuere klinische Studien, die zeigen daß eine pharmakologische Blockade beta-adrenerger Rezeptoren zu einer Verminderung der Herzinsuffizienzmortalität führt. Dieses Mausmodell erlaubte es erstmals den beta1-adrenergen Rezeptor hinsichtlich seiner spontanen Rezeptoraktivität in einem physiologischen Modell zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß der humane beta1-adrenerge Rezeptor spontane Aktivität aufweist, jedoch in einem deutlich geringeren Ausmaß als der beta2-adrenerge Rezeptor. Dies könnte klinisch relevant sein, da klinisch verwendete beta-Rezeptor-Antagonisten die spontane Aktivität des beta1-adrenergen Rezeptors in unserem Modell unterschiedlich stark unterdrückten. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem untersucht, ob sich die beiden kardial exprimierten Beta-Rezeptor-Subtypen Beta1 und Beta2 hinsichtlich ihrer Signaltransduktion unterscheiden. Ausgehend von dem Befund, daß die chronische Aktivierung der beiden Subtypen in transgenen Mausmodellen zu deutlich unterschiedlichen Phänotypen führt, wurden verschiedene intrazelluläre Signalwege auf ihre Aktivierung hin überprüft. Abweichend von publizierten, in vitro nach kurzzeitiger Rezeptorstimulation erhobenen Daten zeigte sich, daß die chronische Aktivierung der Rezeptorsubtypen zu einer unterschiedlichen Aktivierung der kardialen MAP-kinasen (ERK) führt. Die beta1-spezifische Aktivierung dieser Kinasen könnte die beobachtete unterschiedliche Hypertrophieentwicklung in diesen beiden Mausmodellen erklären. Einen weiteren Schwerpunkt bei der Aufklärung des Mechanismus beta-adrenerg induzierter Hypertrophie bildete die Untersuchung der zellulären Calcium-homöostase. Als früheste funktionelle Veränderung in der Entwicklung einer beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie und -insuffizienz trat dabei eine Störung des intrazellulären Calciumtransienten auf. Als möglicher Mechanismus für die Störung des Calciumhaushalts konnte eine zeitgleich auftretende veränderte Expression des Calcium-regulierenden Proteins Junctin beschrieben werden. Einen neuen therapeutischen Ansatz für die Therapie der Herzinsuffizienz könnten schließlich vielleicht die Untersuchungen zum kardialen Na/H-austauscher ergeben: Es konnte erstmals gezeigt werden, daß der kardiale Na/H-Austauscher maßgeblich an der beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie- und Fibrose-entstehung beteiligt ist und daß die pharmakologische Inhibition dieses Proteins sowohl Hypertrophie als auch die Fibrose wirksam unterdrücken kann.
KW  - Beta-Rezeptor
KW  - Maus
KW  - Transgene Tiere
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Transgene Mäuse
KW  - beta-adrenerge Rezeptoren
KW  - Hypertrophie
KW  - Fibrose
KW  - Na/H-Austauscher
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - transgenic mice
KW  - cardiac hypertrophy
KW  - fibrosis
KW  - Na/H-exchanger
KW  - heart failure
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181950
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Epe, B.
A1  - Harttig, U.
A1  - Stopper, Helga
A1  - Metzler, M.
T1  - Covalent binding of reactive estrogen metabolites to microtubular protein as a possible mechanism of aneuploidy induction and neoplastic cell transformation
N2  - Neoplastic cell transfonnation induced by estrogens and some other carcinogen& such as benzene appears to involve the induction of mitotic aneuploidy rather than DNA damage and point mutations. As metabolic activation may also play an important roJe in the mechanism of carcinogenesis of these nongenotoxic compounds, we have studied the Interaction of reactive quinone metabolites of various estrogens and of benzene with the major microtubular protein, tubulin, in a cell-free system. Covalent binding of the radioactively labeled metabolites to the a- and 13-subunit of tubulin was found to depend on the structure of the metabolite. When the adducted tubulins were tested in vitro for their ability to polymerize to microtubules, Inhibition of microtubule assembly was obsened in every case, although to varying extents. It is proposed that the fonnation of covalent tubulin adducts may impair the formation of mitotic spindies and thus contribute to chromosomal nondisjunction and aneuploidy induction.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1990
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63478
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Epe, Bernd
A1  - Häring, Martin
A1  - Ramaiah, Danaboyina
A1  - Stopper, Helga
A1  - Abou-Elzahab, Mohamed M.
A1  - Adam, Waldemar
A1  - Saha-Möller, Chantu R.
T1  - DNA damage induced by furocoumarin hydroperoxides plus UV (360 nm)
N2  - Wben irradiated at 360 nm, furocoumarins with a hydroperoxide group in a side chain effciently give rise to a type of DNA damage that can best be explained by a photoinduced generation of hydroxyl radicals from the excited pbotosensitizers. The observed DNA damage profiles, i.e. the ratios of single-strand breaks, sites of base loss (AP sites) and base modifications sensitive to fonnamidopyrimidine-DNA glycosylase (FPG protein) and endonuclease m, are similar to the DNA damage profile produced by hydroxyl radicals generated by lonizing radiation or by xanthine and xanthine oxidase in the presence of Fe(III)-EDTA. No such damage is observed with the corresponding furocoumarin alcohols or in the absence of near-UV radiation. The damage caused by the photo-excited hydroperoxides is not influenced by superoxide dismutase (SOD) or catalase or by D2O as solvent. The presence of t-butanol, however, reduces both the formation of single-strand breaks and of base odifications sensitive to FPG protein. The cytotoxicity caused by one of the hydroperoxides in L5178Y mome lymphoma cells is found to be dependent on the near-UV irradiation and to be much higher than that of the corresponding alcohol. Therefore the new type of photoinduced damage occurs inside cells. Intercalating photosensitizers with an attached hydroperoxide group might represent a novel and versatile class of DNA damaging agents, e.g. for phototherapy.
KW  - DNS-Schädigung
Y1  - 1993
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86870
ER  - 
TY  - THES
A1  - Eppli, Nenad
T1  - Untersuchung des Einflusses der ERK1/2-Autophosphorylierung an Threonin 188 auf Mausherzen mittels transgener Mäuse mit ubiquitärer Überexpression von ERK2\(^{T188D}\)
T1  - Study on the effects of autophosphorylation of ERK1/2 at threonine 188 on murine hearts by means of transgenic mice ubiquitiously overexpressing ERK2\(^{T188D}\)
N2  - Die ERK2Thr188-Autophosphoylierung stellt einen regulatorischen Signalweg dar, der infolge einer hypertrophen Stimulation die kardiale Hypertrophie begünstigt. Eine Hemmung dieser Phosphorylierung in Kardiomyozyten verhindert die Ausbildung der kardialen Hypertrophie ohne Beeinflussung der kardioprotektiven Funktionen von ERK1/2. Demgegenüber führt die dauerhafte Simulation zu einem gain-of-function-Phänotypen mit ausgeprägter Hypertophie, Fibrose und einer reduzierten Herzfunktion. In dieser Arbeit wurde die dauerhafte Simulation ERK2Thr188-Phosphorylierung (T188D) in einem Mausmodell mit ubiquitärer Expression dieser Mutation untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich nach Stimulation durch TAC in diesen Tieren ein etwas stärkerer hypertropher Phänotyp mit vergrößerten Kardiomyozyten, gesteigerter interstitieller Fibrosierung und reduzierter Herzfunktion ausbildet als in Mäusen mit kardiomyozyten-spezifischer Überexpression diese Mutante. In Fibroblasten- und VSMC-Zelllinien wurde eine gesteigerte Proliferation der T188D-überexprimierenden Zellen im Vergleich zu Kontrollen festgestellt. Somit scheint die ERK2Thr188-Phosphorylierung auch in kardialen Nicht-Myozyten einen maladaptiven Einfluss auf das Herz auszuüben.
N2  - Autophosphorylation of ERK2 on threonine 188 is a regulatory signaling pathway facilitating cardiac hypertrophy due to a hypertrophic stimulation. The formation of cardiac hypertrophy can be impaired by inhibition of the phosphorylation without interfering with the cardioprotective functions of ERK1/2. In contrast, permanent stimulation of ERK2Thr188 phosphorylation leads to a gain-of-function phenotype with distinct hypertrophy fibrosis and a reduced cardiac function. Here, we examined a murine model with ubiquitous overexpression of ERK2Thr188 phosphorylation (T188D). We point out that mice showed an increased hypertrophic phenotype with augmented cardiomyocytes, enhanced interstitial fibrosis and reduced cardiac function in response to TAC compared to mice with overexpression of this mutant limited to cardiomyocytes. Fibroblasts and vascular smooth muscle cells overexpressing T188D showed an enhanced proliferation compared to controls. Taken together, the phosphorylation of ERK2 on threonine 188 exerts a maladaptive influence  on non-myocytes in the heart as well.
KW  - Herzhypertrophie
KW  - cardiac hypertrophy
KW  - ERK1/2-Autophosphorylierung
KW  - autophosphorylation of ERK1/2
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216558
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Fathy, Moustafa
A1  - Fawzy, Michael Atef
A1  - Hintzsche, Henning
A1  - Nikaido, Toshio
A1  - Dandekar, Thomas
A1  - Othman, Eman M.
T1  - Eugenol exerts apoptotic effect and modulates the sensitivity of HeLa cells to cisplatin and radiation
JF  - Molecules
N2  - Eugenol is a phytochemical present in different plant products, e.g., clove oil. Traditionally, it is used against a number of different disorders and it was suggested to have anticancer activity. In this study, the activity of eugenol was evaluated in a human cervical cancer (HeLa) cell line and cell proliferation was examined after treatment with various concentrations of eugenol and different treatment durations. Cytotoxicity was tested using lactate dehydrogenase (LDH) enzyme leakage. In order to assess eugenol’s potential to act synergistically with chemotherapy and radiotherapy, cell survival was calculated after eugenol treatment in combination with cisplatin and X-rays. To elucidate its mechanism of action, caspase-3 activity was analyzed and the expression of various genes and proteins was checked by RT-PCR and western blot analyses. Eugenol clearly decreased the proliferation rate and increased LDH release in a concentration- and time-dependent manner. It showed synergistic effects with cisplatin and X-rays. Eugenol increased caspase-3 activity and the expression of Bax, cytochrome c (Cyt-c), caspase-3, and caspase-9 and decreased the expression of B-cell lymphoma (Bcl)-2, cyclooxygenase-2 (Cox-2), and interleukin-1 beta (IL-1β) indicating that eugenol mainly induced cell death by apoptosis. In conclusion, eugenol showed antiproliferative and cytotoxic effects via apoptosis and also synergism with cisplatin and ionizing radiation in the human cervical cancer cell line.
KW  - eugenol
KW  - HeLa cells
KW  - cisplatin
KW  - radiation
KW  - apoptosis
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193227
SN  - 1420-3049
VL  - 24
IS  - 21
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fazeli, Gholamreza
T1  - Signaling in the induction of genomic damage by endogenous compounds
T1  - Signalwege bei der Induktion von Genomschäden durch endogene Substanzen
N2  - Reactive oxygen species (ROS) are continuously generated in cells and are involved in physiological processes including signal transduction but also their damaging effects on biological molecules have been well described. A number of reports in the literature implicate excessive oxidative stress and/or inadequate antioxidant defense in the pathogenesis of cancer, atherosclerosis, chronic and age related disorders. Several studies have indicated that activation of the renin-angiotensin-aldosterone-system can lead to the formation of ROS. Epidemiological studies have revealed higher renal cell cancer incidences and also higher cancer mortalities in hypertensive individuals. Recently, our group has shown that perfusion of the isolated mouse kidney with Ang II or treatment of several cell lines with Ang II leads to formation of DNA damage and oxidative base modifications. Here, we tried to scrutinize the pathway involved in genotoxicity of Ang II. We confirmed the genotoxicity of Ang II in two kidney cell lines of human origin. Ang II treatment led to the production of superoxide anions which we could hinder when we used the membrane permeable superoxide dismutase (SOD) mimetic TEMPOL. One of the enzymes which is activated in the cells after Ang II treatment and is able to produce ROS is NADPH oxidase. We demonstrated the activation of NADPH oxidase in response to Ang II by upregulation of its p47 subunit using RT-PCR. Also, pPhosphorylation of p47 subunit of NADPH oxidase after Ang II treatment was enhanced. Using two inhibitors we showed that NADPH oxidase inhibition completely prevents DNA damage by Ang II treatment. To differentiate between Nox2 and Nox4 isoforms of NADPH oxidase subunits in the genotoxicity of Ang II, we performed siRNA inhibition and found a role only for Nox4, while Nox2 was not involved. Next, we investigated PKC as a potential activator of NADPH oxidase. We showed that PKC becomes phosphorylated after Ang II treatment and also that inhibition of PKC hinders Ang II from damaging the cells. Our results from using several inhibitors of different parts of the pathway revealed that PKC activation in this pathway is dependent on the action of PLC on membrane phospholipids and production of IP3. IP3 binds to its receptor at endoplasmic reticulum (ER), opening a channel which allows calcium efflux into the cytoplasm. In this manner, both ER calcium stores and extracellular calcium cooperate so that Ang II can exert its genotoxic effect. PLC is activated by AT1R stimulation. We could also show that the genotoxicity of Ang II is mediated via AT1R signaling using the AT1R antagonist candesartan. In conclusion, here we have shown that Ang II is able to damage genomic damage in cell lines of kidney origin. The observed damage is associated with production of ROS. A decrease in Ang II-induced DNA damage was observed after inhibition of G-proteins, PLC, PKC and NADPH oxidase and interfering with intra- as well as extracellular calcium signaling. This leads to the following preliminary model of signaling in Ang II-induced DNA damage: binding of Ang II to the AT1 receptor activates PLC via stimulation of G-proteins, resulting in the activation of PKC in a calcium dependent manner which in turn, activates NADPH oxidase. NADPH oxidase with involvement of its Nox4 subunit then produces reactive oxygen species which cause DNA damage. Dopamine content and metabolism in the peripheral lymphocytes of PD patients are influenced by L-Dopa administration. The PD patients receiving a high dose of L-Dopa show a significantly higher content of dopamine in their lymphocytes compared to PD patients who received a low dose of L-Dopa or the healthy control. Central to many of the processes involved in oxidative stress and oxidative damage in PD are the actions of monoamine oxidase (MAO), the enzyme which is responsible for the enzymatic oxidation of dopamine which leadsing to production of H2O2 as a by-product. We investigated whether dopamine oxidation can cause genotoxicity in lymphocytes of PD patents who were under high dose L-Dopa therapy and afterward questioned the occurrence of DNA damage after dopamine treatment in vitro and tried to reveal the mechanism by which dopamine exerts its genotoxic effect. The frequency of micronuclei in peripheral blood lymphocytes of the PD patients was not elevated compared to healthy age-matched individuals, although the formation of micronuclei revealed a positive correlation with the daily dose of L-Dopa administration in patients who received L-Dopa therapy together with dopamine receptor agonists. In vitro, we describe an induction of genomic damage detected as micronucleus formation by low micromolar concentrations in cell lines with of different tissue origins. The genotoxic effect of dopamine was reduced by addition of the antioxidants TEMPOL and dimethylthiourea which proved the involvement of ROS production in dopamine-induced DNA damage. To determine whether oxidation of dopamine by MAO is relevant in its genotoxicity, we inhibited MAO with two inhibitors, trans-2-phenylcyclopropylamine hydrochloride (PCPA) and Ro 16-6491 which both reduced the formation of micronuclei in PC-12 cells. We also studied the role of the dopamine transporter (DAT) and dopamine type 2 receptor (D2R) signaling in the genotoxicity of dopamine. Inhibitors of the DAT, GBR-12909 and nomifensine, hindered dopamine-induced genotoxicity. These results were confirmed by treatment of MDCK and MDCK-DAT cells, the latter containing the human DAT gene, with dopamine. Only MDCK-DAT cells showed elevated chromosomal damage and dopamine uptake. Although stimulation of D2R with quinpirole in the absence of dopamine did not induce genotoxicity in PC-12 cells, interference with D2R signaling using D2R antagonist and inhibition of G-proteins, phosphoinositide 3 kinase and extracellular signal-regulated kinases reduced dopamine-induced genotoxicity and affected the ability of DAT to take up dopamine. Furthermore, the D2R antagonist sulpiride inhibited the dopamine-induced migration of DAT from cytosol to cell membrane. Overall, the neurotransmitter dopamine causes DNA damage and oxidative stress in vitro. There are also indications that high dose L-Dopa therapy might lead to oxidative stress. Dopamine exerts its genotoxicity in vitro upon transport into the cells and oxidization oxidation by MAO. Transport of dopamine by DAT has the central role in this process. D2R signaling is involved in the genotoxicity of dopamine by affecting activation and cell surface expression of DAT and hence modulating dopamine uptake. We provided evidences for receptor-mediated genotoxicity of two compounds with different mechanism of actions. The involvement of these receptors in many human complications urges more investigations to reveal whether abnormalities in the endogenous compounds-mediated signaling can play a role in the initiation of new conditions like carcinogenesis.
N2  - Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) werden kontinuierlich in Zellen generiert und sind an physiologischen Prozessen wie der Signaltransduktion beteiligt. Aber auch ihre schädigenden Auswirkungen auf biologische Moleküle sind seit langem bekannt. Eine Reihe von Literaturberichten sieht einen Zusammenhang zwischen übermäßigem oxidativen Stress oder einer unzureichenden antioxidativen Verteidigung und Krebs, Atherosklerose und chronischen bzw. altersbedingten Erkrankungen. Mehrere Studien haben belegt, dass die Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems zur Bildung von ROS führen kann. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass Nierenkarzinom-Inzidenzen und -Mortalitäten bei Hypertonikern erhöht sind. Vor kurzem konnte unsere Gruppe zeigen, dass die Perfusion von isolierten Maäusen-Nieren und dieoder Behandlung mehrerer Zelllinien mit Angiotensin II (Ang II) zur Bildung von DNA-Schäden und oxidativen Basenmodifikationen führt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Signalwege der Genotoxizität von Ang II zu bestimmen. Wir bestätigten dDie Genotoxiziät von Ang II in zwei Nieren-Zelllinien humaner Herkunft konnte bestätigt werden. Wir zeigten, dass Ang II-Behandlung zur Produktion von Superoxid-Anionen führt, die durch das membrangängige Superoxid-Dismutase-Mimetikum TEMPOL verhindert werden kann. Eines der Enzyme, das in den Zellen nach Ang II-Behandlung aktiviert wird und ROS produzieren kann, ist die NADPH-Oxidase. Die mittels RT-PCR gemessene Hochregulierung von p47 beweist die Aktivierung der NADPH-Oxidase nach Ang II-Behandlung. Auch die Phosphorylierung von p47 nach Ang II-Behandlung wurde gesteigert. Mittels zweier Inhibitoren zeigten wir, dass NADPH-Oxidase-Hemmung DNA-Schäden durch Ang II-Behandlung vollständig verhindert. Wir versuchten, die Rolle der Nox2- und Nox4-Isoformen der NADPH-Oxidase-Untereinheiten bei der Genotoxizität von Ang II zu differenzieren. Hemmung mittels siRNA bestätigte nur eine Beteiligung der Nox4. Anschließend überprüften wir die Rolle der PKC als potentiellem Aktivator der NADPH-Oxidase. Wir zeigten, dass die PKC nach Ang II-Behandlung PKC phosphoryliert wird und durch die Hemmung der PKC Ang II-induzierten Schäden verhindert werdenird. Die Verwendung mehrerer Inhibitoren der verschiedenen Teile des Signalweges zeigte, dass die PKC-Aktivierung von der Reaktion der PLC mit Membranphospholipiden und der Produktion von IP3 und DAG abhängig ist. IP3 bindet an seinen Rezeptor am Endoplasmatischen Retikulum (ER)., dDie in der Folge auftretende Öffnung eines Kanals ermöglicht einen Calcium-Ausstrom in das Cytoplasma. Auf diese Weise sind sowohl ER-Calcium als auch extrazelluläres Calcium an der Ang II-induzierten genotoxische Wirkung beteiligt. PLC wird durch AT1R-Stimulation aktiviert. Wir konnten mit Hilfe des AT1R-Antagonisten Candesartan auch zeigen, dass die Genotoxizität von Ang II über AT1R-Signaltransduktion vermittelt wird. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass Ang II genomische Schäden in humanen Nieren-Zelllinien verursacht. Die Schäden sind mit der Produktion von ROS verbunden. Eine Reduktion der Ang II-induzierten DNA-Schäden wurde nach Hemmung vonder G-Proteinen, der PLC, PKC und NADPH-Oxidase und Beeinflussung intra- sowie extrazellulärer Calium-Signalgebung gezeigt. Dies führt zu folgendem vorläufigen Modell der Signaltransduktion der von Ang II-induzierten DNA-Schäden: Die Bindung von Ang II an den AT1-Rezeptor aktiviert die PLC durch Stimulationerung der G-Proteine und die PKC in Calcium-abhängiger Weise, dies wiederum aktiviert die NADPH-Oxidase. Die NADPH Oxidase unter Beteiligung ihrerseiner Nox4-Untereinheit erzeugt dann reaktive Sauerstoffspezies, die DNA-Schäden verursachen. Dopamingehalt und -stoffwechsel in peripheren Lymphozyten von Parkinson-Patienten werden durch L-Dopa-Gabe beeinflusst. Die Patienten, die eine hohe Dosis L-Dopa erhalten, zeigen einen signifikant höheren Gehalt an Dopamin in den Lymphozyten im Vergleich zu Patienten, die eine niedrige Dosis L-Dopa erhalten oder der gesunden Kontrollgruppe. Im Mittelpunkt vieler Prozesse bei der Entstehung von oxidativem Stress und oxidativer Schäden bei Parkinson-Patienten steht die Monoaminoxidase (MAO), die für die enzymatische Oxidation von Dopamin und in der Folge für die Entstehung von H2O2 verantwortlich ist. Wir untersuchten, ob die Oxidation von Dopamin genotoxische Wirkung in Lymphozyten von Parkinson-Patienten mit hochdosierter L-Dopa-Therapie induzieren kann. Danach überprüftenfragten wir, ob die Behandlung mit Dopamin in vitro DNA-Schäden induzieren kann und versuchten aufzuzeigen, durch welchen Mechanismus Dopamin seine genotoxische Wirkung entfaltet. Die Häufigkeit von Mikrokernen in peripheren Lymphozyten der Parkinson-Patienten war nicht erhöht im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe, allerdings zeigte die Mikrokernfrequenz eine positive Korrelation mit der täglichen L-Dopa-Dosis bei Patienten, die eine L-Dopa-Therapie zusammen mit einem Dopamin-Rezeptor-Agonisten erhielten. In vitro beobachteten wir bei niedrigen mikromolaren Konzentrationen eine Induktion des genomischen Schadens in Zelllinien, die aus verschiedenen Geweben stammten. Die genotoxische Wirkung von Dopamin wurde durch Zugabe der Antioxidantien TEMPOL und DMTU reduziert, wodurch die Beteiligung von ROS gezeigt werden konnte. Um festzustellen, ob die Oxidation von Dopamin durch MAO für die Genotoxizität relevant ist, hemmten wir MAO mit zwei Inhibitoren, trans-2-Phenylcyclopropylamin-Hydrochlorid (PCPA) und Ro 16-6491, die beide die Bildung von Mikrokernen in PC-12-Zellen reduzieren konnten. Wir untersuchten auch die Rolle des Dopamin-Transporters (DAT) und Dopamin-Typ-2-Rezeptor (D2R)-assoziierter Signalwege in der Genotoxizität von Dopamin. Die Inhibitoren des DAT, GBR-12909 und Nomifensin verhinderten die Dopamin-induzierte Genotoxizität. Diese Ergebnisse wurden durch Behandlung von MDCK- und MDCK-DAT- Zellen (die das humane DAT-Gen besitzen) mit Dopamin bestätigt. Nur MDCK-DAT-Zellen zeigten erhöhte chromosomale Schäden und Dopaminaufnahme. Obwohl die Stimulation mit dem D2R-Rezeptor-Agonisten Quinpirol in Abwesenheit von Dopamin keine Genotoxizität in PC-12-Zellen induzierte, reduzierten sowohl ein D2R-Antagonist, wie auch Inhibitoren des in der Signalkaskade involvierten G-Proteins, der Phosphoinositol-3-Kinase und der extrazellulären signalregulierten Kinasen die Aufnahme von Dopamin mittels DAT und die Dopamin-vermittelte Genotoxizität. Der D2R-Antagonist Sulpirid hemmte die Dopamin-induzierte Migration von DAT aus dem Cytosol zur Zellmembran. Insgesamt verursacht der Neurotransmitter Dopamin DNA-Schäden und oxidativen Stress in vitro. Es gibt Hinweise, dass eine hochdosierte L-Dopa-Therapie zu oxidativem Stress führt. In vitro führt Dopamin zu Genotoxizität durch den Transport in die Zellen und Oxidation durch MAO. Der Transport von Dopamin durch DAT spielt eine zentrale Rolle in diesem Prozess. Die D2R-Signalwege sind an der Genotoxizität von Dopamin durch Auswirkung auf die Aktivierung und Membranexpression von DAT und damit der Dopaminaufnahme beteiligt.
KW  - Angiotensin II
KW  - Mutagenität
KW  - DNS-Schädigung
KW  - DNA-Schaden
KW  - Genotoxizität
KW  - genotoxicity
KW  - DNA damage
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55634
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Federico, Stephanie
A1  - Redenti, Sara
A1  - Sturlese, Mattia
A1  - Ciancetta, Antonella
A1  - Kachler, Sonja
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Cacciari, Barbara
A1  - Moro, Stefano
A1  - Spalluto, Giampiero
T1  - The Influence of the 1-(3-Trifluoromethyl-Benzyl)-1H-Pyrazole-4-yl Moiety on the Adenosine Receptors Affinity Profile of Pyrazolo[4,3-e][1,2,4]Triazolo[1,5-c]Pyrimidine Derivatives
JF  - PLoS One
N2  - A new series of pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazolo[1,5-c]pyrimidine (PTP) derivatives has been developed in order to explore their affinity and selectivity profile at the four adenosine receptor subtypes. In particular, the PTP scaffold was conjugated at the C2 position with the 1-(3-trifluoromethyl-benzyl)-1H-pyrazole, a group believed to confer potency and selectivity toward the human (h) A\(_{2B}\) adenosine receptor (AR) to the xanthine ligand 8-(1-(3-(trifluoromethyl) benzyl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,3-dimethyl-1H-purine-2,6(3H, 7H)-dione (CVT 6975). Interestingly, the synthesized compounds turned out to be inactive at the hA\(_{2B}\) AR but they displayed affinity at the hA\(_3\) AR in the nanomolar range. The best compound of the series (6) shows both high affinity (hA\(_3\) AR K\(_i\) = 11 nM) and selectivity (A\(_1\)/A\(_3\) and A\(_{2A}\)/A\(_3\) > 9090; A\(_{2B}\)/A\(_3\) > 909) at the hA\(_3\) AR. To better rationalize these results, a molecular docking study on the four AR subtypes was performed for all the synthesized compounds. In addition, CTV 6975 and two close analogues have been subjected to the same molecular docking protocol to investigate the role of the 1-(3-trifluoromethyl-benzyl)-1H-pyrazole on the binding at the four ARs.
KW  - drug
KW  - human A(3)
KW  - protein-coupled receptors
KW  - classification
KW  - subtypes
KW  - potent
KW  - antagonists
KW  - mast cells
KW  - targets
KW  - A(2B) receptors
KW  - international union
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137133
VL  - 10
IS  - 12
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fink, Kristin
T1  - Toxins in Renal Disease and Dialysis Therapy : Genotoxic Potential and Mechanisms
T1  - Toxine in Nierenerkrankung und Dialyse Therapie : Genotoxisches Potential und Mechanismus
N2  - In patients suffering from end-stage renal disease who are treated by hemodialysis genomic damage as well as cancer incidence is elevated. One possible cause for the increased genomic damage could be the accumulation of genotoxic substances in the blood of patients. Two possible sources for those toxins have to be considered. The first possibility is that substances from dialysers, the blood tubing system or even contaminated dialysis solutions may leach into the blood of the patients during dialysis. Secondly, the loss of renal filtration leads to an accumulation of substances which are normally excreted by the kidney. If those substances possess toxic potential, they are called uremic toxins. Several of these uremic toxins are potentially genotoxic. Within this thesis several exemplary uremic toxins have been tested for genotoxic effects (homocysteine, homocysteine-thiolactone,leptine, advanced glycated end-products). Additionally, it was analysed whether substances are leaching from dialysers or blood tubing and whether they cause effects in in vitrotoxicity testing. The focus of chemical analytisis was on bisphenol A (BPA), the main component of plastics used in dialysers and dialyser membranes.
N2  - Patienten, die an terminaler Niereninsuffizienz leiden und mittels Hämodialyse behandelt werden, weisen einen erhöhten Genomschaden auf. Dieser könnte ursächlich für die erhöhte Krebsinzidenz dieser Patientengruppe sein. Eine der möglichen Ursachen für den erhöhten Genomschaden stellt die Akkumulation genotoxischer Substanzen im Blut der Patienten dar. Diese Substanzen können prinzipiell aus zwei unterschiedlichen Quellen stammen. Erstens besteht die Möglichkeit, dass während der Dialyse Substanzen aus den Dialysatoren, dem Blutschlauchsystem oder gar aus verunreinigtem Dialysat in das Blut der Patienten übertreten. Zweitens führt der Verlust der Nierenfunktion zu einer stark verminderten Exkretion harnpflichtiger Substanzen. Diese Substanzen akkumulieren im Blut und bilden, sofern sie ein toxisches Potential besitzen, die Gruppe der so genannten urämischen Toxine. Einige dieser urämischen Toxine sind potentiell auch genotoxisch. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden exemplarische Vertreter der urämischen Toxine auf ihre genotoxische Wirkung hin untersucht (Homocstein, Homocystein-Thiolacton, Leptin, Advanced Glycation End-Products). Außerdem wurde analysiert, ob Substanzen aus Dialysatormembranen oder dem Blutschlauchsystem austreten und in in vitro-Toxizitätstests Effekte zeigen. Der Fokus der Analytik lag hierbei auf dem Nachweis von Bisphenol A, dem Hauptbestandteil verschiedener Kunststoffe die für Dialysatoren und Dialysatormembranen verwendet werden.
KW  - Bisphenol A
KW  - Homocystein
KW  - Extrakorporale Dialyse
KW  - Genomschaden
KW  - Urämische Toxine
KW  - bisphenol a
KW  - homocysteine
KW  - dialysis
KW  - genomic damage
KW  - uremic toxins
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31082
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fischer, Thomas Horst
T1  - Die transkriptionelle Regulation der microRNA-21 im Herzen
T1  - The transcriptional regulation of microRNA-21 in the heart
N2  - MicroRNAs sind kleine, nicht kodierende RNA-Moleküle, die posttranskriptionell die Genexpression regulieren. Sie binden hierfür spezifisch an 3’-UTRs von messenger-RNAs und führen entweder direkt zu deren Abbau oder inhibieren deren Translation. Über die Mechanismen, die die Expression von microRNAs regulieren, ist jedoch noch wenig bekannt. Die Tatsache, dass sie als lange Vorläufermoleküle (pri-microRNAs) durch die RNA-Polymerase-II transkribiert werden, legt die Existenz eines Promotorbereiches nahe, der dem proteinkodierender Gene ähnelt. Mit Hilfe von microRNA-Arrays konnten wir im linksventrikulären Myokard mehrere bei Herzinsuffizienz deutlich verändert exprimierte microRNAs identifizieren. Die microRNA-21 ist dabei bereits im Frühstadium der Herzinsuffizienz verstärkt exprimiert (Northern Blot). Auch in primären, kardialen Zellen (Fibroblasten, Kardiomyozyten) wird die microRNA-21 nach Induktion einer Hypertrophie verstärkt exprimiert. Weiterführendes Ziel dieser Arbeit war es nun, diejenigen Mechanismen aufzuklären, die der starken Induktion der microRNA-21 im erkrankten Myokard zu Grunde liegen. Durch bioinformatische Analyse des zugehörigen Promotorbereiches (Trans-Spezies-Konservierung) und Klonierung danach ausgerichteter Fragmente in Luciferase-basierte Reporter-Plasmide konnte ein 118 Basen langer Bereich identifiziert werden, der maßgeblich die Expression der microRNA-21 im Herzen bedingt. Durch Deaktivierung einzelner cis-Elemente konnte die kardiale Expression auf zwei essentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen zurückgeführt werden. Es handelt sich dabei um Erkennungssequenzen für die im Herz bedeutsamen Transkriptionsfaktoren CREB und SRF. Sie liegen in enger räumlicher Nachbarschaft ungefähr 1150 bp vor der Transkriptionsstartstelle. Die Suppression der Expression dieser beiden Transkriptionsfaktoren mittels geeigneter siRNAs führte jeweils zu einer signifikanten Aktivitätsminderung des microRNA-21-Promotors und konnte somit die vorangehenden Ergebnisse validieren. Durch Generierung einer transgenen Tierlinie, die lacZ unter der Kontrolle des microRNA-21-Promotors exprimiert, werden in naher Zukunft nähere Aufschlüsse über die gewebsspezifische Verteilung der microRNA-21-Expresssion in vivo möglich sein. Zusammenfassend beschreiben wir hier erstmals den Mechanismus der transkriptionellen Regulation der microRNA-21 im Herzen. Dieser Mechanismus bedingt wahrscheinlich die starke Induktion dieser microRNA bei kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz.
N2  - MicroRNAs are small, non-coding RNA molecules that posttranscriptionally regulate gene expression. They specifically bind to 3’-UTRs of messenger RNAs and either directly lead to the degradation of the bound messenger-RNA or inhibit its translation. Only little is known, however, about the mechanisms that control the expression of microRNAs. The fact that they are being transcribed as long precursor-molecules (primary microRNAs, pri-microRNAs) by type-II-RNA-polymerase suggests that they have a promoter region similar to those of protein-coding genes. Using microRNA arrays, we were able to identify several differentially expressed microRNAs in the left ventricular myocardium of mice suffering from heart failure. MicroRNA-21 was found to be strikingly upregulated even in early stages of disease (Northern blot) and the induction of hypertrophy in vitro also elevated its expression. The aim of this study was to learn more about the molecular mechanisms that are responsible for the strong induction of microRNA-21 in the failing heart. Bioinformatic analysis of the microRNA-21 promoter region (trans species conservation) and cloning of several fragments into luciferase-based reporter plasmids revealed a 118 bp region to be fundamental to the activity of this promoter in cardiac cells. By deactivating single cis elements we were able to identify two transcription factor binding sites that are essential for microRNA-21 expression. These are recognition sites for the transcription factors CREB and SRF, both of which are known to be important in the heart. They are located in close proximity about 1150 bp upstream of the transcription start site. The suppression of these transcription factors through siRNAs lead to a strong reduction of the microRNA-21 promoter activity and thus validated the preceding results. Summing up we were able to describe the mechanisms that underlie the transcriptional regulation of microRNA-21 in the heart. This mechanism most likely leads to the strong induction of this microRNA in hypertrophy and heart failure.
KW  - Small RNA
KW  - Genregulation
KW  - microRNA-21
KW  - miR-21
KW  - Herz
KW  - Transkription
KW  - microRNA-21
KW  - miR-21
KW  - Herz
KW  - transcription
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-50702
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Fischer, W. H.
A1  - Beland, P. E.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - DNA adducts, cell proliferation and papilloma latency time in mouse skin after repeated dermal application of DMBA and TPA
N2  - 'lbe mouse skin tumor model was used to investigate whether the Ievel of DNA 8dducts and/or the rate of cell division in the epidermis are indicators of the risk of cancer formation for an individual in an outbred animal popul8tion. A high risk was considered to be reftected by 8 short latency period for the 8ppearance of 8 papilloma. Fernale NMRI mice were treated twice weekly with 2.5 nmol 7 ,12-dimethylbenz[a]antbracene (DMBA) and 3 nmoi12-0-tetradecanoylphorbol-13- 8cetate (TPA) and the appearance of papillomas was registered. The first papilloma 8ppeared after 7.5 weeks. After 17 weeks, when 12 of 14 mice bad 8t least one papilloma, an osmotic minipump deliverlog 5-bromo-2'deoxyuridine (BrdU) was implanted into eacb mouse for 24 h. The mice were killed after 24 h ~d the epidermis was analyzed for D:MBA-nucleotide 8dducts by 32p.postlabeling, for the cell number per unit skin length, and for the labeling index for DNA synthesls. Unexpectedly, D:MBA-nucleotide 8dduct Ievels were highest in those anima1s wbich showed the Iongest latency periods. Adduct Ievels were negatively correlated with the 18beling index, indicating that dilution of adducts by cell division was a predominant factor in determining average adduct concentrations. Individual tumor-latency time was not corTelated with either cell ntunber or labeling index. This could be due to the fact that the measurements only provided 8veraged data and gave no infonnation on the specific situation in clones of premalignant cells. Under the conditions of tbis assay, therefore, neither DNA adduct Ievels nor information on the average kinetics of cell division bad a predidive value for the individual amcer risk withln a group of outbred animals receiving the same treatment
KW  - Toxikologie
Y1  - 1993
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60673
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Fischer, W. H.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Short communication : Mouse skin papilloma formation by chronic dermal application of 7,12-dimethylbenz[a]anthracene is not reduced by diet restriction
N2  - No abstract available
KW  - Toxikologie
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60644
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Frey, Anna
A1  - Gassenmaier, Tobias
A1  - Hofmann, Ulrich
A1  - Schmitt, Dominik
A1  - Fette, Georg
A1  - Marx, Almuth
A1  - Heterich, Sabine
A1  - Boivin-Jahns, Valérie
A1  - Ertl, Georg
A1  - Bley, Thorsten
A1  - Frantz, Stefan
A1  - Jahns, Roland
A1  - Störk, Stefan
T1  - Coagulation factor XIII activity predicts left ventricular remodelling after acute myocardial infarction
JF  - ESC Heart Failure
N2  - Aims Acute myocardial infarction (MI) is the major cause of chronic heart failure. The activity of blood coagulation factor XIII (FXIIIa) plays an important role in rodents as a healing factor after MI, whereas its role in healing and remodelling processes in humans remains unclear. We prospectively evaluated the relevance of FXIIIa after acute MI as a potential early prognostic marker for adequate healing.
Methods and results This monocentric prospective cohort study investigated cardiac remodelling in patients with ST-elevation MI and followed them up for 1 year. Serum FXIIIa was serially assessed during the first 9 days after MI and after 2, 6, and 12 months. Cardiac magnetic resonance imaging was performed within 4 days after MI (Scan 1), after 7 to 9 days (Scan 2), and after 12 months (Scan 3). The FXIII valine-to-leucine (V34L) single-nucleotide polymorphism rs5985 was genotyped. One hundred forty-six patients were investigated (mean age 58 ± 11 years, 13% women). Median FXIIIa was 118 % (quartiles, 102–132%) and dropped to a trough on the second day after MI: 109%(98–109%; P < 0.001). FXIIIa recovered slowly over time, reaching the baseline level after 2 to 6 months and surpassed baseline levels only after 12 months: 124 % (110–142%). The development of FXIIIa after MI was independent of the genotype. FXIIIa on Day 2 was strongly and inversely associated with the relative size of MI in Scan 1 (Spearman’s ρ = –0.31; P = 0.01) and Scan 3 (ρ = –0.39; P < 0.01) and positively associated with left ventricular ejection fraction: ρ = 0.32 (P < 0.01) and ρ = 0.24 (P = 0.04), respectively.
Conclusions FXIII activity after MI is highly dynamic, exhibiting a significant decline in the early healing period, with reconstitution 6 months later. Depressed FXIIIa early after MI predicted a greater size of MI and lower left ventricular ejection fraction after 1 year. The clinical relevance of these findings awaits to be tested in a randomized trial.
KW  - blood coagulation factor XIII
KW  - ST-elevation myocardial infarction
KW  - healing and remodelling processes
KW  - cardiac magnetic resonance imaging
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-236013
VL  - 7
IS  - 5
ER  - 
TY  - THES
A1  - Frölich, Nadine
T1  - Analyse der µ-Opiatrezeptoraktivierung und Signaltransduktion in lebenden Zellen mittels FRET-Mikroskopie
T1  - Analysis of µ-opioid receptor activation and signal transduction in living cells using FRET microscopy
N2  - Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer ist ein Phänomen, welches erstmals 1948 von Theodor Förster beschrieben wurde. Mit der Entwicklung von Fluoreszenzproteinen konnten in Kombination mit Mikroskopietechniken Einblicke in zellbiologische Vorgänge gewonnen werden, die durch biochemische oder physiologische Experimente nicht möglich sind. Dabei spielt die hohe zeitliche und räumliche Auflösung eine wichtige Rolle. Auf dem Forschungsgebiet der GPCR, welche die größte Gruppe von Membranproteinen bei den Säugetieren darstellen, wurden insbesondere Erkenntnisse über Konformationsänderungen der Rezeptoren, die Kinetik der Rezeptoraktivierung und die Interaktion mit intrazellulären Signalproteinen gewonnen. Der µ-Opioidrezeptor gehört zur Familie der GPCR und stellt aufgrund seiner analgetischen Wirkungen eine wichtige pharmakologische Zielstruktur dar. Das Ziel dieser Arbeit war sowohl den Rezeptor als auch seine Signalwege mittels FRET-Mikroskopie zu untersuchen. Zunächst sollte ein intramolekularer FRET-Sensor des µ-Opioidrezeptors entwickelt werden, dazu wurden basierend auf den Kenntnissen über die Tertiärstruktur und dem Aufbau bereits bekannter GPCR-Sensoren verschiedene Rezeptorkonstrukte kloniert. Bei den Konstrukten wurden entweder zwei Fluoreszenzproteine oder ein Fluoreszenzprotein und ein Fluorophor-bindendes Tetracysteinmotiv kombiniert. Auch die Positionen der eingefügten Sequenzen wurden in den intrazellulären Domänen variiert, da der Rezeptor auf die Modifikationen mit beeinträchtigter Membranlokalisation reagierte. Durch die Optimierung wurden Rezeptoren konstruiert, die an der Zellmembran lokalisiert waren. Jedoch zeigte keines der Rezeptorkonstrukte Funktionalität im Hinblick auf die Rezeptoraktivierung. Im zweiten Teil wurden die pharmakologischen Effekte der Metabolite von Morphin am humanen µ-Opioidrezeptor systematisch analysiert. Dazu wurde die Fähigkeit der Metabolite, Gi-Proteine zu aktivieren und β-Arrestin2 zu rekrutieren, mittels FRET-basierter Messungen an lebenden Zellen untersucht. Außerdem wurde die Affinität der Metabolite zum humanen µ Opioidrezeptor anhand der Verdrängung eines radioaktiven Liganden analysiert. Meine Experimente identifizierten eine Gruppe mit stark agonistischen und eine mit schwach agonistischen Eigenschaften. Die starken Partialagonisten aktivieren den Rezeptor bereits bei nanomolaren Konzentrationen, während die schwachen Metabolite den Rezeptor erst bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich aktivieren. Die Metabolite Normorphin, Morphin-6-Glucuronid und 6-Acetylmorphin zeigen geringere Potenz als Morphin bei der Gi-Aktivierung aber überraschenderweise höhere Potenz und Effizienz für die β-Arrestin-Rekrutierung. Dies deutet auf eine bevorzugte Aktivierung von β-Arrestin2 hin. Die aus diesen Studien gewonnenen Ergebnisse liefern Hinweise darauf, welche Metabolite bei der Signalverarbeitung am µ Opioidrezeptor in vivo beteiligt sind.
N2  - Fluorescence resonance energy transfer was first described by Theodor Förster in 1948. The discovery and development of intrinsic fluorescent proteins revolutionized cell and molecular biology. The FRET-technique allows the analysis of protein-protein interactions and intramolecular conformational changes. In this method, its high temporal and spatial resolution plays a crucial role. Especially in the research field of GPCR, which are the largest family of membrane proteins in mammals, insights into receptor conformational changes, kinetics of receptor activation and the interaction with intracellular proteins were obtained. The µ-opioid receptor belongs to the GPCR family and is involved in analgesia. Therefore, the receptor is an important pharmacological target. Its pharmacological properties were extensively analyzed in the current thesis by FRET. Engineering of an intramolecular MOR-biosensor was initially planned. Based on the knowledge about the tertiary receptor structure and earlier GPCR-sensors, different receptor constructs were cloned. For each receptor construct either two fluorescent proteins or one fluorescent protein and one fluorophore binding tetracysteine motif were combined. The insertion of the additional amino acid sequences prevented the membrane localization for some constructs. Hence, the insertion site of the amioacid sequences was varied in the intracellular loops. Ultimately, the optimization resulted in some membrane localized receptor constructs with the tetracysteine motif in the third intracellular loop. Nevertheless, none of the receptor constructs was functional in terms of measurable conformational change upon receptor activation. In the second part of this thesis, the pharmacological effects of morphine and its metabolites were studied. The analgesic effects of morphine are mainly mediated via the activation of the µ opioid receptor. This receptor activates inhibitory G-proteins and induces the recruitment of β-arrestin2. Therefore I analyzed activation of these two pathways induced by morphine metabolites using FRET-microscopy in living cells. Furthermore, radioligand binding studies were used to determine the affinity of each compound to the human µ-opioid receptor. This approach identified two groups of metabolites, which were classified into strong and weak ligands. Strong partial agonists showed efficacies in the nanomalar range. In contrast, weak metabolites activated µ opioid receptor pathways in the micromolar range. Normorphine, morphine-6-glucuronide and 6 acetylmorphine had lower potencies regarding Gi-protein activation but higher potencies and efficacies for β-arrestin2 recruitment than morphine. These findings indicate that these metabolites are biased towards β-arrestin2 pathways.
KW  - Opiatrezeptor
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Morphin
KW  - Stoffwechsel
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - Mikroskopie
KW  - Metabolite von Morphin
KW  - Metabolismus
KW  - Metabolites of morphine
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71009
ER  - 
TY  - THES
A1  - Förtsch, Christina
T1  - Pneumolysin: the state of pore-formation in context to cell trafficking and inflammatory responses of astrocytes
T1  - Pneumolysin: Einfluss der Porenbildung auf zelluläre Transportprozesse und inflammatorische Antworten in Astrozyten
N2  - Pneumolysin, a protein toxin, represents one of the major virulence factors of Streptococcus pneumoniae. This pathogen causes bacterial meningitis with especially high disease rates in young children, elderly people and immunosuppressed patients. The protein toxin belongs to the family of cholesterol-dependent cytolysins, which require membrane cholesterol in order to bind and to be activated. Upon activation, monomers assemble in a circle and undergo conformational change. This conformational change leads to the formation of a pore, which eventually leads to cell lysis. This knowledge was obtained by studies that used a higher concentration compared to the concentration of pneumolysin found in the cerebrospinal fluid of meningitis patients. Thus, a much lower concentration of pneumolysin was used in this work in order to investigate effects of this toxin on primary mouse astrocytes. Previously, a small GTPase activation, possibly leading to cytoskeletal changes, was found in a human neuroblastoma cell line. This led to the hypothesis that pneumolysin can lead to similar cytoskeletal changes in primary cells. The aim of this work was to investigate and characterise the effects of pneumolysin on primary mouse astrocytes in terms of a possible pore formation, cellular trafficking and immunological responses. Firstly, the importance of pore-formation on cytoskeletal changes was to be investigated. In order to tackle this question, wild-type pneumolysin and two mutant variants were used. One variant was generated by exchanging one amino acid in the cholesterol recognising region, the second variant was generated by deleting two amino acids in a protein domain that is essential for oligomerisation. These variants should be incapable of forming a pore and were compared to the wild-type in terms of lytic capacities, membrane binding, membrane depolarisation, pore-formation in artificial membranes (planar lipid bilayer) and effects on the cytoskeleton. These investigations resulted in the finding that the pore-formation is required for inducing cell lysis, membrane depolarisation and cytoskeletal changes in astrocytes. The variants were not able to form a pore in planar lipid bilayer and did not cause cell lysis and membrane depolarisation. However, they bound to the cell membrane to the same extent as the wild-type toxin. Thus, the pore-formation, but not the membrane binding was the cause for these changes. Secondly, the effect of pneumolysin on cellular trafficking was investigated. Here, the variants showed no effect, but the wild-type led to an increase in overall endocytotic events and was itself internalised into the cell. In order to characterise a possible mechanism for internalisation, a GFP-tagged version of pneumolysin was used. Several fluorescence-labelled markers for different endocytotic pathways were used in a co-staining approach with pneumolysin. Furthermore, inhibitors for two key-players in classical endocytotic pathways, dynamin and myosin II, were used in order to investigate classical endocytotic pathways and their possible involvement in toxin internalisation. The second finding of this work is that pneumolysin is taken up into the cell via dynamin- and caveolin-independent pinocytosis, which could transfer the toxin to caveosomes. From there, the fate of the toxin remains unknown. Additionally, pneumolysin leads to an overall increase in endocytotic events. This observation led to the third aim of this work. If the toxin increases the overall rate of endocytosis, the question arises whether toxin internalisation favours bacterial tissue penetration of the host or whether it serves as a defence mechanism of the cell in order to degrade the protein. Thus, several proinflammatory cytokines were investigated, as previous studies describe an effect of pneumolysin on cytokine production. Surprisingly, only interleukin 6-production was increased after toxin-treatment and no effect of endocytotic inhibitors on the interleukin 6-production was observed. The conclusion from this finding is that pneumolysin leads to an increase of interleukin 6, which would not depend on the endocytotic uptake of pneumolysin. The production of interleukin 6 would enhance the production of acute phase proteins, T-cell activation, growth and differentiation. On the one hand, this activation could serve pathogen clearance from infected tissue. On the other hand, the production of interleukin 6 could promote a further penetration of pathogen into host tissue. This question should be further investigated.
N2  - Das Protein-Toxin Pneumolysin ist einer der entscheidenden Virulenzfaktoren von Streptococcus pneumoniae. Dieses Protein-Toxin gehört zur Familie der cholesterinabhängigen Zytolysine, die Membrancholesterol für ihre Aktivierung und Bindung benötigen. Nach der Membranbindung ordnen sich die Toxinmonomere kreisförmig an und ändern ihre Konformation, wodurch eine Pore entsteht, die dann zu einer Lyse der Zelle führt. Vor kurzem wurde nach Pneumolysinbehandlung in einer humanen Neuroblastomzelllinie eine Aktivierung kleiner GTPasen gefunden, die für zytoskelettale Veränderungen entscheidend sind (z.B. Zellbewegungen). Deshalb wurde die Hypothese aufgestellt, dass Pneumolysin diese zytoskelettalen Veränderungen auch in primären neuronalen Zellen auslösen könnte. Das Ziel dieser Arbeit war, die Effekte von Pneumolysin auf primäre Mausastrozyten im Hinblick auf Porenbildung, zelluläre Transportprozesse und immunologische Antworten zu untersuchen. Im ersten Teil wird die Bedeutung der Porenbildung auf zytoskelettale Veränderungen untersucht. Hierbei wurden lytische Fähigkeiten, Membranbindung, Membrandepolarisation, Porenbildung im künstlichen Bilayer und Effekte auf das Zytoskelett untersucht. Sowohl der Wildtyp als auch die Varianten zeigten die gleiche Stärke an Membranbindung. Diese Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Porenbildung für die Zell-Lyse, Membrandepolarisation und zytoskelettale Veränderungen in Mausastrozyten wichtig ist und führt zu der Schlussfolgerung, dass nicht die Membranbindung, sondern die Porenbildung entscheidend für die beobachteten zytoskelettalen Veränderungen ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt des Pneumolysin auf zelluläre Transportprozesse untersucht. Erneut zeigten die Pneumolysinvarianten keine Wirkung, während der Wildtyp die Gesamtrate der Endozytose erhöhte. Weiterhin wurde nur der Wildtyp internalisiert. Um einen möglichen Mechanismus für die Internalisierung des Toxins vorschlagen zu können, wurde Pneumolysin als GFP-markiertes Toxin genutzt. Weiterhin wurden einige Marker für unterschiedliche endozytotische Transportprozesse genutzt um eine Ko-lokalisation mit Pneumolysin-GFP zu ermöglichen. Des Weiteren wurden Inhibitoren für zwei Schlüsselproteine endozytotischer Vorgänge, Dynamin und Myosin II, genutzt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass Pneumolysin wahrscheinlich durch dynamin- und caveolin-unabhängige Pinozytose in die Zelle aufgenommen wird. Dieser Mechanismus führt zu der Bildung von Caveosomen, deren weiterer Transport, und somit das Schicksal des internalisierten Toxins, bis heute noch nicht aufgeklärt ist. Die Beobachtung, dass Pneumolysin die Gesamtrate an Endozytose erhöht, führte zum dritten Teil dieser Arbeit. Wenn das Toxin die Gesamtrate an Endozytose erhöht, stellt sich die Frage, ob dieser Vorgang der Zerstörung des Toxins – also einer Abwehr der Zelle – dient, oder ob diese Internalisierung eine Strategie des Pathogens ist, um tiefer in das Wirtsgewebe einzudringen. Aktuelle Studien belegen, dass Pneumolysin einen Einfluss auf inflammatorische Antworten des Immunsystems hat. Aus diesem Grund wurden unterschiedliche proinflammatorische Zytokine untersucht. Überraschenderweise zeigte sich nur eine Erhöhung des Interleukin 6 nach der Toxinbehandlung. Weiterhin hatten die Endozytoseinhibitoren keinen Effekt auf die Produktion dieses proinflammatorischen Zytokins. Pneumolysin führt also zu einem Anstieg der Interleukin 6 Produktion, diese Produktion ist jedoch unabhängig von der Internalisierung dieses Toxins. Die Produktion dieses Interleukins würde zur Produktion der Akute-Phase Proteine, der Aktivierung der T-Zell Antwort, zu Wachstum und Zelldifferenzierung führen. Einerseits könnte diese Aktivierung die Infektion durch das Pathogen bekämpfen. Andererseits könnte S. pneumoniae die erhöhte Produktion durch PLY an Interleukin 6 nutzen um weiter in das Wirtsgewebe vordringen zu können. Diese Frage sollte noch durch weitere Experimente untersucht werden.
KW  - Streptococcus pneumoniae
KW  - Toxin
KW  - Hirnhautentzündung
KW  - Entzündung
KW  - Astrozyt
KW  - Pore
KW  - Pneumolysin
KW  - Meningitis
KW  - Inflammation
KW  - Zelltransport
KW  - Porenbildung
KW  - Pneumolysin
KW  - Meningitis
KW  - Inflammation
KW  - cellular-trafficking
KW  - Pore-formation
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70892
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Förtsch, Christina
A1  - Hupp, Sabrina
A1  - Ma, Jiangtao
A1  - Mitchell, Timothy J.
A1  - Maier, Elke
A1  - Benz, Roland
A1  - Iliev, Asparouh I.
T1  - Changes in Astrocyte Shape Induced by Sublytic Concentrations of the Cholesterol-Dependent Cytolysin Pneumolysin Still Require Pore-Forming Capacity
N2  - Streptococcus pneumoniae is a common pathogen that causes various infections, such as sepsis and meningitis. A major pathogenic factor of S. pneumoniae is the cholesterol-dependent cytolysin, pneumolysin. It produces cell lysis at high concentrations and apoptosis at lower concentrations. We have shown that sublytic amounts of pneumolysin induce small GTPase-dependent actin cytoskeleton reorganization and microtubule stabilization in human neuroblastoma cells that are manifested by cell retraction and changes in cell shape. In this study, we utilized a live imaging approach to analyze the role of pneumolysin’s pore-forming capacity in the actin-dependent cell shape changes in primary astrocytes. After the initial challenge with the wild-type toxin, a permeabilized cell population was rapidly established within 20–40 minutes. After the initial rapid permeabilization, the size of the permeabilized population remained unchanged and reached a plateau. Thus, we analyzed the non-permeabilized (non-lytic) population, which demonstrated retraction and shape changes that were inhibited by actin depolymerization. Despite the non-lytic nature of pneumolysin treatment, the toxin’s lytic capacity remained critical for the initiation of cell shape changes. The non-lytic pneumolysin mutants W433F-pneumolysin and delta6-pneumolysin, which bind the cell membrane with affinities similar to that of the wild-type toxin, were not able to induce shape changes. The initiation of cell shape changes and cell retraction by the wild-type toxin were independent of calcium and sodium influx and membrane depolarization, which are known to occur following cellular challenge and suggested to result from the ion channel-like properties of the pneumolysin pores. Excluding the major pore-related phenomena as the initiation mechanism of cell shape changes, the existence of a more complex relationship between the pore-forming capacity of pneumolysin and the actin cytoskeleton reorganization is suggested.
KW  - Toxikologie
KW  - pneumolysin
KW  - pore formation
KW  - cytoskeleton
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69084
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Gimpl, G.
A1  - Gerstberger, R.
A1  - Mauss, U.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lang, R. E.
T1  - Solubilization and characterization of active neuropeptide-Y receptors from rabbit kidney
N2  - Active neuropeptide Y receptors were solubilized from rabbit kidney membranes using the zwitterionic detergent 3-[ (3-cholamidopropy l)dimethylammonio ]- 1-propanesulfonic acid (CHAPS). In membrane fragmentsandsoluble extracts neuropeptide Y bindingwas time dependent, saturable, reversible, and of high affinity. Scatchard analysis of equilibrium binding data indicated a single class of binding sites with respective Kn and Bmax values of 0.09 nM and 530 fmol/mg of protein for the membrane-bound receptors and 0.10 nM and 1585 fmol/mg of protein for the soluble receptors. Neuropeptide Y bindingwas specifically inhibited by the nonhydrolyzable GTP analog guanosine 5' -0- (3-thiotripbosphate) in a concentration-dependent manner, with IC\(_{50}\) values of 28 and 0.14 \(\mu\)M for membrane- bound and soluble receptors, respectively, suggesting that neuropeptide Y receptors are functionally coupled to GTP-binding regulatory proteins. CrossHoking studies were performed with the heterobifunctional N-hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoate and the monofunctional neuropeptide Y derivative, azidobenzoyl and led to the identification of a 100 kDa peptide that should represent the covalently labeled neuropeptide Y receptor.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1990
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60375
ER  - 
TY  - THES
A1  - Glaser, Nina
T1  - Influence of natural food compounds on DNA stability
T1  - Einfluss natürlicher Nahrungsbestandteile auf die DNA Stabilität
N2  - Cancer is one of the leading causes of death all over the world. Malnutrition and toxic contaminations of food with substances such as mycotoxins have been thought to account for a high percentage of cancers. However, human diet can deliver both mutagens and components that decrease the cancer risk. Genomic damage could be reduced by food components through different mechanisms such as scavenging of reactive oxygen species. In the first part of this study we tried to investigate the effects of patulin and resveratrol on DNA stability in V79 cells. Patulin is a mycotoxin, which is frequently found in spoiled apples and other fruits. The WHO has established a safety level of 50 µg/L, which is indeed not observed by all manufacturers. The acute toxicity of patulin in high concentrations is well known, however its potential carcinogenicity is still a matter of debate. Therefore we wanted to investigate further steps in the mechanism of patulin-induced genotoxicity. Patulin caused the formation of micronuclei and nucleoplasmic bridges in a dose-dependent manner. Further analysis revealed that patulin induced both kinetochore-negative and positive micronuclei. Time course of incubation indicate a new mechanism for patulin-induced nucleoplasmic bridge formation. We hypothized a mechanism via cross-linking of DNA, which was confirmed by a modified version of comet assay. Incubations of cells with patulin led to an increased number of multinucleated cells and multipolar mitoses. Cell cytometry revealed a G2 arrest by patulin, which might explain the amplification of centrosomes and patulin-induced aneuploidy. Patulin cause a dose-dependent DNA damage in comet assay which was influenced by the cellular GSH content. However, an induction of oxidative stress was just seen with higher concentrations of patulin. Levels of cellular glutathione were increased after 24 h incubation indicating an adaptive response to patulin-induced stress. There is growing interest in polyphenols such as resveratrol which have shown many positive effects on human health. The beneficial properties are partially attributed to their ability to scavenge reactive oxygen species. Co-incubation of V79 cells with patulin and 10 µM of the antioxidant resveratrol led to a slight reduction of micronucleus frequency compared to cells which were just treated with patulin. However, in higher concentrations resveratrol themselves caused the formation of micronuclei in V79 cells. Kinetochore analysis indicated only clastogenic properties for resveratrol but no disturbance of mitosis. The antioxidant properties of resveratrol were shown in ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay. However, in cellular system resveratrol in higher concentrations revealed also prooxidative properties, as shown in 2,7-dichlordihydrofluorescein (DCF) assay. The increased level of glutathione after resveratrol treatment might reflect an adaptive response to resveratrol-induced oxidative stress. For the second part of this thesis we investigated the effects of an anthocyanin-rich grape extract on hypertensive Ren-2 rats. Ren-2 rats are an accepted genetically modified rat model for the investigation of hypertension and increased oxidative stress. We divided 23 female Ren-2 rats into three groups. One group was fed with an anthocyanin-rich Dacapo grape extract, one group was treated with the angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor ramipril and the third group was kept without medication during the experiment. After one week untreated group showed a clear increase in systolic and diastolic blood pressure compared to the ramipril treated rats. This was in part attenuated in the animals fed with anthocyanin-rich Dacapo grape extract. Effects on blood pressure were also reflected in an increased thirst of untreated and extract fed animals. Comet assay with cells of kidney and liver revealed a slight protective impact of Dacapo extract on DNA damage compared to the other groups. Similar results were obtained after evaluation of ɣ-H2AX-staining of kidney and heart sections. However, in the small intestine oppositional effects were seen, indicating an increased number of double strand breaks probably due to the high local concentration of polyphenols after oral ingestion. Antioxidative properties of the extract were shown in FRAP assay. However, this effect was not reflected in an increased antioxidative capacity in serum or a protective impact in the dihydroethidium (DHE) assay. The extract showed protective effects on DNA damage in comet assay and ɣ-H2AX-staining, but was not able to reduce hypertension back to the control level of ramipril treated animals. High local concentrations could also result in an increased damage of the affected tissue. Therefore, the administration of such concentrated compounds should be handled with care.
N2  - Krebs ist eine der häufigsten weltweiten Todesursachen. Fehlernährung und Kontaminationen der Nahrungsmittel mit Toxinen wie Schimmelpilzgift tragen zu einem hohen Prozentsatz zu Krebserkrankungen bei. Allerdings enthält die Nahrung neben Mutagenen auch Bestandteile, die dazu beitragen das Krebsrisiko zu senken. Schäden am Genom können durch Nahrungsbestandteile über verschiedene Mechanismen, wie zum Beispiel das Abfangen von freien Radikalen reduziert werden. Im ersten Teil dieser Studie haben wir versucht die Effekte von Patulin und Resveratrol auf die DNA Stabilität von V79 Zellen zu untersuchen. Patulin ist ein Schimmelpilztoxin, welches häufig in verfaulten Äpfeln und anderen Früchten gefunden wird. Die WHO hat einen Grenzwert von 50 µg/L festgelegt, der jedoch nicht von allen Herstellern eingehalten wird. Die akute Giftwirkung von Patulin in hohen Dosen ist gut bekannt, wohingegen seine potentielle Kanzerogenität immer noch umstritten ist. Daher wollten wir weitere Schritte der Patulin induzierten Genotoxizität aufdecken. Patulin führte zu einer dosisabhängigen Bildung von Mikrokernen und Nucleoplasmic Bridges. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Patulin sowohl kinetochor-positive wie auch kinetochor-negative Mikrokerne verursacht. Bei der Analyse des Zeitverlaufs einer Patulininkubation deutete sich ein neuer Mechanismus für die Patulin induzierte Bildung von Nucleoplasmic Bridges an. Wir haben die Hypothese einer Quervernetzung von DNA-Strängen aufgestellt, die durch eine modifizierte Version des Comet Assays bestätigt wurde. Die Inkubation mit Patulin führte zudem zu einer erhöhten Anzahl von vielkernigen Zellen und multipolaren Mitosen. Mittels Durchflusszytometrie konnten wir einen durch Patulin verursachten G2 Arrest nachweisen, der die Amplifikation von Centrosomen und die Patulin induzierte Aneuploidie erklären könnte. Patulin verursachte einen dosisabhängigen Schaden im Comet Assay, der durch den zellulären Glutathiongehalt beeinflusst ist. Eine Auslösung von oxidativem Stress wurde dagegen erst bei höheren Konzentrationen an Patulin beobachtet. Der zelluläre Gluathiongehalt war nach 24 h Inkubationszeit erhöht, was auf eine adaptive Antwort auf den durch Patulin verursachten zellulären Stress hindeutet. Polyphenole wie Resveratrol gewinnen zunehmend an Bedeutung, da zahlreiche positive Effekte auf die menschliche Gesundheit bewiesen wurden. Diese vorteilhaften Eigenschaften werden zum Teil ihrer Eigenschaft als Radikalfänger zugeschrieben. Die Co-Inkubation von V79 Zellen mit Patulin und Resveratrol führte zu einer leichten Reduktion der Mikrokernfrequenz im Vergleich zu Zellen, die nur mit Patulin inkubiert wurden. Allerdings löste Resveratrol in höheren Konzentrationen selbst die Bildung von Mikrokernen aus. Die Kinetochor-Analyse zeigte für Resveratrol clastogene Eigenschaften aber keine störende Effekte auf den Ablauf der Mitose. Die antioxidativen Eigenschaften von Resveratrol wurden im FRAP (ferric reducing antioxidant power) -Assay nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurden im zellulären System mittels DCF (2,7-Dichlordihydro-fluorescein) -Assay in höheren Konzentrationen auch prooxidative Eigenschaften festgestellt. Der erhöhte zelluläre Glutathionspiegel nach Resveratrol-Behandlung könnte dabei auf eine adaptive Anwort auf den durch Resveratrol ausgelösten oxidativen Stress hindeuten Im zweiten Teil dieser Doktorabeit haben wir die Effekte eines anthocyanreichen Traubenextrakts auf hypertensive Ren-2 Ratten untersucht. Ren-2 Ratten sind ein anerkanntes genetisch modifiziertes Rattenmodell zur Untersuchung von Bluthochdruck und erhöhtem oxidativem Stress. Wir haben 23 weibliche Ren-2 Ratten in 3 Gruppen geteilt. Eine Gruppe wurde mit einem anthocyan-reichen Dacapo Traubenextrakt gefüttert, eine Gruppe wurde mit dem ACE (angiotensin converting enzyme) Inhibitor Ramipril behandelt und eine dritte Gruppe wurde während dem Experiment nicht medikamentös behandelt. Nach einer Woche zeigte die nicht therapierte Gruppe einen deutlichen Anstieg des systolischen und diastolischen Blutdrucks. Dieser Anstieg war bei der mit anthocyanreichem Dacapo Traubenextrakt gefütterten Gruppe abgeschwächt. Die Effekte auf den Blutdruck spiegelten sich auch in einer erhöhten Trinkmenge der unbehandelten und mit Extrakt behandelten Tiere wider. Ein Comet Assay mit Nieren- und Leberzellen zeigte einen schwachen schützenden Einfluß des Dacapoextrakts auf den DNA Schaden im Vergleich zu den anderen Behandlungsgruppen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei der Auswertung der ɣ-H2AX Färbung in Nieren- und Herzschnitten erzielt. Im Dünndarm wurden dagegen gegensätzliche Effekte beobachtet, die auf eine erhöhte Doppelstrangfrequenz durch die hohe lokale Konzentration an Polyphenolen nach oraler Aufnahme hindeuten. Die antioxidative Eigenschaften des Extrakts wurden im FRAP_Assay nachgewiesen. Diese Effekte spiegelten sich jedoch nicht in einer erhöhten antioxidativen Kapazität des Serums oder einem schützenden Effekt im DHE-Assay wider. Der Extrakt zeigte schützende Eigenschaften im Comet Assay und in der ɣ-H2AX-Färbung, war aber nicht in der Lage den Bluthochdruck auf das Kontrollniveau der Ramipril-behandelten Tiere herabzusenken. Hohe lokale Konzentrationen können auch zu einem erhöhten Schaden des betroffenen Gewebes führen. Daher sollte die Anwendung solcher hochkonzentrierter Präparate mit Vorsicht bedacht werden.
KW  - Patulin
KW  - Anthocyane
KW  - Resveratrol
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Mutagenität
KW  - Genotoxizität
KW  - Patulin
KW  - anthocyanins
KW  - resveratrol
KW  - genotoxicity
KW  - oxidative stress
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72872
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gläser, Katharina
T1  - Einfluss hochfrequenter Felder des Mobilfunks auf das blutbildende System in vitro
T1  - Effects of radiofrequency radiation on the human hematopoietic system in vitro
N2  - Elektromagnetische Felder (EMF) sind in der Umwelt des Menschen allgegenwärtig. Unter Verwendung unterschiedlicher Frequenzen bilden sie die Grundlage zahlreicher Technologien und begegnen uns im Alltag in einer Vielzahl von Anwendungen. Eine sehr wichtige Anwendung von EMF ist die mobile Kommunikation. Die hierfür verwendeten Frequenzen liegen im hochfrequenten Bereich und variieren mit dem Mobilfunkstandard. Weit verbreitet ist die GSM- und UMTS-Modulation der zweiten (2G) und dritten Generation (3G). Zum neuesten Mobilfunkstandard zählt LTE (4G). 
Aus statistischen Daten geht hervor, dass derzeit weltweit mehr als sieben Milliarden Mobilfunk-Endgeräte existieren. Die weitverbreitete und stetig ansteigende Verwendung dieser Technologien verdeutlicht, dass viele Menschen, darunter auch zunehmend Kinder und Jugendliche, regelmäßig einer Exposition gegenüber EMF ausgesetzt sind. Die wichtigste Expositionsquelle stellt dabei das Mobiltelefon dar, da sich in diesem Szenario die Quelle sehr nah am menschlichen Körper befindet. In der Vergangenheit wurden zahlreiche in-vitro- und in-vivo-Untersuchungen sowie epidemiologische Studien durchgeführt, um potentielle, nicht-thermische Effekte von Mobilfunkstrahlung auf biologische Systeme beurteilen zu können. Ein vollständiger Konsens konnte auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse jedoch nicht erzielt werden, sodass weiterhin Bedenken zum schädlichen Potential dieser nichtionisierenden Strahlung bestehen. Insbesondere wurden Fragestellungen zu Langzeiteffekten sowie zu Effekten, die speziell bei Kindern eine besondere Rolle spielen, bisher nicht ausreichend adressiert. Kinder können empfindlicher auf Umwelteinflüsse reagieren und sind im Vergleich zu Erwachsenen teilweise höher gegenüber EMF exponiert. Dies gilt vor allem für Kopfregionen, in denen sich das aktive, für die Hämatopoese verantwortliche Knochenmark befindet. 
Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, den Einfluss von Mobilfunkstrahlung auf das humane blutbildende System zu untersuchen. Im Fokus standen dabei humane hämatopoetische Stammzellen, die mit Frequenzen der Mobilfunkstandards GSM (900 MHz), UMTS (1.950 MHz) und LTE (2.535 MHz) jeweils über einen kurzen (4 h) und einen langen (20 h) Zeitraum und mit unterschiedlichen Intensitäten (0 W/kg, 0,5 W/kg, 1 W/kg, 2 W/kg und 4 W/kg) exponiert wurden. Vergleichende Experimente erfolgten mit Zellen der Promyelozyten-Zelllinie HL-60. Mögliche Effekte wurden mit den Endpunkten Apoptose, oxidativer Stress, Zellzyklus, DNA-Schaden und –Reparatur sowie Differenzierung und Epigenetik in Form von Histonacetylierung bewertet. In keinem der genannten Endpunkte konnten klare Effekte durch Mobilfunkstrahlung ausgemacht werden, weder für die hämatopoetischen Stammzellen, noch für die Zelllinie HL-60. Die einzige Veränderung wurde bei der Quantifizierung von DNA-Schäden beobachtet. Hier zeigte sich nach der Kurzzeitexposition der Stammzellen mit der Modulation GSM eine kleine, aber statistisch signifikante Abnahme der DNA-Schäden verglichen mit der Scheinexposition. Diese Beobachtung ließ sich in weiteren Replikaten jedoch nicht reproduzieren und wurde daher als nicht biologisch relevant eingestuft.
Insgesamt konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch Mobilfunkstrahlung mit Frequenzen der verbreiteten Modulationen GSM, UMTS und LTE sowie SAR-Werten, die unterhalb und oberhalb des empfohlenen Sicherheitsstandards liegen und typischerweise bei Handytelefonaten auftreten, keine Effekte in Zellen des blutbildenden Systems unter den gegebenen Versuchsbedingungen induziert wurden. Ein besonderer Fokus lag hierbei auf der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Weiterhin wurden zum ersten Mal humane hämatopoetische Stammzellen für derartige Untersuchungen eingesetzt. Dies hat insofern eine besondere Bedeutung, als hämatopoetische Stammzellen aufgrund ihrer multipotenten Eigenschaften eine breitere Analyse mit Hinblick auf die Kanzerogenese und auf das Immunsystem ermöglichen.
Um über die Mobilfunk-Untersuchungen hinaus die hämatopoetischen Stammzellen besser charakterisieren zu können, sowie die Sensitivität von Blutzellen mit unterschiedlichem Differenzierungsstatus zu analysieren, wurden sie anderen Zellen des blutbildenden Systems (undifferenzierte und differenzierte HL-60-Zellen und TK6-Zellen) gegenübergestellt. Eine Behandlung der verschiedenen Zelltypen mit mutagenen Substanzen zeigte, dass sich die hämatopoetischen Stammzellen in den meisten der untersuchten Endpunkte von den Zelllinien unterschieden. Deutliche Abweichungen zeigten sich beim oxidativen Stress, der DNA-Reparatur und der Histonacetylierung; kein Unterschied konnte dagegen bei den DNA-Schäden beobachtet werden. Eine erste Interpretation der erhaltenen Ergebnisse ist auf der Grundlage der unterschiedlichen Eigenschaften von Zellen mit abweichendem Differenzierungsstatus möglich. Um jedoch eine eindeutige Aussage treffen zu können, müssten noch weitere Untersuchungen durchgeführt werden.
N2  - Electromagnetic fields (EMF) are ubiquitous in the human environment. By using different frequencies, they form a basis for numerous technologies and are present in multiple applications of our everyday life. One very important application of EMF is mobile communication, where the frequencies vary depending on the modulation standard. The most common standards are the second (2G) and the third (3G) generation standard GSM and UMTS, respectively. The latest modulation type is the fourth generation standard (4G) LTE.
Statistical data reveal that there are currently more than seven billion mobile phone subscriptions. With the widespread use of these technologies, many people, including an increasing number of children, are continuously exposed to EMF. Given its close proximity to the human body, the mobile phone is the main source of EMF exposure. A huge number of in vitro, in vivo and epidemiological studies have been performed in the past to investigate potential, non-thermal effects of mobile phone radiation on biological systems. However, no complete consensus has been reached, leading to ongoing concerns about the harmful potential of this type of non-ionizing radiation. Furthermore, two major concerns regarding long-term effects and children-specific effects were not thoroughly addressed so far. Children might react in a more sensitive way towards environmental influences and partially absorb more radiofrequency radiation than adults. This particularly applies to head regions where the active bone marrow, which is responsible for hematopoiesis, is located. 
The aim of the present study was to investigate effects of radiofrequency fields emitted by mobile phones on cells of the human hematopoietic system. The focus was on human hematopoietic stem cells which were exposed to modulated GSM (900 MHz), UMTS (1,950 MHz) and LTE (2,535 MHz) radiofrequency fields with SAR values ranging from 0 to 4 W/kg for short (4 h) and long (20 h) time periods. Comparative investigations were performed with cells of the promyelocytic cell line HL-60. Studied endpoints included apoptosis, oxidative stress, cell cycle, DNA damage and DNA repair, differentiation and epigenetics in terms of histone acetylation. In all but one of these end points, no clear effect of mobile phone radiation could be detected, neither in hematopoietic stem cells nor in HL-60 cells. The only alteration was observed when quantifying DNA damage. Compared to the sham exposure, a small but statistically significant decrease in DNA damage was found after exposure of hematopoietic stem cells to the GSM modulation for short time period. This observation could not be reproduced in subsequent replicate experiments, and was thus considered not biologically relevant. 
Overall, these investigations demonstrate that mobile phone radiation at frequencies used in the major technologies GSM, UMTS and LTE and with SAR values below and above the recommended safety limits did not induce effects in cells of the human hematopoietic system under the prevailing conditions. A particular focus was on the reproducibility of the results. Furthermore, for the first time human hematopoietic stem cells were subject for such investigations. This is of particular importance, since hematopoietic stem cells enable a broader analysis with respect to cancerogenesis and the immune system based on their multipotent characteristics. 
Moreover, in order to better characterize the hematopoietic stem cells as well as analyze the sensitivity of hematopoietic cells differing in their differentiation status, hematopoietic stem cells were compared to other cells of the hematopoietic system (i.e. undifferentiated and differentiated HL-60 cells and TK6 cells). Upon treatment with mutagenic substances, a clear distinction was observed between the stem cells and the other cell types for the majority of the investigated endpoints. Significant differences were revealed for oxidative stress, DNA repair and histone acetylation, whereas no difference was observed for DNA damage. A first interpretation of the results obtained can be made on the basis of the different characteristics of cells with a different differentiation status. However, in order to make a distinct statement, additional investigations need to be performed.
KW  - Mobilfunk
KW  - Elektromagnetische Felder
KW  - radiofrequency radiation
KW  - Nichtionisierende Strahlung
KW  - Hämatopoese
KW  - In vitro
KW  - Humane Hämatopoetische Stammzellen
KW  - Apoptose
KW  - Gentoxizität
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Zellzyklus
KW  - Differenzierung
KW  - Epigenetik
KW  - human hematopoietic stem cells
KW  - apoptosis
KW  - genotoxicity
KW  - oxidative stress
KW  - differentiation
KW  - epigenetics
KW  - Hämatopoetische Stammzellen
KW  - Blutbildendes System
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145733
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Gmach, Philipp
A1  - Bathe-Peters, Marc
A1  - Telugu, Narasimha
A1  - Miller, Duncan C.
A1  - Annibale, Paolo
T1  - Fluorescence spectroscopy of low-level endogenous β-adrenergic receptor expression at the plasma membrane of differentiating human iPSC-derived cardiomyocytes
JF  - International Journal of Molecular Sciences
N2  - The potential of human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to be differentiated into cardiomyocytes (CMs) mimicking adult CMs functional morphology, marker genes and signaling characteristics has been investigated since over a decade. The evolution of the membrane localization of CM-specific G protein-coupled receptors throughout differentiation has received, however, only limited attention to date. We employ here advanced fluorescent spectroscopy, namely linescan Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), to observe how the plasma membrane abundance of the β\(_1\)- and β\(_2\)-adrenergic receptors (β\(_{1/2}\)-ARs), labelled using a bright and photostable fluorescent antagonist, evolves during the long-term monolayer culture of hiPSC-derived CMs. We compare it to the kinetics of observed mRNA levels in wildtype (WT) hiPSCs and in two CRISPR/Cas9 knock-in clones. We conduct these observations against the backdrop of our recent report of cell-to-cell expression variability, as well as of the subcellular localization heterogeneity of β-ARs in adult CMs.
KW  - GPCR
KW  - β-adrenergic receptors
KW  - hiPSC-CM
KW  - cardiomyocyte
KW  - fluorescence correlation spectroscopy
KW  - FCS
KW  - fluorescence
KW  - CRISPR/Cas9
KW  - differentiation
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-288277
SN  - 1422-0067
VL  - 23
IS  - 18
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Godbole, Amod
A1  - Lyga, Sandra
A1  - Lohse, Martin J.
A1  - Calebiro, Davide
T1  - Internalized TSH receptors en route to the TGN induce local G\(_{S}\)-protein signaling and gene transcription
JF  - Nature Communications
N2  - A new paradigm of G-protein-coupled receptor (GPCR) signaling at intracellular sites has recently emerged, but the underlying mechanisms and functional consequences are insufficiently understood. Here, we show that upon internalization in thyroid cells, endogenous TSH receptors traffic retrogradely to the trans-Golgi network (TGN) and activate endogenous Gs-proteins in the retromer-coated compartment that brings them to the TGN. Receptor internalization is associated with a late cAMP/protein kinase A (PKA) response at the Golgi/TGN. Blocking receptor internalization, inhibiting PKA II/interfering with its Golgi/TGN localization, silencing retromer or disrupting Golgi/TGN organization all impair efficient TSH-dependent cAMP response element binding protein (CREB) phosphorylation. These results suggest that retrograde trafficking to the TGN induces local G\(_{S}\)-protein activation and cAMP/PKA signaling at a critical position near the nucleus, which appears required for efficient CREB phosphorylation and gene transcription. This provides a new mechanism to explain the functional consequences of GPCR signaling at intracellular sites and reveals a critical role for the TGN in GPCR signaling.
KW  - G protein-coupled receptors
KW  - fluorescence imaging
KW  - hormone receptors
KW  - trans-Golgi network
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170375
VL  - 8
IS  - 443
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Gonzales-Calero, G.
A1  - Cubero, A.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
T1  - G protein coupled A\(_1\) adenosine receptors in coated vesicles of mammalian brain. Characterization by radioligand binding and photoaffinity labeling
N2  - A\(_1\) adenosine receptors in coated vesicles have been characterized by radioligand binding and photoaflinity labelling. Saturation experiments with the antagonist 8-cyclopentyl-1 ,3-[\(^3\)H]dipropyl-xanthine ([\(^3\)H]DPCPX) gave a Kdvalue of 0.7 nM and a Bmax value of 82± 13 fmol/mg protein. For the highly A\(_1\)-selective agonist 2-chloro-N\(^6\)-[\(^3\)H]cyclopentyladenosine ([\(^3\)H]CCPA) a Kd value of 1.7 nM and a Bmax value of 72 ± 29 fmol/mg protein was estimated. Competition of agonists for [\(^3\)H]DPCPX binding gave a pharmacological profile with R-N\(^6\)-phenylisopropyladenosine (R-PIA) > CCPA > S-PIA > 5'-N-ethylcarboxamidoadenosine (NECA), which is identical to brain membranes. The competition curves were best fitted according to a two-site model, suggesting the existence of two affinity states. GTP shifted the competition curve for CCP A to the right and only one affinity state similar to the low affinity state in the absence of GTP was detected. The photoreactive agonist 2-azido-N\(^6\)- \(^{125}\)I-p-hydroxyphenylisopropyladenosine ([\(^{125}\)I]AHPIA) specifically labelled a single protein with an apparent molecular weight of 35,000 in coated vesicles, which is identical to A\(_1\) receptors labelled in brain membranes. Therefore, coated vesicles contain A\(_1\) adenosine receptors with similar binding characteristics as membrane-bound receptors, including GTP-sensitive high-affinity agonist binding. Photoaffinity labelling data suggest that A\(_1\) receptors in these vesicles are not a processed receptor fonn. These results confirm that A\(_1\) receptors in coated vesicles are coupled to a G-protein, and it appears that the A\(_1\) receptor systems in coated vesicles andin plasma membranes are identical.
KW  - Toxikologie
KW  - Adenosine receptors
KW  - coated vesicles
KW  - G-protein
KW  - radioligand
KW  - photoaffinity labelling
KW  - brain membranes
Y1  - 1992
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60435
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Gonzalez-Calero, G.
A1  - Cubero, A.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
T1  - Characterization and photoaffinity labeling of  A1 adenosine receptors in coated visicles form bovine brain
N2  - The antagonist (3 II ) DPCPX exhi bitcd a Kd of 0. 4 nM at coalcd vcsicles from bovine brain. Agonist compelition for ( 3 11) DPCPX bind in~ revcaled two affini ty slales for  gonists. The pholoaffinity probe I25 I -AHPIA specifically labelled a band with a molecular weight of 35 Kd.
KW  - Pharmakologie
Y1  - 1991
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86004
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gregor, Caroline
T1  - Genomische Instabilität bei der humanen Ovarialtumorzellinie BG-1 durch hormonelle Proliferationsstimulierung
T1  - Genomic instability after hormonal stimulation of cell proliferation in human ovarian cancer cells.
N2  - Ergebnisse vieler epidemiologischer Studien über die Risikoabschätzungen von Tumoren hormonabhängiger Gewebe legen einen deutlichen Zusammenhang zwischen den Hormonen und dem Auftreten dieser Tumoren nahe. Dabei wird der zellproliferationssteigernde Effekt der Hormone im Rahmen des Mehrstufenkonzeptes der Kanzerogenese meist als Promotionsfaktor beschrieben. In der vorliegenden Arbeit soll gezeigt werden, dass die hormonelle Induktion einer erhöhten Zellteilungsrate auch primär zu einer genetischen Instabilität beiträgt, mit dem Ziel einen weiteren Mechanismus in der Pathogenese hormonabhängiger Tumoren aufzuklären. Die östrogenrezeptorpositive Ovarialtumorzellinie BG-1 und die rezeptornegativen UCI-107 Zellen wurden mit 17-ß Östradiol behandelt und anschließend mit Hilfe des Mikrokerntests auf chromosomale Schäden untersucht. Die Bestimmung der Mikrokernrate bei den östrogensensitiven BG-1 Zellen zeigte, dass mit steigender Proliferationsinduktion auch die Mikrokernfrequenz konzentrationsabhängig erhöht war. Bei der Behandlung der BG-1 Zellen mit 17-ß Östradiol in Kombination mit dem spezifischen Östrogenrezeptorantagonisten 4- Hydroxytamoxifen wurde die östradiolinduzierte rezeptorabhängige Proliferationsstimulation durch Hydroxytamoxifen gehemmt. Parallel dazu sank auch die Mikrokernrate. Bei vergleichbaren Versuchen mit der östrogeninsensitiven UCI-107 Zellinie, bei der keine Effekte auf die Proliferation bei Behandlung der Zellen mit 17-ß Östradiol alleine sowie in Kombination mit 4- Hydroxytamoxifen detektiert werden konnte, wurde auch keine Mikrokerninduktion beobachtet. Eine erhöhte Mikrokernfrequenz konnte wiederum ausschließlich in den östradiolstimulierten BG-1 Zellen festgestellt werden, als durch den Einsatz des Zytokineseinhibitors Cytochalasin B die Auswertung der Mikrokerne auf jene Zellen normiert wurde, die genau eine Zellteilung durchgeführt hatten. Die Ergebnisse machten deutlich, dass die östradiolstimulierten Zellen auf Grund der beschleunigten Proliferation eine „andere Art von Zellteilung“ durchführen. In einem weiteren Abschnitt der Arbeit wurde der Einfluss der Östradiolstimulierung auf den Zellzyklus untersucht. Mittels eines FACScans konnten die prozentualen Zellzyklusphasenanteile (G1/ G0-, S- und G2/ M- Phase) der BG-1 Zellen zu verschiedenen Zeiten des Wachstums bestimmt werden. Zum Beispiel war der Anteil an Zellen der östradiolstimulierten Zellpopulation in der G2/ M Phase durchgehend um 6-8 % geringer gegenüber dem Anteil an Zellen, die mit Lösungsmittel behandelt wurden. Möglicherweise ist dies ein Erklärungsansatz für das vermehrte Auftreten von Mikrokernen bei Östradiolstimulierung, da bekannt ist, dass es in der G2/ M-Phase einen wichtigen Kontrollpunkt innerhalb des Zellzyklus zur Detektion und Reparatur chromosomaler Schäden gibt. Bei Berechnung der Zellzyklusphasenzeiten ergab sich ebenso in der G2/M Phase eine deutlich verkürzte Verweildauer der östradiol-behandelten BG-1 Zellen. Zusammengefaßt leitet sich die Hypothese ab: „Die Zellen werden auf Grund der hormonellen Proliferationsstimulierung durch den Zellzyklus „gejagt“, demzufolge werden wichtige „Checkpoints“ im Zellzyklus überlaufen, wodurch eine genetische Instabilität entstehen.kann“.
N2  - Estrogen-related cancers are often associated with the hormone's tumor promoting activity. Recently, estradiol has also been demonstrated to induce gene mutations in the physiological concentration range. Mitotic disturbances are found at higher concentrations. In the present study we demonstrate data suggesting an additional mechanism for the induction of genetic damage, i.e. chromosomal breakage. The estrogen receptor-positive (BG-1) human ovarian cancer cell line was investigated for micronucleus formation after treatment with estradiol in the picomolar concentration range. The dose-dependent increase in cell proliferation correlated with an increased genomic damage as detected by the formation of micronuclei. Addition of the specific estradiol-receptor antagonist hydroxytamoxifen suppressed both estradiol-induced cell proliferation as well as formation of micronuclei in BG-1 cells Increased numbers of micronuclei were also seen after normalization of the data to the number of cell divisions by additional treatment of the cells with cytochalasin B. In control experiments with the estrogen insensitive ovarial cancer cells UCI-107 neither cell proliferation nor micronucleus formation was found. Furthermore, analysis of the cell cycle revealed decreased cell numbers in G(2)/M phase after treatment with picomolar concentrations. We hypothesize that hormone-specific forcing of responsive cells through cell cycle leads to an override of checkpoints operating under homeostatic control of the cell cycle, resulting in genomic instability.
KW  - Genomische Instabilität
KW  - Mikrokerne
KW  - BG-1 Zellen
KW  - Östrogene
KW  - Zellzykluskontrolle
KW  - Genetic instability
KW  - micronuclei
KW  - BG-1 cells
KW  - estrogens
KW  - control of the cell cycle
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8072
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Grilli, S.
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Parodi, S.
T1  - Possible implications from results of animal studies in human risk estimations for benzene: nonlinear dose-response relationship due to saturation of metabolism
N2  - To date, all risk assessment studies on benzene have been based almost exclusively on epiderniological data. Wehave attempted a more integrated and quantitative evaluation of carcinogenic risk for hurnans, trying to utilize, in addition to the epidemiological data, all data available, specifically data on metabolism, genotoxicity, and carcinogenicity in small rodents. An integrated evaluation of the globality of the available data seems to suggest a progressive saturation of metabolic capacity both for man and rodents between 10 and 100 ppm. The most susceptible target cells seem tobe different in humans (predominant induction of myelogenous leukemia) and small rodents (induction of a wide variety of tumors). Nevertheless, both epidemiological and experimental carcinogenicity data tend to indicate a flattening ofthe response for the highest dosages, again suggesting a general Saturation of mechanisms of metabolic activation, extended to different target tissues. From a quantitative point of view, the data suggest a carcinogenic potency at 10 ppm two to three times higher than that computable by a linear extrapolation from data in the 100 ppm range. These observations are in accord with the recent proposal of the European Economic Community of reducing benzene time-weighted average occupationallevels from 10 to 5 ppm.
KW  - Toxikologie
KW  - Benzene
KW  - Risk estimation
KW  - Carcinogenicity
KW  - Genotoxicity
KW  - Metabolism saturation
KW  - Dose-response relationship
Y1  - 1987
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60936
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Gross, E.
A1  - Ruzicka, T.
A1  - Restorff, B. von
A1  - Stolz, W.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
T1  - High-affinity binding and lack of growth-promoting activity of 12(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid (12(S)-HETE) in a human epidermal cell line
N2  - No abstract available
KW  - Toxikologie
Y1  - 1990
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60358
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Grunicke, H.
A1  - Pyerin, W.
A1  - Eisenbrand, G.
A1  - Havemann, K.
A1  - Rabes, H. M.
A1  - Molling, K.
A1  - Schwab, M.
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Wahrendorf, J.
A1  - Schirrmacher, V.
T1  - 7th International Symposium of the Division of Experimental Cancer Research (AEK) of the German Cancer Society : [Meeting report]
N2  - No abstract available
KW  - Toxikologie
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60651
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gruse, Tamara
T1  - Untersuchung der Rolle der ERK-Dimerisierung bei der ERK1/2- vermittelten Proliferation von Tumorzellen
T1  - Investigation of the role of ERK dimerization in the ERK1/2-mediated proliferation of tumor cells
N2  - Bei vielen Erkrankungen wie z.B. Herzhypertrophie, Diabetes und Entzündungen spielt die Raf-MEK-ERK-Signalkaskade eine wichtige Rolle. ERK1/2 ist in vielen zellulären Prozessen, u.a. Proliferation, Differenzierung, Wachstum, Hypertrophie und Apoptose involviert. Auch in der Tumorentstehung besitzt dieser MAPK-Signalweg eine signifikante Funktion, da er bei ca. 50% aller Krebsarten deutlich aktiviert ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle einer neu entdeckten Phosphorylierungsstelle an Threonin188 an ERK2 bei der Entstehung und der möglichen Therapie von Tumoren zu erarbeiten. Dafür wurde ein Myc-ERK2309-357-Peptid verwendet, das 2013 in der Arbeitsgruppe Lorenz entwickelt wurde. Myc-ERK2309-357 zeigte in bisher unveröffentlichten Versuchen, dass es direkt an ERK2 bindet, eine Dimerisierung von ERK1/2 hemmen und eine vermehrte Lokalisation von ERK2 im Zellkern verhindern kann. Im Rahmen dieses Projekts konnten wir belegen, dass mit Hilfe des Myc-ERK2309-357-Peptids die Tumorzellproliferation von verschiedenen Krebszelllinien (Caco-2, SCC68, PC/1-1 und PC/13-1) um 60-80% vermindert werden konnte. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass Myc-ERK2309-357 keinen Einfluss auf die  Phosphorylierung von ERK1/2 am TEY-Motiv besitzt. Die Aktivierung von ERK1/2 durch die Kinasen MEK1/2 wird somit nicht beeinflusst und die zytosolischen ERK-Funktionen, wie z.B. der anti-apoptotische Effekt, würden somit bestehen bleiben. Außerdem fanden wir heraus, dass Myc-ERK2309-357 im Vergleich zu den MEK-Inhibitoren U0126 und PD98059 und verglichen mit dem EGF-Rezeptor-Antikörper Cetuximab die Proliferation signifikant besser hemmt.
N2  - The Raf-MEK-ERK signaling cascade plays an important role in many diseases, such as cardiac hypertrophy, diabetes and inflammation. ERK1/2 is involved in many cellular processes, i.a. proliferation, differentiation, growth, hypertrophy and apoptosis. This MAPK signaling pathway also has a significant function in tumorigenesis because it is clearly activated in about 50% of all cancers. The aim of this work was to investigate the role of a newly discovered phosphorylation site on threonine188 in ERK2 in the genesis and possible therapy of tumors. For this, a Myc- ERK2309-357 peptide was used, which was developed in the research group Lorenz in 2013. It has previously been shown that Myc-ERK2309-357 binds directly to ERK2, inhibits ERK1/2 dimerization, and prevents increased localization of ERK2 in the nucleus. In this project we demonstrated that the Myc-ERK2309-357 peptide reduces the tumor cell proliferation of various cancer cell lines (Caco-2, SCC68, PC / 1-1 and PC / 13-1) by 60-80%. Furthermore, we could show that Myc-ERK2309-357 has no influence on the phosphorylation of ERK1/2 on the TEY motif. The activation of ERK1/2 by the kinases MEK1/2 is thus unaffected and the cytosolic ERK functions, e.g. the anti-apoptotic effect, would thus persist. In addition, we discovered that Myc-ERK2309-357 inhibits proliferation of the tumor cells significantly better compared to the MEK inhibitors U0126 and PD98059 and compared to the EGFR antibody Cetuximab.
KW  - Dimerisierung
KW  - MAP-Kinase
KW  - Carcinogenese
KW  - ERK1/2 Dimerisierung
KW  - Tumorzellproliferation
KW  - Krebs
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159847
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Gunz, D.
A1  - Shephard, S. E.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Can nongenotoxic carcinogens be detected with the lacI transgenic mouse mutation assay?
N2  - No abstract available
KW  - Toxikologie
Y1  - 1993
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60707
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Guth, Sabine
A1  - Hüser, Stephanie
A1  - Roth, Angelika
A1  - Degen, Gisela
A1  - Diel, Patrick
A1  - Edlund, Karolina
A1  - Eisenbrand, Gerhard
A1  - Engel, Karl-Heinz
A1  - Epe, Bernd
A1  - Grune, Tilman
A1  - Heinz, Volker
A1  - Henle, Thomas
A1  - Humpf, Hans-Ulrich
A1  - Jäger, Henry
A1  - Joost, Hans-Georg
A1  - Kulling, Sabine E.
A1  - Lampen, Alfonso
A1  - Mally, Angela
A1  - Marchan, Rosemarie
A1  - Marko, Doris
A1  - Mühle, Eva
A1  - Nitsche, Michael A.
A1  - Röhrdanz, Elke
A1  - Stadler, Richard
A1  - van Thriel, Christoph
A1  - Vieths, Stefan
A1  - Vogel, Rudi F.
A1  - Wascher, Edmund
A1  - Watzl, Carsten
A1  - Nöthlings, Ute
A1  - Hengstler, Jan G.
T1  - Contribution to the ongoing discussion on fluoride toxicity
JF  - Archives of Toxicology
N2  - Since the addition of fluoride to drinking water in the 1940s, there have been frequent and sometimes heated discussions regarding its benefits and risks. In a recently published review, we addressed the question if current exposure levels in Europe represent a risk to human health. This review was discussed in an editorial asking why we did not calculate benchmark doses (BMD) of fluoride neurotoxicity for humans. Here, we address the question, why it is problematic to calculate BMDs based on the currently available data. Briefly, the conclusions of the available studies are not homogeneous, reporting negative as well as positive results; moreover, the positive studies lack control of confounding factors such as the influence of well-known neurotoxicants. We also discuss the limitations of several further epidemiological studies that did not meet the inclusion criteria of our review. Finally, it is important to not only focus on epidemiological studies. Rather, risk analysis should consider all available data, including epidemiological, animal, as well as in vitro studies. Despite remaining uncertainties, the totality of evidence does not support the notion that fluoride should be considered a human developmental neurotoxicant at current exposure levels in European countries.
KW  - pharmacology/toxicology
KW  - occupational medicine/industrial medicine
KW  - environmental health
KW  - biomedicine, general
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-307161
SN  - 0340-5761
SN  - 1432-0738
VL  - 95
IS  - 7
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gärttner, Carola
T1  - Beta-adrenerge Signaltransduktion in kardial differenzierten embryonalen Stammzellen
T1  - beta-adrenergic signal transduction in embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurden die kardial differenzierten embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) mittels der von Wobus et al. entwickelten Tröpfchentechnik gewonnen. Eine Optimierung der kardialen Ausbeute konnte durch eine Selektionsmethode erreicht werden, die auf der Expression eines Resistenzgens in den kardial differenzierten ES-Zellen beruht. Hierdurch wurde eine reproduzierbar hohe Anreicherung von ES-Kardiomyozyten erzielt. Die erstmalig durchgeführte quantitative Bestimmung der endogenen &#946;-adrenergen Rezeptorexpression in ES-Kardiomyozyten zeigte eine Subtyp-Verteilung, die mit derjenigen in adulten Maus-Kardiomyozyten übereinstimmt, wobei eine höhere endogene Expression in ES-Kardiomyozyten vorlag. Ferner konnte durch eine &#946;-adrenerge Stimulation in 16 Tage alten ES-Kardiomyozyten eine positive chronotrope Reaktion sowie eine Aktivierung der Adenylatzyklase-Aktivität hervorgerufen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass ES-Kardiomyozyten am 16. Differenzierungstag einen vollständig ausgereiften &#946;-adrenergen Signalweg aufweisen und hinsichtlich der physiologischen Effekte vergleichbare Merkmale mit adulten Maus-Kardiomyoyzten haben. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Fähigkeit eines adenoviralen Gentransfers in ES-Kardiomoyzten zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass der Gentransfer mittels rekombinanten Adenoviren eine sehr effiziente und durchführbare Methode zur Expression von Transgenen in ES-Kardiomyozyten ist. Weiterhin konnte die funktionelle Kopplung der adenoviral überexprimierten &#946;1-adrenergen Rezeptoren nachgewiesen werden. Die Überexpression hatte eine ausgeprägte Sensitivierung der Rezeptorantwort zur Folge, während die maximale Isoprenalin-induzierte cAMP-Produktion nur wenig erhöht wurde. Dies entspricht Befunden an transgenen Mausmodellen mit einer &#946;1-adrenergen Rezeptor-überexpression. Eine Sensitivierung des chronotropen Effektes konnte dagegen nicht gezeigt werden. Möglicherweise führte die Transfektion der ES-Kardiomyozyten-Zellverbände nur zu einem oberflächlich begrenzten Gentransfer, der keinen Einfluss auf die Gesamtheit des funktionellen Synzytiums hatte. Außerdem wurde in dieser Arbeit der Einfluss einer unterschiedlichen Phosducin-Expression auf die kardiale Differenzierungsfähigkeit in transgenen ES-Zellen untersucht. Dabei konnte kein signifikanter Unterschied in der kardialen Differenzierung sowie in der Basalfrequenz von homozygoten und heterozygoten Phosducin Knock-out Klonen beziehungsweise von Phosducin überexprimierenden Zellklonen festgestellt werden.
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurden die kardial differenzierten embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) mittels der von Wobus et al. entwickelten Tröpfchentechnik gewonnen. Eine Optimierung der kardialen Ausbeute konnte durch eine Selektionsmethode erreicht werden, die auf der Expression eines Resistenzgens in den kardial differenzierten ES-Zellen beruht. Hierdurch wurde eine reproduzierbar hohe Anreicherung von ES-Kardiomyozyten erzielt. Die erstmalig durchgeführte quantitative Bestimmung der endogenen &#946;-adrenergen Rezeptorexpression in ES-Kardiomyozyten zeigte eine Subtyp-Verteilung, die mit derjenigen in adulten Maus-Kardiomyozyten übereinstimmt, wobei eine höhere endogene Expression in ES-Kardiomyozyten vorlag. Ferner konnte durch eine &#946;-adrenerge Stimulation in 16 Tage alten ES-Kardiomyozyten eine positive chronotrope Reaktion sowie eine Aktivierung der Adenylatzyklase-Aktivität hervorgerufen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass ES-Kardiomyozyten am 16. Differenzierungstag einen vollständig ausgereiften &#946;-adrenergen Signalweg aufweisen und hinsichtlich der physiologischen Effekte vergleichbare Merkmale mit adulten Maus-Kardiomyoyzten haben. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Fähigkeit eines adenoviralen Gentransfers in ES-Kardiomoyzten zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass der Gentransfer mittels rekombinanten Adenoviren eine sehr effiziente und durchführbare Methode zur Expression von Transgenen in ES-Kardiomyozyten ist. Weiterhin konnte die funktionelle Kopplung der adenoviral überexprimierten &#946;1-adrenergen Rezeptoren nachgewiesen werden. Die Überexpression hatte eine ausgeprägte Sensitivierung der Rezeptorantwort zur Folge, während die maximale Isoprenalin-induzierte cAMP-Produktion nur wenig erhöht wurde. Dies entspricht Befunden an transgenen Mausmodellen mit einer &#946;1-adrenergen Rezeptor-überexpression. Eine Sensitivierung des chronotropen Effektes konnte dagegen nicht gezeigt werden. Möglicherweise führte die Transfektion der ES-Kardiomyozyten-Zellverbände nur zu einem oberflächlich begrenzten Gentransfer, der keinen Einfluss auf die Gesamtheit des funktionellen Synzytiums hatte. Außerdem wurde in dieser Arbeit der Einfluss einer unterschiedlichen Phosducin-Expression auf die kardiale Differenzierungsfähigkeit in transgenen ES-Zellen untersucht. Dabei konnte kein signifikanter Unterschied in der kardialen Differenzierung sowie in der Basalfrequenz von homozygoten und heterozygoten Phosducin Knock-out Klonen beziehungsweise von Phosducin überexprimierenden Zellklonen festgestellt werden
KW  - ß-adrenerge Signaltransduktion
KW  - Embryonalen Stammzellen
KW  - Kardiomoyzyten
KW  - beta-adrenergic signal transduction
KW  - embryonic stem cell
KW  - cardiomyocyt
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18923
ER  - 
TY  - THES
A1  - Haake, Monika
T1  - Belastungen durch Passivrauchen im Kindesalter
T1  - The damage to children's health caused by environmental tobacco smoke
N2  - Hintergrund: Passivrauchen ist nicht nur als kanzerogen für den Menschen eingestuft, sondern verursacht auch verschiedene andere Erkrankungen. Oft wird dabei der Passivrauchbelastung von Kindern im häuslichen Bereich zu wenig Beachtung geschenkt. In dieser Arbeit wurde deswegen der Zusammenhang zwischen Passivrauchen auf der einen Seite und atopischen Erkrankungen, Erkrankungen der oberen Atemwege und Gentoxizität auf der anderen Seite untersucht. Methoden: Die Daten von über 100 Kindern zwischen 1 und 15 Jahren wurden mit Hilfe eines Fragebogens erhoben und zusammen mit den Krankenakten ausgewertet. Zur Prüfung der Gentoxizität wurden Mikrokernraten und Schwesterchromatidenaustausche in peripheren Lymphozyten bestimmt. Der Erfassung der inneren Exposition dienten Hämoglobinaddukte von 4-Aminobiphenyl, welches in Zigarettenrauch vorkommt und als krebserzeugend für den Menschen eingestuft ist. Ergebnisse: Bei Untersuchung der Mikrokernraten zeigten die rauchbelasteten Kinder höhere Mikrokernraten (Mittelwert: 12,7/1000 zweikernige Lymphozyten) als die unbelasteten (Mittelwert: 11,7 Mikrokerne/1000 zweikernige Lymphozyten). Der Unterschied war aber nicht signifikant (p = 0,344). Außerdem hatten die Vorschulkinder mit rauchenden Eltern signifikant höhere Mikrokernraten (Mittelwert: 14,2/1000 zweikernige Lymphozyten) als die Schulkinder (Mittelwert: 9,2/1000 zweikernige Lymphozyten; p = 0,031). Die Analyse der 4-Aminobiphenyl-Hämoglobinaddukte der 1,25- bis 4,0-Jährigen ergab leicht höhere Werte für Kinder mit rauchenden Eltern (Mittelwert: 66,52 pg/g Hb) als für Kinder, deren Eltern nicht zu Hause rauchten, und deren Werte (Mittelwert: 56,18 pg/g Hb) waren höher als die der unbelasteten Kinder (Mittelwert: 49,60 pg/g Hb). Der Unterschied war nicht signifikant. Bei Betrachtung der atopischen Erkrankungen war der Anteil der Atopiker bei der rauchexponierten Gruppe höher (31,3 %) als bei der nicht exponierten (16,3 %), obwohl die genetische Vorbelastung in der rauchbelasteten Gruppe etwas geringer war als in der unbelasteten. Bei den Kindern mit Erkrankungen der oberen Atemwege zeigte sich ein höherer Anteil rauchexponierter Kinder (61,3 %) als in der Gruppe der Kinder mit Erkrankungen, die wahrscheinlich nicht mit postnataler Passivrauchexposition in Zusammenhang stehen (44,8 %). Schlussfolgerung: Diese Arbeit unterstreicht die Bedeutung von Passivrauchen im Hinblick auf atopische Erkrankungen und Erkrankungen der oberen Atemwege bei Kindern. Gerade die häusliche Passivrauch-Belastung im Vorschulalter und ihre Auswirkung auf das Erbgut sollten hinsichtlich der erhöhten Mikrokernraten mehr Beachtung finden.
N2  - Background: Passive smoking is not only classified as carcinogenic in humans, but also causes different other diseases. In this context the exposure of children to environmental tobacco smoke (ETS) at home is often not considered well enough. Therefore the correlation between passive smoking on the one hand and atopic diseases, diseases of the upper airways and genotoxicity on the other hand has been analysed in this dissertation. Methods: The data of more than 100 children from 1 to 15 years of age were collected with the help of a questionnaire and analysed together with the children’s medical files. To test genotoxicity, micronucleus frequencies and sister chromatid exchanges were determined in peripheral lymphocytes. Hemoglobin adducts of 4-aminobiphenyl, which is contained in tobacco smoke and classified as carcinogenic in humans, were used to measure the internal exposure. Results: The examination of the micronucleus frequencies has shown that the ETS-exposed children had higher micronucleus frequencies (mean: 12,7/1000 binucleate lymphocytes) than the non-exposed children (mean: 11,7/1000 binucleate lymphocytes). However, the difference was not significant (p = 0,344). In addition to that, preschool-children with smoking parents had significantly higher micronucleus frequencies (mean: 14,2/1000 binucleate lymphocytes) than school-children (mean: 9,2/1000 binucleate lymphocytes; p = 0,031). The analysis of the 4-aminobiphenyl-hemoglobin adducts of the children from 1,25 to 4 years of age showed results a bit higher for the children with smoking parents (mean: 66,52 pg/g Hb) than for the children whose parents did not smoke at home. The results for these children (mean: 56,18 pg/g Hb) were higher than for those not exposed to environmental tobacco smoke (mean: 49,60 pg/g Hb). The difference was not significant. In regard to the atopic diseases the share of the atopic children in the ETS-exposed group was higher (31,3%) than in the non-exposed one (16,3 %) although the genetic disadvantage in the ETS-exposed group was less serious than in the non-exposed one. Looking at the children with diseases of the upper airways the share of ETS-exposed children was higher (61,3 %) than in the group of children with diseases probably not connected to postnatal exposure to ETS (44,8 %). Conclusion: This dissertation underlines the importance of passive smoking as far as atopic diseases and diseases of the upper airways of children are concerned. Especially the ETS exposure of preschool-children at home and its effects on the genom should be considered more than it is because of the increased micronucleus frequencies.
KW  - Passivrauchen
KW  - Kinder
KW  - Mikrokerne
KW  - Schwesterchromatidenaustausche
KW  - 4-Aminobiphenyl
KW  - Hämoglobinaddukte
KW  - Gentoxizität
KW  - atopische Erkrankungen
KW  - passive smoking
KW  - environm. tobacco smoke
KW  - children
KW  - micronuclei
KW  - sister chromatid exch.
KW  - 4-aminobiphenyl
KW  - hemoglobin adducts
KW  - genotoxicity
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13952
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hadi, Naji Said Aboud
A1  - Bankoglu, Ezgi Eyluel
A1  - Stopper, Helga
T1  - Genotoxicity of pyrrolizidine alkaloids in metabolically inactive human cervical cancer HeLa cells co-cultured with human hepatoma HepG2 cells
JF  - Archives of Toxicology
N2  - Pyrrolizidine alkaloids (PAs) are secondary plant metabolites, which can be found as contaminant in various foods and herbal products. Several PAs can cause hepatotoxicity and liver cancer via damaging hepatic sinusoidal endothelial cells (HSECs) after hepatic metabolization. HSECs themselves do not express the required metabolic enzymes for activation of PAs. Here we applied a co-culture model to mimic the in vivo hepatic environment and to study PA-induced effects on not metabolically active neighbour cells. In this co-culture model, bioactivation of PA was enabled by metabolically capable human hepatoma cells HepG2, which excrete the toxic and mutagenic pyrrole metabolites. The human cervical epithelial HeLa cells tagged with H2B-GFP were utilized as non-metabolically active neighbours because they can be identified easily based on their green fluorescence in the co-culture. The PAs europine, riddelliine and lasiocarpine induced micronuclei in HepG2 cells, and in HeLa H2B-GFP cells co-cultured with HepG2 cells, but not in HeLa H2B-GFP cells cultured alone. Metabolic inhibition of cytochrome P450 enzymes with ketoconazole abrogated micronucleus formation. The efflux transporter inhibitors verapamil and benzbromarone reduced micronucleus formation in the co-culture model. Furthermore, mitotic disturbances as an additional genotoxic mechanism of action were observed in HepG2 cells and in HeLa H2B-GFP cells co-cultured with HepG2 cells, but not in HeLa H2B-GFP cells cultured alone. Overall, we were able to show that PAs were activated by HepG2 cells and the metabolites induced genomic damage in co-cultured HeLa cells.
KW  - co-culture
KW  - micronuclei
KW  - mitotic disturbance
KW  - cytochrome P450s
KW  - membrane transporters
KW  - pyrrolizidine alkaloids
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-324708
VL  - 97
IS  - 1
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Harnoš, Jakub
A1  - Cañizal, Maria Consuelo Alonso
A1  - Jurásek, Miroslav
A1  - Kumar, Jitender
A1  - Holler, Cornelia
A1  - Schambony, Alexandra
A1  - Hanáková, Kateřina
A1  - Bernatík, Ondřej
A1  - Zdráhal, Zbynêk
A1  - Gömöryová, Kristína
A1  - Gybeľ, Tomáš
A1  - Radaszkiewicz, Tomasz Witold
A1  - Kravec, Marek
A1  - Trantírek, Lukáš
A1  - Ryneš, Jan
A1  - Dave, Zankruti
A1  - Fernández-Llamazares, Ana Iris
A1  - Vácha, Robert
A1  - Tripsianes, Konstantinos
A1  - Hoffmann, Carsten
A1  - Bryja, Vítězslav
T1  - Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based biosensors reveals a key role of casein kinase 1
JF  - Nature Communications
N2  - Dishevelled (DVL) is the key component of the Wnt signaling pathway. Currently, DVL conformational dynamics under native conditions is unknown. To overcome this limitation, we develop the Fluorescein Arsenical Hairpin Binder- (FlAsH-) based FRET in vivo approach to study DVL conformation in living cells. Using this single-cell FRET approach, we demonstrate that (i) Wnt ligands induce open DVL conformation, (ii) DVL variants that are predominantly open, show more even subcellular localization and more efficient membrane recruitment by Frizzled (FZD) and (iii) Casein kinase 1 ɛ (CK1ɛ) has a key regulatory function in DVL conformational dynamics. In silico modeling and in vitro biophysical methods explain how CK1ɛ-specific phosphorylation events control DVL conformations via modulation of the PDZ domain and its interaction with DVL C-terminus. In summary, our study describes an experimental tool for DVL conformational sampling in living cells and elucidates the essential regulatory role of CK1ɛ in DVL conformational dynamics.
KW  - biological techniques
KW  - cell signalling
KW  - phosphorylation
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-227837
VL  - 10
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hartmann, Nico
A1  - Knierim, Maria
A1  - Maurer, Wiebke
A1  - Dybkova, Nataliya
A1  - Hasenfuß, Gerd
A1  - Sossalla, Samuel
A1  - Streckfuss-Bömeke, Katrin
T1  - Molecular and functional relevance of Na\(_V\)1.8-induced atrial arrhythmogenic triggers in a human SCN10A knock-out stem cell model
JF  - International Journal of Molecular Sciences
N2  - In heart failure and atrial fibrillation, a persistent Na\(^+\) current (I\(_{NaL}\)) exerts detrimental effects on cellular electrophysiology and can induce arrhythmias. We have recently shown that Na\(_V\)1.8 contributes to arrhythmogenesis by inducing a I\(_{NaL}\). Genome-wide association studies indicate that mutations in the SCN10A gene (Na\(_V\)1.8) are associated with increased risk for arrhythmias, Brugada syndrome, and sudden cardiac death. However, the mediation of these Na\(_V\)1.8-related effects, whether through cardiac ganglia or cardiomyocytes, is still a subject of controversial discussion. We used CRISPR/Cas9 technology to generate homozygous atrial SCN10A-KO-iPSC-CMs. Ruptured-patch whole-cell patch-clamp was used to measure the I\(_{NaL}\) and action potential duration. Ca\(^{2+}\) measurements (Fluo 4-AM) were performed to analyze proarrhythmogenic diastolic SR Ca\(^{2+}\) leak. The I\(_{NaL}\) was significantly reduced in atrial SCN10A KO CMs as well as after specific pharmacological inhibition of Na\(_V\)1.8. No effects on atrial APD\(_{90}\) were detected in any groups. Both SCN10A KO and specific blockers of Na\(_V\)1.8 led to decreased Ca\(^{2+}\) spark frequency and a significant reduction of arrhythmogenic Ca\(^{2+}\) waves. Our experiments demonstrate that Na\(_V\)1.8 contributes to I\(_{NaL}\) formation in human atrial CMs and that Na\(_V\)1.8 inhibition modulates proarrhythmogenic triggers in human atrial CMs and therefore Na\(_V\)1.8 could be a new target for antiarrhythmic strategies.
KW  - Na\(_V\)1.8
KW  - iPSC-cardiomyocytes
KW  - late Na\(^+\) current (I\(_{NaL}\))
KW  - CRISPR Cas9
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-362708
SN  - 1422-0067
VL  - 24
IS  - 12
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hegi, M. E.
A1  - Ulrich, D.
A1  - Sagelsdorff, P.
A1  - Richter, C.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - No measurable increase  in thymidine glycol or 8-hydroxydeoxyguanosine in liver DNA of rats treated with nafenopin or choline-devoid low-methionine diet
N2  - Male rats were treated for 2 months with 1000 ppm nafenopin in the diet or for 4 or 7 days with a choline-devoid low-methionine diet. DNA was isolated from the livers and analyzed for the presence of cis-thymidine glycol-3'-phosphate (cis-dTGp) by 32P-postlabeling and for the Ievel of 8-hydroxy-deoxyguanosine (8-0H-dG) by electrochemical detection (ECD). In no DNA sample was the Ievel of cis-dTGp above the Iimit of detection of 1 modified thymidine per 106 nucleotides. With 8-0H-dG, a background Ievel of this modification of 20 8-0H-dG per 106 nucleosides was found in liver DNA of control rats, which was not affected by either treatment. It is postulated for thymidine glycol that a potential increase was below the Iimit of detection or was rapidly repaired in vivo and that the steady-state Ievel of endogenous 8-hydroxydeoxyguanosine appears not tobe influenced by the treatments chosen.
KW  - Toxikologie
KW  - Oxygen radical
KW  - DNA
KW  - Genotoxicity
KW  - Rat liver peroxisome
KW  - Choline deficiency
KW  - Thymidine glycol
KW  - 8-Hydroxy-deoxyguanosine
Y1  - 1990
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60790
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hegi, M.E.
A1  - Sagelsdorff, P.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Detection by \(^{32}\)P-postlabeling of thymidine glycol in gamma-irradiated DNA
N2  - No abstract available
KW  - Toxikologie
Y1  - 1989
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60863
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heinlein, U-Ju
T1  - Adenosinrezeptoren auf Ovarialkarzinomzellen
T1  - adenosine receptors in ovarian cancer cells
N2  - Seit der Entdeckung, dass Adenosin auch als Botenstoff dient, beschäftigen sich Forschungsgruppen mit Adenosinrezeptoren und ihrer möglichen therapeutischen Modulation, insbesondere in Zusammenhang mit Krebserkrankungen. Bislang sind die Rezeptoren auf diversen Krebszellen nachgewiesen worden. So konnten beispielsweise in einer Brustkrebszelllinie A2B Adenosinrezeptoren nachgewiesen werden, deren Stimulation zu einer Hemmung der wachstumsfördernden MAP Kinase führt. Pharmaka zur weitgehend selektiven Aktivierung oder Hemmung einzelner Adenosinrezeptor-Subtypen stehen ebenfalls zur Verfügung. Beim Ovarialkarzinom mit seiner leider meist erst spät auftretenden Symptomatik besteht derzeit noch keine Möglichkeit zur frühen Diagnosestellung, sodass die Prognose ausgesprochen ungünstig ausfällt und die Erkrankung bei Frauen eine der häufigsten krebsbedingten Todesursachen darstellt. Daher war es ein Ziel dieser Arbeit herauszufinden, ob Adenosinrezeptoren auf diesen Zellen einen möglichen therapeutischen Angriffspunkt bieten. Dazu untersuchten wir die vier Ovarialkarzinomzelllinien OVCAR-3, SK-OV-3, PA-1 und OAW-42 auf eine mögliche Expression von allen vier Adenosinrezeptorsubtypen. Zunächst wurden mit radioaktiv markierten Liganden ([3H]CCPA, [3H]NECA und [3H]HEMADO) Bindungsstudien für den A1-, A2A- und A3-Subtyp durchgeführt. Die Expression des A2B-Rezeptors wurde mithilfe eines funktionellen Nachweises, der Stimulation der Adenylylcyclase mithilfe von NECA (einem unspezifischen Adenosinrezeptoragonisten) analysiert. Im Anschluss daran untersuchten wir an OAW-42 und SK-OV-3 Zellen, ob sich ihr Proliferationsverhalten durch eine Stimulation mit NECA verändern ließe und ob sich das Ansprechen auf gängige Chemotherapeutika bzw. einen Todesliganden ändern würde. Trotz des erfolgreichen Nachweises von Adenosinrezeptoren auf allen Zelllinien waren die Ergebnisse der Proliferationsstudien aber nicht eindeutig. OAW-42 und SK-OV-3 Zellen reagierten zwar auf eine NECA-Stimulation mit sinkendem BrdU-Einbau, OAW-42 Zellen zeigten aber nach Behandlung mit NECA eine leicht erhöhte Resistenz gegenüber Cisplatin. NECA-behandelte SK-OV-3 Zellen reagierten hingegen etwas sensitiver auf Doxorubicin und Fas-Ligand. Die Unterschiede waren aber insgesamt sehr gering und wurden daher von uns als nicht entscheidender Effekt gewertet. Auch Untersuchungen zur Expression der Adenosin-generierenden Enzyme CD39 und CD73 vor und nach NECA-Stimulation blieben ohne erkennbare Veränderung. Insofern ergaben unsere Untersuchungen keine Hinweise darauf, dass Adenosinrezeptoren eine mögliche therapeutische Zielstruktur darstellen könnten. Zukünftige Studien können aber die gewonnenen Daten als Grundlage und Ausgangspunkt nützen, um auch andere Tumorzellarten zu untersuchen und im Kampf gegen den Krebs nach neuen potenziellen pharmakologischen Angriffspunkten zu suchen.
N2  - Purpose of the study: Adenosine and adenosine receptors are widely distributed throughout the human body. While they are thought to be involved in many diseases, they seem to play a particularly important role in cancer. Adenosine receptors were already identified in many different cancer tissues. Moreover, extracellular adenosine accumulates in solid tumor masses as a consequence of poor blood supply leading to hypoxia, cell death and concomitant adenine nucleotide breakdown. From a pharmacological point-of-view, numerous tools for activating or inhibiting adenosine receptors have been developed which could be used as therapeutics to combat cancer.One such strategy, for instance, might be based on the identification of A2B adenosine receptors in a breast cancer cell line which mediate the inhibition of growth-promoting MAP kinase activity. Among genuinely gynecological cancers, ovarian carcinoma is associated with the highest mortality rate. Its poor prognosis is mostly due to late primary diagnosis caused by the absence of early symptoms and by the lack of suitable screening programs. As current therapies show limited efficacy against late-stage ovarian cancer, there is an unmet medical need to be addressed by scientists and physicians. In this study we investigated if the human ovarian cancer cell lines OVCAR-3, SK-OV-3, PA-1 and OAW-42 express adenosine receptors on their surfaces. We used binding assays with the help of tritiated radioligands ([3H]CCPA , [3H]NECA und [3H]HEMADO) to identify the A1, A2A, A3 subtype and used a functional assay, namely the stimulation of the adenylylcyclase to detect A2B adenosine receptors with [32P]ATP and the nonselective adenosine receptor agonist NECA. Furthermore we investigated whether stimulation of adenosine receptors with NECA had any effect on the proliferation of OAW-42 and SK-OV-3 cells or on their sensitivity towards chemotherapeutic agents like cisplatin and doxorubicin. Results: We found adenosine receptors in all of the screened ovarian cancer cells, but their effects on proliferation and survival were ambiguous. OAW-42 and SK-OV-3 cells slightly reduced the incorporation of BrdU after treatment with 10 µM NECA. However, OAW-42 cells also became more resistant to cisplatin after treatment with NECA. SK-OV-3 cells, in contrast, were sensitized to doxorubicin and Fas ligand after incubation with NECA. Flow cytometry (FACS) further showed that the cell surface expression for the adenosine-generating ectonucleotidases CD39 and CD73 remained unaltered after stimulation of the cells with NECA. Taken together, the observed effects were quite small and it is questionable whether adenosine receptors represent suitable targets in ovarian cancer. Nevertheless, adenosine receptors remain interesting targets for cancer therapy. Our studies may thus stimulate future research on different tumor entities, with the purpose of finding the best application for the available adenosine receptor-specific drugs.
KW  - Eierstockkrebs
KW  - Adenosin
KW  - Adenosinrezeptor
KW  - ovarian cancer
KW  - adenosine
KW  - adenosine receptor
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-81920
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hintzsche, Henning
T1  - Gentoxizität nichtionisierender Strahlung - Auswirkungen von Mobilfunk- und Terahertzstrahlung auf das Genom
T1  - Genotoxicity of non-ionizing radiation - Effects of mobile phone and terahertz radiation on the genome
N2  - Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob nichtionisierende elektromagnetische Strahlung verschiedener Frequenzbereiche Genomschaden hervorrufen kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Biomonitoring-Studie zu dieser Thematik konzipiert und durchgeführt. Es wurden 131 Probanden detailliert zu ihrer Mobilfunknutzung befragt. Anschließend wurden Mundschleimhautzellen entnommen und für eine mikroskopische Untersuchung aufbereitet und angefärbt. In den Zellen wurden Mikrokerne und andere Kernanomalien quantifiziert. Es zeigte sich keine Erhöhung der Mikrokernfrequenz in Abhängigkeit von der Dauer der Mobiltelefonnutzung. Auch die anderen abgefragten Parameter hatten keinen Einfluss auf die Höhe des Genomschadens. Als Positivkontrollen wurden vier Patienten, die eine lokale Strahlentherapie (ionisierende Strahlung) erhielten, eingeschlossen. Hier zeigte sich eine deutliche Erhöhung der Mikrokernfrequenz. Um festzustellen, ob die Mikrokerninduktion erst bei höheren Leistungsflussdichten als denen, die beim Mobilfunk verwendet werden, auftritt, wurden in-vitro-Versuche durchgeführt, bei denen verschiedene Zelllinien einer Strahlung von 900 MHz ausgesetzt wurden. Nach Exposition und einer Postinkubationsperiode wurden die Zellen fixiert und die Mikrokernfrequenz bestimmt. Neben den Leistungen wurden hier auch die Expositionszeiten und die Postinkubationsperioden variiert. In keinem Fall konnte eine Erhöhung der Mikrokernfrequenz festgestellt werden. Insgesamt konnte ein Einfluss elektromagnetischer Strahlung auf das Genom weder am Menschen im Rahmen einer Biomonitoring-Studie noch an verschiedenen Zelllinien im Rahmen von in-vitro-Versuchen festgestellt werden. Terahertzstrahlung ist elektromagnetische Strahlung im Bereich von 0,1 bis 10 THz, d. h. sie liegt zwischen Mikrowellen und Infrarotlicht. Derzeit wird sie hauptsächlich für spektroskopische Untersuchungen und zur Qualitätskontrolle im Herstellungs-prozess verschiedener Produkte verwendet. Anwendungen in der Sicherheitstechnik (z. B. Ganzkörperscanner) und in der Medizintechnik (z. B. Bildgebung) stehen kurz vor der Markteinführung bzw. sind bereits etabliert. Diese Anwendungen bringen eine Exposition der betroffenen Menschen mit sich. Außerdem wird an weiteren Techniken wie etwa der Datenübertragung gearbeitet. Die Wirkungen auf biologische Systeme sind im Gegensatz zum Mobilfunkbereich bisher nur unzureichend untersucht. Da bisher keine vollständigen Literaturübersichten vorlagen, wurde eine umfassende Literaturrecherche durchgeführt. Ziel war es, alle bisher durchgeführten Studien zu diesem Thema aufzulisten. Um diese Datenbasis zu verbreitern wurden in-vitro-Versuche bei verschiedenen Frequenzen durchgeführt. Als Strahlungsquellen wurden eine Frequenzvervielfacherkaskade (0,106 THz), ein Rückwärtswellen-Oszillator (0,380 THz) und ein Ferninfrarot-Laser (2,520 THz) eingesetzt. Die Strahlung wurde in einen modifizierten Inkubator geführt, so dass die Expositionen bei definierter Temperatur und konstantem CO2-Gehalt durchgeführt werden konnten. Da Terahertzstrahlung durch Wasser sehr stark absorbiert wird, sind bei einer Exposition des Menschen primär die obersten Hautschichten betroffen. Aus diesem Grund wurden primäre Hautfibroblasten und HaCaT-Zellen, eine Keratinozyten-Zelllinie, als biologische Systeme verwendet. Die Zellen wurden für unterschiedliche Zeitperioden mit verschiedenen Leistungsflussdichten exponiert. Anschließend wurden die Zellen für den Comet Assay aufbereitet und analysiert. Der Comet Assay ist eine Methode zur Quantifizierung von Einzel- und Doppelstrangbrüchen der DNA. Weiterhin wurden die Zellen nach einer Postinkubationsperiode für den Mikrokerntest aufbereitet. Neben unbehandelten Kontrollen und Sham-Expositionen wurden auch Positivkontrollen durchgeführt. Es konnte keine Erhöhung der Anzahl der DNA-Strangbrüche bzw. der Mikrokernfrequenz festgestellt werden. Da bekannt war, dass im Mobilfunkbereich unter bestimmten Bedingungen Störungen der Mitose, nicht aber Erhöhungen der Mikrokernfrequenz, auftreten, wurden Mitosestörungen nach Exposition bei 0,106 THz untersucht. Hierzu wurden AL-Zellen für 30 Minuten exponiert und anschließend ohne Postinkubation direkt fixiert. Analysiert wurden Störungen in allen Phasen der Mitose. Es zeigte sich, dass die Frequenz der Störungen in der Pro- und Metaphase unverändert blieb. Die Störungen in der Ana- und Telophase nahmen dagegen mit steigender Leistungsflussdichte zu. Insgesamt konnte im Terahertzbereich unter den gewählten Expositionsbedingungen kein DNA-Schaden beobachtet werden. Bei 0,106 THz konnten Mitosestörungen als Folge der Exposition gezeigt werden. Der Zusammenhang zwischen diesen Mitosestörungen und DNA-Schäden, insbesondere der Mikrokerninduktion, konnte bisher nicht abschließend geklärt werden und bleibt Gegenstand weiterer Untersuchungen.
N2  - The aim of the present study was to investigate whether non-ionizing radiation of different frequencies can cause genomic damage. Within the course of the present work, a biomonitoring study was designed and performed. 131 participants were interviewed and asked for their mobile phone use customs. Subsequently buccal mucosa cells were retrieved, prepared and stained for microscopy analysis. Micronuclei and other nuclear anomalies indicating genomic damage were quantified. No increase in micronucleus frequency depending on mobile phone use or other retrieved parameters were observed. Four patients receiving radiation therapy (ionizing radiation) were included as positive controls. A clear increase in micronucleus frequency was observed here. To determine whether micronucleus induction only occurs at higher power densities, in vitro investigations with different cell lines exposed to 900 MHz radiation were carried out. After exposition and post-incubation, cells were fixed and the micronucleus frequency was determined. Besides power density also exposition times and post-incubation periods were varied. In no case an increase in micronucleus frequency could be observed. 7. Summary 108 All in all, no influence of electromagnetic radiation on the genome could be observed, neither on humans in the biomonitoring study nor on cell lines in the in vitro study. Terahertz radiation is electromagnetic radiation in the range from 0.1 to 10 THz, i. e. between microwaves and infrared light. Currently it is used in spectroscopy and for quality control procedures in manufacturing processes. Application in security technology (e. g. full body scanners) and medical technology (e. g. medical imaging) have recently been established or are about to enter the market. These applications also involve exposure of humans. Furthermore, other technologies such as data transfer are being developed. So far the effects on biological systems of this frequency range are investigated only insufficiently. A thorough literature search was conducted because no comprehensive literature review was available. The aim was to completely list all available studies on this topic. To enlarge this data basis, in vitro studies at different frequencies were conducted. Radiation sources were a frequency multiplier chain (0.106 THz), a backward wave oscillator (0.380 THz) and a far infrared laser (2.520 THz). The radiation beam was led into a modified incubator in order to perform expositions under controlled temperature and CO2 concentration conditions. Terahertz radiation is strongly absorbed by water, thus in case of exposure of humans the skin will be affected primarily. This is the reason why primary dermal fibroblasts and HaCaT cells, a keratinocyte cell line, were used as biological systems. The cells were exposed to different power densities for different time periods. Subsequently cells were prepared and analyzed using the comet assay which quantifies DNA single and double strand breaks. Also, after a post-incubation period cells were prepared for the micronucleus test. Besides untreated controls and sham expositions also positive controls were 7. Summary 109 performed. No induction of DNA damage, neither as strand breaks nor as micronucleus frequency elevation, was observed. Because it was known that under certain experimental conditions mitotic disturbances but not micronucleus formation occur after exposition to mobile phone radiation, these mitotic disturbances were analyzed after terahertz exposition. AL cells were exposed for 30 minutes with 0.106 THz and fixed directly after the exposition. All phases of mitosis were analyzed, but it turned out that primarily ana- and telophase were affected. These disturbances increased with increasing power density. All in all, no DNA damage could be observed under the applied experimental conditions. After exposition to 0.106 THz mitotic disturbances occurred in AL cells. The link between these mitotic disturbances and the DNA damage, particularly the micronucleus formation, could not be resolved completely and remains subject of further investigations.
KW  - Mutagenität
KW  - Nichtionisierende Strahlung
KW  - Terahertzbereich
KW  - Mobiles Endgerät
KW  - Gentoxizität
KW  - Nichtionisierende Strahlung
KW  - Terahertzstrahlung
KW  - Mobilfunkstrahlung
KW  - Angewandte Toxikologie
KW  - genotoxicity
KW  - non-ionizing radiation
KW  - terahertz radiation
KW  - mobil phone radiation
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57684
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hintzsche, Henning
A1  - Jastrow, Christian
A1  - Kleine-Ostmann, Thomas
A1  - Kärst, Uwe
A1  - Schrader, Thorsten
A1  - Stopper, Helga
T1  - Terahertz electromagnetic fields (0.106 THz) do not induce manifest genomic damage in vitro
N2  - Terahertz electromagnetic fields are non-ionizing electromagnetic fields in the frequency range from 0.1 to 10 THz. Potential applications of these electromagnetic fields include the whole body scanners, which currently apply millimeter waves just below the terahertz range, but future scanners will use higher frequencies in the terahertz range. These and other applications will bring along human exposure to these fields. Up to now, only a limited number of investigations on biological effects of terahertz electromagnetic fields have been performed. Therefore, research is strongly needed to enable reliable risk assessment. Cells were exposed for 2 h, 8 h, and 24 h with different power intensities ranging from 0.04 mW/cm2 to 2 mW/cm2, representing levels below, at, and above current safety limits. Genomic damage on the chromosomal level was measured as micronucleus formation. DNA strand breaks and alkali-labile sites were quantified with the comet assay. No DNA strand breaks or alkali-labile sites were observed as a consequence of exposure to terahertz electromagnetic fields in the comet assay. The fields did not cause chromosomal damage in the form of micronucleus induction.
KW  - Toxikologie
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76268
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hintzsche, Henning
A1  - Montag, Gracia
A1  - Stopper, Helga
T1  - Induction of micronuclei by four cytostatic compounds in human hematopoietic stem cells and human lymphoblastoid TK6 cells
JF  - Scientific Reports
N2  - For mutagenicity testing, primary lymphocytes or mammalian cell lines are employed. However, the true target for carcinogenic action of mutagenic chemicals may be stem cells. Since hematopoietic cancers induced by chemical agents originate at the hematopoietic stem cell (HSC) stage and since one of the side effects of chemotherapeutic cancer treatment is the induction of secondary tumors, often leukemias, HSC may be a suitable cell system. We compared the sensitivity of HSC with the genotoxicity testing cell line TK6 for chromosomal mutations. HSC were less sensitive than TK6 cells for the genotoxic effects of the model genotoxins and chemotherapeutic agents doxorubicin, vinblastine, methyl methanesulfonate (MMS) and equally sensitive for mitomycin C (MMC). However, loss of viability after mitomycin C treatment was higher in HSC than in TK6 cells. Among the factors that may influence sensitivity for genomic damage, the generation or response to reactive oxygen species (ROS) and the effectiveness of DNA damage response can be discussed. Here we show that HSC can be used in a standard micronucleus test protocol for chromosomal mutations and that their sensitivity was not higher than that of a classical testing cell line.
KW  - apoptosis
KW  - haematopoietic stem cells
KW  - TK6 cells
KW  - micronuclei
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176210
VL  - 8
IS  - 3371
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hoffmann, Dana
T1  - Neue Biomarker zum Nachweis von Nierentoxizität
T1  - Novel Biomarker of Nephrotoxicity
N2  - Der Prozess von der Entdeckung und Entwicklung eines potentiellen Arzneistoffs bis zu dessen Zulassung ist extrem kosten&#8208; und zeitintensiv und eine Vielzahl dieser Stoffe kann aufgrund toxischer Nebenwirkungen in präklinischen Studien nicht weiterentwickelt werden. Dabei ist die Niere eines der Hauptziele von Xenobiotika&#8208;induzierter Organtoxizität, jedoch ist eine frühe Detektion von Nierenschäden schwierig. Den derzeitig verwendeten klinischen Parameter, wie Blutharnstoff (BUN) und Serumkreatinin fehlt es an Sensitivität und Spezifität, da sie Fremdstoff&#8208;induzierte Toxizität meist erst aufzeigen, wenn schon ein erheblicher Teil der Nierenfunktion beeinträchtigt ist. Daher ist es notwendig, empfindlichere und zuverlässigere Biomarker zu identifizieren und zu validieren, welche kleinste Nierenschädigungen früher als traditionelle Parameter erkennen. In den letzten Jahren wurden in der Literatur aber auch von verschiedenen Projekten eine Reihe neuer gen&#8208;basierender und Urinbiomarker (Kim&#8208;1, Clusterin, Lipocalin&#8208;2, Timp&#8208;1) identifiziert. Ziel dieser Dissertation war es die Aussagekraft dieser Marker im Vergleich zu traditionellen Endpunkten, einschließlich klinische Chemie und Histopathologie an Gewebe&#8208;, Urin&#8208; und Serumproben von männlichen Ratten, welche mit Modellsubstanzen für Nephrotoxizität (Aristolochiasäure und Gentamicin) oder nephrotoxischen Arzneistoffkandidaten (PredTox Projekt) behandelt wurden, mittels qRT&#8208;PCR, Immunhistochemie und ELISA zu untersuchen. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Effekte auf Ebene der Gen&#8208; und Proteinexpression generell sehr gut mit den histopathologischen Veränderungen korrelieren. Sie konnten meist früher oder in niedrigeren Dosierungen als die traditionellen Nierenmarker BUN und Serumkreatinin detektiert werden. Eine erhöhte Expression und Exkretion von Kim&#8208;1 zeigte sich in allen Studien als eine der frühesten Antworten auf Schädigung der proximalen Tubuli und stellt somit den empfindlichsten Biomarker dar. Die erhöhte Ausscheidung von Clusterin konnte teilweise vor einer veränderten Gen&#8208; und Proteinexpression im Gewebe detektiert werden und unterstützen die Verwendung von Clusterin als nicht&#8208;invasiven Biomarker. Obwohl eine gesteigerte Exkretion von Lipocalin&#8208;2 sehr früh nach Schädigung des proximalen Tubulus detektiert werden konnte, ist diese nicht spezifisch für einen Nierenschaden. Dennoch könnte die vermehrte Expression/Ausscheidung von Lipocalin&#8208;2 als frühe Antwort auf eine Entzündung oder einen Gewebeschaden eine sinnvolle Ergänzung der routinemäßigen Testung auf Toxizität darstellen. Ebenfalls konnte ein dosis&#8208; und zeitabhängiger Konzentrationsanstieg von einem Großteil der potentiellen Biomarker des „WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2“ im Urin beobachtet werden. Da jedoch die potentiellen Biomarker unterschiedliche Empfindlichkeiten besitzen und unter Umständen auch vom Mechanismus der Toxizität von Verbindungen abhängen, erscheint eine Kombination von verschiedenen Biomarkern zur frühzeitigen Erkennung von proximalen Nierenschäden sowie zur Verlaufskontrolle von Nierenerkrankungen sinnvoll. Durch die einfache Probenahme und leichte Bestimmung ist die Messung der neuen potentiellen Nierenbiomarker im Urin neben der Bestimmung der traditionellen Parameter der klinischen Chemie sowie der Histopathologie sinnvoll für die Identifizierung von Nierenschädigungen in präklinischen Studien.
N2  - The discovery and development of new drugs is very costly and time&#8208;consuming and the rate of drug failure due to late&#8208;breaking findings in preclinical toxicity studies is high. The kidney is a major target of xenobiotic induced organ toxicity but early detection of renal damage or minor effects on renal function is challenging due to the functional reserve of the kidney. Current clinical pathology parameters of nephrotoxicity such as blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine are relatively insensitive and non specific, revealing kidney damage not until 70&#8208;80 % of the renal epithelial mass has been lost. There is a clear need for the identification and validation of more sensitive and reliable biomarkers, which are indicators of minimal kidney damage rather than impaired kidney function. Recently a range of novel gene&#8208;based and urinary kidney biomarker (Kim&#8208;1, clusterin, lipocalin&#8208;2 and Timp&#8208;1) was identified from literature and various colloraborative projects. The aim of this work was to investigate the performance of these markers compared to traditional endpoints, such as clinical chemistry and histopathology in tissue, urine and serum samples collected from studies, in which male Wistar rats were treated either with model compounds of nephrotoxicity (aristolochic acid and gentamicin) or drug candidates (PredTox) using qRT&#8208;PCR, immunohistochemistry and ELISA. In summary, effects on marker gene and protein expression generally correlated well with the renal histopathology alterations and were frequently detected at earlier time&#8208;points or lower doses than the traditional clinical parameters BUN and serum creatinine. Overexpression and enhanced urinary excretion of Kim&#8208;1 was one of the earliest responses to proximal tubule damage and might be seen as the most sensitive marker of nephrotoxicity. Furthermore, urinary Clusterin was increased before changes in gene and protein expression or even histopathological alterations were evident, confirming urinary clusterin as a sensitive, non&#8208;invasive marker for renal injury. Although changes in urinary lipocalin&#8208;2 occurred very early after proximal tubule damage, lipocalin&#8208;2 may not specific for kidney injury. However, its rapid response to inflammation and tissue damage in general may reinforce its use in routine toxicity testing. A dose&#8208; and time&#8208;dependent increase in most of the novel urinary biomarkers was evident using the “WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2”. Due to the the variable sensitivity of a single biomarker, a combination of many different biomarkers to detect kidney injury appears to be useful. Concerning of the easy sampling and measurement, the additional determination of potential urinary biomarkers of nephrotoxcity next to the traditional clinical chemistry parameters and histopathological changes is helpful to identify kidney damage at early time&#8208;points.
KW  - Biomarker
KW  - Nephrotoxizität
KW  - Niere
KW  - biomarker
KW  - nephrotoxicity
KW  - kidney
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48562
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hoffmann, Linda S
A1  - Schmidt, Peter M
A1  - Keim, Yvonne
A1  - Hoffmann, Carsten
A1  - Schmidt, Harald H H W
A1  - Stasch, Johannes-Peter
T1  - Fluorescence Dequenching Makes Haem-Free Soluble Guanylate Cyclase Detectable in Living Cells
JF  - PLOS ONE
N2  - In cardiovascular disease, the protective NO/sGC/cGMP signalling-pathway is impaired due to a decreased pool of NO-sensitive haem-containing sGC accompanied by a reciprocal increase in NO-insensitive haem-free sGC. However, no direct method to detect cellular haem-free sGC other than its activation by the new therapeutic class of haem mimetics, such as BAY 58-2667, is available. Here we show that fluorescence dequenching, based on the interaction of the optical active prosthetic haem group and the attached biarsenical fluorophor FlAsH can be used to detect changes in cellular sGC haem status. The partly overlap of the emission spectrum of haem and FlAsH allows energy transfer from the fluorophore to the haem which reduces the intensity of FlAsH fluorescence. Loss of the prosthetic group, e. g. by oxidative stress or by replacement with the haem mimetic BAY 58-2667, prevented the energy transfer resulting in increased fluorescence. Haem loss was corroborated by an observed decrease in NO-induced sGC activity, reduced sGC protein levels, and an increased effect of BAY 58-2667. The use of a haem-free sGC mutant and a biarsenical dye that was not quenched by haem as controls further validated that the increase in fluorescence was due to the loss of the prosthetic haem group. The present approach is based on the cellular expression of an engineered sGC variant limiting is applicability to recombinant expression systems. Nevertheless, it allows to monitor sGC's redox regulation in living cells and future enhancements might be able to extend this approach to in vivo conditions.
KW  - spontaneously hypersensitive-rats
KW  - nitric-oxide
KW  - down-regulation
KW  - energy-transfer
KW  - cyclic-gmp
KW  - protein
KW  - activation
KW  - identification
KW  - in-vivo
KW  - no
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139631
VL  - 6
IS  - 8
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Holler, E.
A1  - Fischer, H.
A1  - Weber, C.
A1  - Stopper, Helga
A1  - Steger, H.
A1  - Simek, H.
T1  - A DNA polymerase with unusual properties from the slime mold Physarum polycephalum
N2  - Two forms of a DNA polymerase have been purified from microplasmodia of Physarum polycephalum by poly(ethyleneimine) precipitation and chromatography on DEAE-Sephacel, phosphocellulose, heparin Sepharose, hydroxyapatite, DNA-agarose, blue-Sepharose. They were separated from DNA polymerase cx on phosphocellulose and from each other on heparin-Sepharose. Form HS1 enzymewas 30-40% pure and form HS2 enzyme 60% with regard toprotein contents of the preparations. Form HS2 enzymewas generated from form HS1 enzyme on prolonged standing of enzyme preparations. The DNA polymerases were obtained as complexes of a 60-kDa protein associated with either a 135-kDa (HS1) or a 110-kDa (HS2) DNA-polymerizing polypeptidein a 1:1 molar stoichiometry. The biochemical function of the 60-kDa protein remained unknown. The complexes tended to dissociate during gradient centrifugation and during partition chromatography as weil as during polyacrylamide gradient gel electrophoresis under nondenaturing conditions at high dilutions of samples. Both forms existed in plasmodia extracts, their proportions depending on several factors including those which promoted proteolysis. The DNA polymerases resembled eucaryotic DNA polymerase ß by several criteria and were functionally indistinguishable from each other. It is suggested that lower eucaryotes contain repair DNA polymerases, which are similar to those of eubacteria on a molecular mass basis.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1987
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63501
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hommers, L. G.
A1  - Richter, J.
A1  - Yang, Y.
A1  - Raab, A.
A1  - Baumann, C.
A1  - Lang, K.
A1  - Schiele, M. A.
A1  - Weber, H.
A1  - Wittmann, A.
A1  - Wolf, C.
A1  - Alpers, G. W.
A1  - Arolt, V.
A1  - Domschke, K.
A1  - Fehm, L.
A1  - Fydrich, T.
A1  - Gerlach, A.
A1  - Gloster, A. T.
A1  - Hamm, A. O.
A1  - Helbig-Lang, S.
A1  - Kircher, T.
A1  - Lang, T.
A1  - Pané-Farré, C. A.
A1  - Pauli, P.
A1  - Pfleiderer, B.
A1  - Reif, A.
A1  - Romanos, M.
A1  - Straube, B.
A1  - Ströhle, A.
A1  - Wittchen, H.-U.
A1  - Frantz, S.
A1  - Ertl, G.
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Lueken, U.
A1  - Deckert, J.
T1  - A functional genetic variation of SLC6A2 repressor hsa-miR-579-3p upregulates sympathetic noradrenergic processes of fear and anxiety
JF  - Translational Psychiatry
N2  - Increased sympathetic noradrenergic signaling is crucially involved in fear and anxiety as defensive states. MicroRNAs regulate dynamic gene expression during synaptic plasticity and genetic variation of microRNAs modulating noradrenaline transporter gene (SLC6A2) expression may thus lead to altered central and peripheral processing of fear and anxiety. In silico prediction of microRNA regulation of SLC6A2 was confirmed by luciferase reporter assays and identified hsa-miR-579-3p as a regulating microRNA. The minor (T)-allele of rs2910931 (MAFcases = 0.431, MAFcontrols = 0.368) upstream of MIR579 was associated with panic disorder in patients (pallelic = 0.004, ncases = 506, ncontrols = 506) and with higher trait anxiety in healthy individuals (pASI = 0.029, pACQ = 0.047, n = 3112). Compared to the major (A)-allele, increased promoter activity was observed in luciferase reporter assays in vitro suggesting more effective MIR579 expression and SLC6A2 repression in vivo (p = 0.041). Healthy individuals carrying at least one (T)-allele showed a brain activation pattern suggesting increased defensive responding and sympathetic noradrenergic activation in midbrain and limbic areas during the extinction of conditioned fear. Panic disorder patients carrying two (T)-alleles showed elevated heart rates in an anxiety-provoking behavioral avoidance test (F(2, 270) = 5.47, p = 0.005). Fine-tuning of noradrenaline homeostasis by a MIR579 genetic variation modulated central and peripheral sympathetic noradrenergic activation during fear processing and anxiety. This study opens new perspectives on the role of microRNAs in the etiopathogenesis of anxiety disorders, particularly their cardiovascular symptoms and comorbidities.
KW  - clinical genetics
KW  - psychiatric disorders
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-322497
VL  - 8
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hommers, Leif
T1  - Über die Interaktion aktivierter G-Proteine mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren
T1  - Interaction of activated G Protein with activated G Protein coupled receptors
N2  - Aktivierte G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktivieren heterotrimere GProteine, in dem sie den Austausch von GDP zu GTP am G-Protein katalysieren. Theoretische Untersuchungen mittels eines vereinfachten kinetischen Modells des Gi/o-Protein Zyklus legen nahe, dass nicht nur GDP-,sondern auch GTP-gebundene Gi/o-Proteine mit aktivierten α2A-adrenergen Rezeptoren (α2A-AR) interagieren können. Demgemäß sollten aktivierte Gi/o-Proteine mit aktivierten α2A-AR vermehrt interagieren, wenn mehr α2A-AR aktiviert werden als für eine maximale G-Protein Aktivierung nötig sind. Dies sollte zu einer paradoxen Deaktivierung von Gi/o-Proteinen und deren Effektorproteinen, z.B. dem G-Protein gekoppelten, einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal (GIRK-Kanal) führen. Mittels FRET lässt sich in lebenden und in permeabilisierten Zellen unter Kontrolle der intrazellulären Nukleotide die Aktivierung von α2A-AR, die Interaktion von Gi/o-Proteinen mit α2A-AR und die Aktivierung von Gi/o-Proteinen bestimmen. Die Arbeit zeigt auf mehreren Ebenen, dass Go-Proteine mit aktivierten α2A-AR interagieren und im nukleotidfreiem Zustand sequestriert werden können: (I) Go-Proteine,irreversibel durch GTPγS aktiviert werden abhängig von der Rezeptor Aktivierung in Abwesenheit von Nukleotiden deaktiviert, (II) Go-Proteine interagieren in Gegenwart niedriger Nukleotidkonzentrationen in wesentlich größer Fraktion mit aktivierten α2A-AR als in Gegenwart hoher Nukleotidkonzentrationen, (III) Go Proteine können in Gegenwart niedriger GTP und GTPγS-Konzentrationen bei Aktivierung des α2A-AR inaktiviert werden. Die Arbeit zeigt exemplarisch an der Signalkaskade des α2A-AR und Go, dass der G-Protein Zyklus in lebenden Zellen reversibel ist, woraus eine Deaktivierung aktivierter G-Proteine und aktivierter G-Protein Effektoren resultieren kann. Dies erklärt paradoxe Befunde zur Deaktivierung von GIRK-Kanälen in Myozyten durch A1-Rezeptoren.
N2  - G protein coupled receptors activate heterotrimeric G proteins by catalyzing the exchange of GDP with GTP at the Gα subunit. Kinetic modelling of the Gi/o protein cycle suggests, that both GDP- and GTP-bound Gi/o proteins interact with activated α2A-adrenergic receptors (α2A-AR). Consequently, upon activating more α2A-AR then required for maximal Gi/o protein activation, the interaction of activated Gi/o proteins with activated α2A-AR will become incresingly prominent and ultimately lead to a paradoxic deactivation of Gi/o proteins and their effectors such as G protein coupled inwardly rectifying potassium channels. Using means of FRET allows the detection of the receptor activation, receptor/G protein interaction and G protein activation in single living cells and in single permeabilized cells while controlling the intracellular nucleotide composition.Data suggest, that activated Go proteins may be sequestrated at activated α2A-AR in their nucleotide-free state: (I) Go proteins irreversibly activated by GTPγS become inactivated upon receptor stimulation in the absence of nucleotides, (II) Go proteins interact with activated α2A-AR to a large extent in the presence of low concentrations of nucleotide, (III) Go proteins may be inactivated upon activation of α2A-AR in the presence of low concentrations of GTP or GTPγS. Taken together, the data demonstrate the reversibility of the G protein cycle in living cells for the paradigm α2A-AR/Go pathway. The data thereby explain the paradoxic inactivation of G protein coupled inwardly rectifying potassium channels in myocytes upon activation of adenosine A1 receptors.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - G protein coupled receptor
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56576
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hommers, Leif
T1  - Modulation der Einwärtsgleichrichrichtung von GIRK-Kanälen durch G-Protein Untereinheiten
T1  - Modulation of the rectification properties of GIRK channels by G Protein subunits
N2  - G-Protein-gekoppelte einwärtsgleichrichtende Kalium-Kanäle sind durch zwei Eigenschaften gekennzeichnet: (I) Die Leitfähigkeit für K+-Ionen ist positiv des Kalium-Gleichgewichtspotentials reduziert und (II) die Kanal-Aktivität wird durch Bindung von G betagamma-Dimere heterotrimerer Gi/o-Proteine reguliert. In der Literatur wurde die Aktivierung von GIRK-Kanälen als eine Zunahme ihrer Offenwahrscheinlichkeit unabhängig vom Membranpotential beschrieben. Die vorliegenden Untersuchungen zeigten, dass es bei starker Aktivierung des GIRK-Kanals durch G betagamma-Dimere auch zu einer Abschwächung der Einwärtsgleichrichtung kommt. Im heterologen Expressionssystem konnte bei Rezeptor-Stimulation mit Agonist die Einwärtsgleichrichtung von GIRK-Kanälen abhängig von der Stärke der Koexpression von G betagamma-Dimeren geschwächt werden. Dieser Effekt entstand nicht durch eine Veränderung der Affinität, mit der Polyamine und Mg2+-Ionen den GIRK-Kanal membranpotentialabhängig blockieren. Die Kinetik, mit der Polyamine den GIRK-Kanal blockieren, war nicht verändert; eine Erhöhung der intrazellulären Mg2+-Konzentration um den Faktor 20 konnte eine Abschwächung der Einwärtsgleichrichtung nicht mindern. Es wurde vermutet, dass eine Änderung der Konformation von Strukturen nahe des Selektivitätsfilters die Abschwächung der Einwärtsgleichrichtung verursacht. Gestützt wurde diese Vermutung zum einen dadurch, dass Ba2+- und Cs+-Ionen, die von extrazellulärer Seite her den Kanal an Strukturen nahe des Selektivitätsfilters blockieren können, unter schwach einwärtsgleichrichtenden Bedingungen eine geringere Bindungsaffinität hatten und zum anderen dadurch, dass das relative Ausmaß des GIRK-Kanal-Blocks durch Cs+-Ionen mit der Stärke der Einwärtsgleichrichtung korrelierte.
N2  - G Protein-coupled inwardly rectifying potassium channels (GIRK channels) conduct K+ ions at membrane potentials negative of the potassium reversal potential and are activated by binding of G betagamma subunits of heterotrimeric Gi/o proteins. Activation of GIRK channels was described to be a process, which results in an increase in open probabilty independent of the membrane potential. The investigations of this thesis enhance this modell by supoorting evidence, that the degree of rectification becomes weakened upon strong GIRK channel activation. The weakened inward rectification was not associated with a shift in Mg2+ or polyamine binding affinities towards GIRK. It was concluded, that structeres close to the selectivity filter may be involved in the process, as proposed by the finding, that Cs+ and Ba2+ block (which is considered to take place near the selectivity filter) is less efficient in weakly inward rectifying GIRK channels.
KW  - GIRK
KW  - Einwärtsgleichrichtung
KW  - G Protein
KW  - Gi/o
KW  - G beta gamma
KW  - GIRK
KW  - Einwärtsgleichrichtung
KW  - G Protein
KW  - Gi/o
KW  - G beta gamma
KW  - GIRK
KW  - Inward Rectification
KW  - G Protein
KW  - Gi/o
KW  - G beta gamma
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40388
ER  - 
TY  - THES
A1  - Horn, Daniela
T1  - Kardiotoxizität von CTRPs und das Vorkommen der CTRP-Rezeptoren in Kardiomyozyten
T1  - Cardiotoxicity of CTRPs and the presence of CTRP receptors in cardiomyocytes
N2  - Die C1q/tumor necrosis factor-related proteins (CTRPs) sind eine Ligandenfamilie aus sezernierten Plasmaproteinen, welche sich in ihrem Grundbauplan ähneln.
Daten aus der Literatur deuten darauf hin, dass sie zum Teil positive Effekte auf den Stoffwechsel und das Herz-Kreislaufsystem besitzen und somit eine mögliche therapeutische Zielstruktur darstellen. Während für manche CTRPs bereits Rezeptoren identifiziert werden konnten, ist für andere immer noch nicht geklärt, an welche Rezeptoren sie binden oder über welche sie diese Wirkungen erzielen. Um die CTRPs zukünftig therapeutisch nutzen zu können, muss die Wirkung der CTRPs auf verschiedene Zellen weiter analysiert werden. Dafür wurden in dieser Arbeit Zellen, auf die Expression bereits bekannter CTRP-Rezeptoren hin, untersucht. Des Weiteren wurden die durch CTRP2, CTRP3, CTRP4, CTRP9A, CTRP10, CTRP11, CTRP13 und CTRP14 induzierten Änderungen in der ATP- und Laktatproduktion als Surrogatparameter für Kardiotoxizität in den Kardiomyozytenzelllinien H9c2 und AC16 getestet, um potenziell kardiotoxische Wirkungen frühzeitig erkennen zu können. Es konnte gezeigt werden, dass die CTRPs sicher für Kardiomyozyten zu sein scheinen, was eine wichtige Grundlage für die therapeutische Nutzbarkeit darstellt.
N2  - C1q/tumor necrosis factor-related proteins (CTRPs) are a ligand family of secreted plasma proteins that are similar in their basic structure.
Literature on the subject indicate that some of them have positive effects on the metabolism and the cardiovascular system and therefore represent a potential therapeutic target structure. While some receptors have already been identified for some CTRPs, for others it is still not clear which receptors they bind to or through which they achieve these effects. In order to be able to use the CTRPs therapeutically in the future, the effect of the CTRPs on different cells must be further analyzed. For that cells were examined in this study for the expression of already known CTRP receptors. Furthermore, CTRP2, CTRP3, CTRP4, CTRP9A, CTRP10, CTRP11, CTRP13 and CTRP14 were tested in the cardiomyocyte cell lines H9c2 and AC16 with respect to their effect on production of ATP and lactate as surrogate parameters for cardiotoxicity in order to be able to recognize potentially cardiotoxic effects at an early stage. It was shown that the CTRPs appear to be safe for cardiomyocytes, which is an important basis for therapeutic utility.
KW  - Herzmuskelzelle
KW  - Zelllinie
KW  - CTRP
KW  - C1q/tumor necrosis factor-related proteins
KW  - Kardiomyozyten
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-349029
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Huber, K. W.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Methylation of DNA in stomach and small intestine of rats after oral administration of methylamine and nitrite
N2  - Young adult male Sprague-Dawley rats were given 30 \(\mu\)mol/kg body weight [\(^{14}\)C]methylamine hydrochloride and 700 \(\mu\)mol/ kg body weight sodium nilrite by oral gavage. DNA isolated from the stomach and from the first 15 cm of the smaß intestine was methylated, containing 7-methylguanine (7mG) at a level of one 7mG molecule per 5x10\8^6\) and lx10\(^7\) nucleotides, respectively. No 7mG was found fn the liver at a limit of detection of one 7mG molecule per 2xl0\(^8\) nucleotides. ln a second experiment, the excised stomachs were incubated with deoxyribonuclease before the isolation of the DNA in order to degrade DNA in the Iumen and in the uppermost lining cells. This treatment resulted in a 30% decrease in the yield of DNA and a 90% reduction in the level of 7mG formation. The results show that nitrosation of a primary alkylamine yields a precursor of an alkylating agent which has a long enough lifetime to diffuse towards and react with intracellular DNA. A correlation of DNA methylation in the stomach with the corresponding tumor formation by the methylating carcinogen N-methyi-N'-nitro-N-nitroso-guanidine was used to estimate the roJe of DNA damage resulting from endogenous nitrosation of dietary methylamine in man. It was concluded that the risk resulting from this single amine must be negligible bot that a similar evaluation of other primary amines is required before the over-aU role of primary amine nitrosation in the etiology of human gastric cancer can be assessed.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1984
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60984
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Huber, K. W.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Methylation of DNA by incubation with methylamine and nitrite
N2  - DNA was incubated in septum-closed reaction vials with [\(^{14}\)C]methylamine and nitrite. The DNA was purified, hydrolysed with hydrochloric acid, and the purines were analysed by h.p.l.c. 7-Methylguanine was detectable as a result of DN A methylation in experiments perfonned in 100 mM acetate at pH 4. Using different concentrations of amine and nitrite a first order reaction for total amine and a second order for total nilrite could be shown. A study on the pH dependence using 100 mM malonate buffer, pH 2.0-6.0, revealed a maximum rate at pH 3.5, with steep slopes above and below this pH value, in agreement with a mathematical analysis of the reaction equations. The data show that the alkylating agent fonned spontaneously by nitrosation and deamination of a primary amine has a long enough lifetime to react with DNA in vitro. Using the reactioil orders established here, an extrapolation to lower concentrations found in the stomach can now be perfonned. Future in vivo experiments on the methylation of gastro-intestinal DNA then would show to what extent DNA in a cell is protected from alkylation.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1984
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61011
ER  - 
TY  - THES
A1  - Humrich, Jan
T1  - G-Protein betagamma-Regulation durch Phosducin-like Proteine
T1  - G protein betagamma regulation by phosducin-like proteins
N2  - Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der Länge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquitär exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abhängigen Funktionen führt. Der um 83 Aminosäuren verlängerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches für die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte überraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator für Gbetagamma-abhängige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden Fähigkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verlängerten N-Terminus durch die ubiquitäre Casein Kinase 2 (CK2) zurückgeführt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) führte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsfähigkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinität nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsfähigkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminosäure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsfähigkeit, als auch die Fähigkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuhängen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinfärbung) nicht die Funktionsfähigkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu können. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass möglicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein könnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Domänen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma führte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert.
N2  - Phosducin-like protein (PhLP) exists in two splice variants PhLPLONG (PhLPL) and PhLPSHORT (PhLPS): They differ in the length of their N-termini and their expression pattern: The long form (PhLPL) is a ubiquitously expressed protein and binds G-protein betagamma-subunits (Gbetagamma) and thereby inhibits Gbetagamma-mediated function. The extended N-terminus of PhLPL (83 amino acids) contains a highly conserved Gbetagamma-binding motif which plays the crucial role in binding and regulating Gbetagamma-subunits. In contrast, the short splice variant PhLPS, which has a more restricted expression, lacks this motif and did not seem to exert a major Gbetagamma-inhibition, when tested with purified proteins. In the present work, for the first time, we investigated the Gbetagamma-inhibiting properties of PhLPL and PhLPS in intact cells. Surprisingly, PhLPS was the more potent and effective Gbetagamma inhibitor, while PhLPL was limited in this respect. The reason for the limited ability to inhibit Gbetagamma in intact cells was found in a constitutive phosphorylation by the ubiquitious kinase casein kinase 2 (CK2). The responsible phosphorylation sites could be identified (S18, T19, S20) and mutation of those sites into alanines could ameliorate the function of PhLPL. We therefore hypothesised that CK2 dependent phosphorylation of PhLPL should reduce binding affinity towards Gbetagamma subunits. But instead, direct phosphorylation of recombinant PhLPL by CK2 did not reduce its binding affinites. A thorough analysis of the N terminus of PhLPL revealed that a single mutation of the conserved N terminal binding motif (W66V) was sufficient to ablate Gbetagamma binding and Gbetagamma inhibition in intact cells. A first hint to an alternative mechanism came from the observation that - in the presence of PhLPS - the protein content of Gbeta and Ggamma subunits was dramatically reduced (as determined by Western blotting). This phenomenon seemed to be dependent on a proteasomal pathway (which was shown by effects of the specific proteasome inhibitor lactacystine). But a stabilization of the Gbeta and Ggamma subunits through N terminal fusion of a dye-labeling protein could not restore the function of Gbetagamma in the presence of PhLPS. Instead, it could be demonstrated that under these conditions Gbeta and Ggamma did not form functional dimers any more. This finding led to the conclusion that a protein folding mechanism was possibly involved. A postulated role in the folding of WD40 repeat proteins (like the Gbeta subunit) was assumed for the cytosolic chaperonin complex CCT in the literature. PhLPS was able to bind to TCP-1alpha, a subunit of CCT, as were the functionally active domains of PhLPS. We further demonstrated that the inhibition of CCT by RNA interference with TCP-1alpha also led to down-regulation of Gbeta and Ggamma subunits. So, in this thesis, a novel mechanism of G-protein regulation through inhibition of Gbetagamma protein folding was described. Further, a switch mechanism between direct Gbetagamm binding (induced by phosphorylation of PhLPL) and inhibition of Gbetagamm folding (induced by alternative splicing or dephosphorylation of PhLP) is postulated.
KW  - G-Proteine
KW  - Membranrezeptor
KW  - Regulation
KW  - Proteinfaltung
KW  - Phosphorylierung
KW  - Zellkultur
KW  - RNS-Interferenz
KW  - Proteinkinase A
KW  - Protein-Protein-Wechselwirkung
KW  - Proteinkinase CK2
KW  - Immunoblot
KW  - Phosducin
KW  - Phosducin-like Proteine
KW  - CCT
KW  - TCP-1 alpha
KW  - Proteasom
KW  - WD 40 Repeat Proteins
KW  - Inhibition
KW  - Protein Folding
KW  - Protein Interaction
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40059
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hupp, Sabrina
T1  - Modulation of Actin Dynamics by the Cholesterol-Dependent Cytolysin Pneumolysin - a novel mechanism beyond pore formation
T1  - Einfluß des CDCs Pneumolysin auf die Aktin-Dynamik - neue Eigenschaften eines Poren-bildenden Toxins
N2  - Streptococcus pneumoniae is one of the major causes of bacterial meningitis, which mainly affects young infants in the developing countries of Africa, Asia (esp. India) and South America, and which has case fatality rates up to 50% in those regions. Bacterial meningitis comprises an infection of the meninges and the sub-meningeal cortex tissue of the brain, whereat the presence of pneumolysin (PLY), a major virulence factor of the pneumococcus, is prerequisite for the development of a severe outcome of the infection and associated tissue damage (e. g. apoptosis, brain edema, and ischemia). Pneumolysin belongs to the family of pore forming, cholesterol-dependent cytolysins (CDCs), bacterial protein toxins, which basically use membrane-cholesterol as receptor and oligomerize to big aggregates, which induce cell lysis and cell death by disturbance of membrane integrity. Multiple recent studies, including this work, have revealed a new picture of pneumolysin, whose cell-related properties go far beyond membrane binding, pore formation and the induction of cell death and inflammatory responses. For a long time, it has been known that bacteria harm the tissues of their hosts in order to promote their own survival and proliferation. Many bacterial toxins aim to rather hijack cells than to kill them, by interacting with cellular components, such as the cytoskeleton or other endogenous proteins. This study was able to uncover a novel capacity of pneumolysin to interact with components of the actin machinery and to promote rapid, actin-dependent cell shape changes in primary astrocytes. The toxin was applied in disease-relevant concentrations, which were verified to be sub-lytic. These amounts of toxin induced a rapid actin cortex collapse in horizontal direction towards the cell core, whereat membrane integrity was preserved, indicating an actin severing function of pneumolysin, and being consistent with cell shrinkage, displacement, and blebbing observed in live cell imaging experiments. In contrast to neuroblastoma cells, in which pneumolysin led to cytoskeleton remodeling and simultaneously to activation of Rac1 and RhoA, in primary astrocytes the cell shape changes were seen to be primarily independent of small GTPases. The level of activated Rac1 and RhoA did not increase at the early time points after toxin application, when the initial shape changes have been observed, but at later time points when the actin-dependent displacement of cells was slower and less severe, probably presenting the cell’s attempt to re-establish proper cytoskeleton function. A GUV (giant unilamellar vesicle) approach provided insight into the effects of pneumolysin in a biomimetic system, an environment, which is strictly biochemical, but still comprises cellular components, limited to the factors of interest (actin, Arp2/3, ATP, and Mg2+ on one side, and PLY on the other side). This approach was able to show that the wildtype-toxin, but not the Δ6 mutant (mutated in the unfolding domain, and thus non-porous), had the capacity to exhibit its functions through a membrane bilayer, meaning it was able to aggregate actin, which was located on the other side of the membrane, either via direct interaction with actin or in an Arp2/3 activating manner. Taking a closer look at these two factors with the help of several different imaging and biochemical approaches, this work unveiled the capacity of pneumolysin to bind and interact both with actin and Arp2 of the Arp2/3 complex. Pneumolysin was capable to slightly stabilize actin in an actin-pyrene polymerization assay. The same experimental setup was applied to show that the toxin had the capacity to lead to actin polymerization through activation of the Arp2/3 complex. This effect was additionally confirmed with the help of fluorescent microscopy of rhodamine (TRITC)-tagged actin. Strongest Arp2/3 activation, and actin nucleation/polymerization is achieved by the VCA domain of the WASP family proteins. However, addition of PLY to the Arp2/3–VCA system led to an enhanced actin nucleation, suggesting a synergistic activation function of pneumolysin. Hence, two different effects of pneumolysin on the actin cytoskeleton were observed. On the one hand an actin severing property, and on the other hand an actin stabilization property, both of which do not necessarily exclude each other. Actin remodeling is a common feature of bacterial virulence strategies. This is the first time, however, that these properties were assigned to a toxin of the CDC family. Cytoskeletal dysfunction in astrocytes leads to dysfunction and unregulated movement of these cells, which, in context of bacterial meningitis, can favor bacterial penetration and spreading in the brain tissue, and thus comprises an additional role of pneumolysin as a virulence factor of Streptococcus pneumonia in the context of brain infection.
N2  - S. pneumoniae gehört zur Gruppe der Pathogene, die bakterielle Meningitis verursachen, eine Infektion, die hauptsächlich bei Neugeborenen und Kleinkindern in den Entwicklungsländern von Afrika, Asien und Südamerika auftritt, und in diesen Regionen Sterblichkeitsraten von bis zu 50% aufweist. Meningitis ist eine Infektion der Hirnhäute und dem sich direkt darunter befindlichen Cortex-Gewebe. Pneumolysin (PLY), ein Haupt-Pathogenitätsfaktor des sog. Pneumococcus, ist hauptsächlich verantwortlich für einen schweren Verlauf der Infektion und für Gewebeschädigungen, wie Apoptose, Hirnödemen und Ischämie. Pneumolysin gehört zur Familie der Cholesterol-abhängigen Cytolysine (CDCs), bakteriellen Protein-Toxinen, die an Membran-Cholesterol binden, sich zu großen Aggregaten zusammenschließen und durch die Beeinträchtigung der Membranintegrität (Porenbildung) Zell-Lyse und Zelltod verursachen. Zahlreiche neuere Studien, darunter auch diese Arbeit, haben ein neues Bild von Pneumolysin aufgezeigt, dessen Eigenschaften weit über die Membranbindung, die Poren-Bildung und die Induktion von Zelltod und inflammatorischen Prozessen hinausgehen. Es ist weithin bekannt, dass Bakterien das Gewebe ihres Wirts schädigen, um ihre eigene Vermehrung und ihre Ausbreitung zu begünstigen. In diesem Zusammenhang fungieren bakterielle Toxine als Pathogenitätsfaktoren, die mit zellulären Komponenten, wie dem Zytoskelett und anderen Zytosol-Proteinen interagieren, was allerdings bevorzugt zu Zellveränderungen, und seltener zum Zelltod führt. Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass Pneumolysin schnelle, und zum Teil gravierende, Aktin-abhängige Zellstruktur-Veränderungen in primären Astrozyten hervorruft. Hierbei wurde das Toxin in Konzentrationen appliziert, die im Liquor von Meningitis-Patienten detektiert werden können, und die zusätzlich als sub-lytisch für Astrozyten in Zellkultur verifiziert wurden. Diese Toxin-Mengen führten zu einem schnellen, horizontalen Aktinkortex-Kollaps, wobei die Membranintegrität erhalten blieb. Dies deutete auf eine „Severing“-Funktion (das Abtrennen oder Zerschneiden von Aktinfilamenten) von Pneumolysin hin, was mit den Beobachtungen übereinstimmt, die in Experimenten mit lebendigen Zellen gemacht wurden (Zellveränderungen, Zellbewegungen und „Blebbings“). Im Gegensatz zu Neuroblastoma Zellen, in denen Pneumolysin Zytoskelett-Veränderungen, und gleichzeitig die Aktivierung von Rac1 und RhoA verursachte, waren die Zell-Veränderungen bei Astrozyten primär unabhängig von der Aktivierung kleiner GTPasen. Obwohl gezeigt werden konnte, dass die Veränderungen vom Aktin-Zytosklett abhängig waren, war das Level an Rac1 und RhoA in den frühen Phasen nach der Toxin-Gabe nicht erhöht. Eine Aktivierung der GTPasen konnte dahingegen zu späteren Zeitpunkten detektiert werden, in denen die Zellbewegung abgeschwächt und verlangsamt war. Die späte Aktivierung kann als Reaktion der Zelle auf die vom Toxin ausgelösten Veränderungen gesehen werden, die zu einer Wiederherstellung der normalen Zytoskelett-Funktion führen soll. GUV-Experimente ermöglichten eine genauere Betrachtung der Pneumolysin-Effekte in einem biomimetischen, jedoch strikt biochemischen Ansatz, der alle zellulären Komponenten enthält, die untersucht werden sollen (Pneumolysin, Aktin, Arp2/3, ATP, und Mg2+). Im GUV-System befand sich das Toxin im Inneren der Vesikel, und Aktin in der extra-vesikulären Suspension, einem Verhältnis genau umgekehrt zum zellullären System. Zusätzlich wurden Arp2/3 und ATP/Mg2+, für die Aktin-Polymerisierung essentielle Faktoren, in der Aktin-Suspension zur Verfügung gestellt. Die GUV-Experimente konnten zeigen, dass Wildtyp-Pneumolysin, allerdings nicht seine Mutante Δ6-PLY (Mutation in der sog. unfolding domain, und deshalb nicht Poren-bildend), seine Effekte auf das Aktin-Zytoskelett durch die Membran-Barriere hindurch, in einer Membran-gebundenen Form ausüben kann. Aktin wurde an den Stellen höchster Toxinbindung aggregiert, was entweder über eine direkte Interaktion von PLY mit Aktin, oder über eine Aktivierung des Aktin-Effektors Arp2/3 durch Pneumolysin erklärt werden kann. Weitere biochemische Ansätze (wie enzyme-linked sorbent assays, ELSAs) und Mikroskopie-Techniken (Immunocyto-Chemie) konnten beweisen, dass Pneumolysin sowohl mit Aktin, als auch mit Arp2 (einer Komponente des heptameren Arp2/3 Proteinkomplexes) direkt interagieren kann. Aktin-Pyren Experimente und Fluoreszenzmikroskopie (von TRITC-markiertem Aktin) wiesen auf eine Kapazität von Pneumolysin hin, Aktin direkt zu stabilisieren, und über die Aktivierung von Arp2/3 eine Aktin-Polymerisierung hervorrufen zu können.
KW  - Hirnhautentzündung
KW  - Bakteriengift
KW  - Perforine
KW  - Actin
KW  - Meningitis
KW  - Meningitis
KW  - Bacterial Toxins
KW  - Pneumolysin
KW  - Actin
KW  - Pore formation
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70889
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hupp, Sabrina
A1  - Förtsch, Christina
A1  - Wippel, Carolin
A1  - Ma, Jiangtao
A1  - Mitchell, Timothy J.
A1  - Iliev, Asparouh I.
T1  - Direct Transmembrane Interaction between Actin and the Pore-Competent, Cholesterol-Dependent Cytolysin Pneumolysin
JF  - Journal of Molecular Biology
N2  - The eukaryotic actin cytoskeleton is an evolutionarily well-established pathogen target, as a large number of bacterial factors disturb its dynamics to alter the function of the host cells. These pathogenic factors modulate or mimic actin effector proteins or they modify actin directly, leading to an imbalance of the precisely regulated actin turnover. Here, we show that the pore-forming, cholesterol-dependent cytolysin pneumolysin (PLY), a major neurotoxin of Streptococcus pneumoniae, has the capacity to bind actin directly and to enhance actin polymerisation in vitro. In cells, the toxin co-localised with F-actin shortly after exposure, and this direct interaction was verified by Förster resonance energy transfer. PLY was capable of exerting its effect on actin through the lipid bilayer of giant unilamellar vesicles, but only when its pore competence was preserved. The dissociation constant of G-actin binding to PLY in a biochemical environment was 170–190 nM, which is indicative of a high-affinity interaction, comparable to the affinity of other intracellular actin-binding factors. Our results demonstrate the first example of a direct interaction of a pore-forming toxin with cytoskeletal components, suggesting that the cross talk between pore-forming cytolysins and cells is more complex than previously thought.
KW  - pore-forming toxin
KW  - cholesterol-dependent cytolysin
KW  - actin
KW  - membrane
KW  - pneumolysin
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-132297
VL  - 425
IS  - 3
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hümmert, Martin W.
T1  - Untersuchung einer monomeren Mutante der extrazellulär regulierten Kinase 2 (ERK2) bei kardialer Hypertrophie
T1  - Analysis of a monomeric mutant of extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2) on cardiac hypertrophy
N2  - Die Raf-MEK-ERK1/2-Kaskade spielt eine wichtige Rolle in der Vermittlung von kardialer Hypertrophie und Zellüberleben. Durch unsere Arbeitsgruppe konnte im Vorfeld gezeigt werden, dass die Dimerisierung von ERK2 eine Voraussetzung für dessen Autophosphorylierung an Thr188 darstellt, welche wiederum für die Übermittlung der hypertrophen Effekten von ERK1/2 erforderlich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daraus abgeleitet die Fragestellung untersucht, ob mit Verhinderung der ERK2-Dimerisierung eine nützliche Strategie zur Inhibition von Hypertrophie vorliegt und welchen Einfluss diese auf das Zellüberleben hat.

Die Auswirkungen der Dimerisierungsdefizienz von ERK2 wurden in neonatalen Kardiomyozyten der Ratte und in transgenen Mäusen mithilfe einer ERK2-Mutante untersucht, der einige Aminosäuren in der ERK-ERK-Interaktionsfläche fehlen und daher keine Dimere bilden kann (ERK2Δ174-177). Eine Überexpression von ERK2Δ174-177 in neonatalen Kardiomyozyten verringerte signifikant die Antwort auf hypertrophe Stimuli (Phenylephrin, Endothelin 1). Im Anschluss daran wurden die Effekte der Dimerisierungsdefizienz von ERK2 in vivo an transgenen Mäusen mit kardialer Überexpression von ERK2Δ174-177 erforscht. Diese Mäuse zeigten unter basalen Bedingungen keine Unterschiede gegenüber Wildtyp-Mäusen hinsichtlich Kardiomyozytengröße, Ventrikelwanddicke und kardialer Funktion. Unter chronischer Druckbelastung mittels TAC ließ sich hingegen ein signifikant vermindertes Ausmaß an Hypertrophie im Vergleich zu Wildtyp quantifizieren. Da der ERK1/2-Signalweg auch am Überleben von Kardiomyozyten beteiligt ist, wurde die Apoptose an histologischen Schnitten von Mausherzen analysiert. Interessanterweise fand sich bei Herzen, die das dimerisierungsdefiziente ERK2-Protein überexprimierten, eine mit Wildtyp vergleichbare Anzahl TUNEL-positiver Zellen. Ein ähnliches Ergebnis konnte bei der Messung des Fibrosegrades an Sirius-Rot gefärbten histologischen Schnitten beobachtet werden. Zuletzt wurden die Folgen der ERK2-Dimerisierungsdefizienz auf physiologische Hypertrophie mit einem Laufrad-Versuchsaufbau evaluiert. Transgene ERK2Δ174-177- und Wildtyp-Mäuse zeigten unter diesem physiologischen Stimulus keine Unterschiede im Hinblick auf die Zunahme an kardialer Hypertrophie.

Da die Dimerisierungsdefizienz von ERK2 zu einer reduzierten pathologischen Hypertrophie, ohne negative Auswirkungen auf ERK1/2-vermittelte anti-apoptotische Effekte noch auf kardiale Funktion oder physiologische Hypertrophieprozesse führt, stellt die Hemmung der ERK-Dimerisierung ein attraktives Ziel zur Therapie pathologischer Hypertrophie sowie potentiell auch anderer auf den ERK1/2-Signalweg basierenden Krankheiten dar.
N2  - The Raf-MEK-ERK1/2 pathway plays a crucial role in signal transmission of cardiac hypertrophy and cell survival. In advance, we showed that dimerization of ERK2 is a prerequisite for autophosphorylation on Thr188, promoting cardial hypertrophic effects. In this study we therefore investigated the role of ERK2-dimerization in cardiac hypertrophy and cell survival.
Overexpression of the dimerization deficient mutant ERK2Δ174-177 in neonatal rat cardiomyocytes significantly attenuated the hypertrophic response on hypertrophic stimuli (phenylephrine, ET-1). Moreover mice with cardiac overexpression of ERK2Δ174-177 who underwent chronic pressure overload by transverse aortic constriction demonstrated significant lower cardiac hypertrophy compared to wild type mice in histological examination and echocardiography. No difference was found in the rate of apoptotic cells measured in histological sections by TUNEL assay. Interestingly, ERKΔ174-177-mice who underwent running-wheel experiments showed no difference in physiological hypertrophy compared to wild type mice. 
In conclusion, the dimerization deficiency of ERK2 lead to reduced pathological cardiac hypertrophy without negative impact neither on ERK1/2-mediated anti-apoptotic effects nor on physiological hypertrophic processes. Hence, inhibition of ERK-dimerization might be an attractive target to reduce pathological hypertrophy and potentially interferes with other diseases mediated by the ERK1/2 pathway.
KW  - ERK2d4
KW  - ERK1/2
KW  - ERK-Monomer
KW  - ERK Dimerisierungsdefizienz
KW  - kardiale Hypertrophie
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155644
N1  - veröffentlicht am 01.07.2020
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Ilin, Alexander
A1  - Kulmanov, Murat
A1  - Nersesyan, Armen
A1  - Stopper, Helga
T1  - Genotoxic activity of the new pharmaceutical FS-1 in Salmonella/microsome test and mouse lymphoma L5178Y cells
JF  - Journal of BUON
N2  - Purpose: 
The purpose of this study was to determine possible genotoxic effects of a new very promising antibacterial/ antiviral drug FS-1. 

Methods: 
The drug was tested in TA98, TA100, TA102, TA 1535 and TA1537 strains of Salmonella (Ames test) with and without metabolic activation, and also in mouse lymphoma L5178Y cells by means of micronucleus and comet assays. In microbes the drug was tested at concentrations up to 500 \(\mu\)g/plate and in mouse lymphoma cells up to 2,000 \(\mu\)g/ml. 

Results: 
In both test-systems in all experiments completely negative results were obtained although FS-1 was tested at maximum tolerated doses. 

Conclusions: 
The drug is not genotoxic. This is advantageous because many antibacterial/antiviral drugs possess such activity.
KW  - mutagenicity
KW  - antibacterial/antiviral drug
KW  - comet assay
KW  - mouse lymphoma L5178Y
KW  - Salmonella/microsome assay
KW  - micronucleus test
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-143769
VL  - 20
IS  - 2
ER  - 
TY  - THES
A1  - İşbilir, Ali
T1  - Localization and Trafficking of CXCR4 and CXCR7
T1  - Lokalisation und Verteilung von CXCR4 und CXCR7
N2  - G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest class of membrane proteins, and are the master components that translate extracellular stimulus into intracellular signaling, which in turn modulates key physiological and pathophysiological processes. Research within the last three decades suggests that many GPCRs can form complexes with each other via mechanisms that are yet unexplored. Despite a number of functional evidence in favor of GPCR dimers and oligomers, the existence of such complexes remains controversial, as different methods suggest diverse quaternary organizations for individual receptors. Among various methods, high resolution fluorescence microscopy and imagebased fluorescence spectroscopy are state-of-the-art tools to quantify membrane protein oligomerization with high precision. This thesis work describes the use of single molecule fluorescence microscopy and implementation of two confocal microscopy based fluorescence fluctuation spectroscopy based methods for characterizing the quaternary organization of two class A GPCRs that are important clinical targets: the C-X-C type chemokine receptor 4 (CXCR4) and 7 (CXCR7), or recently named as the atypical chemokine receptor 3 (ACKR3). The first part of the results describe that CXCR4 protomers are mainly organized as monomeric entities that can form transient dimers at very low expression levels allowing single molecule resolution. The second part describes the establishment and use of spatial and temporal brightness methods that are based on fluorescence fluctuation spectroscopy. Results from this part suggests that ACKR3 forms clusters and surface localized monomers, while CXCR4 forms increasing amount of dimers as a function of receptor density in cells. Moreover, CXCR4 dimerization can be modulated by its ligands as well as receptor conformations in distinct manners. Further results suggest that antagonists of CXCR4 display distinct binding modes, and the binding mode influences the oligomerization and the basal activity of the receptor: While the ligands that bind to a “minor” subpocket suppress both dimerization and constitutive activity, ligands that bind to a distinct, “major” subpocket only act as neutral antagonists on the receptor, and do not modulate neither the quaternary organization nor the basal signaling of CXCR4. Together, these results link CXCR4 dimerization to its density and to its activity, which may represent a new strategy to target CXCR4.
N2  - G protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Klasse der Membranproteine und sind entscheidend an der Übersetzung extrazellulärer Reize in intrazelluläre Signale beteiligt, welche wiederum unzählige physiologische und pathophysiologische Prozesse regulieren. Die Forschungsergebnisse der letzten drei Jahrzehnte deutet darauf hin, dass viele GPCRs mittels noch weitgehend unbekannter Mechanismen miteinander Komplexe bilden können. Trotz vielfältiger Beobachtungen, die für die funktionelle Relevanz von GPCR-Dimeren und -Oligomeren sprechen, ist deren Existenz dennoch weiterhin umstritten, vor allem da verschiedene Methoden auf unterschiedliche quaternäre Anordnungen derselben Rezeptoren hinweisen. Von den derzeit verfügbaren Methoden zur genauen Untersuchung der GPCR Dimerisierung/-Oligomerisierung, stellen die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie sowie die bildbasierte Fluoreszenzspektroskopie die Techniken der Wahl dar. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die Anwendung der Einzelmolekül Fluoreszenzmikroskopie sowie zweier konfokalmikroskopischer
Methoden zur Messung der Fluoreszenzfluktuation, mit deren Hilfe die quaternäre Anordnung zweier klinisch hochattraktiver Klasse A GPCRs untersucht wurde: der C-X-C Typ Chemokinrezeptoren 4 (CXCR4) und 7 (CXCR7), letzterer auch bekannt als atypischer Chemokinrezeptor 3 (ACKR3). Der erste Teil der Ergebnisse legt anhand Untersuchungen an einzelnen Molekülen dar, dass CXCR4 überwiegend in Form monomerer Einheiten auftritt, die bei sehr geringen Expressionsleveln kurzlebige Dimere bilden können. Der zweite Teil beschreibt die Etablierung und Anwendung räumlicher und zeitlicher Brillanzmethoden, die auf der spektroskopischen Untersuchung der Fluoreszenzfluktuation beruhen. Die Ergebnisse dieses Abschnitts deuten darauf hin, dass ACKR3 sowohl in Form beständiger Rezeptor-Cluster, und monomere Einheit an der Oberfläche lebender Zellen auftritt. CXCR4 ist bei zunehmender Rezeptordichte hingegen vermehrt in Form von Dimeren zu finden. Zudem kann die Dimerisierung von CXCR4 von dessen Liganden, als auch von der drei dimensionalen Anordnung der Rezeptorteilstrukturen (Rezeptorkonformation)auf unterschiedliche Weise reguliert werden. Die weiteren Ergebnisse legen nahe, dass Antagonisten auf unterschiedliche Weise an CXCR4 binden können und dass der jeweilige Bindungsmodus entscheidend für den Einfluss des Liganden auf Oligomerisierung und basale Aktivität von CXCR4 ist: Während Liganden, die an eine kleinere Untertasche des Rezeptors binden, sowohl die Dimerisierung als auch die Basalaktivität unterdrücken, fungieren Verbindungen, die an eine andere, größere Untertasche binden, lediglich als neutrale Antagonisten und zeigen keinerlei Einfluss auf die quaternäre Anordnung und basale Aktivität von CXCR4. Zusammenfassend verknüpfen diese Ergebnisse CXCR4-Dimerisierung mit der Rezeptordichte in Zellen und seiner Aktivität, was die Grundlage für neue Strategien zur phamakologischen Modulation von CXCR4 darstellen könnte.
KW  - G-Protein gekoppelter Rezeptor
KW  - GPCR
KW  - Receptor
KW  - Chemokine
KW  - oligomerization
KW  - CXCR4
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249378
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jaggi, W.
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Lüthy, J.
A1  - Zweifel, U.
A1  - Schlatter, C.
T1  - In vivo covalent binding of aflatoxin metabolites isolated from animal tissue to rat-liver DNA
N2  - Ring-labelled [\(^{14}\)C)aflatoxin B\(_1\) (AFB\(_1\)), prepared by biosynthesis. or generally labelled [\(^3\)H]AFB\(_1\) was administered by oral gavage to young adult male rats. After 6 hr. the liver was removed and two fractions were isolated, namely macromolecules, which contamed about 3 % of the initial dose of AFB\(_1\) radioactivity. and water-soluble, low-molecular aftatoxin conjugates containing about0·2% of the administered radioactivity. These two fractions were administered orally to other rats in order to determine the potential of radioactive aftatoxin residues for covalent binding to DNA. Such binding can be used as an indicator for carcinogenic potency. Liver DNA was isolated 9-12 hr after admmistration of the aflatoxin derivatives and in no case was any radioactivity detected on the DNA. It can be deduced on the basis of the limit of detection of radioactivity on the DNA, that macromolecule bound AFB\(_1\) derivatives are at least 4000 times less active than AFB\(_1\) with respect to covalent binding to rat-liver DNA. and that the water-soluble conjugates are at least 100 times less potent than AFB, itself. It is concluded that the carcinogenic risk for humans who consume liver or meat. containing such aflatoxin residues is negligible when compared with the risk from intake of aftatoxins in other food items.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1980
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61101
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jaggi, W.
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Schlatter, C.
T1  - Comparative studies on the covalent binding of the carcinogen benzo(a)pyrene to DNA in various model systems
N2  - The covalent binding of tritiated benzo(a)pyrene (BP) to DNA has been determined in rat liver in vivo, in rat liver perfused in situ, after incubation of BP with liver single cells, with liver homogenate, with liver microsomes and DNA, with fibroblasts from a rat granulorna pouch, and with · 2 cell lines. Li ver single cells were found to be a valuable compromise between the rnost sensitive system (microsomal incubation of BP with DNA) and the biologically most relevant system (in vivo ).
KW  - Toxikologie
Y1  - 1979
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61131
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jaggi, W.
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Schlatter, C.
T1  - Covalent binding of ethinylestradiol and estrone to rat liver DNA in vivo
N2  - Thecovalent bindingof [6,7-\(^3\)H]ethinylestradiol (EE)and [6,7-\(^3\)H]estrone (E) to liver DNA of 200 g female ratswas measured 8 h after the administration of 80 \(\mu\)g (9.2 mCi) estrogen by gavage. The binding is 1.5 for EE and 1.1 for E, expressedas binding to DNA/dose, in units of \(\mu\)mol hormonefmol DNA phosphate/mmole honnone/kg body wt. It is in the same order of magnitude as for benzene and about 10 000 tim es below the binding of typical liver carcinogens, such as aflatoxin B\(_1\) or N,N-dimethylnitrosamine.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1978
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61162
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Janevski, J.
A1  - Choh, V.
A1  - Stopper, Helga
A1  - Schiffmann, D.
A1  - De Boni, U.
T1  - Diethylstilbestrol alters the morphology and calcium levels of growth cones of PC12 cells in vitro
N2  - Diethylstilbestrol (DES) is a synthetic estrogen with carcinogenic properties. DES is known to alter cytoskeletal components, including the organization of actin stress fibres in C6 rat glioma cells. ln a test of the hypothesis that DES disrupts actin Filaments of growth cones in neuron-like cells, DES-induced changes in filopodial lengths were quantified in rat pheochromocytoma (PC12) cells in vitro. DES significantly altered growth cone morphology, with collapse of growth cone filopodia and neurite retraction invariably occurring at a concentration of 10 MikroM. At 5 MikroM DES, transient reductions in total filopodiallengths occurred. At DES concentrations of 0.1 nM and 1 nM, reductions in total filopodiallengths occurred in a fraction of growth cones. Evidence exists which shows that growth cone activity and morphology are intimately linked to Ieveis of intracellular, free calcium and that DES increases such levels. Measurements of free intracellular calcium levels by fluorescence microscopy, at times concurrent with the DES-induced reduction in total filopodial lengths, showed that calcium levels were indeed significantly increased by 10 MirkoM DES. Labelling of filamentaus actin (f-actin) with FITC-phalloidin showed that the f-actin distribution in growth cones exposed to DES could not be differentiated from the distribution found in spontaneously retracting growth cones. Tagether with evidence which showed that growth cone motility was not affected, the results are taken to indicate that DES, rather than acting directly on the cytoskeleton, exerts its effects indirectly, by a calcium-induced destabilization of actin filaments in the growth cone.
KW  - Calcium
KW  - Zellskelett
KW  - Wachstumskonus
KW  - Diethylstilbestrol
KW  - Diethylstilbestrol
KW  - rat pheochromocytoma cells
KW  - growth cone
KW  - cytoskeleton
KW  - calcium
Y1  - 1993
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86858
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Janz, Anna
A1  - Walz, Katharina
A1  - Cirnu, Alexandra
A1  - Surjanto, Jessica
A1  - Urlaub, Daniela
A1  - Leskien, Miriam
A1  - Kohlhaas, Michael
A1  - Nickel, Alexander
A1  - Brand, Theresa
A1  - Nose, Naoko
A1  - Wörsdörfer, Philipp
A1  - Wagner, Nicole
A1  - Higuchi, Takahiro
A1  - Maack, Christoph
A1  - Dudek, Jan
A1  - Lorenz, Kristina
A1  - Klopocki, Eva
A1  - Ergün, Süleyman
A1  - Duff, Henry J.
A1  - Gerull, Brenda
T1  - Mutations in DNAJC19 cause altered mitochondrial structure and increased mitochondrial respiration in human iPSC-derived cardiomyocytes
JF  - Molecular Metabolism
N2  - Highlights
• Loss of DNAJC19's DnaJ domain disrupts cardiac mitochondrial structure, leading to abnormal cristae formation in iPSC-CMs.
• Impaired mitochondrial structures lead to an increased mitochondrial respiration, ROS and an elevated membrane potential.
• Mutant iPSC-CMs show sarcomere dysfunction and a trend to more arrhythmias, resembling DCMA-associated cardiomyopathy.

Background
Dilated cardiomyopathy with ataxia (DCMA) is an autosomal recessive disorder arising from truncating mutations in DNAJC19, which encodes an inner mitochondrial membrane protein. Clinical features include an early onset, often life-threatening, cardiomyopathy associated with other metabolic features. Here, we aim to understand the metabolic and pathophysiological mechanisms of mutant DNAJC19 for the development of cardiomyopathy.

Methods
We generated induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) of two affected siblings with DCMA and a gene-edited truncation variant (tv) of DNAJC19 which all lack the conserved DnaJ interaction domain. The mutant iPSC-CMs and their respective control cells were subjected to various analyses, including assessments of morphology, metabolic function, and physiological consequences such as Ca\(^{2+}\) kinetics, contractility, and arrhythmic potential. Validation of respiration analysis was done in a gene-edited HeLa cell line (DNAJC19tv\(_{HeLa}\)).

Results
Structural analyses revealed mitochondrial fragmentation and abnormal cristae formation associated with an overall reduced mitochondrial protein expression in mutant iPSC-CMs. Morphological alterations were associated with higher oxygen consumption rates (OCRs) in all three mutant iPSC-CMs, indicating higher electron transport chain activity to meet cellular ATP demands. Additionally, increased extracellular acidification rates suggested an increase in overall metabolic flux, while radioactive tracer uptake studies revealed decreased fatty acid uptake and utilization of glucose. Mutant iPSC-CMs also showed increased reactive oxygen species (ROS) and an elevated mitochondrial membrane potential. Increased mitochondrial respiration with pyruvate and malate as substrates was observed in mutant DNAJC19tv HeLa cells in addition to an upregulation of respiratory chain complexes, while cellular ATP-levels remain the same. Moreover, mitochondrial alterations were associated with increased beating frequencies, elevated diastolic Ca\(^{2+}\) concentrations, reduced sarcomere shortening and an increased beat-to-beat rate variability in mutant cell lines in response to β-adrenergic stimulation.

Conclusions
Loss of the DnaJ domain disturbs cardiac mitochondrial structure with abnormal cristae formation and leads to mitochondrial dysfunction, suggesting that DNAJC19 plays an essential role in mitochondrial morphogenesis and biogenesis. Moreover, increased mitochondrial respiration, altered substrate utilization, increased ROS production and abnormal Ca\(^{2+}\) kinetics provide insights into the pathogenesis of DCMA-related cardiomyopathy.
KW  - cell biology
KW  - molecular biology
KW  - dilated cardiomyopathy with ataxia
KW  - genetics
KW  - metabolism
KW  - mitochondria
KW  - OXPHOS
KW  - ROS
KW  - contractility
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350393
SN  - 2212-8778
VL  - 79
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jarzina, Sebastian
A1  - Di Fiore, Stefano
A1  - Ellinger, Bernhard
A1  - Reiser, Pia
A1  - Frank, Sabrina
A1  - Glaser, Markus
A1  - Wu, Jiaqing
A1  - Taverne, Femke J.
A1  - Kramer, Nynke I.
A1  - Mally, Angela
T1  - Application of the adverse outcome pathway concept to in vitro nephrotoxicity assessment: kidney injury due to receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload as a case study
JF  - Frontiers in Toxicology
N2  - Application of adverse outcome pathways (AOP) and integration of quantitative in vitro to in vivo extrapolation (QIVIVE) may support the paradigm shift in toxicity testing to move from apical endpoints in test animals to more mechanism-based in vitro assays. Here, we developed an AOP of proximal tubule injury linking a molecular initiating event (MIE) to a cascade of key events (KEs) leading to lysosomal overload and ultimately to cell death. This AOP was used as a case study to adopt the AOP concept for systemic toxicity testing and risk assessment based on in vitro data. In this AOP, nephrotoxicity is thought to result from receptor-mediated endocytosis (MIE) of the chemical stressor, disturbance of lysosomal function (KE1), and lysosomal disruption (KE2) associated with release of reactive oxygen species and cytotoxic lysosomal enzymes that induce cell death (KE3). Based on this mechanistic framework, in vitro readouts reflecting each KE were identified. Utilizing polymyxin antibiotics as chemical stressors for this AOP, the dose-response for each in vitro endpoint was recorded in proximal tubule cells from rat (NRK-52E) and human (RPTEC/TERT1) in order to (1) experimentally support the sequence of key events (KEs), to (2) establish quantitative relationships between KEs as a basis for prediction of downstream KEs based on in vitro data reflecting early KEs and to (3) derive suitable in vitro points of departure for human risk assessment. Time-resolved analysis was used to support the temporal sequence of events within this AOP. Quantitative response-response relationships between KEs established from in vitro data on polymyxin B were successfully used to predict in vitro toxicity of other polymyxin derivatives. Finally, a physiologically based kinetic (PBK) model was utilized to transform in vitro effect concentrations to a human equivalent dose for polymyxin B. The predicted in vivo effective doses were in the range of therapeutic doses known to be associated with a risk for nephrotoxicity. Taken together, these data provide proof-of-concept for the feasibility of in vitro based risk assessment through integration of mechanistic endpoints and reverse toxicokinetic modelling.
KW  - adverse outcome pathway (AOP)
KW  - nephrotoxicity
KW  - QIVIVE
KW  - risk assessment
KW  - key event relationship
KW  - In vitro toxicity testing
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-284796
SN  - 2673-3080
VL  - 4
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jarzina, Sebastian Oskar
T1  - Assessment of systemic toxicity in vitro using the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept: nephrotoxicity due to receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload and inhibition of mtDNA polymerase-ɣ   as case studies
T1  - Bewertung der systemischen Toxizität in vitro unter Verwendung des Adverse Outcome Pathway (AOP)-Konzepts: Nephrotoxizität infolge rezeptorvermittelter Endozytose und lysosomaler Überlastung sowie Hemmung der mtDNA-Polymerase-ɣ als Fallstudien
N2  - The US National Research Council (NRC) report "Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)", published in 2007, calls for a complete paradigm shift in tox-icity testing. A central aspect of the proposed strategy includes the transition from apical end-points in in vivo studies to more mechanistically based in vitro tests. To support and facilitate the transition and paradigm shift in toxicity testing, the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept is widely recognized as a pragmatic tool. As case studies, the AOP concept was ap-plied in this work to develop AOPs for proximal tubule injuries initiated by Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload and Inhibition of mtDNA polymerase-. These AOPs were used as a mechanistic basis for the development of in vitro assays for each key event (KE). To experimentally support the developed in vitro assays, proximal tubule cells from rat (NRK-52E) and human (RPTEC/TERT1) were treated with model compounds. To measure the dis-turbance of lysosomal function in the AOP – Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload, polymyxin antibiotics (polymyxin B, colistin, polymyxin B nonapeptide) were used as model compounds. Altered expression of lysosomal associated membrane protein 1/2 (LAMP-1/2) (KE1) and cathepsin D release from lysosomes (KE2) were determined by im-munofluorescence, while cytotoxicity (KE3) was measured using the CellTiter-Glo® cell via-bility assay. Importantly, significant differences in polymyxin uptake and susceptibility be-tween cell lines were observed, underlining the importance of in vitro biokinetics to determine an appropriate in vitro point of departure (PoD) for risk assessment. Compared to the in vivo situation, distinct expression of relevant transporters such as megalin and cubilin on mRNA and protein level in the used cell lines (RPTEC/TERT1 and NRK-52E) could not be con-firmed, making integration of quantitative in vitro to in vivo extrapolations (QIVIVE) neces-sary. Integration of QIVIVE by project partners of the University of Utrecht showed an im-provement in the modelled biokinetic data for polymyxin B. To assess the first key event, (KE1) Depletion of mitochondrial DNA, in the AOP – Inhibition of mtDNA polymerase-, a RT-qPCR method was used to determine the mtDNA copy number in cells treated with mod-el compounds (adefovir, cidofovir, tenofovir, adefovir dipivoxil, tenofovir disoproxil fumarate). Mitochondrial toxicity (KE2) was measured by project partners using the high-content imaging technique and MitoTracker® whereas cytotoxicity (KE3) was determined by CellTiter-Glo® cell viability assay. In contrast to the mechanistic hypothesis underlying the AOP – Inhibition of mtDNA polymerase-, treatment with model compounds for 24 h resulted in an increase rather than a decrease in mtDNA copy number (KE1). Only minor effects on mitochondrial toxicity (KE2) and cytotoxicity (KE3) were observed. Treatment of RPT-EC/TERT1 cells for 14 days showed only a slight decrease in mtDNA copy number after treatment with adefovir dipivoxil and tenofovir disoproxil fumarate, underscoring some of the limitations of short-term in vitro systems. To obtain a first estimation for risk assessment based on in vitro data, potential points of departure (PoD) for each KE were calculated from the obtained in vitro data. The most common PoDs were calculated such as the effect concentra-tion at which 10 % or 20_% effect was measured (EC10, EC20), the highest no observed effect concentration (NOEC), the lowest observed effect concentration (LOEC), the benchmark 10 % (lower / upper) concentrations (BMC10, BMCL10, BMCU10) and a modelled non-toxic con-centration (NtC). These PoDs were then compared with serum and tissue concentrations de-termined from in vivo studies after treatment with therapeutic / supratherapeutic doses of the respective drugs in order to obtain a first estimate of risk based on in vitro data. In addition, AOPs were used to test whether the quantitative key event relationships between key events allow prediction of downstream effects and effects on the adverse outcome (AO) based on measurements of an early key event. Predictions of cytotoxicity from the mathematical rela-tionships showed good concordance with measured cytotoxicity after treatment with colistin and polymyxin b nonapeptide. The work also revealed uncertainties and limitations of the ap-plied strategy, which have a significant impact on the prediction and on a risk assessment based on in vitro results.
N2  - Der Bericht des US National Research Council (NRC) „Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)“, der 2007 veröffentlicht wurde, sieht einen vollständigen Paradigmenwechsel in der Toxizitätsprüfung vor. Ein zentraler Aspekt des Berichts beinhaltet den Übergang von apikal ermittelten Endpunkten für Toxizität in in vivo Studien, zu mehr mechanistisch basierten in vitro Tests. Um den Übergang zu erleichtern und den Paradigmen-wechsel in der Prüfung auf Toxizität zu unterstützen, wird das Adverse Outcome Pathway (AOP) Konzept als pragmatisches Instrument weithin anerkannt. In dieser Arbeit wurde das AOP Konzept angewandt, um neue Ansätze zur Prüfung auf systemische Toxizität zu unter-suchen. Dazu wurden AOPs für proximale Tubulusschäden, die durch lysosomale Überladung und Inhibition der mtDNA Polymerase- initiiert werden, entwickelt. Diese AOPs wurden als mechanistische Grundlage für die Entwicklung von mechanistisch relevanten in vitro Tests für jedes Schlüsselereignis (KE) verwendet. Um die entwickelten in vitro Tests experimentell zu unterstützen, wurden proximale Tubuluszellen aus der Ratte (NRK-52E) und aus dem Men-schen (RPTEC/TERT1) mit Hilfe von Modellsubstanzen behandelt. Zur Messung der Störung der lysosomalen Funktion im AOP – Rezeptor-vermittelte Endozytose und lysosomale Überla-dung wurden Polymyxin-Antibiotika (Polymyxin B, Colistin, Polymyxin B Nonapeptid) als Modellsubstanzen verwendet. Die gestörte Expression des lysosomal assoziierten Membran-proteins 1/2 (LAMP 1/2) (KE1) und die Cathepsin D Freisetzung (KE2) wurden mittels Im-munofluoreszenztechnik bestimmt und die Zytotoxizität (KE3) mittels CellTiter-Glo® Zellvia-bilitätstest gemessen. Zwischen den Zelllinien wurden signifikante Unterschiede in der Auf-nahme von Polymyxinen und der Empfindlichkeit beobachtet, was die Bedeutung der in vitro Biokinetik zur Definition eines geeigneten Ausgangspunktes für die Risikobewertung unter-streicht. 
Im Vergleich zur in vivo Situation, konnte eine eindeutige Expression von relevanten Trans-portern wie Megalin und Cubilin auf mRNA und Proteinebene in den verwendeten Zelllinien (RPTEC/TERT1 und NRK-52E) nicht gezeigt werden, was eine zusätzliche Integration von quantitativen in vitro zu in vivo Extrapolationen (QIVIVE) unabdingbar macht. Die Integrati-on von QIVIVE durch Projektpartner der Universität Utrecht zeigte eine Verbesserung der modellierten biokinetischen Werte für Polymyxin B. Zur Bestimmung des ersten Schlüsseler-eignisse, (KE1) Depletion von mitochondrialer DNA, im AOP – Hemmung der mitochondria-len DNA Polymerase-, wurde nach Behandlung mit Modellsubstanzen (Adefovir, Cidofovir, Tenofovir, Adefovirdipivoxil, Tenofovirdisoproxil Fumarat) eine RT-qPCR Methode verwen-det, um die mtDNA Kopienzahl zu bestimmen. Die mitochondriale Toxizität (KE2) wurde mittels eines hochauflösenden Bildgebungsverfahrens und MitoTracker® vom Projektpartner des Fraunhofer Institut in Hamburg gemessen, während die Zytotoxizität (KE3) mittels Cel-lTiter-Glo® Zellviabilitätstest ermittelt wurde. Entgegen der mechanistischen Hypothese des AOPs – Hemmung der mitochondrialen DNA Polymerase-, führte eine 24 h Behandlung mit den Modellsubstanzen eher zu einer Erhöhung als zu einer Verringerung der mtDNA-Kopienzahl (KE1). Auch wurden nur geringe Auswirkungen auf die mitochondriale Toxizität (KE2) und Zytotoxizität (KE3) beobachtet. Die Behandlung von RPTEC/TERT1 Zellen über einen Zeitraum von 14 Tagen zeigte eine leichte Abnahme der mtDNA Kopienzahl nach Be-handlung mit Adefovirdipivoxil und Tenofovirdisoproxil Fumarat, was den Bedarf an zeit-aufgelösten Daten und Einschränkungen von kurzfristigen in vitro Systemen unterstreicht. Um eine erste Einschätzung für die Risikobewertung basierend auf in vitro Daten zu erhalten, wurden aus den erhaltenen in vitro Daten für jedes KE mögliche Ausgangspunkte (Points of Departure (PoD)) berechnet. Dazu wurden gängige in vitro PoDs berechnet, wie die Effekt-konzentration, bei der 10 % bzw. 20 % Effekt gemessen wurden (EC10, EC20), die höchste Konzentration ohne Wirkung (no observed effect Konzentration (NOEC)), die niedrigste Konzentration mit beobachteter Wirkung (lowest observed effect Konzentration (LOEC)), die Benchmark 10 % (unterer / obere) Konzentrationen (BMC10, BMCL10, BMCU10) und eine modellierte nicht-toxische Konzentration (NtC). Diese wurden dann mit Serum- bzw. Ge-webskonzentrationen aus in vivo Studien verglichen, die nach Gabe therapeutischer / suprathe-rapeutischer Dosen gemessen wurden. Zusätzlich wurde überprüft, ob es mit Hilfe von quanti-tativen Beziehungen zwischen Schlüsselereignissen möglich ist, basierend auf der Bestimmung früher Schlüsselereignisse nachfolgende Effekte vorherzusagen. Diese Untersuchungen zeig-ten eine gute Korrelation der aus den mathematischen Beziehungen modellierten Daten mit den tatsächlich gemessenen Werten der Zytotoxizität der Modellsubstanzen Colistin und Po-lymyxin B-Nonapeptid. Im Rahmen der Arbeit wurden auch Unsicherheiten und Limitationen der Strategie deutlich, die maßgebliche Auswirkungen auf die Vorhersage und auf die Risiko-bewertung basierend auf in vitro Resultaten haben.
KW  - Adverse outcome pathway (AOP)
KW  - Nephrotoxicity
KW  - In vitro testing
KW  - QIVIVE
KW  - Risk Assessment
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-264842
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jauch, A.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - In vivo assay for somatic point mutations induced by genotoxic carcinogens: incorporation of [\(^{35}\)S]methionine into a rat liver cytochrome b\(_5\) normally lacking sulphur-containing amino acids
N2  - The trypsin fragments of rat liver microsomal cytochron1e b\(_5\) (Tb\(_5\)) lack both methionine (met) and cysteine (cys), i.e., the sulphur-containing antino acids. Tb\(_5\) should therefore contain no 358-radioactivity after isolation from animals treated wHh [\(^{35}\)S]met or [\(^{36}\)S]cys. If, however, the nucleic acids coding for this polypeptide have been damaged by a genotoxic carcinogen, a miscoding could result in an incorporation of met or cys into the polypeptide so that Tb\(_8\) could now be \(^{36}\)S-radiolabelled. Two experiments are descrihed. the first one where a toxic regimen of N -nitrosomorpholine (NNM) to rats resulted in a significant increase of \(^{35}\)S-radioactivity in the Tbs of liver microsomes, and a second experiment with a non-toxic regimen of N,N diethylnitrosamine (DENA), where no increase was observable.
KW  - Toxikologie
KW  - MammaJian mutagenicity test
KW  - Pointmutation
KW  - Protein coding
KW  - Cytochrome b5
KW  - Amino acid composition
KW  - Rat Iiver microsomes
Y1  - 1983
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61047
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jauch, A.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Metallothionein protein variants generated in rat liver as a result of DNA and RNA ethylations by the carcinogen diethylnitrosamine
N2  - Metallothionein (MT) is a protein which contains 20 cysteine residues but no aromatic amino acids. It was tested whether treatment of male rats with the hepatocarcinogen diethylnitrosamine (DENA) could ethylate nucleic acids in such a way that protein variants containing measurable amounts of aromatic amino acid residues could be isolated from the livers of treated animals. To give a low Iimit of detection, the "wrong" amino acid precursors were administered in radiolabelled form at high Ievels of activity (7 mCi/kg each of [\(^3\)H]tyrosine and [\(^3\)H]phenylalanine). 11 \(\mu\)Ci/kg [\(^{14}\)C]cysteine was given as an intemal marker for MT biosynthesis. 6 h after amino acid administration, metallothionein (MT) was isolated from the liver and extensively purified. Afteracid hydrolysis and collection of Cys, Tyr, and Phe from an HPLC analysis of the amino acids, the \(^3\)H/\(^{14}\)C ratio was determined. The carcinogen-treated rats exhibited a significantly higher ratio than the vehicle-treated animals. This type of in vivo assay might find interesting applications in the investigation of nucleic acid alkylations as promutagenic lesions.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1986
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60946
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jeanclos, Elisabeth
A1  - Knobloch, Gunnar
A1  - Hoffmann, Axel
A1  - Fedorchenko, Oleg
A1  - Odersky, Andrea
A1  - Lamprecht, Anna‐Karina
A1  - Schindelin, Hermann
A1  - Gohla, Antje
T1  - Ca\(^{2+}\) functions as a molecular switch that controls the mutually exclusive complex formation of pyridoxal phosphatase with CIB1 or calmodulin
JF  - FEBS Letters
N2  - Pyridoxal 5′‐phosphate (PLP) is an essential cofactor for neurotransmitter metabolism. Pyridoxal phosphatase (PDXP) deficiency in mice increases PLP and γ‐aminobutyric acid levels in the brain, yet how PDXP is regulated is unclear. Here, we identify the Ca\(^{2+}\)‐ and integrin‐binding protein 1 (CIB1) as a PDXP interactor by yeast two‐hybrid screening and find a calmodulin (CaM)‐binding motif that overlaps with the PDXP‐CIB1 interaction site. Pulldown and crosslinking assays with purified proteins demonstrate that PDXP directly binds to CIB1 or CaM. CIB1 or CaM does not alter PDXP phosphatase activity. However, elevated Ca\(^{2+}\) concentrations promote CaM binding and, thereby, diminish CIB1 binding to PDXP, as both interactors bind in a mutually exclusive way. Hence, the PDXP‐CIB1 complex may functionally differ from the PDXP‐Ca\(^{2+}\)‐CaM complex.
KW  - calmodulin
KW  - chronophin
KW  - CIB1
KW  - haloacid dehalogenase
KW  - pyridoxal phosphatase
KW  - vitamin B6
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217963
VL  - 594
IS  - 13
SP  - 2099
EP  - 2115
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jeanclos, Elisabeth
A1  - Schlötzer, Jan
A1  - Hadamek, Kerstin
A1  - Yuan-Chen, Natalia
A1  - Alwahsh, Mohammad
A1  - Hollmann, Robert
A1  - Fratz, Stefanie
A1  - Yesilyurt-Gerhards, Dilan
A1  - Frankenbach, Tina
A1  - Engelmann, Daria
A1  - Keller, Angelika
A1  - Kaestner, Alexandra
A1  - Schmitz, Werner
A1  - Neuenschwander, Martin
A1  - Hergenröder, Roland
A1  - Sotriffer, Christoph
A1  - von Kries, Jens Peter
A1  - Schindelin, Hermann
A1  - Gohla, Antje
T1  - Glycolytic flux control by drugging phosphoglycolate phosphatase
JF  - Nature Communications
N2  - Targeting the intrinsic metabolism of immune or tumor cells is a therapeutic strategy in autoimmunity, chronic inflammation or cancer. Metabolite repair enzymes may represent an alternative target class for selective metabolic inhibition, but pharmacological tools to test this concept are needed. Here, we demonstrate that phosphoglycolate phosphatase (PGP), a prototypical metabolite repair enzyme in glycolysis, is a pharmacologically actionable target. Using a combination of small molecule screening, protein crystallography, molecular dynamics simulations and NMR metabolomics, we discover and analyze a compound (CP1) that inhibits PGP with high selectivity and submicromolar potency. CP1 locks the phosphatase in a catalytically inactive conformation, dampens glycolytic flux, and phenocopies effects of cellular PGP-deficiency. This study provides key insights into effective and precise PGP targeting, at the same time validating an allosteric approach to control glycolysis that could advance discoveries of innovative therapeutic candidates.
KW  - phosphoglycolate phosphatase
KW  - glycolytic flux control
KW  - intrinsic metabolism
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-300928
VL  - 13
IS  - 1
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jesaitis, A. J.
A1  - Erickson, R. W.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Bommakanti, R. K.
A1  - Siemsen, D. W.
T1  - Functional molecular complexes of human N-formyl peptide chemoattractant receptors and actin
N2  - When human neutrophils become desensitized to formyl peptide chemoattractants, the receptors (FPR) for these peptides are converted to a high affinity, GTP-insensitive form that is associated with the Triton X-1 00- insoluble membrane skeleton from surface membrane domains. These domains are actin and fodrin-rich, but G protein-depfeted suggesting that FPR shuttling between G protein-enriched and depleted domains may control signal transduction. Todetermine the molecular basis for FPR interaction with the membrane skeleton, neutrophil subcellular fractions were screened for molecules that could bind photoaffinity-radioiodinated FPR solubilized in Triton X-1 00. These receptors showed a propensity to bind to a 41- to43-kDa proteinband on nitrocelluloseoverlays of SOS-PAGE-separated cytosol and plasma membrane fractions of neutrophils. This binding, as weil as FPR binding to purified neutrophil actin, was inhibited 50% by 0.6 \(\mu\)M free neutrophil cytosolic actin. Addition of greater than 1 \(\mu\)M G-actin to crude or lectin-purified Triton X-1 00 extracts of FPR from neutrophil membranes increased the sedimentationrate of a significant fraction of FPR two to three fold as measured by velocity sedimentation in Triton X-1 00-containing linear sucrose density gradients. Addition of anti-actin antibodies to FPR extracts caused a concentration-dependent immunoprecipitation of at least 65% of the FPR. More than 40% of the immunoprecipitated FPR was specifically retained on protein A affinity matrices. Membrane actin was stabilized to alkaline washing when membranes were photoaffinity labeled. Conversely, when purified neutrophil cytosolic actinwas added to membranes or their digitonin extracts, after prior depletion of actin by an alkaline membrane wash, photoaffinity labeling of FPR was increased two- to fourfold with an EC\(_{50}\) of approximately 0.1 \(\mu\)M actin. We conclude that FPR from human neutrophils may interact with actin in membranes to form Triton X-1 00-stable physical complexes. These complexes can accept additional G-actin monomers to form higher order molecular complexes. Formation of FPR-actin complexes in the neutrophil may play a role in the regulation of chemoattractantinduced activation or actin polymerization.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1993
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60445
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jesaitis, A. J.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
T1  - Cytoskeletal regulation of chemotactic receptors: Molecular complexation of N-formyl peptide receptors with G proteins and actin
N2  - Signal transduction via receptors for N-formylmethionyl peptide chemoattractants (FPR) on human neutrophils is a highly regulated process. It involves direct interaction of receptors with heterotrimeric G-proteins and may be under thc control of cytoskeletal clemcnts. Evidencc exists suggesting that thc cytoskeleton and/or the membrane ske1eton determines the distribution of FPR in the plane of the plasma membrane, thus controlling FPR accessibility to different protcins in functionally distinct membrane domains. In desensitized cells, FPR are restricted to domains which are depleted of G proteins but enriched in cytoskeletal proteins such as actin and fodrin. Thus, the G protein signal transduction partners of FPR become inacccssible to the agonist-occupied receptor, preventing cell activation. We are investigating the molecular basis for the interaction of FPR with the membrane skeleton, and our results suggest that FPR, and possibly other receptors, may directly bind to cytoskeletal proteins such as actin.
KW  - Immunologie
KW  - chemotaxis
KW  - formyl peptides
KW  - receptors
KW  - actin
KW  - G proteins
KW  - cytoskeleton
KW  - membrane skeleton
Y1  - 1993
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79673
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jochmann, Svenja
A1  - Elkenani, Manar
A1  - Mohamed, Belal A.
A1  - Buchholz, Eric
A1  - Lbik, Dawid
A1  - Binder, Lutz
A1  - Lorenz, Kristina
A1  - Shah, Ajay M.
A1  - Hasenfuß, Gerd
A1  - Toischer, Karl
A1  - Schnelle, Moritz
T1  - Assessing the role of extracellular signal‐regulated kinases 1 and 2 in volume overload‐induced cardiac remodelling
JF  - ESC Heart Failure
N2  - Aims
Volume overload (VO) and pressure overload (PO) induce differential cardiac remodelling responses including distinct signalling pathways. Extracellular signal‐regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2), key signalling components in the mitogen‐activated protein kinase (MAPK) pathways, modulate cardiac remodelling during pressure overload (PO). This study aimed to assess their role in VO‐induced cardiac remodelling as this was unknown.

Methods and results
Aortocaval fistula (Shunt) surgery was performed in mice to induce cardiac VO. Two weeks of Shunt caused a significant reduction of cardiac ERK1/2 activation in wild type (WT) mice as indicated by decreased phosphorylation of the TEY (Thr‐Glu‐Tyr) motif (−28% as compared with Sham controls, P < 0.05). Phosphorylation of other MAPKs was unaffected. For further assessment, transgenic mice with cardiomyocyte‐specific ERK2 overexpression (ERK2tg) were studied. At baseline, cardiac ERK1/2 phosphorylation in ERK2tg mice remained unchanged compared with WT littermates, and no overt cardiac phenotype was observed; however, cardiac expression of the atrial natriuretic peptide was increased on messenger RNA (3.6‐fold, P < 0.05) and protein level (3.1‐fold, P < 0.05). Following Shunt, left ventricular dilation and hypertrophy were similar in ERK2tg mice and WT littermates. Left ventricular function was maintained, and changes in gene expression indicated reactivation of the foetal gene program in both genotypes. No differences in cardiac fibrosis and kinase activation was found amongst all experimental groups, whereas apoptosis was similarly increased through Shunt in ERK2tg and WT mice.

Conclusions
VO‐induced eccentric hypertrophy is associated with reduced cardiac ERK1/2 activation in vivo. Cardiomyocyte‐specific overexpression of ERK2, however, does not alter cardiac remodelling during VO. Future studies need to define the pathophysiological relevance of decreased ERK1/2 signalling during VO.
KW  - ERK1/2
KW  - volume overload
KW  - aortocaval fistula model
KW  - cardiac remodelling
KW  - eccentric hypertrophy
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212735
VL  - 6
IS  - 5
SP  - 1015
EP  - 1026
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jonas, René
T1  - Toxizität und Gentoxizität von Phytohormonen und deren Metaboliten
T1  - Toxicity and genotoxicity of phytohormones and their metabolites
N2  - Phytohormone, insbesondere solche mit östrogenem Potential werden heute vermehrt in der postklimakterischen Hormonersatztherapie als natürliche Alternative zu Designeröstrogenen eingesetzt, da sie vermutlich ein besseres Wirkungs-Nebenwirkungsprofil besitzten. Mengenmäßig am bedeutensten sind die Phytoöstrogene aus den Stoffgruppen der Isoflavone, Cumestane und Indol-3-carbinole. Weit über 100 Pflanzen produzieren Phytohormone. Die bekanntesten sind die Sojabohne, Weintrauben, Leinsamen, Haferflocken, Spargel, Traubensilberkerze und roter Klee. Phytohormone können täglich in großer Menge aufgenommen werden (1mg pro kg Körpergewicht), wobei durchaus Plasmaspiegel von über 1µM erreicht werden. Gerade deshalb darf nicht davon ausgegangen werden, daß natürliche Produkte per se gut für die Gesundheit wären. Phytohormone und insbesondere deren Metaboliten, die während der intestinalen Passage entstehen, wurden vielfach nicht den gleichen Prüfbedingungen unterzogen wie sie für andere in Lebensmitteln vorkommenden Substanzen, wie z.B. Konservierungs-, Farb- oder Aromastoffen, heute selbstverständlich ist. Diese Arbeit soll deshalb anhand von in-vitro Tests an Mauslymphomzellen L5178Y für eine Auswahl an Phytohormonen und deren Metaboliten mögliche toxische oder gentoxische Effekte detektieren und die bestehende Datenlage ergänzen. Aus der Gruppe der Isoflavone wurden die Daidzeinmetaboloiten Equol und O-desmethylangolensin und die Glyceteinmetaboliten 3,4,7- und 4,6,7-Trihyroxyisoflavon untersucht. Aus der Gruppe der Flavone wurde Fisetin und aus der Gruppe der Stilbene Resveratrol untersucht. Weiterhin wurden Daten zu den Anthocyanen Delphinidin-, Pelargonidin- und Cyanidin-Chlorid erhoben. Toxische Effekte wurden anhand von Proliferatiosexperimenten, durch die Bestimmung der Zellvitalität (Ethidiumbromid-Flouresceinmethode) und durch die Analyse der Teilungsaktivität nach Behandlung mit Cytocalasin B und anschließender Bestimmung des Anteils mehrkerniger Zellen detektiert. Zur Bestimmung von gentoxischen Effekte wurde auf den Mikrokerntest zurückgegriffen. Ergänzend sollte eine Immunfloureszenzfärbung der Kinetochorproteine in Mikrokernen Aufschluß über aneugene oder klastogene Wirksamkeit der untersuchten Substanzen geben. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten weisen darauf hin, daß erste adverse Effekte der Phytohormone oder deren Metaboliten im Bereich der erreichbaren Plasmakonzentration liegen, so daß eine übertriebene Aufnahme hochdosierter Phytohormonen derzeit als kritisch erachtet und weiterer Forschungsbedarf festgestellt werden muß.
N2  - Phytohormones, particulary those which have oestrogen potential, are nowadays increasingly used in the postclimacteric hormone replacement therapy, as a natural alternative to artificially synthesized oestrogens, since they are thought to have a better effect/side effect profile.Most important in terms of quantity are the phytoestroges which are part of either the isoflavone- coumestane- or indol 3 carbinol-substance group. For more than 100 plants produce phytohormones, the most well-known of which are the soy bean, the grape, linseeds, oat flakes, asparagus and red clover. Phytohormones can be taken up in large quantities each day (1 mg per kg body weight), whereby plasma levels of more than 1 µM can be reached. That is exactely why one can not proceed on the assumption that natural products are per se healthy. In many cases, when phytohormones and especially their metabolites, which are synthesized during the intestinal passage process, are tested, the test conditions, which are used today for the testing of other substances which are contained in food (e.g. preservatives, artificial colourings or flavouring substances), are not applied. This work is intended to detect possible toxic or genotoxic effects of phytohormones and their metabolites on the basis of tests with mouse lymphoma cells. From the isoflavone-group, the daidzein metabolites equol and o-desmethylangolensine, and the glycetein metabolites 3,4,7- and 4,6,7-trihydroxyisoflavone have therefore been examined, as well as fisetin and resveratrol from the substance-group of flavones and stilbenes respectively. This work also provides new data on anthocyanes delphinidin-, pelargonidin- and cyanidin-chloride. Toxic effects were detected o the basis of experimental registration of the proliferation process, by determining the cell vitality (ethidium bromide – flouresceine – method) and by analysis of the separation-activity after the application of cytochalsine B, directely followed by the determination of the proportion of cells with more than one nucleus. The detemination of genotoxic effects was done using the micronucleus-test. Additionally, an immune flourescense couloring of the kinetochore proteins in micronuclei should explain the aneugene or clastogene effectiveness of the substances examined. The data established through this study indicates that primary adverse effects of phytohormones or their metabolites can be detected within reachable plasma concentrations, so that an excessive take-up of phytohormones has to be classified as critical and it also shows, that there is need for further research in this field.
KW  - Phytohormone
KW  - Östrogen
KW  - Toxizität
KW  - Gentoxizität
KW  - Mikrokerne
KW  - phytohormones
KW  - estrogen
KW  - toxicity
KW  - genotoxicity
KW  - micronuclei
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11063
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jonas, René
T1  - Arsen-induzierte Zyto- und Gentoxizität sowie deren Modulation
T1  - Arsenite-induced cyto- and genotoxicity and their modulation
N2  - Arsen ist dafür bekannt, dass es mutagen und kanzerogen wirkt und ein gentoxisches Potential besitzt. Die Mechanismen, durch die diese Effekte ausgeübt werden, sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Parameter, die mit der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), z.B. Superoxiddismutaseaktivität und Hämoxygenase-Genexpression, und Veränderungen des epigenetischen Musters der DNA, z.B. Depletion von S-Adenosylmethionin, in Zusammenhang stehen, durch Arsen beeinflusst werden. In dieser Studie wurde versucht, das gentoxische Potential von Arsen mit Hilfe des Comet Assay, eines Standard-Gentoxizitätstests, zu charakterisieren sowie zu prüfen, ob dieser Test eine geeignete Messmethode für die gentoxische Wirkung von Arsen darstellt. Dies wurde unter Heranziehung verschiedener additiver Messgrößen wie der Vitalität und der Proliferation sowie der parallelen Quantifizierung der Mitose-, C-Mitose-, Mikrokern- und Apoptosefrequenzen der verwendeten murinen L5178Y-Zellen durchgeführt. Des Weiteren wurde der den Arsen-bedingten DNA-Schäden zugrundeliegende Mechanismus genauer beleuchtet. Unter Zuhilfenahme verschiedener Modulatoren wurden durch Arsen induzierter oxidativer Stress und durch Arsen induzierte Veränderung der epigenetischen DNA-Struktur untersucht. Ferner wurde geprüft, inwieweit die Inhibition von oxidativem Stress und Hypomethylierung der DNA zur Verringerung von potenziellen Folgen wie der Entstehung unnatürlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen beitragen können, die wiederum eventuell in der Entstehung von Karzinomen resultieren können. Für die Modulation der Freisetzung von ROS wurden als prooxidative Substanz 4-Nitrochinolin-1-Oxid und als Antioxidantien Benfotiamin (Vitamin-B1-Prodrug), N-Acetylcystein (NAC) und &#945;-Tocopherol (Vitamin E) ausgewählt. Das Methylierungs¬muster der DNA sollte durch das hypomethylierende Agens 5-Azacytidin und durch die potenziell hypermethylierenden Verbindungen S-Adenosylmethionin (SAM) und Folat beeinflusst werden. Die Untersuchungen bezüglich des gentoxischen Potentials von Arsen und die Eignung des Comet Assay für dessen Quantifizierung ergaben, dass unter Miteinbeziehung der erwähnten additiven Parameter und der Quantifizierung nach Behandlung mit unterschiedlichen Arsen-Konzentrationen nach unterschiedlich langen Behandlungszeiten die im Comet Assay erzielten Werte als korrekt und zuverlässig angesehen werden können. Des Weiteren zeigten die Untersuchungen der Freisetzung von ROS und der Veränderung des DNA-Methylierungsmusters mit Hilfe von Modulatoren, dass beide Mechanismen an den Arsen-induzierten Effekten beteiligt sind. Nicht nur konnte mit Hilfe der Modulatoren jeweils die Inhibition der Freisetzung von ROS und der DNA-Hypomethylierung erreicht werden, es konnte zudem gezeigt werden, dass die Substanzen auch die Reduktion der erhöhten Anzahl unnatürlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen bewirkten. Dieser Zusammenhang konnte in dieser Studie zum ersten Mal aufgezeigt werden und könnte im Hinblick auf die potenzielle Erniedrigung der Krebsinzidenzen durch Supplementierung der Bevölkerung in Gebieten mit Arsen-belastetem Trinkwasser mit den genannten Modulatoren von Bedeutung sein.
N2  - Arsenite is known to be mutagenic as well as carcinogenic and is further known to have a genotoxic potency. However, the mechanisms by which these effects are exerted is not yet fully understood. It could be shown, that parameters which are linked to the release of reactive oxygen species e. g. increase activity of superoxide dismutase or increased expression of heme oxygenase or which are linked to changes in the epigenetic pattern of the DNA, like for example depletion of S-adenosylmethionine, are affected by arsenite. In the course of this study, we attempted to characterize the genotoxic potential of sodium arsenite with the aid of the comet assay, a standard genotoxicity test, and to examine, whether this test is a suitable method for the quantification of arsenite-induced genotoxicity. Additionally, parameters like the frequencies of mitoses, C-mitoses, micronuclei and apoptoses were evaluated in murine L5178Y-cells. Furthermore, the mechanism underlying the arsenite-induced DNA-damage was investigated. With the aid of several modulators, arsenite-induced oxidative stress and arsenite-induced epigenetic modifications were examined. In addition we analyzed, to which extent the inhibition of oxidative stress and DNA-hypomethylation can contribute to a decrease in pathologic mitosis morphologies and chromosomal aberrations, which in turn could possibly result in cancer development. For the modulation of the release of reactive oxygen species, the pro-oxidative substance 4-nitroquinoline-1-oxide and the antioxidative substances benfotiamine, N-acetylcysteine and &#945;-tocopherol were chosen. The epigenetic pattern of the DNA was meant to be affected by the hypomethylating agent 5-azacytidine and the hypermethylating agents S-adenosylmethionine and folic acid. The experiments concerning the genotoxicity of arsenite and the suitability of the comet assay to quantify this genotoxic capacity revealed, that if the parameters mentioned above and different concentrations of arsenite and different incubation times were taken into consideration, the results gained with the aid of the comet assay can be considered as correct and reliable. Furthermore, the investigation of the release of reactive oxygen species and modifications of the DNA methylation patters with the aid of modulators showed, that both mechanisms are involved in the effects induced by sodium arsenite. The modulators were able to inhibit the release of reactive oxygen species and hypomethylation of the DNA respectively. In addition a decrease in the frequencies of pathologic mitosis morphologies and chromosomal aberrations could be shown. This connection could be shown for the first time in the course of this study and could be of relevance with regard to a possible decrease of the incidence of cancer by supplementation of populations with the introduced modulators in areas with drinking water contaminated with arsenite.
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Methylierung
KW  - DNS-Reparatur
KW  - DNS-Schädigung
KW  - DNS-Strangbruch
KW  - DNS-Doppelstrangbruch
KW  - DNS
KW  - Arsen
KW  - oxidative stress
KW  - methylation
KW  - dna damage
KW  - arsenite
KW  - dna strand break
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28772
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Joos, J. P.
A1  - Saadatmand, A. R.
A1  - Schnabel, C.
A1  - Viktorinová, I.
A1  - Brand, T.
A1  - Kramer, M.
A1  - Nattel, S.
A1  - Dobrev, D.
A1  - Tomancak, P.
A1  - Backs, J.
A1  - Kleinbongard, P.
A1  - Heusch, G.
A1  - Lorenz, K.
A1  - Koch, E.
A1  - Weber, S.
A1  - El-Armouche, A.
T1  - Ectopic expression of S28A-mutated Histone H3 modulates longevity, stress resistance and cardiac function in Drosophila
JF  - Scientific Reports
N2  - Histone H3 serine 28 (H3S28) phosphorylation and de-repression of polycomb repressive complex (PRC)-mediated gene regulation is linked to stress conditions in mitotic and post-mitotic cells. To better understand the role of H3S28 phosphorylation in vivo, we studied a Drosophila strain with ectopic expression of constitutively-activated H3S28A, which prevents PRC2 binding at H3S28, thus mimicking H3S28 phosphorylation. H3S28A mutants showed prolonged life span and improved resistance against starvation and paraquat-induced oxidative stress. Morphological and functional analysis of heart tubes revealed smaller luminal areas and thicker walls accompanied by moderately improved cardiac function after acute stress induction. Whole-exome deep gene-sequencing from isolated heart tubes revealed phenotype-corresponding changes in longevity-promoting and myotropic genes. We also found changes in genes controlling mitochondrial biogenesis and respiration. Analysis of mitochondrial respiration from whole flies revealed improved efficacy of ATP production with reduced electron transport-chain activity. Finally, we analyzed posttranslational modification of H3S28 in an experimental heart failure model and observed increased H3S28 phosphorylation levels in HF hearts. Our data establish a critical role of H3S28 phosphorylation in vivo for life span, stress resistance, cardiac and mitochondrial function in Drosophila. These findings may pave the way for H3S28 phosphorylation as a putative target to treat stress-related disorders such as heart failure.
KW  - cardiac hypertrophy
KW  - epigenetics
KW  - heart failure
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323637
VL  - 8
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kaestner, Alexandra Annika Nadine
T1  - Charakterisierung pharmakologischer Phosphoglykolatphosphatase-Inhibitoren
T1  - Characterization of pharmacological phosphoglycolate phosphatase inhibitors
N2  - In dieser Arbeit geht es um die Phosphoglykolatphosphatase (PGP), die als Phosphatase vom Haloazid Dehalogenase-Typ (HAD-Phosphatase) zu der ubiquitär vorkommenden Superfamilie der HAD-Hydrolasen gehört. In der Literatur ist eine in vitro Phosphatase-Aktivität gegenüber 2-Phospho-L-Laktat (2PL), 4-Phospho-D-Erythronat (4PE), Phosphoglykolat (PG) und Glycerol-3-Phosphat (G3P) beschrieben. 2PL und 4PE entstehen in Nebenreaktionen während der Glykolyse und hemmen bei Akkumulation die Glykolyse bzw. den Pentosephosphatweg. PG kann auch in einer Nebenreaktion während der Glykolyse oder im Rahmen der Reparatur von oxidativen DNA-Schäden entstehen. G3P entsteht aus Dihydroxyacetonphosphat und bildet das Kohlenhydratgerüst der Triacylglyceride (TAG). Zelluläre Studien konnten Hinweise auf die Regulierung des epidermalen wachstumsfaktor-(EGF-)induzierten Zytoskelettumbaus durch die PGP liefern und die Untersuchung von Mäusen mit PGP-Inaktivierung zeigte einen Einfluss auf die Zellproliferation und embryonale Entwicklung. Die Regulation der PGP-Expression führte zu Veränderungen im Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsel.

Die Untersuchung der PGP-Funktionen erfolgte bislang ausschließlich mit genetischen Ansätzen. Aufgrund von möglichen Kompensationsmechanismen und Off-Target-Effekten müssen genetische und pharmakologische Methoden als sich ergänzende Ansätze verstanden werden. Um die Funktionen der PGP besser zu verstehen, fokussiert sich die vorliegende Arbeit auf die gezielte pharmakologische PGP-Inhibition. In Vorarbeiten wurden 41.000 Moleküle gescreent und fünf potentielle Inhibitoren identifiziert. Ziele dieser Arbeit waren zum einen die Implementierung der Inhibitor # 1-Behandlung in der Zellkultur, zum anderen die Charakterisierung der PGP-Hemmung durch Inhibitor # 48 und die Durchführung erster Selektivitätstestungen mit Inhibitor # 48.

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass Inhibitor # 1 in der Lage ist, die endogene PGP in Zelllysaten der murinen spermatogonialen Zelllinie (GC1) zu hemmen. Unter bestimmten Bedingungen führte die Inhibitor # 1-Behandlung der GC1-Zellen zur Hemmung der PGP. Erste Analysen zellulärer Inhibitoreffekte konnten eine Steigerung der TAG-Konzentration in behandelten GC1-Zellen nachweisen. Die PGP-Hemmung durch Inhibitor # 48 wurde als unkompetitive Inhibition charakterisiert und es zeigten sich keine relevanten Inhibitoreffekte auf die HAD-Phosphatasen Magnesium-abhängige Phosphatase 1 (MDP1), Lysin-Histidin-Pyrophosphat-Phosphatase (LHPP) und Polynukleotidase 5'-Kinase/3'-Phosphatase (PnkP). Dagegen konnte eine Aktivitätssteigerung von Phospho 2 beobachtet werden. Die vorliegende Arbeit liefert somit erste Erkenntnisse über die Anwendung des PGP-Inhibitors # 1 in der Zellkultur und schafft die Grundlage für nachfolgende Untersuchungen mit Inhibitor # 48. Weitere Experimente sind notwendig, die die Inhibitorbehandlung in der Zellkultur optimieren und die Selektivität weiter charakterisieren, um mithilfe der Inhibitoren neue Erkenntnisse über die physiologische und pathophysiologische Rolle der PGP gewinnen zu können.
N2  - The present thesis describes the analysis of phosphoglycolate phosphatase (PGP), a haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatase of the ubiquitous superfamily of HAD hydrolases. In vitro and in cells, PGP has been described to dephosphorylate 2-phospho-L-lactate (2PL), 4-phospho-D-erythronate (4PE), phosphoglycolate (PG) and glycerol-3-phosphate (G3P). 2PL and 4PE are formed in side reactions by two core glycolytic enzymes and, when they accumulate, inhibit glycolysis or the pentose phosphate pathway, respectively. PG may also be formed in a side reaction during glycolysis or during the repair of oxidative DNA damage. G3P can be generated by glycerol kinase-mediated phosphorylation of glycerol, or by reduction of dihydroxyacetone phosphate. G3P forms the activated backbone of triglycerides. Cellular studies provided evidence for the regulation of epidermal growth factor (EGF) induced cytoskeletal remodeling by PGP, and examination of mice with PGP inactivation revealed its effect on cell proliferation and embryonic development. The experimental deletion or overexpression of PGP in cells, mice and rats resulted in changes in carbohydrate and lipid metabolism.

To date, the study of PGP functions has been conducted exclusively using genetic approaches, and no pharmacological PGP inhibitors have been described so far. The goal of this thesis was to characterize small molecule PGP inhibitors that have previously been identified in the group by high throughput screening. Specifically, the aim of this work was to implement inhibitor # 1 treatment in cell culture and to characterize PGP inhibition by inhibitor # 48 as well as to perform initial selectivity assays with inhibitor # 48.

Inhibitor # 1 is able to inhibit endogenous PGP in cell lysates of the murine spermatogonial cell line (GC1). Under certain conditions, inhibitor # 1 treatment of GC1 cells resulted in inhibition of PGP. Preliminary analyses of cellular inhibitory effects demonstrated an increase in TG levels in treated GC1 cells. Inhibitor # 48 was characterized as an uncompetitive PGP-inhibitor. No relevant inhibitor effects on the HAD phosphatases magnesium-dependent phosphatase-1 (MDP1), phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) and polynucleotidase 5´-kinase/3´-phosphatase (PnkP) could be detected. In contrast, an increase in the activity of Phospho 2 was observed. The present work thus provides first insights into the application of the PGP inhibitor # 1 in cell culture and lays the foundation for subsequent studies with inhibitor # 48. Further experiments are needed to improve inhibitor treatment in cell culture and to further characterize selectivity in order to gain new insights into the physiological and pathophysiological role of PGP by using the inhibitors.
KW  - Phosphoglykolatphosphatase
KW  - Inhibitor
KW  - Phosphatase
KW  - phosphoglycolatephosphatase
KW  - inhibitor
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-272394
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kahlert, Katrin
T1  - Der Einfluss von RKIP auf die Progression von Herzinsuffizienz
T1  - RKIP protects from pressure overload induced heart failure
N2  - GRK2 vermittelt über die Phosphorylierung und Inaktivierung kardialer β1-Rezeptoren eine verminderte kardiale Kontraktilität. RKIP als GRK2-Inhibitor spielt eine Rolle in der GPCR-Signalgebung. Die Überexpression des Proteins führt zu einer verbesserten Herzfunktion. Dieser Effekt wird möglicherweise über die GRK2-Inhibition vermittelt und eröffnet die Diskussion über weitere durch RKIP vermittelte protektive Effekte im Herzen.
In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass die kardiale RKIP-Expression in Mäusen und humanem Herzgewebe bei Herzinsuffizienz gesteigert ist. Zudem beschrieb ich den protektiven Effekt einer gesteigerten Expression von RKIP in murinen Herzen im Hinblick auf die Ausprägung typischer struktureller und morphologischer Zeichen von Herzinsuffizienz.
Echokardiographische Untersuchungen zeigten, dass RKIP die Herzfunktion positiv beeinflusst. RKIP-tg-Mäuse wiesen eine gesteigerte Verkürzungsfraktion und einen dauerhaft hyperkontraktilen Phänotyp auf. Trotz fehlenden Einflusses auf die kardiale Hypertrophie bewirkte die chronische linksventrikuläre Druckbelastung durch TAC in RKIP-tg-Mäusen eine geringere kardiale Dilatation und den Erhalt einer stärkeren Kontraktilität als in Wildtyp-Mäusen. 
Die Ligation der Aorta transversa bewirkte bei Wildtyp-Mäusen zudem strukturelle und molekulare Veränderungen, die typisch für einen herzinsuffizienten Phänotyp sind. Der Anteil fibrotischen Gewebes und die Apoptose im Herzen nahmen zu. Strukturelle Veränderungen des Herzgewebes sind ein Korrelat für ein herzinsuffizientes Herz. RKIP-tg-Mäuse zeigten diese Veränderungen in einem deutlich geringeren Ausmaß und weisen auf eine protektive Wirkung einer kardialen RKIP-Überexpression hin. Interessanterweise war die mRNA-Expression der Fibrosemarker CTGF und TGFß nach chronischer linksventrikulärer Druckbelastung sowohl bei Wildtyp-Mäusen als auch bei RKIP-transgenen Mäusen erhöht. Die Ursache für das Fehlen eines signifikanten Unterschiedes könnte sein, dass diese Marker nicht spezifisch für die kardiale Fibrosierung sind, sondern deren Expression auch mit der kardialen Hypertrophie zusammenhängt.
Eine weitere Beobachtung war der Anstieg der mRNA-Expression der Herzinsuffizienz-Marker BNP und ANF nach chronischer Druckbelastung in Wildtyp- und RKIP-tg-Mäusen. Die Ergebnisse bestätigten, dass BNP spezifischer für die durch chronische linksventrikuläre Druckerhöhung verursachte Herzinsuffizienz zu sein scheint.
Ich beobachtete eine gesteigerte RKIP-Expression bei Herzinsuffizienz und kardialer Hypertrophie. Herzbiopsien herzinsuffizienter und an Aortenstenose erkrankter Patienten wiesen im Vergleich zu Kontrollen eine erhöhte RKIP-Proteinexpression auf. Auch C57BL/6J-Mäuse wiesen nach chronischer linksventrikulärer Druckbelastung eine gesteigerte kardiale RKIP-Expression im Vergleich zu Kontrollen auf. Die Hochregulation der RKIP-Expression könnte als protektiver feedback-Mechanismus interpretiert werden. 
Resultat dieser Arbeit ist, dass RKIP eine protektive Wirkung bei der Progression von durch chronische linksventrikuläre Druckbelastung induzierte Herzinsuffizienz hat, am ehesten durch seine Funktion als GRK2-Inhibitor und seine Rolle bei der GPCR-Signalgebung.
N2  - Failing hearts are unable to adequately supply the body with blood and oxygen. Common therapeutic strategies interfere with cardiac remodelling, reduce cardiac pre- and afterload or aim at direct improvement of cardiac contractility. Cardiac contractility is mainly controlled by 1-adrenergic receptors. Resensitization of -adrenergic receptors by inhibition of G-protein coupled receptor kinase 2 (GRK2) is discussed as a potential strategy to treat heart failure. Raf kinase inhibitor protein (RKIP) is as a physiological inhibitor of GRK2 and it increases contractility of neonatal cardiomyocytes. In this study its effects on cardiac function in pressure overload induced heart failure and determined the expression patterns of RKIP in failing hearts of humans and mice was assessed. Transverse aortic contriction (TAC) was performed on 7-week-old C57/BL6 mice to induce heart failure by pressure overload of left ventricles. 
After three weeks of TAC, echocardiography showed distinct signs of decreased cardiac function in wild-type mice. Fractional shortening was reduced and left ventricular diameters were increased. 
Histological analyses revealed increased interstitial fibrosis, caspase- and TUNEL-assays indicated myocyte apoptosis. 
Western blot analysis and real-time PCR showed significant upregulation of RKIP expression in failing hearts compared to non-banded control hearts. Interestingly, this upregulation of RKIP protein expression was also detected in failing human hearts and in samples of patients with aortic valve stenosis but not in healthy control samples.
To assess the effects of RKIP overexpression on heart failure, heart function and structure of RKIP transgenic mice and wild-type mice 3 weeks after TAC was analysed. 
While left ventricular hypertrophy was increased to similar extents in wild-type and RKIP trangenic mice, RKIP mice did neither develop dilatation of the left ventricle nor a decrease in fractional shortening. The mRNA-expression of the fibrosis markers CTGF and TGFwas upregulated in banded wild-type mice and in banded RKIP transgenic mice after 3 weeks of TAC indicating its correlation not only for fibrosis but possibly also for hypertrophy.
The mRNA-expression of the heart failure markers BNP and ANF was upregulated in banded wild-type mice and in banded RKIP transgenic mice after 3 weeks of TAC. The results confirm that BNP is more specific for heart failure than ANF. 
Taken together, cardiac overexpression of RKIP prevented left ventricular dilatation and loss of contractile function in a mouse model of pressure overload induced heart failure. Therefore, increased RKIP expression may be an interesting target to prevent detrimental effects from increased left ventricular pressure.
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Raf kinase inhibitor protein
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139191
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kampfinger, Katja
T1  - Nachweis einer Mismatch-Reparatur-Defizienz in L5178Y Tk+/--3.7.2C-Mauslymphomzellen
T1  - Evidence of a mismatch repair deficiency in L5178Y Tk+/--3.7.2C mouse lymphoma cells
N2  - Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizitätsermittlung. Für die Überprüfung der Gentoxizität stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verfügung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den für die Testung notwendigen Veränderungen weitere Veränderungen zu tragen, die zu Reaktionen führen können, wie sie in den Primärzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale abschätzen zu können. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-tätsprüfung am häufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Veränderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrität des Genoms zu gewährleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch äußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die geschädigten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu überleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Schäden und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomschäden bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, während andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen für alkylierende Agenzien beschrieben ist, führte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Phänotyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Phänotyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen geprüft und bestätigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte für den gezeigten MMR-defizienten Phänotyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Verände-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese führt nach 260 Aminosäuren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminosäuren zu einem Abbruch der Aminosäuresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information für den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedomäne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die für den C-Terminus hingegen, der für die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit für die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erklären kann. Daraus folgt für den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizitätstests, dass die Berücksichtigung ihrer MMR-Defizienz die Möglichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann.
N2  - The development and approval of pharmaceuticals as well as the evaluation of xenobiotics require several test systems for the detection of genotoxicity. There is a number of established genotoxicity test systems, which are often based on cancer cell lines. In addition to mutations that are essential for genotoxicity testing, cancer cell lines may also carry mutations that might cause reactions not occurring in the primary cells of the organism. Therefore the knowledge of the genetic background of the cell line used is important for the evaluation of test results and the subsequent genotoxicity risk assessment. Among test systems that are based on cancer cells the mouse lymphoma cell line L5178Y adopts a very prominent position due to its worldwide application for genotoxicity testing. The dissertation on hand provides evidence that there are mutations in the L5178Y cell line that are related to the mismatch-repair system (MMR system). MMR participates in safeguarding the genomic integrity. In MMR-proficient cells, DNA defects that arise during replication, homologous recombination or as a result of genotoxic effects are either recognized and repaired or the genetically altered cells are eliminated by induction of apoptosis. MMR-deficient cells, however, survive despite serious DNA defects and accumulate them. The accumulation of DNA damage as result of treatment with alkylating agents had been observed in L5178Y cells while other cell lines had reacted with an induction of apoptosis. The induction of apoptosis after treatment with alkylating agents is described in the literature as a typical behaviour for MMR-deficient cells. From this the hypothesis was established, that L5178Y-cells might exhibit a MMR-deficient phenotype. This MMR-deficient phenotype was proven by selective treatment of L5178Y cells and cells with known MMR status with the alkylating agent MNNG followed by the subsequent comparison of the different reactions. The comparison was carried out by the detection of genotoxic effects using the micronucleus test and the comet assay. On the protein level there was not an indication that the observed MMR-deficiency was related to the the three most important MMR-proteins MSH2, MLH1 and MSH6: All proteins demonstrated expression levels that were comparable to the levels of the MMR-proficient control cells. On the DNA level, however, several mutations were detected by sequence analysis of the coding regions of all genes known to be involved in MMR. The most important among these mutations was an insertion mutation (964(insC)) in pms2, that caused a frameshift after 260 amino acids. By this frameshift, a stop-codon was introduced, leading to an interruption of the sequence after 313 amino acids. While the information of the N-terminal region of pms2 containing the DNA-binding domain as well as the ATPase active sites is still present, the information of the C-terminus is lost. This region is responsible for the dimerisation with the MMR-protein MLH1. Therefore, the MMR-function that is due to this complex, is missing. In conclusion, a MMR-deficiency of L5178Y cells was demonstrated. This MMR-deficiency is explained by an insertion-mutation in pms2 (964(insC)). Consideration of this MMR-deficiency enhances the meaningfulness of the evaluation of test results with L5178Y mouse lymphoma cells in risk assessment.
KW  - Maus
KW  - Zelle
KW  - L5178Y-Zellen
KW  - MMR-Reparatur
KW  - pms2
KW  - Genotoxizität
KW  - Alkylantien
KW  - L5178Y cells
KW  - mismatch repair
KW  - pms2
KW  - genotoxicity
KW  - alkylating agent
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26023
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TY  - THES
A1  - Kannen Cardoso, Vinicius
T1  - The role of Fluoxetine against preneoplastic lesions and tumors in colon tissue
T1  - Die Rolle von Fluoxetin gegen präneoplastische Läsionen und Tumoren im Darmgewebe
N2  - Introduction: Colon cancer is one of the major human malignancies worldwide, and much effort has been applied to understand the process of colon carcinogenesis, as well as the role of potential treatments and co-therapeutical agents against it. A growing body of evidence suggests that the use of fluoxetine (FLX), an antidepressant belonging to the selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs), may be associated with a reduced colon cancer risk. However, controversial opinions have been published and an identification of the mechanisms of the activity of FLX on colon cells would help in the clarification of this controversy. Objectives: Using several in vitro and in vivo-based methods and analyses, we aimed to verify whether FLX has antioxidant, pro-oxidant or DNA-damaging potential in standard toxicological assays; to check whether and how FLX could prevent and reduce colon preneoplastic lesions; to ascertain whether FLX has any oncostatic potential against colon tumors; and, to investigate whether FLX activity could be comparable with a known and current applied chemotherapeutic agent against colon cancer. Results: FLX did not have any antioxidant potential in our experiments. Although it did not induce reactive oxygen species (ROS) generation or DNA-damage in fibroblast and colon tumor cell lines, FLX reduced dysplasia and proliferation in two different carcinogen models. Further, a significant decrease in colon stromal reactivity and angiogenesis was found in both carcinogen-induced preneoplasia models. In a xenograft model of colon cancer, FLX shrank tumors, reduced tumor proliferation, arrested cancer cells at the G0/G1 cell-cycle phase, and took ROS generation under control. Such effects were detected together with an intracellular acidification and loss of mitochondrial membrane potential in FLX-treated cells. Modulating mitochondrial respiratory chain, HIF-1 expression and Akt/mTOR signaling pathway, FLX was found to reduce colon tumors similar to the widely used chemotherapeutic agent 5-Fluoracil activity. Conclusion: Our collective data suggest that FLX is a remarkable chemopreventive and oncostatic agent against colon preneoplastic lesions and tumors, acting without DNA-damage or ROS generation.
N2  - Einleitung: Darmkrebs ist eine der wichtigsten menschlichen Tumorarten weltweit und viel Aufwand wurde unternommen, um den Prozess der Colonkarzinogenese, sowie die Rolle der möglichen Behandlungen und Co-therapeutische Mittel zu verstehen. Eine wachsende Zahl von Hinweisen deuted darauf hin, dass die Verwendung von Fluoxetin (FLX), einem Antidepressivum aus der Klasse der selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRIs), mit einem reduzierten Dickdarmkrebs-Risiko verbunden sein kann. Allerdings sind auch kontroverse Meinungen veröffentlicht worden und eine Identifizierung der Mechanismen der Aktivität von FLX auf Darmzellen würde bei der Klärung dieser Kontroverse helfen. Ziele: Mit in vitro-und in vivo-Methoden wollten wir prüfen, ob FLX antioxidatives, prooxidatives oder DNA-schädigendes Potential in Standard-toxikologischen Untersuchungen hat; des weiteren sollte analysiert werden, ob und wie FLX präneoplastischen Läsionen verhindern und reduzieren kann, sowie ob FLX onkostatisches Potenzial gegen Darmtumoren hat. Letzteres sollte im direkten Vergleich mit dem etablierten Chemotherapeutikum 5-Fluoruracil untersucht werden. Ergebnisse: FLX zeigte keine direkte antioxidative Kapazität in unseren Testsystemen. Obwohl es keine Bildung reaktiver Sauerstoffspecies (ROS) und keine Induktion von DNA-Schaden in Fibroblasten und Kolon Tumorzellinien verursachte, reduzierte FLX Dysplasien und Proliferation in zwei verschiedenen Kanzerogen-Modellen in vivo. Ferner wurde eine signifikante Abnahme der Reaktivität der Stromazellen und von Angiogenese in beiden Karzinogen-induzierten Präneoplasie-Modellen gefunden. In einem Xenograft Modell des Kolonkarzinoms brachte FLX die Tumoren durch verringerte Proliferation zum Schrumpfen. In vitro wurde in den entsprechenden Zellinien eine Anreicherung der Zellen in der Ga0/G1 Zellzyklus-Phase, eine Reduktion Hypoxie-verursachter ROS-Bildung, intrazelluläre Ansäuerung und Velust des mitochondrialen Membranpotentials nach FLX-Behandlung gefunden. Weitere Aktivitäten waren auf die mitochondriale Atmungskette, HIF-1 Expression und den Akt/mTOR-Sinalweg zu beobachten. Die Reduktion der Kolontumoren war der mit 5-Fluoruracil erzielten vergleichbar. Schlussfolgerung: Unsere Daten deuten darauf hin, dass FLX eine bemerkenswerte chemopräventive und onkostatischen Aktivität gegen präneoplastische Läsionen und Tumore im Darm aufweist, die ohne Induktion von DNA-Schäden ROS stattfindet.
KW  - Fluoxetin
KW  - Magenkrebs
KW  - Fluoxetine
KW  - Colon cancer
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77589
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TY  - JOUR
A1  - Kannen, Vinicius
A1  - Hintzsche, Henning
A1  - Zanette, Dalila L.
A1  - Silva Jr., Wilson A.
A1  - Garcia, Sergio B.
A1  - Waaga-Gasser, Anna Maria
A1  - Stopper, Helga
T1  - Antiproliferative Effects of Fluoxetine on Colon Cancer Cells and in a Colonic Carcinogen Mouse Model
N2  - The antidepressant fluoxetine has been under discussion because of its potential influence on cancer risk. It was found to inhibit the development of carcinogen-induced preneoplastic lesions in colon tissue, but the mechanisms of action are not well understood. Therefore, we investigated anti-proliferative effects, and used HT29 colon tumor cells in vitro, as well as C57BL/6 mice exposed to intra-rectal treatment with the carcinogen N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) as models. Fluoxetine increased the percentage of HT29 cells in the G0/G1 phase of cell-cycle, and the expression of p27 protein. This was not related to an induction of apoptosis, reactive oxygen species or DNA damage. In vivo, fluoxetine reduced the development of MNNG-induced dysplasia and vascularization-related dysplasia in colon tissue, which was analyzed by histopathological techniques. An anti-proliferative potential of fluoxetine was observed in epithelial and stromal areas. It was accompanied by a reduction of VEGF expression and of the number of cells with angiogenic potential, such as CD133, CD34, and CD31-positive cell clusters. Taken together, our findings suggest that fluoxetine treatment targets steps of early colon carcinogenesis. This confirms its protective potential, explaining at least partially the lower colon cancer risk under antidepressant therapy.
KW  - Medizin
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75879
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TY  - THES
A1  - Kauk, Michael
T1  - Investigating the Molecular Mechanism of Receptor Activation at Muscarinic Receptors by Means of Pathway-Specific Dualsteric Ligands and Partial Agonists
T1  - Molekulare Grundlagen der Rezeptoraktivierung von muskarinergen Acetylcholin Rezeptoren durch dualstere Liganden und Partialagonisten
N2  - G protein-coupled receptors (GPCRs) form the biggest receptor family that is encoded in the human genome and represent the most druggable target structure for modern therapeutics respectively future drug development. Belonging to aminergic class A GPCRs muscarinic Acetylcholine receptors (mAChRs) are already now of clinical relevance and are also seen as promising future drug targets for treating neurodegenerative diseases like Alzheimer or Parkinson. The mAChR family consist of five subtypes showing high sequence identity for the endogenous ligand binding region and thus it is challenging until now to selectively activate a single receptor subtype. A well accepted method to study ligand binding, dynamic receptor activation and downstream signaling is the fluorescence resonance energy transfer (FRET) application. Here, there relative distance between two fluorophores in close proximity (<10 nm) can be monitored in a dynamic manner. The perquisite for that is the spectral overlap of the emission spectrum of the first fluorophore with the excitation spectrum of the second fluorophore. By inserting two fluorophores into the molecular receptor structure receptor FRET sensors can serve as a powerful tool to study dynamic receptor pharmacology.
Dualsteric Ligands consist of two different pharmacophoric entities and are regarded as a promising ligand design for future drug development. The orthosteric part interacts with high affinity with the endogenous ligand binding region whereas the allosteric part binds to a different receptor region mostly located in the extracellular vestibule. Both moieties are covalently linked. Dualsteric ligands exhibit a dynamic ligand binding. The dualsteric binding position is characterized by a simultaneous binding of the orthosteric and allosteric moiety to the receptor and thus by receptor activation. In the purely allosteric binding position no receptor activation can be monitored.
In the present work the first receptor FRET sensor for the muscarinic subtype 1 (M1) was generated and characterized. The M1-I3N-CFP sensor showed an unaltered physiological behavior as well as ligand and concentration dependent responses. The sensor was used to characterize different sets of dualsteric ligands concerning their pharmacological properties like receptor activation. It was shown that the hybrids consisting of the synthetic full agonist iperoxo and the positive allosteric modulator of BQCA type is very promising. Furthermore, it was shown for orthosteric as well as dualsteric ligands that the degree of receptor activation is highly dependent on the length of and the chemical properties of the linker moiety. For dualsteric ligands a bell-shaped activation characteristic was reported for the first time, suggesting that there is an optimal linker length for dualsteric ligands. The gained knowledge about hybrid design was then used to generate and characterize the first photo-switchable dualsteric ligand. The resulting hybrids were characterized with the M1-I3N-CFP sensor and were described as photo-inactivatable and dimmable. In addition to the ligand characterization the ligand application methodology was further developed and improved. Thus, a fragment-based screening approach for dualsteric ligands was reported in this study for the first time. With this approach it is possible to investigate dualsteric ligands in greater detail by applying either single ligand fragments alone or in a mixture of building blocks. These studies revealed the insights that the effect of dualsteric ligands on a GPCR can be rebuild by applying the single building blocks simultaneously. The fragment-based screening provides high potential for the molecular understanding of dualsteric ligands and for future screening approaches. Next, a further development of the standard procedure for measuring FRET by sensitized emission was performed. Under normal conditions single cell FRET is measured on glass coverslips. After coating the coverslips surface with a 20 nm thick gold layer an increased FRET efficiency up to 60 % could be reported. This finding was validated in different approaches und in different configurations. This FRET enhancement by plasmonic surfaces was until yet unreported in the literature for physiological systems and make FRET for future projects even more powerful.
N2  - G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Proteinfamilie, die im humanen Genom verschlüsselt ist. Sie sind nicht nur die Zielstruktur für eine Vielzahl von derzeit gebräuchlichen Medikamenten, sondern gehören auch zu den vielversprechendsten Therapieansätzen für die moderne Medikamentenentwicklung. Muskarinerge Acetylcholin Rezeptoren (mAChRs) gehören zu den aminergen Klasse A GPCRs und sind bereits heute von klinischer Relevanz. Die muskarinerge Rezeptorfamilie wird von fünf Subtypen gebildet, die sich besonders durch eine hohe Sequenzidentität in der endogenen Ligandenbindestelle (orthostere Bindestelle) auszeichnen. Aus diesem Grund ist es mit den herkömmlich verwendeten Medikamenten nicht möglich, einen ganz bestimmten Subtyp zu therapieren, ohne auch andere Subtypen zu beeinflussen und so unerwünschte Nebenwirkungen zu erhalten. Eine Möglichkeit Ligandenbindung, dynamische Rezeptoraktivierung oder Signalweiterleitung von GPCRs nach pharmakologischen Gesichtspunkten zu charakterisieren, stellt der Floreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) dar. Mit Hilfe dieser Methode kann über kleine Entfernungen (<10 nm) die relative Orientierung von zwei Fluorophoren mit überlappenden Spektralbereichen mit hoher zeitlicher Auflösung verfolgt werden. Integriert man das Fluorophorpaar mit Hilfe gentechnischer Methoden in die Molekülstruktur des Rezeptors, kann man dessen Konformationsänderung bzw. Aktivierung infolge einer Ligandenbindung aufzeichnen.
Dualstere Liganden sind eine Substanzklasse von hohem zukünftigen klinischen Potential und zeichnen sich durch die Verknüpfung mehrerer pharmakologisch aktiver Untereinheiten aus. Der orthostere Molekülteil interagiert mit der endogenen Ligandenbindestelle und der allostere Molekülteil interagiert mit einem zweiten Rezeptorabschnitt, der häufig in den extrazellulären Schlaufen des Rezeptors zu finden ist. Diese allosteren Bindestellen zeichnet sich durch eine vergleichsweise geringe Sequenzidentität aus, weswegen allostere Modulatoren auch selektiv an Subtypen binden können. Aufgrund des Aufbaus können dualstere Liganden auf vielfältige Weise mit dem Rezeptor interagieren und dieser Bindemechanismus wurde als dynamische Ligandenbindung beschrieben. Zum einen können beide Molekülteile gleichzeitig mit dem Rezeptor interagieren und ihn aktivieren (dualsterer Bindemodus) und zum anderen findet man einen rein allosteren Bindemodus, der den Rezeptor nicht aktiviert. Der orthostere Molekülteil ist vor allem für die Rezeptoraktivierung zuständig, die sich durch eine hohe Affinität auszeichnet und der allostere Molekülteil kann selektive Rezeptorinteraktionen vermitteln. Da dualstere Moleküle immer Eigenschaften beider Untereinheiten besitzen, werden dualstere Liganden als sehr vielversprechend erachtet, zukünftig subtypselektive Medikamente darzustellen.
In dieser Arbeit wurde der erste Rezeptor FRET Sensor für den muskarinergen Subtyp 1 (M1) beschrieben und es konnte gezeigt werden, dass sich dieser Rezeptorsensor in seiner physiologischen Funktion nicht von dem wild Typ unterscheidet. Des Weiteren können mit Hilfe dieses Sensors liganden- und konzentrationsabhängige Rezeptorantworten aufgezeichnet werden. Der M1-I3N-CFP wurde dazu genutzt verschiedene Reihen dualsterer Liganden zu charakterisieren und auf ihre aktivierenden Eigenschaften bezüglich des M1 zu testen. Es wurde gezeigt, dass die Kombination aus dem synthetischen und hochpotenten Agonisten Iperoxo als Orthoster und dem in der Literatur als M1 selektiven positiven allosteren Modulator beschriebenen BQCA als Alloster sehr vielversprechend ist. Es konnte gezeigt werden, dass die rezeptoraktivierenden Eigenschaften sowohl von orthosteren wie auch von dualsteren Liganden stark von der Linkerlänge abhängig sind. Für dualstere Liganden konnte so ein glockenförmiger Zusammenhang zwischen Linkerlänge und Rezeptoraktivierung herausgearbeitet werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass bestimmte Hybride, die den M1 aktivieren, an anderen Subtypen keine Effekte hervorrufen und somit als subtypselektiv beschrieben werden können. Im Anschluss wurde mit Hilfe des gewonnenen Wissens über Iperoxo/BQCA Hybride, das Moleküldesign der dualsteren Liganden weiterentwickelt. So wurden in dieser Arbeit die ersten photo-schaltbaren bzw. photo-dimmbaren dualsteren Liganden beschrieben und charakterisiert. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die herkömmliche Charakterisierung von dualsteren Liganden weiterentwickelt. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass es möglich ist, die Aktivierung eines Rezeptors durch einen dualsteren Liganden nachzustellen, indem die einzelnen Fragmente des ursprünglichen Liganden gleichzeitig appliziert werden. Diese auf Fragmenten basierende Charakterisierung ist die erste Anwendung dieser Art und birgt großes Potential für die zukünftige Suche nach neuen Wirkstoffen. Neben der Untersuchung von pharmakologischen Schwerpunkten wurde auch die Weiterentwicklung der Rezeptor FRET Methodik beschrieben. Die herkömmliche Anwendung der Rezeptor FRET Sensoren geschieht auf Objektträgern aus Quarzglas. In dieser Arbeit wurde diese Anwendung dahingehend weiterentwickelt, dass die Objektträger mit einer 20 nm dicken Goldschicht beschichtet wurden, um den Einfluss von Plasmonoberflächen auf physiologisch relevante FRET Messungen zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der Goldbeschichtung und in Abhängigkeit des Versuchsaufbaus die Energietransfereffizienz um bis zu 60 % gesteigert werden konnte. Diese Entdeckung zeigt Potential zukünftig die FRET-Reichweite zu erhöhen und so bisher nicht charakterisierbare Sachverhalte aufklären zu können.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Muscarinrezeptor
KW  - Dualsteric Ligands
KW  - Partial Agonists
KW  - Dualstere Liganden
KW  - Partialagonismus
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173729
N1  - Online-Version enthält nicht den Appendix (Volltexte der Originalveröffentlichungen der Zeitschriftenaufsätze)
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TY  - THES
A1  - Kellert, Marco
T1  - Untersuchungen zum Metabolismus von Furan in Ratte und Maus, sowie zur Reaktivität und Gentoxizität von cis-2-Buten-1,4-dial in vitro und in Zellkultur
T1  - Metabolism of furan in rats and mice and tests for the reactivity and genotoxicity of cis-2-butene-1,4-dial in vitro and in cell culture.
N2  - Furan wird in einer Vielzahl von Speisen durch Hitzebehandlung gebildet und ist kanzerogen in der Leber von Ratte und Maus. Durch die hohe Flüchtigkeit von Furan ist eine Expositionsabschätzung auf Basis der Kontamination von Lebensmitteln nur bedingt möglich. Ein alternativer Ansatz dazu ist die Identifizierung von Furanmetaboliten als Expositions­biomarker. Nach der Aufnahme wird Furan zunächst zum Dialdehyd cis-2-Buten-1,4-dial oxidiert. cis-2-Buten-1,4-dial besitzt mehrere elektrophile Strukturelemente, welche eine Reaktion mit Protein und DNS wahrscheinlich machen und damit zur bekannten Toxizität von Furan beitragen können. Es stellt sich in diesem Zusammenhang die Frage, ob eine Reaktion mit Protein die Reaktion mit der DNS verhindern kann und somit keine direkt gentoxischen Effekte auftreten. Für ein kanzerogenes Agens ohne direkte gentoxische Wirkung kann eine Schwellendosis unterhalb derer kein DNS-Schaden auftritt diskutiert werden. Für eine fundierte Risikobewertung bezüglich der Aufnahme von Furan über die Nahrung ist dies unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit wurde nach der oralen Gabe von Furan im Urin von Fischer 344 Ratten nach Metaboliten gesucht. Eine Kontrollgruppe erhielt nur die Trägersubstanz Öl. Das vor und nach Exposition über jeweils zwei 24 Stunden Perioden gesammelte Urin wurde mittels einer Tandemmassenspektrometrie-Methode analysiert. Die Methode bestand aus einem Full-Scan und einer darüber gesteuerten Aufzeichnung eines Fragmentionenspektrums. Die Full-Scan-Daten wurden mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse untersucht. In der ersten Sammelperiode nach der Behandlung konnten durch die erste Hauptkomponente die behandelten von den unbehandelten Tieren getrennt werden. Aus den für die Trennung relevanten Verbindungen konnten fünf Biomarker strukturell aufgeklärt werden. In einer weiteren Tierstudie an Ratten und Mäusen wurde die Kinetik und die Dosis-Wirkungs-Beziehung der identifizierten Biomarker untersucht. Die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Urine auf die identifizierten Biomarker hin zeigte, dass in der Ratte alle und in der Maus alle bis auf einen dosisabhängig anstiegen. Die Kinetik der Ausscheidung lieferte wertvolle Hinweise auf die Entstehung der Biomarker. Die Ausscheidung der Biomarker mit Lysinstruktur erfolgte über mehr als 72 Stunden. Dies war ein Hinweis auf eine Freisetzung aus Protein. Die Ausscheidung der restlichen Verbindungen erfolgte ausschließlich in den ersten 24 Stunden. Die in der Literatur vorhandenen Daten zur Gentoxizität von Furan und cis-Buten-1,4-dial sind unschlüssig und unvollständig. In der vorliegenden Arbeit wurde cis-2-Buten-1,4-dial im Ames Stamm TA104 und in L5178Y Mauslymphomzellen auf Mutagenität und Gentoxizität untersucht. Durch starke Zytotoxizität war der Konzentrationsbereich auf 4.5 µmol/Platte limitiert. Innerhalb dieses Bereich konnte mit der Vorinkubationsvariante des Ames-Tests keine Mutagenität beobachtet werden. Die L5178Y Mauslymphomzellen wurden mit Standardprotokollen für den Mikrokern-Test, Kometen-Test und den Thymidinkinase-Test untersucht. Der Konzentrationsbereich von cis-2-Buten-1,4-dial erstreckte sich bis 100 µM, konnte aber auf Grund der starken Zytotoxizität nur bis 25 µM ausgewertet werden. Dennoch konnte bereits in diesem Bereich ein 1.7- bzw. 2.2-facher Anstieg im Kometen- bzw. Thymidinkinase-Test beobachtet werden. Verglichen mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat hatte cis-2-Buten-1,4-dial bei einer deutlich höheren Zytotoxizität eine ähnliche Potenz bezüglich der Mutagenität und Gentoxizität. Um das DNS-vernetzende Potential von cis-2-Buten-1,4-dial zu bestimmen wurde eine Variante des Kometen-Tests verwendet. Es wurde dabei untersucht, ob die Vorbehandlung von Zellen mit cis-2-Buten-1,4-dial die durch &#947;-Strahlung induzierbaren Kometen reduzieren kann. Während die Positivkontrolle Glutaraldehyd die Kometen tatsächlich verringerte, blieb dieser Effekt bei cis-2-Buten-1,4-dial aus. Im Gegenteil, bei einer Konzentration von &#8805;100 mM konnte durch die Zunahme von Zellen mit beginnender Apoptose ein Anstieg der Kometen beobachtet werden. Obwohl cis-2-Buten-1,4-dial sehr deutliche gentoxische und mutagene Effekte zeigte, beschränkte die hohe Zytotoxizität den auswertbaren Bereich. Möglicherweise kann diese Problematik einen Teil der unschlüssigen Ergebnisse erklären, sicher ist jedoch, dass für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität und Kanzerogenität ein Beitrag von nicht gentoxischen Effekten diskutiert werden muss.
N2  - Furan has been found in a number of heated food items and is carcinogenic in the liver of rats and mice. Estimates of human exposure on the basis of concentrations measured in food are not reliable because of the volatility of furan. A biomarker approach was therefore indicated. Metabolism of furan includes the formation of an unsaturated dialdehyde, cis-2-butene-1,4-dial. In view of the multifunctional electrophilic reactivity of cis-2-butene-1,4-dial, adduct formation with protein and DNA may explain some of the toxic effects. DNA-adduction is a direct genotoxic effect. The major question was weather a direct genotoxicity of cis-2-butene-1,4-dial could be prevented by the reaction with protein structures. If so, the genotoxic and mutagenic effects are likely to show a threshold dose, reducing the cancer risk for low exposure levels. We searched for metabolites excreted in the urine of male Fischer 344 rats treated by oral gavage with 40 mg furan per kg body weight. A control group received the vehicle oil only. Urine collected over two 24-hour periods both before and after treatment was analyzed by a column-switching LC-MS/MS method. Data were acquired by a full scan survey scan in combination with information dependent acquisition of fragmentation spectra by the use of a linear ion trap. The full scan data was analyzed by principal component analysis (PCA). The first principal component fully separated the samples of treated rats from the controls in the first post-treatment sampling period. Five of the compounds that are responsible for the separation could be identified as the reaction product of cis-2-butene-1,4-dial with either glutathion or lysine (protein). In a second animal study rats and mice were treated with seven different doses of furan in the range from 125 µg to 8 mg per kg body weight. Dose-response and kinetic over 72 h of the seven identified biomarkers was examined by LC-MS/MS in the urine. In the rats all biomarkers showed a dose-dependent increase. In the mice one biomarker lacked of dose dependency. Different excretion profiles were attributed to the formation of either protein adducts or glutathione conjugates. Whereas the protein-derived biomarkers with a lysin moiety showed a slow excretion over more than 72 h, the glutathion-dervived biomarkers were only excreted within the first 24 h. Short-term tests for genotoxicity of furan in mammalian cells are inconclusive, little is known for cis-2-butene-1,4-dial. We investigated cis-2-butene-1,4-dial generated by hydrolysis of 2,5-diacetoxy-2,5-dihydrofuran for genotoxicity and mutagenicity in Salmonella typhimurium (Strain TA104) and in L5178Y mouse lymphoma cells. The Ames Test was negative in the preincubation assay with and without reduction of cytotoxicity by addition of glutathione after preincubation phase. Remarkable cytotoxicity limited the analysis range up to 4.5 µmol/plate. Mutagenicity and genotoxicicty in L5178Y mouse lymphoma cells was evaluated using standard procedures for the comet assay, the micronucleus test, and the mouse lymphoma thymidine kinase gene mutation assay. cis-2-butene-1,4-dial was tested at 0, 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 µM. Cytotoxicity was remarkable; cell viability at 50 µM was reduced to <50%. Up to 25 µM, cell viability was >90%, and measures of comet assay and thymidine kinase mutations were increased over control about 1.7 an 2.2-fold, respectively. Compared to methyl methanesulfonate used as positive control, cis-2-butene-1,4-dial was of similar potency for genotoxicity but much more cytotoxic. A potential cross-linking activity of cis-2-butene-1,4-dial was investigated by checking whether gamma radiation-induced DNA migration in the comet assay could be reduced by pretreatment with cis-2-butene-1,4-dial. As opposed to the effect of the positive control glutaraldehyde, cis-2-butene-1,4-dial treatment did not reduce the comets. On the contrary, an increase was observed at &#8805;100 µM cis-2-butene-1,4-dial, which was attributable to early apoptotic cells. Although cis-2-butene-1,4-dial was found to be a relatively potent genotoxic agent in terms of the concentration necessary to double the background measures, cytotoxicity strongly limited the concentration range that produced interpretable results. This may explain some of the inconclusive results and indicates that nongenotoxic effects must be taken into account in the discussion of modes of toxic and carcinogenic action of furan.
KW  - Metabolismus
KW  - Mutagenität
KW  - Biomarker
KW  - Furan
KW  - LC-MS
KW  - Harn
KW  - cis-2-Buten-1
KW  - 4-dial
KW  - Gentoxizität
KW  - furan
KW  - metabolism
KW  - biomarker
KW  - mutagenicity
KW  - genotoxicity
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28716
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TY  - THES
A1  - Kestler, Christian
T1  - Untersuchungen über die Dimerisierung der HAD-Phosphatase Chronophin
T1  - Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin
N2  - Phosphatasen der HAD (haloacid dehalogenase)-Familie sind weit verbreitet in allen Domänen des Lebens und erfüllen die verschiedensten zellulären Aufgaben, beispielsweise in Metabolismus und Zellregulation. Die HAD-Phosphatase Chronophin zeigt Phosphataseaktivität unter anderem gegenüber Pyridoxal-5‘-Phosphat (PLP), einem essentiellen Kofaktor vieler biochemischer Prozesse, und Phosphocofilin, einem Regulator des Aktinzytoskeletts. Chronophin dimerisiert über die Interaktion zweier identischer Untereinheiten zu einem Homodimer. Ziel dieser Arbeit war, die Rolle dieser Dimerisierung, eines bei HAD-Phosphatasen weit verbreiteten Oligomerisierungszustandes, näher zu untersuchen.
Hierzu wurde die Dimerisierung erfolgreich durch den Austausch der Aminosäuren Alanin 194 und 195 zu Lysinen (Mutation A194K/A195K) gestört. Der Nachweis einer konstitutiv monomeren Chronophin-Mutante mittels Größenausschlusschromatographie, Rasterkraftmikroskopie, analytischer Ultra¬zentrifugation und Zellexperimenten wurde schließlich über die Struktur¬auflösung mittels Röntgenstrukturanalyse bestätigt. Aktivitätsmessungen der monomeren Mutante gegenüber dem Substrat PLP zeigten eine deutliche Verminderung der Phosphataseaktivität. Die Röntgenstrukturanalyse von Chronophin A194K/A195K im Vergleich mit Wildtyp-Chronophin enthüllte einen Mechanismus, wie die sogenannte Substratspezifitätsschleife, die für die korrekte Positionierung des PLP sorgt, im Homodimer des Wildtyps durch Interaktionen mit dem zweiten Protomer stabilisiert wird. Diese Stabilisierung fehlt bei der monomeren Mutante und äußert sich in einer veränderten Stellung der Substratspezifitätsschliefe. Der Strukturvergleich von Chronophin mit weiteren HAD-Phosphatasen der selben strukturellen Untergruppe vom C2a-Typ lässt eine allgemeine Gültigkeit der hier beschriebenen allosterischen Kontrolle von Substratspezifität über Homodimerisierung bei HAD-Phosphatasen vermuten und könnte so neue Ansatzpunkte für möglicherweise auch therapeutisch nutzbare Aktivitätshemmungen liefern.
N2  - Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin
KW  - Dimerisierung
KW  - Phosphatasen
KW  - Pyridoxalphosphat
KW  - Ortspezifische Mutagenese
KW  - Chronophin
KW  - Substratspezifitätsschleife
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149777
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kircher, Malte Tim
T1  - Neuronale Genotoxizität von Angiotensin II
T1  - Neuronal Genotoxicity of Angiotensin II
N2  - In recent decades, the acceptance has steadily increased that oxidative stress plays an important role in the development of chronic diseases, malignant neoplasia and the acceleration of the aging process. As one of the most common chronic diseases, hypertension is often associated with a misregulated renin-angiotensin-aldosterone system that causes chronic oxidative stress. Hypertension is a risk factor for neurological diseases such as vascular dementia (VaD) and many neurological disorders, including VaD, have an ROS-associated or inflammatory component in their etiology.
Our group has already demonstrated AT-II-induced genotoxicity in kidney and myocardial cells and tissues. The aim of this dissertation was to investigate a possible association between AT-II and neurodegeneration that is triggered by neuronal genotoxicity of AT-II.
First, we showed in two neuronal cell lines that AT-II causes dose-dependent genome damage. Subsequent experiments could attribute this toxicity to NOX-produced superoxide generated after AT-II binding to the AT1R. In addition, AT-II-induced depletion of the most important intracellular antioxidant - glutathione - was demonstrated.
In vivo, we were able to show that AT1aR knockout mice after AT-II treatment showed significantly more genome damage in the subfornic organ (SFO) than wild-type mice. The SFO is one of the few structures in the brain with an interrupted blood-brain barrier, which makes it accessible and particularly sensitive to circulating AT-II. In the recent literature, these genome damages were also observed in kidney and heart tissues and prove an additional genotoxicity of AT-II independent of AT1aR and consequently independent of blood pressure.
In summary, this work shows that increased AT-II levels in neuronal cells cause genome damage due to NOX-produced superoxide. It is hoped that these results will one day help to decipher the complete development of VaD.
N2  - In den letzten Jahrzehnten ist die Akzeptanz stetig größer geworden, dass oxidativer Stress eine bedeutende Rolle bei der Entstehung von chronischen Erkrankungen, malignen Neoplasien sowie der Beschleunigung des Alterungsprozesses spielt. Als eine der häufigsten chronischen Erkrankungen ist Hypertonie oft mit einem fehlregulierten Renin-Angiotensin-Aldosteron-System assoziiert, welches chronisch oxidativen Stress verursacht. Bluthochdruck ist ein Risikofaktor für neurologische Erkrankungen wie der vaskulären Demenz (VaD) und viele neurologischen Störungen, einschließlich der VaD, haben eine ROS-assoziierte beziehungsweise inflammatorische Komponente in ihrer Entstehung. 
Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits eine AT-II-induzierte Genotoxizität in Nieren- und Myokardzellen bzw. -Gewebe nachweisen. Ziel dieser Dissertation war es, einen möglichen Zusammenhang zwischen AT-II und Neurodegeneration zu untersuchen, welche durch eine neuronale Genotoxizität von AT-II ausgelöst wird.
Zunächst zeigten wir in zwei neuronalen Zelllinien, dass AT-II eine Dosis-abhängige Genomschädigung verursacht. Nachfolgende Experimente konnten diese Toxizität auf NOX-produziertes Superoxid zurückführen, das nach Bindung von AT-II an den AT1R generiert wird. Zudem konnte ein AT-II-induzierter Verbrauch des wichtigsten intrazellulären Antioxidans – Glutathion - nachgewiesen werden.
In vivo konnten wir zeigen, dass AT1aR-Knockout-Mäuse nach AT-II-Behandlung signifikant mehr Genomschäden im Subfornikalorgan (SFO) aufwiesen als Wildtypmäuse. Das SFO hat als eine der wenigen Strukturen im Gehirn eine unterbrochene Blut-Hirn-Schranke, was es für zirkulierendes AT-II zugänglich und besonders empfindlich macht. Diese Genomschäden wurden in der neueren Literatur auch in Nieren- und Herzgewebe beschrieben und belegen eine zusätzliche, AT1aR- und damit Blutdruck-unabhängige Genotoxizität von AT-II.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass erhöhte AT-II-Konzentrationen in Nervenzellen Genomschäden durch NOX-produziertes Superoxid verursachen. Die Hoffnung ist, dass diese Ergebnisse dabei helfen, eines Tages die vollständige Entstehung der VaD zu entschlüsseln.
KW  - Angiotensin II
KW  - Toxizität
KW  - Neuronale
KW  - toxicity
KW  - angiotensin II
KW  - neuronal
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-214273
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Kirchner, S.
A1  - Stopper, Helga
A1  - Papp, T.
A1  - Eckert, I.
A1  - Yoo, H. J.
A1  - Vig, B. K.
A1  - Schiffmann, D.
T1  - Cytogenetic changes in primary, immortalized and malignant mammalian cells
N2  - Some chromosomes in transformed rat cells and somatic cell hybrids fail to display the presence of kinetochore proteins as detected by antikinetochore antibodies. Suchchromosomes (K- Chromosomes) may constitute a novel mechanism for the genesis of aneuploidy. Wehave analyzed primary~ immortalized and malignant marnmalian cells for the presence of kinetochore proteins and micronuclei. Our resuJts suggest a correlation of the K- chromosome and micronucleus frequency with the variability in chromosome number. Upon in situ hybridization with the minor satellite and alpha satellite sequences some Kchromosomes showed a signal. This indicates that the observed lack of kinetocbores is not necessarily due to a lack of centromeric DNA. We conclude that dislocated K- chromosomes may become incorporated into micronuclei which are prone to loss. Such events would be associated with the generation of aneuploidy.
KW  - Toxikologie
KW  - Micronuclei
KW  - Kinetochore
KW  - Chromosome distribution
Y1  - 1993
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63439
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klaunig, James E.
A1  - Dekant, Wolfgang
A1  - Plotzke, Kathy
A1  - Scialli, Anthony R.
T1  - Biological relevance of decamethylcyclopentasiloxane (D5) induced rat uterine endometrial adenocarcinoma tumorigenesis: Mode of action and relevance to humans
JF  - Regulatory Toxicology and Pharmacology
N2  - Decamethylcyclopentasiloxane (D5) is a cyclic siloxane used in the production and formulation of consumer products with potential exposure to manufacturing workers, consumer, and the general public. Following a combined 2-year inhalation chronic bioassay performed in Fischer 344 (F344) rats, an increase in uterine endometrial adenocarcinomas was noted at the highest concentration to which animals were exposed. No other neoplasms were detected. In this study, a dose of 160 ppm produced an incidence of 8% endometrial adenocarcinomas. Based on a number of experimental studies with D5, the current manuscript examines the biological relevance and possible modes of action for the uterine endometrial adenocarcinomas observed in the rat following chronic exposure to D5. Variable rates of spontaneous uterine endometrial adenocarcinomas have been reported for untreated F344 CrIBr rats. As such, we concluded that the slight increase in uterine endometrial adenocarcinomas observed in the D5 chronic bioassay might not be the result of D5 exposure but may be related to variability of the spontaneous tumor incidence in this strain of rat. However, if the uterine endometrial adenocarcinomas are related to D5-exposure, alteration in the estrous cycle in the aging F344 rat is the most likely mode of action. D5 is not genotoxic or estrogenic. The alteration in the estrous cycle is caused by a decrease in progesterone with an increase in the estrogen:progesterone ratio most likely induced by a decrease in prolactin concentration. Available data support that exposure to D5 influences prolactin concentration. Although the effects on prolactin concentrations in a number of experiments were not always consistent, the available data support the conclusion that D5 is acting via a dopamine receptor agonist-like mechanism to alter the pituitary control of the estrous cycle. In further support of this mode of action, studies in F344 aged animals showed that the effects of D5 on estrous cyclicity produced a response consistent with a dopamine-like effect and further suggest that D5 is accelerating the aging of the reproductive endocrine system in the F344 rat utilized in this study. This mode of action for uterine endometrial adenocarcinoma tumorigenesis is not relevant for humans.
KW  - Reproductive toxicity
KW  - Carcinogenicity
KW  - Silicones
KW  - Enzyme induction
KW  - Uterine tumors
KW  - Rat
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190952
VL  - 74
IS  - Supplement
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klenk, Christoph
A1  - Hommers, Leif
A1  - Lohse, Martin J.
T1  - Proteolytic cleavage of the extracellular domain affects signaling of parathyroid hormone 1 receptor
JF  - Frontiers in Endocrinology
N2  - Parathyroid hormone 1 receptor (PTH1R) is a member of the class B family of G protein-coupled receptors, which are characterized by a large extracellular domain required for ligand binding. We have previously shown that the extracellular domain of PTH1R is subject to metalloproteinase cleavage in vivo that is regulated by ligand-induced receptor trafficking and leads to impaired stability of PTH1R. In this work, we localize the cleavage site in the first loop of the extracellular domain using amino-terminal protein sequencing of purified receptor and by mutagenesis studies. We further show, that a receptor mutant not susceptible to proteolytic cleavage exhibits reduced signaling to G\(_s\) and increased activation of G\(_q\) compared to wild-type PTH1R. These findings indicate that the extracellular domain modulates PTH1R signaling specificity, and that its cleavage affects receptor signaling.
KW  - GPCRs
KW  - parathyroid hormone 1 receptor
KW  - matrix metalloproteinase
KW  - ectodomain cleavage
KW  - biased signaling
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-262055
SN  - 1664-2392
VL  - 13
ER  - 
TY  - THES
A1  - Klenk, Johann Christoph
T1  - Effekte von Parathormon auf die Struktur und Komplexierung des Parathormonrezeptors 1
T1  - Effects of parathyroid hormone on the structure and complexation of parathyroid hormone receptor 1
N2  - Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR.
N2  - The Parathyroid hormone receptor type 1 (PTHR) belongs to the class 2 of G-protein coupled receptors (GPCRs) and is the main regulator of calcium homeostasis of the body. The first part of the dissertation describes a novel mechanism of receptor regulation based on a proteolytic cleavage of the receptor’s extracellular domain. Prolonged stimulation with PTH led to an apparent increase in molecular mass and in stability of the PTHR. Biochemical analysis of the receptor protein revealed that the PTHR undergoes posttranslational cleavage. Agonistic but not antagonistic PTH-peptides prevented this cleavage, thereby stabilizing the molecular mass and also increasing the half life of the receptor. The cleavage was shown to occur within an unstructured stretch of the extracellular domain of the receptor, which connects two parts required for ligand binding and which is unique in the PTHR amongst all class 2 GPCRs. The cleaved N-terminal fragment was further connected by a disulfide bridge and could only be released by reducing agents. By testing a panel of different protease inhibitors, a protease belonging to the family of zinc-dependent metalloproteases could be identified to be responsible for the PTHR cleavage. Thus, these findings describe a new mechanism how PTHR homeostasis may be regulated. In the second part, the interaction between the adaptor proteins NHERF1 and beta-arrestin2 with the PTHR was assessed. Both proteins interacted independently with the receptor. While NHERF1 formed a constitutive interaction with the PTHR C-terminus, beta-arrestin2-binding required activation of the receptor. Using biochemical and microscopic methods it was shown that both proteins formed a ternary complex with the receptor. This complex was mediated by a direct interaction between NHERF1 and beta-arrestin2 which has been identified in this work. As a consequence, NHERF1 leads to a coupling of beta-arrestin2 close to the PTHR. Association kinetics of beta-arrestin2 with the PTHR measured by fluorescent resonance energy transfer were two-fold increased in the presence of NHERF, suggesting that the ternary complex facilitates the desensitization of the PTHR by beta-arrestin2.
KW  - Parathormon
KW  - Proteolyse
KW  - Endokrinologie
KW  - Calcium
KW  - Rezeptor
KW  - Retinales S-Antigen
KW  - GPCR
KW  - Matrix-Metalloprotease
KW  - NHERF
KW  - Signaltransduktion
KW  - G-Protein
KW  - GPCR
KW  - Matrix-Metalloproteinase
KW  - NHERF
KW  - signal transduction
KW  - G-protein
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47288
ER  - 
TY  - THES
A1  - Klenk, Johann Christoph
T1  - Posttranslationale Modifikation von Phosducin durch den small ubiquitin-related modifier "SUMO"
T1  - Posttranslational modification of phosducin with the small ubiquitin-related modifier 'SUMO'
N2  - Die Rezeptor vermittelte Aktivierung heterotrimerer G-Proteine ist einer der bedeutendsten Signaltransduktionsmechanismen in vielen Organismen. Die Vielzahl unterschiedlicher Rezeptoren und Agonisten macht eine effektive Kontrolle des einzelnen Signals unumgänglich. Das zytosolische Protein Phosducin bindet beta-gamma-Untereinheiten aktivierter G-Proteine und hemmt damit sowohl Gbeta-gamma-vermittelte Effekte als auch Galpha-vermittelte Effekte. In der vorliegenden Arbeit wurde neben der bekannten 33 kDa Form von Phosducin eine weitere 47 kDa große Form in der Retina und im Herz identifiziert. Hierbei handelte es sich um Phosducin, welches mit dem small ubiquitin-related modifier, SUMO, modifiziert war. Weiterhin wurde sowohl in vitro als auch in zellulären Sytemen gezeigt, dass Phosducin mit einem Molekül SUMO an Lysin 33 modifiziert wird. Durch punktgerichtete Mutation dieser Modifikationsstelle wurde eine SUMOylierungs-defiziente Phosducin-Mutante generiert. Diese Mutante unterliegt einem gesteigerten Turnover im Vergleich zu Wildtyp-Phosducin, welcher auf die verstärke Ubiquitinierung und dem damit verbundenen proteasomalen Abbau der Mutante zurückzuführen war. Dies demonstriert, dass SUMOylierung von Phosducin protektive Wirkung auf dieses Protein hat. Darüberhinaus behindert die SUMOylierung von Phosducin dessen Bindung an Gbeta-gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine. Diese Beobachtungen erlauben den Schluss, dass SUMOylierung neben der Phosphorylierung ein neuer und wichtiger Mechanismus ist, über den die Verfügbarkeit von Phosducin als G-Protein-Regulator kontrolliert wird.
N2  - Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins is one of the most important signalling mechanisms in many organisms. The variety of different receptors and ligands require a tight control of the individual signalling processes. The cytosolic protein Phosducin has been show to tightly bind to Gbeta-gamma subunits of heterotrimeric G-proteins thereby attenuating Gbeta-gamma and G-alpha mediated signals. In the present study a previously unknown 47 kDa high molecular isoform of 33 kDa protein phosducin was identified in the retina and the heart. This isoform was shown to be phosducin modified with the small ubiquitin-related modifier SUMO. Further experiments in vitro and in cells revealed that phosducin is modified with SUMO at lysine 33. Mutation of lysine 33 abolished SUMOylation of phosducin. Compared to wild-type phosducin the SUMOylation-deficient mutant of phosducin revealed reduced steady state protein levels and increased ubiquitination. This suggests that SUMOylation is protecting phosducin from ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Moreover, SUMOylation of phosducin decreased its ability to bind to Gbeta-gamma subunits of heterotrimeric G-proteins. Together, these findings show that phosducin is a previously unrecognized target of SUMO modification, and that SUMOylation controls phosducin stability in cells as well as its functional properties.
KW  - SUMO
KW  - Ubiquitin
KW  - Phosducin
KW  - G-Protein
KW  - posttranslationale Modifikation
KW  - SUMO
KW  - ubiquitin
KW  - phosducin
KW  - G-protein
KW  - posttranslational modification
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19140
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Barbara
A1  - Mentrup, Birgit
A1  - Regensburger, Martina
A1  - Zeck, Sabine
A1  - Schneidereit, Jutta
A1  - Schupp, Nicole
A1  - Linden, Christian
A1  - Merz, Cornelia
A1  - Ebert, Regina
A1  - Jakob, Franz
T1  - 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Treatment Delays Cellular Aging in Human Mesenchymal Stem Cells while Maintaining Their Multipotent Capacity
JF  - PLoS ONE
N2  - 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25D3) was reported to induce premature organismal aging in fibroblast growth factor-23 (Fgf23) and klotho deficient mice, which is of main interest as 1,25D3 supplementation of its precursor cholecalciferol is used in basic osteoporosis treatment. We wanted to know if 1,25D3 is able to modulate aging processes on a cellular level in human mesenchymal stem cells (hMSC). Effects of 100 nM 1,25D3 on hMSC were analyzed by cell proliferation and apoptosis assay, beta-galactosidase staining, VDR and surface marker immunocytochemistry, RT-PCR of 1,25D3-responsive, quiescence-and replicative senescence-associated genes. 1,25D3 treatment significantly inhibited hMSC proliferation and apoptosis after 72 h and delayed the development of replicative senescence in long-term cultures according to beta-galactosidase staining and P16 expression. Cell morphology changed from a fibroblast like appearance to broad and rounded shapes. Long term treatment did not induce lineage commitment in terms of osteogenic pathways but maintained their clonogenic capacity, their surface marker characteristics (expression of CD73, CD90, CD105) and their multipotency to develop towards the chondrogenic, adipogenic and osteogenic pathways. In conclusion, 1,25D3 delays replicative senescence in primary hMSC while the pro-aging effects seen in mouse models might mainly be due to elevated systemic phosphate levels, which propagate organismal aging.
KW  - perspectives
KW  - bone marrow
KW  - mutant mice
KW  - oxidative stress
KW  - transcription factors
KW  - vitamin-D-receptor
KW  - differentiation
KW  - tissue
KW  - 2',7'-dichlorofluorescin
KW  - homeostasis
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133392
VL  - 7
IS  - 1
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Cristalli, G.
A1  - Grifantini, M.
A1  - Vittori, S.
A1  - Lohse, M. J.
T1  - Photoaffinity labeling of A\(_1\) adenosine receptors
JF  - The journal of biological chemistry
N2  - The ligand-binding subunit of the A\(_1\)-adenosine receptor has been identified by photoaffinity labeling. A photolabile derivative of R- \(N^6\)-phenylisopropyladenosine, R-2-azido-\(N^6\)-p-hydroxyphenylisopropyladenosine (R-AHPIA), has been synthesized as a covalent specific Iigand for A\(_1\)-adenosine receptors. In adenylate cyclase studies with membranes of rat fat cells and human platelets, R·AHPIA has adenosine receptor agonist activity with a more than 60-fold selectivity for the A\(_1\)-subtype. It competes for [\(^3\)H].\(N^6\)- phenylisopropyladenosine binding to Arreceptors of rat brain membranes with a Ki value of 1.6 nM. After UV irradiation, R-AHPIA binds irreversibly to the receptor, as indicated by a loss of [\(^3\)H)\(N^6\)-phenylisopropyladenosine binding afterextensive washing; the K; value for this photoinactivation is 1.3 nM. The p-hydroxyphenyl substituent of R-AHPIA can be directly radioiodinated to give a photoaffinity Iabel of high specific radioactivity (\(^{125}\)I-AHPIA). This compound has a KD value of about 1.5 nM as assessed from saturation and kinetic experiments. Adenosine analogues compete for \(^{125}\)I-AHPIA binding to rat brain membranes with an order of potency characteristic for A\(_1\)-adenosine receptors. Dissociation curves following UV irradiation at equilibrium demonstrate 30-40% irreversible specific binding. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis indicates that the probe is photoincorporated into a single peptide of M\(_r\) = 35,000. Labeling of this peptide can be blocked specifically and stereoselectively by adenosine receptor agonists and antagonists in a manner which is typical for the A\(_1\)-subtype. The results indicate that \(^{125}\)I-AHPIA identifies the ligand-binding subunit of the A\(_1\)-adenosine receptor, which is a peptide with M\(_r\) = 35,000.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1985
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60198
VL  - 27
IS  - 260
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Jesaitis, A. J.
T1  - Neutrophil chemoattractant receptors and the membrane skeleton
N2  - Signal transduction via receptors for N-formylmethionyl peptide chemoattractants (FPR) on human neutrophils is a highly regulated process which involves participation of cytoskeletal elements. Evidence exists suggesting that the cytoskeleton and/or the membrane skeleton controls the distributJon of FPR in the plane of the plasma membrane, thus controlling the accessibility of FPR to different proteins in functionally distinct domains. In desensitized cells, FPR are restricted todomains which are depleted of G proteins but enriched in cytoskeletal proteins such as actin and fodrin. Thus, the G protein signal transduction partners of FPR become inaccessible to the agonist-occupied receptor, preventing cell activation. The mechanism of interaction of FPR with the membrane skeleton is poorly understood but evidence is accumulating that suggests a direct binding of FPR (and other receptors) to cytoskeletal proteins such as actin.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60471
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Jesaitis, A. J.
T1  - Physical coupling of N-formyl peptide chemoattractant receptors to G protein is not affected by desensitization
N2  - Desensitization of N-formyl peptide chemoattractant receptors (FPR) in human neutrophils results in association of these receptors to the membrane skeleton. This is thought to be the critical event in the lateral segregation of receptors and guanyl nucleotide-binding proteins (G proteins) within the plane of the plasma membrane resulting in an interruption of the signaling cascade. In this study we probed the interaction of FPR with G protein in human neutrophils that were desensitized to various degrees. Human neutrophils were desensitized using the photoreactive agonist N-formyl-met-leu-phelys- N\(^\epsilon\)-[\(^{125}\)I]2(p-azidosalicylamido )ethyl-1 ,3 '-dithiopropionate (/MLFK-[\(^{125}\)I]ASD). The interaction if FPR with G protein was studied via a reconstitution assay and subsequent analysis of FPR-G protein complexes in sucrose density gradients. FPR-G protein complexes were reconstituted with solubilized FPR from partially and fully desensitized neutrophils with increasing concentrations of Gi purified from bovine brain. The respective EC\(_{50}\) values for reconstitution were similar to that determined for FPR from unstimulated neutrophils (Bommakanti RK et al., J Bio[ Chem 267: 757~7581, 1992). We conclude, therefore, that the affinity of the interaction of FPR with G protein is not affected by desensitization, consistent with the model of lateral segregation of FPR and G protein as a mechanism of desensitization.
KW  - Toxikologie
KW  - chemotactic receptors
KW  - G proteins
KW  - N-formyl peptides
KW  - signal transduction
KW  - receptor-G protein coupling
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60483
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Jesaitis, A. J.
T1  - The interaction of N-formyl peptide chemoattractant receptors with the membrane skeleton is energy-dependent
N2  - Desensitization of N-fonnyl peptide chemoattractant receptors (FPR) in human neutrophils is thought to be achieved by lateral segregation of receptors and G proteins within the plane of the plasma membrane resulting in an interruption of the signalling cascade. Direct coupling of FPR to membrane skeletal actin appears to be the basis of this process~ however, the molecular mechanism is unknown. In this study we investigated the effect of energy depletion on formation of FPR-membrane skeleton complexes. In addition the effect of the protein kinase C inhibitor stauroporine and the phosphatase inhibitor okadaic acid on coupling of FPR to the membrane skeletonwas studied. Human neutrophils were desensitized using the photoreactive agonist N-formy1-met-leu-phe-1ys-N'[\(^{125}\)I]2(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'-dithiopropionate (fMLFK-[\(^{125}\)I]ASD) after ATP depletion with NaF or after incubation with the respective inhibitors. The interaction of FPR with the membrane skeleton was studied by Sedimentation of the membrane skeleton-associated receptors in sucrose density gradients. Energy depletion of the cells markedly inhibited the formation of FPR-membrane skeleton complexes. This does not appear tobe related to inhibition of protein phosphorylation due to ATP depletion because inhibition of protein kinases and phosphatases bad no significant effect on coupling of FPR to the membrane skeleton. We conclude, therefore, that coupling of FPR to the membrane skeleton is an energy,dependent process which does not appear to require modification of the receptor protein by phosphorylation.
KW  - Toxikologie
KW  - Chemotactic receptors
KW  - G proteins
KW  - N-formyl peptides
KW  - signal transduction
KW  - desensitization
KW  - membrane skeleton
KW  - receptor-G protein coupling.
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60499
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Keil, R.
A1  - Zimmer, F. J.
A1  - Schwabe, U.
T1  - Guanine nucleotide effects on 8-cyclopentyl-1,3-[\(^3\)H]dipropylxanthine binding to membrane-bound and solubilized A\(_1\) adenosine receptors of rat brain
N2  - The effects of guanine nucleotides on binding of 8-cyclopentyl-1,3-[\(^3\)H]dipropylxanthine [\(^3\)H]DPCPX), a highly selective A\(_1\) adenosine receptor antagonist, have been investigated in rat brain membranes and solubilized A\(_1\) receptors. GTP, which induces uncoupling of receptors from guanine nucleotide binding proteins, increased binding of [\(^3\)H]DPCPX in a concentration-dependent manner. The rank order of potency for different guanine nucleotides for increasing [\(^3\)H]DPCPX bindingwas the same as for guanine nuc1eotide-induced inhibition of agonist binding. Therefore, a role for a guanine nucleotide binding protein, e.g., G\(_i\), in the regulation of antagonist binding is suggested. This was confirmed by inactivation ofGi by N-ethylmaleimide (NEM) treatment of membranes, which resulted in an increase in [\(^3\)H]DPCPX binding similar to that seen with addition of GTP. Kinetic and equilibrium binding studies showed that the GTP- or NEM-induced increase in antagonist binding was not caused by an affinity change of A\(-1\) receptors for [\(^3\)H]DPCPX but by an increased Bmu value. Guanine nucleotides had similar effects on membrane-bound and solubilized receptors, with the effects in the solubilized system being more pronounced. In the absence of GTP, when rnost receptors are in a high-affinity state for agonists, only a few receptors are labeled by [\(^3\)H]DPCPX. It is suggested that [\(^3\)H]DPCPX binding is inhibited when receptors are coupled to G\(_i\). Therefore, uncoupling of A\(_1\) receptors from G\(_i\) by guanine nucleotides or by inactivation of G\(_i\) with NEM results in an increased antagonist binding. 
Key Words: Adenosine receptors-8 -Cyclopentyl-1,3-eH]dipropylxanthine-Antagenist binding-Guanine nucleotide effects. Klotz K.-N. et al. Guanine nucleotide etfects on 8-cyclopentyl-1 ,3-eH]dipropylxanthine binding to membrane-bound and solubilized A1 adenosine receptors of rat brain. J. Neurochem. 54, 1988-1994 (1990).
KW  - Toxikologie
Y1  - 1990
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60369
ER  - 
TY  - CHAP
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Keil, Roger
A1  - Zimmer, Franz-Josef
A1  - Schwabe, Ulrich
T1  - Modulation of (§H) DPCPX binding to membrane-bound ans solubilized A1 adenosine receptors by guanine nucleotides
N2  - No abstract available
KW  - Adenosinrezeptor
Y1  - 1989
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86153
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Krotec, K. L.
A1  - Gripentrog, J.
A1  - Jesaitis, A. J.
T1  - Regulatory interaction of N-formyl peptide chemoattractant receptors with the membrane skeleton in human neutrophils
N2  - The cytoskeleton and/or membrane skeleton has been implicated in the regulation of N-formyl peptide receptors. The coupling of these chemotactic receptors to the membrane skeleton was investigated in plasma membranes from unstimulated and desensitized human neutrophils using the photoreactive agonist N-formyl-met-leu-phelys-N\(^6\)-[\(^{125}\)I]2(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'-dithiopropionate (fMLFK-[\(^{125}\)I]ASD). When membranes of unstimulated cells were solubilized in Triton-X 100, a detergent that does not disrupt actin filaments, only 50% of the photoaffinity-labeled receptors were solubilized sedimenting in sucrose density gradients at a rate consistent with previous reports. The remainder were found in the pellet fraction along with the membrane skeletal actin. Solubilization of the membranes in the presence of p-chloromercuriphenylsulfonic acid, elevated concentrations of KCI, or deoxyribonuclease I released receptors in parallel with actin. When membranes from neutrophils, desensitized by incubation with fMLFK-e 251]ASD at 15°C, were solubilized, nearly all receptors were recovered in the pellet fraction. lncubation of cells with the Iigand at 4°C inhibited desensitization partially and prevented the conversion of a significant fraction of receptors to the form associated with the membrane skeletal pellet. ln these separations the photoaffinity-labeled receptors not sedimenting to the pellet cosedimented with actin. Approximately 25% of these receptors could be immunosedimented with antiactin antibodies suggesting that N-formyl peptide receptors may interact directly with actin. These results are consistent with a regulatory role for the interaction of chemotactic N-formyl peptide receptors with actin of the membrane skeleton.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60466
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lohse, M. J.
T1  - The glycoprotein nature of A\(_1\) adenosine receptors
N2  - A\(_1\) adenosine receptors from different tissues and species we~e photoaffinity labelled and then the carbohydrate content was examined by both enzymatic and chemical treatment. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of the labelled membrane receptors shows that neuraminidase treatment alters the electrophoretic mobility of the receptor band indica ting the presence of terminal neurandnie acids. Neuraminidase digestion does not influence the binding characteristics of the receptor. The totally deglycosylated receptor protein obtained by chemical treatment has an apparent molecular weight Of 32,000.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1986
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60231
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Schwabe, U.
T1  - Chemical modification of A\(_1\) adenosine receptors in rat brain membranes - evidence for histidine in different domains of the ligand binding site
N2  - Chemical modification of amino acid residues was used to probe the ligand recognition site of A\(_1\) adenosine receptors from rat brain membranes. The effect of treatment with group·specific reagents on agonist and antagonist radioligand binding was investigated. The histidine-specific reagent diethylpyrocarbonate (DEP) induced a loss of binding of the agonist R-N\(^6\)-[\(^3\)H]phenylisopropyladenosine ([\(^3\)H]PIA), which could be prevented in part by agonists, but not by antagonists. DEP treatment induced also a loss of binding of the antagonist [\(^3\)H]8- cyclopentyl-1 ,3-dipropylxanthine ([\(^3\)H]DPCPX). Antagonists protected A\(_1\) receptors from this inactivation while agonists did not. This result provided evidence for the existence of at least 2 different histidine residues involved in ligand binding. Consistent with a modification of the binding site, DEP did not alter the affinity of [\(^3\)H]DPCPX, but reduced receptor number. From the selective protection of [\(^3\)H] PIA and [\(^3\)H]DPCPX binding from inactivation, it is concluded that agonists and antagonists oocupy different domains at the binding site. Sulfhydryl modifying reagents did not influence antagonist binding, but inhibited agonist binding. This effect is explained by modification of tbe inhibitory guanine nucleotide binding protein. Pyridoxal 5-phosphate inactivated both [\(^3\)H]PIA and [\(^3\)H]DPCPX binding, but the receptors could not be protected from inactivation by ligands. Therefore, no amino group seems to be located at the Iigand binding site. In addition, it was shown that no further amino acids witb polar side chains are present. The absence of bydrophilic amino acids frout the recognition site of the receptor apart from histidine suggests an explanation for the lack of hydrophilic ligands with high affinity for A\(_1\) receptors.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1988
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60295
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Schwabe, U.
T1  - Characterization of the solubilized A\(_1\) adenosine receptor from rat brain membranes
N2  - A\(_1\) adenosine receptors from rat brain membranes were solubilized with the zwitterionic detergent 3-[3-( cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate. The solubilized receptors retained all the characteristics of membrane-bound A\(_1\) adenosine receptors. A high and a low agonist affinity state for the radiolabelled agonist (R)-\(N^6\)-[\(^3\)H]phenylisopropyladenosine([\(^3\)H]PJA) with K\(_D\) values of 0.3 and 12 nM, respectively, were detected. High-affinity agonist binding was regulated by guanine nucleotides. In addition agonist binding was still modulated by divalent cations. The solubilized A\(_1\) adenosine receptors could be labelled not only with the agonist [\(^3\)H]PIA but also with the antagonist I ,3-diethyi-8-[\(^3\)H]phenylxanthine. Guanine nucleotides did not affect antagonist binding as reported for membrane-bound receptors. These results suggest that the solubilized receptors are still coupled to the guanine nucleotide binding protein N; and that all regulatory functions are retained on solubilization. Key Words: A1 adenosine receptors - Solubilization- Rat brain membranes. Klotz K.-N. et al. Characterization of the solubilized A1 adenosine receptor from rat brain membranes. J. Neurochem. 46, 1528-1534 (1986).
KW  - Toxikologie
KW  - A1 adenosine receptors
KW  - solubilization
KW  - rat brain membranes
Y1  - 1986
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60222
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Schwabe, U.
A1  - Cristalli, G.
A1  - Vittori, S.
A1  - Grifantini, M.
T1  - 2-Chloro-N\(^6\)-[\(^3\)H]cyclopentyladenosine ([\(^3\)H]CCPA) - a high affinity agonist radioligand for A\(_1\) adenosine receptors
N2  - The tritiated analogue of 2-chloro-N6-cyclopentyladenosine (CCPA), an adenosine derivative with subnanomolar affinity and a 10000-fold selectivity for A1 adenosine receptors, has been examined as a new agonist radioligand. [3H]CCP A was prepared with a specifi.c radioactivity of 1.58 TBqjmmol ( 43 Ci/mmol) and bound in a reversible manner to A1 receptors from rat brain membranes with a high affinity K0 -value of 0.2 nmol/1. In the presence of GTP a K0 -value of 13 nmol/1 was determined for the low affinity state for agonist binding. Competition of several adenosine receptor agonists and antagonists for [3H]CCPA binding to rat brain membranes confrrmed binding to an A1 receptor. Solubilized A1 receptors bound [3H]CCPA with similar affinity for the high affinity state. At solubilized receptors a reduced association rate was observed in the presence of MgC12, as has been shown for the agonist [ 3H]N6-phenylisopropyladenosine ([3H]PIA). [3H]CCPA was also used for detection of A1 receptors in rat cardio myocyte membranes, a tissue with a very low receptor density. A K0 -value of 0.4 nmol/1 and a Bmax-value of 16 fmol/ mg protein was determined in these membranes. In human platelet membranes no specific binding of [3H]CCPA was measured at concentrations up to 400 nmoljl, indicating that A2 receptors did not bind [3H]CCPA. Based on the subnanomolar affinity and the high selectivity for A1 receptors [ 3H]CCPA proved to be a useful agonist radioligand for characterization of A 1 adenosine receptors also in tissues with very low receptor density.
KW  - Toxikologie
KW  - Adenosine receptors
KW  - Radioligauds
KW  - agonists
Y1  - 1989
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60328
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Vogt, H.
A1  - Tawfik-Schlieper, H.
T1  - Comparison of A\(_1\) adenosine receptors in brain from different species by radioligand binding and photoaffinity labelling
N2  - Radioligand binding to A\(_1\) adenosine receptors at brain membranes from seven species was investigated. The antagonist 8-cyclopentyl-1 ,3-[\(^3\)H]dipropylxanthine ([\(^3\)H]DPCPX) bound with affinities between 0.17 nM in sheep brain and 2.1 nM in guinea pig brain. Competition of several antagonists for [\(^3\)H]DPCPX binding showed that the most potent compounds were DPCPX with K\(_i\) values of 0.05 nM in bovine brain and 1.1 nM in guinea pig brain and xanthine amine congener (XAC) with K\(_i\) values of 0.03 nM in bovine brain and 5.5 nM in guinea pig brain. The differences in affinity of the agonist radio Iigand 2-chloro-N\(^6\) -[\(^3\)H]cyclopen tyladenosine ([\(^3\)H]CCP A) were less pronounced, rauging from a K\(_D\) value of 0.12 nM (hamster brain) to 0.42 nM (guinea pig brain). Agonist competition for [\(^3\)H]DPCPX binding of photoaffinity labelling, however, exhibited marked species differences. N-Ethylcarboxamidoadenosine (NECA) and S-N\(^6\)-phenylisopropyladenosine (S-PIA) showed 20 to 25-fold different K\(_D\) values in different species. NECA had a particularly high affinity in guinea pig brain and was only two-fold less potent than R-PIA. Thus, the difference from the "classical" A\(_1\) receptor profile (R-PIA > -NECA > S-PIA) is not sufficient to speculate that A\(_1\) receptor subtypes may exist that are coupled to different effector systems. Our data show that these difference can easily be explained by species differences.
KW  - Toxikologie
KW  - A1 adenosine receptors
KW  - Species differences
KW  - Radioligand binding
KW  - Photoaffinity labelling
Y1  - 1991
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60388
ER  -