Theresa Brand

• RKIP ist ein Kinaseregulator, der unter anderem Raf und GRK-2 kontrolliert. Im Herzen inhibiert RKIP die GRK-2 und verstärkt daher die beta-adrenerge Signalweiterleitung. Eine Überexpression von RKIP im murinen Herzen führt zu einer Steigerung der kardialen Kontraktilität, die gut toleriert wird. Aufgrund einer ausgewogenen Aktivierung der beta1- und beta2-Adrenorezeptoren (beta-AR) hat der positiv inotrope Effekt -unerwarteterweise- keine schädlichen Auswirkungen auf das Herzgewebe. Der beobachtete Phänotyp weist auf einen erhöhtenRKIP ist ein Kinaseregulator, der unter anderem Raf und GRK-2 kontrolliert. Im Herzen inhibiert RKIP die GRK-2 und verstärkt daher die beta-adrenerge Signalweiterleitung. Eine Überexpression von RKIP im murinen Herzen führt zu einer Steigerung der kardialen Kontraktilität, die gut toleriert wird. Aufgrund einer ausgewogenen Aktivierung der beta1- und beta2-Adrenorezeptoren (beta-AR) hat der positiv inotrope Effekt -unerwarteterweise- keine schädlichen Auswirkungen auf das Herzgewebe. Der beobachtete Phänotyp weist auf einen erhöhten Energiebedarf hin. Da dies möglicherweise einen Effekt von RKIP auf Mitochondrien beinhaltet, war das Ziel dieses Projekts die Aufklärung einer möglichen Achse aus RKIP, betaAR und Mitochondrien. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten einen Effekt von RKIP auf die mitochondriale Morphologie. Die Mitochondrien in wildtypischen (Wt) Mausherzen reihten sich entlang der Myofilamente auf. In Mäusen mit einer Herz-spezifischen Überexpression von RKIP (RKIP-tg) war ein größerer Anteil des Herzgewebes mit Mitochondrien bedeckt, hervorgerufen durch eine erhöhte Anzahl an Mitochondrien im Vergleich zu Wt. Trotzdem ist die hochgeordnete Struktur von Mitochondrien und Myofilamenten nicht gestört. Die Mitochondrien bilden sogar mehrschichtige Reihen zwischen den Myofilamenten aus. Im Gegensatz dazu sind Mitochondrien aus RKIP-knockout Tieren (RKIP-KO) kleiner und ihre Konnektivität, die die geordnete Struktur ausprägt, geht verloren. Die Veränderungen der mitochondrialen Morphologie gehen einher mit Anomalitäten im Expressionsniveau von Proteinen der mitochondrialen Teilung und Fusion. Mitochondrien sind sehr dynamische Organellen, die permanenten Teilungs- und Fusionsprozessen unterliegen, die von einem Set aus GTPasen ausgeführt werden. Die Expression von DRP-1, einem Protein der mitochondrialen Teilung, ist in RKIP-KO Mausherzen hochreguliert im Vergleich zu Wt und RKIP-tg. Das könnte die reduzierte Größe von Mitochondrien in RKIP-KO Herzen erklären. Im Gegensatz dazu ist Mfn-1, ein Protein der mitochondrialen Fusionsmaschinerie, zwischen den Genotypen nicht verändert. Das passt gut zu der Beobachtung, dass RKIP nicht zu einer Vergrößerung von individuellen Mitochondrien führt. Trotzdem ist Mfn-2, ein Protein das zur Verknüpfung von Mitochondrien und von Mitochondrien mit anderen Organellen beiträgt, in RKIP-tg Mausherzen verglichen mit Wt und RKIP-KO hochreguliert. Das könnte zu der Ausbildung eines Netzwerkes zwischen der erhöhten Anzahl an Mitochondrien beitragen. Um zu überprüfen, ob die morphologischen Veränderungen auf funktionaler Ebene gespiegelt werden, wurden Sauerstoffverbrauchsmessungen durchgeführt. Tatsächlich zeigten Mitochondrien, die aus RKIP-KO Herzen gewonnen wurden, eine erniedrigte ADP-stimulierte Atmung verglichen mit Wt Mitochondrien. Bezieht man die Hyperpolarisation der inneren Mitochondrienmembran, die in isolierten Kardiomyozyten beobachtet wurde, mit ein, könnte das auf einen Defekt in der ATP-Synthese zurückzuführen sein. Im Einklang damit ist das Expressionsniveau von ATP5a, einem Protein, das am Aufbau der ATP-Synthase beteiligt ist, in isolierten Mitochondrien aus RKIP-KO Mausherzen reduziert. Das deutet auf eine essentielle Funktion von RKIP bei der mitochondrialen Funktion hin. Im Gegensatz dazu war die mitochondriale Funktion in RKIP-überexprimierenden Herzen normal. Der Sauerstoffverbrauch und das mitochondriale Membranpotential waren nicht von Wt zu unterscheiden. Jedoch steigerte eine RKIP-Überexpression das Expressionsniveau von Proteinen der Atmungskette. Dies führte uns zu der Hypothese, dass RKIP kardiale Mitochondrien schützt. Um dies zu testen, wurden Ischämie/Reperfusionsbedingungen in isolierten Kardiomyozyten simuliert, indem ein Puffer zugesetzt wurde, der die metabolischen Veränderungen während einer Ischämie imitiert. Während das mitochondriale Membranpotential in Wt Kardiomyozyten kollabiert, wenn der Ischämiepuffer zugegeben wird, waren RKIP-tg Kardiomyozyten vor diesem schädlichen Effekt geschützt. Das deutet einen RKIP-vermittelten Schutz der kardialen Mitochondrien unter ischämischen Bedingungen an. Da RKIP im Herzen als GRK-2-Inhibitor fungiert, wollten wir als nächstes die Beteiligung der betaAR am RKIP-vermittelten Effekt auf Mitochondrien untersuchen. Daher wurden die RKIP-induzierten Veränderungen der Proteinexpression in Abwesenheit von beta1AR oder beta2AR analysiert. Interessanterweise hebt der Verlust des beta2AR den RKIP-vermittelten Anstieg der Mfn-2 Expression und der Proteine der Atmungskette komplett auf, während ein beta1-KO keinen Effekt hat. Um die Rolle des beta2AR als Mitochondrien-protektiven Rezeptor weiter zu beleuchten, wiederholten wir die Experimente, bei denen adulte Kardiomyozyten mit Ischämiepuffer behandelt wurden. In Abwesenheit des beta2AR verlor RKIP seinen schützenden Effekt auf kardiale Mitochondrien. Zusammengenommen weist das darauf hin, dass RKIP einen Effekt auf morphologischer und funktionaler Ebene sowie auf Proteinebene auf Mitochondrien ausübt. Die erhöhte Anzahl an funktionalen Mitochondrien könnte dabei helfen, die zusätzliche Energie bereitzustellen, die für eine langfristige Erhöhung der kardialen Kontraktilität benötigt wird. Da wir beobachtet haben, dass RKIP Mitochondrien beeinflussen könnte, war die nächste Überlegung, die Rolle von Mitochondrien im Kontext von genetischen Formen der Kardiomyopathie zu untersuchen. Die PLNR9C Mutation verursacht eine schnell fortschreitende Form der dilatativen Kardiomyopathie. In einem Mausmodell verlängerte die gleichzeitige Überexpression von RKIP das Überleben und stellte die Herzfunktion in PLNR9C Mäusen wieder her. Zunächst beobachten wir einen reduzierten Sauerstoffverbrauch in kardialen Mitochondrien aus PLNR9C Mäusen. Nimmt man die Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials dazu, scheint die mitochondriale Fehlfunktion auf einem Defekt der Substratoxidation zu beruhen. Eine gleichzeitige Überexpression von RKIP normalisierte den mitochondrialen Phänotyp der PLNR9C Mäuse fast vollständig. Das legt nahe, dass Mitochondrien nicht nur Teil der PLNR9C-induzierten Kardiomyopathie sind, sondern auch des RKIP-abhängigen Schutzes. Da Mitochondrien in einer Vielzahl von kardialen Situationen eine zentrale Rolle einnehmen, war das nächste Ziel die mitochondriale Gesundheit als Parameter für die Testung von Substanztoxizität zu etablieren. Die Messung des mitochondrialen Membranpotentials wurde angewandt, um eine kleine Bibliothek von MEK-Inhibitoren auf ihre mitochondriale Toxizität zu testen. Die bekannten Nebenwirkungen der MEK-Inhibitoren auf Kardiomyozyten und die Rolle der ERK-Aktivierung bei der Apoptose veranlasste uns dazu. Tatsächlich brach das mitochondriale Membranpotential nach Behandlung mit MEK-Inhibitoren ein und verringerte sich unter oxidativem Stress noch weiter. Im Gegensatz dazu führte eine neue Interventionsstrategie für die Raf/MEK/ERK-Kaskade, die spezifisch mit der nukleären Akkumulation von ERK interferiert, die zytosolische ERK-Aktivität aber erhält, nicht zu einer Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials und schützte die Kardiomyozyten sogar unter Wasserstoffperoxidbehandlung. Zusammen genommen betont das Projekt die immens wichtige Rolle von Mitochondrien für neue Strategien zur Kontraktionskraftsteigerung, in pathologischen Situationen, wie Kardiomyopathien, und deren Interventionsstrategien und sogar für das Sicherheitsprofil von neuen therapeutischen Substanzen.…
• RKIP is a kinase regulator controlling Raf and GRK-2, amongst others. In the heart, RKIP inhibits GRK-2 and thus enhances beta-adrenergic receptor (betaAR) signalling. RKIP overexpression in murine hearts leads to a well-tolerated increase in cardiac contractility. Due to a balanced activation of beta1AR and beta2AR the positive inotropic effect has -unexpectedly- no detrimental effects on cardiac tissue. The observed phenotype indicates an increased energy demand. As this may imply an effect of RKIP on mitochondria, the aim of this project wasRKIP is a kinase regulator controlling Raf and GRK-2, amongst others. In the heart, RKIP inhibits GRK-2 and thus enhances beta-adrenergic receptor (betaAR) signalling. RKIP overexpression in murine hearts leads to a well-tolerated increase in cardiac contractility. Due to a balanced activation of beta1AR and beta2AR the positive inotropic effect has -unexpectedly- no detrimental effects on cardiac tissue. The observed phenotype indicates an increased energy demand. As this may imply an effect of RKIP on mitochondria, the aim of this project was the elucidation of a potential RKIP-betaAR-mitochondria axis. Electron microscopy images revealed an impact of RKIP on mitochondrial morphology. Mitochondria in wild type (Wt) mouse hearts are aligned between myofilaments. In mice with cardiac-specific overexpression of RKIP (RKIP-tg) a higher fraction of cardiac tissue is occupied by mitochondria due to an increase in mitochondrial number compared to Wt. Nevertheless, the highly ordered structure of mitochondria and myofilaments is not disturbed. The mitochondria even form multi-lane rows between the myofilaments. In contrast, in mice with a global knockout of RKIP (RKIP-KO) mitochondria are of reduced size and their inter-connectivity, giving rise to the ordered structure, is lost. The changes in mitochondrial morphology go along with abnormalities in the expression levels of proteins involved in mitochondrial fission and fusion. Mitochondria are highly dynamic organelles that undergo constant events of fusion and division mediated by a set of GTPases. The expression of DRP-1, a protein involved in mitochondrial fission, is upregulated in RKIP-KO mouse hearts compared with Wt and RKIP-tg. This could explain the reduced size of mitochondria in RKIP-KO hearts. In contrast, Mfn-1, a protein of the mitochondrial fusion machinery, is not altered between the genotypes. This fits well with the observation that RKIP does not induce an increased size of individual mitochondria. Nevertheless, Mfn-2, a protein contributing to inter-mitochondrial and inter-organelle connectivity, is upregulated in RKIP-tg mouse hearts compared to Wt and RKIP-KO. This could contribute to the formation of a network between the increased numbers of mitochondria. To check, if the changes in morphology mirror alterations in mitochondrial function, oxygen consumption assays were conducted. Indeed, mitochondria derived from RKIP-KO mouse hearts show a decreased ADP-stimulated respiration compared to Wt mitochondria. Taking the hyperpolarisation of the inner mitochondrial membrane, observed in isolated cardiomyocytes, into account, this could result from a defect in ATP-synthesis. Along the same line, the expression level of ATP5a, a protein involved in ATP-synthase, is reduced in isolated mitochondria from RKIP-KO mouse hearts. This hints towards an essential role of RKIP in mitochondrial function. In contrast, mitochondrial function was normal in RKIP-overexpressing hearts. Oxygen consumption and mitochondrial membrane potential was indistinguishable from Wt mitochondria. But RKIP overexpression increased the expression levels of proteins involved in the respiratory chain. This led us to the hypothesis of a RKIP-induced protection for cardiac mitochondria. To test this assumption, ischemia reperfusion conditions were simulated in isolated cardiomyocytes applying a buffer that mimics metabolic changes during ischemia. While mitochondrial membrane potential in Wt cardiomyocytes collapses upon application of ischemic buffer, RKIP-tg cardiomyocytes were protected from this adverse event. This suggests a RKIP-mediated protection of cardiac mitochondria under ischemic conditions. As RKIP acts as a GRK-2 inhibitor in the heart, we next thought to evaluate the contribution of the betaAR in the RKIP-mediated effect on mitochondria. Therefore, we analysed the RKIP-induced changes in protein expression in the absence of beta1 or beta2AR. Interestingly, the loss of beta2AR completely abolished the RKIP-mediated increases in protein expression of Mfn-2 and the proteins of the respiratory chain, while beta1 knockout had no effect. To further establish the role of beta2AR as a mitochondria-protective receptor, we repeated the experiments using ischemic buffer on adult cardiomyocytes. In the absence of beta2AR, RKIP lost its shielding effect on cardiac mitochondria. Taken together, this suggests, that RKIP has an impact on cardiac mitochondria on a morphological, functional and on a protein level. The increased number of functional mitochondria could help to provide the additional amount of energy that is needed for the long-term increase in cardiac contractility. Moreover, a protective connection of RKIP, beta2AR and mitochondria seems to exist. As we learned that RKIP could affect mitochondria, we next thought to investigate the role of mitochondria in the context of a hereditary form of cardiomyopathy. The PLNR9C mutation induces a rapidly progressive form of dilative cardiomyopathy. In a mouse model, the simultaneous overexpression of RKIP prolonged life span and rescued cardiac function in PLNR9C mice. First, we observed a reduced oxygen consumption in PLNR9C cardiac mitochondria. Together with a depolarization of the mitochondrial membrane potential, the mitochondrial malfunction seems to be based on a defect in substrate oxidation. A simultaneous overexpression of RKIP almost normalised the mitochondrial phenotype of PLNR9C mice. Suggesting that mitochondria are not only part of PLNR9C-induced cardiomyopathy but also of the RKIP-dependent rescue. As mitochondria are central organelles in a wide variety of cardiac situations, the next aim was to establish mitochondrial health as a read-out for compound toxicity testing. The measurement of mitochondrial membrane potential was used to test a small series of MEK-inhibitors with regard to their potential mitochondrial toxicity. This was prompted by the known side effects of MEK-inhibitors on cardiomyocytes and the role of ERK activation in apoptosis. Indeed, mitochondrial membrane potential collapsed in response to MEK-inhibitor treatment and even further decreased under oxidative stress conditions. In contrast, a new targeting strategy for the Raf/MEK/ERK cascade, interfering specifically with ERK nuclear accumulation preserving cytosolic ERK activity, did not lead to depolarization of mitochondrial membrane potential and even protected cardiomyocytes under hydrogen peroxide treatment. Taken together, the project places emphasis on the immense important role of mitochondria for new strategies to enhance cardiac contraction force, in pathological conditions such as cardiomyopathies and their respective intervention strategies and even for safety profiling of new therapeutic compounds.…