CRISPR/Cas9-basierte Etablierung Alkalischer Phosphatase-defizienter odontogener Zelllinien zur Analyse der dentalen Aspekte der Hypophosphatasie

CRISPR/Cas9-based establishment of alkaline phosphatase deficient odontogenous cell lines to analyze dental aspects of Hypophosphatasia

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-243491
  • Die Hypophosphatasie (HPP) ist eine seltene Erberkrankung, welche durch compound-heterozygote oder dominant negative heterozygote Mutationen des ALPL Gens zu einem Funktionsverlust der gewebeunspezifischen Alkalischen Phosphatase (TNAP) führt. Die daraus resultierenden Mineralisierungsstörungen betreffen sowohl den Knochen als auch in milderen Ausprägungsformen die Zähne und den Zahnhalteapparat. Das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen das erste Anzeichen der HPP ist dabei der vorzeitige Verlust der Milchzähne ohne physiologischeDie Hypophosphatasie (HPP) ist eine seltene Erberkrankung, welche durch compound-heterozygote oder dominant negative heterozygote Mutationen des ALPL Gens zu einem Funktionsverlust der gewebeunspezifischen Alkalischen Phosphatase (TNAP) führt. Die daraus resultierenden Mineralisierungsstörungen betreffen sowohl den Knochen als auch in milderen Ausprägungsformen die Zähne und den Zahnhalteapparat. Das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen das erste Anzeichen der HPP ist dabei der vorzeitige Verlust der Milchzähne ohne physiologische Wurzelresorption. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene TNAP defiziente immortalisierte Zellen des parodontalen Ligaments (PDL) mittels der CRISPR/Cas9 Methode generiert und anschließend fünf Zelllinien charakterisiert. Die dabei entstandenen Mutationen variierten von einer moderaten heterozygoten Punktmutation zu einer schwerwiegenden homozygoten Deletion eines einzelnen Nukleotids, welche in einem vorzeitigen Stopcodon resultierte. Analysen der ALPL Expression (qPCR), TNAP Aktivitätsmessungen (CSPD Assay) und TNAP Färbungen zeigten einen signifikanten Rückgang in allen TNAP-defizienten Zelllinien mit einer starken Korrelation zwischen der Restaktivität und dem Ausmaß der Mutation, welche in Einklang mit der komplexen Genotyp-Phänotyp Korrelation bei HPP zu bringen ist. Das Potential der osteogenen Differenzierung der hTERT PDL Zellen wurde in der homozygot mutierten Zelllinie komplett unterdrückt. Mögliche Mechanismen des vorzeitigen Zahnverlustes bei HPP Patienten ist die geminderte Formation und Mineralisation des Wurzelzements und die fehlerhafte Insertion der parodontalen Fasern. Die hier erstmalig etablierten Zellkulturmodelle liefern ein valides spenderunabhängiges in vitro Modell der HPP, welches dazu beitragen kann, die molekularbiologischen Zusammenhänge der dentalen Aspekte der Hypophosphatasie zu ergründen und daraus gegebenenfalls neue Therapieansätze abzuleiten.show moreshow less
  • Hypophosphatasia (HPP) is a rare inherited disorder caused by loss-of-function mutations in the ALPL gene encoding the Tissue Nonspecific Alkaline Phosphatase (TNAP). Besides skeletal symptoms, some patients also present dental abnormalities like for example the premature loss of deciduous teeth. Here we generated and characterized five different TNAP-deficient periodontal ligament (PDL) derived cell lines using the method of CRISPR-Cas9. The mutations varied from a moderate heterozygous point mutation to a severe homozygous deletion leading toHypophosphatasia (HPP) is a rare inherited disorder caused by loss-of-function mutations in the ALPL gene encoding the Tissue Nonspecific Alkaline Phosphatase (TNAP). Besides skeletal symptoms, some patients also present dental abnormalities like for example the premature loss of deciduous teeth. Here we generated and characterized five different TNAP-deficient periodontal ligament (PDL) derived cell lines using the method of CRISPR-Cas9. The mutations varied from a moderate heterozygous point mutation to a severe homozygous deletion leading to a premature stop codon. Analysis of the ALPL expression and TNAP activity measurements in CSPD Assays and TNAP stainings revealed a decrease for all TNAP-deficient cell lines with a strong correlation between the residual activity and the extend of the mutation. The already limited differentiation capacity of immortalized hTERT (human telomerase reverse transcriptase) PDL cells is completely abolished in the homozygously mutated cell line. Putative key mechanisms for the premature exfoliation in HPP are the restricted formation and mineralization of the cementum and the impaired insertion of elastic dental fibers. The newly generated TNAP-deficient cell lines provide a promising and donor independent in vitro model to gain better understanding of the molecular mechanisms of dental problems in HPP.show moreshow less

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Metadaten
Author: Sofia Paulus [verh. Rehling]GND
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-243491
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Medizinische Fakultät
Faculties:Medizinische Fakultät / Lehrstuhl für Orthopädie
Medizinische Fakultät / Poliklinik für Zahnerhaltung und Parodontologie
Referee:Prof. Dr. Franz Jakob, Prof. Dr. Ulrich Schlagenhauf
Date of final exam:2021/08/03
Language:German
Year of Completion:2023
DOI:https://doi.org/10.25972/OPUS-24349
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 616 Krankheiten
GND Keyword:Hypophosphatasie; Alkalische Phosphatase; CRISPR/Cas-Methode
Tag:CRISPR/Cas9
TNAP
Release Date:2023/08/03
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht mit Print on Demand