TY - JOUR A1 - Janz, Anna A1 - Walz, Katharina A1 - Cirnu, Alexandra A1 - Surjanto, Jessica A1 - Urlaub, Daniela A1 - Leskien, Miriam A1 - Kohlhaas, Michael A1 - Nickel, Alexander A1 - Brand, Theresa A1 - Nose, Naoko A1 - Wörsdörfer, Philipp A1 - Wagner, Nicole A1 - Higuchi, Takahiro A1 - Maack, Christoph A1 - Dudek, Jan A1 - Lorenz, Kristina A1 - Klopocki, Eva A1 - Ergün, Süleyman A1 - Duff, Henry J. A1 - Gerull, Brenda T1 - Mutations in DNAJC19 cause altered mitochondrial structure and increased mitochondrial respiration in human iPSC-derived cardiomyocytes JF - Molecular Metabolism N2 - Highlights • Loss of DNAJC19's DnaJ domain disrupts cardiac mitochondrial structure, leading to abnormal cristae formation in iPSC-CMs. • Impaired mitochondrial structures lead to an increased mitochondrial respiration, ROS and an elevated membrane potential. • Mutant iPSC-CMs show sarcomere dysfunction and a trend to more arrhythmias, resembling DCMA-associated cardiomyopathy. Background Dilated cardiomyopathy with ataxia (DCMA) is an autosomal recessive disorder arising from truncating mutations in DNAJC19, which encodes an inner mitochondrial membrane protein. Clinical features include an early onset, often life-threatening, cardiomyopathy associated with other metabolic features. Here, we aim to understand the metabolic and pathophysiological mechanisms of mutant DNAJC19 for the development of cardiomyopathy. Methods We generated induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) of two affected siblings with DCMA and a gene-edited truncation variant (tv) of DNAJC19 which all lack the conserved DnaJ interaction domain. The mutant iPSC-CMs and their respective control cells were subjected to various analyses, including assessments of morphology, metabolic function, and physiological consequences such as Ca\(^{2+}\) kinetics, contractility, and arrhythmic potential. Validation of respiration analysis was done in a gene-edited HeLa cell line (DNAJC19tv\(_{HeLa}\)). Results Structural analyses revealed mitochondrial fragmentation and abnormal cristae formation associated with an overall reduced mitochondrial protein expression in mutant iPSC-CMs. Morphological alterations were associated with higher oxygen consumption rates (OCRs) in all three mutant iPSC-CMs, indicating higher electron transport chain activity to meet cellular ATP demands. Additionally, increased extracellular acidification rates suggested an increase in overall metabolic flux, while radioactive tracer uptake studies revealed decreased fatty acid uptake and utilization of glucose. Mutant iPSC-CMs also showed increased reactive oxygen species (ROS) and an elevated mitochondrial membrane potential. Increased mitochondrial respiration with pyruvate and malate as substrates was observed in mutant DNAJC19tv HeLa cells in addition to an upregulation of respiratory chain complexes, while cellular ATP-levels remain the same. Moreover, mitochondrial alterations were associated with increased beating frequencies, elevated diastolic Ca\(^{2+}\) concentrations, reduced sarcomere shortening and an increased beat-to-beat rate variability in mutant cell lines in response to β-adrenergic stimulation. Conclusions Loss of the DnaJ domain disturbs cardiac mitochondrial structure with abnormal cristae formation and leads to mitochondrial dysfunction, suggesting that DNAJC19 plays an essential role in mitochondrial morphogenesis and biogenesis. Moreover, increased mitochondrial respiration, altered substrate utilization, increased ROS production and abnormal Ca\(^{2+}\) kinetics provide insights into the pathogenesis of DCMA-related cardiomyopathy. KW - cell biology KW - molecular biology KW - dilated cardiomyopathy with ataxia KW - genetics KW - metabolism KW - mitochondria KW - OXPHOS KW - ROS KW - contractility Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350393 SN - 2212-8778 VL - 79 ER - TY - JOUR A1 - Jarzina, Sebastian A1 - Di Fiore, Stefano A1 - Ellinger, Bernhard A1 - Reiser, Pia A1 - Frank, Sabrina A1 - Glaser, Markus A1 - Wu, Jiaqing A1 - Taverne, Femke J. A1 - Kramer, Nynke I. A1 - Mally, Angela T1 - Application of the adverse outcome pathway concept to in vitro nephrotoxicity assessment: kidney injury due to receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload as a case study JF - Frontiers in Toxicology N2 - Application of adverse outcome pathways (AOP) and integration of quantitative in vitro to in vivo extrapolation (QIVIVE) may support the paradigm shift in toxicity testing to move from apical endpoints in test animals to more mechanism-based in vitro assays. Here, we developed an AOP of proximal tubule injury linking a molecular initiating event (MIE) to a cascade of key events (KEs) leading to lysosomal overload and ultimately to cell death. This AOP was used as a case study to adopt the AOP concept for systemic toxicity testing and risk assessment based on in vitro data. In this AOP, nephrotoxicity is thought to result from receptor-mediated endocytosis (MIE) of the chemical stressor, disturbance of lysosomal function (KE1), and lysosomal disruption (KE2) associated with release of reactive oxygen species and cytotoxic lysosomal enzymes that induce cell death (KE3). Based on this mechanistic framework, in vitro readouts reflecting each KE were identified. Utilizing polymyxin antibiotics as chemical stressors for this AOP, the dose-response for each in vitro endpoint was recorded in proximal tubule cells from rat (NRK-52E) and human (RPTEC/TERT1) in order to (1) experimentally support the sequence of key events (KEs), to (2) establish quantitative relationships between KEs as a basis for prediction of downstream KEs based on in vitro data reflecting early KEs and to (3) derive suitable in vitro points of departure for human risk assessment. Time-resolved analysis was used to support the temporal sequence of events within this AOP. Quantitative response-response relationships between KEs established from in vitro data on polymyxin B were successfully used to predict in vitro toxicity of other polymyxin derivatives. Finally, a physiologically based kinetic (PBK) model was utilized to transform in vitro effect concentrations to a human equivalent dose for polymyxin B. The predicted in vivo effective doses were in the range of therapeutic doses known to be associated with a risk for nephrotoxicity. Taken together, these data provide proof-of-concept for the feasibility of in vitro based risk assessment through integration of mechanistic endpoints and reverse toxicokinetic modelling. KW - adverse outcome pathway (AOP) KW - nephrotoxicity KW - QIVIVE KW - risk assessment KW - key event relationship KW - In vitro toxicity testing Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-284796 SN - 2673-3080 VL - 4 ER - TY - THES A1 - Jarzina, Sebastian Oskar T1 - Assessment of systemic toxicity in vitro using the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept: nephrotoxicity due to receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload and inhibition of mtDNA polymerase-ɣ as case studies T1 - Bewertung der systemischen Toxizität in vitro unter Verwendung des Adverse Outcome Pathway (AOP)-Konzepts: Nephrotoxizität infolge rezeptorvermittelter Endozytose und lysosomaler Überlastung sowie Hemmung der mtDNA-Polymerase-ɣ als Fallstudien N2 - The US National Research Council (NRC) report "Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)", published in 2007, calls for a complete paradigm shift in tox-icity testing. A central aspect of the proposed strategy includes the transition from apical end-points in in vivo studies to more mechanistically based in vitro tests. To support and facilitate the transition and paradigm shift in toxicity testing, the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept is widely recognized as a pragmatic tool. As case studies, the AOP concept was ap-plied in this work to develop AOPs for proximal tubule injuries initiated by Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload and Inhibition of mtDNA polymerase-. These AOPs were used as a mechanistic basis for the development of in vitro assays for each key event (KE). To experimentally support the developed in vitro assays, proximal tubule cells from rat (NRK-52E) and human (RPTEC/TERT1) were treated with model compounds. To measure the dis-turbance of lysosomal function in the AOP – Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload, polymyxin antibiotics (polymyxin B, colistin, polymyxin B nonapeptide) were used as model compounds. Altered expression of lysosomal associated membrane protein 1/2 (LAMP-1/2) (KE1) and cathepsin D release from lysosomes (KE2) were determined by im-munofluorescence, while cytotoxicity (KE3) was measured using the CellTiter-Glo® cell via-bility assay. Importantly, significant differences in polymyxin uptake and susceptibility be-tween cell lines were observed, underlining the importance of in vitro biokinetics to determine an appropriate in vitro point of departure (PoD) for risk assessment. Compared to the in vivo situation, distinct expression of relevant transporters such as megalin and cubilin on mRNA and protein level in the used cell lines (RPTEC/TERT1 and NRK-52E) could not be con-firmed, making integration of quantitative in vitro to in vivo extrapolations (QIVIVE) neces-sary. Integration of QIVIVE by project partners of the University of Utrecht showed an im-provement in the modelled biokinetic data for polymyxin B. To assess the first key event, (KE1) Depletion of mitochondrial DNA, in the AOP – Inhibition of mtDNA polymerase-, a RT-qPCR method was used to determine the mtDNA copy number in cells treated with mod-el compounds (adefovir, cidofovir, tenofovir, adefovir dipivoxil, tenofovir disoproxil fumarate). Mitochondrial toxicity (KE2) was measured by project partners using the high-content imaging technique and MitoTracker® whereas cytotoxicity (KE3) was determined by CellTiter-Glo® cell viability assay. In contrast to the mechanistic hypothesis underlying the AOP – Inhibition of mtDNA polymerase-, treatment with model compounds for 24 h resulted in an increase rather than a decrease in mtDNA copy number (KE1). Only minor effects on mitochondrial toxicity (KE2) and cytotoxicity (KE3) were observed. Treatment of RPT-EC/TERT1 cells for 14 days showed only a slight decrease in mtDNA copy number after treatment with adefovir dipivoxil and tenofovir disoproxil fumarate, underscoring some of the limitations of short-term in vitro systems. To obtain a first estimation for risk assessment based on in vitro data, potential points of departure (PoD) for each KE were calculated from the obtained in vitro data. The most common PoDs were calculated such as the effect concentra-tion at which 10 % or 20_% effect was measured (EC10, EC20), the highest no observed effect concentration (NOEC), the lowest observed effect concentration (LOEC), the benchmark 10 % (lower / upper) concentrations (BMC10, BMCL10, BMCU10) and a modelled non-toxic con-centration (NtC). These PoDs were then compared with serum and tissue concentrations de-termined from in vivo studies after treatment with therapeutic / supratherapeutic doses of the respective drugs in order to obtain a first estimate of risk based on in vitro data. In addition, AOPs were used to test whether the quantitative key event relationships between key events allow prediction of downstream effects and effects on the adverse outcome (AO) based on measurements of an early key event. Predictions of cytotoxicity from the mathematical rela-tionships showed good concordance with measured cytotoxicity after treatment with colistin and polymyxin b nonapeptide. The work also revealed uncertainties and limitations of the ap-plied strategy, which have a significant impact on the prediction and on a risk assessment based on in vitro results. N2 - Der Bericht des US National Research Council (NRC) „Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)“, der 2007 veröffentlicht wurde, sieht einen vollständigen Paradigmenwechsel in der Toxizitätsprüfung vor. Ein zentraler Aspekt des Berichts beinhaltet den Übergang von apikal ermittelten Endpunkten für Toxizität in in vivo Studien, zu mehr mechanistisch basierten in vitro Tests. Um den Übergang zu erleichtern und den Paradigmen-wechsel in der Prüfung auf Toxizität zu unterstützen, wird das Adverse Outcome Pathway (AOP) Konzept als pragmatisches Instrument weithin anerkannt. In dieser Arbeit wurde das AOP Konzept angewandt, um neue Ansätze zur Prüfung auf systemische Toxizität zu unter-suchen. Dazu wurden AOPs für proximale Tubulusschäden, die durch lysosomale Überladung und Inhibition der mtDNA Polymerase- initiiert werden, entwickelt. Diese AOPs wurden als mechanistische Grundlage für die Entwicklung von mechanistisch relevanten in vitro Tests für jedes Schlüsselereignis (KE) verwendet. Um die entwickelten in vitro Tests experimentell zu unterstützen, wurden proximale Tubuluszellen aus der Ratte (NRK-52E) und aus dem Men-schen (RPTEC/TERT1) mit Hilfe von Modellsubstanzen behandelt. Zur Messung der Störung der lysosomalen Funktion im AOP – Rezeptor-vermittelte Endozytose und lysosomale Überla-dung wurden Polymyxin-Antibiotika (Polymyxin B, Colistin, Polymyxin B Nonapeptid) als Modellsubstanzen verwendet. Die gestörte Expression des lysosomal assoziierten Membran-proteins 1/2 (LAMP 1/2) (KE1) und die Cathepsin D Freisetzung (KE2) wurden mittels Im-munofluoreszenztechnik bestimmt und die Zytotoxizität (KE3) mittels CellTiter-Glo® Zellvia-bilitätstest gemessen. Zwischen den Zelllinien wurden signifikante Unterschiede in der Auf-nahme von Polymyxinen und der Empfindlichkeit beobachtet, was die Bedeutung der in vitro Biokinetik zur Definition eines geeigneten Ausgangspunktes für die Risikobewertung unter-streicht. Im Vergleich zur in vivo Situation, konnte eine eindeutige Expression von relevanten Trans-portern wie Megalin und Cubilin auf mRNA und Proteinebene in den verwendeten Zelllinien (RPTEC/TERT1 und NRK-52E) nicht gezeigt werden, was eine zusätzliche Integration von quantitativen in vitro zu in vivo Extrapolationen (QIVIVE) unabdingbar macht. Die Integrati-on von QIVIVE durch Projektpartner der Universität Utrecht zeigte eine Verbesserung der modellierten biokinetischen Werte für Polymyxin B. Zur Bestimmung des ersten Schlüsseler-eignisse, (KE1) Depletion von mitochondrialer DNA, im AOP – Hemmung der mitochondria-len DNA Polymerase-, wurde nach Behandlung mit Modellsubstanzen (Adefovir, Cidofovir, Tenofovir, Adefovirdipivoxil, Tenofovirdisoproxil Fumarat) eine RT-qPCR Methode verwen-det, um die mtDNA Kopienzahl zu bestimmen. Die mitochondriale Toxizität (KE2) wurde mittels eines hochauflösenden Bildgebungsverfahrens und MitoTracker® vom Projektpartner des Fraunhofer Institut in Hamburg gemessen, während die Zytotoxizität (KE3) mittels Cel-lTiter-Glo® Zellviabilitätstest ermittelt wurde. Entgegen der mechanistischen Hypothese des AOPs – Hemmung der mitochondrialen DNA Polymerase-, führte eine 24 h Behandlung mit den Modellsubstanzen eher zu einer Erhöhung als zu einer Verringerung der mtDNA-Kopienzahl (KE1). Auch wurden nur geringe Auswirkungen auf die mitochondriale Toxizität (KE2) und Zytotoxizität (KE3) beobachtet. Die Behandlung von RPTEC/TERT1 Zellen über einen Zeitraum von 14 Tagen zeigte eine leichte Abnahme der mtDNA Kopienzahl nach Be-handlung mit Adefovirdipivoxil und Tenofovirdisoproxil Fumarat, was den Bedarf an zeit-aufgelösten Daten und Einschränkungen von kurzfristigen in vitro Systemen unterstreicht. Um eine erste Einschätzung für die Risikobewertung basierend auf in vitro Daten zu erhalten, wurden aus den erhaltenen in vitro Daten für jedes KE mögliche Ausgangspunkte (Points of Departure (PoD)) berechnet. Dazu wurden gängige in vitro PoDs berechnet, wie die Effekt-konzentration, bei der 10 % bzw. 20 % Effekt gemessen wurden (EC10, EC20), die höchste Konzentration ohne Wirkung (no observed effect Konzentration (NOEC)), die niedrigste Konzentration mit beobachteter Wirkung (lowest observed effect Konzentration (LOEC)), die Benchmark 10 % (unterer / obere) Konzentrationen (BMC10, BMCL10, BMCU10) und eine modellierte nicht-toxische Konzentration (NtC). Diese wurden dann mit Serum- bzw. Ge-webskonzentrationen aus in vivo Studien verglichen, die nach Gabe therapeutischer / suprathe-rapeutischer Dosen gemessen wurden. Zusätzlich wurde überprüft, ob es mit Hilfe von quanti-tativen Beziehungen zwischen Schlüsselereignissen möglich ist, basierend auf der Bestimmung früher Schlüsselereignisse nachfolgende Effekte vorherzusagen. Diese Untersuchungen zeig-ten eine gute Korrelation der aus den mathematischen Beziehungen modellierten Daten mit den tatsächlich gemessenen Werten der Zytotoxizität der Modellsubstanzen Colistin und Po-lymyxin B-Nonapeptid. Im Rahmen der Arbeit wurden auch Unsicherheiten und Limitationen der Strategie deutlich, die maßgebliche Auswirkungen auf die Vorhersage und auf die Risiko-bewertung basierend auf in vitro Resultaten haben. KW - Adverse outcome pathway (AOP) KW - Nephrotoxicity KW - In vitro testing KW - QIVIVE KW - Risk Assessment Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-264842 ER - TY - JOUR A1 - Jauch, A. A1 - Lutz, Werner K. T1 - In vivo assay for somatic point mutations induced by genotoxic carcinogens: incorporation of [\(^{35}\)S]methionine into a rat liver cytochrome b\(_5\) normally lacking sulphur-containing amino acids N2 - The trypsin fragments of rat liver microsomal cytochron1e b\(_5\) (Tb\(_5\)) lack both methionine (met) and cysteine (cys), i.e., the sulphur-containing antino acids. Tb\(_5\) should therefore contain no 358-radioactivity after isolation from animals treated wHh [\(^{35}\)S]met or [\(^{36}\)S]cys. If, however, the nucleic acids coding for this polypeptide have been damaged by a genotoxic carcinogen, a miscoding could result in an incorporation of met or cys into the polypeptide so that Tb\(_8\) could now be \(^{36}\)S-radiolabelled. Two experiments are descrihed. the first one where a toxic regimen of N -nitrosomorpholine (NNM) to rats resulted in a significant increase of \(^{35}\)S-radioactivity in the Tbs of liver microsomes, and a second experiment with a non-toxic regimen of N,N diethylnitrosamine (DENA), where no increase was observable. KW - Toxikologie KW - MammaJian mutagenicity test KW - Pointmutation KW - Protein coding KW - Cytochrome b5 KW - Amino acid composition KW - Rat Iiver microsomes Y1 - 1983 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61047 ER - TY - JOUR A1 - Jauch, A. A1 - Lutz, Werner K. T1 - Metallothionein protein variants generated in rat liver as a result of DNA and RNA ethylations by the carcinogen diethylnitrosamine N2 - Metallothionein (MT) is a protein which contains 20 cysteine residues but no aromatic amino acids. It was tested whether treatment of male rats with the hepatocarcinogen diethylnitrosamine (DENA) could ethylate nucleic acids in such a way that protein variants containing measurable amounts of aromatic amino acid residues could be isolated from the livers of treated animals. To give a low Iimit of detection, the "wrong" amino acid precursors were administered in radiolabelled form at high Ievels of activity (7 mCi/kg each of [\(^3\)H]tyrosine and [\(^3\)H]phenylalanine). 11 \(\mu\)Ci/kg [\(^{14}\)C]cysteine was given as an intemal marker for MT biosynthesis. 6 h after amino acid administration, metallothionein (MT) was isolated from the liver and extensively purified. Afteracid hydrolysis and collection of Cys, Tyr, and Phe from an HPLC analysis of the amino acids, the \(^3\)H/\(^{14}\)C ratio was determined. The carcinogen-treated rats exhibited a significantly higher ratio than the vehicle-treated animals. This type of in vivo assay might find interesting applications in the investigation of nucleic acid alkylations as promutagenic lesions. KW - Toxikologie Y1 - 1986 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60946 ER - TY - JOUR A1 - Jeanclos, Elisabeth A1 - Knobloch, Gunnar A1 - Hoffmann, Axel A1 - Fedorchenko, Oleg A1 - Odersky, Andrea A1 - Lamprecht, Anna‐Karina A1 - Schindelin, Hermann A1 - Gohla, Antje T1 - Ca\(^{2+}\) functions as a molecular switch that controls the mutually exclusive complex formation of pyridoxal phosphatase with CIB1 or calmodulin JF - FEBS Letters N2 - Pyridoxal 5′‐phosphate (PLP) is an essential cofactor for neurotransmitter metabolism. Pyridoxal phosphatase (PDXP) deficiency in mice increases PLP and γ‐aminobutyric acid levels in the brain, yet how PDXP is regulated is unclear. Here, we identify the Ca\(^{2+}\)‐ and integrin‐binding protein 1 (CIB1) as a PDXP interactor by yeast two‐hybrid screening and find a calmodulin (CaM)‐binding motif that overlaps with the PDXP‐CIB1 interaction site. Pulldown and crosslinking assays with purified proteins demonstrate that PDXP directly binds to CIB1 or CaM. CIB1 or CaM does not alter PDXP phosphatase activity. However, elevated Ca\(^{2+}\) concentrations promote CaM binding and, thereby, diminish CIB1 binding to PDXP, as both interactors bind in a mutually exclusive way. Hence, the PDXP‐CIB1 complex may functionally differ from the PDXP‐Ca\(^{2+}\)‐CaM complex. KW - calmodulin KW - chronophin KW - CIB1 KW - haloacid dehalogenase KW - pyridoxal phosphatase KW - vitamin B6 Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217963 VL - 594 IS - 13 SP - 2099 EP - 2115 ER - TY - JOUR A1 - Jeanclos, Elisabeth A1 - Schlötzer, Jan A1 - Hadamek, Kerstin A1 - Yuan-Chen, Natalia A1 - Alwahsh, Mohammad A1 - Hollmann, Robert A1 - Fratz, Stefanie A1 - Yesilyurt-Gerhards, Dilan A1 - Frankenbach, Tina A1 - Engelmann, Daria A1 - Keller, Angelika A1 - Kaestner, Alexandra A1 - Schmitz, Werner A1 - Neuenschwander, Martin A1 - Hergenröder, Roland A1 - Sotriffer, Christoph A1 - von Kries, Jens Peter A1 - Schindelin, Hermann A1 - Gohla, Antje T1 - Glycolytic flux control by drugging phosphoglycolate phosphatase JF - Nature Communications N2 - Targeting the intrinsic metabolism of immune or tumor cells is a therapeutic strategy in autoimmunity, chronic inflammation or cancer. Metabolite repair enzymes may represent an alternative target class for selective metabolic inhibition, but pharmacological tools to test this concept are needed. Here, we demonstrate that phosphoglycolate phosphatase (PGP), a prototypical metabolite repair enzyme in glycolysis, is a pharmacologically actionable target. Using a combination of small molecule screening, protein crystallography, molecular dynamics simulations and NMR metabolomics, we discover and analyze a compound (CP1) that inhibits PGP with high selectivity and submicromolar potency. CP1 locks the phosphatase in a catalytically inactive conformation, dampens glycolytic flux, and phenocopies effects of cellular PGP-deficiency. This study provides key insights into effective and precise PGP targeting, at the same time validating an allosteric approach to control glycolysis that could advance discoveries of innovative therapeutic candidates. KW - phosphoglycolate phosphatase KW - glycolytic flux control KW - intrinsic metabolism Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-300928 VL - 13 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Jesaitis, A. J. A1 - Erickson, R. W. A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Bommakanti, R. K. A1 - Siemsen, D. W. T1 - Functional molecular complexes of human N-formyl peptide chemoattractant receptors and actin N2 - When human neutrophils become desensitized to formyl peptide chemoattractants, the receptors (FPR) for these peptides are converted to a high affinity, GTP-insensitive form that is associated with the Triton X-1 00- insoluble membrane skeleton from surface membrane domains. These domains are actin and fodrin-rich, but G protein-depfeted suggesting that FPR shuttling between G protein-enriched and depleted domains may control signal transduction. Todetermine the molecular basis for FPR interaction with the membrane skeleton, neutrophil subcellular fractions were screened for molecules that could bind photoaffinity-radioiodinated FPR solubilized in Triton X-1 00. These receptors showed a propensity to bind to a 41- to43-kDa proteinband on nitrocelluloseoverlays of SOS-PAGE-separated cytosol and plasma membrane fractions of neutrophils. This binding, as weil as FPR binding to purified neutrophil actin, was inhibited 50% by 0.6 \(\mu\)M free neutrophil cytosolic actin. Addition of greater than 1 \(\mu\)M G-actin to crude or lectin-purified Triton X-1 00 extracts of FPR from neutrophil membranes increased the sedimentationrate of a significant fraction of FPR two to three fold as measured by velocity sedimentation in Triton X-1 00-containing linear sucrose density gradients. Addition of anti-actin antibodies to FPR extracts caused a concentration-dependent immunoprecipitation of at least 65% of the FPR. More than 40% of the immunoprecipitated FPR was specifically retained on protein A affinity matrices. Membrane actin was stabilized to alkaline washing when membranes were photoaffinity labeled. Conversely, when purified neutrophil cytosolic actinwas added to membranes or their digitonin extracts, after prior depletion of actin by an alkaline membrane wash, photoaffinity labeling of FPR was increased two- to fourfold with an EC\(_{50}\) of approximately 0.1 \(\mu\)M actin. We conclude that FPR from human neutrophils may interact with actin in membranes to form Triton X-1 00-stable physical complexes. These complexes can accept additional G-actin monomers to form higher order molecular complexes. Formation of FPR-actin complexes in the neutrophil may play a role in the regulation of chemoattractantinduced activation or actin polymerization. KW - Toxikologie Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60445 ER - TY - JOUR A1 - Jesaitis, A. J. A1 - Klotz, Karl-Norbert T1 - Cytoskeletal regulation of chemotactic receptors: Molecular complexation of N-formyl peptide receptors with G proteins and actin N2 - Signal transduction via receptors for N-formylmethionyl peptide chemoattractants (FPR) on human neutrophils is a highly regulated process. It involves direct interaction of receptors with heterotrimeric G-proteins and may be under thc control of cytoskeletal clemcnts. Evidencc exists suggesting that thc cytoskeleton and/or the membrane ske1eton determines the distribution of FPR in the plane of the plasma membrane, thus controlling FPR accessibility to different protcins in functionally distinct membrane domains. In desensitized cells, FPR are restricted to domains which are depleted of G proteins but enriched in cytoskeletal proteins such as actin and fodrin. Thus, the G protein signal transduction partners of FPR become inacccssible to the agonist-occupied receptor, preventing cell activation. We are investigating the molecular basis for the interaction of FPR with the membrane skeleton, and our results suggest that FPR, and possibly other receptors, may directly bind to cytoskeletal proteins such as actin. KW - Immunologie KW - chemotaxis KW - formyl peptides KW - receptors KW - actin KW - G proteins KW - cytoskeleton KW - membrane skeleton Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79673 ER - TY - JOUR A1 - Jochmann, Svenja A1 - Elkenani, Manar A1 - Mohamed, Belal A. A1 - Buchholz, Eric A1 - Lbik, Dawid A1 - Binder, Lutz A1 - Lorenz, Kristina A1 - Shah, Ajay M. A1 - Hasenfuß, Gerd A1 - Toischer, Karl A1 - Schnelle, Moritz T1 - Assessing the role of extracellular signal‐regulated kinases 1 and 2 in volume overload‐induced cardiac remodelling JF - ESC Heart Failure N2 - Aims Volume overload (VO) and pressure overload (PO) induce differential cardiac remodelling responses including distinct signalling pathways. Extracellular signal‐regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2), key signalling components in the mitogen‐activated protein kinase (MAPK) pathways, modulate cardiac remodelling during pressure overload (PO). This study aimed to assess their role in VO‐induced cardiac remodelling as this was unknown. Methods and results Aortocaval fistula (Shunt) surgery was performed in mice to induce cardiac VO. Two weeks of Shunt caused a significant reduction of cardiac ERK1/2 activation in wild type (WT) mice as indicated by decreased phosphorylation of the TEY (Thr‐Glu‐Tyr) motif (−28% as compared with Sham controls, P < 0.05). Phosphorylation of other MAPKs was unaffected. For further assessment, transgenic mice with cardiomyocyte‐specific ERK2 overexpression (ERK2tg) were studied. At baseline, cardiac ERK1/2 phosphorylation in ERK2tg mice remained unchanged compared with WT littermates, and no overt cardiac phenotype was observed; however, cardiac expression of the atrial natriuretic peptide was increased on messenger RNA (3.6‐fold, P < 0.05) and protein level (3.1‐fold, P < 0.05). Following Shunt, left ventricular dilation and hypertrophy were similar in ERK2tg mice and WT littermates. Left ventricular function was maintained, and changes in gene expression indicated reactivation of the foetal gene program in both genotypes. No differences in cardiac fibrosis and kinase activation was found amongst all experimental groups, whereas apoptosis was similarly increased through Shunt in ERK2tg and WT mice. Conclusions VO‐induced eccentric hypertrophy is associated with reduced cardiac ERK1/2 activation in vivo. Cardiomyocyte‐specific overexpression of ERK2, however, does not alter cardiac remodelling during VO. Future studies need to define the pathophysiological relevance of decreased ERK1/2 signalling during VO. KW - ERK1/2 KW - volume overload KW - aortocaval fistula model KW - cardiac remodelling KW - eccentric hypertrophy Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212735 VL - 6 IS - 5 SP - 1015 EP - 1026 ER - TY - THES A1 - Jonas, René T1 - Toxizität und Gentoxizität von Phytohormonen und deren Metaboliten T1 - Toxicity and genotoxicity of phytohormones and their metabolites N2 - Phytohormone, insbesondere solche mit östrogenem Potential werden heute vermehrt in der postklimakterischen Hormonersatztherapie als natürliche Alternative zu Designeröstrogenen eingesetzt, da sie vermutlich ein besseres Wirkungs-Nebenwirkungsprofil besitzten. Mengenmäßig am bedeutensten sind die Phytoöstrogene aus den Stoffgruppen der Isoflavone, Cumestane und Indol-3-carbinole. Weit über 100 Pflanzen produzieren Phytohormone. Die bekanntesten sind die Sojabohne, Weintrauben, Leinsamen, Haferflocken, Spargel, Traubensilberkerze und roter Klee. Phytohormone können täglich in großer Menge aufgenommen werden (1mg pro kg Körpergewicht), wobei durchaus Plasmaspiegel von über 1µM erreicht werden. Gerade deshalb darf nicht davon ausgegangen werden, daß natürliche Produkte per se gut für die Gesundheit wären. Phytohormone und insbesondere deren Metaboliten, die während der intestinalen Passage entstehen, wurden vielfach nicht den gleichen Prüfbedingungen unterzogen wie sie für andere in Lebensmitteln vorkommenden Substanzen, wie z.B. Konservierungs-, Farb- oder Aromastoffen, heute selbstverständlich ist. Diese Arbeit soll deshalb anhand von in-vitro Tests an Mauslymphomzellen L5178Y für eine Auswahl an Phytohormonen und deren Metaboliten mögliche toxische oder gentoxische Effekte detektieren und die bestehende Datenlage ergänzen. Aus der Gruppe der Isoflavone wurden die Daidzeinmetaboloiten Equol und O-desmethylangolensin und die Glyceteinmetaboliten 3,4,7- und 4,6,7-Trihyroxyisoflavon untersucht. Aus der Gruppe der Flavone wurde Fisetin und aus der Gruppe der Stilbene Resveratrol untersucht. Weiterhin wurden Daten zu den Anthocyanen Delphinidin-, Pelargonidin- und Cyanidin-Chlorid erhoben. Toxische Effekte wurden anhand von Proliferatiosexperimenten, durch die Bestimmung der Zellvitalität (Ethidiumbromid-Flouresceinmethode) und durch die Analyse der Teilungsaktivität nach Behandlung mit Cytocalasin B und anschließender Bestimmung des Anteils mehrkerniger Zellen detektiert. Zur Bestimmung von gentoxischen Effekte wurde auf den Mikrokerntest zurückgegriffen. Ergänzend sollte eine Immunfloureszenzfärbung der Kinetochorproteine in Mikrokernen Aufschluß über aneugene oder klastogene Wirksamkeit der untersuchten Substanzen geben. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten weisen darauf hin, daß erste adverse Effekte der Phytohormone oder deren Metaboliten im Bereich der erreichbaren Plasmakonzentration liegen, so daß eine übertriebene Aufnahme hochdosierter Phytohormonen derzeit als kritisch erachtet und weiterer Forschungsbedarf festgestellt werden muß. N2 - Phytohormones, particulary those which have oestrogen potential, are nowadays increasingly used in the postclimacteric hormone replacement therapy, as a natural alternative to artificially synthesized oestrogens, since they are thought to have a better effect/side effect profile.Most important in terms of quantity are the phytoestroges which are part of either the isoflavone- coumestane- or indol 3 carbinol-substance group. For more than 100 plants produce phytohormones, the most well-known of which are the soy bean, the grape, linseeds, oat flakes, asparagus and red clover. Phytohormones can be taken up in large quantities each day (1 mg per kg body weight), whereby plasma levels of more than 1 µM can be reached. That is exactely why one can not proceed on the assumption that natural products are per se healthy. In many cases, when phytohormones and especially their metabolites, which are synthesized during the intestinal passage process, are tested, the test conditions, which are used today for the testing of other substances which are contained in food (e.g. preservatives, artificial colourings or flavouring substances), are not applied. This work is intended to detect possible toxic or genotoxic effects of phytohormones and their metabolites on the basis of tests with mouse lymphoma cells. From the isoflavone-group, the daidzein metabolites equol and o-desmethylangolensine, and the glycetein metabolites 3,4,7- and 4,6,7-trihydroxyisoflavone have therefore been examined, as well as fisetin and resveratrol from the substance-group of flavones and stilbenes respectively. This work also provides new data on anthocyanes delphinidin-, pelargonidin- and cyanidin-chloride. Toxic effects were detected o the basis of experimental registration of the proliferation process, by determining the cell vitality (ethidium bromide – flouresceine – method) and by analysis of the separation-activity after the application of cytochalsine B, directely followed by the determination of the proportion of cells with more than one nucleus. The detemination of genotoxic effects was done using the micronucleus-test. Additionally, an immune flourescense couloring of the kinetochore proteins in micronuclei should explain the aneugene or clastogene effectiveness of the substances examined. The data established through this study indicates that primary adverse effects of phytohormones or their metabolites can be detected within reachable plasma concentrations, so that an excessive take-up of phytohormones has to be classified as critical and it also shows, that there is need for further research in this field. KW - Phytohormone KW - Östrogen KW - Toxizität KW - Gentoxizität KW - Mikrokerne KW - phytohormones KW - estrogen KW - toxicity KW - genotoxicity KW - micronuclei Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11063 ER - TY - THES A1 - Jonas, René T1 - Arsen-induzierte Zyto- und Gentoxizität sowie deren Modulation T1 - Arsenite-induced cyto- and genotoxicity and their modulation N2 - Arsen ist dafür bekannt, dass es mutagen und kanzerogen wirkt und ein gentoxisches Potential besitzt. Die Mechanismen, durch die diese Effekte ausgeübt werden, sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Parameter, die mit der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), z.B. Superoxiddismutaseaktivität und Hämoxygenase-Genexpression, und Veränderungen des epigenetischen Musters der DNA, z.B. Depletion von S-Adenosylmethionin, in Zusammenhang stehen, durch Arsen beeinflusst werden. In dieser Studie wurde versucht, das gentoxische Potential von Arsen mit Hilfe des Comet Assay, eines Standard-Gentoxizitätstests, zu charakterisieren sowie zu prüfen, ob dieser Test eine geeignete Messmethode für die gentoxische Wirkung von Arsen darstellt. Dies wurde unter Heranziehung verschiedener additiver Messgrößen wie der Vitalität und der Proliferation sowie der parallelen Quantifizierung der Mitose-, C-Mitose-, Mikrokern- und Apoptosefrequenzen der verwendeten murinen L5178Y-Zellen durchgeführt. Des Weiteren wurde der den Arsen-bedingten DNA-Schäden zugrundeliegende Mechanismus genauer beleuchtet. Unter Zuhilfenahme verschiedener Modulatoren wurden durch Arsen induzierter oxidativer Stress und durch Arsen induzierte Veränderung der epigenetischen DNA-Struktur untersucht. Ferner wurde geprüft, inwieweit die Inhibition von oxidativem Stress und Hypomethylierung der DNA zur Verringerung von potenziellen Folgen wie der Entstehung unnatürlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen beitragen können, die wiederum eventuell in der Entstehung von Karzinomen resultieren können. Für die Modulation der Freisetzung von ROS wurden als prooxidative Substanz 4-Nitrochinolin-1-Oxid und als Antioxidantien Benfotiamin (Vitamin-B1-Prodrug), N-Acetylcystein (NAC) und α-Tocopherol (Vitamin E) ausgewählt. Das Methylierungs¬muster der DNA sollte durch das hypomethylierende Agens 5-Azacytidin und durch die potenziell hypermethylierenden Verbindungen S-Adenosylmethionin (SAM) und Folat beeinflusst werden. Die Untersuchungen bezüglich des gentoxischen Potentials von Arsen und die Eignung des Comet Assay für dessen Quantifizierung ergaben, dass unter Miteinbeziehung der erwähnten additiven Parameter und der Quantifizierung nach Behandlung mit unterschiedlichen Arsen-Konzentrationen nach unterschiedlich langen Behandlungszeiten die im Comet Assay erzielten Werte als korrekt und zuverlässig angesehen werden können. Des Weiteren zeigten die Untersuchungen der Freisetzung von ROS und der Veränderung des DNA-Methylierungsmusters mit Hilfe von Modulatoren, dass beide Mechanismen an den Arsen-induzierten Effekten beteiligt sind. Nicht nur konnte mit Hilfe der Modulatoren jeweils die Inhibition der Freisetzung von ROS und der DNA-Hypomethylierung erreicht werden, es konnte zudem gezeigt werden, dass die Substanzen auch die Reduktion der erhöhten Anzahl unnatürlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen bewirkten. Dieser Zusammenhang konnte in dieser Studie zum ersten Mal aufgezeigt werden und könnte im Hinblick auf die potenzielle Erniedrigung der Krebsinzidenzen durch Supplementierung der Bevölkerung in Gebieten mit Arsen-belastetem Trinkwasser mit den genannten Modulatoren von Bedeutung sein. N2 - Arsenite is known to be mutagenic as well as carcinogenic and is further known to have a genotoxic potency. However, the mechanisms by which these effects are exerted is not yet fully understood. It could be shown, that parameters which are linked to the release of reactive oxygen species e. g. increase activity of superoxide dismutase or increased expression of heme oxygenase or which are linked to changes in the epigenetic pattern of the DNA, like for example depletion of S-adenosylmethionine, are affected by arsenite. In the course of this study, we attempted to characterize the genotoxic potential of sodium arsenite with the aid of the comet assay, a standard genotoxicity test, and to examine, whether this test is a suitable method for the quantification of arsenite-induced genotoxicity. Additionally, parameters like the frequencies of mitoses, C-mitoses, micronuclei and apoptoses were evaluated in murine L5178Y-cells. Furthermore, the mechanism underlying the arsenite-induced DNA-damage was investigated. With the aid of several modulators, arsenite-induced oxidative stress and arsenite-induced epigenetic modifications were examined. In addition we analyzed, to which extent the inhibition of oxidative stress and DNA-hypomethylation can contribute to a decrease in pathologic mitosis morphologies and chromosomal aberrations, which in turn could possibly result in cancer development. For the modulation of the release of reactive oxygen species, the pro-oxidative substance 4-nitroquinoline-1-oxide and the antioxidative substances benfotiamine, N-acetylcysteine and α-tocopherol were chosen. The epigenetic pattern of the DNA was meant to be affected by the hypomethylating agent 5-azacytidine and the hypermethylating agents S-adenosylmethionine and folic acid. The experiments concerning the genotoxicity of arsenite and the suitability of the comet assay to quantify this genotoxic capacity revealed, that if the parameters mentioned above and different concentrations of arsenite and different incubation times were taken into consideration, the results gained with the aid of the comet assay can be considered as correct and reliable. Furthermore, the investigation of the release of reactive oxygen species and modifications of the DNA methylation patters with the aid of modulators showed, that both mechanisms are involved in the effects induced by sodium arsenite. The modulators were able to inhibit the release of reactive oxygen species and hypomethylation of the DNA respectively. In addition a decrease in the frequencies of pathologic mitosis morphologies and chromosomal aberrations could be shown. This connection could be shown for the first time in the course of this study and could be of relevance with regard to a possible decrease of the incidence of cancer by supplementation of populations with the introduced modulators in areas with drinking water contaminated with arsenite. KW - Oxidativer Stress KW - Methylierung KW - DNS-Reparatur KW - DNS-Schädigung KW - DNS-Strangbruch KW - DNS-Doppelstrangbruch KW - DNS KW - Arsen KW - oxidative stress KW - methylation KW - dna damage KW - arsenite KW - dna strand break Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28772 ER - TY - JOUR A1 - Joos, J. P. A1 - Saadatmand, A. R. A1 - Schnabel, C. A1 - Viktorinová, I. A1 - Brand, T. A1 - Kramer, M. A1 - Nattel, S. A1 - Dobrev, D. A1 - Tomancak, P. A1 - Backs, J. A1 - Kleinbongard, P. A1 - Heusch, G. A1 - Lorenz, K. A1 - Koch, E. A1 - Weber, S. A1 - El-Armouche, A. T1 - Ectopic expression of S28A-mutated Histone H3 modulates longevity, stress resistance and cardiac function in Drosophila JF - Scientific Reports N2 - Histone H3 serine 28 (H3S28) phosphorylation and de-repression of polycomb repressive complex (PRC)-mediated gene regulation is linked to stress conditions in mitotic and post-mitotic cells. To better understand the role of H3S28 phosphorylation in vivo, we studied a Drosophila strain with ectopic expression of constitutively-activated H3S28A, which prevents PRC2 binding at H3S28, thus mimicking H3S28 phosphorylation. H3S28A mutants showed prolonged life span and improved resistance against starvation and paraquat-induced oxidative stress. Morphological and functional analysis of heart tubes revealed smaller luminal areas and thicker walls accompanied by moderately improved cardiac function after acute stress induction. Whole-exome deep gene-sequencing from isolated heart tubes revealed phenotype-corresponding changes in longevity-promoting and myotropic genes. We also found changes in genes controlling mitochondrial biogenesis and respiration. Analysis of mitochondrial respiration from whole flies revealed improved efficacy of ATP production with reduced electron transport-chain activity. Finally, we analyzed posttranslational modification of H3S28 in an experimental heart failure model and observed increased H3S28 phosphorylation levels in HF hearts. Our data establish a critical role of H3S28 phosphorylation in vivo for life span, stress resistance, cardiac and mitochondrial function in Drosophila. These findings may pave the way for H3S28 phosphorylation as a putative target to treat stress-related disorders such as heart failure. KW - cardiac hypertrophy KW - epigenetics KW - heart failure Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323637 VL - 8 ER - TY - THES A1 - Kaestner, Alexandra Annika Nadine T1 - Charakterisierung pharmakologischer Phosphoglykolatphosphatase-Inhibitoren T1 - Characterization of pharmacological phosphoglycolate phosphatase inhibitors N2 - In dieser Arbeit geht es um die Phosphoglykolatphosphatase (PGP), die als Phosphatase vom Haloazid Dehalogenase-Typ (HAD-Phosphatase) zu der ubiquitär vorkommenden Superfamilie der HAD-Hydrolasen gehört. In der Literatur ist eine in vitro Phosphatase-Aktivität gegenüber 2-Phospho-L-Laktat (2PL), 4-Phospho-D-Erythronat (4PE), Phosphoglykolat (PG) und Glycerol-3-Phosphat (G3P) beschrieben. 2PL und 4PE entstehen in Nebenreaktionen während der Glykolyse und hemmen bei Akkumulation die Glykolyse bzw. den Pentosephosphatweg. PG kann auch in einer Nebenreaktion während der Glykolyse oder im Rahmen der Reparatur von oxidativen DNA-Schäden entstehen. G3P entsteht aus Dihydroxyacetonphosphat und bildet das Kohlenhydratgerüst der Triacylglyceride (TAG). Zelluläre Studien konnten Hinweise auf die Regulierung des epidermalen wachstumsfaktor-(EGF-)induzierten Zytoskelettumbaus durch die PGP liefern und die Untersuchung von Mäusen mit PGP-Inaktivierung zeigte einen Einfluss auf die Zellproliferation und embryonale Entwicklung. Die Regulation der PGP-Expression führte zu Veränderungen im Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsel. Die Untersuchung der PGP-Funktionen erfolgte bislang ausschließlich mit genetischen Ansätzen. Aufgrund von möglichen Kompensationsmechanismen und Off-Target-Effekten müssen genetische und pharmakologische Methoden als sich ergänzende Ansätze verstanden werden. Um die Funktionen der PGP besser zu verstehen, fokussiert sich die vorliegende Arbeit auf die gezielte pharmakologische PGP-Inhibition. In Vorarbeiten wurden 41.000 Moleküle gescreent und fünf potentielle Inhibitoren identifiziert. Ziele dieser Arbeit waren zum einen die Implementierung der Inhibitor # 1-Behandlung in der Zellkultur, zum anderen die Charakterisierung der PGP-Hemmung durch Inhibitor # 48 und die Durchführung erster Selektivitätstestungen mit Inhibitor # 48. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass Inhibitor # 1 in der Lage ist, die endogene PGP in Zelllysaten der murinen spermatogonialen Zelllinie (GC1) zu hemmen. Unter bestimmten Bedingungen führte die Inhibitor # 1-Behandlung der GC1-Zellen zur Hemmung der PGP. Erste Analysen zellulärer Inhibitoreffekte konnten eine Steigerung der TAG-Konzentration in behandelten GC1-Zellen nachweisen. Die PGP-Hemmung durch Inhibitor # 48 wurde als unkompetitive Inhibition charakterisiert und es zeigten sich keine relevanten Inhibitoreffekte auf die HAD-Phosphatasen Magnesium-abhängige Phosphatase 1 (MDP1), Lysin-Histidin-Pyrophosphat-Phosphatase (LHPP) und Polynukleotidase 5'-Kinase/3'-Phosphatase (PnkP). Dagegen konnte eine Aktivitätssteigerung von Phospho 2 beobachtet werden. Die vorliegende Arbeit liefert somit erste Erkenntnisse über die Anwendung des PGP-Inhibitors # 1 in der Zellkultur und schafft die Grundlage für nachfolgende Untersuchungen mit Inhibitor # 48. Weitere Experimente sind notwendig, die die Inhibitorbehandlung in der Zellkultur optimieren und die Selektivität weiter charakterisieren, um mithilfe der Inhibitoren neue Erkenntnisse über die physiologische und pathophysiologische Rolle der PGP gewinnen zu können. N2 - The present thesis describes the analysis of phosphoglycolate phosphatase (PGP), a haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatase of the ubiquitous superfamily of HAD hydrolases. In vitro and in cells, PGP has been described to dephosphorylate 2-phospho-L-lactate (2PL), 4-phospho-D-erythronate (4PE), phosphoglycolate (PG) and glycerol-3-phosphate (G3P). 2PL and 4PE are formed in side reactions by two core glycolytic enzymes and, when they accumulate, inhibit glycolysis or the pentose phosphate pathway, respectively. PG may also be formed in a side reaction during glycolysis or during the repair of oxidative DNA damage. G3P can be generated by glycerol kinase-mediated phosphorylation of glycerol, or by reduction of dihydroxyacetone phosphate. G3P forms the activated backbone of triglycerides. Cellular studies provided evidence for the regulation of epidermal growth factor (EGF) induced cytoskeletal remodeling by PGP, and examination of mice with PGP inactivation revealed its effect on cell proliferation and embryonic development. The experimental deletion or overexpression of PGP in cells, mice and rats resulted in changes in carbohydrate and lipid metabolism. To date, the study of PGP functions has been conducted exclusively using genetic approaches, and no pharmacological PGP inhibitors have been described so far. The goal of this thesis was to characterize small molecule PGP inhibitors that have previously been identified in the group by high throughput screening. Specifically, the aim of this work was to implement inhibitor # 1 treatment in cell culture and to characterize PGP inhibition by inhibitor # 48 as well as to perform initial selectivity assays with inhibitor # 48. Inhibitor # 1 is able to inhibit endogenous PGP in cell lysates of the murine spermatogonial cell line (GC1). Under certain conditions, inhibitor # 1 treatment of GC1 cells resulted in inhibition of PGP. Preliminary analyses of cellular inhibitory effects demonstrated an increase in TG levels in treated GC1 cells. Inhibitor # 48 was characterized as an uncompetitive PGP-inhibitor. No relevant inhibitor effects on the HAD phosphatases magnesium-dependent phosphatase-1 (MDP1), phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) and polynucleotidase 5´-kinase/3´-phosphatase (PnkP) could be detected. In contrast, an increase in the activity of Phospho 2 was observed. The present work thus provides first insights into the application of the PGP inhibitor # 1 in cell culture and lays the foundation for subsequent studies with inhibitor # 48. Further experiments are needed to improve inhibitor treatment in cell culture and to further characterize selectivity in order to gain new insights into the physiological and pathophysiological role of PGP by using the inhibitors. KW - Phosphoglykolatphosphatase KW - Inhibitor KW - Phosphatase KW - phosphoglycolatephosphatase KW - inhibitor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-272394 ER - TY - THES A1 - Kahlert, Katrin T1 - Der Einfluss von RKIP auf die Progression von Herzinsuffizienz T1 - RKIP protects from pressure overload induced heart failure N2 - GRK2 vermittelt über die Phosphorylierung und Inaktivierung kardialer β1-Rezeptoren eine verminderte kardiale Kontraktilität. RKIP als GRK2-Inhibitor spielt eine Rolle in der GPCR-Signalgebung. Die Überexpression des Proteins führt zu einer verbesserten Herzfunktion. Dieser Effekt wird möglicherweise über die GRK2-Inhibition vermittelt und eröffnet die Diskussion über weitere durch RKIP vermittelte protektive Effekte im Herzen. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass die kardiale RKIP-Expression in Mäusen und humanem Herzgewebe bei Herzinsuffizienz gesteigert ist. Zudem beschrieb ich den protektiven Effekt einer gesteigerten Expression von RKIP in murinen Herzen im Hinblick auf die Ausprägung typischer struktureller und morphologischer Zeichen von Herzinsuffizienz. Echokardiographische Untersuchungen zeigten, dass RKIP die Herzfunktion positiv beeinflusst. RKIP-tg-Mäuse wiesen eine gesteigerte Verkürzungsfraktion und einen dauerhaft hyperkontraktilen Phänotyp auf. Trotz fehlenden Einflusses auf die kardiale Hypertrophie bewirkte die chronische linksventrikuläre Druckbelastung durch TAC in RKIP-tg-Mäusen eine geringere kardiale Dilatation und den Erhalt einer stärkeren Kontraktilität als in Wildtyp-Mäusen. Die Ligation der Aorta transversa bewirkte bei Wildtyp-Mäusen zudem strukturelle und molekulare Veränderungen, die typisch für einen herzinsuffizienten Phänotyp sind. Der Anteil fibrotischen Gewebes und die Apoptose im Herzen nahmen zu. Strukturelle Veränderungen des Herzgewebes sind ein Korrelat für ein herzinsuffizientes Herz. RKIP-tg-Mäuse zeigten diese Veränderungen in einem deutlich geringeren Ausmaß und weisen auf eine protektive Wirkung einer kardialen RKIP-Überexpression hin. Interessanterweise war die mRNA-Expression der Fibrosemarker CTGF und TGFß nach chronischer linksventrikulärer Druckbelastung sowohl bei Wildtyp-Mäusen als auch bei RKIP-transgenen Mäusen erhöht. Die Ursache für das Fehlen eines signifikanten Unterschiedes könnte sein, dass diese Marker nicht spezifisch für die kardiale Fibrosierung sind, sondern deren Expression auch mit der kardialen Hypertrophie zusammenhängt. Eine weitere Beobachtung war der Anstieg der mRNA-Expression der Herzinsuffizienz-Marker BNP und ANF nach chronischer Druckbelastung in Wildtyp- und RKIP-tg-Mäusen. Die Ergebnisse bestätigten, dass BNP spezifischer für die durch chronische linksventrikuläre Druckerhöhung verursachte Herzinsuffizienz zu sein scheint. Ich beobachtete eine gesteigerte RKIP-Expression bei Herzinsuffizienz und kardialer Hypertrophie. Herzbiopsien herzinsuffizienter und an Aortenstenose erkrankter Patienten wiesen im Vergleich zu Kontrollen eine erhöhte RKIP-Proteinexpression auf. Auch C57BL/6J-Mäuse wiesen nach chronischer linksventrikulärer Druckbelastung eine gesteigerte kardiale RKIP-Expression im Vergleich zu Kontrollen auf. Die Hochregulation der RKIP-Expression könnte als protektiver feedback-Mechanismus interpretiert werden. Resultat dieser Arbeit ist, dass RKIP eine protektive Wirkung bei der Progression von durch chronische linksventrikuläre Druckbelastung induzierte Herzinsuffizienz hat, am ehesten durch seine Funktion als GRK2-Inhibitor und seine Rolle bei der GPCR-Signalgebung. N2 - Failing hearts are unable to adequately supply the body with blood and oxygen. Common therapeutic strategies interfere with cardiac remodelling, reduce cardiac pre- and afterload or aim at direct improvement of cardiac contractility. Cardiac contractility is mainly controlled by 1-adrenergic receptors. Resensitization of -adrenergic receptors by inhibition of G-protein coupled receptor kinase 2 (GRK2) is discussed as a potential strategy to treat heart failure. Raf kinase inhibitor protein (RKIP) is as a physiological inhibitor of GRK2 and it increases contractility of neonatal cardiomyocytes. In this study its effects on cardiac function in pressure overload induced heart failure and determined the expression patterns of RKIP in failing hearts of humans and mice was assessed. Transverse aortic contriction (TAC) was performed on 7-week-old C57/BL6 mice to induce heart failure by pressure overload of left ventricles. After three weeks of TAC, echocardiography showed distinct signs of decreased cardiac function in wild-type mice. Fractional shortening was reduced and left ventricular diameters were increased. Histological analyses revealed increased interstitial fibrosis, caspase- and TUNEL-assays indicated myocyte apoptosis. Western blot analysis and real-time PCR showed significant upregulation of RKIP expression in failing hearts compared to non-banded control hearts. Interestingly, this upregulation of RKIP protein expression was also detected in failing human hearts and in samples of patients with aortic valve stenosis but not in healthy control samples. To assess the effects of RKIP overexpression on heart failure, heart function and structure of RKIP transgenic mice and wild-type mice 3 weeks after TAC was analysed. While left ventricular hypertrophy was increased to similar extents in wild-type and RKIP trangenic mice, RKIP mice did neither develop dilatation of the left ventricle nor a decrease in fractional shortening. The mRNA-expression of the fibrosis markers CTGF and TGFwas upregulated in banded wild-type mice and in banded RKIP transgenic mice after 3 weeks of TAC indicating its correlation not only for fibrosis but possibly also for hypertrophy. The mRNA-expression of the heart failure markers BNP and ANF was upregulated in banded wild-type mice and in banded RKIP transgenic mice after 3 weeks of TAC. The results confirm that BNP is more specific for heart failure than ANF. Taken together, cardiac overexpression of RKIP prevented left ventricular dilatation and loss of contractile function in a mouse model of pressure overload induced heart failure. Therefore, increased RKIP expression may be an interesting target to prevent detrimental effects from increased left ventricular pressure. KW - Herzinsuffizienz KW - Herzinsuffizienz KW - Raf kinase inhibitor protein Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139191 ER - TY - THES A1 - Kampfinger, Katja T1 - Nachweis einer Mismatch-Reparatur-Defizienz in L5178Y Tk+/--3.7.2C-Mauslymphomzellen T1 - Evidence of a mismatch repair deficiency in L5178Y Tk+/--3.7.2C mouse lymphoma cells N2 - Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizitätsermittlung. Für die Überprüfung der Gentoxizität stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verfügung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den für die Testung notwendigen Veränderungen weitere Veränderungen zu tragen, die zu Reaktionen führen können, wie sie in den Primärzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale abschätzen zu können. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-tätsprüfung am häufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Veränderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrität des Genoms zu gewährleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch äußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die geschädigten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu überleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Schäden und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomschäden bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, während andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen für alkylierende Agenzien beschrieben ist, führte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Phänotyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Phänotyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen geprüft und bestätigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte für den gezeigten MMR-defizienten Phänotyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Verände-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese führt nach 260 Aminosäuren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminosäuren zu einem Abbruch der Aminosäuresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information für den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedomäne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die für den C-Terminus hingegen, der für die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit für die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erklären kann. Daraus folgt für den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizitätstests, dass die Berücksichtigung ihrer MMR-Defizienz die Möglichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann. N2 - The development and approval of pharmaceuticals as well as the evaluation of xenobiotics require several test systems for the detection of genotoxicity. There is a number of established genotoxicity test systems, which are often based on cancer cell lines. In addition to mutations that are essential for genotoxicity testing, cancer cell lines may also carry mutations that might cause reactions not occurring in the primary cells of the organism. Therefore the knowledge of the genetic background of the cell line used is important for the evaluation of test results and the subsequent genotoxicity risk assessment. Among test systems that are based on cancer cells the mouse lymphoma cell line L5178Y adopts a very prominent position due to its worldwide application for genotoxicity testing. The dissertation on hand provides evidence that there are mutations in the L5178Y cell line that are related to the mismatch-repair system (MMR system). MMR participates in safeguarding the genomic integrity. In MMR-proficient cells, DNA defects that arise during replication, homologous recombination or as a result of genotoxic effects are either recognized and repaired or the genetically altered cells are eliminated by induction of apoptosis. MMR-deficient cells, however, survive despite serious DNA defects and accumulate them. The accumulation of DNA damage as result of treatment with alkylating agents had been observed in L5178Y cells while other cell lines had reacted with an induction of apoptosis. The induction of apoptosis after treatment with alkylating agents is described in the literature as a typical behaviour for MMR-deficient cells. From this the hypothesis was established, that L5178Y-cells might exhibit a MMR-deficient phenotype. This MMR-deficient phenotype was proven by selective treatment of L5178Y cells and cells with known MMR status with the alkylating agent MNNG followed by the subsequent comparison of the different reactions. The comparison was carried out by the detection of genotoxic effects using the micronucleus test and the comet assay. On the protein level there was not an indication that the observed MMR-deficiency was related to the the three most important MMR-proteins MSH2, MLH1 and MSH6: All proteins demonstrated expression levels that were comparable to the levels of the MMR-proficient control cells. On the DNA level, however, several mutations were detected by sequence analysis of the coding regions of all genes known to be involved in MMR. The most important among these mutations was an insertion mutation (964(insC)) in pms2, that caused a frameshift after 260 amino acids. By this frameshift, a stop-codon was introduced, leading to an interruption of the sequence after 313 amino acids. While the information of the N-terminal region of pms2 containing the DNA-binding domain as well as the ATPase active sites is still present, the information of the C-terminus is lost. This region is responsible for the dimerisation with the MMR-protein MLH1. Therefore, the MMR-function that is due to this complex, is missing. In conclusion, a MMR-deficiency of L5178Y cells was demonstrated. This MMR-deficiency is explained by an insertion-mutation in pms2 (964(insC)). Consideration of this MMR-deficiency enhances the meaningfulness of the evaluation of test results with L5178Y mouse lymphoma cells in risk assessment. KW - Maus KW - Zelle KW - L5178Y-Zellen KW - MMR-Reparatur KW - pms2 KW - Genotoxizität KW - Alkylantien KW - L5178Y cells KW - mismatch repair KW - pms2 KW - genotoxicity KW - alkylating agent Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26023 ER - TY - THES A1 - Kannen Cardoso, Vinicius T1 - The role of Fluoxetine against preneoplastic lesions and tumors in colon tissue T1 - Die Rolle von Fluoxetin gegen präneoplastische Läsionen und Tumoren im Darmgewebe N2 - Introduction: Colon cancer is one of the major human malignancies worldwide, and much effort has been applied to understand the process of colon carcinogenesis, as well as the role of potential treatments and co-therapeutical agents against it. A growing body of evidence suggests that the use of fluoxetine (FLX), an antidepressant belonging to the selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs), may be associated with a reduced colon cancer risk. However, controversial opinions have been published and an identification of the mechanisms of the activity of FLX on colon cells would help in the clarification of this controversy. Objectives: Using several in vitro and in vivo-based methods and analyses, we aimed to verify whether FLX has antioxidant, pro-oxidant or DNA-damaging potential in standard toxicological assays; to check whether and how FLX could prevent and reduce colon preneoplastic lesions; to ascertain whether FLX has any oncostatic potential against colon tumors; and, to investigate whether FLX activity could be comparable with a known and current applied chemotherapeutic agent against colon cancer. Results: FLX did not have any antioxidant potential in our experiments. Although it did not induce reactive oxygen species (ROS) generation or DNA-damage in fibroblast and colon tumor cell lines, FLX reduced dysplasia and proliferation in two different carcinogen models. Further, a significant decrease in colon stromal reactivity and angiogenesis was found in both carcinogen-induced preneoplasia models. In a xenograft model of colon cancer, FLX shrank tumors, reduced tumor proliferation, arrested cancer cells at the G0/G1 cell-cycle phase, and took ROS generation under control. Such effects were detected together with an intracellular acidification and loss of mitochondrial membrane potential in FLX-treated cells. Modulating mitochondrial respiratory chain, HIF-1 expression and Akt/mTOR signaling pathway, FLX was found to reduce colon tumors similar to the widely used chemotherapeutic agent 5-Fluoracil activity. Conclusion: Our collective data suggest that FLX is a remarkable chemopreventive and oncostatic agent against colon preneoplastic lesions and tumors, acting without DNA-damage or ROS generation. N2 - Einleitung: Darmkrebs ist eine der wichtigsten menschlichen Tumorarten weltweit und viel Aufwand wurde unternommen, um den Prozess der Colonkarzinogenese, sowie die Rolle der möglichen Behandlungen und Co-therapeutische Mittel zu verstehen. Eine wachsende Zahl von Hinweisen deuted darauf hin, dass die Verwendung von Fluoxetin (FLX), einem Antidepressivum aus der Klasse der selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRIs), mit einem reduzierten Dickdarmkrebs-Risiko verbunden sein kann. Allerdings sind auch kontroverse Meinungen veröffentlicht worden und eine Identifizierung der Mechanismen der Aktivität von FLX auf Darmzellen würde bei der Klärung dieser Kontroverse helfen. Ziele: Mit in vitro-und in vivo-Methoden wollten wir prüfen, ob FLX antioxidatives, prooxidatives oder DNA-schädigendes Potential in Standard-toxikologischen Untersuchungen hat; des weiteren sollte analysiert werden, ob und wie FLX präneoplastischen Läsionen verhindern und reduzieren kann, sowie ob FLX onkostatisches Potenzial gegen Darmtumoren hat. Letzteres sollte im direkten Vergleich mit dem etablierten Chemotherapeutikum 5-Fluoruracil untersucht werden. Ergebnisse: FLX zeigte keine direkte antioxidative Kapazität in unseren Testsystemen. Obwohl es keine Bildung reaktiver Sauerstoffspecies (ROS) und keine Induktion von DNA-Schaden in Fibroblasten und Kolon Tumorzellinien verursachte, reduzierte FLX Dysplasien und Proliferation in zwei verschiedenen Kanzerogen-Modellen in vivo. Ferner wurde eine signifikante Abnahme der Reaktivität der Stromazellen und von Angiogenese in beiden Karzinogen-induzierten Präneoplasie-Modellen gefunden. In einem Xenograft Modell des Kolonkarzinoms brachte FLX die Tumoren durch verringerte Proliferation zum Schrumpfen. In vitro wurde in den entsprechenden Zellinien eine Anreicherung der Zellen in der Ga0/G1 Zellzyklus-Phase, eine Reduktion Hypoxie-verursachter ROS-Bildung, intrazelluläre Ansäuerung und Velust des mitochondrialen Membranpotentials nach FLX-Behandlung gefunden. Weitere Aktivitäten waren auf die mitochondriale Atmungskette, HIF-1 Expression und den Akt/mTOR-Sinalweg zu beobachten. Die Reduktion der Kolontumoren war der mit 5-Fluoruracil erzielten vergleichbar. Schlussfolgerung: Unsere Daten deuten darauf hin, dass FLX eine bemerkenswerte chemopräventive und onkostatischen Aktivität gegen präneoplastische Läsionen und Tumore im Darm aufweist, die ohne Induktion von DNA-Schäden ROS stattfindet. KW - Fluoxetin KW - Magenkrebs KW - Fluoxetine KW - Colon cancer Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77589 ER - TY - JOUR A1 - Kannen, Vinicius A1 - Hintzsche, Henning A1 - Zanette, Dalila L. A1 - Silva Jr., Wilson A. A1 - Garcia, Sergio B. A1 - Waaga-Gasser, Anna Maria A1 - Stopper, Helga T1 - Antiproliferative Effects of Fluoxetine on Colon Cancer Cells and in a Colonic Carcinogen Mouse Model N2 - The antidepressant fluoxetine has been under discussion because of its potential influence on cancer risk. It was found to inhibit the development of carcinogen-induced preneoplastic lesions in colon tissue, but the mechanisms of action are not well understood. Therefore, we investigated anti-proliferative effects, and used HT29 colon tumor cells in vitro, as well as C57BL/6 mice exposed to intra-rectal treatment with the carcinogen N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) as models. Fluoxetine increased the percentage of HT29 cells in the G0/G1 phase of cell-cycle, and the expression of p27 protein. This was not related to an induction of apoptosis, reactive oxygen species or DNA damage. In vivo, fluoxetine reduced the development of MNNG-induced dysplasia and vascularization-related dysplasia in colon tissue, which was analyzed by histopathological techniques. An anti-proliferative potential of fluoxetine was observed in epithelial and stromal areas. It was accompanied by a reduction of VEGF expression and of the number of cells with angiogenic potential, such as CD133, CD34, and CD31-positive cell clusters. Taken together, our findings suggest that fluoxetine treatment targets steps of early colon carcinogenesis. This confirms its protective potential, explaining at least partially the lower colon cancer risk under antidepressant therapy. KW - Medizin Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75879 ER - TY - THES A1 - Kauk, Michael T1 - Investigating the Molecular Mechanism of Receptor Activation at Muscarinic Receptors by Means of Pathway-Specific Dualsteric Ligands and Partial Agonists T1 - Molekulare Grundlagen der Rezeptoraktivierung von muskarinergen Acetylcholin Rezeptoren durch dualstere Liganden und Partialagonisten N2 - G protein-coupled receptors (GPCRs) form the biggest receptor family that is encoded in the human genome and represent the most druggable target structure for modern therapeutics respectively future drug development. Belonging to aminergic class A GPCRs muscarinic Acetylcholine receptors (mAChRs) are already now of clinical relevance and are also seen as promising future drug targets for treating neurodegenerative diseases like Alzheimer or Parkinson. The mAChR family consist of five subtypes showing high sequence identity for the endogenous ligand binding region and thus it is challenging until now to selectively activate a single receptor subtype. A well accepted method to study ligand binding, dynamic receptor activation and downstream signaling is the fluorescence resonance energy transfer (FRET) application. Here, there relative distance between two fluorophores in close proximity (<10 nm) can be monitored in a dynamic manner. The perquisite for that is the spectral overlap of the emission spectrum of the first fluorophore with the excitation spectrum of the second fluorophore. By inserting two fluorophores into the molecular receptor structure receptor FRET sensors can serve as a powerful tool to study dynamic receptor pharmacology. Dualsteric Ligands consist of two different pharmacophoric entities and are regarded as a promising ligand design for future drug development. The orthosteric part interacts with high affinity with the endogenous ligand binding region whereas the allosteric part binds to a different receptor region mostly located in the extracellular vestibule. Both moieties are covalently linked. Dualsteric ligands exhibit a dynamic ligand binding. The dualsteric binding position is characterized by a simultaneous binding of the orthosteric and allosteric moiety to the receptor and thus by receptor activation. In the purely allosteric binding position no receptor activation can be monitored. In the present work the first receptor FRET sensor for the muscarinic subtype 1 (M1) was generated and characterized. The M1-I3N-CFP sensor showed an unaltered physiological behavior as well as ligand and concentration dependent responses. The sensor was used to characterize different sets of dualsteric ligands concerning their pharmacological properties like receptor activation. It was shown that the hybrids consisting of the synthetic full agonist iperoxo and the positive allosteric modulator of BQCA type is very promising. Furthermore, it was shown for orthosteric as well as dualsteric ligands that the degree of receptor activation is highly dependent on the length of and the chemical properties of the linker moiety. For dualsteric ligands a bell-shaped activation characteristic was reported for the first time, suggesting that there is an optimal linker length for dualsteric ligands. The gained knowledge about hybrid design was then used to generate and characterize the first photo-switchable dualsteric ligand. The resulting hybrids were characterized with the M1-I3N-CFP sensor and were described as photo-inactivatable and dimmable. In addition to the ligand characterization the ligand application methodology was further developed and improved. Thus, a fragment-based screening approach for dualsteric ligands was reported in this study for the first time. With this approach it is possible to investigate dualsteric ligands in greater detail by applying either single ligand fragments alone or in a mixture of building blocks. These studies revealed the insights that the effect of dualsteric ligands on a GPCR can be rebuild by applying the single building blocks simultaneously. The fragment-based screening provides high potential for the molecular understanding of dualsteric ligands and for future screening approaches. Next, a further development of the standard procedure for measuring FRET by sensitized emission was performed. Under normal conditions single cell FRET is measured on glass coverslips. After coating the coverslips surface with a 20 nm thick gold layer an increased FRET efficiency up to 60 % could be reported. This finding was validated in different approaches und in different configurations. This FRET enhancement by plasmonic surfaces was until yet unreported in the literature for physiological systems and make FRET for future projects even more powerful. N2 - G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Proteinfamilie, die im humanen Genom verschlüsselt ist. Sie sind nicht nur die Zielstruktur für eine Vielzahl von derzeit gebräuchlichen Medikamenten, sondern gehören auch zu den vielversprechendsten Therapieansätzen für die moderne Medikamentenentwicklung. Muskarinerge Acetylcholin Rezeptoren (mAChRs) gehören zu den aminergen Klasse A GPCRs und sind bereits heute von klinischer Relevanz. Die muskarinerge Rezeptorfamilie wird von fünf Subtypen gebildet, die sich besonders durch eine hohe Sequenzidentität in der endogenen Ligandenbindestelle (orthostere Bindestelle) auszeichnen. Aus diesem Grund ist es mit den herkömmlich verwendeten Medikamenten nicht möglich, einen ganz bestimmten Subtyp zu therapieren, ohne auch andere Subtypen zu beeinflussen und so unerwünschte Nebenwirkungen zu erhalten. Eine Möglichkeit Ligandenbindung, dynamische Rezeptoraktivierung oder Signalweiterleitung von GPCRs nach pharmakologischen Gesichtspunkten zu charakterisieren, stellt der Floreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) dar. Mit Hilfe dieser Methode kann über kleine Entfernungen (<10 nm) die relative Orientierung von zwei Fluorophoren mit überlappenden Spektralbereichen mit hoher zeitlicher Auflösung verfolgt werden. Integriert man das Fluorophorpaar mit Hilfe gentechnischer Methoden in die Molekülstruktur des Rezeptors, kann man dessen Konformationsänderung bzw. Aktivierung infolge einer Ligandenbindung aufzeichnen. Dualstere Liganden sind eine Substanzklasse von hohem zukünftigen klinischen Potential und zeichnen sich durch die Verknüpfung mehrerer pharmakologisch aktiver Untereinheiten aus. Der orthostere Molekülteil interagiert mit der endogenen Ligandenbindestelle und der allostere Molekülteil interagiert mit einem zweiten Rezeptorabschnitt, der häufig in den extrazellulären Schlaufen des Rezeptors zu finden ist. Diese allosteren Bindestellen zeichnet sich durch eine vergleichsweise geringe Sequenzidentität aus, weswegen allostere Modulatoren auch selektiv an Subtypen binden können. Aufgrund des Aufbaus können dualstere Liganden auf vielfältige Weise mit dem Rezeptor interagieren und dieser Bindemechanismus wurde als dynamische Ligandenbindung beschrieben. Zum einen können beide Molekülteile gleichzeitig mit dem Rezeptor interagieren und ihn aktivieren (dualsterer Bindemodus) und zum anderen findet man einen rein allosteren Bindemodus, der den Rezeptor nicht aktiviert. Der orthostere Molekülteil ist vor allem für die Rezeptoraktivierung zuständig, die sich durch eine hohe Affinität auszeichnet und der allostere Molekülteil kann selektive Rezeptorinteraktionen vermitteln. Da dualstere Moleküle immer Eigenschaften beider Untereinheiten besitzen, werden dualstere Liganden als sehr vielversprechend erachtet, zukünftig subtypselektive Medikamente darzustellen. In dieser Arbeit wurde der erste Rezeptor FRET Sensor für den muskarinergen Subtyp 1 (M1) beschrieben und es konnte gezeigt werden, dass sich dieser Rezeptorsensor in seiner physiologischen Funktion nicht von dem wild Typ unterscheidet. Des Weiteren können mit Hilfe dieses Sensors liganden- und konzentrationsabhängige Rezeptorantworten aufgezeichnet werden. Der M1-I3N-CFP wurde dazu genutzt verschiedene Reihen dualsterer Liganden zu charakterisieren und auf ihre aktivierenden Eigenschaften bezüglich des M1 zu testen. Es wurde gezeigt, dass die Kombination aus dem synthetischen und hochpotenten Agonisten Iperoxo als Orthoster und dem in der Literatur als M1 selektiven positiven allosteren Modulator beschriebenen BQCA als Alloster sehr vielversprechend ist. Es konnte gezeigt werden, dass die rezeptoraktivierenden Eigenschaften sowohl von orthosteren wie auch von dualsteren Liganden stark von der Linkerlänge abhängig sind. Für dualstere Liganden konnte so ein glockenförmiger Zusammenhang zwischen Linkerlänge und Rezeptoraktivierung herausgearbeitet werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass bestimmte Hybride, die den M1 aktivieren, an anderen Subtypen keine Effekte hervorrufen und somit als subtypselektiv beschrieben werden können. Im Anschluss wurde mit Hilfe des gewonnenen Wissens über Iperoxo/BQCA Hybride, das Moleküldesign der dualsteren Liganden weiterentwickelt. So wurden in dieser Arbeit die ersten photo-schaltbaren bzw. photo-dimmbaren dualsteren Liganden beschrieben und charakterisiert. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die herkömmliche Charakterisierung von dualsteren Liganden weiterentwickelt. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass es möglich ist, die Aktivierung eines Rezeptors durch einen dualsteren Liganden nachzustellen, indem die einzelnen Fragmente des ursprünglichen Liganden gleichzeitig appliziert werden. Diese auf Fragmenten basierende Charakterisierung ist die erste Anwendung dieser Art und birgt großes Potential für die zukünftige Suche nach neuen Wirkstoffen. Neben der Untersuchung von pharmakologischen Schwerpunkten wurde auch die Weiterentwicklung der Rezeptor FRET Methodik beschrieben. Die herkömmliche Anwendung der Rezeptor FRET Sensoren geschieht auf Objektträgern aus Quarzglas. In dieser Arbeit wurde diese Anwendung dahingehend weiterentwickelt, dass die Objektträger mit einer 20 nm dicken Goldschicht beschichtet wurden, um den Einfluss von Plasmonoberflächen auf physiologisch relevante FRET Messungen zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der Goldbeschichtung und in Abhängigkeit des Versuchsaufbaus die Energietransfereffizienz um bis zu 60 % gesteigert werden konnte. Diese Entdeckung zeigt Potential zukünftig die FRET-Reichweite zu erhöhen und so bisher nicht charakterisierbare Sachverhalte aufklären zu können. KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Muscarinrezeptor KW - Dualsteric Ligands KW - Partial Agonists KW - Dualstere Liganden KW - Partialagonismus Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173729 N1 - Online-Version enthält nicht den Appendix (Volltexte der Originalveröffentlichungen der Zeitschriftenaufsätze) ER - TY - THES A1 - Kellert, Marco T1 - Untersuchungen zum Metabolismus von Furan in Ratte und Maus, sowie zur Reaktivität und Gentoxizität von cis-2-Buten-1,4-dial in vitro und in Zellkultur T1 - Metabolism of furan in rats and mice and tests for the reactivity and genotoxicity of cis-2-butene-1,4-dial in vitro and in cell culture. N2 - Furan wird in einer Vielzahl von Speisen durch Hitzebehandlung gebildet und ist kanzerogen in der Leber von Ratte und Maus. Durch die hohe Flüchtigkeit von Furan ist eine Expositionsabschätzung auf Basis der Kontamination von Lebensmitteln nur bedingt möglich. Ein alternativer Ansatz dazu ist die Identifizierung von Furanmetaboliten als Expositions­biomarker. Nach der Aufnahme wird Furan zunächst zum Dialdehyd cis-2-Buten-1,4-dial oxidiert. cis-2-Buten-1,4-dial besitzt mehrere elektrophile Strukturelemente, welche eine Reaktion mit Protein und DNS wahrscheinlich machen und damit zur bekannten Toxizität von Furan beitragen können. Es stellt sich in diesem Zusammenhang die Frage, ob eine Reaktion mit Protein die Reaktion mit der DNS verhindern kann und somit keine direkt gentoxischen Effekte auftreten. Für ein kanzerogenes Agens ohne direkte gentoxische Wirkung kann eine Schwellendosis unterhalb derer kein DNS-Schaden auftritt diskutiert werden. Für eine fundierte Risikobewertung bezüglich der Aufnahme von Furan über die Nahrung ist dies unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit wurde nach der oralen Gabe von Furan im Urin von Fischer 344 Ratten nach Metaboliten gesucht. Eine Kontrollgruppe erhielt nur die Trägersubstanz Öl. Das vor und nach Exposition über jeweils zwei 24 Stunden Perioden gesammelte Urin wurde mittels einer Tandemmassenspektrometrie-Methode analysiert. Die Methode bestand aus einem Full-Scan und einer darüber gesteuerten Aufzeichnung eines Fragmentionenspektrums. Die Full-Scan-Daten wurden mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse untersucht. In der ersten Sammelperiode nach der Behandlung konnten durch die erste Hauptkomponente die behandelten von den unbehandelten Tieren getrennt werden. Aus den für die Trennung relevanten Verbindungen konnten fünf Biomarker strukturell aufgeklärt werden. In einer weiteren Tierstudie an Ratten und Mäusen wurde die Kinetik und die Dosis-Wirkungs-Beziehung der identifizierten Biomarker untersucht. Die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Urine auf die identifizierten Biomarker hin zeigte, dass in der Ratte alle und in der Maus alle bis auf einen dosisabhängig anstiegen. Die Kinetik der Ausscheidung lieferte wertvolle Hinweise auf die Entstehung der Biomarker. Die Ausscheidung der Biomarker mit Lysinstruktur erfolgte über mehr als 72 Stunden. Dies war ein Hinweis auf eine Freisetzung aus Protein. Die Ausscheidung der restlichen Verbindungen erfolgte ausschließlich in den ersten 24 Stunden. Die in der Literatur vorhandenen Daten zur Gentoxizität von Furan und cis-Buten-1,4-dial sind unschlüssig und unvollständig. In der vorliegenden Arbeit wurde cis-2-Buten-1,4-dial im Ames Stamm TA104 und in L5178Y Mauslymphomzellen auf Mutagenität und Gentoxizität untersucht. Durch starke Zytotoxizität war der Konzentrationsbereich auf 4.5 µmol/Platte limitiert. Innerhalb dieses Bereich konnte mit der Vorinkubationsvariante des Ames-Tests keine Mutagenität beobachtet werden. Die L5178Y Mauslymphomzellen wurden mit Standardprotokollen für den Mikrokern-Test, Kometen-Test und den Thymidinkinase-Test untersucht. Der Konzentrationsbereich von cis-2-Buten-1,4-dial erstreckte sich bis 100 µM, konnte aber auf Grund der starken Zytotoxizität nur bis 25 µM ausgewertet werden. Dennoch konnte bereits in diesem Bereich ein 1.7- bzw. 2.2-facher Anstieg im Kometen- bzw. Thymidinkinase-Test beobachtet werden. Verglichen mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat hatte cis-2-Buten-1,4-dial bei einer deutlich höheren Zytotoxizität eine ähnliche Potenz bezüglich der Mutagenität und Gentoxizität. Um das DNS-vernetzende Potential von cis-2-Buten-1,4-dial zu bestimmen wurde eine Variante des Kometen-Tests verwendet. Es wurde dabei untersucht, ob die Vorbehandlung von Zellen mit cis-2-Buten-1,4-dial die durch γ-Strahlung induzierbaren Kometen reduzieren kann. Während die Positivkontrolle Glutaraldehyd die Kometen tatsächlich verringerte, blieb dieser Effekt bei cis-2-Buten-1,4-dial aus. Im Gegenteil, bei einer Konzentration von ≥100 mM konnte durch die Zunahme von Zellen mit beginnender Apoptose ein Anstieg der Kometen beobachtet werden. Obwohl cis-2-Buten-1,4-dial sehr deutliche gentoxische und mutagene Effekte zeigte, beschränkte die hohe Zytotoxizität den auswertbaren Bereich. Möglicherweise kann diese Problematik einen Teil der unschlüssigen Ergebnisse erklären, sicher ist jedoch, dass für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität und Kanzerogenität ein Beitrag von nicht gentoxischen Effekten diskutiert werden muss. N2 - Furan has been found in a number of heated food items and is carcinogenic in the liver of rats and mice. Estimates of human exposure on the basis of concentrations measured in food are not reliable because of the volatility of furan. A biomarker approach was therefore indicated. Metabolism of furan includes the formation of an unsaturated dialdehyde, cis-2-butene-1,4-dial. In view of the multifunctional electrophilic reactivity of cis-2-butene-1,4-dial, adduct formation with protein and DNA may explain some of the toxic effects. DNA-adduction is a direct genotoxic effect. The major question was weather a direct genotoxicity of cis-2-butene-1,4-dial could be prevented by the reaction with protein structures. If so, the genotoxic and mutagenic effects are likely to show a threshold dose, reducing the cancer risk for low exposure levels. We searched for metabolites excreted in the urine of male Fischer 344 rats treated by oral gavage with 40 mg furan per kg body weight. A control group received the vehicle oil only. Urine collected over two 24-hour periods both before and after treatment was analyzed by a column-switching LC-MS/MS method. Data were acquired by a full scan survey scan in combination with information dependent acquisition of fragmentation spectra by the use of a linear ion trap. The full scan data was analyzed by principal component analysis (PCA). The first principal component fully separated the samples of treated rats from the controls in the first post-treatment sampling period. Five of the compounds that are responsible for the separation could be identified as the reaction product of cis-2-butene-1,4-dial with either glutathion or lysine (protein). In a second animal study rats and mice were treated with seven different doses of furan in the range from 125 µg to 8 mg per kg body weight. Dose-response and kinetic over 72 h of the seven identified biomarkers was examined by LC-MS/MS in the urine. In the rats all biomarkers showed a dose-dependent increase. In the mice one biomarker lacked of dose dependency. Different excretion profiles were attributed to the formation of either protein adducts or glutathione conjugates. Whereas the protein-derived biomarkers with a lysin moiety showed a slow excretion over more than 72 h, the glutathion-dervived biomarkers were only excreted within the first 24 h. Short-term tests for genotoxicity of furan in mammalian cells are inconclusive, little is known for cis-2-butene-1,4-dial. We investigated cis-2-butene-1,4-dial generated by hydrolysis of 2,5-diacetoxy-2,5-dihydrofuran for genotoxicity and mutagenicity in Salmonella typhimurium (Strain TA104) and in L5178Y mouse lymphoma cells. The Ames Test was negative in the preincubation assay with and without reduction of cytotoxicity by addition of glutathione after preincubation phase. Remarkable cytotoxicity limited the analysis range up to 4.5 µmol/plate. Mutagenicity and genotoxicicty in L5178Y mouse lymphoma cells was evaluated using standard procedures for the comet assay, the micronucleus test, and the mouse lymphoma thymidine kinase gene mutation assay. cis-2-butene-1,4-dial was tested at 0, 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 µM. Cytotoxicity was remarkable; cell viability at 50 µM was reduced to <50%. Up to 25 µM, cell viability was >90%, and measures of comet assay and thymidine kinase mutations were increased over control about 1.7 an 2.2-fold, respectively. Compared to methyl methanesulfonate used as positive control, cis-2-butene-1,4-dial was of similar potency for genotoxicity but much more cytotoxic. A potential cross-linking activity of cis-2-butene-1,4-dial was investigated by checking whether gamma radiation-induced DNA migration in the comet assay could be reduced by pretreatment with cis-2-butene-1,4-dial. As opposed to the effect of the positive control glutaraldehyde, cis-2-butene-1,4-dial treatment did not reduce the comets. On the contrary, an increase was observed at ≥100 µM cis-2-butene-1,4-dial, which was attributable to early apoptotic cells. Although cis-2-butene-1,4-dial was found to be a relatively potent genotoxic agent in terms of the concentration necessary to double the background measures, cytotoxicity strongly limited the concentration range that produced interpretable results. This may explain some of the inconclusive results and indicates that nongenotoxic effects must be taken into account in the discussion of modes of toxic and carcinogenic action of furan. KW - Metabolismus KW - Mutagenität KW - Biomarker KW - Furan KW - LC-MS KW - Harn KW - cis-2-Buten-1 KW - 4-dial KW - Gentoxizität KW - furan KW - metabolism KW - biomarker KW - mutagenicity KW - genotoxicity Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28716 ER - TY - THES A1 - Kestler, Christian T1 - Untersuchungen über die Dimerisierung der HAD-Phosphatase Chronophin T1 - Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin N2 - Phosphatasen der HAD (haloacid dehalogenase)-Familie sind weit verbreitet in allen Domänen des Lebens und erfüllen die verschiedensten zellulären Aufgaben, beispielsweise in Metabolismus und Zellregulation. Die HAD-Phosphatase Chronophin zeigt Phosphataseaktivität unter anderem gegenüber Pyridoxal-5‘-Phosphat (PLP), einem essentiellen Kofaktor vieler biochemischer Prozesse, und Phosphocofilin, einem Regulator des Aktinzytoskeletts. Chronophin dimerisiert über die Interaktion zweier identischer Untereinheiten zu einem Homodimer. Ziel dieser Arbeit war, die Rolle dieser Dimerisierung, eines bei HAD-Phosphatasen weit verbreiteten Oligomerisierungszustandes, näher zu untersuchen. Hierzu wurde die Dimerisierung erfolgreich durch den Austausch der Aminosäuren Alanin 194 und 195 zu Lysinen (Mutation A194K/A195K) gestört. Der Nachweis einer konstitutiv monomeren Chronophin-Mutante mittels Größenausschlusschromatographie, Rasterkraftmikroskopie, analytischer Ultra¬zentrifugation und Zellexperimenten wurde schließlich über die Struktur¬auflösung mittels Röntgenstrukturanalyse bestätigt. Aktivitätsmessungen der monomeren Mutante gegenüber dem Substrat PLP zeigten eine deutliche Verminderung der Phosphataseaktivität. Die Röntgenstrukturanalyse von Chronophin A194K/A195K im Vergleich mit Wildtyp-Chronophin enthüllte einen Mechanismus, wie die sogenannte Substratspezifitätsschleife, die für die korrekte Positionierung des PLP sorgt, im Homodimer des Wildtyps durch Interaktionen mit dem zweiten Protomer stabilisiert wird. Diese Stabilisierung fehlt bei der monomeren Mutante und äußert sich in einer veränderten Stellung der Substratspezifitätsschliefe. Der Strukturvergleich von Chronophin mit weiteren HAD-Phosphatasen der selben strukturellen Untergruppe vom C2a-Typ lässt eine allgemeine Gültigkeit der hier beschriebenen allosterischen Kontrolle von Substratspezifität über Homodimerisierung bei HAD-Phosphatasen vermuten und könnte so neue Ansatzpunkte für möglicherweise auch therapeutisch nutzbare Aktivitätshemmungen liefern. N2 - Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin KW - Dimerisierung KW - Phosphatasen KW - Pyridoxalphosphat KW - Ortspezifische Mutagenese KW - Chronophin KW - Substratspezifitätsschleife Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149777 ER - TY - THES A1 - Kircher, Malte Tim T1 - Neuronale Genotoxizität von Angiotensin II T1 - Neuronal Genotoxicity of Angiotensin II N2 - In recent decades, the acceptance has steadily increased that oxidative stress plays an important role in the development of chronic diseases, malignant neoplasia and the acceleration of the aging process. As one of the most common chronic diseases, hypertension is often associated with a misregulated renin-angiotensin-aldosterone system that causes chronic oxidative stress. Hypertension is a risk factor for neurological diseases such as vascular dementia (VaD) and many neurological disorders, including VaD, have an ROS-associated or inflammatory component in their etiology. Our group has already demonstrated AT-II-induced genotoxicity in kidney and myocardial cells and tissues. The aim of this dissertation was to investigate a possible association between AT-II and neurodegeneration that is triggered by neuronal genotoxicity of AT-II. First, we showed in two neuronal cell lines that AT-II causes dose-dependent genome damage. Subsequent experiments could attribute this toxicity to NOX-produced superoxide generated after AT-II binding to the AT1R. In addition, AT-II-induced depletion of the most important intracellular antioxidant - glutathione - was demonstrated. In vivo, we were able to show that AT1aR knockout mice after AT-II treatment showed significantly more genome damage in the subfornic organ (SFO) than wild-type mice. The SFO is one of the few structures in the brain with an interrupted blood-brain barrier, which makes it accessible and particularly sensitive to circulating AT-II. In the recent literature, these genome damages were also observed in kidney and heart tissues and prove an additional genotoxicity of AT-II independent of AT1aR and consequently independent of blood pressure. In summary, this work shows that increased AT-II levels in neuronal cells cause genome damage due to NOX-produced superoxide. It is hoped that these results will one day help to decipher the complete development of VaD. N2 - In den letzten Jahrzehnten ist die Akzeptanz stetig größer geworden, dass oxidativer Stress eine bedeutende Rolle bei der Entstehung von chronischen Erkrankungen, malignen Neoplasien sowie der Beschleunigung des Alterungsprozesses spielt. Als eine der häufigsten chronischen Erkrankungen ist Hypertonie oft mit einem fehlregulierten Renin-Angiotensin-Aldosteron-System assoziiert, welches chronisch oxidativen Stress verursacht. Bluthochdruck ist ein Risikofaktor für neurologische Erkrankungen wie der vaskulären Demenz (VaD) und viele neurologischen Störungen, einschließlich der VaD, haben eine ROS-assoziierte beziehungsweise inflammatorische Komponente in ihrer Entstehung. Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits eine AT-II-induzierte Genotoxizität in Nieren- und Myokardzellen bzw. -Gewebe nachweisen. Ziel dieser Dissertation war es, einen möglichen Zusammenhang zwischen AT-II und Neurodegeneration zu untersuchen, welche durch eine neuronale Genotoxizität von AT-II ausgelöst wird. Zunächst zeigten wir in zwei neuronalen Zelllinien, dass AT-II eine Dosis-abhängige Genomschädigung verursacht. Nachfolgende Experimente konnten diese Toxizität auf NOX-produziertes Superoxid zurückführen, das nach Bindung von AT-II an den AT1R generiert wird. Zudem konnte ein AT-II-induzierter Verbrauch des wichtigsten intrazellulären Antioxidans – Glutathion - nachgewiesen werden. In vivo konnten wir zeigen, dass AT1aR-Knockout-Mäuse nach AT-II-Behandlung signifikant mehr Genomschäden im Subfornikalorgan (SFO) aufwiesen als Wildtypmäuse. Das SFO hat als eine der wenigen Strukturen im Gehirn eine unterbrochene Blut-Hirn-Schranke, was es für zirkulierendes AT-II zugänglich und besonders empfindlich macht. Diese Genomschäden wurden in der neueren Literatur auch in Nieren- und Herzgewebe beschrieben und belegen eine zusätzliche, AT1aR- und damit Blutdruck-unabhängige Genotoxizität von AT-II. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass erhöhte AT-II-Konzentrationen in Nervenzellen Genomschäden durch NOX-produziertes Superoxid verursachen. Die Hoffnung ist, dass diese Ergebnisse dabei helfen, eines Tages die vollständige Entstehung der VaD zu entschlüsseln. KW - Angiotensin II KW - Toxizität KW - Neuronale KW - toxicity KW - angiotensin II KW - neuronal Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-214273 ER - TY - JOUR A1 - Kirchner, S. A1 - Stopper, Helga A1 - Papp, T. A1 - Eckert, I. A1 - Yoo, H. J. A1 - Vig, B. K. A1 - Schiffmann, D. T1 - Cytogenetic changes in primary, immortalized and malignant mammalian cells N2 - Some chromosomes in transformed rat cells and somatic cell hybrids fail to display the presence of kinetochore proteins as detected by antikinetochore antibodies. Suchchromosomes (K- Chromosomes) may constitute a novel mechanism for the genesis of aneuploidy. Wehave analyzed primary~ immortalized and malignant marnmalian cells for the presence of kinetochore proteins and micronuclei. Our resuJts suggest a correlation of the K- chromosome and micronucleus frequency with the variability in chromosome number. Upon in situ hybridization with the minor satellite and alpha satellite sequences some Kchromosomes showed a signal. This indicates that the observed lack of kinetocbores is not necessarily due to a lack of centromeric DNA. We conclude that dislocated K- chromosomes may become incorporated into micronuclei which are prone to loss. Such events would be associated with the generation of aneuploidy. KW - Toxikologie KW - Micronuclei KW - Kinetochore KW - Chromosome distribution Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63439 ER - TY - JOUR A1 - Klaunig, James E. A1 - Dekant, Wolfgang A1 - Plotzke, Kathy A1 - Scialli, Anthony R. T1 - Biological relevance of decamethylcyclopentasiloxane (D5) induced rat uterine endometrial adenocarcinoma tumorigenesis: Mode of action and relevance to humans JF - Regulatory Toxicology and Pharmacology N2 - Decamethylcyclopentasiloxane (D5) is a cyclic siloxane used in the production and formulation of consumer products with potential exposure to manufacturing workers, consumer, and the general public. Following a combined 2-year inhalation chronic bioassay performed in Fischer 344 (F344) rats, an increase in uterine endometrial adenocarcinomas was noted at the highest concentration to which animals were exposed. No other neoplasms were detected. In this study, a dose of 160 ppm produced an incidence of 8% endometrial adenocarcinomas. Based on a number of experimental studies with D5, the current manuscript examines the biological relevance and possible modes of action for the uterine endometrial adenocarcinomas observed in the rat following chronic exposure to D5. Variable rates of spontaneous uterine endometrial adenocarcinomas have been reported for untreated F344 CrIBr rats. As such, we concluded that the slight increase in uterine endometrial adenocarcinomas observed in the D5 chronic bioassay might not be the result of D5 exposure but may be related to variability of the spontaneous tumor incidence in this strain of rat. However, if the uterine endometrial adenocarcinomas are related to D5-exposure, alteration in the estrous cycle in the aging F344 rat is the most likely mode of action. D5 is not genotoxic or estrogenic. The alteration in the estrous cycle is caused by a decrease in progesterone with an increase in the estrogen:progesterone ratio most likely induced by a decrease in prolactin concentration. Available data support that exposure to D5 influences prolactin concentration. Although the effects on prolactin concentrations in a number of experiments were not always consistent, the available data support the conclusion that D5 is acting via a dopamine receptor agonist-like mechanism to alter the pituitary control of the estrous cycle. In further support of this mode of action, studies in F344 aged animals showed that the effects of D5 on estrous cyclicity produced a response consistent with a dopamine-like effect and further suggest that D5 is accelerating the aging of the reproductive endocrine system in the F344 rat utilized in this study. This mode of action for uterine endometrial adenocarcinoma tumorigenesis is not relevant for humans. KW - Reproductive toxicity KW - Carcinogenicity KW - Silicones KW - Enzyme induction KW - Uterine tumors KW - Rat Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190952 VL - 74 IS - Supplement ER - TY - JOUR A1 - Klenk, Christoph A1 - Hommers, Leif A1 - Lohse, Martin J. T1 - Proteolytic cleavage of the extracellular domain affects signaling of parathyroid hormone 1 receptor JF - Frontiers in Endocrinology N2 - Parathyroid hormone 1 receptor (PTH1R) is a member of the class B family of G protein-coupled receptors, which are characterized by a large extracellular domain required for ligand binding. We have previously shown that the extracellular domain of PTH1R is subject to metalloproteinase cleavage in vivo that is regulated by ligand-induced receptor trafficking and leads to impaired stability of PTH1R. In this work, we localize the cleavage site in the first loop of the extracellular domain using amino-terminal protein sequencing of purified receptor and by mutagenesis studies. We further show, that a receptor mutant not susceptible to proteolytic cleavage exhibits reduced signaling to G\(_s\) and increased activation of G\(_q\) compared to wild-type PTH1R. These findings indicate that the extracellular domain modulates PTH1R signaling specificity, and that its cleavage affects receptor signaling. KW - GPCRs KW - parathyroid hormone 1 receptor KW - matrix metalloproteinase KW - ectodomain cleavage KW - biased signaling Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-262055 SN - 1664-2392 VL - 13 ER - TY - THES A1 - Klenk, Johann Christoph T1 - Effekte von Parathormon auf die Struktur und Komplexierung des Parathormonrezeptors 1 T1 - Effects of parathyroid hormone on the structure and complexation of parathyroid hormone receptor 1 N2 - Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR. N2 - The Parathyroid hormone receptor type 1 (PTHR) belongs to the class 2 of G-protein coupled receptors (GPCRs) and is the main regulator of calcium homeostasis of the body. The first part of the dissertation describes a novel mechanism of receptor regulation based on a proteolytic cleavage of the receptor’s extracellular domain. Prolonged stimulation with PTH led to an apparent increase in molecular mass and in stability of the PTHR. Biochemical analysis of the receptor protein revealed that the PTHR undergoes posttranslational cleavage. Agonistic but not antagonistic PTH-peptides prevented this cleavage, thereby stabilizing the molecular mass and also increasing the half life of the receptor. The cleavage was shown to occur within an unstructured stretch of the extracellular domain of the receptor, which connects two parts required for ligand binding and which is unique in the PTHR amongst all class 2 GPCRs. The cleaved N-terminal fragment was further connected by a disulfide bridge and could only be released by reducing agents. By testing a panel of different protease inhibitors, a protease belonging to the family of zinc-dependent metalloproteases could be identified to be responsible for the PTHR cleavage. Thus, these findings describe a new mechanism how PTHR homeostasis may be regulated. In the second part, the interaction between the adaptor proteins NHERF1 and beta-arrestin2 with the PTHR was assessed. Both proteins interacted independently with the receptor. While NHERF1 formed a constitutive interaction with the PTHR C-terminus, beta-arrestin2-binding required activation of the receptor. Using biochemical and microscopic methods it was shown that both proteins formed a ternary complex with the receptor. This complex was mediated by a direct interaction between NHERF1 and beta-arrestin2 which has been identified in this work. As a consequence, NHERF1 leads to a coupling of beta-arrestin2 close to the PTHR. Association kinetics of beta-arrestin2 with the PTHR measured by fluorescent resonance energy transfer were two-fold increased in the presence of NHERF, suggesting that the ternary complex facilitates the desensitization of the PTHR by beta-arrestin2. KW - Parathormon KW - Proteolyse KW - Endokrinologie KW - Calcium KW - Rezeptor KW - Retinales S-Antigen KW - GPCR KW - Matrix-Metalloprotease KW - NHERF KW - Signaltransduktion KW - G-Protein KW - GPCR KW - Matrix-Metalloproteinase KW - NHERF KW - signal transduction KW - G-protein Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47288 ER - TY - THES A1 - Klenk, Johann Christoph T1 - Posttranslationale Modifikation von Phosducin durch den small ubiquitin-related modifier "SUMO" T1 - Posttranslational modification of phosducin with the small ubiquitin-related modifier 'SUMO' N2 - Die Rezeptor vermittelte Aktivierung heterotrimerer G-Proteine ist einer der bedeutendsten Signaltransduktionsmechanismen in vielen Organismen. Die Vielzahl unterschiedlicher Rezeptoren und Agonisten macht eine effektive Kontrolle des einzelnen Signals unumgänglich. Das zytosolische Protein Phosducin bindet beta-gamma-Untereinheiten aktivierter G-Proteine und hemmt damit sowohl Gbeta-gamma-vermittelte Effekte als auch Galpha-vermittelte Effekte. In der vorliegenden Arbeit wurde neben der bekannten 33 kDa Form von Phosducin eine weitere 47 kDa große Form in der Retina und im Herz identifiziert. Hierbei handelte es sich um Phosducin, welches mit dem small ubiquitin-related modifier, SUMO, modifiziert war. Weiterhin wurde sowohl in vitro als auch in zellulären Sytemen gezeigt, dass Phosducin mit einem Molekül SUMO an Lysin 33 modifiziert wird. Durch punktgerichtete Mutation dieser Modifikationsstelle wurde eine SUMOylierungs-defiziente Phosducin-Mutante generiert. Diese Mutante unterliegt einem gesteigerten Turnover im Vergleich zu Wildtyp-Phosducin, welcher auf die verstärke Ubiquitinierung und dem damit verbundenen proteasomalen Abbau der Mutante zurückzuführen war. Dies demonstriert, dass SUMOylierung von Phosducin protektive Wirkung auf dieses Protein hat. Darüberhinaus behindert die SUMOylierung von Phosducin dessen Bindung an Gbeta-gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine. Diese Beobachtungen erlauben den Schluss, dass SUMOylierung neben der Phosphorylierung ein neuer und wichtiger Mechanismus ist, über den die Verfügbarkeit von Phosducin als G-Protein-Regulator kontrolliert wird. N2 - Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins is one of the most important signalling mechanisms in many organisms. The variety of different receptors and ligands require a tight control of the individual signalling processes. The cytosolic protein Phosducin has been show to tightly bind to Gbeta-gamma subunits of heterotrimeric G-proteins thereby attenuating Gbeta-gamma and G-alpha mediated signals. In the present study a previously unknown 47 kDa high molecular isoform of 33 kDa protein phosducin was identified in the retina and the heart. This isoform was shown to be phosducin modified with the small ubiquitin-related modifier SUMO. Further experiments in vitro and in cells revealed that phosducin is modified with SUMO at lysine 33. Mutation of lysine 33 abolished SUMOylation of phosducin. Compared to wild-type phosducin the SUMOylation-deficient mutant of phosducin revealed reduced steady state protein levels and increased ubiquitination. This suggests that SUMOylation is protecting phosducin from ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Moreover, SUMOylation of phosducin decreased its ability to bind to Gbeta-gamma subunits of heterotrimeric G-proteins. Together, these findings show that phosducin is a previously unrecognized target of SUMO modification, and that SUMOylation controls phosducin stability in cells as well as its functional properties. KW - SUMO KW - Ubiquitin KW - Phosducin KW - G-Protein KW - posttranslationale Modifikation KW - SUMO KW - ubiquitin KW - phosducin KW - G-protein KW - posttranslational modification Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19140 ER - TY - JOUR A1 - Klotz, Barbara A1 - Mentrup, Birgit A1 - Regensburger, Martina A1 - Zeck, Sabine A1 - Schneidereit, Jutta A1 - Schupp, Nicole A1 - Linden, Christian A1 - Merz, Cornelia A1 - Ebert, Regina A1 - Jakob, Franz T1 - 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Treatment Delays Cellular Aging in Human Mesenchymal Stem Cells while Maintaining Their Multipotent Capacity JF - PLoS ONE N2 - 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25D3) was reported to induce premature organismal aging in fibroblast growth factor-23 (Fgf23) and klotho deficient mice, which is of main interest as 1,25D3 supplementation of its precursor cholecalciferol is used in basic osteoporosis treatment. We wanted to know if 1,25D3 is able to modulate aging processes on a cellular level in human mesenchymal stem cells (hMSC). Effects of 100 nM 1,25D3 on hMSC were analyzed by cell proliferation and apoptosis assay, beta-galactosidase staining, VDR and surface marker immunocytochemistry, RT-PCR of 1,25D3-responsive, quiescence-and replicative senescence-associated genes. 1,25D3 treatment significantly inhibited hMSC proliferation and apoptosis after 72 h and delayed the development of replicative senescence in long-term cultures according to beta-galactosidase staining and P16 expression. Cell morphology changed from a fibroblast like appearance to broad and rounded shapes. Long term treatment did not induce lineage commitment in terms of osteogenic pathways but maintained their clonogenic capacity, their surface marker characteristics (expression of CD73, CD90, CD105) and their multipotency to develop towards the chondrogenic, adipogenic and osteogenic pathways. In conclusion, 1,25D3 delays replicative senescence in primary hMSC while the pro-aging effects seen in mouse models might mainly be due to elevated systemic phosphate levels, which propagate organismal aging. KW - perspectives KW - bone marrow KW - mutant mice KW - oxidative stress KW - transcription factors KW - vitamin-D-receptor KW - differentiation KW - tissue KW - 2',7'-dichlorofluorescin KW - homeostasis Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133392 VL - 7 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Cristalli, G. A1 - Grifantini, M. A1 - Vittori, S. A1 - Lohse, M. J. T1 - Photoaffinity labeling of A\(_1\) adenosine receptors JF - The journal of biological chemistry N2 - The ligand-binding subunit of the A\(_1\)-adenosine receptor has been identified by photoaffinity labeling. A photolabile derivative of R- \(N^6\)-phenylisopropyladenosine, R-2-azido-\(N^6\)-p-hydroxyphenylisopropyladenosine (R-AHPIA), has been synthesized as a covalent specific Iigand for A\(_1\)-adenosine receptors. In adenylate cyclase studies with membranes of rat fat cells and human platelets, R·AHPIA has adenosine receptor agonist activity with a more than 60-fold selectivity for the A\(_1\)-subtype. It competes for [\(^3\)H].\(N^6\)- phenylisopropyladenosine binding to Arreceptors of rat brain membranes with a Ki value of 1.6 nM. After UV irradiation, R-AHPIA binds irreversibly to the receptor, as indicated by a loss of [\(^3\)H)\(N^6\)-phenylisopropyladenosine binding afterextensive washing; the K; value for this photoinactivation is 1.3 nM. The p-hydroxyphenyl substituent of R-AHPIA can be directly radioiodinated to give a photoaffinity Iabel of high specific radioactivity (\(^{125}\)I-AHPIA). This compound has a KD value of about 1.5 nM as assessed from saturation and kinetic experiments. Adenosine analogues compete for \(^{125}\)I-AHPIA binding to rat brain membranes with an order of potency characteristic for A\(_1\)-adenosine receptors. Dissociation curves following UV irradiation at equilibrium demonstrate 30-40% irreversible specific binding. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis indicates that the probe is photoincorporated into a single peptide of M\(_r\) = 35,000. Labeling of this peptide can be blocked specifically and stereoselectively by adenosine receptor agonists and antagonists in a manner which is typical for the A\(_1\)-subtype. The results indicate that \(^{125}\)I-AHPIA identifies the ligand-binding subunit of the A\(_1\)-adenosine receptor, which is a peptide with M\(_r\) = 35,000. KW - Toxikologie Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60198 VL - 27 IS - 260 ER - TY - JOUR A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Jesaitis, A. J. T1 - Neutrophil chemoattractant receptors and the membrane skeleton N2 - Signal transduction via receptors for N-formylmethionyl peptide chemoattractants (FPR) on human neutrophils is a highly regulated process which involves participation of cytoskeletal elements. Evidence exists suggesting that the cytoskeleton and/or the membrane skeleton controls the distributJon of FPR in the plane of the plasma membrane, thus controlling the accessibility of FPR to different proteins in functionally distinct domains. In desensitized cells, FPR are restricted todomains which are depleted of G proteins but enriched in cytoskeletal proteins such as actin and fodrin. Thus, the G protein signal transduction partners of FPR become inaccessible to the agonist-occupied receptor, preventing cell activation. The mechanism of interaction of FPR with the membrane skeleton is poorly understood but evidence is accumulating that suggests a direct binding of FPR (and other receptors) to cytoskeletal proteins such as actin. KW - Toxikologie Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60471 ER - TY - JOUR A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Jesaitis, A. J. T1 - Physical coupling of N-formyl peptide chemoattractant receptors to G protein is not affected by desensitization N2 - Desensitization of N-formyl peptide chemoattractant receptors (FPR) in human neutrophils results in association of these receptors to the membrane skeleton. This is thought to be the critical event in the lateral segregation of receptors and guanyl nucleotide-binding proteins (G proteins) within the plane of the plasma membrane resulting in an interruption of the signaling cascade. In this study we probed the interaction of FPR with G protein in human neutrophils that were desensitized to various degrees. Human neutrophils were desensitized using the photoreactive agonist N-formyl-met-leu-phelys- N\(^\epsilon\)-[\(^{125}\)I]2(p-azidosalicylamido )ethyl-1 ,3 '-dithiopropionate (/MLFK-[\(^{125}\)I]ASD). The interaction if FPR with G protein was studied via a reconstitution assay and subsequent analysis of FPR-G protein complexes in sucrose density gradients. FPR-G protein complexes were reconstituted with solubilized FPR from partially and fully desensitized neutrophils with increasing concentrations of Gi purified from bovine brain. The respective EC\(_{50}\) values for reconstitution were similar to that determined for FPR from unstimulated neutrophils (Bommakanti RK et al., J Bio[ Chem 267: 757~7581, 1992). We conclude, therefore, that the affinity of the interaction of FPR with G protein is not affected by desensitization, consistent with the model of lateral segregation of FPR and G protein as a mechanism of desensitization. KW - Toxikologie KW - chemotactic receptors KW - G proteins KW - N-formyl peptides KW - signal transduction KW - receptor-G protein coupling Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60483 ER - TY - JOUR A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Jesaitis, A. J. T1 - The interaction of N-formyl peptide chemoattractant receptors with the membrane skeleton is energy-dependent N2 - Desensitization of N-fonnyl peptide chemoattractant receptors (FPR) in human neutrophils is thought to be achieved by lateral segregation of receptors and G proteins within the plane of the plasma membrane resulting in an interruption of the signalling cascade. Direct coupling of FPR to membrane skeletal actin appears to be the basis of this process~ however, the molecular mechanism is unknown. In this study we investigated the effect of energy depletion on formation of FPR-membrane skeleton complexes. In addition the effect of the protein kinase C inhibitor stauroporine and the phosphatase inhibitor okadaic acid on coupling of FPR to the membrane skeletonwas studied. Human neutrophils were desensitized using the photoreactive agonist N-formy1-met-leu-phe-1ys-N'[\(^{125}\)I]2(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'-dithiopropionate (fMLFK-[\(^{125}\)I]ASD) after ATP depletion with NaF or after incubation with the respective inhibitors. The interaction of FPR with the membrane skeleton was studied by Sedimentation of the membrane skeleton-associated receptors in sucrose density gradients. Energy depletion of the cells markedly inhibited the formation of FPR-membrane skeleton complexes. This does not appear tobe related to inhibition of protein phosphorylation due to ATP depletion because inhibition of protein kinases and phosphatases bad no significant effect on coupling of FPR to the membrane skeleton. We conclude, therefore, that coupling of FPR to the membrane skeleton is an energy,dependent process which does not appear to require modification of the receptor protein by phosphorylation. KW - Toxikologie KW - Chemotactic receptors KW - G proteins KW - N-formyl peptides KW - signal transduction KW - desensitization KW - membrane skeleton KW - receptor-G protein coupling. Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60499 ER - TY - JOUR A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Keil, R. A1 - Zimmer, F. J. A1 - Schwabe, U. T1 - Guanine nucleotide effects on 8-cyclopentyl-1,3-[\(^3\)H]dipropylxanthine binding to membrane-bound and solubilized A\(_1\) adenosine receptors of rat brain N2 - The effects of guanine nucleotides on binding of 8-cyclopentyl-1,3-[\(^3\)H]dipropylxanthine [\(^3\)H]DPCPX), a highly selective A\(_1\) adenosine receptor antagonist, have been investigated in rat brain membranes and solubilized A\(_1\) receptors. GTP, which induces uncoupling of receptors from guanine nucleotide binding proteins, increased binding of [\(^3\)H]DPCPX in a concentration-dependent manner. The rank order of potency for different guanine nucleotides for increasing [\(^3\)H]DPCPX bindingwas the same as for guanine nuc1eotide-induced inhibition of agonist binding. Therefore, a role for a guanine nucleotide binding protein, e.g., G\(_i\), in the regulation of antagonist binding is suggested. This was confirmed by inactivation ofGi by N-ethylmaleimide (NEM) treatment of membranes, which resulted in an increase in [\(^3\)H]DPCPX binding similar to that seen with addition of GTP. Kinetic and equilibrium binding studies showed that the GTP- or NEM-induced increase in antagonist binding was not caused by an affinity change of A\(-1\) receptors for [\(^3\)H]DPCPX but by an increased Bmu value. Guanine nucleotides had similar effects on membrane-bound and solubilized receptors, with the effects in the solubilized system being more pronounced. In the absence of GTP, when rnost receptors are in a high-affinity state for agonists, only a few receptors are labeled by [\(^3\)H]DPCPX. It is suggested that [\(^3\)H]DPCPX binding is inhibited when receptors are coupled to G\(_i\). Therefore, uncoupling of A\(_1\) receptors from G\(_i\) by guanine nucleotides or by inactivation of G\(_i\) with NEM results in an increased antagonist binding. Key Words: Adenosine receptors-8 -Cyclopentyl-1,3-eH]dipropylxanthine-Antagenist binding-Guanine nucleotide effects. Klotz K.-N. et al. Guanine nucleotide etfects on 8-cyclopentyl-1 ,3-eH]dipropylxanthine binding to membrane-bound and solubilized A1 adenosine receptors of rat brain. J. Neurochem. 54, 1988-1994 (1990). KW - Toxikologie Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60369 ER - TY - CHAP A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Keil, Roger A1 - Zimmer, Franz-Josef A1 - Schwabe, Ulrich T1 - Modulation of (§H) DPCPX binding to membrane-bound ans solubilized A1 adenosine receptors by guanine nucleotides N2 - No abstract available KW - Adenosinrezeptor Y1 - 1989 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86153 ER - TY - JOUR A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Krotec, K. L. A1 - Gripentrog, J. A1 - Jesaitis, A. J. T1 - Regulatory interaction of N-formyl peptide chemoattractant receptors with the membrane skeleton in human neutrophils N2 - The cytoskeleton and/or membrane skeleton has been implicated in the regulation of N-formyl peptide receptors. The coupling of these chemotactic receptors to the membrane skeleton was investigated in plasma membranes from unstimulated and desensitized human neutrophils using the photoreactive agonist N-formyl-met-leu-phelys-N\(^6\)-[\(^{125}\)I]2(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'-dithiopropionate (fMLFK-[\(^{125}\)I]ASD). When membranes of unstimulated cells were solubilized in Triton-X 100, a detergent that does not disrupt actin filaments, only 50% of the photoaffinity-labeled receptors were solubilized sedimenting in sucrose density gradients at a rate consistent with previous reports. The remainder were found in the pellet fraction along with the membrane skeletal actin. Solubilization of the membranes in the presence of p-chloromercuriphenylsulfonic acid, elevated concentrations of KCI, or deoxyribonuclease I released receptors in parallel with actin. When membranes from neutrophils, desensitized by incubation with fMLFK-e 251]ASD at 15°C, were solubilized, nearly all receptors were recovered in the pellet fraction. lncubation of cells with the Iigand at 4°C inhibited desensitization partially and prevented the conversion of a significant fraction of receptors to the form associated with the membrane skeletal pellet. ln these separations the photoaffinity-labeled receptors not sedimenting to the pellet cosedimented with actin. Approximately 25% of these receptors could be immunosedimented with antiactin antibodies suggesting that N-formyl peptide receptors may interact directly with actin. These results are consistent with a regulatory role for the interaction of chemotactic N-formyl peptide receptors with actin of the membrane skeleton. KW - Toxikologie Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60466 ER - TY - JOUR A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Lohse, M. J. T1 - The glycoprotein nature of A\(_1\) adenosine receptors N2 - A\(_1\) adenosine receptors from different tissues and species we~e photoaffinity labelled and then the carbohydrate content was examined by both enzymatic and chemical treatment. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of the labelled membrane receptors shows that neuraminidase treatment alters the electrophoretic mobility of the receptor band indica ting the presence of terminal neurandnie acids. Neuraminidase digestion does not influence the binding characteristics of the receptor. The totally deglycosylated receptor protein obtained by chemical treatment has an apparent molecular weight Of 32,000. KW - Toxikologie Y1 - 1986 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60231 ER - TY - JOUR A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Lohse, M. J. A1 - Schwabe, U. T1 - Chemical modification of A\(_1\) adenosine receptors in rat brain membranes - evidence for histidine in different domains of the ligand binding site N2 - Chemical modification of amino acid residues was used to probe the ligand recognition site of A\(_1\) adenosine receptors from rat brain membranes. The effect of treatment with group·specific reagents on agonist and antagonist radioligand binding was investigated. The histidine-specific reagent diethylpyrocarbonate (DEP) induced a loss of binding of the agonist R-N\(^6\)-[\(^3\)H]phenylisopropyladenosine ([\(^3\)H]PIA), which could be prevented in part by agonists, but not by antagonists. DEP treatment induced also a loss of binding of the antagonist [\(^3\)H]8- cyclopentyl-1 ,3-dipropylxanthine ([\(^3\)H]DPCPX). Antagonists protected A\(_1\) receptors from this inactivation while agonists did not. This result provided evidence for the existence of at least 2 different histidine residues involved in ligand binding. Consistent with a modification of the binding site, DEP did not alter the affinity of [\(^3\)H]DPCPX, but reduced receptor number. From the selective protection of [\(^3\)H] PIA and [\(^3\)H]DPCPX binding from inactivation, it is concluded that agonists and antagonists oocupy different domains at the binding site. Sulfhydryl modifying reagents did not influence antagonist binding, but inhibited agonist binding. This effect is explained by modification of tbe inhibitory guanine nucleotide binding protein. Pyridoxal 5-phosphate inactivated both [\(^3\)H]PIA and [\(^3\)H]DPCPX binding, but the receptors could not be protected from inactivation by ligands. Therefore, no amino group seems to be located at the Iigand binding site. In addition, it was shown that no further amino acids witb polar side chains are present. The absence of bydrophilic amino acids frout the recognition site of the receptor apart from histidine suggests an explanation for the lack of hydrophilic ligands with high affinity for A\(_1\) receptors. KW - Toxikologie Y1 - 1988 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60295 ER - TY - JOUR A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Lohse, M. J. A1 - Schwabe, U. T1 - Characterization of the solubilized A\(_1\) adenosine receptor from rat brain membranes N2 - A\(_1\) adenosine receptors from rat brain membranes were solubilized with the zwitterionic detergent 3-[3-( cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate. The solubilized receptors retained all the characteristics of membrane-bound A\(_1\) adenosine receptors. A high and a low agonist affinity state for the radiolabelled agonist (R)-\(N^6\)-[\(^3\)H]phenylisopropyladenosine([\(^3\)H]PJA) with K\(_D\) values of 0.3 and 12 nM, respectively, were detected. High-affinity agonist binding was regulated by guanine nucleotides. In addition agonist binding was still modulated by divalent cations. The solubilized A\(_1\) adenosine receptors could be labelled not only with the agonist [\(^3\)H]PIA but also with the antagonist I ,3-diethyi-8-[\(^3\)H]phenylxanthine. Guanine nucleotides did not affect antagonist binding as reported for membrane-bound receptors. These results suggest that the solubilized receptors are still coupled to the guanine nucleotide binding protein N; and that all regulatory functions are retained on solubilization. Key Words: A1 adenosine receptors - Solubilization- Rat brain membranes. Klotz K.-N. et al. Characterization of the solubilized A1 adenosine receptor from rat brain membranes. J. Neurochem. 46, 1528-1534 (1986). KW - Toxikologie KW - A1 adenosine receptors KW - solubilization KW - rat brain membranes Y1 - 1986 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60222 ER - TY - JOUR A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Lohse, M. J. A1 - Schwabe, U. A1 - Cristalli, G. A1 - Vittori, S. A1 - Grifantini, M. T1 - 2-Chloro-N\(^6\)-[\(^3\)H]cyclopentyladenosine ([\(^3\)H]CCPA) - a high affinity agonist radioligand for A\(_1\) adenosine receptors N2 - The tritiated analogue of 2-chloro-N6-cyclopentyladenosine (CCPA), an adenosine derivative with subnanomolar affinity and a 10000-fold selectivity for A1 adenosine receptors, has been examined as a new agonist radioligand. [3H]CCP A was prepared with a specifi.c radioactivity of 1.58 TBqjmmol ( 43 Ci/mmol) and bound in a reversible manner to A1 receptors from rat brain membranes with a high affinity K0 -value of 0.2 nmol/1. In the presence of GTP a K0 -value of 13 nmol/1 was determined for the low affinity state for agonist binding. Competition of several adenosine receptor agonists and antagonists for [3H]CCPA binding to rat brain membranes confrrmed binding to an A1 receptor. Solubilized A1 receptors bound [3H]CCPA with similar affinity for the high affinity state. At solubilized receptors a reduced association rate was observed in the presence of MgC12, as has been shown for the agonist [ 3H]N6-phenylisopropyladenosine ([3H]PIA). [3H]CCPA was also used for detection of A1 receptors in rat cardio myocyte membranes, a tissue with a very low receptor density. A K0 -value of 0.4 nmol/1 and a Bmax-value of 16 fmol/ mg protein was determined in these membranes. In human platelet membranes no specific binding of [3H]CCPA was measured at concentrations up to 400 nmoljl, indicating that A2 receptors did not bind [3H]CCPA. Based on the subnanomolar affinity and the high selectivity for A1 receptors [ 3H]CCPA proved to be a useful agonist radioligand for characterization of A 1 adenosine receptors also in tissues with very low receptor density. KW - Toxikologie KW - Adenosine receptors KW - Radioligauds KW - agonists Y1 - 1989 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60328 ER - TY - JOUR A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Vogt, H. A1 - Tawfik-Schlieper, H. T1 - Comparison of A\(_1\) adenosine receptors in brain from different species by radioligand binding and photoaffinity labelling N2 - Radioligand binding to A\(_1\) adenosine receptors at brain membranes from seven species was investigated. The antagonist 8-cyclopentyl-1 ,3-[\(^3\)H]dipropylxanthine ([\(^3\)H]DPCPX) bound with affinities between 0.17 nM in sheep brain and 2.1 nM in guinea pig brain. Competition of several antagonists for [\(^3\)H]DPCPX binding showed that the most potent compounds were DPCPX with K\(_i\) values of 0.05 nM in bovine brain and 1.1 nM in guinea pig brain and xanthine amine congener (XAC) with K\(_i\) values of 0.03 nM in bovine brain and 5.5 nM in guinea pig brain. The differences in affinity of the agonist radio Iigand 2-chloro-N\(^6\) -[\(^3\)H]cyclopen tyladenosine ([\(^3\)H]CCP A) were less pronounced, rauging from a K\(_D\) value of 0.12 nM (hamster brain) to 0.42 nM (guinea pig brain). Agonist competition for [\(^3\)H]DPCPX binding of photoaffinity labelling, however, exhibited marked species differences. N-Ethylcarboxamidoadenosine (NECA) and S-N\(^6\)-phenylisopropyladenosine (S-PIA) showed 20 to 25-fold different K\(_D\) values in different species. NECA had a particularly high affinity in guinea pig brain and was only two-fold less potent than R-PIA. Thus, the difference from the "classical" A\(_1\) receptor profile (R-PIA > -NECA > S-PIA) is not sufficient to speculate that A\(_1\) receptor subtypes may exist that are coupled to different effector systems. Our data show that these difference can easily be explained by species differences. KW - Toxikologie KW - A1 adenosine receptors KW - Species differences KW - Radioligand binding KW - Photoaffinity labelling Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60388 ER - TY - THES A1 - Knaus, Anne Elizabeth T1 - Pharmacological target proteins of alpha2-agonists in alpha2ABC-deficient mice T1 - Pharmakologische Zielproteine von alpha2-Agonisten bei alpha2ABC-Rezeptor-defizienten Mäusen N2 - Clonidine is an agonist at alpha2-adrenergic receptors that mediate a wide variety of the physiological responses to epinephrine and norepinephrine, such as inhibition of neurotransmitter release as well as sedation and analgesia. As with other therapeutically used alpha2-agonists such as moxonidine and rilmenidine, clonidine possesses an imidazoline structure and is believed to lower blood pressure not only via central and peripheral alpha2-receptors, but perhaps even more so by acting on central “imidazoline I1 receptors” in the brain stem. The molecular structure of these hypothetical “imidazoline I1 receptors” has not yet been identified. In order to test whether ligands with an imidazoline structure elicit pharmacological effects via alpha2-adrenergic receptors or via “imidazoline receptors”, mice were generated with a targeted deletion of all three alpha2-adrenergic receptor subtypes (alpha2ABC-KO). These alpha2ABC-KO mice were an ideal model in which to examine the pharmacological effects of the centrally acting antihypertensives clonidine, moxonidine and rilmenidine in the absence of alpha2-adrenergic receptors. As expected, sedative and analgesic actions of clonidine were completely absent in alpha2ABC-KO mice, confirming the sole role of alpha2-receptors in these properties of clonidine. Clonidine significantly lowered heart rate in anesthetized alpha2ABC-KO and wild-type mice by up to 150 beats/min. A similar bradycardic effect of clonidine was observed in isolated spontaneously beating right atria from alpha2ABC-KO mice. After treatment with the specific If inhibitor ZD 7288, clonidine was no longer able to lower spontaneous beating frequency, suggesting a common site of action. Furthermore, in HEK293 cells stably transfected with HCN2 and HCN4, it could be shown that clonidine inhibits the If current via blockade of pacemaker channels with similar affinity as in isolated alpha2ABC-KO and wild-type atria. This inhibition was demonstrated again in isolated sinoatrial node (SAN) cells from alpha2ABC-KO mice and was identical in potency and efficacy to clonidine inhibition observed in isolated wild-type SAN cells, confirming that inhibition of atrial HCN channels constitutes the alpha2-independent bradycardic action of clonidine. Direct inhibition of cardiac HCN pacemaker channels contributes to the bradycardic effects of clonidine in gene-targeted mice. Thus clonidine-like drugs represent novel structures for future HCN channel inhibitors. N2 - alpha2-adrenerge Rezeptoren vermitteln die vielfältigen Wirkungen der endogenen Catecholamine Noradrenalin und Adrenalin, darunter auch eine Hemmung der Noradrenalin-Freisetzung sowie Sedierung und Analgesie. Clonidin und die ebenfalls therapeutisch eingesetzten alpha2-Agonisten Moxonidin und Rilmenidin besitzen eine Imidazolin-Teilstrukur. Es wird zur Zeit diskutiert, ob die hypotensive Wirkung dieser Arzneimittel nicht nur auf zentrale und periphere alpha2-Rezeptoren zurückzuführen ist, sondern auch auf sogenannte “I1 Imidazolin-Rezeptoren” in der ventrolateralen Medulla. Bis heute ist die molekulare Struktur dieser hypothetischen Rezeptoren nicht bekannt. Um diese Imidazolin-Hypothese zu überprüfen wurden Mäuse mit einer gezielten Deletion in allen drei alpha2-Rezeptor Genen generiert (alpha2ABC-KO). Dieses Mausmodell eignete sich hervorragend, um die pharmakologische Wirkung von den zentral-wirksamen Antihypertensiva Clonidin, Moxonidin und Rilmenidin in der völligen Abwesenheit von alpha2-Rezeptoren zu untersuchen. Wie erwartet fehlten die sedativen und analgetischen Wirkungen des Clonidins bei alpha2ABC-KO Mäusen, wodurch die alleinige Beteiligung von alpha2-Rezeptoren an diesen Eigenschaften des Clonidins bestätigt wurde. Bei anästhesierten alpha2ABCKO und Wildtyp-Mäusen zeigte Clonidin eine signifikante Senkung der basalen Herzfrequenz in beiden Genotypen von bis zu 150 Schlägen/min. In ähnlicher Weise setzte Clonidin in isolierten, spontan schlagenden rechten Vorhöfen von alpha2ABC-KO die Schlagfrequenz herab. Nach Vorbehandlung der Vorhöfe mit dem spezifischen If Inhibitor ZD 7288 fand keine weitere Senkung der Schlagfrequenz durch Clonidin mehr statt, was auf einen gemeinsamen Wirkort der beiden Substanzen hindeutete. In stabil transfizierten HEK293 Zellen zeigte Clonidin eine Inhibition des If Stromes durch Blockade von HCN2- und HCN4-Kanälen mit ähnlicher Potenz wie in den isolierten Vorhöfen. Ebenfalls in isolierten Sinusknoten (SAN) Zellen von alpha2ABC-KO und Wildtyp-Mäusen inhibierte Clonidin den If Strom mit gleicher Potenz. Diese Befunde bestätigen, dass die Blockade von atrialen HCN-Kanälen den Mechanismus der alpha2-unabhängigen, Clonidin-induzierten Bradykardie darstellt. Die direkte Hemmung von kardialen HCN-Schrittmacher-Kanälen trägt wesentlich zur bradykarden Wirkung von Clonidin bei transgenen Mäusen bei. Clonidin-Derivate bilden somit die Basis für die Entwicklung neuer HCN-Kanal-Inhibitoren. KW - alpha2-Rezeptor KW - Clonidin KW - HCN-Kanal KW - alpha2-KO Maus KW - I1 Imidazolin Bindungsstelle KW - alpha2-receptor KW - clonidine KW - HCN channel KW - alpha2-KO mouse KW - I1 imidazoline binding site Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23752 ER - TY - JOUR A1 - Koch, R. A1 - Deger, A. A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Schenzle, D. A1 - Krämer, H. A1 - Kelm, S. A1 - Müller, G. A1 - Rapp, R. A1 - Weber, U. T1 - Characterization of solubilized insulin receptors from rat liver microsomes. Existence of two receptor species with different binding properties N2 - Insulin receptors were solubilized from rat liver microsomes by the nonionic detergent Triton X-100. After gel filtration of the extract on Sepharose CL-6B, two insulin-binding species (peak I and peak li) were obtained. The structure and binding properties of both peaks were characterized. Gel filtration yielded Stokes radii of 9.2 nm (peak I) and 8.0 nm (peak Il). Both peaks were glycoproteins. At 4°C peak 1 showed optimal insulin binding at pH 8.0 and high ionic strength. In contrast, peak li bad its binding optimum at pH 7.0 and low ionic strength, where peak I bindingwas minimal. For peak I the change in insulin binding under different conditions of pH and ionic strength was due to a change in receptor affinity only. For peak 11 an additional change in receptor number was found. Both peaks yielded non-linear Scatchard plots under most of the buffer conditions examined. At their binding optima at 4 oc the high affinity dissociation constants were 0.50 nM (peak I) and 0.55 nM (peak II). Sodium dodecyl sulfatejpolyacrylamide gel electrophoresis of peak I revealed five receptor bands with Mr 400000, 365000, 320000, 290000, and 245000 under non-reducing conditions. For peak II two major receptor bands with M\(_r\) 210000 and 115000 were found. The peak II receptor bands were also obtained aftermild reduction of peak I. After complete reduction both peaks showed one major receptor band with M\(_r\) 130000. The reductive generation of the peak II receptor together with molecular mass estimations suggest that the peak I receptor is the disulfide-linked dimer of the peak II receptor. Thus, Triton extracts from rat liver microsomes contain two receptor species, which are related, but differ considerably in their size and insulin-binding properties. KW - Toxikologie Y1 - 1986 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60215 ER - TY - THES A1 - Kodandaraman, Geema T1 - Influence of insulin-induced oxidative stress in genotoxicity and disease T1 - Einfluss von insulininduziertem oxidativem Stress auf Genotoxitität und Krankheit N2 - Hormones are essential components in the body and their imbalance leads to pathological consequences. T2DM, insulin resistance and obesity are the most commonly occurring lifestyle diseases in the past decade. Also, an increased cancer incidence has been strongly associated with obese and T2DM patients. Therefore, our aim was to study the influence of high insulin levels in accumulating DNA damage in in vitro models and patients, through the induction of oxidative stress. The primary goal of this study was to analyze the genotoxicity induced by the combined action of two endogenous hormones (insulin and adrenaline) with in vitro models, through the induction of micronuclei and to see if they cause an additive increase in genomic damage. This is important for multifactorial diseases having high levels of more than one hormone, such as metabolic syndrome and conditions with multiple pathologies (e.g., T2DM along with high stress levels). Furthermore, the combination of insulin and the pharmacological inhibition of the tumor suppressor gene: PTEN, was to be tested in in vitro models for their genotoxic effect and oxidative stress inducing potential. As the tumor suppressor gene: PTEN is downregulated in PTEN associated syndromes and when presented along with T2DM and insulin resistance, this may increase the potential to accumulate genomic damage. The consequences of insulin action were to be further elucidated by following GFP-expressing cells in live cell-imaging to observe the ability of insulin, to induce micronuclei and replicative stress. Finally, the detrimental potential of high insulin levels in obese patients with hyperinsulinemia and pre-diabetes was to be studied by analyzing markers of oxidative stress and genomic damage. In summary, the intention of this work was to understand the effects of high insulin levels in in vitro and in patients to understand its relevance for the development of genomic instability and thus an elevated cancer risk. N2 - In-vitro-Genotoxizitätsstudien mit hohen Konzentrationen von Insulin und die Kombination mit Adrenalin zeigten keinen additiven Anstieg der Mikrokernzahl. Der Insulinrezeptor und der AKT-Signalweg waren in den insulinvermittelten Genomschaden involviert. Die endogenen ROS-Quellen, Mitochondrien und NOX, waren an dem insulinvermittelten DNA-Schaden beteiligt. Hohe Konzentrationen von mitochondrialen ROS alleine, verursacht durch einen Komplex III Mitochondrien-Inhibitor, führten zu Zytotoxizität, aber nicht zu einer Zunahme des Genomschadens. Daher ist die durch das NOX-Enzym vermittelte ROS-Produktion wahrscheinlich der gemeinsame Faktor des genotoxischen Signalweges von Insulin und Adrenalin. Die Überstimulation des NOX-Enzyms führte zu einer Sättigung der zellulären biologischen Effekte und fehlender Additivität bei der Induktion von Genomschaden. Dies könnte jedoch unter physiologischen Bedingungen anders sein, da die Hormonspiegel niedriger sind und die ROS-Quellen nicht durch jedes einzelne der Hormone bereits maximal genutzt und daher erschöpft werden. Damit könnte die Möglichkeit eines additiven Genomschadens in vivo bestehen. Die Rolle des AKT-Signalwegs bei der Insulin-vermittelten genomischen Schädigung ist bereits etabliert und hier wurde nun die Funktion des negativen Regulatorproteins PTEN untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die PTEN Inhibierung nicht nur zu einer erhöhten Genotoxizität durch MN-Induktion führte, sondern auch zur Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktion. Obwohl kein Anstieg von ROS nach PTEN-Inhibierung beobachtet wurde, könnte die mitochondriale Dysfunktion zur metabolischen Imbalance sowie zur Zunahme des Genomschadens führen. Dies könnte insbesondere bei Patienten mit bestimmten PTEN-assoziierten Syndromen und Krebserkrankungen, die eine defekte PTEN-vermittelte Tumorsuppressorfunktion, DNA-Reparaturdefekte und kompromittierte antioxidative Abwehrmechanismen aufweisen, eine wichtige Rolle spielen. Wenn diese Patienten zusätzlich von Hyperinsulinämie betroffen sind, könnte eine Akkumulation von Genomschaden erfolgen und das Risiko zur Krebsentstehung wäre erhöht. Der Mechanismus der Genomschadensinduktion durch Insulin wurde bisher mit einer ROS-vermittelten DNA-Oxidation in Verbindung gebracht, aber noch nicht mit der mitogenen Signalgebung. Bei dieser beschleunigte das mitogene Potential des Insulins die Zellteilung und verursachte einen leichten replikativen Stress. Der milde replikative Stress könnte der Kontrolle durch die mitotischen Checkpoint-Proteine entgehen und zu Chromosomen-Fehlverteilungen und Chromosomenbrüchen führen. Dieser Effekt wurde in der Krebszelllinie Hela in Form von multipolaren Spindeln und Mikronuklei beobachtet und es ist nicht klar ob normale Zellen mit effizienterer Kontrolle dies verhindern könnten. Insgesamt könnte ein durch hohe Insulinspiegel vermittelter Schaden im Kontext anderer Komorbiditäten wie etwa PTEN Syndromen, metabolischem Syndrom oder Adipositas zu einer Akkumulation von DNA-Schäden führen. Schließlich zeigte die Analyse von Proben adipöser Patienten eine Zunahme von DNA-Schaden und oxidativem Stress im Vergleich zu den gesunden Kontrollen. Der Anstieg des DNA-Schadens war am höchsten in der Untergruppe der Patienten mit Insulinresistenz. Hoher Insulinspiegel bedeutet somit ein Risiko vom erhöhten oxidativen Stress und Genomschaden, insbesondere in Kombination mit Komorbiditäten. Erschwert wird das Verständnis dieser multifaktoriellen Zusammenhänge durch das komplexe Zusammenspiel von oxidativem Stress und seiner zellulären Regulation in vielen physiologischen sowie pathophysiologischen Prozessen. Daneben ist es eine Herausforderung, Genomschäden bei den geringen Wirkspiegeln hormoneller Effekte zu detektieren. Weitere Untersuchungen der komplexen Insulin-vermittelten Genomschadenswege werden notwendig sein, um mögliche Risiken der Hyperinsulinämie bei Erkrankungen wie Stoffwechselkrankheiten, Diabetes Typ 2 und Adipositas besser zu charakterisieren. KW - Insulin KW - Genotoxicity KW - Micronucleus Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242005 ER - TY - THES A1 - Konrad, Charlotte T1 - Biochemische Charakterisierung von cAMP-Gradienten – Einfluss von Phosphodiesterasen T1 - Biochemical Characterization of cAMP Gradients – Influence of Phosphodiesterases N2 - Cyclisches Adenosinmonophosphat ist ein ubiquitärer zweiter Botenstoff zahlreicher Signalwege im menschlichen Körper. Auf eine Vielzahl verschiedenster extrazellulärer Signale folgt jedoch eine Erhöhung desselben intrazellulären Botenstoffs - cAMP. Nichtsdestotrotz schafft es die Zelle, Signalspezifität aufrecht zu erhalten. Ein anerkanntes, wenn auch bisher unverstandenes Modell, um dieses zu ermöglichen, ist das Prinzip der Kompartimentierung. Die Zelle besitzt demnach Areale verschieden hoher cAMP-Konzentrationen, welche lokal begrenzt einzelne Signalkaskaden beeinflussen und somit eine differenzierte Signalübertragung ermöglichen. Eine mögliche Ursache für die Ausbildung solcher Bereiche geringerer cAMP- Konzentrationen (hier als Domänen bezeichnet), ist die hydrolytische Aktivität von Phosphodiesterasen (PDEs), welche als einzige Enzyme die Fähigkeiten besitzen, cAMP zu degradieren. In dieser Arbeit wird der Einfluss der cAMP-Hydrolyse verschiedener PDEs auf die Größe dieser Domänen evaluiert und mit denen der PDE4A1 verglichen, welche bereits durch unsere Arbeitsgruppe aufgrund ihrer Größe als Nanodomänen definiert wurden. Der Fokus wird dabei auf den Einfluss von kinetischen Eigenschaften der Phosphodiesterasen gelegt. So werden eine PDE mit hoher Umsatzgeschwindigkeit (PDE2A3) und eine PDE mit hoher Substrataffinität (PDE8A1) verglichen. Mithilfe sogenannter Linker, Abstandshaltern definierter Länge, werden zusätzlich die Nanodomänen ausgemessen, um einen direkten Zusammenhang zwischen Größe und kinetischer Eigenschaft anzugeben. Die Zusammenschau der Ergebnisse zeigt, dass die maximale Umsatzgeschwindigkeit der Phosphodiesterasen direkt mit der Größe der Nanodomänen korreliert. Durch den unmittelbaren Vergleich der gesamten PDE mit ihrer katalytischen Domäne wird zusätzlich der Einfluss von regulatorischen Domänen evaluiert. Es wird gezeigt, dass diese cAMP-Gradienten modulieren können. Bei der PDE2A3 geschieht die Modulation u.a. durch Stimulation mit cGMP, welche höchstwahrscheinlich dosisabhängig ist und somit graduell verläuft. Hiermit präsentieren sich die Domänen als dynamische Bereiche, d.h. sie können in ihrer Ausprägung reguliert werden. In dieser Arbeit wird die Hypothese bestätigt, dass Phosphodiesterasen eine wichtige Rolle in der Kompartimentierung von cAMP spielen, die Gruppe jedoch inhomogener ist, als bislang angenommen. Die Gradienten-Bildung lässt sich nicht bei jeder Phosphodiesterase darstellen (PDE8A1). Einige Phosphodiesterasen (PDE2A3) jedoch bilden Kompartimente, die durch externe Stimuli in ihrer Größe reguliert werden können. Die Arbeit legt den Grundstein zur breiteren Charakterisierung des spezifischen Einflusses weiterer PDEs auf cAMP-Kompartimentierung, welches nicht nur das Verständnis der Kompartimentierungs-Strategien voranbringt, sondern auch essentiell für das Verständnis der Pathophysiologie zahlreicher Krankheitsbilder, aber auch für das Verständnis bereits angewandter aber auch potentiell neuer Medikamente ist. N2 - Cyclic AMP is a ubiquitous second messenger, which is involved in a huge variety of signaling pathways. Nevertheless, thinking about signaling specificity, it is unclear how numerous diverse signals are all translated via the same second messenger. However, to ensure downstream specificity there is one accepted model - the compartmentalization of cAMP. Different levels of cAMP therefore lead to signaling islets or areas, which ensure a more diverse downstream signaling. One example, which guarantees areas with lower cAMP concentration, is the local hydrolysis of cAMP due to phosphodiesterases’ hydrolytic activity. In this thesis the ability of different phosphodiesterases to build cAMP gradients is compared to the ability of the PDE4 to build cAMP domains in the scale of nanometers, which was already shown by our group. To discriminate influence factors of the formation of those nanodomains, the focus was set on distinct PDEs’ kinetic properties. Therefore, a PDE with a high velocity (PDE2A3) for cAMP hydrolysis is compared to the PDE with the highest known affinity (PDE8A1) to cAMP. Furthermore, with the tools provided by our group, linkers, which are “nanorulers” of distinct size, were used to directly measure the radius of those domains. It is revealed, that the size of the nanodomains directly correlates with the hydrolysis velocity. Furthermore, by comparison of full length PDE with its catalytic domain, it is shown, that their regulatory domains can modulate the ability of phosphodiesterases to create cAMP gradients. In PDE2A3, modulation of cAMP gradients was observed upon cGMP stimulation, which probably occurs in a concentration-dependent matter. Thus, cAMP domains seem to be dynamic areas, i.e. they can be regulated in their size. It is postulated, that phosphodiesterases are one important force for creating compartments, but the family of PDEs itself is inhomogeneous. Not every PDE can build detectable compartments (PDE8A1), but others can build compartments, which are regulated through external stimuli (PDE2A3). The thesis builds the foundation for additional characterization of the other PDE families, which would provide further insight in strategies of cAMP compartmentalization. Moreover, the knowledge of distinct functions of PDEs on cAMP compartments is crucial for the understanding of the pathophysiology of several diseases and the understanding of present and future pharmacological therapies. KW - Cyclo-AMP KW - Phosphodiesterase KW - cAMP KW - PDE Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205728 ER - TY - THES A1 - Kopp, Eva Katharina T1 - Biotransformation and Toxicokinetics of Acrylamide in Humans T1 - Biotransformation und Toxikokinetik von Acrylamid im Menschen N2 - The widely used chemical acrylamide (AA) has been classified as a probable human carcinogen. This classification was based on positive results in rodent carcinogenicity studies as well as on a number of in vitro mutagenicity assays. In 2002, AA was discovered to be formed during the preparation of starch-containing foods. According to the latest FDA exposure assessment (2006), the average daily intake has been estimated from AA levels in foodstuffs and from nutritional habits to be around 0.4 µg/kg b.w. with a 90th percentile of 0.95 µg/kg b.w.. In children and adolescents however, the daily AA intake is about 1.5 times higher, due to lower body weight and differing consumption patterns. Apart from the diet, humans may be exposed to AA during the production or handling of monomeric AA, from AA residues in polyacrylamides, and from cigarette smoke. After oral administration, AA is readily absorbed and distributed throughout the organism. AA is metabolized to the reactive epoxide glycidamide (GA) via the CYP 450 isoenzyme CYP 2E1. Both, AA and GA are conjugated with glutathione. After enzymatic processing, the mercapturic acids N-Acetyl-S-(2-carbamoylethyl)-L-cysteine (AAMA) as well as the regioisomers N-Acetyl-S-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)-L-cysteine (GAMA) and N-Acetyl-S-(1-carbamoyl-2-hydroxy-ethyl)-L-cysteine (iso-GAMA) are excreted with urine. An additional pathway for the metabolic conversion of GA is the epoxide hydrolase mediated hydrolysis to the diol compound glyceramide. Following administration of AA at doses exceeding the daily dietary intake by a factor of 1000 - 6000 to human subjects, a new urinary metabolite was found, which could be identified as the S-oxide of AAMA (AAMA-sulfoxide). In general, data from animal studies are used for risk assessment of (potential) human carcinogens. However, inter-species differences in toxicodynamics or toxicokinetics, e.g. in biotransformation may lead to under- or overestimation of human risk. The objective of this work was to establish a highly specific and sensitive analytical method to quantify the major urinary metabolites of AA. Other aims apart from measurements concerning the human background exposure were the evaluation of biotransformation and toxicokinetics of AA in humans and rats after oral administration of 13C3-AA. The obtained data was intended to help avoid linear extrapolation from animal models for future risk assessments of AA carcinogenicity. N2 - Die weitverbreitete Chemikalie Acrylamid (AA) wurde als möglicherweise krebserregend im Menschen eingestuft. Diese Klassifizierung beruhte auf positiven Ergebnissen aus Kanzerogenitätsstudien in Nagern sowie einer Reihe von in vitro Mutagenitätstests. Im Jahr 2002 wurde entdeckt, dass AA während der Zubereitung von stärkehaltigen Nahrungsmitteln entsteht. Nach den neuesten Expositionsabschätzungen der FDA (2006) wurde auf der Basis von AA-Gehalten in Lebensmitteln und Ernährungsgewohnheiten eine tägliche Aufnahme von etwa 0.4 µg/kg KG (Körpergewicht) errechnet. Die 90. Percentile lag bei 0.95 µg/kg KG. In Kindern und Heranwachsenden ist die tägliche AA Aufnahme jedoch um etwa Faktor 1.5 höher. Dies beruht auf einem vergleichsweise geringeren Körpergewicht und anderen Ernährungsvorlieben (175). Außer über die Nahrung können Menschen während der Produktion oder Verarbeitung von monomerem AA, über Rückstände in Polyacrylamiden und über Zigarettenrauch gegenüber AA exponiert sein. Nach oraler Gabe wird AA schnell resorbiert und im ganzen Organismus verteilt . AA wird über das Cytochrom P450 Isoenzym CYP 2E1 in das reaktive Epoxid Glycidamid (GA) umgewandelt. Sowohl AA als auch GA binden an Glutathion. Nach enzymatischer Verstoffwechslung werden die Mercaptursäuren N-Acetyl-S-(2-carbamoylethyl)-L-cystein (AAMA) sowie die Regioisomere N-Acetyl-S-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)-L-cystein (GAMA) und N-Acetyl-S-(1-carbamoyl-2-hydroxyethyl)-L-cystein (iso-GAMA) mit dem Urin ausgeschieden. Ein weiterer Weg für die metabolische Umwandlung von GA ist die durch Epoxidhydrolase katalysierte Hydrolyse zum Diol Glyceramid. Nach der Verabreichung von AA an Menschen in Dosen, die die tägliche Aufnahme über die Nahrung um das 1000 bis 6000-fache überschritten, wurde ein neuer Metabolit im Urin entdeckt, der als das S-oxid von AAMA identifiziert werden konnte. Im Allgemeinen werden Daten aus Tierstudien für die Risikobewertung von (möglichen) Kanzerogenen im Menschen verwendet. Spezies-Unterschiede bezüglich der Biotransformation können demzufolge zu Unter- oder Überbewertung des Risikos für den Menschen führen. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine hochspezifische und empfindliche analytische Methode für die Quantifizierung der wichtigsten Metaboliten von AA im Urin zu entwickeln. Neben Messungen bezüglich der Hintergrundbelastung im Menschen sollten Biotransformation und Toxikokinetik von AA in Menschen und Ratten nach oraler Gabe von 13C3-AA bestimmt werden. Die gewonnenen Daten sollten dazu beitragen, lineare Extrapolation ausgehend von Tiermodellen für zukünftige Risikoabschätzungen zu vermeiden. KW - Acrylamid KW - Metabolismus KW - Toxikokinetik KW - Risikobewertung KW - Speziesunterschiede KW - Acrylamide KW - Metabolism KW - Toxicokinetics KW - Risk Assessment KW - Species Differences Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37273 ER - TY - THES A1 - Koussémou, Yéwa Bony Marthe T1 - A\(_{2B}\) adenosine receptor signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells: Mechanism of A\(_{2B}\)-mediated reduction of ERK1/2 phosphorylation T1 - Signalwege des A\(_{2B}\) Adenosinrezeptors in MDA-MB-231 Brustkrebszellen: Mechanismus der A\(_{2B}\)-vermittelten Reduktion der ERK1/2 Phosphorylierung N2 - Recently, it was shown that MDA-MB-231 breast cancer cells express very high levels of the A2BAR as the sole adenosine receptor subtype, and stimulation of the A2BAR in MDA-MB-231 cells triggers an unusual inhibitory signal on ERK1/2 phosphorylation. The ERK1/2 pathway is reported to be associated with the control of growth, proliferation and differentiation of cells and as such might serve as a promising target for tumor treatment. The present study investigated signaling mechanisms involved in linking A2BAR to ERK1/2 phosphorylation in MDA-MB-231 cells. The A2BAR mediated reduction of ERK1/2 phosphorylation and of proliferation of MDA-MB-231 cell is in good agreement with previous results from (Dubey et al., 2005). These observations provide support to the hypothesis that activation of A2BAR could attenuate the growth of some types of cancer cell and argue against a stimulation of proliferation resulting from the activation of A2BAR as discussed by (Fernandez-Gallardo et al., 2016). AC activation by forskolin has recently been shown to enhance the activity of the chemotherapeutic agent doxorubicin in TNBC cells via a mechanism dependent on the PKA-mediated inhibition of ERK1/2 phosphorylation. Furthermore, forskolin also increased the sensitivity of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 triple negative breast cancer cells to 5-fluorouracil and taxol (Illiano et al., 2018), and sustains the evidence of anticancer activity mediated by cAMP/PKA-mediated ERK1/2 inhibition. Similar to these studies, a reduced amount of pERK1/2 was also observed after stimulation of AC with FSK, application of cAMP-AM or inhibition of PDE-4. The inhibition of ERK1/2 phosphorylation was mimicked by UTP and abolished with the PLC inhibitor U73122 or by chelating intracellular Ca2+ with BAPTA-AM. These results point to an important role for both cAMP and Ca2+ signaling in the pathway leading to a decrease in ERK1/2 phosphorylation. This study encourages the idea that A2BAR could be used as target in cancer therapy. But A2BAR did not only stimulate signaling cascades associated with cell survival and proliferation reduction, but also key phases relevant in angiogenesis like Ca2+ mobilization (Kohn et al., 1995). Whereas the potency toward AC and Ca2+ are similar for the diverse agonists, the potency to promote ERK1/2 reduction is much higher. Interestingly, the proliferation of MDA-MB-231 cells is inhibited by low nanomolar agonist concentration which is inactive in Ca2+ mobilization. This means that it is certainly possible to reduce the proliferation without promoting angiogenesis. LUF6210 is particularly interesting when considering that it preferentially stimulates a reduction in ERK1/2 phosphorylation over Ca2+ and therefore may not promote angiogenesis. LUF6210 is therapeutically appealing as adjuvant in treatment of cancer. Given that stimulation of AC can activate a reduction of ERK1/2 phosphorylation and proliferation in cancer cells, agonist bias toward Gs-AC-PKA-mediated ERK1/2 inhibition represent a potential therapy of various malignancies. The fact that the reduction of ERK1/2 phosphorylation followed by reduced proliferation observed in MDA-MB-231 cells were mediated by the activation of the A2BAR illustrates the importance of this receptor subtype in cancer. A2BARs must be considered as a key factor in cancer treatment and deserve attention for the development of new therapeutic strategies. N2 - Adenosin reguliert eine Reihe physiologischer Funktionen über die vier ARs, die zur Familie der GPCR gehören. Adenosin beeinflusst das Zellwachstum sowohl positiv als auch negativ. Dabei spielen die MAPK eine wichtige Rolle. Diverse Studien haben gezeigt, dass die Aktivierung alle ARs Subtypen zur Phosphorylierung der MAPK ERK1/2 führt. Es gibt immer mehr Hinweise auf die Beteiligung des A2BAR am Wachstum und der Progression von Tumoren. Die MDA-MB-231 Brustkrebszellen weisen eine hohe Expressionsrate des A2BAR als einzige ARs Subtypen auf. Zusätzlich zu AC-Aktivierung und intrazellulärer Ca2+-Freisetzung führt die Stimulation des A2BAR der MDA-MB-231-Brustkrebszellen zur Reduktion der ERK1/2 Phosphorylierung. NECA, der unselektive AR-Agonist, führt zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Inhibition der ERK1/2 Phosphorylierung. Auch eine signifikante Reduktion der Proliferation der MDA-MB-231 Brustkrebszellen wurde beobachtet. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass A2BARs das Wachstum von MDA-MB-231 Zellen hemmen, indem sie die Aktivierung des ERK1/2 reduzieren, was in gutem Einklang mit den Ergebnissen von (Dubey et al., 2005) steht. Diese Ergebnisse unterstützen die Ansicht, dass die Aktivierung von A2BAR das Wachstum von bestimmten Arten von Krebszellen hemmt, und wiederspricht dem fördernden Effekt des Wachstums von A2BAR beschrieben in (Fernandez-Gallardo et al., 2016). Die AC-Aktivierung durch Forskolin erhöht den Effekt des Chemotherapeutikums Doxorubicin in TNBC Zellen. Darüber hinaus erhöhte Forskolin auch die Empfindlichkeit von MDA-MB-231 und MDA-MB-468 TNBC auf 5-Fluorouracil und Taxol (Illiano et al., 2018) und bestätigt die anti-Krebs-Aktivität von reduzierter ERK1/2 Phosphorylierung, die von cAMP/PKA abhängig ist. Ähnlich zu diesen Studien reduziert sowohl eine Behandlung der MDA-MB-231 Zellen mit Forskolin oder mit cAMP-AM, als auch Hemmung der PDE-4 die ERK1/2 Phosphorylierung. Die durch A2BAR-vermittelte Reduktion der pERK1/2 ist in Anwesenheit des PKA Inhibitors H89 gehemmt. Die Reduktion der ERK1/2 Phosphorylierung wurde durch den PLC-Inhibitor U73122 und den Ca2+ Chelator BAPTA-AM gehemmt. Außerdem induziert die Ca2+ Freisetzung bei UTP die Reduktion der ERK1/2 Phosphorylierung. Diese Ergebnisse weisen auf eine wichtige Rolle von cAMP und Ca2+ in der A2BAR-vermittelten Hemmung der ERK1/2 Phosphorylierung hin. Eine solche Abnahme kann als Folge der Hemmung einer Kinase oder Stimulation einer Phosphatase auftreten. Wir untersuchten die MKPs, ein negativer Regulator der MAPK-Aktivität. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Stimulation des A2BAR in MDA-MB-231 Zellen zu erhöhter MKP-1 und MKP-2 Expression führt. Dieser Effekt bietet einen neuartigen Mechanismus für die A2BAR-vermittelte Reduktion der ERK1/2 Phosphorylierung. Der A2BAR und die induzierten Phosphatasen MKP-1 und MKP-2 könnten daher interessant für die Hemmung der Proliferation schnell wachsender Krebszellen sein. Auch wenn die Hemmung von Phosphatasen Aktivitäten die Reduktion der ERK1/2 Phosphorylierung rückgängig macht, deuten unsere Ergebnisse auf eine Beteilung der c-Raf-1 in der Reduktion der ERK1/2 Phosphorylierung hin. Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der -AR Rezeptoren ähnliche Signale wie A2BAR in MDA-MB-231 Zellen regulieren. Daher kann die Reduktion der ERK1/2 Phosphorylierung in MDA-MB-231 Zellen den Gs-gekoppelten Rezeptoren zugeordnet werden. A2BAR stimuliert auch eine Ca2+-Antwort, die mit der Angiogenese in Verbindung gebracht wird (Kohn et al., 1995). Interessanterweise ist das Wachstum von MDA-MB-231 Zellen mit nanomolare NECA Konzentration gehemmt, wobei diese in der Ca2+-Mobilisierung inaktiv ist, so dass das Wachstum gehemmt werden kann, ohne dabei die Angiogenese zu fördern. LUF6210 ruft kein Ca2+ Signal hervor und ist daher von Bedeutung, wenn man bedenkt, dass es die ERK1/2 Phosphorylierung redurziert aber die Angiogenese nicht beeinflusst. LUF6210 ist deshalb therapeutisch ansprechend in der Behandlung von Krebs. Angesichts der Tatsache, dass die Stimulation der AC die Reduktion der ERK1/2-Phosphorylierung und der Proliferation in Krebszellen aktiviert, sind selective Gs-AC-PKA Agonisten erforderlich in der Therapie verschiedener maligner Erkrankungen. KW - Adenosinrezeptor KW - A2B adenosine receptor KW - Brustkrebs KW - CAMP production KW - intracellular calcium release KW - reduction of ERK1/2 phosphorylation KW - reduction of cells proliferation KW - A2BAR KW - induzierte Phosphatasen MKP-1 und MKP-2 KW - Hemmung der Proliferation schnell wachsender Krebszellen Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209655 ER - TY - THES A1 - Kramer, Sofia T1 - Hemmung pathologischer kardialer Hypertrophie über das Dimer-Interface von ERK1/2 T1 - Inhibition of pathological cardiac hypertrophy by the dimer interface of ERK1/2 N2 - Die extrazellulär Signal-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) spielen eine zentrale Rolle bei der Vermittlung kardialer Hypertrophie und dem Zellüberleben. Hypertrophe Stimuli aktivieren ERK1/2, triggern deren Dimerisierung und in der Folge die ERK188-Autophosphorylierung. Diese neu entdeckte Autophosphorylierung ist eine Voraussetzung für den nukleären Import von ERK1/2 und führt zum Entstehen pathologischer kardialer Hypertrophie. Da das Dimer Interface von ERK eine mögliche Zielstruktur darstellt, um selektiv die nukleären Signalwege von ERK zu unterbrechen, wurde untersucht, ob man mit Hemmung der ERK-Dimerisierung eine therapeutische Möglichkeit hat, um pathologische kardiale Hypertrophie zu verhindern. Dazu wurden verschiedene ERK2 Mutanten und Peptide generiert, um die ERK-Dimerisierung zu verhindern. Die Effekte dieser Konstrukte auf die ERK-Dimerisierung und den Kernimport wurden in verschiedenen Zelltypen mittels Fluoreszenzmikroskopie, Co-Immunopräzipitationen und Duolink proximity ligation assays getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die Peptide effektiv die ERK-ERK Interaktion nach Stimulation mit Phenylephrin und/oder Carbachol verhindern. Zusätzlich reduzierten die Peptide ERKT188-Phosphorylierung und in der Folge den ERK-Import in den Nukleus und Kardiomyozytenhypertrophie. Normale ERK-Aktivierung wurde jedoch durch die Peptide nicht verhindert. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass das ERK-Dimer Interface eine wertvolle Zielstruktur ist, mit dem man nukleäre ERK1/2 Signalwege selektiv unterbrechen und damit effektiv Kardiomyozytenwachstum reduzieren kann, ohne gleichzeitig das Zellüberleben zu gefährden. N2 - The extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) have a central role in cardiac hypertrophy and cell survival. Hypertrophic stimuli activate ERK1/2, trigger ERK dimerization and subsequently ERKT188-autophosphorylation. This newly discovered autophosphorylation is a prerequisite for nuclear ERK1/2 translocation and leads to the development of pathological cardiac hypertrophy. As the ERK dimer interface is a potential target to selectively interfere with nuclear ERK1/2 signaling, we investigated whether the interference with ERK dimerization may serve as a therapeutic strategy to prevent pathological cardiac hypertrophy. For this, we generated ERK2 mutants and peptide constructs that interfere with ERK dimerization. These constructs were evaluated in various cell types by their effects on nuclear ERK translocation and dimerization by fluorescence microcopy, co-immunoprecipitation and Duolink proximity ligation assays. We showed that the peptides indeed prevented ERK-ERK interaction in response to phenylephrine and/or carbachol stimulation. In addition, the peptides prevented ERKT188-phosphorylation and interfered with all ERK1/2 effects that are associated with ERKT188-phosphorylation e.g. nuclear ERK translocation and cardiomyocyte hypertrophy. Interestingly, the peptide did not inhibit the general activation of ERK1/2. These data indicate that the ERK dimer interface is a valuable target for selective inhibition of nuclear ERK1/2 signaling, that is able to effectively attenuate ERK1/2 mediated cardiomyocyte growth but without impairing cell survival. KW - Dimerisierung KW - Herzhypertrophie KW - Interferenz KW - MAP-Kinase KW - ERK1/2 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233739 ER - TY - THES A1 - Kreutzmann, Moritz Paul T1 - Untersuchung von Markern für oxidativen Stress und DNA-Schäden bei arterieller Hypertonie T1 - Investigation of markers for oxidative stress and DNA damage in arterial hypertension N2 - Patienten mit arterieller Hypertonie haben ein erhöhtes Risiko eine Tumorerkrankung, insbesondere Nierenzellkarzinome, zu entwickeln. Die arterielle Hypertonie ist über die Entstehung von oxidativem Stress mit der Entwicklung von DNA-Schäden verknüpft, wobei ein hochreguliertes Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) eine entscheidende Rolle einnimmt. Das Ziel dieser Arbeit war es zum einen Hypertoniker (HypAll) und gesunde Kontrollen und zum anderen gut (HypGut) und schlecht (HypSch) eingestellte Hypertoniker unter Berücksichtigung der eingenommenen Antihypertensiva bezüglich ihrer Level an oxidativem Stress und DNA-Schäden zu vergleichen. Zusätzlich erfolgte im Rahmen einer Längsschnittanalyse der intraindividuelle Vergleich unter den Hypertonikern. Hierfür erfolgte die Bestimmung von SHp, D-ROM und 3-Nitrotyrosin als Marker für oxidativen Stress im Plasma, von 8-oxodG, 15-F2t-Isoprostan und Malondialdehyd als Marker für oxidativen Stress im Urin und von γ-H2AX und Mikrokernen als Marker für DNA-Schäden in Lymphozyten. Dabei konnte ein erhöhter oxidativer Stress in der HypAll-Gruppe verglichen zu den Kontrollen anhand aller Marker für oxidativen Stress mit Ausnahme von Malondialdehyd festgestellt werden. Nach Altersadjustierung zeigte sich dieser Gruppenunterschied nur noch für die Proteinstressmarker SHp und 3-Nitrotyrosin signifikant. Bezüglich der Marker für DNA-Schäden ergab sich kein Unterschied zwischen HypAll und Kontrollen. Ebenso zeigte sich kein signifikanter Unterschied in den Leveln für oxidativen Stress und DNA-Schäden zwischen der HypGut- und HypSch-Gruppe. Zuletzt konnte im Rahmen der Längsschnittstudie ein positiver Zusammenhang zwischen der Entwicklung des Blutdrucks und des oxidativen Stresses anhand der Veränderung von D-ROM und des systolischen Blutdrucks beobachtet werden. Die teils nicht-signifikanten und teils mangelnden Unterschiede zwischen HypAll und Kontrollen sowie zwischen HypGut und HypSch sind am ehesten durch das besondere Patientengut, welches sich auch grundlegend von dem anderer vergleichbarer Studien unterscheidet, erklärbar. Die Patienten mit therapieresistenter Hypertonie (TRH) zeichnen sich durch eine langjährige Einnahme zahlreicher Antihypertensiva aus. Diese, insbesondere die RAAS-wirksamen, besitzen eine über die reine Blutdrucksenkung hinausgehende antioxidative und antigenotoxische Wirkung, welche vermutlich zu einer Angleichung der Level für oxidativen Stress und DNA-Schäden geführt hat. Um die Dynamik der Biomarker und den Einfluss der Antihypertensiva auf oxidativen Stress und DNA-Schäden besser zu verstehen, sind weitere Studien über einen längeren Beobachtungszeitraum sowie mit zusätzlich therapienaiven Hypertonikern sinnvoll. Die weitere Erforschung von Biomarkern, um sie im klinischen Alltag zur Verbesserung der Patientenbehandlung einsetzen zu können, ist notwendig. N2 - Patients with arterial hypertension are at an increased risk of developing tumors, especially renal cell carcinoma. Arterial hypertension is linked to the development of DNA damage through the development of oxidative stress, with an upregulated renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) playing a decisive role. The aim of this work was to compare 1. hypertensive patients (HypAll) and healthy controls and 2. hypertensive patients with good (HypGut) and poorly (HypSch) adjusted hypertension with regard to their level of oxidative stress and DNA damage. For this purpose, SHp, D-ROM and 3-nitrotyrosine were determined as markers for oxidative stress in plasma, 8-oxodG, 15-F2t-isoprostane and malondialdehyde as markers for oxidative stress in urine and γ-H2AX and micronuclei as markers for DNA damage in lymphocytes. An increased oxidative stress was found in the HypAll group compared to the controls as measured by all markers for oxidative stress with the exception of malondialdehyde. After adjusting for age, this group difference was only significant for the protein stress markers SHp and 3-nitrotyrosine. With regard to the markers for DNA damage, there was no difference between HypAll and controls. Also there was no significant difference in the levels of oxidative stress and DNA damage between the HypGut and HypSch groups. The partly insignificant and partly lacking differences between HypAll and controls as well as between HypGut and HypSch can best be explained by the special patient population, which is also fundamentally different from that of other comparable studies. The patients with therapy-resistant hypertension are characterized by long-term use of numerous antihypertensive drugs. These, especially the RAAS-effective ones, have an antioxidant and antigenotoxic effect that goes beyond the pure lowering of blood pressure. This has presumably led to an equalization of the levels for oxidative stress and DNA damage. In order to better understand the dynamics of the biomarkers and the influence of antihypertensive drugs on oxidative stress and DNA damage, further studies over a longer observation period and with additional therapy-naive hypertensive patients are useful. Further research into biomarkers is necessary so that they can be used in everyday clinical practice to improve patient treatment. KW - Oxidativer Stress KW - DNS-Schädigung KW - Biomarker KW - Hypertonie KW - Mikrokern KW - γ-H2AX Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243380 ER - TY - JOUR A1 - Kugler-Steigmeier, M. E. A1 - Friederich, U. A1 - Graf, U. A1 - Lutz, Werner K. A1 - Maier, P. A1 - Schlatter, C. T1 - Genotoxicity of aniline derivatives in various short-term tests N2 - Various substituted aniline derivatives were tested for genotoxicity in several short-term tests in order to examine the hypothesis that a Substitution at both ortho positions (2,6-disubstitution) could prevent genotoxicity due to steric hindrance of an enzymatic activation to electrophilic intermediates. In the Salmonellajmicrosome assay, 2,6-dialkylsubstituted anilines and 2,4,6-trimethylaniline (2,4,6-TMA) were weakly mutagenic in strain TA100 when 20% S9 mixwas used, although effects were small compared to those of 2,4-dimethylaniline and 2,4,5-trimethylaniline (2,4,5-TMA). In Drosophila me/anogaster, however, 2,4,6-TMA and 2,4,6-trichloroaniline (TCA) were mutagenic in the wing spottestat 2-3 times lower doses than 2,4,5-TMA. In the 6-thioguanine resistance test in cultured fibroblasts, 2,4,6-TMA was again mutagenic at lower doses than 2,4,5-TMA. Two methylene-bis-aniline derivatives were also tested with the above methods: 4,4'-methylene-bis-(2-chloroaniline) (MOCA) was moderately genotoxic in al1 3 test systems whereas 4,4'-methylene-bis-(2-ethyl-6-methylaniline) (MMEA) showed no genotoxicity at all. DNA binding sturlies in rats, however, revealed that both MOCA and MMEA produced DNA adducts in the liver at Ievels typically found for moderately strong genotoxic carcinogens. These results indicate that the predictive value of the in vitro test systems and particularly the Salmonellajmicrosome assay is inadequate to detect genotoxicity in aromatic amines. Genotoxicity seems to be a general property of aniline derivatives and does not seem to be greatly influenced by substitution at both ortho positions. KW - Toxikologie KW - Aniline derivatives KW - Genotoxicity KW - Short-term tests KW - Covalent DNA binding Y1 - 1989 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60857 ER - TY - THES A1 - Kämpf, Anne Kristina T1 - Does methylphenidate cause a cytogenetic effect in children with attention deficit hyperactivity disorder? T1 - Zytogenetische Veränderungen durch Methylphenidat bei Kindern mit ADHS? N2 - MPH wird seit über 50 Jahren zur Therapie des ADHS eingesetzt. Gerade in den letzten Jahren wurde deutlich, dass der Einsatz ohne fundierte Kenntnis über mögliche Langzeit-effekte erfolgte, da zum Zeitpunkt der Zulassung aufgrund der begrenzten technischen Möglichkeiten weniger strenge und weniger umfassende Einschränkungen beachtet wer-den mussten (Walitza, Werner et al. 2007). Da in den letzten Jahren die Anzahl der verschrieben Tagesdosen MPH sprunghaft anstiegen, ist es wichtig, auch die langfristigen Nebenwirkungen von MPH zu untersuchen (Janhsen 2007). Eine Studie von El-Zein et al. von 2005 brachte die Frage auf, ob MPH eventuell Genomschäden hervorrufe. Bei 11 von 12 untersuchten Kindern wurde unter der Therapie mit MPH um das 2,4fache erhöhte Mikrokernfrequenzen gefunden (El-Zein, Abdel-Rahman et al. 2005). Dies beunruhig-te vor allem im Hinblick auf das mit erhöhten Mikrokernfrequenzen korrelierte erhöhte Karzinomrisiko. Eine daraufhin von Walitza et al. durchgeführte Studie, die ebenfalls Mikrokernfrequenzen in peripheren Blutzellen untersuchte (Walitza, Werner et al. 2007), konnte keine Hinweise auf eine Genomschädigung durch MPH erbringen. Zahlreiche weitere Untersuchungen zur potentiellen Genomschädigung durch MPH konnten die Ergebnisse durch in vivo- oder in vitro-Studien nicht bestätigen und kritisierten die ge-ringe Stichprobengröße sowie mangelnde Transparenz der Arbeit von El-Zein (Preston, Kollins et al. 2005; El-Zein, Hay et al. 2006; Holtmann, Kaina et al. 2006; Suter, Martus et al. 2006). Da jedoch keine weitere Studie sich konkret mit zytogenetischen Effekten in peripheren Blutzellen befasste, soll die vorliegende Arbeit dazu dienen, den Verdacht einer Genomschädigung endgültig auszuräumen (Walitza, Kampf et al. 2009). Dazu wurde eine größere Gruppe von Kindern eingeschlossen, sowie Untersuchungen zu verschiedenen Zeitpunkten während der MPH-Einnahme, bis hin zu Untersuchungen nach einem Zeitraum von 12 Monaten der MPH- Einnahme, durchgeführt. Mit Hilfe eines Mikrokerntestes wurden in der vorliegenden Studie versucht, DNS-Schäden an periphe-ren Lymphozyten zu bestimmen, um daraus auf ein potentiell erhöhtes Krebsrisiko schließen zu können. Im Vergleich mit einer gesunden Kontrollgruppe waren die Werte von ADHS-Kindern ohne MPH-Therapie sowie nach 3 und 12 Monaten MPH-Therapie zwar signifikant er-höht, diese gesunde Kontrollgruppe wies jedoch im Vergleich mit internationalen Refe-renzwerten eine extrem niedrige Mikrokernfrequenz auf, so dass davon ausgegangen werden muss, dass diese Vergleiche nur begrenzte Aussagekraft haben. In keiner der verschiedenen mit MPH therapierten Gruppen konnten über die Dauer der Einnahme eine signifikant Erhöhung der Mikrokernfrequenzen im Vergleich zu den Werten vor Einnahmebeginn nachgewiesen werden, was den Schluss zulässt, dass eine Therapie mit Methylphenidat in therapieüblichen Dosen bei Kindern das Erbgut nicht zu schädigen scheint. Dieses Ergebnis bestätigen inzwischen auch weitere Studien. Der Mikrokerntest erfasst Genomschäden, nicht jedoch etwaige tumorpromovierende Eigenschaften des verabreichten Medikaments. Damit ist unklar, ob MPH auf andere Art als über eine Schädigung des Genoms das Karzinomrisiko erhöhen könnte. Erste epidemiologische Studien sehen jedoch keinen Hinweis auf eine wie auch immer entstandene erhöhte Karzinominzidenz unter der Therapie mit MPH (Selby, Friedman et al. 1989; Oestreicher, Friedman et al. 2007). Hier scheinen jedoch weitere epidemiologische Studien, die mög-lichst große Zeitspannen umfassen, nötig zu sein N2 - Attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) is the most frequent psychiatric disorder in children and adolescents and is often treated with methylphenidate (MPH), resulting in MPH exposure in more than 1% of all children in many countries. A 2005 report on cytogenetic effects in peripheral lymphocytes from 12 ADHD children treated for 3 months with MPH raised questions about its genetic toxicity and potential carcinogenicity. A healthy control group (23 individuals), a chronically MPH-treated (>12 months) group (21 patients), and a drug naïve group of ADHD-affected children (26 patients), which was analyzed again after 3 months (17 patients) and 6 months (11 patients), provided samples for analysis of micronucleated lymphocytes. No significant alteration in genomic damage as seen as micronucleus frequency in peripheral lypmphocytes was detected after MPH treatment. No indication for genomic damage induced by MPH was obtained in this study. Ongoing studies in the USA, as well as continuation of recently published epidemiological cancer incidence analysis should provide additional reassurance for MPH-treated ADHD patients. KW - Methylphenidat KW - Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom KW - Kleinkern KW - micronucleus assay KW - cytogenetic effects KW - mutagenicity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77652 ER -