Lennart Groß

• One rarely finds practical guidelines for the implementation of complex optical setups. Here, we aim to provide technical details on the decision making of building and revising a custom sensor-based adaptive optics (AO) direct stochastic optical reconstruction microscope (dSTORM) to provide practical assistance in setting up or troubleshooting similar devices. The foundation of this report is an instrument constructed as part of a master's thesis in 2021, which was built for deep tissue imaging. The setup is presented in the following way:One rarely finds practical guidelines for the implementation of complex optical setups. Here, we aim to provide technical details on the decision making of building and revising a custom sensor-based adaptive optics (AO) direct stochastic optical reconstruction microscope (dSTORM) to provide practical assistance in setting up or troubleshooting similar devices. The foundation of this report is an instrument constructed as part of a master's thesis in 2021, which was built for deep tissue imaging. The setup is presented in the following way: (1) An optical and mechanical overview of the system at the beginning of this internship is given. (2) The optical components are described in detail in the order at which the light passes through, highlighting their working principle and implementation in the system. The optical component include (2A) a focus on even sample illumination, (2B) restoring telecentricity when working with commercial microscope bodies, (2C) the AO elements, namely the deformable mirror (DM) and the wavefront sensor, and their integration, and (2D) the separation of wavefront and image capture using fluorescent beads and a dichroic mirror. After addressing the limitations of the existing setup, modification options are derived. The modifications include the implementation of adjustment only light paths to improve system stability and revise the degrees of freedom of the components and changes in lens choices to meet the specifications of the AO components. Last, the capabilities of the modified setup are presented and discussed: (1) First, we enable epifluorescence imaging of bead samples through 180 µm unstained murine hippocampal tissue with wavefront error correction of ~ 90 %. Point spread function, wavefront shape and Zernike decomposition of bead samples are presented. (2) Second, we move from epifluorescent to dSTORM imaging of tubulin stained primary mouse hippocampal cells, which are imaged through up to 180 µm of unstained murine hippocampal tissue. We show that full width at half maximum (FWHM) of prominent features can be reduced in size by nearly a magnitude from uncorrected epiflourescence images to dSTORM images corrected by the adaptive optics. We present dSTORM localization count and FWHM of prominent features as as a function of imaging depth.…
• Praktische Leitlinien für die Implementierung komplexer optischer Systeme sind selten zu finden. Hier wollen wir technische Details zur Entscheidungsfindung beim Bau und der Überarbeitung eines maßgefertigten Mikroskops mit sensorgestützter adaptiver Optik (AO) und direkter stochastischer optischer Rekonstruktion (dSTORM) bereitstellen, um praktische Hilfestellung bei der Einrichtung oder Fehlerbehebung ähnlicher Geräte zu geben. Grundlage dieses Berichts ist ein Instrument, das im Rahmen einer Masterarbeit im Jahr 2021 für die Abbildung vonPraktische Leitlinien für die Implementierung komplexer optischer Systeme sind selten zu finden. Hier wollen wir technische Details zur Entscheidungsfindung beim Bau und der Überarbeitung eines maßgefertigten Mikroskops mit sensorgestützter adaptiver Optik (AO) und direkter stochastischer optischer Rekonstruktion (dSTORM) bereitstellen, um praktische Hilfestellung bei der Einrichtung oder Fehlerbehebung ähnlicher Geräte zu geben. Grundlage dieses Berichts ist ein Instrument, das im Rahmen einer Masterarbeit im Jahr 2021 für die Abbildung von tiefem Gewebe gebaut wurde. Der Aufbau wird wie folgt dargestellt: (1) Es wird ein optischer und mechanischer Überblick über das System zu Beginn dieses Praktikums gegeben. (2) Die optischen Komponenten werden in der Reihenfolge, in der das Licht sie durchläuft, detailliert beschrieben und ihre Funktionsweise und Umsetzung im System hervorgehoben. Zu den optischen Komponenten gehören (2A) ein Fokus auf gleichmäßige Probenausleuchtung, (2B) die Wiederherstellung der Telezentrizität bei der Arbeit mit handelsüblichen Mikroskopkörpern, (2C) die AO-Elemente, nämlich der deformierbare Spiegel (DM) und der Wellenfrontsensor, und deren Integration, sowie (2D) die Trennung von Wellenfront- und Bilderfassung mittels fluoreszierender Beads und einem dichroitischen Spiegel. Nachdem die Einschränkungen des bestehenden Aufbaus angesprochen wurden, werden Modifikationsmöglichkeiten abgeleitet. Die Modifikationen umfassen die Implementierung von Justage-Lichtpfaden, um die Systemstabilität zu verbessern und die Freiheitsgrade der Komponenten zu überarbeiten, sowie Änderungen bei der Auswahl der Linsen, um die Spezifikationen der AO-Komponenten zu erfüllen. Abschließend werden die Ergebnisse des modifizierten Aufbaus vorgestellt und diskutiert: (1) Zunächst ermöglichen wir die Epifluoreszenz-Abbildung von Bead-Proben durch 180 µm ungefärbtes Hippocampus-Gewebe der Maus mit einer Wellenfront-Fehlerkorrektur von ~ 90 %. Es werden Punktspreizungsfunktion, Wellenfrontform und Zernike-Zerlegung von Bead-Proben vorgestellt. (2) Zweitens gehen wir von der Epifluoreszenz zur dSTORM-Bildgebung von Tubulin-gefärbten primären Hippocampuszellen der Maus über, die durch bis zu 180 µm ungefärbtes Hippocampusgewebe der Maus abgebildet werden. Wir zeigen, dass die Halbwertsbreite (Full Width at Half Maximum, FWHM) auffälliger Merkmale von unkorrigierten Epifloureszenz-Bildern zu dSTORM-Bildern, die durch die adaptive Optik korrigiert wurden, um fast eine Größenordnung reduziert werden kann. Wir präsentieren die Anzahl der dSTORM-Lokalisierungen und die FWHM auffälliger Merkmale als Funktion der Abbildungstiefe.…