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Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a 3D Spheroid Culture System - Extracellular Matrix Development, Adipogenic Differentiation, and Secretory Properties

Humane mesenchymale Stammzellen aus dem Fettgewebe in einem 3D Sphäroid Kultursystem - Entwicklung der Extrazellulärmatrix, adipogene Differenzierung und sekretorische Eigenschaften

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-204249
  • The ability to differentiate into mesenchymal lineages, as well as immunomodulatory, anti-inflammatory, anti-apoptotic, and angiogenic properties give ASCs great therapeutic potential. Through their culture as multicellular, three-dimensional spheroids this potential can even be enhanced. Accordingly, 3D spheroids are not only promising candidates for the application in regenerative medicine and inflammatory disease therapy, but also for the use as building blocks in tissue engineering approaches. Due to the resemblance to physiologicalThe ability to differentiate into mesenchymal lineages, as well as immunomodulatory, anti-inflammatory, anti-apoptotic, and angiogenic properties give ASCs great therapeutic potential. Through their culture as multicellular, three-dimensional spheroids this potential can even be enhanced. Accordingly, 3D spheroids are not only promising candidates for the application in regenerative medicine and inflammatory disease therapy, but also for the use as building blocks in tissue engineering approaches. Due to the resemblance to physiological cell-cell and cell-matrix interactions, 3D spheroids gain higher similarity to real tissues, what makes them a valuable tool in the development of bioactive constructs equivalent to native tissues in terms of its cellular and extracellular structure. Especially, to overcome the still tremendous clinical need for adequate implants to repair soft tissue defects, 3D spheroids consisting of ASCs are a promising approach in adipose tissue engineering. Nevertheless, studies on the use of ASC-based spheroids as building blocks for fat tissue reconstruction have so far been very rare. In order to optimally exploit their therapeutic potential to further their use in regenerative medicine, including adipose tissue engineering approaches, a 3D spheroid model consisting of ASCs was characterized extensively in this work. This included not only the elucidation of the structural features, but also the differentiation capacity, gene expression, and secretory properties. In addition, the elucidation of underlying mechanisms contributing to the improved therapeutic efficiency was addressed.show moreshow less
  • Humane mesenchymale Stammzellen aus dem Fettgewebe (ASCs) verfügen über ein großes therapeutisches Potenzial. Dieses reicht von ihrer Fähigkeit zur Differenzierung entlang der mesenchymalen Linien bis hin zu entzündungshemmenden und immunmodulatorischen Eigenschaften, was sie zu vielversprechenden Kandidaten im Einsatz für die regenerative Zelltherapie macht. Die Routinekultur dieser Zellen unter herkömmlichen 2D-Kulturbedingungen führt durch den Verlust der Umgebung in einem dreidimensionalen Gewebeverbund zur Beeinträchtigung ihrerHumane mesenchymale Stammzellen aus dem Fettgewebe (ASCs) verfügen über ein großes therapeutisches Potenzial. Dieses reicht von ihrer Fähigkeit zur Differenzierung entlang der mesenchymalen Linien bis hin zu entzündungshemmenden und immunmodulatorischen Eigenschaften, was sie zu vielversprechenden Kandidaten im Einsatz für die regenerative Zelltherapie macht. Die Routinekultur dieser Zellen unter herkömmlichen 2D-Kulturbedingungen führt durch den Verlust der Umgebung in einem dreidimensionalen Gewebeverbund zur Beeinträchtigung ihrer regenerativen Fähigkeiten. Die Kultivierung in dreidimensionalen Zellaggregaten (Sphäroiden), in denen die Zellen in einem mehr physiologischen 3D Verbund innerhalb ihrer sekretierten Matrix interagieren können, erscheint somit als geeignete Möglichkeit das therapeutische Potential von ASCs zu steigern. Dies macht ASC-basierte Sphäroide nicht nur zu einem vielversprechenden Ansatz in der regenerativen Medizin im Allgemeinen, sondern auch zu einem innovativen Tool in ihrer Verwendung als „Bausteine“ für das Konzept des Tissue Engineerings. Insbesondere im Bereich des Fettgewebe-Engineerings besteht ein immenser klinischer Bedarf an der Entwicklung geeigneter Implantate für die Rekonstruktion von Weichteildefekten. Hierfür erscheinen Sphäroide aus den leicht und in ausreichender Menge zu isolierenden ASCs besonders attraktiv. Der effektive Einsatz solcher Sphäroide in der regenerativen Medizin, sowie im Fettgewebe-Engineering, erfordert jedoch zunächst ihre umfassende Charakterisierung in Bezug auf Strukturmerkmale, Differenzierungsfähigkeit und sekretorische Eigenschaften. Dazu wurden im ersten Teil dieser Arbeit der Prozess der Sphäroidbildung sowie die daran beteiligten Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionen untersucht. Mit Hilfe der sogenannten Liquid-Overlay Technik gelang die reproduzierbare und kontrollierte Zusammenlagerung der ASCs in dreidimensionale Sphäroide innerhalb von 24 h. Hinsichtlich der Entwicklung von Extrazellulärmatrix-Komponenten während der Sphäroidbildung zeigte sich Fibronektin als die Matrix-Komponente, welche als Erste während des Prozesses zu detektieren war. Durch das Blockieren des Fibronektin-spezifischen β1-Integrins mittels eines spezifischen Antikörpers konnte ein Einfluss dieser frühen Fibronektin-Expression auf den Verlauf der Zellaggregation gezeigt werden. Bei dem hier blockierten β1-Integrin handelt es sich um einen zellulären Rezeptor, welcher maßgeblich an der Fibronektinbindung beteiligt ist. Eine Abhängigkeit der Sphäroidbildung von der Zell-Zell Interaktion mittels Cadherine konnte hingegen für die ASCs nicht nachgewiesen werden. Somit konnten im ersten Abschnitt neben einer detaillierten Beschreibung der ASC-Sphäroidbildung zusätzlich erste Erkenntnisse über die dem Prozess zugrundeliegenden Mechanismen gewonnen werden. Der effektive Einsatz von ASC-basierten Sphäroiden als Bausteine für das Fettgewebe-Engineering erfordert Kenntnisse sowohl über die Entwicklung der ECM als wichtigen gewebe-inhärenten Faktor, als auch über eine effiziente adipogene Induktion. Somit lag der Fokus im zweiten Teil dieser Arbeit auf der Charakterisierung der Extrazellulärmatrix in den ASC-Sphäroiden, sowie auf deren Fähigkeit zur adipogenen Differenzierung im Vergleich zur konventionellen 2D-Kultur unter der Verwendung verschiedener Induktionsprotokolle. Differenzierte Sphäroide weisen mit Laminin, Kollagen Typ I, IV und VI als nachgewiesenen Hauptbestandteilen eine Fettgewebs-spezifische Matrixzusammensetzung auf, die eine ausgeprägte Ähnlichkeit zu der des nativen Fettgewebes zeigt. Darüber hinaus konnte eine verbesserte Differenzierungsfähigkeit der ASC-Sphäroide nach einem kurzen induktiven Stimulus gegenüber der 2D kultivierten Zellen gezeigt werden. Dies wurde sowohl hinsichtlich des Triglyceridgehalts, sowie der Expression adipogener Markergene nachgewiesen. Diese verbesserte Differenzierbarkeit und die Möglichkeit mit den Sphäroiden fettgewebeähnliche Mikrogewebe herzustellen, machen diese Zellaggregate zu vielversprechenden Bausteinen für Ansätze im Fettgewebe-Engineering. Inzwischen ist bekannt, dass die Extrazellulärmatrix nicht nur als inertes, unterstützendes Gerüst wirkt, sondern auch zelluläre Prozesse, einschließlich der Differenzierung, durch die Interaktion mit zellulären Rezeptoren beeinflusst. Laminin als wichtige ECM Komponente der Basalmembran reifer Adipozyten konnte in der ECM der adipogen differenzierenden Sphäroide im Gegensatz zu 2D Kulturen zu einem sehr frühen Zeitpunkt der Adipogenese nachgewiesen werden. Um einen positiven Einfluss des Laminins auf den Prozess der adipogenen Differenzierung weitergehend zu untersuchen, wurde ein shRNA-vermittelter Knockdown eines spezifischen Laminin-Gens, welches für die Lamininkette α4 des adipospezifischen Laminin-8 Heterotrimers kodiert, durchgeführt. Obwohl ein stabiler Knockdown des LAMA4 Gens in den ASCs erreicht wurde, so konnte dennoch keine direkte Korrelation zur adipogenen Differenzierungsfähigkeit der Zellen festgestellt werden, da die reduzierte Expression dieses einzelnen Laminin-Gens sich nicht konsequent in der Expression des Gesamtlaminins auf Proteinebene durchsetzte. Das verbesserte therapeutische Potenzial mesenchymaler Stammzellen in einer dreidimensionalen Umgebung beschränkt sich nicht nur auf ihre verbesserte Differenzierungsfähigkeit, sondern umfasst auch die parakrine Sekretion der Zellen, die angiogene, anti-apoptotische, entzündungshemmende und immunmodulatorische Eigenschaften vermittelt. Um dies auch für ASCs zu bestätigen, wurden im letzten Teil dieser Arbeit die Genexpression von ASC-basierten Sphäroiden im Vergleich zu 2D kultivierten Zellen untersucht. Durch mRNA Genexpressionsanalysen konnte für ausgewählte entzündungshemmende, anti-apoptotische und anti-tumor wirksame Zytokine eine signifikant höhere Expression in den Sphäroiden gegenüber der 2D Kultur gezeigt werden. Für einen der wichtigsten entzündungshemmenden Faktoren, Prostaglandin E2, konnte eine erhöhte Sekretion von ASCs, kultiviert als 3D Sphäroide, auch auf Sekretionsebene bestätigt werden. Die Identifizierung intrinsischer Faktoren, welche zu dem verbesserten therapeutischen Potenzial der Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung beitragen, ist noch ausstehend. Zur Untersuchung des Einflusses von Zell-Zellkontakten diente ein PCR-Array zum Screening hierfür relevanter Gene. Durch den Vergleich der beiden Kulturbedingungen, 2D Monolayer und 3D Sphäroide, sollten mögliche Unterschiede in den ASCs festgestellt werden können, welche eventuell für das verbesserte therapeutische Potenzial der Sphäroide mitunter verantwortlich sind. Dabei konnten eindeutige Unterschiede zwischen ASCs aus der 3D bzw. 2D-Kultur festgestellt werden. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet, um einem umfassenden Verständnis der Rolle von Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionen in einem 3D-Sphäroid-Kultursystem näherzukommen. Zusammengefasst tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zu einer umfangreichen Charakterisierung der ASC Sphäroide hinsichtlich struktureller Merkmale, Differenzierungsfähigkeit und sekretorischer Eigenschaften bei. Es wurde gezeigt, dass ASCs der 3D Sphäroide nicht nur eine verbesserte Differenzierungsfähigkeit, sowie eine erhöhte Expression von Genen aufweisen, welche für verschiedene Zytokine codieren, sondern ebenso in der Lage sind Fettgewebs-ähnliche Mikrogewebe zu bilden. Diese Erkenntnisse tragen dadurch insgesamt zur Förderung der ASC Sphäroide in ihrer effektiven Anwendung in der regenerativen Medizin und im Bereich des Fettgewebe-Engineerings bei.show moreshow less

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Metadaten
Author: Christiane Höfner
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-204249
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Graduate Schools
Faculties:Graduate Schools / Graduate School of Life Sciences
Medizinische Fakultät / Klinik und Poliklinik für Unfall-, Hand-, Plastische und Wiederherstellungschirurgie (Chirurgische Klinik II)
Referee:Prof. Dr. Torsten Blunk, PD Dr. Matthias Becker, Prof. Dr. Norbert Schütze
Date of final exam:2020/05/12
Language:English
Year of Completion:2020
DOI:https://doi.org/10.25972/OPUS-20424
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
GND Keyword:adipose; Extracellular Matrix
Tag:3D spheroid culture; adipogenic differentiation; adipose-derived; mesenchymal stem cells; secretory properties
Release Date:2020/05/20
Note:
Journal of Tissue Engineering Part A
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht mit Print on Demand