TY - THES A1 - Bayer, Tanja T1 - Toxicity and biotransformation of 1,1,1,3,3-Pentafluoropropane, 3,3,3-Trifluoropropionic acid and 1,1,1,3-Tetrachloropropane T1 - Toxizität und Biotransformation von 1,1,1,3,3-Pentafluorpropan, 3,3,3-Trifluorpropionsäure und 1,1,1,3-Tetrachlorpropan N2 - The biotransformation of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane was investigated in rats and in in vitro systems. First, the metabolites were identified in vivo using GC/MS and 19F NMR analysis. The main metabolite was identified as trifluoroacetic acid, the minor metabolite as 3,3,3-trifluoropropionic acid and as a cleavage product, inorganic fluoride was found. As the in vitro system, liver microsomes from rat and human samples and rat liver homogenates were used. Trifluoroacetic acid and 3,3,3 trifluoropropionic acid were confirmed in vitro as metabolic intermediates, following biotransformation of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane by the cytochrome P-450-system. Studies, designed for clarifying the cardiotoxicity of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane were driven by the hypothesis that 3,3,3-trifluoropropionic acid is the toxic agent. This was based on the lethal toxicity, which was observed in previous in vivo experiments. In addition, the point of its structural similarity to toxic agents as for example monofluoroacetic acid or of possible metabolic intermediates like difluoroacrylic acid with known toxicity were considered to support this assumption. However, trifluoroacetic acid was neglected as the sought-after toxic agent because of its different toxic effects, known from literature. Investigations on the biotransformation of 3,3,3-trifluoropropionic acid were performed and resulted in no metabolic activity and in poor elimination of 3,3,3-trifluoropropionic acid in vivo. The histopathological effects on the heart, which were observed in the 90-day oral toxicity study of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane in rats, namely mononuclear inflammatory cell infiltrations and degenerated myocardial fibers, were not observed after a 28 day repeated exposure of up to 10 mg/kg b.w. of 3,3,3-trifluoropropionic acid. However, a single high dose of 3,3,3-trifluoropropionic acid lead to severe toxicological effects. The difference in the observed toxic effects after a single and repeated administration may be due to adaptive mechanisms in rats. The toxicological effects included clinical signs like ataxia, coma and cramps. The conditions of the rats suggested possible inhibition of the energy supply to the organism. Furthermore, the interference of 3,3,3-trifluoropropionic acid in the functionality of the organism was investigated. Experiments were performed in vitro in rat liver and heart mitochondria to investigate effects on the mitochondrial ß-oxidation. However, the transformation of the substrate [U14C] palmitic acid in the ß oxidation pathway was not inhibited by 3,3,3-trifluoropropionic acid. In addition, no cytotoxicity of 3,3,3 trifluoropropionic acid was observed in the cell culture systems. The main effect after a single dose of 3,3,3-trifluoropropionic acid was seen in clinical pathology and metabonomic analysis. The decrease in blood glucose is considered to have the most far-reaching consequences for the toxicity of 3,3,3-trifluoropropionic acid. If considering this change as the primary effect after a single dose, secondary effects, for example, the above-mentioned clinical signs could be explained. In addition, the observed high level of ketone bodies might have been responsible for life-threatening possible ketoacidosis. In general, ketoacidosis occurs after an imbalance between glycolysis, lipolysis, TCA cycle activity and respiratory function. Based on the results, ß-oxidation of fatty acids was not affected, and due to the decrease in glucose levels and the high levels of acetyl CoA, glycolysis was considered not to be impaired. Increased amounts of acetyl CoA might be a result of insufficient activity of the TCA cycle. However, the inhibition of the TCA cycle can be based on the impairment of specific enzymes and/or on the involvement of messenger substrates like insulin. Supporting the first mentioned aspect are decreased levels of TCA cycle intermediates, like α-ketoglutarate or citrate, as seen in 1H-NMR spectra of urine. However, the second aspect would explain the drop in blood glucose with the impairment of glucose transporters or the impairment of the insulin balance. If a single dose of 3,3,3-trifluoropropionic acid had stimulated the insulin release, glycolysis would be activated, and high amounts of acetyl CoA would be produced. In case of impaired use by the TCA cycle, levels of ketone bodies would be increased. Experiments were designed to characterize the direct effect of 3,3,3-trifluoropropionic acid on rat insulinoma-derived INS-1 cells as possible increase in insulin release. Further investigations are necessary to answer in which step of the metabolic pathway 3,3,3-trifluoropropionic acid interferes or finally which specific enzyme is inhibited or activated by 3,3,3-trifluoropropionic acid, leading to the drop in blood glucose and finally in lethal toxicity. N2 - Die Biotransformation von 1,1,1,3,3-Pentafluorpropan wurde in Ratten und in in vitro Systemen untersucht. Die in der Ratte mit dem Urin ausgeschiedenen Metabolite wurden per GC/MS und 19F-NMR identifiziert. Als Hauptmetabolit entstand Trifluoressigsäure, als Nebenmetabolit 3,3,3-Trifluorpropionsäure und als Abspaltungsprodukt Fluorid. Als in in vitro Systeme wurden Ratten- und Humanleber-mikrosomen, sowie Rattenleberhomogenate verwendet. Auch hier wurden Trifluoressigsäure und 3,3,3-Trifluorpropionsäure als metabolische Zwischenprodukte identifiziert. Weitere in vivo Studien wurden durchgeführt um die beobachtete subchronische Kardiotoxizität von 1,1,1,3,3-Pentafluorpropan zu erklären. Da vorangegangene Experimente eine hohe letale Toxizität des Metaboliten 3,3,3-Trifluorpropionsäure zeigten, wurde dieser als das toxische Agens hypothetisiert. Diese Annahme unterstützend, ist dessen strukturelle Ähnlichkeit zu Substanzen mit bekannten toxischen Profilen wie Monofluoressigsäure oder Difluoracrylsäure, ein mögliches entstehendes Intermediat. Der Hauptmetabolit Trifluoressigsäure jedoch, wurde auf Grund seiner bekannten Toxizität als initiierendes Agens der Kardiotoxizität ausgeschlossen. In vivo Untersuchungen mit 3,3,3-Trifluorpropionsäure zeigten jedoch keine weitere metabolische Aktivität und eine geringe renale Ausscheidung an 3,3,3-Trifluorpropionsäure. Nach einer einmalig hohen Dosis von 3,3,3-Trifluorpropionsäure traten markante Symptome wie Ataxie, komatöse Zustände und Krämpfe auf. Dies deutete auf eine Beeinträchtigung des Energiezustandes des Organismus hin. Die histo-pathologischen Veränderungen des Herzens, mononukleäre Infiltrate von Entzündungszellen und degenerierte Myokard-Fasern, die für 1,1,1,3,3-Pentafluorpropan in einer 90-Tages Studie in Nagern beobachtet wurden, konnten jedoch nicht nach 28-tägiger Exposition mit 10 mg/kg Körpergewicht 3,3,3-Trifluorpropionsäure beobachtet werden. Die unterschiedlichen Effekte die nach einmaliger und wiederholter Gabe beobachtet wurden, lassen sich durch mögliche Adaptionsprozesse erklären, die initiale Schädigungen kompensieren. Die folgenden Experimente waren auf die funktionelle Beeinflussung des Organismus durch 3,3,3-Trifluorpropionsäure ausgerichtet. In vitro Untersuchungen in Mitochondrien von Rattenleber und –herz mit dem Umsatz des Modellsubstrates [U14C] Palmitinsäure zeigten jedoch keine Inhibierung der ß-Oxidation durch 3,3,3-Trifluorpropionsäure. Zytotoxizitätsassays wurden im Weiteren in der human-hepatonom Zell-Linie HepG2, und in der kardialen Muskelzell-Linie H9C2 mit folgenden Endpunkten durchgeführt: die Freisetzung von LDH, ein Parameter für die Membranintegrität, die MTT Reduktase Aktivität, ein Parameter für die metabolische Aktivität, und die Messung von Kristallviolett, ein Parameter für die Viabilität von Zellen. Für 3,3,3-Trifluorpropionsäure konnte jedoch keine Zytotoxizität beobachtet werden. Deutliche Effekte wurden hingegen in der klinischen Pathologie und anhand Metabonomics beobachtet. Diese bestanden vor allem in der Abnahme der Glukosekonzentration im Blut, das weitreichende Konsequenzen mit sich führt, und als primärer Effekt die sekundären Effekte wie die beobachtenden klinischen Symptome erklären könnte. Ein weiterer Schlüsselparameter war die Erhöhung von Ketonkörpern in Urin und Serum, welche für eine lebensbedrohliche mögliche Ketoazidosis verantwortlich sein kann und durch ein Ungleichgewicht im Energiehaushalt ausgelöst werden kann. Da eine Beeinträchtigung der ß Oxidation und der Glykolyse ausgeschlossen wurde, könnte das erhöhte Vorkommen von Acetyl-CoA auf eine limitierte Aktivität des Zitronensäurezyklus hindeuten. Grund hierfür kann die Inhibierung von beteiligten Enzymen sein oder auch der Einfluß von Messenger-Substraten wie Insulin. Ersteres wurde untermauert mit der Beobachtung in 1H NMR Spektren von Urin mit erhöhten Mengen an Intermediaten des Zitronensäurezyklus, wie α Ketoglutarate oder Zitrat. Letzteres würde den Abfall der Blutglukose, basierend auf Beeinflussung von Glukosetransportern oder des Insulinhaushaltes, erklären. Wenn 3,3,3-Trifluorpropionsäure die Freisetzung von Insulin stimulieren würde, würde der Abbau von Glukose aktiviert werden und erhöhte Mengen an Acetyl-CoA resultieren. Wenn gleichzeitig eine Beeinträchtigung des Zitronensäurezyklus vorliegt, kann dies zu einer Erhöhung an Ketonkörpern führen. Experimente zur Messung des Insulin- und Glukosespiegels wurden in vivo und in vitro mit der Ratteninsulinoma Zell-Linie INS-1 durchgeführt, um den Effekt von 3,3,3-Trifluorpropionsäure auf die Freisetzung von Insulin zu charakterisieren. Basierend auf diesen Ergebnissen sind weitere Untersuchungen erforderlich um den Metabolismus von 3,3,3-Trifluorpropionsäure, sowie dessen mögliche Interaktion mit Enzymen oder Rezeptoren aufzuklären, und um den raschen Glukoseabfall im Blut zu erklären, der zu einer letalen Toxizität führen kann KW - Fluorkohlenwasserstoffe KW - Biotransformation KW - Biotransformation KW - Fluorkohlenwasserstoffe KW - Metabonomix KW - HFC245fa KW - Trifluorpropionsäure KW - biotransformation KW - hydrofluorocarbons KW - metabonomics KW - HFC245fa KW - trifluoropropionic acid Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15731 ER - TY - THES A1 - Leitz, Michael R. T1 - Vergleichende Pharmakologie der Subtypen von menschlichen Beta- adrenergen Rezeptoren - Charakterisierung von stabil in CHO-Zellen transfizierten Rezeptoren T1 - Comparative pharmacology of Beta-adrenergic receptor subtypes - Characterization of stably transfected receptors in CHO-cells N2 - Seit langem werden auf das β-adrenerge System wirkende Pharmaka, v.a. β1-Antagonisten und β2-Agonisten, therapeutisch eingesetzt, allerdings sind die pharmakologischen Eigenschaften dieser Stoffe an den drei bekannten β-adrenergen Subtypen teilweise nur unzureichend untersucht. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, vergleichbare pharmakologische Daten für Agonisten (Adrenalin, Noradrenalin, Isoprenalin, Fenoterol, Salbutamol, Salmeterol, Terbutalin, Formoterol, Broxaterol) und Neutrale und Inverse Antagonisten (Propranolol, Alprenolol, Atenolol, Metoprolol, Bisoprolol, Carvedilol, Pindolol, BRL 37344, CGP 20712, SR 59230A, CGP 12177, ICI 118551) an allen drei Subtypen von adrenergen Rezeptoren in einem zellbiologisch identischen Hintergrund zu gewinnen. Dazu stellten wir stabil transfizierte CHO-Zelllinien her, die die einzelnen humanen β-adrenergen Subtypen in vergleichbarer Menge exprimierten. Nach der pharmakologischen Charakterisierung der einzelnen Rezeptorsubtypen erfolgte die Affinitätsmessung von klinisch häufig eingesetzten wie auch experimentell verwendeten Substanzen mit dem unselektiven β-adrenergen Antagonisten 125I-CYP als Radioligand. Darüber hinaus untersuchten wir die β-adrenerg vermittelte Stimulation der Adenylylcyclase in isolierten Membranen dieser Zelllinien. Alle untersuchten Substanzen zeigten charakteristische Bindungs- und funktionale Eigenschaften. Wir konnten nachweisen, dass einige β2- bzw. β3-Agonisten an den anderen Subtypen inversen Agonismus zeigen. Zusätzlich konnten β1-Antagonisten mit agonistischer Aktivität an β2- und β3-AR gefunden werden. Die gewonnenen Daten können somit helfen, klinisch beobachtete Effekte, wie z.B. die unerwünschten Wirkungen der entsprechenden Medikamente, besser zu verstehen. Insbesondere die Ergebnisse am β3-AR sind als Referenz und Ausgangspunkt weiterer Studien an diesem noch relativ wenig untersuchten Rezeptor wertvoll. N2 - Although many β1-receptor antagonists and β2-receptor agonists have been used in pharmacotherapy for many years their pharmacological properties at all three known subtypes of β-adrenergic receptors are not always well characterized. The aim of this study was, therefore, to provide comparative binding characteristics of agonists (epinephrine, norepinephrine, isoproterenol, fenoterol, salbutamol, salmeterol, terbutalin, formoterol, broxaterol) and antagonists (propranolol, alprenolol, atenolol, metoprolol, bisoprolol, carvedilol, pindolol, BRL 37344, CGP 20712, SR 59230A, CGP 12177, ICI 118551) at all three subtypes of human β-adrenergic receptors in an identical cellular background. We generated Chinese hamster ovary (CHO) cells stably expressing the three β-adrenergic receptor subtypes at comparable levels. We characterized these receptor subtypes and analyzed the affinity of routinely used drugs as well as experimental compounds in competition binding studies, using the non-selective antagonist 125I-cyanopindolol as a radioligand. Furthermore, we analyzed the β-receptor-mediated adenylyl cyclase activity in isolated membranes from these cell lines. The results from our experiments show that all compounds exhibit distinct patterns of selectivity and activity at the three β-receptor subtypes. In particular, a number of β2- or β3-receptor agonists that are inverse agonists at the other subtypes were identified. In addition, β1-receptor antagonists with agonistic activity at β2- and β3-receptors were found. These specific mixtures of agonism, antagonism, and inverse agonism at different subtypes may have important implications for the therapeutic use of the respective compounds. KW - Beta-adrenerge Rezeptoren KW - CHO-Zellen KW - Beta-Rezeptor Subtypen KW - stabile Transfektion KW - Beta- adrenergic receptors KW - CHO-cells KW - Beta-Receptor subtypes KW - stable transfection Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18655 ER - TY - THES A1 - Nikolaev, Viacheslav T1 - Development and application of fluorescent cAMP und cGMP biosensors T1 - Entwicklung und Anwendung fluoreszierender Biosensoren für cAMP und cGMP N2 - The cyclic nucleotides cAMP and cGMP are two ubiquitous important second messengers, which regulate diverse physiological responses from vision and memory to blood pressure and thrombus formation. They act in cells via cAMP- and cGMP-dependent protein kinases (PKA and GK), cyclic nucleotide-gated channels and Epac. Although the concept of cyclic nucleotide signalling is well developed based on classical biochemical studies, these techniques have not allowed to analyze cAMP and cGMP in live cells with high temporal and spatial resolution. In the present study fluorescence resonance energy transfer was used to develop a technique for visualization of cAMP and cGMP in live cells and in vitro by means of fluorescent biosensors. Ligand-induced conformational change in a single nucleotide-binding domain flanked with green fluorescent protein mutants was used for dynamic, highly sensitive measurements of cAMP and cGMP. Such biosensors retained binding properties and chemical specificity of unmodified domains, allowing to image cyclic nucleotides in a physiologically relevant range of concentrations. To develop cAMP-sensors, binding domains of PKA, Epac and cAMP-gated HCN-channel were used. cGMP-sensors were based on single domains of GK and phosphodiesterases (PDEs). Sensors based on Epac were used to analyze spatio-temporal dynamics of cAMP in neurons and macrophages, demonstrating that cAMP-gradients travel with a high speed (~ 40 μm/s) throughout the entire cytosol. To understand the mechanisms of cAMP-compartmentation, kinetics properties of phosphodi-esterase (PDE2) were, next, analyzed in aldosterone producing cells. PDE2 is able to rapidly hydrolyze extensive amounts of cAMP, so that the speed of cAMP-hydrolysis is much faster than that of its synthesis, which might serve as a basis of compartmentation. cAMP-sensors were also used to develop a clinically relevant diagnostic method for reliable detection of β1-adrenergic receptor autoantibodies in cardiac myopathy patients, which has allowed to significantly increase the sensitivity of previously developed diagnostic approaches. Conformational change in a single binding domain of GK and PDE was, next, used to create novel fluorescent biosensors for cGMP. These sensors demonstrated high spatio-temporal resolution and were applied to analyze rapid dynamics of cGMP production by soluble and particulate guanylyl cyclases as well as to image cGMP in mesangial cells. In summary, highly sensitive biosensors for cAMP and cGMP based on single cyclic nucleotide-binding domains have been developed and used in various biological and clinically relevant applications. N2 - Die zyklischen Nukleotide cAMP and cGMP sind zwei ubiquitäre Botenstoffe, die verschiedene physiologische Prozesse regulieren, vom Sehen und Gedächtnis bis zu Blutdruck und Thrombusbildung. Sie wirken über cAMP- und cGMP-abhängige Kinasen (PKA und GK), Kanäle und Epac. Obgleich die Funktionen von zyklischen Nukleotiden in klassischen biochemischen Studien gut untersucht sind, ermöglichen diese Methoden nicht, cAMP und cGMP in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu analysieren. In dieser Arbeit wurde Fluoreszenzresonanzenergietransfer benutzt, um eine Technik für die Visualisierung von cAMP and cGMP in lebenden Zellen und in vitro zu entwickeln. Ligand-induzierte Konformationsänderung in einer einzelnen, mit Grünfluoreszenzproteinmutanten fusionierten Bindungsdomäne diente als Grundlage für Biosensoren, die dynamische, hochsensitive Messungen von cAMP und cGMP ermöglichen. Bei solchen Sensoren wurden die chemischen und Bindungseigenschaften von unmodifizierten Domänen aufrechterhalten, was die cAMP- und cGMP-Messungen im physiologischen Konzentrationsbereich in lebenden Zellen ermöglicht. Für die Entwicklung der cAMP-Sensoren wurden die Domänen von PKA, Epac und von einem cAMP- gesteuerten HCN-Kanal benutzt. cGMP-Sensoren beruhen sich auf den Bindungsdomänen von GK und Phosphodiesterasen (PDEs). Mit Hilfe der auf Epac-basierten Sensoren wurde die cAMP-Dynamik in Neuronen und Makrophagen zeitlich und räumlich aufgelöst. In diesen Zellen diffundiert cAMP mit hoher Geschwindigkeit (~ 40 μm/s) frei durch das ganze Zytosol. Um die Mechanismen der cAMP-Kompartimentierung besser zu verstehen, wurden die kinetischen Eigenschaften der PDE2 in aldosteronproduzierenden Zellen analysiert. PDE2 ist imstande, große Mengen von cAMP äußerst schnell zu hydrolisieren, so dass die Geschwindigkeit der cAMP-Hydrolyse viel höher ist als von cAMP-Synthese, was eine Grundlage der cAMP-Kompartimentierung sein könnte. cAMP-Sensoren wurden auch benutzt, um eine klinisch relevante diagnostische Methode zu entwickeln, die Autoantikörper gegen β1-adrenergen Rezeptoren bei Herzinsuffizienzpatienten zuverlässig nachweist. Diese Methode hat ermöglicht, die Sensitivität der früher entwickelten Techniken zu verbessern. Konformationsänderung in einzelnen Bindungsdomänen von GK und PDE wurde als nächstes benutzt, um ein Reihe neuer fluoreszierender Biosensoren für cGMP zu entwickeln. Diese Sensoren zeigten hohe räumliche und zeitliche Auslösung und wurden zur Analyse schneller Dynamik von cGMP-Synthese und für cGMP-Imaging in Mesangialzellen angewandt. Zusammenfassend wurden hochsensitive Biosensoren für cAMP und cGMP auf Grund einzelner, mit Grünfluoreszenzproteinmutanten fusionierter Bindungs-domäne entwickelt und in verschiedenen biologischen und klinisch relevanten Applikationen eingesetzt. KW - Cyclo-AMP KW - Cyclo-GMP KW - Biosensor KW - Fluoreszenz KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - cAMP KW - cGMP KW - FRET KW - Fluoreszenz KW - Sensor KW - cAMP KW - cGMP KW - FRET KW - fluorescence KW - sensor Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15673 ER - TY - THES A1 - Gärttner, Carola T1 - Beta-adrenerge Signaltransduktion in kardial differenzierten embryonalen Stammzellen T1 - beta-adrenergic signal transduction in embryonic stem cell-derived cardiomyocytes N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden die kardial differenzierten embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) mittels der von Wobus et al. entwickelten Tröpfchentechnik gewonnen. Eine Optimierung der kardialen Ausbeute konnte durch eine Selektionsmethode erreicht werden, die auf der Expression eines Resistenzgens in den kardial differenzierten ES-Zellen beruht. Hierdurch wurde eine reproduzierbar hohe Anreicherung von ES-Kardiomyozyten erzielt. Die erstmalig durchgeführte quantitative Bestimmung der endogenen β-adrenergen Rezeptorexpression in ES-Kardiomyozyten zeigte eine Subtyp-Verteilung, die mit derjenigen in adulten Maus-Kardiomyozyten übereinstimmt, wobei eine höhere endogene Expression in ES-Kardiomyozyten vorlag. Ferner konnte durch eine β-adrenerge Stimulation in 16 Tage alten ES-Kardiomyozyten eine positive chronotrope Reaktion sowie eine Aktivierung der Adenylatzyklase-Aktivität hervorgerufen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass ES-Kardiomyozyten am 16. Differenzierungstag einen vollständig ausgereiften β-adrenergen Signalweg aufweisen und hinsichtlich der physiologischen Effekte vergleichbare Merkmale mit adulten Maus-Kardiomyoyzten haben. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Fähigkeit eines adenoviralen Gentransfers in ES-Kardiomoyzten zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass der Gentransfer mittels rekombinanten Adenoviren eine sehr effiziente und durchführbare Methode zur Expression von Transgenen in ES-Kardiomyozyten ist. Weiterhin konnte die funktionelle Kopplung der adenoviral überexprimierten β1-adrenergen Rezeptoren nachgewiesen werden. Die Überexpression hatte eine ausgeprägte Sensitivierung der Rezeptorantwort zur Folge, während die maximale Isoprenalin-induzierte cAMP-Produktion nur wenig erhöht wurde. Dies entspricht Befunden an transgenen Mausmodellen mit einer β1-adrenergen Rezeptor-überexpression. Eine Sensitivierung des chronotropen Effektes konnte dagegen nicht gezeigt werden. Möglicherweise führte die Transfektion der ES-Kardiomyozyten-Zellverbände nur zu einem oberflächlich begrenzten Gentransfer, der keinen Einfluss auf die Gesamtheit des funktionellen Synzytiums hatte. Außerdem wurde in dieser Arbeit der Einfluss einer unterschiedlichen Phosducin-Expression auf die kardiale Differenzierungsfähigkeit in transgenen ES-Zellen untersucht. Dabei konnte kein signifikanter Unterschied in der kardialen Differenzierung sowie in der Basalfrequenz von homozygoten und heterozygoten Phosducin Knock-out Klonen beziehungsweise von Phosducin überexprimierenden Zellklonen festgestellt werden. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden die kardial differenzierten embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) mittels der von Wobus et al. entwickelten Tröpfchentechnik gewonnen. Eine Optimierung der kardialen Ausbeute konnte durch eine Selektionsmethode erreicht werden, die auf der Expression eines Resistenzgens in den kardial differenzierten ES-Zellen beruht. Hierdurch wurde eine reproduzierbar hohe Anreicherung von ES-Kardiomyozyten erzielt. Die erstmalig durchgeführte quantitative Bestimmung der endogenen β-adrenergen Rezeptorexpression in ES-Kardiomyozyten zeigte eine Subtyp-Verteilung, die mit derjenigen in adulten Maus-Kardiomyozyten übereinstimmt, wobei eine höhere endogene Expression in ES-Kardiomyozyten vorlag. Ferner konnte durch eine β-adrenerge Stimulation in 16 Tage alten ES-Kardiomyozyten eine positive chronotrope Reaktion sowie eine Aktivierung der Adenylatzyklase-Aktivität hervorgerufen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass ES-Kardiomyozyten am 16. Differenzierungstag einen vollständig ausgereiften β-adrenergen Signalweg aufweisen und hinsichtlich der physiologischen Effekte vergleichbare Merkmale mit adulten Maus-Kardiomyoyzten haben. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Fähigkeit eines adenoviralen Gentransfers in ES-Kardiomoyzten zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass der Gentransfer mittels rekombinanten Adenoviren eine sehr effiziente und durchführbare Methode zur Expression von Transgenen in ES-Kardiomyozyten ist. Weiterhin konnte die funktionelle Kopplung der adenoviral überexprimierten β1-adrenergen Rezeptoren nachgewiesen werden. Die Überexpression hatte eine ausgeprägte Sensitivierung der Rezeptorantwort zur Folge, während die maximale Isoprenalin-induzierte cAMP-Produktion nur wenig erhöht wurde. Dies entspricht Befunden an transgenen Mausmodellen mit einer β1-adrenergen Rezeptor-überexpression. Eine Sensitivierung des chronotropen Effektes konnte dagegen nicht gezeigt werden. Möglicherweise führte die Transfektion der ES-Kardiomyozyten-Zellverbände nur zu einem oberflächlich begrenzten Gentransfer, der keinen Einfluss auf die Gesamtheit des funktionellen Synzytiums hatte. Außerdem wurde in dieser Arbeit der Einfluss einer unterschiedlichen Phosducin-Expression auf die kardiale Differenzierungsfähigkeit in transgenen ES-Zellen untersucht. Dabei konnte kein signifikanter Unterschied in der kardialen Differenzierung sowie in der Basalfrequenz von homozygoten und heterozygoten Phosducin Knock-out Klonen beziehungsweise von Phosducin überexprimierenden Zellklonen festgestellt werden KW - ß-adrenerge Signaltransduktion KW - Embryonalen Stammzellen KW - Kardiomoyzyten KW - beta-adrenergic signal transduction KW - embryonic stem cell KW - cardiomyocyt Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18923 ER - TY - THES A1 - Semmel, Britta Birgit T1 - Gentoxizität durch hormonell stimulierte Proliferation T1 - Stimulation of proliferation causes genetic instability N2 - Hormone spielen bei der Kanzerogenese eine wichtige Rolle, indem sie vor allem auf die Phase der Promotion einwirken und die Proliferation bereits initiierter Zellen steigern können. In dieser Arbeit wurden humane Ovarialkarzinomzellen mit Östrogen, Insulin, IGF und EGF zur Proliferation angeregt, woraus eine erhöhte Mikrokernrate resultierte. Mikrokerne sind chromatinhaltige Strukturen, die außerhalb des Zellkerns liegen. Somit lag nahe, dass durch die Steigerung der Proliferation eine genetische Instabiltät erzeugt wurde. Weitere Experimente zeigten eine Forcierung der genetisch geschädigten Zellen durch den Zellzyklus, so dass vermutet werden kann, dass schnell proliferierende Zellen durch Verringerung der zellulären Reparaturmechanismen eine erhöhte Rate an genetischer Instabilität aufweisen. Unterstützt wird diese Hypothese durch Analyse diverser Zellzyklusregulationsproteine mittel Wester-Blot. KW - Kanzerogenese KW - Hormone KW - Mikrokerne KW - Zellzyklus KW - cell-cycle KW - micronuclei KW - cancer Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18714 ER - TY - THES A1 - Haake, Monika T1 - Belastungen durch Passivrauchen im Kindesalter T1 - The damage to children's health caused by environmental tobacco smoke N2 - Hintergrund: Passivrauchen ist nicht nur als kanzerogen für den Menschen eingestuft, sondern verursacht auch verschiedene andere Erkrankungen. Oft wird dabei der Passivrauchbelastung von Kindern im häuslichen Bereich zu wenig Beachtung geschenkt. In dieser Arbeit wurde deswegen der Zusammenhang zwischen Passivrauchen auf der einen Seite und atopischen Erkrankungen, Erkrankungen der oberen Atemwege und Gentoxizität auf der anderen Seite untersucht. Methoden: Die Daten von über 100 Kindern zwischen 1 und 15 Jahren wurden mit Hilfe eines Fragebogens erhoben und zusammen mit den Krankenakten ausgewertet. Zur Prüfung der Gentoxizität wurden Mikrokernraten und Schwesterchromatidenaustausche in peripheren Lymphozyten bestimmt. Der Erfassung der inneren Exposition dienten Hämoglobinaddukte von 4-Aminobiphenyl, welches in Zigarettenrauch vorkommt und als krebserzeugend für den Menschen eingestuft ist. Ergebnisse: Bei Untersuchung der Mikrokernraten zeigten die rauchbelasteten Kinder höhere Mikrokernraten (Mittelwert: 12,7/1000 zweikernige Lymphozyten) als die unbelasteten (Mittelwert: 11,7 Mikrokerne/1000 zweikernige Lymphozyten). Der Unterschied war aber nicht signifikant (p = 0,344). Außerdem hatten die Vorschulkinder mit rauchenden Eltern signifikant höhere Mikrokernraten (Mittelwert: 14,2/1000 zweikernige Lymphozyten) als die Schulkinder (Mittelwert: 9,2/1000 zweikernige Lymphozyten; p = 0,031). Die Analyse der 4-Aminobiphenyl-Hämoglobinaddukte der 1,25- bis 4,0-Jährigen ergab leicht höhere Werte für Kinder mit rauchenden Eltern (Mittelwert: 66,52 pg/g Hb) als für Kinder, deren Eltern nicht zu Hause rauchten, und deren Werte (Mittelwert: 56,18 pg/g Hb) waren höher als die der unbelasteten Kinder (Mittelwert: 49,60 pg/g Hb). Der Unterschied war nicht signifikant. Bei Betrachtung der atopischen Erkrankungen war der Anteil der Atopiker bei der rauchexponierten Gruppe höher (31,3 %) als bei der nicht exponierten (16,3 %), obwohl die genetische Vorbelastung in der rauchbelasteten Gruppe etwas geringer war als in der unbelasteten. Bei den Kindern mit Erkrankungen der oberen Atemwege zeigte sich ein höherer Anteil rauchexponierter Kinder (61,3 %) als in der Gruppe der Kinder mit Erkrankungen, die wahrscheinlich nicht mit postnataler Passivrauchexposition in Zusammenhang stehen (44,8 %). Schlussfolgerung: Diese Arbeit unterstreicht die Bedeutung von Passivrauchen im Hinblick auf atopische Erkrankungen und Erkrankungen der oberen Atemwege bei Kindern. Gerade die häusliche Passivrauch-Belastung im Vorschulalter und ihre Auswirkung auf das Erbgut sollten hinsichtlich der erhöhten Mikrokernraten mehr Beachtung finden. N2 - Background: Passive smoking is not only classified as carcinogenic in humans, but also causes different other diseases. In this context the exposure of children to environmental tobacco smoke (ETS) at home is often not considered well enough. Therefore the correlation between passive smoking on the one hand and atopic diseases, diseases of the upper airways and genotoxicity on the other hand has been analysed in this dissertation. Methods: The data of more than 100 children from 1 to 15 years of age were collected with the help of a questionnaire and analysed together with the children’s medical files. To test genotoxicity, micronucleus frequencies and sister chromatid exchanges were determined in peripheral lymphocytes. Hemoglobin adducts of 4-aminobiphenyl, which is contained in tobacco smoke and classified as carcinogenic in humans, were used to measure the internal exposure. Results: The examination of the micronucleus frequencies has shown that the ETS-exposed children had higher micronucleus frequencies (mean: 12,7/1000 binucleate lymphocytes) than the non-exposed children (mean: 11,7/1000 binucleate lymphocytes). However, the difference was not significant (p = 0,344). In addition to that, preschool-children with smoking parents had significantly higher micronucleus frequencies (mean: 14,2/1000 binucleate lymphocytes) than school-children (mean: 9,2/1000 binucleate lymphocytes; p = 0,031). The analysis of the 4-aminobiphenyl-hemoglobin adducts of the children from 1,25 to 4 years of age showed results a bit higher for the children with smoking parents (mean: 66,52 pg/g Hb) than for the children whose parents did not smoke at home. The results for these children (mean: 56,18 pg/g Hb) were higher than for those not exposed to environmental tobacco smoke (mean: 49,60 pg/g Hb). The difference was not significant. In regard to the atopic diseases the share of the atopic children in the ETS-exposed group was higher (31,3%) than in the non-exposed one (16,3 %) although the genetic disadvantage in the ETS-exposed group was less serious than in the non-exposed one. Looking at the children with diseases of the upper airways the share of ETS-exposed children was higher (61,3 %) than in the group of children with diseases probably not connected to postnatal exposure to ETS (44,8 %). Conclusion: This dissertation underlines the importance of passive smoking as far as atopic diseases and diseases of the upper airways of children are concerned. Especially the ETS exposure of preschool-children at home and its effects on the genom should be considered more than it is because of the increased micronucleus frequencies. KW - Passivrauchen KW - Kinder KW - Mikrokerne KW - Schwesterchromatidenaustausche KW - 4-Aminobiphenyl KW - Hämoglobinaddukte KW - Gentoxizität KW - atopische Erkrankungen KW - passive smoking KW - environm. tobacco smoke KW - children KW - micronuclei KW - sister chromatid exch. KW - 4-aminobiphenyl KW - hemoglobin adducts KW - genotoxicity Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13952 ER - TY - THES A1 - Wassermann, Veronika T1 - Ueber die Beteiligung der Hitzeschockproteine HSP27 und HSP70 an einer Resistenz, Resistenzentwicklung unter CMF-Therapie T1 - Is heat shock protein expression an important faktor in drug resistance? N2 - Ein Problem der Therapie maligner Tumore ist die Resistez gegenüber Chemotherapeutika. Diskutiert wird ein Zusammenhang zur Expression von Hitzeschockproteinen (HSP). Insbesondere das in Mamma-Karzinomen stark exprimierte HSP27 und HSP70 scheinen hier beteiligt. Hitzeschockproteine sind Teil eines durch Noxen induzierten Mechanismus, welcher Schutz vor weiterer Noxenexposition verleiht, also die entsprechenen Zellen im Unterschied zu nicht exponierten Kontrollzellen zu überleben befähigt. Es kommt nach einem Streßereignis zu einer Veränderung von Zelltod unter nachfolgenden Bedingungen, z.B. Verhütung von Apoptose (physiologischer Zelltod). Tumortherapie mittels Zytostatika stellt eine „kontrollierte Apoptose“ dar. Ziel dieser Therapie muß es also folglich sein, eine HSP-Induktion zu vermeiden, da eine solche den Therapieerfolg und Benefit für den Patienten schmälert. Die Exposition einer Tumorzelle mit einem chemotherapeutisch wirksamen Medikament bedeutet für diese Zelle toxischen/oxidativen Streß, den sie nur durch Induktion entsprechender Abwehrmechanismen überleben kann. Diese Mechanismen haben letztlich einen wesentlichen Einfluß auf die Wirksamkeit des Medikamentes und Profit des Patienten durch die ihm angebotene Therapie. Eine frühe adaptive Zellantwort von Säugerzellen auf toxische Einflüsse stellt die Expression von Hitzeschockproteinen dar. Den Fokus der vorliegenden Untersuchungen stellen einerseits diejenigen Substanzen dar, welche heutzutage in der Therapie des Mamma-Karzinoms eingesetzt werden, den drei Einzelsubstanzen des CMF-Protokolls Methotrexat, 5-Fluorouracil und Cyclophosphamid, andererseits die Hitzeschockproteine mit der höchsten bekannten Bedeutung für Tumorwachstum. In einem ersten Schritt wurde in vitro mit einem Zellsystem, welches durch Transfektion mit dem humanen hsp27-Gen bei bekannter HSP70-Induzierbarkeit als einfaches isoliertes Zellsystem ein gutes Werkzeug zur spezifischen Untersuchung dieser beiden Proteine darstellt, untersucht werden, inwieweit sich diese speziellen Proteine durch die unterschiedlichen Substanzgruppen des CMF-Protokolls induzieren lassen. Es wurde also nach einer adaptiven Zellantwort in Form einer Induktion von HSP27 und HSP70 nachfolgend einer Noxenexposition gesucht werden. In einem zweiten Schritt wurde untersucht, ob die für diese beiden HSPs postulierte zytoprotektive Eigenschaften auch für Zytostatika gelten. Es wurde überprüft , inwieweit Chemotherapeutika unter dem Einfluß von HSP70 und HSP27 stehen, also inwieweit die Expression von HSP27 und HSP70 einen Zellschutz gegen toxischen Streß (durch CMF) in den verwendeten L929-Mausfibroblasten darstellen kann. N2 - Resistance to cytotoxic drugs is a major problem in tumor therapy. Paradoxycally both aquired and inhärent resistance to chemotherapeutica seem to be more common in tumors than in normal cells. A correllation to the expression of heat schock proteins (HSPs) is discussed. In particular, HSP27 and HSP70 seem to controbute to this phenomen. Our study focussed on the role of both HSPs in cellular response to methotrexate, 5-FU an cyclophosphamide, which are actually used in breast cancer therapy. KW - Hietzeschockprotein KW - Resistenzentwicklung KW - CMF-Therapie KW - Mammakarzinom KW - heat shock protein KW - resistance KW - cancer Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12292 ER - TY - THES A1 - Trösken, Eva-Regina T1 - Toxicological evaluation of azole fungicides in agriculture and food chemistry T1 - Toxikologische Beurteilung der Anwendung von Azolfungiziden in der Landwirtschaft und Lebensmittelchemie N2 - Azole sind wichtige Chemikalien, die als Fungizide in der Landwirtschaft und der Medizin eingesetzt werden. Auch als Zytostatika in der Humanmedizin finden sie Anwendung. Die fungizide Wirkung beruht auf der Hemmung der Lanosterol-14α-Demethylase (CYP51), die die Demethylierung von Lanosterol zum „Follicular Fluid Meiosis Activating Steroid (FF-MAS)“ katalysiert. Für Pilze ist das später resultierende Ergosterol ein essentieller Bestandteil der Zellmembran. Exponierten Pilzen fehlt Ergosterol was zu einem Zusammenbruch der Zellmembran führt. Säugetiere können Cholesterol, das spätere Produkt der Lanosterol-14α-Demethylierung, das zur Synthese von z.B. Gallensäuren und Sexualhormonen nötig ist, mit der Nahrung aufnehmen. FF-MAS und das resultierende T-MAS (Testis Meiosis Activating Steroids), die direkten Produkte der CYP51 katalysierten Reaktion, wirken als Meiose-aktivierende Steroide auf Ovarien und Hoden und werden nicht mit der Nahrung aufgenommen. Eine Hemmung der CYP51 Aktivität könnte das endokrine System beeinflussen und wird daher als unerwünschte Nebenwirkung der Azole betrachtet. Aromatase (CYP19) katalysiert die Demethylierung von Testosteron zu Östradiol und wird durch Azole gehemmt. Die Verringerung der Östrogenspiegel durch CYP19-Inhibition ist das Wirkprinzip der als Zytostatika genutzten Azole, bei den Fungiziden wird es als unerwünschte Nebenwirkung angesehen. Ein ideales Azol sollte Pilz-CYP51 stark inhibieren, aber sowohl humanes CYP19 wie auch humanes CYP51 sollten durch ein solches Azol nicht inhibiert werden. Ein ideales Azol-Zytostatikum sollte eine starke inhibitorische Potenz gegenüber humanem CYP19 aufweisen, hingegen sollten humanes und Pilz-CYP51 nicht inhibiert werden. Ziel dieser Arbeit war es nun festzustellen: sind Fungizide und Antimykotika starke Inhibitoren von Pilz-CYP51? Zeigen Fungizide und Antimykotika keine Aktivität gegenüber humanem CYP19 und humanem CYP51? Sind Zytostatika starke Inhibitoren von humanem CYP19? Zeigen Zytostatika keine Aktivität gegenüber humanem CYP51 und Pilz-CYP51? Die inhibitorische Potenz von 22 Azolen, aus den drei Anwendungsgebieten, wurden an vier Systemen getestet: i) an humanem CYP19 und einem fluoreszierenden Pseudosubstrat, ii) an CYP19 und Testosteron als Substrat, iii) an humanem CYP51 und iv) Candida albicans CYP51 und Lanosterol als Substrat. Die Produktbildung wurde mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie gekoppelter Tandem-Massenspektrometrie nach Photosprayionisation gemessen. Das humane CYP51 wurde von „BD Gentest Cooperation“ zur Verfügung gestellt. Ein katalytisch aktiver Enzymkomplex bestehend aus der Lanosterol-14α-Demethylase von Candida albicans und der Oxidoreduktase von Candida tropicalis, wurde im Baculovirussystem exprimiert. Ein Vergleich der inhibitorischen Wirkstärke der Substanzen auf menschliches CYP19 und CYP51 und Pilz-CYP51 zeigt, dass einige Azole das erwünschte Bild zeigen. Dazu gehören die beiden Zytostatika Fadrozol und Letrozol, sowie Fluconazol und Itraconazol, zwei Antimykotika aus der Humanmedizin, und einige Fungizide z.B. Cyproconazol und Hexaconazol. Ein unerwünschtes Bild zeigen z.B. Prochloraz, Bifonazol, Ketoconazol und Miconazol. Sieben Azole weisen ein gemischtes Bild an inhibitorischen Wirkstärken auf. Um einen modellartigen Eindruck der Rückstände von Azolen in Lebensmitteln zu erhalten, wurde eine auf LC-ESI-MS/MS basierende Rückstandsanalytik für Azole im Wein entwickelt. Alle gefunden Rückstände lagen unterhalb der behördlich festgelegten Rückstandshöchstmengen. Um die inhibitorische Wirkung der Azole auf die verschiedenen Enzymsysteme in einem größeren Zusammenhang zu bringen, wurden die IC50 Werte mit Expositionsdaten von Bauern, maximalen Plasmaspiegeln in Patienten nach der Einnahme von Antimykotika und mit Expositionsgrenzwerten für die Langzeitaufnahme von Pflanzenschutzmittelrückständen („Acceptable Daily Intake Levels“, ADI) verglichen. Basierend auf den dargestellten Ergebnissen können folgende Schlussfolgerungen gezogen werden. Das Risiko für landwirtschaftliche Arbeiter durch Exposition gegenüber Azolfungiziden kann im Bezug auf menschliches CYP19 und CYP51 als vernachlässigbar eingestuft werden, wenn die entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden. Im medizinischen Bereich muss grundsätzlich der Einsatz von Bifonazol, Miconazol und Ketoconazol mit Blick auf die hohe inhibitorische Potenz gegenüber menschlichem CYP19 und 51 kritisch betrachtet werden. Unter der Annahme, dass die ADI Werte eingehalten werden, stellen Rückstände auf Lebensmitteln in Bezug auf die genannten Enzymsysteme keine Bedrohung für den Verbraucher da. Die Inhibition von CYP19 muss als Störung des Hormonsystems angesehen werden. Die Bedeutung von FF-MAS und T-MAS im endokrinen System muss noch abschließend geklärt werden und damit auch die Frage, wie viel Bedeutung der Inhibition von menschlichem CYP51 beigemessen werden muss. N2 - Azoles are important chemicals used as antifungal agents in agriculture and human medicine, but also as cytostatic drugs in tumour chemotherapy. Antifungal activities are based on inhibition of lanosterol-14α-demethylase (CYP51). CYP51 catalyses the oxidative removal of the methyl group # 32 of lanosterol to produce follicular fluid meiosis activating steroid (FF-MAS). For fungi the later resulting ergosterol is an essential compound of the cell membrane. Exposed fungi lack ergosterol, which leads to a collapse of the cell membrane. In mammals cholesterol, the downstream product of lanosterol-14α-demethylation necessary for the synthesis of bile acids, mineral corticoids, glucocorticoids and sex steroids, can be supplemented with food intake. However FF-MAS and the resulting T-MAS (testis meiosis activating steroids), the direct products of the CYP51 reaction, act as meiosis-activating steroids on ovaries and testes and are not supplemented with food intake. Inhibition of CYP51 in humans may therefore affect the endocrine system and is an unwanted side effect of azoles. Aromatase (CYP19) catalyses the demethylation of testosterone to estradiol and is inhibited by azoles. Reduction of estrogen levels by CYP19 inhibition is the working principle of cytostatic drugs used in breast cancer therapy but is considered an unwanted side effect for azoles used to treat fungal infections. A favourable fungicide or antifungal drug should be a strong inhibitor of fungal CYP51. In contrast human CYP51 and human CYP19 should not be inhibited by an azole fungicide or antifungal agent. The favourable cytostatic drug should show a high potency towards human CYP19. Neither human CYP51 nor fungal CYP51 should be inhibited by a cytostatic drug. The aim of this work was to assess: are fungicides and antifungal drugs strong inhibitors of fungal CYP51? In return do they not inhibit human CYP51 and human CYP19? Do cytostatic drugs strongly inhibit human CYP19? And in return do they not inhibit human CYP51 or fungal CYP51? Inhibitory potencies of 22 azole compounds used for the three purposes were tested in four inhibition assays: i) on commercially available human CYP19 utilising a fluorescent pseudo substrate dibenzylfluorescein (DBF) ii) on CYP19 utilising testosterone as substrate iii) on human CYP51 and iv) Candida albicans CYP51 utilising lanosterol as substrate. Product formation was measured by liquid chromatography – tandem mass spectrometry utilising photospray ionisation (APPI). A functional human CYP51 was available from BD Gentest Cooperation. A functional enzyme complex comprising of the Candida albicans lanosterol-14α-demethylase and the Candida tropicalis oxidoreductase was expressed in the baculovirus system. When comparing inhibitory potencies on CYP19, human CYP51 and Candida albicans CYP51 a number of agents show desirable patterns of inhibition e.g. the two cytostatic drugs, or two antifungal agents used in human medicine, fluconazole and itraconazole, and a wide variety of the fungicides, e.g. cyproconazole and hexaconazole. Undesirable patterns of inhibition were exhibited by a number of compounds, e.g. prochloraz, bifonazole, ketoconazole and miconazole. Seven compounds show a more complex picture of inhibitory potencies though. To get a picture of residue levels of azoles in food in a model case an LC-ESI-MS/MS method was developed for the determination of azole compounds in wine. All residues were below the maximum residue levels set by authorities. To classify the inhibitory potencies on the different enzyme systems IC50 values obtained were compared to exposure levels measured in farmers, maximum plasma concentrations in humans reported after exposure to antifungal drugs and to acceptable daily intake levels set by authorities. Based on the findings presented, the following conclusions can be drawn. The risk for agricultural workers set by exposure to azole fungicides with respect to human CYP51 and CYP19 can be regarded as negligible when safety measures are adhered to. As a matter of principle however, the usage of bifonazole, miconazole and ketoconazole has to be viewed with caution in respect to the high level of inhibition of human CYP51 and/or CYP19. Under the assumption that the acceptable daily intake amounts set by authorities for azole compounds are not exceeded the residues do not pose a threat to consumer safety judged by our findings. Inhibition of CYP19 with the consequence of a reduction of estradiol levels has to be regarded as a possible disrupting effect of the hormone balance. The relevance of FF-MAS and T-MAS in the endocrine system however still has to be evaluated completely bringing with it the question of how much importance has to be attached to the inhibition of human CYP51. KW - Azole KW - Fungizid KW - Toxikologie KW - CYP19 KW - CYP51 KW - Azole KW - Toxikologie KW - CYP19 KW - CYP51 KW - Azoles KW - Toxicology Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17016 ER - TY - THES A1 - Vukicevic, Vladimir T1 - Mechanisms of apoptosis modulation and their contribution to genomic instability in tumor cells T1 - Mechanismen von Apostose Modulation und ihr Beitrag zur genomischen Instabilität N2 - The concept of programmed cell death has been increasingly considered from various aspects since early 1970’s. Primarily, knowledge of apoptosis referred to morphological changes in which chromatin is condensed and increasingly fragmented, revealed as small structure in the nucleus. The membrane shrinks and the cell becomes dense as can be seen by flow cytometry. Interestingly, similar modes of cell deletion were observed in nematodes indicating that apoptosis is a highly conserved machinery. Three Caeonorhabditis elegans gene products are found to have high homology with mammalian apoptotic genes: CED-9 inhibits apoptosis and is related to bcl-2; CED-3 and CED-4 promote apoptosis and are related to caspase 9 and APAF-1. Apoptosis is not accidental death, but a highly controlled and medically important molecular process. More general terms such as ‘physiological’ or ‘regulated’ cell death cover different morphologies and sequences. Programmed suicide of cells that were subjected to toxic exogenous and endogenous stimuli plays a key role in understanding cancer development and its treatment. Apoptosis involves sequences of events that may overlap and play contradictory or antagonistic roles in cell death. Generally, the ability to trigger apoptotic processes in cancer cells would benefit an organism by keeping homeostasis intact. Programmed cell death is a regularly present mechanism, for instance, in lymphocyte recruitment in the thymus where immature lymphocytes may recognize host antigens. Therefore, such lymphocytes become apoptotic and are removed by macrophages. Removal prevents possible autoimmune diseases. Unlike apoptosis, necrosis is a passive process of cell death recognizable by membrane morphological changes and accompanied by leakage of intracellular material into intercellular space that may cause inflammation in the organism. Signals that may initiate apoptosis are generally classified into two groups: signals that launch extrinsic apoptotic pathways starting with aggregation of death receptors and intrinsic apoptotic pathways starting with disruption of intracellular homeostasis such as the release of mitochondrial factors or DNA degradation. Early in the process, apoptotic signals may lead to a broad range of signaling mechanisms such as DNA repair and assessment of DNA damage (check points). Thus, failure in any of these steps can cause a defective apoptotic response that plays a decisive role in both tumorigenesis and drug resistance in tumor treatment. More distinctly, the capability of cancer cells to go into apoptosis prevents further neoplastic changes. Generally, the purpose of this study is to investigate the balance between formation of genomic damage and induction of apoptosis under genotoxic stress. After genotoxic insult there are different possibilities for the fate of a cell (Figure 1). The genomic integrity is analyzed at cellular checkpoints, usually leading to a delay in cell cycle progression if DNA was damaged. Mutations in genes such as p53 and p21 change the cellular response to genotoxic stress and may alter the balance between apoptosis and genomic damage. However, p53 is usually mutated or not expressed in 70% of human tumors. Alterations in p53 states that reflect distinct apoptotic response upon induction of DNA damage were examined. In this study, three cell lines with distinct p53 states were used: TK6 harboring wild-type p53, WTK1 with mutated p53 and NH32 with knocked out p53. In the present work we applied different approaches to investigate the correlation between DNA damage and apoptotic responsiveness in cancer cell lines with different p53 states or in hormone responsive cell lines with over expressed bcl-2 gene. We were focused on effects caused by temporary down regulation of the p53 and Bcl-2 activity in human lymphoblastoid cell lines. In addition, we investigated the impact of estradiol-induced proliferation on apoptosis and DNA damage in stably transfected cells with bcl-2gene. N2 - Apoptotische Ereignisse als Reaktion auf exogen induzierten gentoxischen Schaden erhält die Homeostase von Organismen durch die Entfernung betroffener Zellen. Fehler in der apoptotischen Reaktion spielen sowohl für die Tumorentstehung als auch für die Chemotherapie-Resistenz eine wichtige Rolle. Der Zweck dieser Studie war es, die Balance von Genom-Schaden, gemessen durch Mikrokern-Bildung, und der Induktion von Apoptose als Reaktion auf gentoxischen Stress zu untersuchen. Mikrokerne erscheinen als Folge unterschiedlicher Chromosomenaberrationen. Der Mikrokern-Test hat schnell an Akzeptanz gewonnen und wird inzwischen als Routine-Test für Gentoxizitätsprüfung eingesetzt. Die Hypothese war, dass die Mikrokern-Bildung umgekehrt mit dem Auftreten von Apoptose korreliert ist. In drei humanen Zelllinien mit wildtyp p53, mutiertem p53 und knock-out p53 konnten durch Behandlung mit dem gentoxischen Topoisomerase-II-Hemmer Etoposid Apoptosen induziert werden. Die dabei beobachtete Erhöhung der Mikrokern-Häufigkeit war in Zellen mit mutiertem p53 stärker ausgeprägt als in Zellen mit wildtyp p53 oder knock-out p53. Drei Vorgehensweisen wurden angewandt, um die molekularen Mechanismen zu verändern, welche die Wechselbeziehung zwischen apoptotischen Ereignissen und induziertem DNA-Schaden bestimmen. Im ersten Ansatz wurde die Apoptose vorübergehend durch Pifithrin (PFT-α), einen p53-Blocker, verhindert. So wurde der Einfluss verschiedener p53-Zustände (Wildtyp, mutiert und knock-out) auf DNA-Reparatur, den Zellzyklus und Apoptose untersucht. Der zweite Ansatz bestand aus einer vorübergehenden Transfektion mit bcl-2 Antisense Oligonukleotiden zur Reduktion der Bcl-2-Expression. Der dritte Weg war eine stabile Transfektion des bcl-2-Gens in eine estrogenrezeptorhaltigen Zelllinie. Dies ermöglichte den Einfluss von β-Estradiol-induzierter Zellproliferation zu untersuchen. KW - Apoptosis KW - DNS-Schädigung KW - Kleinkern KW - Tumorzelle KW - Apoptose KW - DNA Schaden KW - Micronucleus KW - p53 KW - Bcl-2 KW - Apoptosis KW - DNA damage KW - Micronuclei KW - p53 KW - Bcl-2 Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10605 ER - TY - THES A1 - Adelhardt, Melanie T1 - Einfluß der Dialysetherapie auf den Genomschaden von Nierenpatienten in einer prospektiven Studie T1 - Effect of different treatment modalities on genomic damage of end-stage renal failure patients N2 - Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz haben im Vergleich zur Normalbevölkerung eine deutlich erhöhte Inzidenz maligner Erkrankungen. Frühere Untersuchungen zeigten, dass periphere Blutlymphozyten dieser Patienten einen höheren genetischen Schaden aufweisen, wodurch das Risiko einer malignen Entartung steigt. In dieser Arbeit wurde der genetische Schaden mithilfe zweier Testverfahren, Comet Assay und Mikrokerntest, untersucht. Es handelte sich um eine prospektive Studie mit zwei Patientenkollektiven. Die erste Gruppe bestand aus Patienten, die aufgrund einer terminalen Niereninsuffizienz innerhalb der nächsten Monate eine Dialysetherapie mittels konventioneller Hämodialyse beginnen mußten. Die zweite Gruppe bildeten Dialysepatienten, die im Verlauf von konventioneller Dialyse auf Hämodiafiltration umgestellt wurden. Bei allen Patienten wurde der genetische Schaden der peripheren Blutlymphozyten in den Monaten vor und nach Therapiebeginn bzw. Therapieumstellung regelmäßig untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass 4 der 10 Prädialysepatienten nach Beginn der Dialyse einen niedrigeren genetischen Schaden hatten, 2 Patienten hatten unterschiedliche Werte in Comet Assay und Mikrokerntest und bei 2 Patienten ergab sich im Verlauf eine höhere DNA-Schädigung. Die verbliebenen 2 Patienten mußten aufgrund einer konstant bleibenden Niereninsuffizienz nicht mit der Dialysetherapie beginnen. Bei Zusammenfassung aller Einzelwerte zeigte sich, dass das Kollektiv der Prädialysepatienten insgesamt vom Beginn der Behandlung profitiert hat. In der Gruppe der Dialysepatienten hatte 2 von 7 Patienten nach Umstellung auf Hämodiafiltration eine geringere DNA-Schädigung, 2 Patienten zeigten unterschiedliche Ergebnisse im Comet Assay und Mikrokerntest und 2 weitere Patienten wiesen eine höheren genetischen Schaden in den Lymphozyten auf. Ein Patient konnte bei fehlenden Vorwerten nicht berücksichtigt werden. Im Gruppenvergleich zeigte sich für alle Dialysepatienten ein gleichbleibender DNA-Schaden, gemessen mithilfe des Comet Assays bei leicht erhöhten Mikrokernraten. Jedoch hatte sich die Zellproliferation ebenfalls etwas verbessert. Zusammenfassend ergibt sich somit in beiden Gruppen kein eindeutiges Ergebnis, woraus neue Therapieempfehlungen für Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz abzuleiten wären. Um weiter Einflußvariablen auf die Höhe des genetischen Schadens festzustellen, sind weiter Untersuchungen mit größeren Patientenkollektiven erforderlich. N2 - Patients with end-stage renal disease show a significant higher incidence for cancer compared to the average population. Former studies revealed increased genomic damage – associated with higher risk for malignant transformation – in peripheral blood lymphocytes of these patients. This study investigated the genomic damage by micronucleus frequency and by comet assay analysis. It was set up as a longitudinal study with two groups of patients. The first group includes patients with end-stage renal disease to begin dialysis therapy within the next months. The second group consisted of patients to be treated with conventional hemodialysis, who switched to hemodiafiltration. The genomic damage in the peripheral blood lymphocytes was measured regularly in the months before and after changing the treatment. Our results show, that 4 out of 10 conventionally treated patients had a lower genomic damage. 2 patients showed different results in comet assay analysis and micronucleus frequency and 2 patients revealed an increased genomic damage. The remaininge patients did not need dialysis therapy due to the stable course of their renal disease. The results of all these patients together implicate a reduction of the genomic damage after beginning the dialysis therapy. The group of patients switching from hemodialysis to hemodiafiltration showed following results: 2 patients had lower genomic damage, 2 patients presented different findings in micronucleus frequency and comet assay analysis, whereas the last 2 patients had even an increased genomic damage. One patient had to be excluded due to insufficient data acquired before changing treatment. In this group the comet assay delivered no significant changes in the genomic damage whereas the micronucleus frequency increased slightly. In conclusion there are no consistent findings to set up new therapy standards for patients with end-stage renal disease. Further investigations with more patients are needed to find out more variables influencing the genomic damage. KW - Hämodialyse KW - Hämodiafiltration KW - Genomschaden KW - Comet Assay KW - Mikrokerntest KW - hemodialysis KW - hemodiafiltration KW - genomic damage KW - comet assay analysis KW - micronucleus frequency Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23123 ER - TY - THES A1 - Roman, Adriana T1 - Erhöhung des Genomschadens in der humanen Brustkrebszelllinie MCF-7 durch die Induktion vermehrter Zellproliferation T1 - Increased formation of micronuclei after hormonal stimulation of cell proliferation in human breast cancer cells N2 - Die karzinogene Aktivität von Östradiol wurde bereits in mehreren Studien nachgewiesen und scheint das Ergebnis einer Kombination von hormonellen und genotoxischen Mechanismen zu sein. In der vorliegenden Arbeit konnte ein weiterer Mechanismus der Induktion chromosomaler Schäden durch Östradiol festgestellt werden. Es kam in der östrogenrezeptorpositiven Zelllinie MCF-7 zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der Zellproliferation und Mikrokernsteigerung, als Maß für die chromosomale Schädigung. In der östrogenrezeptornegativen Zelllinie MDA-MB231 konnte weder einer Steigerung der Zellproliferation, noch eine vermehrte Mikrokerninduktion nachgewiesen werden. Die Vermutung ist, dass die Zellen, durch den Proliferationsdruck den Zellteilungszyklus schneller durchlaufen und infolgedessen vermehrt Fehler im Replikationsablauf entstehen können. Zudem können wichtige Reparaturmechanismen oder Zellzykluskontrollpunkte nicht mehr adäquat agieren. N2 - The carcinogenicity of sex hormones is considered to be the result of a combination of genotoxic and epigenetic modes of action. In this work are data presented on the induction of micronuclei in estrogen receptor-positive (MCF-7) and -negative (MDA-MB231) human breast cancer cell lines treated with estradiol to support an additional mechanism of chromosomal damage. MCF-7 cells, but not MDA cells, treated with estradiol in the picomolar concentration range showed an increase in micronucleus formation which correlated with the estradiol-induced cell proliferation. Addition of the specific estradiol-receptor antagonist hydroxytamoxifen suppressed the estradiol-induced formation of micronuclei in MCF-7 cells. The induced genomic damage may be explained by a hormone-specific forcing of responsive cells through the cell cycle, thereby overriding checkpoints operating under homeostatic control of the cell cycle. KW - Genomschaden KW - Mikrokerne KW - Karzinogenese KW - Östrogene KW - Zellproliferationssteigerung KW - micronuclei KW - carcinogenicity KW - estrogen KW - proliferation KW - checkpoints Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23501 ER - TY - THES A1 - Brink, Andreas T1 - The biological significance of chemically-induced DNA adducts in relation to background DNA damage T1 - Die biologische Bedeutung von chemisch induzierten DNA-Addukten in Relation zum Hintergrund-DNA-Schaden N2 - No abstract available KW - DNS-Schädigung KW - DNS-Strangbruch KW - HPLC-MS KW - API-Massenspektrometrie KW - LC-MS KW - Gentoxikologie KW - Mutagenitätstest KW - Dosis-Wirkungs-Beziehung KW - DNA-Addukte KW - Dosis-Wirkungs-Beziehung KW - Hintergrund-DNA-Schaden KW - Comet assay KW - DNA adducts KW - Dose response relationships KW - Background DNA damage Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23850 ER - TY - THES A1 - Simon, Karoline T1 - Development and Evaluation of a Generic HPLC-Tandem MS Screening Method for the Detection of Potential Biomarkers for Reactive Intermediates T1 - Entwicklung und Evaluierung einer generischen HPLC-Tandem MS Methode zur Detektion potentieller Biomarker für Reaktive Intermediate N2 - Conjugation of reactive intermediates of drugs with proteins or DNA may result in toxic effects such as hepatotoxicity, agranulocytosis, allergies, tumors, etc. From 1975 to 1999, 2.9% of drugs were withdrawn from the market due to such severe adverse drug reactions. Thus, formation of chemically reactive intermediates is a widely discussed problem in drug development processes. Early detection of potentially toxic compounds is required for drug discovery and drug development. Conjugation of such electrophilic compounds with glutathione (GSH) is one of the most important detoxifying reactions in vivo. Processing of these GSH-conjugates ultimately leads to the formation of renally cleared mercapturic acids, which may also be oxidized to sulfoxides. Thus, mercapturic acids may be generated and detected in vitro and non-invasively in vivo in urine to assess the reactivity of a compound in early stages of drug development processes. Therefore, the aim of this work was to develop and evaluate a HPLC-MS/MS screening method for simple and rapid detection and characterization of known and unknown mercapturic acids and application of the method to several different matrices. Based on the common constant neutral loss (CNL) of 129 Da of all mercapturic acids tested (in negative ion mode), a CNL survey scan was performed using a linear ion trap instrument and was combined with two enhanced product ion (EPI) scans with different collision energies to characterize the detected signals. The CNL resulted from the cleavage between the sulfur and the carbon atom in the N-acetyl-L-cysteine moiety. After optimization of the experimental parameters, the detection limits of the reference substances in rat urine ranged from 0.3 to 15.5 pmol on column (i.e. 20 ng/ml to 800 ng/ml). For in vitro evaluation of the method, the model compounds acetaminophen, diclofenac, bifonazole, clozapine, troglitazone, carbamazepine, and bisphenol A were screened for formation of reactive intermediates and, hence, detection of the corresponding mercapturic acids. To determine possible species- and tissue-specific toxicities, the model compounds were incubated with stimulated neutrophils and with liver microsomes from rats and humans. Species-specific differences were observed in incubations of acetaminophen and diclofenac with rat and human hepatic microsomes. Tissue-specific differences in biotransformation of the model compounds in incubations with human neutrophils and human liver microsomes were observed for diclofenac, carbamazepine, clozapine, and bifonazole. The developed HPLC-MS/MS method was also evaluated in vivo by analysis of rat and human urine. Drug-related mercapturic acids were detected in urine of rats orally treated with acetaminophen (20 mg/kg and 640 mg/kg b.w.) or diclofenac (10 mg/kg and 20 mg/kg b.w.). Human urine samples were analyzed before and after oral administration of a clinically used dose of 500 mg and 50 mg of acetaminophen. Besides detection of the mercapturic acid of N-acetylbenzoquinoneimine (AAP-MA), a second mercapturic acid with m/z 327 occurred dose-dependently in rat and human urine samples after administration of acetaminophen. Further investigations on identification of this metabolite using authentic compounds and comparing their MS/MS mass spectra demonstrated oxidation of AAP-MA to stereoisomeric sulfoxides in vivo. For diclofenac, a novel mercapturic acid with m/z 441 was detected in rat urine samples that was identical to a metabolite obtained in incubations with human neutrophils before. The in vivo formation of this diclofenac metabolite is described here for the first time. In addition, three endogenously formed mercapturic acids were detected and identified. In conclusion, the results of the in vitro and in vivo evaluation demonstrate the advantages of the rapid and generic HPLC-MS/MS screening method for the detection of mercapturic acids, that can be obtained with a minimum of sample preparation and a high throughput in diverse matrices. N2 - Konjugation reaktiver Intermediate mit Proteinen oder DNA kann zu toxischen Effekten wie Hepatotoxizität, Neutropenie, Allergien, Tumoren u.a. führen. Zwischen 1975 und 1999 wurden 2.9% der zugelassenen Arzneistoffe wegen Auftretens solcher unerwünschten, toxischen Nebenwirkungen vom Markt genommen. Daher stellen Substanzen, die reaktive Intermediate bilden können, ein großes Problem in der Arzneistoffentwicklung dar. Aus diesem Grund ist die pharmazeutische Forschungsindustrie daran interessiert, solche potenziell toxischen Substanzen bereits in frühen Phasen der Arzneistoffentwicklung zu erfassen. Elektrophile, reaktive Intermediate sind instabil und reagieren schnell mit nukleophilen Substraten. Die Konjugation reaktiver Intermediate mit Glutathion stellt hierbei einen der Hauptmechanismen der Detoxifizierung im Organismus dar. In vivo können enzymatisch geregelte Reaktionen das Glutathionaddukt abbauen und so zur Bildung renal ausscheidbarer Merkaptursäuren führen, die auch zu den entsprechenden Sulfoxiden oxidiert werden können. Man kann Merkaptursäuren aber auch direkt durch Konjugation mit N-Acetyl-L-cystein gewinnen. So können reaktive Intermediate in vitro generiert und als Merkaptursäuren detektiert und nicht-invasiv auch in vivo erfasst werden. Ziel dieser Arbeit war es, eine HPLC-MS/MS-Screening-Methode zur einfachen und schnellen Detektion und Charakterisierung von bekannten und unbekannten Merkaptursäuren als Biomarker für die Bildung reaktiver Metabolite in verschiedenen Matrices zu entwickeln und zu evaluieren. Für alle untersuchten Merkaptursäuren und deren Sulfoxide war ein Neutralverlust von 129 Da (im negativen Ionenmodus) charakteristisch. Dieser entstand durch Spaltung der Schwefel-Kohlenstoff-Bindung im Merkaptursäureanteil und diente als Basis für die Entwicklung der HPLC-MS/MS-Methode. Dafür wurde ein CNL-Scan auf 129 Da im negativen Ionenmodus durchgeführt. Der CNL-Scan konnte unter Verwendung der vorhandenen Ionenfalle mit zwei Produkt-ionen-Scans (EPI) mit unterschiedlichen Kollisionsenergien kombiniert und für eine Charakterisierung der detektierten Signale verwandt werden. Nach Optimierung der Instrument- und HPLC-Parameter wurden für die einzelnen Referenzsubstanzen Nachweisgrenzen im Bereich von 0.3 bis 15.5 pmol on column (entspricht einem Bereich von 20 ng/ml bis 800 ng/ml) in Rattenurin bestimmt. Für die In-vitro-Evaluierung der CNL-Screening-Methode wurden die Modellsubstanzen Paracetamol, Diclofenac, Troglitazon, Bifonazol, Clozapin, Carbamazepin und Bisphenol A auf die Bildung reaktiver Intermediate hin untersucht, die durch Zusatz von N-acetylcystein abgefangen wurden. Um eventuell Aufschluß über gewebe- oder speziesspezifische Toxizitäten von Arzneistoffen zu bekommen, wurden die Modellsubstanzen in stimulierten neutrophilen Granulozyten und in Ratten- und Humanlebermikrosomen inkubiert. Speziesspezifische Unterschiede in der Bildung von reaktiven Intermediaten zwischen Inkubationen mit Ratten- und Humanlebermikrosomen wurden bei Paracetamol und Diclofenac beobachtet. Organspezifische Unterschiede in der Bildung von reaktiven Intermediaten zwischen Inkubationen mit neutrophilen Granulozyten und humanen Lebermikrosomen wurden bei Diclofenac, Carbamazepin, Clozapin und Bifonazol gefunden. Die HPLC-MS/MS-Screening-Methode wurde durch Messungen von Ratten- und Humanurinproben auch in vivo evaluiert. Arzneistoffbezogene Merkaptursäuren wurden in Urinproben von Ratten gemessen, die über eine Schlundsonde Paracetamol (20 mg/kg und 640 mg/kg K.G.) bzw. Diclofenac (10 mg/kg und 20 mg/kg K.G.) zugeführt bekommen hatten. Humanurin wurde nach Gabe einer therapeutischen Dosis von 500 mg Paracetamol und einer subtherapeutischen Dosis von 50 mg analysiert. Neben der bekannten Merkaptursäure des N-acetylbenzochinonimins (NAPQI) wurde ein weiterer Metabolit (m/z 327) dosisabhängig in den Urinproben von Ratte und Mensch detektiert. Durch nähere Untersuchungen zur Identifizierung dieses Metaboliten anhand von Referenzsubstanzen und deren Massenspektren konnte nachgewiesen werden, dass das Merkapturat des NAPQI zu stereoisomeren Sulfoxiden oxidiert wurde. Bei den Diclofenac-Proben wurde zum ersten Mal ein Metabolit mit m/z 441 in Rattenurin detektiert und charakterisiert, der nur in Inkubationen mit stimulierten neutrophilen Granulozyten, jedoch nicht mit Lebermikrosomen gebildet wurde. Mit der entwickelten HPLC-MS/MS Screening Methode konnten weitere, vom Arzneistoff unabhängige Merkaptursäuren im Urin detektiert und charakterisiert werden. Schließlich zeigen die Ergebnisse zur In-vitro- und In-vivo-Evaluierung die Vorteile dieser schnellen und generischen HPLC-MS/MS-Screening-Methode zur Detektion von Merkaptursäuren, die mit minimaler Probenvorbereitung und hohem Probendurchsatz für verschiedene Matrices eingesetzt werden kann. KW - Acetylcysteinderivate KW - Reaktive Zwischenstufe KW - Biomarker KW - HPLC-MS KW - Merkaptursäuren KW - Biomarker KW - Massenspektrometrie KW - reaktive Metabolite KW - mercapturic acids KW - biomarker KW - mass spectrometry KW - reactive metabolites Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21916 ER - TY - THES A1 - Nickel, Florian T1 - UCP2 und DIPP2alpha als differentiell exprimierte Kandidatengene in einem murinen Modell der Herzinsuffizienz T1 - UCP2 and DIPP2a: two candidate genes in a murine heart failure model N2 - Die Herzinsuffizienz ist eine der führenden Todesursachen weltweit. Eine auf die neurohumorale Aktivierung zugeschnittene Therapie mit ACE-Hemmern bzw. Angiotensin-Rezeptorantagonisten, Betablockern, Aldosteronantagonisten und Diuretika verbessert zwar die Symptomatik und Prognose. Letztere ist bei Diagnosestellung jedoch immer noch schlechter als die vieler maligner Erkrankungen einzuschätzen. Ziel ist daher die Entwicklung von Medikamenten, die den Krankheitsverlauf des Syndroms Herzinsuffizienz aufhalten bzw. umkehren. Ein Ansatz ist dabei die Analyse sogenannter Kandidatengene, die im kranken Herzen differentiell exprimiert werden und potentiell medikamentös beeinflussbar sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei solcher Kandidatengene charakterisiert. Mäuse mit kardialer Überexpression b1-adrenerger Rezeptoren entwickeln eine Herzinsuffizienz mit kardialer Hypertrophie und Fibrose. In Gen Arrays mit 21000 Maus-ESTs zeigten sich unter anderem die Gene des Uncoupling Protein 2 (UCP2) und der Diphosphoinositol-Polyphosphat-Phosphohydrolase 2 alpha (DIPP2a) aktiviert. Diese Befunde wurden zunächst mittels RNase Protection Assay und RT-PCR bestätigt. Auch andere murine Herzinsuffizienzmodelle wurden untersucht. So ließ sich ebenfalls im druckinduzierten Herzinsuffizienzmodell nach artifizieller Aortenstenose sowie im b2-AR überexprimierenden Herzen eine erhöhte Konzentration von UCP2- und DIPP2a-mRNA messen. Um zu prüfen, ob diese differentielle mRNA-Expression deletäre oder protektive Effekte vermittelt, wurden jeweils transgene Mauslinien mit herzspezifischer Überexpression von UCP2 und DIPP2a generiert. Die Linie UCP2-TG1 mit hoher Überexpression sowie ein Gründer-Tier der UCP2-transgenen Mäuse entwickelten eine Herzinsuffizienz mit vergrößertem Herzen, linksventrikulärem Pumpversagen, interstitieller Fibrose und typischen Veränderungen der molekularen Marker ANF und SERCA. Zudem fanden sich dilatierte Vorhöfe sowie eine bradykarde Herzrhythmusstörung. UCP2 ist ein Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung im Mitochondrium. Im energieintensiven Stoffwechsel des Myokards könnte eine durch UCP2 reduzierte ATP-Synthese zu den genannten Veränderungen führen. Für UCP2 wurden auch protektive Eigenschaften durch das Abfangen freier Radikale beschrieben. Die Linie UCP2-TG3 mit niedrigerem Überexpressionsniveau und ohne kardialen Phänotyp wurde deshalb einem Aortic banding unterzogen, wo sich in der Überlebenskurve kein protektiver oder deletärer Effekt einer moderat vermehrten Entkopplung im Vergleich zum Wildtyp zeigte. In drei unabhängigen Linien transgener Mäuse mit herzspezifischer Überexpression von DIPP2a ließ sich morphometrisch eine kardiale Hypertrophie nachweisen. Die Linie DIPP2a-TG9 mit dem höchsten Überexpressionsniveau zeigte zudem eine kardiale Fibrose sowie unter Dobutamin eine verminderte kardiale Kontraktilitätsreserve im Vergleich zum Wildtypen. DIPP-Proteine hydrolysieren Inositolphosphate und Nukleosiddiphosphate und greifen so in zentrale Stoffwechselvorgänge ein, die im einzelnen noch nicht geklärt sind. Es konnte hier im Mausmodell gezeigt werden, dass UCP2 und DIPP2a zwei für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz relevante Zielproteine darstellen. Geplant ist die weitere Aufklärung der beteiligten Mechanismen, um diese letztlich auch therapeutisch beeinflussen zu können. N2 - The expression of uncoupling protein 2 (UCP2) and diphosphoinositol polyphosphate phosphohydrolase 2 alpha (DIPP2a) was shown to be upregulated in a murine model of chronic heart failure overexpressing beta1-adrenergic receptors and in other heart failure models. These candidate genes could play a protective or detrimental role in the development of chronic cardiac insufficiency. To test this hypothesis mice overexpressing UCP2 and DIPP2a, respectively, were generated. UCP2-transgenes with high expression level developed a chronic heart failure with interstitial fibrosis, cardiac hypertrophy and altered molecular markers of heart failure. They showed dysplastic atria and a bradyarrhythmia. DIPP2a-transgens with high expression level showed minor fibrotic changes in the myocardium in advanced age. Cardiac reserve was reduced as well. UCP2 and DIPP2a are two candidate genes which might be involved in the development of chronic heart failure. KW - UCP2-Protein KW - DIPP2a-Protein KW - Kandidatengene KW - Herzinsuffizienz KW - UCP2 KW - DIPP2a KW - heart failure Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34502 ER - TY - THES A1 - Wagner, Silvia T1 - Identifizierung von Biomarkern mittels LC-MS-basiertem Metabonomics - Merkaptursäuren als Indikatoren für die Bildung toxischer Intermediate T1 - Identification of biomarkers via LC-MS-based metabonomics – mercapturic acids as indicators for the formation of toxic intermediates N2 - Metabonomics bildet das Ende der Omics-Kaskade und stellt eine top-down-Strategie zur Erfassung und Interpretation des Metaboloms, d. h. der Gesamtheit aller niedermolekularen Metaboliten in einem intakten Organismus, dar. Ziel der Technik ist es, mittels geeigneter ungerichteter Screeningverfahren in nicht-invasiv zu gewinnenden biologischen Proben wie Urin oder Blut charakteristische Metabolitenprofile zu bestimmen. Im Kontext des Metabonomics wurde in Anlehnung an den Geno- bzw. Phänotyp hierfür der Begriff „Metabotyp“ geprägt. Durch biostatistische Methoden, die auf Mustererkennung (pattern recognition) basieren, können Signaturen gegenübergestellt und auf diesem Weg gruppenspezifische Metaboliten, d. h. Biomarker bzw. Metabolitenmuster, extrahiert werden. Metabonomics kann folglich als Fusion klassischer bioanalytischer und biostatistischer Verfahren aufgefasst werden. Seit der Einführung im Jahr 1999 hat sich das Konzept des Metabonomics in mehrere Richtungen weiterentwickelt. So gab es Bestrebungen, die Technik, die ursprünglich zur Prädiktion von toxischen Effekten bei der Arzneistoffentwicklung etabliert wurde, auf Fragestellungen zu übertragen, die den Menschen im Mittelpunkt haben. Neben präklinischen Anwendungen verfolgt man mit Metabonomics zunehmend das Ziel, einer personalisierten Medizin und Ernährung einen Schritt näher zu kommen. Da sich die ursprünglich eingesetzte NMR-Technik als zu unempfindlich und die resultierenden Metabolitenprofile als zu anfällig gegenüber biologischen und analytischen Einflussgrößen (Confoundern) erwiesen haben, wurde parallel auf sensitivere Verfahren wie die Massenspektrometrie gesetzt. Insbesondere die Kopplung mit der Hochdruckflüssigchromatographie erwies sich hierbei für das Metabolitenscreening als geeignet. Schnell wurde allerdings klar, dass aus den klassischen full scan/TOF-Methoden Datensätze resultierten, die häufig zu komplex waren, um mit nachgeschalteten chemometrischen Verfahren die „Spreu vom Weizen trennen“ zu können. Da sich Metabolitendatenbanken bisher noch im Aufbau befinden, ist die Identifizierung der Marker mit zusätzlichen Schwierigkeiten verbunden und bedarf aufwändiger analytischer Verfahren. Eine Strategie stellt daher die Beschränkung auf ein Metabolitensubset dar. Indem man sich auf Metabolitenklassen fokussiert, die einen Bezug zum untersuchten Mechanismus haben, können die Erfolgsaussichten bei der Identifizierung charakteristischer Biomarker deutlich erhöht werden. Aufgrund zahlreicher exogener und endogener Faktoren (Arzneistoffe, Industriechemikalien, Nahrungsbestandteile, Tabakrauchbestandteile, Produkte der Lipidperoxidation etc.) ist der menschliche Organismus stets einer Vielzahl an elektrophilen Verbindungen ausgesetzt. Oxidative Schädigungen an Strukturen wie der DNA, Proteinen und Lipiden werden mit einer Reihe von Krankheitsbildern in Zusammenhang gebracht, darunter Parkinson, Alzheimer, Krebs und Volkskrankheiten wie Arteriosklerose, Allergien und koronare Herzerkrankungen. Mit dem Glutathionsystem verfügt der Körper über einen wirksamen Detoxifizierungsmechanismus. Das Tripeptid Glutathion reagiert als Nukleophil mit den exogen oder endogen gebildeten elektrophilen Intermediaten. Endprodukte sind Merkaptursäuren (N-Acetyl-L-Cystein-Addukte) bzw. deren Sulfoxide, die in erster Linie mit dem Urin ausgeschieden werden. Folglich besteht zwischen diesen Merkaptursäurederivaten und der elektrophilen Belastung eines Organismus ein direkter Zusammenhang. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der Arbeit, einen nicht-invasiven Metabonomicsansatz zur Anwendung am Menschen zu entwickeln. Durch die Fokussierung des Metabolitenscreenings auf die Effekt-, Dosis- und Suszeptibilitätsmarkerklasse der Merkaptursäuren sollten hierbei die Erfolgsaussichten im Hinblick auf die Identifizierung potentieller Biomarker für diverse toxikologische sowie medizinische Endpunkte erhöht werden. N2 - Metabonomics forms the end of the omics-cascade and represents a top-down strategy for the interpretation of the metabolome, i. e. all the low molecular weight metabolites in an intact organism. The aim of the approach is to analyse characteristic metabolite profiles by suitable untargeted screening methods in biological samples like urine or blood that can be obtained in a non-invasive manner. In the context of metabonomics, the term “metabotype” was defined according to the geno- and phenotype, respectively. Biostatistical methods based on pattern recognition techniques allow comparing metabolic signatures and extracting group specific metabolites and biomarkers. Therefore, metabonomics can be regarded as the fusion of bioanalytical and biostatistical techniques. Since its introduction in 1999, the concept of metabonomics has permanently gained importance in many fields of scientific research. One aim was to transfer the methodology, which was originally established to predict toxic effects in drug development processes, to human issues. Apart from preclinical questions, metabonomics is increasingly applied in the area of personalised medicine and nutrition. As the NMR technique used by pioneers of the field was too insensitive and the resulting metabolite profiles were too susceptible to biological and analytical confounders, more sensitive techniques like mass spectrometry were more and more applied. Especially mass spectrometry in combination with high performance liquid chromatography showed great promise for the screening of metabolites. However, after a very short time, it was clear that the data sets resulting from full scan/TOF-methods were too complex to “separate the wheat from the chaff” with chemometric procedures. Metabolite databases are still under construction, and therefore marker identification is challenging and requires complex analytical techniques. Thus, one strategy is to concentrate on a certain metabolite subset. The focus on a metabolite class with a close relation to the mechanism under investigation can considerably increase the prospects of success in the biomarker identification process. Due to a variety of exogenous and endogenous factors (drugs, industrial chemicals, food ingredients, and tobacco smoke) the human organism is steadily confronted with a multitude of electrophilic compounds. Oxidative damage of the DNA, proteins, and lipids is associated with the development of diseases like Parkinson’s, Alzheimer’s, cancer and widespread diseases like arteriosclerosis, allergies and coronary heart diseases. With the glutathione system the human organism is equipped with an efficient detoxification mechanism. The tripeptide glutathione reacts as nucleophile with exogenously and endogenously formed electrophilic intermediates. End products are mercapturic acids (N-acetyl-L-cysteine-adducts) and respective sulfoxides that are predominantly excreted with urine. Therefore, there is a close relationship between these mercapturic acid patterns and the electrophilic burden of an organism. In this context, the aim of this thesis was to develop a non-invasive human metabonomics approach that focuses the metabolite screening on the effect, dose and susceptibility marker class of the mercapturic acids. Thus, the prospects of success regarding the identification of potential biomarkers for various toxicological and pathological endpoints should be increased. KW - Metabolom KW - Biomarker KW - Datenanalyse KW - Paracetamol KW - Validierung KW - Tetrachlormethan KW - Raucher KW - Tabakrauch KW - Zigarettenrauch KW - Biostatistik KW - Chemometrie KW - Hauptkomponentenanalyse KW - Methode der partiellen kleinsten Quadrate KW - Diskriminanzanalyse KW - Fl KW - Merkaptursäuren KW - Metabonomics KW - Metabolomics KW - Expositionsmarker KW - mercapturic acids KW - metabonomics KW - metabolomics KW - markers of exposure Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35760 ER - TY - THES A1 - Treutlein, Anna-Teresa T1 - Genomprotektive Wirkung der Vitamine Folsäure und Vitamin B12 in Dialysepatienten T1 - Reduction of the Genomic damage level in hemodialysis patients by Folis acid and Vitamin B12 Supplementation N2 - Bei Dialysepatienten sind vermehrte Genomschäden bekannt, sie unterliegen auch einer erhöhten Karzinominzidenz. Erhöhte Genomschäden können in vivo durch die Substitution von Folsäure reduziert werden, unter Gabe von Vitamin B12 sinkt die Empfindlichkeit gegenüber genotoxischen Agentien. 27 Dialysepatienten nahmen an dieser Studie teil. Die 9 Patienten der Substitutions-gruppe Folsäure erhielten dreimal wöchentlich 15 mg Folsäure intravenös, den 10 Patienten der Substitutionsgruppe Folsäure + Vitamin B12 wurde zusätzlich einmal wöchentlich 1000 µg Vitamin B12 intravenös verabreicht. 8 Dialysepatienten und 7 nicht dialysepflichtige Probanden dienten als Kontrolle. Zu drei Zeitpunkten vor und drei Zeitpunkten nach Substitutionsbeginn wurden die Mikrokernfrequenzen in peripheren, doppelkernigen Lymphozyten bestimmt. Mikro-kerne dienen als Marker für Genomschäden, die Methode ist gut erprobt und es ist ein Zusammenhang zwischen erhöhten Mikrokernfrequenzen und einer prospektiv erhöhten Karzinominzidenz beschrieben. Weiterhin wurden die Homocystein-Plasmaspiegel vor und nach Substitutionsbeginn gemessen. Homocystein zählt zu den Urämietoxinen, in vitro steigt bei erhöhten Homocysteinwerten dosisabhängig der Genomschaden in Form von Mikrokernen an. Vor Substitutionsbeginn wiesen die Dialysepatienten um ein mehrfaches gegenüber den Referenzwerten erhöhte Mikrokernfrequenzen auf, wobei die Mikrokernfrequenzen der Frauen deutlich über denen der Männer lagen. Mit zunehmender Dialysedauer kam es zu einer Reduktion der Mikrokernfrequenz, wobei diese immer noch gegenüber den Referenzwerten erhöht blieb. Unter Gabe von Folsäure + Vitamin B12 kam es zu einem signifikant stärkeren Rückgang der Mikrokernfrequenz als unter alleiniger Folsäuregabe. Dieser Rückgang unter Vitaminsubstitution nahm mit zunehmendem Dialysealter zunächst zu, bei einer Dialysedauer von länger als 10 Jahren nahm er wieder ab. Die Homocysteinspiegel waren vor Substitutionsbeginn deutlich erhöht. Unter kombinierter Gabe von Folsäure und Vitamin B12 kam es zu einer signifikanten Reduktion der Homocysteinwerte, so dass diese sogar unterhalb der im Normbereich liegenden Homocysteinwerte der nicht dialysepflichtigen Kontrollgruppe lagen. Ob die in der Studie vielversprechende kombinierte Substitution von Folsäure und Vitamin B12 tatsächlich das Krebsrisiko von Dialysepatienten beeinflussen kann, wird nur durch prospektive Langzeitstudien zu klären sein. Ebenfalls werden weitere Studien nötig sein, um die optimale Dosis, welche möglicherweise in Abhängigkeit von Alter, Geschlecht, Dialysedauer und Grunderkrankung variieren kann, zu ermitteln. Weitere Vorteile einer therapeutischen Gabe von Folsäure und Vitamin B12 liegen sicherlich einerseits in den vergleichsweise geringen Kosten und andererseits in der guten Verträglichkeit, welche für die Compliance der Patienten von großer Bedeutung ist. N2 - A reduction of genomic damage in PBL can be achieved in dialysis patients by supplementation with folic acid and vitamin b12. This may be mediated by a combination of homocsteine reduction and enhancement of plasma antioxidant capacity. KW - Folsäure KW - Vitamin B12 KW - Dialyse KW - genomprotektiv KW - Mikrokerne KW - folic acid KW - vitamin b12 KW - dialysis patients KW - genomic damage KW - micronuclei Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36028 ER - TY - THES A1 - Bermel, Christina Maria T1 - Regulation von G-beta-gamma-Untereinheiten durch Phosducin-ähnliche Proteine (PhLP) T1 - Regulation of Gbetagamma-subunits by phosducin-like proteins (PhLP) N2 - Phosducin-like protein (PhLP) gehört zur Phosducinfamilie der G-Protein-betagamma-Regulatoren und kommt in zwei Spleißvarianten vor. Die lange Isoform PhLPlong und die kurze Isoform PhLPshort unterscheiden sich allein durch das Vorhandensein des 81 Aminosäuren langen N-Terminus von PhLPlong. In Versuchen mit gereinigten Proteinen erwies sich PhLPlong als der stärkere Gbetagamma-Inhibitor, während die Bedeutung von PhLPshort nicht bekannt war. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß in transfizierten HEK 293-Zellen PhLPshort die Gbetagamma-vermittelte Signalbildung 20mal stärker hemmt als PhLPlong. Da der zusätzliche N-Terminus von PhLPlong mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen für die konstitutiv aktive Caseinkinase 2 besitzt, wurde angenommen, daß die lange Spleißvariante in Zellen einer solchen Regulation unterliegt, was sich auf seine Funktion als Gbetagamma-Inhibitor auswirkt. Durch schrittweise Trunkierungen bzw. Serin-/Threonin-Alaninmutationen wurden die potentiellen Phosphorylierungsstellen entfernt, was zur Verbesserung der Gbetagamma-Hemmfähigkeit führte. Der N-terminale Aminosäurenabschnitt Ser-18/Thr-19/Ser-20 wurde dabei als die verantwortliche Stelle identifiziert. In unserer Arbeitsgruppe wurde gezeigt, daß PhLPlong in HEK 293-Zellen im Gegensatz zu PhLPshort einer konstitutiven Phosphorylierung unterliegt und durch die Caseinkinase2 katalysiert wird. In dieser Arbeit werden die Phosphorylierung von PhLPlong durch die Caseinkinase2 anhand von rekombinanten Proteinen sowie ihre Kinetik dargestellt. Das Vorhandensein von mRNA der Caseinkinase2 in HEK 293-Zellen zeigt, daß sie in der Zelle exprimiert und somit aktiv ist, was ihre physiologische Bedeutung herausstellt. Eine direkte Gbetagamma-Bindung konnte durch Immunpräzipitation nur für PhLPlong nachgewiesen werden, weswegen für PhLPshort ein alternativer Mechanismus der Gbetagamma-Hemmung angenommen wurde, was in folgenden Arbeiten näher untersucht wurde. N2 - Phosducin-like protein (PhLP) is a member of the phosducin family of G-protein betagamma-regulators and exists in two splice variants. The long isoform PhLPlong and the short isoform PhLPshort differ by the presence or absence of an 81 amino-acid N terminus. In isolated biochemical assay systems PhLPlong is the more potent Gbetagamma-inhibitor, whereas the functional role of PhLPshort is still unclear. In this work we report that in intact HEK 293 cells PhLPshort inhibited Gbetagamma-induced inositol phosphate generation with ~20-fold greater potency than PhLPlong. As the additional N terminus of PhLPlong contains several putative phosphorylation sites for the constitutively active casein kinase 2, we presumed that the long splice variant undergoes such a regulation in cells, which reduces its ability to inhibit Gbetagamma-subunits. In this work it was shown in assay systems with recombinant proteins that only the long splice variant PhLPlong is phosphorylated by casein kinase 2 in HEK 293 cells. The presence of mRNA of casein kinase 2 in HEK 293 cells demonstrates its physiological role. Progressive truncation and serine/threonine to alanine mutations of the PhLPlong N terminus identified a serine/threonine cluster (Ser-18/Thr-19/Ser-20) within a small N-terminal region of PhLPlong (amino acids 5-28) as the site where PhLPlong function was modified in HEK 293 cells. Co-immunoprecipitations of transsiently transfected HEK 293 cells showed a direct binding of Gbetagamma-subunits only for the weaker inhibitor PhLPlong. Therefore we considered an alternative mechanism of Gbetagamma-inhibition for PhLPshort which has been examined in further publications. KW - Phosducin-ähnliches protein (PhLP) KW - G-Protein KW - Gbetagamma-Untereinheiten KW - Caseinkinase 2 KW - phosducin-like protein (PhLP) KW - G-protein KW - Gbetagamma-subunits KW - casein kinase 2 Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19981 ER - TY - THES A1 - Behr, Björn T1 - Neue Mutanten des humanen beta1-adrenergen Rezeptors zeigen für die Rezeptoraktivierung relevante Aminosäuren T1 - NOVEL MUTANTS OF THE HUMAN BETA1-ADRENERGIC RECEPTOR REVEAL AMINO ACIDS RELEVANT FOR RECEPTOR ACTIVATION N2 - Eine durch Aktivierung eines G-Protein gekoppelten Rezeptors induzierte Konfirmationsänderung resultiert in einer Signaltransduktion durch das G-Protein zu einem Effektorenzym wie der Adenylylcyclase. In dieser Arbeit konnten Aminosäuren in dem zur G-Protein gekoppelten Rezeptorfamilie zugehörigen beta1-adrenergen Rezeptor identifiziert werden, welche für dessen Aktivierung von Bedeutung sind. Der Analyse von beta1-adrenergen Rezeptormutanten lag die Erkenntnis zu Grunde, dass therapeutisch genutzte Liganden wie Terbutalin, oder das experimentell eingesetzte Broxaterol Agonisten am beta2- und beta3-adrenergen Rezeptor, jedoch Antagonisten am beta1-adrenergen Rezeptor sind. Dieses Verhalten wurde zum Anlass genommen spezifische Aminosäuren zu identifizieren, welche eine bedeutende Funktion in der Aktivierung von beta -Rezeptorsubtypen haben könnten. Nach einem Aminosäurevergleich innerhalb der Familie der beta-adrenergen Rezeptoren konnten Aminosäurepositionen identifiziert werden, die identisch im beta2- bzw. beta3-Rezeptor sind und sich von denen des beta1- Rezeptors unterscheiden und damit das Aktivierungsprofil von Broxaterol und Terbutalin widerspiegeln. Mit zielgerichteten Punktmutationen wurden nun insbesondere im Bereich der Transmembranregionen solche Aminosäuren im beta1-adrenergen Rezeptor durch die entsprechende des beta2- (beta3-) Rezeptors ersetzt. Obwohl keine der getesteten Mutanten Unterschiede im pharmakologischen Bindungsprofil zeigten, konnten vier Mutanten gefunden werden, welche partiell oder vollständig durch Broxaterol oder Terbutalin aktiviert wurden. Die beiden Mutanten I185L sowie D212N konnten mit Broxaterol und Terbutalin aktiviert werden, zwei Liganden, die Antagonisten am beta1- Wildtyprezeptor sind. Außerdem konnten zwei weitere Mutanten, V120L und K253R, durch Terbutalin aktiviert werden. Betrachtet man die Struktur von Terbutalin, so ist dieser Ligand den endogenen Katecholaminen ähnlicher als Broxaterol. Ein Rezeptormodell zeigt, dass die vier relevanten Aminosäuren außerhalb der Ligandenbindungsregion liegen und somit eine direkte Interaktion mit dem Liganden unwahrscheinlich erscheint. Diese These wird durch das im Vergleich zum Wildtyp nicht veränderte Bindungsprofil der beta1-Rezeptormutanten unterstützt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Aminosäuren V120, I185, D212 und K253 in der ligandeninduzierten Konfirmationsänderung des beta1-Rezeptors von Bedeutung sind. N2 - Activation of G protein-coupled receptors like the beta1-adrenergic receptor results in conformational changes which ultimately lead to signal propagation through a G protein to an effector like adenylyl cyclase. In this study we identify amino acids which seem to be critical for activation of the human beta1-adrenergic receptor. Activation patterns of mutant receptors were analyzed using two structurally different ligands for beta-adrenergic receptors which both are mixed agonist/antagonists. Broxaterol and terbutaline are agonists at beta2- and beta3-receptors, however, they act as antagonists at the beta1-subtype. We reasoned that this functional selectivity may be reflected by a corresponding sequence pattern in the receptor subtypes. Therefore, we exchanged single amino acids of the beta1-adrenergic receptor for residues that were identical in the beta2- and beta3- subtypes but different in the beta1-receptor. Pharmacological characterization of such receptor mutants revealed that binding of a panel of agonists and antagonists including broxaterol and terbutaline was unaltered. However, two of the mutants (I185V and D212N) were activated by broxaterol and terbutaline which acted as antagonists at the wilde-type receptor. Two additional mutants (V120L and K253R) could be activated by terbutaline alone which is structurally more closely related to endogenous catecholamines like epinephrine than to broxaterol. A model of the human beta1-adrenergic receptor showed that the four gain-of-function mutations are outside of the putative ligand-binding domain substantiating the lack of an effect of the mutations on binding characteristics. These results support the notion that V120, I185, D212 and K253 are critically involved in conformational changes occuring during receptor activation. KW - Adrenerger Rezeptor KW - Mutation KW - Aktivierung KW - Adrenergic Receptor KW - Mutation KW - Activation Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19074 ER - TY - THES A1 - Klenk, Johann Christoph T1 - Posttranslationale Modifikation von Phosducin durch den small ubiquitin-related modifier "SUMO" T1 - Posttranslational modification of phosducin with the small ubiquitin-related modifier 'SUMO' N2 - Die Rezeptor vermittelte Aktivierung heterotrimerer G-Proteine ist einer der bedeutendsten Signaltransduktionsmechanismen in vielen Organismen. Die Vielzahl unterschiedlicher Rezeptoren und Agonisten macht eine effektive Kontrolle des einzelnen Signals unumgänglich. Das zytosolische Protein Phosducin bindet beta-gamma-Untereinheiten aktivierter G-Proteine und hemmt damit sowohl Gbeta-gamma-vermittelte Effekte als auch Galpha-vermittelte Effekte. In der vorliegenden Arbeit wurde neben der bekannten 33 kDa Form von Phosducin eine weitere 47 kDa große Form in der Retina und im Herz identifiziert. Hierbei handelte es sich um Phosducin, welches mit dem small ubiquitin-related modifier, SUMO, modifiziert war. Weiterhin wurde sowohl in vitro als auch in zellulären Sytemen gezeigt, dass Phosducin mit einem Molekül SUMO an Lysin 33 modifiziert wird. Durch punktgerichtete Mutation dieser Modifikationsstelle wurde eine SUMOylierungs-defiziente Phosducin-Mutante generiert. Diese Mutante unterliegt einem gesteigerten Turnover im Vergleich zu Wildtyp-Phosducin, welcher auf die verstärke Ubiquitinierung und dem damit verbundenen proteasomalen Abbau der Mutante zurückzuführen war. Dies demonstriert, dass SUMOylierung von Phosducin protektive Wirkung auf dieses Protein hat. Darüberhinaus behindert die SUMOylierung von Phosducin dessen Bindung an Gbeta-gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine. Diese Beobachtungen erlauben den Schluss, dass SUMOylierung neben der Phosphorylierung ein neuer und wichtiger Mechanismus ist, über den die Verfügbarkeit von Phosducin als G-Protein-Regulator kontrolliert wird. N2 - Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins is one of the most important signalling mechanisms in many organisms. The variety of different receptors and ligands require a tight control of the individual signalling processes. The cytosolic protein Phosducin has been show to tightly bind to Gbeta-gamma subunits of heterotrimeric G-proteins thereby attenuating Gbeta-gamma and G-alpha mediated signals. In the present study a previously unknown 47 kDa high molecular isoform of 33 kDa protein phosducin was identified in the retina and the heart. This isoform was shown to be phosducin modified with the small ubiquitin-related modifier SUMO. Further experiments in vitro and in cells revealed that phosducin is modified with SUMO at lysine 33. Mutation of lysine 33 abolished SUMOylation of phosducin. Compared to wild-type phosducin the SUMOylation-deficient mutant of phosducin revealed reduced steady state protein levels and increased ubiquitination. This suggests that SUMOylation is protecting phosducin from ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Moreover, SUMOylation of phosducin decreased its ability to bind to Gbeta-gamma subunits of heterotrimeric G-proteins. Together, these findings show that phosducin is a previously unrecognized target of SUMO modification, and that SUMOylation controls phosducin stability in cells as well as its functional properties. KW - SUMO KW - Ubiquitin KW - Phosducin KW - G-Protein KW - posttranslationale Modifikation KW - SUMO KW - ubiquitin KW - phosducin KW - G-protein KW - posttranslational modification Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19140 ER - TY - THES A1 - Winkler, Michaela T1 - Einfluss einer fortgesetzten Benfotiamintherapie auf die Konzentration zirkulierender Advanced Glycation Endproducts, proinflammatorischer Zytokine und DNA-Läsionen bei Hämodialysepatienten T1 - Influence of a prolonged therapy with benfotiamine on the concentration of circulating advanced glycation endproducts, proinflammatory cytokines and DNA-lesions at hemodialysis patients N2 - Der Einsatz der Vitamin B 1 Vorstufe Benfotiamin hat sich im Tiermodell durch Verhinderung oder gar Aufhebung typischer diabetischer Folgeschäden wie Ne- phropathie, Retinopathie und Neuropathie ausgezeichnet. Diese Wirkung wird unter anderem der Aktivitätssteigerung des Enzyms Transketolase zugeschrie- ben, welches auch bei Dialysepatienten ohne diabetische Grunderkrankung sup- primiert ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Auswirkungen einer ora- len Benfotiaminsubstitution auf den Stoffwechsel von Langzeithämodialysepati- enten zu untersuchen. Die 15 rekrutierten Patienten mit und ohne Diabetes mel- litus erhielten über einen Zeitraum von 2 Monaten eine Dosis von 300 mg/d Benfotiamin, die in den folgenden 2 Monaten bis maximal 450 mg/d gesteigert wurde. Um einen Eindruck über den Verlauf der Entzündungssituation und des oxidativen Stresses zu gewinnen, wurden im Patientenvollblut AGEs und pro- inflammatorische Zytokine gemessen. Außerdem wurden peripheren Lympho- zyten mit Hilfe des alkaline Comet-Assay und des Mikrokerntestes auf DNA- Schädigungen analysiert. In beiden Patientengruppen lässt die Senkung der Mi- krokernraten den Schluss zu, dass Benfotiamin DNA-Schäden und somit eventu- ell das Krebsrisiko reduziert. Dieses vielversprechende Ergebnis korreliert jedoch nicht mit dem Resultat des Comet-Assay. Da hier der relative DNA-Schaden ten- dentiell ansteigt, sollte es Ziel weiterer Studien sein, diesen Sachverhalt an ei- nem größeren Patientenkollektiv mit Kontrollgruppen zu überprüfen. Eventuell ist letzteres Testsystem wegen seiner hohen Sensitivität in diesem Fall nicht op- timal geeignet. Außerdem sollte gezielt auf die beobachtete schnellere und stär- kere Mikrokernsenkung der diabetischen Patienten eingegangen werden, da die- se in der vorliegenden Studie zahlenmäßig unterrepräsentiert waren. Positiv zu bewerten ist der leichte CRP-Abfall sowie der Anstieg des Gesamtproteins und Albumin im Serum, was auf eine Reduktion der Mikroinflammation und oder eine verbesserte Ernährungssituation hinweist. Andererseits spricht der Anstieg des Neopterin- und Interleukin 6-Spiegels gegen die Veränderung des Inflamma- tionsstatus. Entgegen der Erwartung ließ sich in dieser Studie keine Reduktion der zirkulierenden AGEs und AOPPs im Serum erzielen. Um eine Reduktion des oxidativen Stresses besser beurteilen zu können, sollten in Folgestudien direkte und leicht veränderliche Marker wie der Glutathionspiegel verwendet werden. Zusammenfassend reduzierte Benfotiamin bei Hämodialysepatienten mit und ohne Diabetes mellitus DNA-Schäden in peripheren Lymphozyten bei unver- änderter Inflammationssituation und steigerte die Plasmaproteinkonzentration. Dies wurde eventuell durch Reduktion von oxidativem Stress und oder Beein- flussung seiner Ursachen wie Reduktion von Urämietoxinen erreicht.Weitere kli- nische Studien sind notwendig, um dieses vielversprechende Medikament in der täglichen Praxis einsetzen zu können. Besonders vorteilhaft ist seine gute Verträg- lichkeit auch in hoher Dosierung. Darüber hinaus soll das Präparat auch neuro- patische Schmerzen reduzieren, die sich bei Dialysepatienten häufig manifestie- ren, und wirkt somit multikausal. N2 - It has been shown in animal models, that Benfotiamine, a precursor of the vitamine B1, prevents typical complications of diabets, like nephropathy, retinopathy and neuropathy. This effect is attributed to the increased activity of the enzyme trankelotase. The latter is also suppressed in patients of the hemodialysis program who are not diabetic. The goal of this thesis was to show the effects of an oral administration of benfotiamine on longterm hemodialysis patients. Fifteen patients were treated with 300 mg per day of benfotiamine which was increased in the following two months to 450 mg per day. The patient group consisted of a sub-group of diabetic and non-diabetic individuals. Advanced glycation endproducts (AGEs) and proinflammatory cytocines were measured in patients full-blood to show the impact on the inflammation and the oxidative stress situation. The DNA-damage in peripheral lymphocytes was determined using the alkaline comet-assay and the micronucleus-assay. The rate of micronuclei was diminished in both patient groups which could be attributed to the reduction of DNA-damage by benfotiamine and so eventually to a reduced risk of cancer. However, this result does not agree with the comet-assay experiments. The relative DNA-damage increased in the course of the study and so seems to be unaffected by the benfotiamine therapy. This may be attributed to the high sensitivity of the comet-assay technique. Therefore, further investigations with a bigger patient group in a double-blind study are necessary. Additionally, there should be a greater focus on diabetic patients that showed a faster and increased reduction of micronuclei which were underrepresentated in this study. The slight reduction of CRP and the increased protein and serum-albumine concentration correlates to a better nutritional status. On the other hand, the increasing neopterine and interleukine 6 level do not agree to the changes in the inflammatory situation. Against all expectations there was no reduction of AGEs and AOPPs in patients serum. Following studies should focus on rapidly changing direct markers like the glutathione level. In summary, benfotiamine reduces DNA-damage in peripheral lymphocytes in hemodialysis patients with or without diabetes. The plasma protein concentration was increased but unexpectedly the inflammatory situation was stable. These effects may be due to a reduction of oxidative stress or its causes like diminished ureamic toxines. One of Benfotiamines advantages is its good tolerance, even in increased dosages. Furthermore it seems to diminish neuropathic pain which is frequent in hemodialysis patients. However, more clinical studies are neccessary for a use in daily practice. KW - Benfotiamin KW - Advanced glycosylation end products KW - Comet Assay KW - Dialyse KW - Cytokine KW - Mikronukleus-Assay KW - benfotiamine KW - advanced glycosylation end product KW - hemodialysis patients KW - comet-assay Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27563 ER -